DE69631544T2

DE69631544T2 - Fettleibigkeitsprotein (ob) zur erhögung der mageren körpermasse

Info

Publication number: DE69631544T2
Application number: DE69631544T
Authority: DE
Inventors: Ann Mary PELLEYMOUNTER; Francis Christopher TOOMBS; Michael Benjamin Mann
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1995-11-22
Filing date: 1996-11-04
Publication date: 2004-12-23
Anticipated expiration: 2016-11-05
Also published as: AU7607496A; AU763755B2; ATE259243T1; AU4265200A; AU4265300A; DE69631544D1; EP1285664A3; DK0866720T3; NZ527007A; JP2002206000A; CA2236163A1; MX9803992A; JP4173914B2; NZ511617A; WO1997018833A1; ATE455554T1; IL124442A0; EP0866720A1; AU763769B2; NZ512083A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von OB-Protein-Zusammensetzungen zur Herstellung eines Medikaments zur Erhöhung der mageren Körpermasse und ein Verfahren der kosmetischen Behandlung durch Erhöhen der mageren Körpermasse, um das äußere Erscheinungsbild zu verbessern, umfassend das Verabreichen von OB-Protein-Zusammensetzungen.
HINTERGRUND
Obwohl die molekulare Grundlage für Fettleibigkeit in weiten Teilen unbekannt ist, hat die Identifizierung des „OB-Gens" und des kodierten Proteins („OB-Protein") ein wenig Licht auf die Mechanismen geworfen, die der Körper verwendet, um die Körperfettablagerung zu regulieren. Zhang et al., Nature 372: 425–432 (1994); siehe ebenso die Berichtigung in Nature 374: 479 (1995). Das OB-Protein ist in vivo sowohl in ob/ob-mutanten Mäusen (Mäuse, die aufgrund eines Defekts in der Produktion des OB-Genprodukts fettleibig sind) als auch in normalen Wildtypmäusen aktiv. Die biologische Aktivität manifestiert sich unter anderem in einem Gewichtsverlust. Siehe allgemein Barinaga, „Obese" Protein Slims Mice, Science 269: 475–476 (1995).
Die anderen biologischen Effekte von OB-Proteinen sind nicht gut charakterisiert. Es ist zum Beispiel bekannt, daß in ob/ob-mutanten Mäusen die Verabreichung des OB-Proteins zu einer Abnahme der Serum-Insulin-Konzentrationen und Serum-Glukose-Konzentrationen führt. Es ist ebenso bekannt, daß die Verabreichung von OB-Protein zu einer Abnahme an Körperfett führt. Dies wurde sowohl in ob/ob-mutanten Mäusen als auch in nicht-fettleibigen normalen Mäusen beobachtet. Pelleymounter et al., Science 269: 540–543 (1995); Halaas et al., Science 269: 543–546 (1995). Siehe auch Campfield et al., Science 269: 546–549 (1995) (Periphere und zentrale Verabreichung von Mikrogramm-Dosen von OB-Protein verringerten die Nahrungsaufnahme und Körpergewicht von ob/ob- und Nahrungs-induzierten fettleibigen Mäu sen, aber nicht in db/db-fettleibigen Mäusen). In keinem dieser Berichte sind Toxizitäten beobachtet worden, noch nicht einmal bei den höchsten Dosierungen.
Die Aufklärung von anderen biologischen Effekten des OB-Proteins, insbesondere an Tieren, die möglicheweise nicht von einem Gewichtsverlust profitieren oder diesen möglicherweise nicht benötigen, wird zusätzliche Verwendungen für das OB-Protein bereitstellen.
Eine solche Verwendung, wie durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt, betrifft die Erhöhung der mageren Körpermasse.
Natürlich ist eine Modulation der Ernährungsweise und körperlicher Anstrengung ein Weg, um die Muskelgröße zu erhöhen. Es gibt ebenso Zusammensetzungen, die verwendet werden, um die magere Masse zu erhöhen. Gegenwärtige Zusammensetzungen, bei denen davon ausgegangen wird, daß sie die magere Körpermasse erhöhen, schließen anabole Steroide, wie etwa Testosteron und Derivate, und menschliches Wachstumshormon ein. Diese haben jedoch bekanntermaßen unerwünschte Nebenwirkungen. (Die Zusammenfassung unten wird vollständig in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) Kapitel 50 auf Seiten 948–1001 erklärt.))
Menschliches Wachstumshormon, wie etwa Protropin und Somatropin verursachen bekanntermaßen häufig Hypercalciurie, die gewöhnlich in 2 bis 3 Monaten zurückgeht. Hyperglykämie und Diabetes mellitus treten ebenfalls bekanntermaßen auf.
Myalgie und Kopfschmerzen am frühen Morgen sind als relativ häufig beobachtet worden, und gelegentlich können Fällen von Hypothyreoidismus und Übersättigung von Cholesterin in der Galle auftreten. Wenn die Epiphysen geschlossen sind, sollte das Hormon nicht verwendet werden, da eine kontinuierliche Stimulation des Wachstums der Phalangen und des Kieferknochens, nicht aber von anderen Knochen, abnorme Körperproportionen verursachen kann.
Anabole Steroide erhöhen die athletische Leistung und die Aggressivität. Ihre Verwendung ist von dem American College of Sports Medicine verurteilt worden. Die Leistung von Frauen wird verbessert, allerdings auf Kosten einer Vermännlichung und Akne vulgaris. Androgene verursachen Hirsutismus, ein Tiefer- oder Heiserwerden der Stimme, frühzeitige Pubertät und Epiphysenverschließung bei nicht ausgewachsenen Männern, erhöhte Libido (sowohl bei Männern als auch Frauen) Priapismus, Oligospermie und Testikelatrophie, Vergrößerung der Klitoris bei der Frau, Wallungen, verringertes Ejakulationsvolumen und Spermienpopulation, Gynäkomastie, Überempfindlichkeit, Akne, Gewichtszunahme, Ödem und Hypercalcämie. Eine verlängerte Verwendung erhöht die Aggressivität, manchmal in enormem Ausmaß, und viele Tätlichkeiten sollen auf einen Missbrauch von Androgenen zurückzuführen sein. Über Paranoia-artiges und anderes psychotisches Verhalten ist berichtet worden. Gallenstauung und Gelbsucht treten auf. Es wurde über einige Fälle von Hepatom nach einer langfristigen Therapie berichtet.
Es ist deshalb wünschenswert, eine therapeutische oder kosmetische Zusammensetzung zu haben, die die magere Körpermasse ohne die bei den gegenwärtig verfügbaren Arzneien beobachteten Nebenwirkungen erhöht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Beobachtung, daß die Verabreichung von OB-Protein an nicht-fettleibige als auch fettleibige Tiere zu einer Zunahme der mageren Körpermasse führt. Daher hat OB-Protein zusätzlich zu seiner Wirkung als ein gewichtsreduzierendes Mittel die Fähigkeit, als ein Mittel zu wirken, das die magere Körpermasse beeinflusst. Als solches werden zahlreiche die magere Körpermasse erhöhenden Therapien in Erwägung gezogen, sogar für Patienten, die nicht notwendigerweise von einer Verringerung des Gewichtes profitieren würden. Daher ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung von OB-Protein (oder Analoge und Derivate davon) zur Herstellung eines Medikaments zum Erhöhen der mageren Körpermasse, oder eine kosmetische Behandlung durch Erhöhen der mageren Körpermasse, um das äußere Erscheinungsbild zu verbessern.
Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die vorliegende Erfindung das Verringern der Konzentrationen an Insulin, die für die Behandlung von Diabetes notwendig sind. Die Zunahme an magerer Körpermasse mit einer einhergehenden Abnahme der Masse an Fettgewebe erhöht die Empfindlichkeit gegenüber Insulin. Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von OB-Protein (oder Analogen oder Derviaten davon) zum Verringern der Menge an Insulin, die für die Behandlung von Diabetes notwendig ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Wie oben festgestellt, sind die Verwendungen der vorliegenden Erfindung diejenigen zum Erhöhen der mageren Körpermasse in einem Individuum. Es ist beobachtet worden, daß diese Zunahme an magerer Körpermasse eine Abnahme an Fettmasse begleitet. Daher kann sogar, wenn die Verabreichung von OB-Protein (oder Analogen oder Derivaten davon) nicht zu dem erwünschten Ausmaß an Gewichtsverlust führt, die Verabreichung von OB-Protein dazu nützlich sein, die Körpermasse umzuformen, indem das Körperfett verringert wird, während die magere Masse erhöht wird.
Zusätzlich kann die Zunahme an magerer Körpermasse ein Individuum gegenüber Insulin empfindlicher machen, und daher betrifft die vorliegende Verwendung von OB-Protein (oder Analogen oder Derivaten davon) ebenso die Erhöhung der Insulinempfindlichkeit in einem Diabetes-Patienten. Während der genaue Wirkmechanismus unbestimmt ist, kann mageres Gewebe (z. B. Muskel), im Vergleich zu Fettgewebe, gegenüber den Wirkungen von Insulin empfindlicher sein. Deshalb kann eine Zunahme an magerem Gewebe mehr Zellen zur Verfügung stellen, die gegenüber Insulin empfindlich sind. Darüberhinaus kann eine Eliminierung von Fett- (z. B. adipösem) Gewebe den zusätzlichen Vorteil haben, daß das magere Gewebe zusätzlich der peripheren Zirkulation ausgesetzt wird, in der zirkulierendes Insulin gefunden wird. Es ist deshalb ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung, daß ein Verfahren zum Erhöhen der Empfindlichkeit gegenüber Insulin bereitgestellt wird. Auf andere Art gesagt, ein Verfahren zum Verringern der Dosierung von Insulin, die von einem Diabetiker benötigt wird, wird somit ebenso bereitgestellt.
Die Zunahme an magerem Gewebe kann eine Zunahme an Muskelgewebe sein. Es wird beobachtet, daß eine solche Zunahme eine Zunahme insgesamt ist, anstelle von auf bestimmte Gebiete lokalisiert zu sein (z. B. Beispiele 1 und 2 unten). Als solches kann die Körperkraft insgesamt zunehmen. Einer Zunahme an Körperkraft insgesamt können andere Vorteile folgen, wie etwa eine Abnahme an Knochenresorption, mit dem Potential, eine Zerbrechlichkeit umzukehren oder zu verbessern, wie etwa Osteoporose. Bei Patienten, die eine verbessern athletische Leistung wünschen, kann auch eine Zunahme an Körperkraft insgesamt bereitgestellt werden. Eine Zunahme der Produktion von roten Blutkörperchen oder deren Wirksamkeit kann es ebenso wie eine Zunahme an mit Sauerstoff angereicherten Blut geben. Als solches kann die mentale ebenso wie die physische Leistung verbessert werden.
Das OB-Protein kann aus rekombinantem murinem, unten dargestellt, (SEQ ID NO: 2) oder rekombinantem menschlichen Protein, wie dargestellt in Zhang et al., Nature, oben, hierin einbezogen durch Bezugnahme) oder aus denjenigen Proteinen ausgewählt werden, denen ein Glutaminrest an Position 28 fehlt. (Siehe Zhang et al, Nature, oben, auf Seite 428). Man kann ebenso das rekombinante menschliche OB-Protein-Analog verwenden, wie dargestellt in SEQ ID NO: 4, das 1) ein Arginin anstelle von Lysin an Position 35 und 2) ein Leucin anstelle von Isoleucin an Position 74 enthält. (Eine Kurzschriftabkürzung für dieses Analog ist das rekombinante menschliche R→K³⁵, L→I⁷⁴). Die Aminosäuresequenzen für die rekombinanten menschlichen Analog- und rekombinanten murinen Proteine werden unten dargestellt mit einem Methioninrest an der -1-Position, jedoch kann, wie mit allen vorliegenden OB-Proteinen und -Analogen der Methioninrest abwesend sein.
Das murine Protein ist im wesentlichen homolog zu dem menschlichen Protein, insbesondere als matures Protein, und weiter insbesondere am N-Terminus. Man kann ein Analog des rekombinanten menschlichen Proteins durch Verändern (wie etwa durch Substituieren von Aminosäureresten), in der rekombinanten menschlichen Sequenz, der Aminosäuren herstellen, die von der murinen Sequenz abweichen. Da das rekombinante menschliche Protein biologische Aktivität in Mäusen hat, wäre ein solches Analaog wahrscheinlich in Menschen aktiv. Zum Beispiel kann man unter Verwendung eines menschlichen Proteins mit einem Lysin an Rest 35 und einem Isoleucin an Rest 74 gemäß der Numerierung von SEQ ID NO: 4, wobei die erste Aminosäure Valin und die Aminosäure an Position an 146 Cystein ist, eine oder mehrere der Aminosäuren an Positionen 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 und 145 durch eine andere Aminosäure austauschen. Man kann die Aminosäure an der entsprechenden Position des murinen Proteins (SEQ ID NO: 2) oder eine andere Aminosäure auswählen. Man kann weiterhin „Konsensus"-Moleküle herstellen auf der Grundlage der Ratten-OB-Protein-Sequenz. Murakami et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 209: 944–952 (1995), hierin einbezogen durch Bezugnahme. Ratten-OB-Protein unterscheidet sich von menschlichem OB-Protein an den folgenden Positionen (unter Verwendung der Numerierung von SEQ ID NO: 4): 4, 32, 33, 35, 50, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138 und 145. Man kann eine oder mehrere der Aminosäuren an diesen divergierenden Positionen durch eine andere Aminosäure substituieren. Die Positionen in fettem Druck sind diejenigen, an denen das murine OB-Protein ebenso wie das Ratten-OB-Protein von dem menschlichen OB-Protein divergieren und somit besonders für eine Veränderung geeignet sind. An einer oder mehreren dieser Positionen kann man eine Aminosäure von dem entsprechenden Ratten-OB-Protein oder eine andere Aminosäure substituieren.
Die Positionen von sowohl Ratten- als auch murinem OB-Protein, die von dem reifen humanen OB-Protein divergieren sind: 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 und 145. Ein menschliches OB-Protein gemäß SEQ ID NO: 4 (mit Lysin an Position 35 und Isoleucin an Position 74) mit einer oder mehreren der obigen Aminosäuren deletiert oder ersetzt durch eine andere Aminosäure, wie etwa die Aminosäure, die in der entsprechenden Ratten- oder murinen Sequenz gefunden wird, kann ebenso wirksam sein.
Zusätzlich sind die Aminosäuren, die in Rhesusaffen-OB-Protein gefunden werden, die von dem menschlichen OB-Protein divergieren (mit identischen Aminosäuren in Klammern in Einbuchstaben-Aminosäuren-Abkürzung aufgeführt): 8 (S), 35 (R), 48 (V), 53 (Q), 60 (I), 66 (I), 67 (N), 68 (L), 89 (L), 100 (L), 108 (E), 112 (D) und 118 (L). Da (wie in Beispiel 2 unten beschrieben) das rekombinante menschliche OB-Protein in Cynomolgus-Affen aktiv ist, kann ein menschliches OB-Protein gemäß SEQ ID NO: 4 (mit Lysin an Position 35 und Isoleucin an Position 74) wirksam sein, das eine oder mehrere der Rhesusaffen-divergenten Aminosäuren durch eine andere Aminosäure, wie etwa die Aminosäure in Klammern, ersetzt hat. Es sollte beachtet werden, daß bestimmte Rhesus-divergierende Aminosäuren ebenso diejenigen sind, die in den obigen murinen Spezies gefunden werden (Positionen 35, 68, 89, 100 und 112). Daher kann man ein murines/Rhesus/menschliches Konsensus-Molekül erzeugen, das (unter Verwendung der Numerierung aus SEQ ID NO: 4 mit einem Lysin an Position 35 und einem Isoleucin an Position 74) eine oder mehrere der Aminosäuren an Positionen durch eine andere Aminosäure ersetzt hat: 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 und 145.
Andere Analoge können durch Deletieren eines Teils der Proteinaminosäuresequenz hergestellt werden. Zum Beispiel fehlt dem reifen Protein eine Leader-Sequenz (–22 bis –1). Man kann die folgenden trunkierten Formen von menschlichen OB-Proteinmolekülen herstellen (unter Verwendung der Numerierung von SEQ ID NO: 4):

(a) Aminosäuren 98–146
(b) Aminosäuren 1–32
(c) Aminosäuren 40–116
(d) Aminosäuren 1–99 und (verbunden mit) 112–146.
(e) Aminosäuren 1–99 und (verbunden mit) 112–146 mit einer oder mehreren der Aminosäuren 100–111 zwischen Aminosäuren 99 und 112 gebracht.

Zusätzlich können die trunkierten Formen ebenso eine oder mehrere der Aminosäuren verändert haben, die von menschlichem OB-Protein divergieren (in dem Rhesus-, Ratten- oder murinen OB-Protein). Darüberhinaus können alle Veränderungen in der Form von veränderten Aminosäuren sein, wie etwa Peptidomimetika oder D-Aminosäuren.
Das vorliegende Protein (hierein wird der Begriff „Protein" so verwendet, daß er „Peptid" und OB-Analoge einschließt, wie etwa die unten aufgeführten, sofern nicht anders angezeigt) kann ebenso durch das Anhängen von einer oder mehreren chemischen Gruppen an die Proteingruppe derivatisiert werden. Die chemisch modifizierten Derivate können weiter für intraarterielle, intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane, intravenöse, orale, nasale, pulmonale, topische oder andere Verabreichungsrouten formuliert werden. Es ist gefunden worden, daß eine chemische Modifizierung von biologisch aktiven Proteinen unter bestimmten Bedingungen zusätzliche Vorteile bereitstellen kann, wie etwa die Erhöhung der Stabilität und der Zirkulationszeit des therapeutischen Proteins und eine Verringerung der Immunogenizität. Siehe US-Patente Nr. 4,179,337, Davis et al., erteilt am 18. Dezember 1979. Für einen Übersichtsartikel siehe Abuchowski et al., in Enzymes as Drugs. (J. S. Holcerberg and J. Roberts, eds. Seiten 367–383 (1981)). Ein Übersichtsartikel, beschreibend Proteinmodifizierung und Fusionsproteine, ist Francis, Focus on Growth Factors 3: 4–10 (Mai 1992) (veröffentlicht von Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20, OLD, UK).
Die chemischen Gruppen, die für die Derivatisierung geeignet sind, können von verschiedenen wasserlöslichen Polymeren ausgewählt werden. Das ausgewählte Polymer sollte wasserlöslich sein, so daß das Protein, an welches es angehängt ist, in einer wäßrigen Umgebung nicht ausfällt, wie etwa einer physiologischen Umgebung. Bevorzugt wird für die therapeutische Verwendung der Endproduktzubereitung das Polymer pharmazeutisch akzeptabel sein. Ein Fachmann wird in der Lage sein, das erwünschte Polymer auf der Grundlage von solchen Überlegungen auszuwählen, wie, ob das Polymer/Protein-Konjugat therapeutisch verwendet werden wird, und, wenn dies der Fall ist, erwünschte Dosierung, Zirkulationszeit, Widerstandsfähigkeit gegenüber Proteolyse und andere Überlegungen. Für die vorliegenden Protei ne und Peptide kann die Wirksamkeit der Derivatisierung durch Verabreichung des Derivats in der erwünschten Form (d. h. mittels osmotischer Pumpe, oder bevorzugter, durch Injektion oder Infusion, oder weiter formuliert für orale, pulmonale oder nasale Abgaben zum Beispiel) und durch Beobachten der biologischen Effekte, wie hierin beschrieben, bestätigt werden.
Das wasserlösliche Polymer kann aus der Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus z. B. Polyethylenglycol, Copolymere von Ethylenglycol/Propylenglycol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Poly-1,3-dioxolan, Poly-1,3,6-trioxan, Ethylen/Maleinsäureanhydrid-Copolymer, Polyaminosäuren (entweder Homopolymere oder statistische oder nicht-statistische Copolymere), und Dextran oder Poly(n-Vinylpyrrolidon)polyethylenglycol, Propylenglycolhomopolymere, Polypropylenoxid/Ethylenoxid-Copolymere, Polyoxyethylierte Polyole, Polystyrolmaleat und Polyvinylalkohol. Polyethylenglykolpropionaldehyd kann aufgrund seiner Stabilität in Wasser Vorteile bei der Herstellung haben.
Fusionsproteine können hergestellt werden, indem man Polyaminosäuren an die OB-Protein- (oder Analog-)Gruppe anhängt. Zum Beispiel kann die Polyaminosäure ein Trägerprotein sein, das dazu dient, die Zirkulationshalbwertszeit des Proteins zu erhöhen. Für die vorliegenden therapeutischen oder kosmetischen Zwecke sollte eine solche Polyaminosäure diejenigen sein, die keine neutralisierende Antigenantwort oder eine andere nachteilige Antwort erzeugen. Eine solche Polyaminosäure kann ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Serumalbumin (wie etwa menschliches Serumalbumin), einem Antikörper oder einem Teil davon (wie etwa einer konstanten Antikörperregion, manchmal als „F_C" bezeichnet) oder anderen Polyaminosäuren. Wie unten angezeigt, kann der Ort des Anhängens der Polyaminosäure am N-Terminus der OB-Protein-Gruppe oder einem anderen Ort sein und kann ebenso durch eine chemische „Linker"-Grupper mit dem OB-Protein verknüpft sein.
Das Polymer kann jedes Molekulargewicht haben und kann verzweigt oder unverzweigt sein. Für Polyethylenglycol liegt das bevorzugte Molekulargewicht zwischen ungefähr 2 kDa und ungefähr 100 kDa (wobei der Begriff „ungefähr" darauf hinweist, daß in Zubereitungen mit Polyethylenglycol einige Moleküle mehr, einige weniger als das aufgeführte Molekulargewicht wiegen werden), um die Behandlung und die Herstellung zu erleichtern. Andere Größen können verwendet werden, abhängig von dem erwünschten therapeutischen Profil (z. B. der Dauer der erwünschten verzögerten Freisetzung, den Effekten, sofern vorhanden, auf die bio logische Aktivität, die Leichtigkeit bei der Handhabung, dem Grad oder Mangel an Antigenizität und anderen bekannten Effekten des Polyethylenglycols auf ein therapeutisches Protein oder Analog).
Die Anzahl an Polymermolekülen, die so angehängt werden, kann variieren, und ein Fachmann wird in der Lage sein, den Effekt auf die Funktion zu bestimmen. Man kann mono-derivatisieren oder kann eine di-, tri-, tetra- oder irgendeine Derivatisierungskombination mit denselben oder unterschiedlichen chemischen Gruppen (z. B. Polymeren, wie etwa unterschiedliche Gewichte von Polyethylenglykolen) bereitstellen. Das Verhältnis von Polymermolekülen zu Proteinen- (oder Peptid-) Molekülen wird variieren, ebenso wie ihre Konzentrationen in der Reaktionsmischung. Im allgemeinen wird das optimale Verhältnis (hinsichtlich der Reaktionseffizienz dahingehend, daß es keinen Überschuß an nicht-umgesetztem Protein oder Polymer gibt) anhand von Faktoren bestimmt werden, wie etwa dem erwünschten Derivatisierungsgrad (z. B. Mono-, Di-, Tri-, etc.), dem Molekulargewicht des ausgewählten Polymers, ob das Polymer verzweigt oder nicht-verzweigt ist, und den Reaktionsbedingungen.
Die chemischen Gruppen sollten an das Protein unter Berücksichtigung der Effekte auf die funktionellen oder antigenen Domänen des Proteins angehängt werden. Es gibt eine Vielzahl von Anhängungsmethoden, die Fachleuten zur Verfügung stehen. Z. B. EP 0 401 384 , hierin durch Bezugnahme aufgenommen (Kopplung von PEG und G-CSF), siehe ebenso Malik et al., Exp. Hematol. 20: 1028–1035 (1992) (Bericht über Pegylierung von GM-CSF unter Verwendung von Tresylchlorid). Zum Beispiel kann Polyethylenglykol kovalent durch Aminosäurereste über eine reaktive Gruppe gebunden werden, wie etwa eine freie Amino- oder Carboxylgruppe. Reaktive Gruppen sind diejenigen, an die ein aktiviertes Polyethylenglykolmolekül gebunden werden kann. Die Aminosäurereste mit einer freien Aminogruppe können Lysinreste und den N-terminalen Aminosäurerest einschließen. Diejenigen mit einer freien Carboxylgruppe können Asparaginsäurereste, Glutaminsäurereste und den C-terminalen Aminosäurerest einschließen. Sulfhydrylgruppen können ebenso als eine reaktive Gruppe zum Anhängen des (der) Polyethylenglykolmoleküls (Polyethylenglykolmoleküle) verwendet werden. Bevorzugt für therapeutische Zwecke ist die Anhängung an eine Aminogruppe, wie etwa Anhängung an den N-Terminus oder eine Lysingruppe. Die Anhängung an Resten, die für die Rezeptorbindung wichtig sind, sollte vermieden werden, wenn Rezeptorbindung erwünscht ist.
Möglicherweise ist spezifisch ein N-terminal chemisch modifiziertes Protein erwünscht. Unter Verwendung von Polyethylenglykol als eine Erläuterung der vorliegenden Zusammensetzungen kann man aus einer Vielzahl von Polyethylenglykolmolekülen (anhand von Molekuargewicht, Verzweigung etc.), das Verhältnis von Polyethylenglykolmolekülen zu Proteinmolekülen in der Reaktionsmischung, den durchzuführenden Typ der Pegylierungsreaktion und das Verfahren zum Erhalten des ausgewählten N-terminal pegylierten Proteins auswählen. Das Verfahren zum Erhalten der N-terminal pegylierten Zubereitung (d. h. Trennen dieser Gruppe von anderen mono-pegylierten Gruppen, sofern notwendig), kann mittels Aufreinigung des N-terminal pegylierten Materials aus einer Population von pegylierten Proteinmolekülen erfolgen. Eine selektive N-terminale chemische Modifizierung kann über eine reduktive Alkylierung erzielt werden, die unterschiedliche Reaktivität von verschiedenen Typen von primären Aminogruppen ausnützt (Lysin gegen den N-Terminus), die zur Derivatisierung in einem bestimmten Protein zur Verfügung stehen. Unter den geeigneten Reaktionsbedingungen wird eine im wesentlichen selektive Derivatisierung des Proteins am N-Terminus mit einem Carbonylgruppen-enthaltenden Polymer erzielt. Zum Beispiel kann man das Protein selektiv N-terminal pegylieren, indem man die Reaktion bei einem pH durchführt, der es einem ermöglicht, die pK_a-Unterschiede zwischen der ε-Aminogruppe der Lysinreste und der α-Aminogruppe des N-terminalen Restes des Proteins auszunutzen. Durch eine solche selektive Derivatisierung wird die Anhängung eines wasserlöslichen Polymers an ein Protein kontrolliert: Die Konjugation mit dem Polymer findet überwiegend am N-Terminus des Proteins statt, und keine signifikante Modifizierung von anderen reaktiven Gruppen, wie etwa der Lysinseitenkettenaminogruppen, findet statt. Unter Verwendung von reduktiver Alkylierung kann das wasserlösliche Polymer von dem oben beschriebenen Typ sein und sollte ein einzelnes reaktives Aldehyd zum Koppeln an das Protein haben. Polyethylenglykolpropionaldehyd, enthaltend ein einzelnes reaktives Aldehyd, kann verwendet werden.
Ein N-terminal monopegyliertes Derivat wird aus Gründen der leichten Herstellung eines Therapeutikums bevorzugt. N-terminale Pegylierung stellt ein homogenes Produkt sicher, da die Charakterisierung des Produktes relativ zu di-, tri- oder anderen multi-pegylierten Produkten vereinfacht ist. Die Verwendung des obigen reduktiven Alkylierungsprozesses zur Herstellung eines N-terminalen Produkts wird aus Gründen der erleichterten kommerziellen Herstellung bevorzugt.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Verwendung von pharmazeutischen Zusammensetzungen der Proteine und Derivate bereitgestellt. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können zur Verabreichung mittels Injektion oder für orale, pulmonale, nasale, transdermale oder andere Formen der Verabreichung dienen. Im allgemeinen werden von der Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen umfaßt, die wirksame Mengen an Protein oder Derivatprodukten der Erfindung zusammen mit pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Löslichkeitsvermittlern, Emulgatoren, Adjuvantien und/oder Trägern umfassen. Solche Zusammensetzungen schließen Verdünnungsmittel mit verschiedenem Puffergehalt (z. B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat), pH und Ionenstärke, Zusatzstoffe, wie etwa Detergenzien, und löslichkeitsvermittelnde Agenzien (z. B. Tween 80, Polysorbat 80), Antioxidantien (z. B. Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit), Konservierungsmittel (z. B. Thimersol, Benzylalkohol) und Füllsubstanzen (z. B. Laktose, Mannitol), den Einbau des Materials in partikuläre Zubereitungen von polymeren Verbindungen, wie etwa Polymilchsäure, Polyglycolsäure etc. oder in Liposomen ein. Hyaluronsäure kann ebenso verwendet werden, und dies kann den Effekt haben, eine verlängerte Dauer im Kreislauf zu fördern. Solche Zusammensetzungen können den physikalischen Zustand, Stabilität, die in-vivo-Freisetzungsrate und die in-vivo-Clearance-Rate der vorliegenden Proteine und Derivate beeinflussen. Siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) Seiten 1435–1712, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden. Die Zusammensetzungen können in flüssiger Form zubereitet werden oder können in getrockneter Pulverform, wie etwa lyophylisierter Form vorliegen. Implantierbare Formulierungen mit verzögerter Freisetzung werden ebenso in Erwägung gezogen, ebenso wie transdermale Formulierungen.
Es werden zur Verwendung hierin orale Festdosierungsformen in Erwägung gezogen, die allgemein in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage 1990 (Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) in Kapitel 89 beschrieben werden, was hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Feste Dosierungsformen schließen Tabletten, Kapseln, Pillen, Trochiscen oder Pastillen, Cachets oder Pellets ein. Ebenso kann eine Liposomen- oder Protein-Verkapselung verwendet werden, um die vorliegenden Zusammensetzungen zu formulieren (wie zum Beispiel Protein-Mikrosphären, über die in US-Patent Nr. 4,925,673 berichtet wird). Liposomenverkapselung kann verwendet werden, und die Liposomen können mit verschiedenen Polymeren derivatisiert werden (z. B. US-Patent Nr. 5,013,556). Eine Beschreibung von möglichen Festdosierungsformen für das Therapeutikum wird von Marshall, K. In: Modern Pharmaceu tics Edited by G. S. Banker und C. T. Rhodes, Kapitel 10, 1979 gegeben, hierin aufgenommen durch Bezugnahme. Im allgemeinen wird die Formulierung das Protein (oder Analog oder Derivat) und inerte Inhaltsstoffe einschließen, die einen Schutz gegen die Magenumgebung und eine Freisetzung des biologischen aktiven Materials im Darm ermöglichen.
Ebenso spezifisch in Erwägung gezogen werden orale Dosierungsformen der obigen derivatisierten Proteine. Proteine können chemisch modifiziert werden, so daß eine orale Verabreichung des Derivats wirksam ist. Im allgemeinen ist die in Erwägung gezogene chemische Modifizierung das Anhängen von wenigstens einer Gruppe an das Protein- (oder Peptid-) Molekül selbst, wobei besagte Gruppe (a) die Inhibition der Proteolyse und (b) die Aufnahme in den Blutstrom vom Magen oder Darm ermöglicht. Ebenso erwünscht ist die Zunahme an Gesamtstabilität des Proteins und Zunahme an Zirkulationszeit im Körper. Beispiele für solche Gruppen schließen ein: Polyethylenglykol, Copolymere von Ethylenglykol und Propylenglykol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Polyprolin. Abuchowski und Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts. In: "Enzymes as Drugs", Hocenberg und Roberts, Aufl., Wiley-Interscience, New York, NY, (1981), S. 367–383; Newmark, et al., J. Appl. Biochem. 4: 185–189 (1982). Andere Polymere, die verwendet werden könnten, sind Poly-1,3-dioxolan und Poly-1,3,6-tioxocan.
Für das Protein (oder Derivat) kann der Ort der Freisetzung der Magen, der Dünndarm (das Duodenum, das Jejunum oder das Ileum), oder der Dickdarm sein. Ein Fachmann verfügt über Formulierungen, die sich nicht im Magen auflösen werden, jedoch das Material im Duodenum oder anderswo im Darm freisetzen werden. Bevorzugt wird die Freisetzung die nachteiligen Effekte der Magenumgebung vermeiden, entweder durch Schutz des Proteins (oder Derivats) oder durch Freisetzung des biologisch aktiven Materials über die Magenumgebung hinaus, wie etwa im Darm.
Um eine vollständige Magenresistenz sicherzustellen, ist eine Beschichtung essentiell, die gegenüber wenigstens pH 5,0 undurchlässig ist. Beispiele für die häufigeren inerten Inhaltsstoffe, die als enterische Beschichtungen verwendet werden, sind Celluloseacetattrimellitat (CAT), Hydroxypropylmethylcellulosephthalat (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, Polyvinylacetatphthalat (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, Celluloseacetatphthalat (CAP), Eudragit L, Eudragit S und Schellack. Diese Beschichtungen können als gemischte Filme verwendet werden.
Eine Beschichtung oder Mischung von Beschichtungen kann ebenso auf Tabletten verwendet werden, die nicht zum Schutz gegen den Magen vorgesehen sind. Dies kann Zuckerbeschichtungen oder Beschichtungen einschließen, die die Tablette leichter zu schlucken machen. Kapseln können aus einer harten Schale bestehen (wie etwa Gelatine), zur Abgabe des trokkenen Therapeutikums, d. h. Pulvers; für flüssige Formen kann eine weiche Gelatineschale verwendet werden. Das Schalenmaterial von Cachets könnte dicke Stärke oder anderes eßbares Papier sein. Für Pillen, Pastillen, verschmolzene Tabletten und Tablettentrituraten können Feuchtverarbeitungstechniken verwendet werden.
Das Therapeutikum kann in der Formulierung als feine multipartikuläre Teilchen in der Form von Granula oder Pellets mit einer Partikelgröße von ungefähr 1 mm eingeschlossen sein. Die Formulierung des Materials für die Kapselverabreichung könnte ebenso als ein Pulver, leicht komprimierte Klümpchen oder sogar als Tabletten sein. Das Therapeutikum könnte mittels Kompression zubereitet werden.
Farbstoffe und Aromastoffe können alle eingeschlossen werden. Zum Beispiel kann das Protein (oder Derivat) formuliert werden (wie etwa mittels Liposom- oder Mikrosphären-Verkapselung) und dann weiterhin innerhalb eines eßbaren Produktes eingebaut werden, wie etwa einem gekühlten Getränk, enthaltende Farbstoffe und Aromamittel.
Man kann das Volumen des Therapeutikums mit einem inerten Material verdünnen oder erhöhen. Diese Verdünnungsmittel könnten Kohlenhydrate, insbesondere Mannitol, α-Laktose, wasserfreie Laktose, Cellulose, Saccharose, modifizierte Dextrane und Stärke einschließen. Bestimmte anorganische Salze können ebenso als Füllmaterialien verwendet werden, einschließlich Calciumtriphosphat, Magnesiumcarbonat und Natriumchlorid. Einige kommerziell erhältliche Verdünnungsmittel sind Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress und Avicell.
Zersetzungsmittel können in den Formulierungen des Therapeutikums in eine feste Dosierungsform eingebaut werden. Materialien, die als Zersetzungsmittel verwendet werden, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Stärke, einschließlich des kommerziellen Zersetzungsmittels, beruhend auf Stärke, Explotab. Natriumstärkeglycolat, Amberlite, Natriumcarboxymethylcellulose, Ultramylopectin, Natriumalginat, Gelatine, Orangenschale, Säurecarbo xymethylcellulose, natürlicher Schwamm und Bentonit können alle verwendet werden. Eine andere Form der Zersetzungsmittel sind die unlöslichen Kationenaustauschharze. Pulverisierte Gummis können als Zersetzungsmittel und als Bindemittel verwendet werden, und diese können pulverisierte Gummis, wie etwa Agar, Karaya oder Tragant einschließen. Alginsäure und ihr Natriumsalz sind ebenso als Zersetzungsmittel nützlich.
Bindemittel können verwendet werden, um das therapeutische Mittel zusammenzuhalten, um eine harte Tablette zu bilden, und schließen Materialien aus natürlichen Produkten, wie etwa Akazie, Tragant, Stärke und Gelatine ein. Andere schließen Methylcellulose (MC), Ethylcellulose (EC) und Carboxymethylcellulose (CMC) ein. Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) könnten beide in alkoholischen Lösungen verwendet werden, um das Therapeutikum zu granulieren.
Ein reibungsverminderndes Mittel kann in der Formulierung des Therapeutikums eingebaut werden, um ein Zusammenkleben während des Formulierungsprozesses zu verhindern. Schmiermittel können als eine Schicht zwischen dem Therapeutikum und der Formwand verwendet werden, und diese können einschließen, sind aber nicht beschränkt auf Stearinsäure, einschließlich ihrer Magnesium und Calciumsalze, Polytetrafluorethylen (PTFE), flüssiges Paraffin, pflanzliche Öle und Wachse. Lösliche Schmiermittel können ebenso verwendet werden, wie etwa Natriumlaurylsulfat, Magnesiumlaurylsulfat, Polyethyleneglycol mit verschiedenen Molekulargewichten, Carbowax 4000 und 6000.
Gleitmittel, die die Fließeigenschaften der Arznei während der Formulierung verbessern könnten und um eine Umordnung während der Kompression zu unterstützen, könnten zugegeben werden. Die Gleitmittel können Stärke, Talk, pyrogenes Siliciumdioxid und hydratisiertes Silicoaluminat einschließen.
Um die Auflösung des Therapeutikums in die wäßrige Umgebung zu erleichtern, könnte ein oberflächenaktives Mittel als Feuchthaltemittel zugegeben werden. Oberflächenaktive Mittel können anionische Detergenzien einschließen, wie etwa Natriumlaurylsulfat, Dioctylnatriumsulfosuccinat und Dioctylnatriumsulfonat. Kationische Detergenzien können verwendet werden und könnten Benzalkoniumchlorid oder Benzethoniumchlorid einschließen. Die Liste von potentiellen nicht-ionischen Detergenzien, die in der Formulierung als oberflächenaktive Mittel eingeschlossen werden könnten, sind Lauromacrogol 400, Polyoxyl 40 Stearat, Polyoxye thylen-hydriertes Rizinusöl 10, 50 und 60, Glycerolmonostearat, Polysorbat 40, 60, 65 und 80, Saccharose-Fettsäureester, Methylcellulose und Carboxymethylcellulose. Diese oberflächenaktiven Mittel könnten in der Formulierung des Proteins oder Derivats entweder allein oder al seine Mischung in unterschiedlichen Verhältnissen vorhanden sein.
Zusatzstoffe, die potentiell die Aufnahme des Proteins (oder Derivats) erhöhen, sind zum Beispiel die Fettsäuren Ölsäure, Linolsäure und Linolensäure.
Formulierungen mit kontrollierter Freisetzung können erwünscht sein. Die Arznei könnte in eine inerte Matrix eingebaut werden, die die Freisetzung mittels entweder Diffusion oder einem Leckmechanismus ermöglicht, d. h. Gummis. Langsam sich zersetzende Matrizes können ebenso in die Formulierung eingebaut sein. Eine andere Form der kontrollierten Freisetzung dieses Therapeutikums ist mit Hilfe eines Verfahrens auf der Grundlage des Oros-Therapeutikum-Systems (Alza Corp.), d. h. die Arznei ist in einer semipermeablen Membran eingeschlossen, die einen Wassereintritt ermöglicht und Arznei durch eine einzelne kleine Öffnung aufgrund von Osmoseeffekten hinausdrückt. Einige enterische Beschichtungen haben ebenso einen verzögerten Freisetzungseffekt.
Andere Beschichtungen können für die Formulierung verwendet werden. Diese schließen eine Vielzahl von Zuckern ein, die in einer Beschichtungspfanne aufgetragen werden könnten. Das therapeutische Mittel könnte ebenso in einer Filmtablette gegeben werden, und die Materialien, die in diesem Falle verwendet werden, werden in zwei Gruppen aufgeteilt. Die ersten sind die nicht-enterischen Materialien und schließen Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Methylhydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, Providon und die Polyethylenglycole ein. Die zweite Gruppe besteht aus den enterischen Materialien, die häufig Ester der Phthalsäure sind.
Eine Mischung der Materialien könnte verwendet werden, um die optimale Filmbeschichtung bereitzustellen. Die Filmbeschichtung kann in einem Pfannenbeschichter oder in einem Flüssigbett oder mittels Kompressionsbeschichtung durchgeführt werden.
Ebenso hierin in Erwägung gezogen wird eine pulmonale Abgabe des vorliegenden Proteins oder Derivats davon. Das Protein (Derivat) wird an die Lungen eines Säugetiers bei der Inhalation abgegeben und durchläuft die Lungenschleimhaut in den Blutstrom. (Andere Berichte hierüber schließen Adjei et al., Pharmaceutical Research 7: 565–569 (1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics 63: 135–144 (1990) (Leuprolidacetat); Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology 13(suppl. 5): S. 143–146 (1989) (Endothelin-1); Hubbard et al., Annals of Internal Medicine 3: 206–212 (1989) (α1-Antitrypsin); Smith et al., J. Clin. Invest. 84: 1145–1146 (1989) (α-1-Proteinase); Oswein et al., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, 1990 (rekombinantes menschliches Wachstumshormon); Debs et al., The Journal of Immunology 140: 3482–3488 (1988) (Interferon-γ and Tumornekrosefaktor-alpha) und Platz et al., U.S. Patent Nr. 5,284,656 (Granulocyten-Kolonie-stimulierender Faktor).
Bei der Ausübung dieser Erfindung werden eine Vielzahl von mechanischen Vorrichtungen in Erwägungen gezogen, die zur pulmonalen Abgabe von therapeutischen Produkten angelegt sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Vernebelungsgeräte, Inhalatoren mit abgemessener Dosis und Pulver-Inhalatoren, die alle den Fachleuten bekannt sind.
Eine spezifische Beispiele für kommerziell erhältliche Vorrichtungen, die für die Ausübung dieser Erfindung geeignet sind, sind der Ultravent-Vernebeler, hergestellt von Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; der Acorn II-Vernebeler, hergestellt von Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; der Ventolin-Inhalator mit abgemessener Dosis, hergestellt von Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; und der Spinhaler-Pulver-Inhalator, hergestellt von Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.
Alle solche Vorrichtungen erfordern die Verwendung von Formulierungen, die für die Abgabe von Protein (oder eines Analogs oder Derivats davon) geeignet sind. Typischerweise ist jede Formulierung für den Typ von verwendeter Vorrichtungen spezifisch und kann die Verwendung eines geeigneten Treibmittel-Materials beinhalten, zusätzlich zu Verdünnungsmitteln, Adjuvantien und/oder Trägern, die bei der Therapie nützlich sind.
Das Protein (oder Derivat) sollte am vorteilhaftesten in partikulärer Form zubereitet sein mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von weniger als 10 μm (oder Mikron), am bevorzugtesten 0,5 bis 5 μm, für die effektivste Abgabe an die distale Lunge.
Träger schließen Kohlenhydrate, wie etwa Trehalose, Mannitol, Xylitol, Saccharose, Laktose und Sorbitol ein. Andere Inhaltsstoffe zur Verwendung bei Formulierungen können DPPC, DOPE, DSPC und DOPC einschließen. Natürliche oder synthetische oberflächenaktive Mittel können verwendet werden. Polyethylenglycol kann verwendet werden (abgesehen von seiner Verwendung beim Derivatisieren des Proteins oder Analog). Dextrane, wie etwa Cyclodextran, können verwendet werden. Gallensalze und andere verwandte Verstärker können verwendet werden. Cellulose und Cellulosederivate können verwendet werden. Aminosäuren können verwendet werden, wie etwa zur Verwendung in einer Pufferformulierung.
Ebenso wird die Verwendung von Liposomen, Mikrokapseln oder Mikrosphären, Einschlußkomplexen, oder andere Typen von Trägern in Erwägung gezogen.
Formulierungen, die zur Verwendung mit einem Vernebelungsgerät geeignet sind, entweder mit Düse oder Ultraschall, werden typischerweise Protein (oder Derivat) umfassen, aufgelöst in Wasser bei einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis 25 mg biologisch aktives Protein pro ml Lösung. Die Formulierung kann ebenso einen Puffer und einen einfachen Zucker enthalten (z. B. für die Proteinstabilisierung und Regulierung des osmotischen Drucks). Die Formulierung für das Vernebelungsgerät kann ebenso ein oberflächenaktives Mittel enthalten, um eine Oberlächen-induzierte Aggregation des Proteins zu verringern oder zu verhindern, die durch die Atomisierung der Lösung beim Bilden des Aerosols verursacht wird.
Formulierungen zur Verwendung mit einem Inhalationsgerät mit abgemessener Dosierung werden im allgemeinen ein fein verteiltes Pulver umfassen, enthaltend das Protein (oder Derivat), suspendiert in einem Treibmittel mit der Hilfe eines oberflächenaktiven Mittels. Das Treibmittel kann jedes herkömmliche Material sein, das zu diesem Zwecke verwendet wird, wie etwa ein Chlorfluorkohlenstoff, ein Chlorfluorkohlenwasserstoff, ein Fluorkohlenwasserstoff oder ein Kohlenwasserstoff, einschließlich Trichlorfluormethan, Dichlordifluormethan, Dichlortetrafluorethanol und 1,1,1,2-Tetrafluorethan, oder Kombinationen davon. Geeignete oberflächenaktive Mittel schließen Sorbitantrioleat und Sojalecithin ein. Ölsäure kann ebenso als ein oberflächenaktives Mittel nützlich sein.
Formulierungen zum Abgeben aus einer Pulverinhalationsvorrichtung werden ein fein zerteiltes trockenes Pulver, enthaltend Protein (oder Derivat) umfassen, und können ebenso ein Füllmittel, wie etwa Laktose, Sorbitol, Saccharose, Mannitol, Trehalose oder Xylitol in Mengen enthalten, die eine Verteilung des Pulvers von der Vorrichtung erleichtern, z. B. 50 bis 90 Gew.-% der Formulierung.
Nasale Abgabe des Proteins (oder Analogs oder Derivats) wird ebenso in Erwägung gezogen. Die nasale Abgabe ermöglicht die Passage des Proteins in den Blutstrom direkt nach Verabreichung des therapeutischen Produkts an die Nase, ohne die Notwendigkeit zur Ablagerung des Produktes in der Lunge. Formulierungen für die nasale Abgabe schließen diejenigen mit Dextran oder Cyclodextran ein. Die Abgabe über einen Transport über andere Schleimhäute wird ebenso erwogen.
Ein Fachmann wird in der Lage sein, effektive Dosierungen durch Verabreichung und Beobachten des erwünschten therapeutischen Effektes zu bestimmen. Bevorzugt wird die Formulierung des Moleküls dergestalt sein, daß zwischen ungefähr 0,10 μg/kg/Tag und 10 mg/kg/Tag den erwünschten therapeutischen Effekt ergeben wird. Die effektiven Dosierungen können unter Verwendung von Diagnosewerkzeugen mit der Zeit bestimmt werden. Zum Beispiel kann zuerst ein Diagnosemittel zum Messen der Menge an OB-Protein im Blut (oder Plasma oder Serum) verwendet werden, um endogene Konzentrationen an OB-Protein zu bestimmen. Ein solches Diagnosewerkzeug kann in der Form eines Antikörper-Assay, wie etwa einem Antikörper-Sandwich-Assay sein. Die Menge an endogenem OB-Protein wird anfänglich quantifiziert, und eine Grundlinie wird bestimmt. Die therapeutischen Dosierungen werden bestimmt, während die Quantifizierung an endogenem und exogenem OB-Protein (d. h. das Protein, Analog oder Derivat, das innerhalb des Körpers gefunden wird, entweder selbst produziert oder verabreicht) über den Verlauf der Therapie fortgesetzt wird. Die Dosierungen können deshalb über den Verlauf der Therapie variieren, wobei eine relativ hohe Dosierung anfänglich verwendet wird, bis ein therapeutischer Nutzen beobachtet wird, und geringere Dosierungen werden verwendet, um die therapeutischen Nutzen aufrechtzuerhalten.
Idealerweise wird in Situationen, bei denen nur eine Erhöhung an magerer Körpermasse erwünscht wird, die Dosierung nicht ausreichen, um zu einem Gewichtsverlust zu führen. Daher können während eines anfänglichen Therapieverlaufes einer fettleibigen Person Dosierungen verabreicht werden, durch die ein Gewichtsverlust und eine damit einhergehende Abnahme an Fettgewebe/Zunahme an magerem Gewebe erzielt wird. Wenn ein ausreichender Gewichtsverlust erzielt wird, kann eine Dosierung verabreicht werden, die ausreicht, um eine Wiederzunahme an Gewicht zu verhindern, die jedoch ausreicht, um die erwünschte Zunahme an magerer Masse (oder die Verhinderung von Abnahme an magerer Masse) aufrechtzuerhalten. Diese Dosierungen können empirisch bestimmt werden, da die Effekte von OB-Protein um kehrbar sind. Z. B. Campfield et al., Science 269: 546–549 (1995) bei 547. Daher würde man, falls eine Dosierung, die zu einem Gewichtsverlust führt, beobachtet wird, wenn ein Gewichtsverlust nicht erwünscht ist, eine geringere Dosis verabreichen, um die erwünschte Zunahme an magerer Körpermasse zu erzielen, jedoch das erwünschte Gewicht beizubehalten.
Zum Erhöhen der Empfindlichkeit eines Individuums gegenüber Insulin können ähnliche Dosierungsüberlegungen berücksichtigt werden. Die Zunahme an magerer Masse ohne Gewichtsverlust kann in ausreichendem Maße erzielt werden, um die Menge an Insulin zu verringern (oder potentiell Amylin oder andere potentielle Diabetes-behandelnde Arzneien), die einem Individuum zur Behandlung von Diabetes verabreicht würden.
Für eine Zunahme an Körperkraft insgesamt kann es ähnliche Dosierungsüberlegungen geben. Eine Zunahme an magerer Körpermasse mit einer einhergehenden Zunahme an Körperkraft insgesamt kann mit Dosen erzielt werden, die nicht dazu ausreichen, zu einem Gewichtsverlust zu führen. Andere Vorteile, wie etwa eine Zunahme an roten Blutkörperchen (und Sauerstoffanreicherung im Blut) und eine Abnahme an Knochenresorption oder Osteoporose kann ebenso in der Abwesenheit von Gewichtsverlust erzielt werden.
Die vorliegenden Verfahren können zusammen mit anderen Medikamenten verwendet werden, wie etwa diejenigen, die für die Behandlung von Diabetes (z. B. Insulin und möglicherweise Amylin) Cholesterin und Blutdruck-senkenden Medikamenten (wie etwa diejenigen, die Blut-Lipid-Konzentrationen oder andere cardiovaskuläre Medikamente), und aktivitätserhöhende Medikamente (z. B. Amphetamine) nützlich sind. Eine solche Verabreichung kann zeitgleich oder in Reihe nacheinander erfolgen.
Zusätzlich können die vorliegenden Verfahren zusammen mit Operationsprozeduren verwendet werden, wie etwa kosmetischen Operationen, die darauf angelegt sind, das Erscheinungsbild eines Körpers insgesamt zu verändern (z. B. Fettabsaugung oder Laser-Operationen, die darauf angelegt sind, die Körpermasse zu reduzieren, oder Implantationsoperationen, die darauf angelegt sind, das Erscheinungsbild der Körpermasse zu erhöhen). Die Gesundheitsvorteile von Herzoperationen, wie etwa Bypaß-Operationen oder anderen Operationen, die darauf angelegt sind, einen nachteilhaften Zustand zu erleichtern, der durch die Blockade von Blutgefäßen durch Fettablagerungen, wie etwa arterielle Plaques, verursacht wird, kann durch die zeitgleiche Verwendung der vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren erhöht werden.
Verfahren zum Eliminieren von Gallensteinen, wie etwa Ultraschall- oder Laser-Verfahren können ebenso vor, während oder nach einem Verlauf der vorliegenden therapeutischen Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können die vorliegenden Verfahren als ein Zusatz zu Operationen oder Therapien für gebrochene Knochen, beschädigte Muskeln oder andere Therapien verwendet werden, die durch eine Zunahme an magerer Körpermasse verbessert würden.
Deshalb stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung zur Herstellung eines Medikaments zum Erhöhen der mageren Körpermasse und ein Verfahren zur kosmetischen Behandlung durch Erhöhen der mageren Körpermasse bereit, um das äußere Erscheinungsbild zu verbessern, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge eines OB-Proteins, Analogs oder Derivats davon, ausgewählt aus:

(a) der Aminosäuresequenz 1–146, dargestellt in SEQ ID NO: 2 (unten) oder SEQ ID NO: 4 (unten),
(b) der Aminosäuresequenz 1–146, dargestellt in SEQ ID NO: 4 (unten), mit einem Lysinrest an Position 35 und einem Isoleucinrest an Position 74;
(c) der Aminosäuresequenz des Teils (b) mit einer unterschiedlichen Aminosäure substituiert an einer oder mehreren der folgenden Positionen (unter Verwendung der Numerierung gemäß SEQ ID NO: 4 und unter Beibehaltung derselben Numerierung sogar in der Abwesenheit eines Glutaminrestes an Position 28): 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142, und 145;
(d) der Aminosäuresequenz der Teile (a), (b) oder (c), der fakultativ ein Glutaminrest an Position 28 fehlt;
(e) der Aminosäuresequenz der Teile (a) (b), (c), oder (d) mit einem Methionylrest am N-Terminus;
(f) einem trunkierten OB-Proteinanalog, ausgewählt aus: (unter Verwendung der Numerierung von SEQ ID NO: 4 mit einem Lysinrest an Position 35 und einem Isoleucinrest an Position 74):
(i) Aminosäuren 98–146
(ii) Aminosäuren 1–32
(iii) Aminosäuren 40–116
(iv) Aminosäuren 1–99 und 112–146
(v) Aminosäuren 1–99 und 112–146 mit einer oder mehreren der Aminosäuren 100–111 aufeinanderfolgend eingebracht zwischen Aminosäuren 99 und 112; und
(vi) dem trunkierten OB-Analog des Teils (i) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142, und 145 substituiert mit einer anderen Aminosäure;
(vii) dem trunkierten Analog des Teils (ii) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 4, 8 und 32 substituiert mit einer anderen Aminosäure;
(viii) dem trunkierten Analog des Teils (iii) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 und 112 ersetzt durch eine andere Aminosäure;
(vix) dem trunkierten Analog von Teil (iv) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142, und 145 ersetzt durch eine andere Aminosäure;
(x) dem trunkierten Analog des Teils (v) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142, und 145 ersetzt durch eine andere Aminosäure;
(xi) dem trunkierten Analog der Teile (i)–(x) mit einem N-terminalen Methionylrest; und
(g) dem OB-Protein oder Analogderivat von einem der Teile (a) bis (f), umfassend eine chemische Gruppe, die an die Proteingruppe geknüpft ist;
(h) einem Derivat des Teils (g), wobei besagte chemische Gruppe eine wasserlösliche Polymergruppe ist;
(i) einem Derivat des Teils (h), wobei besagte wasserlösliche Polymergruppe Polyethylenglycol ist;
(j) einem Derivat des Teils (h), wobei besagte wasserlösliche Polymergruppe eine Polyaminosäuregruppe ist;
(k) einem Derivat des Teils (h), wobei besagte wasserlösliche Polymergruppe nur an den N-Terminus der besagten Proteingruppe angehängt ist;
(l) einem OB-Protein, Analog oder Derivat von einem der Teile (a) bis (k) in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

Die folgenden Beispiele werden dargeboten, um die Erfindung vollständig zu illustrieren, sollen aber nicht dahingehend ausgelegt werden, daß sie den Umfang davon beschränken. Beispiel 1 zeigt, daß OB-Protein zum Erhöhen der mageren Masse in nicht-fettleibigen Tieren wirksam ist. Beispiel 2 zeigt, daß OB-Protein zum Erhöhen der mageren Masse in fettleibigen Primaten wirksam ist. Beispiel 3 bis 5 sind vorhersagende Beispiele für die Verwendung am Menschen. Materialien und Methoden folgen.
BEISPIEL 1
Diese Daten demonstrieren, daß das OB-Protein oder Analoge oder Derivate davon zum Erhöhen der mageren Masse wirksam ist.
Rekombinantes murines Methionyl-OB-Protein (wie unten beschrieben) wurde kontinuierlich über eine osmotische Pumpeninfusion für eine Periode von vier Wochen verabreicht. Die Daten aus Tabelle 1 zeigen die durchschnittliche Körperzusammensetzung (für CD 1-Mäuse) bei den angezeigten Dosierungen:
TABELLE 1
In nicht-fettleibigen CD1-Mäusen wurde gezeigt, daß rekombinates murines Methionyl-OB-Protein, das kontinuierlich bei einer Dosierung von entweder 0,3 oder 1 mg/kg/Tag verabreicht wurde, eine Zunahme an magerer Masse, relativ zu den Kontrolltieren, bewirkt, denen PBS verabreicht wurde.
BEISPIEL 2
Dieses Beispiel zeigt, daß rekombinantes humanes Methionyl-OB-Protein eine Zunahme an magerer Körpermasse in Primaten bewirkt.
Fettleibige Cynomolgus-Affen, die mehr als 20% Körperfett hatten, wurde rekombinantes humanes Methionyl-OB-Protein subkutan bei einer täglichen Dosis von 1 mg Protein/kg Körpergewicht/Tag verabreicht (siehe Materialien und Methoden, unten). Kontrolltieren wurde Phosphat-gepufferte Salzlösung verabreicht. Die Körperzusammensetzung wurde mittels einer Dual-Energie-Röntgen-Absorptimetrie („DEXA")-Analyse bestimmt. Messungen der Körperzusammensetzung wurden in 7-tägigen Intervallen durchgeführt.
Die Tabellen 2A und 2B zeigen die Ergebnisse einer Körperzusammensetzungsanalyse hinsichtlich Masse an Fett- oder magerem Gewebe. Daten werden in Gramm dargestellt. Die Resultate für die zwei Kontrolltiere sind in Tabelle 2A. Die Daten für die vier Testtiere werden in Tabelle 2B dargestellt (die Daten für die Knochenmasse werden ebenso dargestellt). Wie gesehen werden kann, hatten die Tiere am Tag 28 näherungsweise 264 g Fett verloren und näherungsweise 138 g magere Masse zugenommen. Am Tag 28 hatten die Kontrolltiere 36 g Fettgewebe verloren und näherungsweise 25 g magere Masse zugenommen. Dies zeigt, daß OB-Protein eine Zunahme an magerer Körpermasse bewirkt.
TABELLE 2A
TABELLE 2B
BEISPIEL 3
Ein nicht-fettleibiger menschlicher Patient wünscht eine Zunahme an magerer Körpermasse aus therapeutischen Zwecken, wie etwa die Erholung von einer Krankheit, die zu einer Abnahme an magerer Körpermasse führte. Dem Patient wird eine wirksame Menge an OB-Protein, Analog oder Derivat davon verabreicht, um zu der erwünschten Zunahme an magerer Körpermasse zu führen. Eine Zunahme an magerer Körpermasse wird unter Verwendung von DEXA-Scanning überwacht. Die Konzentrationen an zirkulierendem OB-Protein oder Analog oder Derivat können unter Verwendung eines Diagnosekits überwacht werden, wie etwa einem Antikörper-Assay gegen das OB-Protein (oder einer andern Antigen-Quelle, sofern anwendbar).
BEISPIEL 4
Ein menschlicher Patient wünscht eine Zunahme an magerer Körpermasse aus kosmetischen oder athletischen Gründen, wie etwa einer Abnahme an magerer Körpermasse, um das äußere Erscheinungsbild zu verbessern. Dem Patient wird eine wirksame Menge an OB-Protein, Analog oder Derivat davon verabreicht, um zu der erwünschten Zunahme an magerer Körpermasse zu führen. Die Zunahme an magerer Körpermasse wird unter Verwendung von DEXA-Scanning überwacht. Die Sauerstoffkonzentrationen im Blut nehmen zu. Die Konzentrationen an zirkulierendem OB-Protein oder Analog oder Derivat können unter Verwendung eines Diagnosekits überwacht werden, wie etwa einem Antikörper-Assay gegen das OB-Protein (oder einer anderen Antigen-Quelle, sofern anwendbar).
BEISPIEL 5
Ein menschlicher Diabetes-Patient will verringerte Dosierungen an Insulin zur Behandlung von Diabetes verwenden. Dem Patient wird eine wirksame Menge an OB-Protein, Analog oder Derivat davon verabreicht, um zu einer Zunahme an magerer Körpermasse zu führen. Die Empfindlichkeit des Patienten gegenüber Insulin steigt an, und die Dosierung von Insulin, die notwendig ist, um die Symptome von Diabetes zu erleichtern, nimmt ab, entweder im Hinblick auf eine Abnahme der Einheiten an benötigtem Insulin oder im Hinblick auf eine Abnahme der Anzahl von Injektionen von Insulin, die pro Tag benötigt werden. Die Konzentrationen an zirkulierendem OB-Protein oder Analog oder Derivat können unter Verwendung eines Diagnosekits überwacht werden, wie etwa einem Antikörper-Assay gegen das OB-Protein (oder einer anderen Antigen-Quelle, sofern anwendbar).
BEISPIEL 6
Ein nicht-fettleibiger älterer menschlicher Patient wünscht eine Zunahme an Körperkraft insgesamt. Dem Patient wird eine wirksame Menge an OB-Protein, Analog oder Derivat davon verabreicht, um zu einer Zunahme an magerer Körpermasse und einer Zunahme an Körperkraft insgesamt zu führen. Die Knochenresorption wird ebenso verringert und ein Osteoporose-Zustand wird verbessert. Die Konzentrationen an zirkulierendem OB-Protein oder Analog oder Derivat kann unter Verwendung eines Diagnosekits überwacht werden, wie etwa einem Antikörper-Assay gegen das OB-Protein (oder einer anderen Antigen-Quelle, sofern anwendbar).
MATERIALIEN UND METHODEN
Tiere
Nagetiere: CD1-Wildtyp Mäuse wurden für Beispiel 1 verwendet (Daten aus Tabelle 1). Die Tiere wurden unter akzeptablen Bedingungen gehalten.
Primaten: Sechs Cynomolgus-Affen wurden insgesamt verwendet. Alle Affen waren zumindest zu 20% fett am Beginn der Studie. Die Tiere wurden im Hinblick auf Gewicht randomisiert, und vier Tiere wurden mit OB-Protein getestet, zwei Tiere waren Kontrollen.
Verabreichung von Protein oder Vehikel
Für Nagetiere. Für Beispiel 1 (Daten aus Tabelle 1) wurde rekombinantes murines Protein (wie unten beschrieben) oder Vehikel (Phosphat-gepufferte Salzlösung, "PBS", pH 7,4) mittels osmotischer Pumpeninfusion verabreicht. Alzet osmotische Minipumpen (Alza, Palo Alto, CA, Modell Nr. 2002) wurden operativ in jeder Maus in einer subkutanen Tasche in dem Gebiet unter dem Schulterblatt eingebracht und nach zwei Wochen ersetzt. Die Pumpen wurden kalibriert, um 0,5 μl Proteinlösung pro Stunde für die in Tabelle 1 angezeigten Dosierungen abzugeben.
Für Primaten. Für Beispiel 2 wurde rekombinantes humanes Methionyl-OB-Protein (aus SEQ ID NO: 4 mit einem Lysin an Position 35 und einem Isoleucin an Position 74) dosiert auf 1 mg/ml PBS, subkutan in einer Dosierung von 1 mg Protein/kg Körpergewicht/Tag verabreicht. Kontrolltieren wurde PBS auf dieselbe Weise verabreicht.
Analyse des Nagetierkadavers. Kadaveranalyse wurde durchgeführt wie in A. I. Leshner, V. A. Litwin, and R. L. Squibb, Brain Res. 9: 281 (1972). Der Wassergehalt wurde durch Abzug des Kadavergewichts vor und nach einer 4-tägigen Dehydratisierungsperiode bestimmt. Fett wurde aus einem vorher abgewogenen Teil des zermahlenen, getrockneten Kadavers mit Ethylether und Ethylalkohol extrahiert, so daß der prozentuale Fettanteil von der Menge an Material berechnet werden konnte, der nach der Extraktionsprozedur verblieb. Die magere Masse wurde als der Anteil an zermahlenem Kadaver definiert, der nach der Dehydratisierung und Etherextraktion verblieb.
Dual-Energie-Röntgen-Absorptimetrie-Scanning an Primaten
"DEXA"-Scanning wurde zu den Zeitpunkten, die in Tabelle 2A und B in Beispiel 2 angezeigt sind, durchgeführt.
Protein: Sequenz ID No: 1 und 2 zeigen rekombinante murine OB-DNA und -Protein, und Sequenz ID No. 3 und 4 zeigen eine analoge rekombinante humane OB-DNA und -Protein.
Murines rekombinantes Protein wie in SEQ ID NO: 2 wurde in Beispiel 1 verwendet. Rekombinantes humanes OB-Protein wie in SEQ ID NO: 4 mit einem Lysinrest an Position 35 und einem Isoleucinrest an Position 74 wurde in Beispiel 2 verwendet. Wie oben angezeigt, veranschaulichen die murinen und humanen rekombinanten Protein-Analoge unten das OB-Protein, das bei den vorliegenden Behandlungsverfahren und der Herstellung eines Medikaments verwendet werden kann. Andere OB-Proteine oder -Analoge oder Derivate davon können verwendet werden.
Hierin wird auf die erste Aminosäure der Aminosäuresequenz für rekombinantes Protein als +1 Bezug genommen, und diese ist Valin, und die Aminosäure an Position –1 ist Methionin. Die C-terminate Aminosäure ist 146 (Cystein).
Rekombinante murine met-OB (doppelsträngig) DNA und Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 1 und 2)
Rekombinante humane met-OB-analog- (doppelsträngig)-DNA und Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 3 und 4)
VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG
Die unten aufgeführten Verfahren zur Herstellung sind verwendet worden, um biologisch aktives rekombinantes murines oder humanes Methionyl-OB-Protein-Analog zu erzeugen. Ähnliche Verfahren können verwendet werden, um biologisch aktives rekombinantes humanes Methionyl-OB-Protein herzustellen.
Expressionsvektor und Wirtstamm
Der verwendete Plasmidexpressionsvektor is pCFM1656, ATCC-Hinterlegungsnr. 69576. Die obige DNA wurde in den Expressionsvektor pCFM1656 ligiert, mit XbaI und BamHI linearisiert und in den E. coli Wirtsstamm FM5 transformiert. E. coli FM5-Zellen stammten von Amgen Inc., Thousand Oaks, CA aus E. coli K-12-Stamm (Bachmann, et al., Bacteriol. Rev. 40: 116–167 (1976)) und enthalten das integrierte Lambdaphagenrepressorgen, cI₈₅₇ (Sussman et al. C. R. Acad. Sci. 254: 1517–1579 (1962)). Vektorproduktion, Zelltransformation und Kolonienauswahl wurden mittels Standardverfahren durchgeführt. Z. B. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Wirtszellen wurden in LB-Medium wachsengelassen.
Fermentationsprozeß. Ein dreiphasiges Fermentationprotokol, das als Fed-Batch-Verfahren bekannt ist, wurde verwendet. Die Medienzusammensetzungen sind unten dargestellt.
Charge („Batch"): Eine Stickstoff- und Phosphat-Quelle wurden sterilisiert (durch Erhöhen auf 122°C für 35 Minuten, 18–20 psi) im Fermentationgefäß (Biolafitte, 12 Liter Kapazität). Beim Kühlen wurden Kohlenstoff, Magnesium, Vitamin und Spurenmetallquellen aseptisch zugegeben. Eine Übernachtkultur der obigen rekombinantes murines Protein produzierenden Bakterien (16 Stunden oder mehr) von 500 ml (in LB-Medium wachsengelassen) wurde zum Fermentor dazugegeben.
Zuführung I („Feed I"): Beim Erreichen von 4,0–6,0 OD₆₀₀ wurde den Kulturen Zuführung I zugeführt. Die Glukose wurde bei einer begrenzenden Geschwindigkeit zugeführt, um die Wachstumsrate (μ) zu kontrollieren. Ein automatisiertes System (Verteilungskontrollsystem genannt) wurde instruiert, um die Wachstumsrate auf 0,15 Generationen pro Stunde zu steuern.
Zuführung II („Feed II"): Wenn die OD₆₀₀ 30 erreicht hatte, wurde die Kulturtemperatur langsam auf 42°C erhöht, und die Zuführung auf Zuführung II, unten umgeschaltet. Die Fermentation ließ man für 10 Stunden ablaufen, wobei alle 2 Stunden eine Probe genommen wurde. Nach 10 Stunden wurde der Inhalt des Fermentors auf unter 20°C abgekühlt und mittels Zentrifugation geerntet.
Medienzusammensetzung
Vitaminlösung (Charge und Zuführung I): 0,5 g Biotin, 0,4 g Folsäure und 4,2 g Riboflavin wurden in 450 ml H₂O und 3 ml 10 N NaOH aufgelöst und auf 500 ml H₂O gebracht, 14 g Pyridoxin-HCl und 61 g Niacin wurden in 150 ml H₂O und 50 ml 10 N NaOH aufgelöst und auf 250 ml in H₂O gebracht. 54 g Pantothensäure wurde in 200 ml H₂O aufgelöst und auf 250 ml gebracht. Die drei Lösungen wurden kombiniert und auf 10 Liter Gesamtvolumen gebracht.
Spurenmetallösung (Charge und Zuführung I)

Eisenchlorid (FeCl₃·6H₂O): 27 g/l
Zinkchlorid (ZnCl₂·4H₂O): 2 g/l
Kobaltchlorid (CoCl₂·6H₂O): 2 g/l
Natriummolybdat (NaMoO₄·2H₂O): 2 g/l
Calciumchlorid (CaCl₂·2H₂O): 1 g/l
Kupfersulfat (CuSO₄·5H₂O): 1,9 g/l
Borsäure (H₃BO₃): 0,5 g/l
Manganchlorid (MnCl₂·4H₂O): 1,6 g/l
Natriumcitratdihydrat: 73,5 g/l

Aufreinigungsprozeß für murines OB-Protein
Die Aufreinigung wurde mit den folgenden Schritten erzielt (sofern nicht andersweitig dargestellt, wurden die folgenden Schritte bei 4°C durchgeführt):

1. Zellpaste. E. coli Zellpaste wurde in dem 5-fachen Volumen an 7 mM EDTA, pH 7,0 suspendiert. Die Zellen in EDTA wurden weiter aufgebrochen durch zwei Passagen durch einen Mikrofverflüssiger. Die aufgebrochenen Zellen wurden bei 4,2 K upm für 1 Stunde in einer Beckman J6-B-Zentrifuge mit einem JS-4.2-Rotor zentrifugiert.
2. Inclusion Body-Waschung #1. Der Überstand von oben wurde entfernt, und das Pellet wurde mit dem 5-fachen Volumen an 7 mM EDTA, pH 7,0 resuspendiert und homogenisiert. Diese Mischung wurde wie in Schritt 1 zentrifugiert.
3. Inclusion body-Waschung #2. Der Überstand von oben wurde entfernt, und das Pellet wurde in dem 10-fachen Volumen an 20 mM Tris, pH 8,5, 10 mM DTT und 1% Deoxychloat resuspendiert und homogenisiert. Diese Mischung wurde wie in Schritt 1 zentrifugiert.
4. Inclusion body-Waschung #3. Der Überstand von oben wurde entfernt, und das Pellet wurde in dem 10-fachen Volumen an destilliertem Wasser resuspendiert und homogenisiert. Diese Mischung wurde wie in Schritt 1 zentrifugiert.
5. Rückfaltung. Das Pellet wurde mit 15 Volumina an 10 mM HEPES, pH 8,5, 1% Natriumsarcosin (N-Lauroylsarcosin) bei Zimmertemperatur rückgefaltet. Nach 60 Minuten wurde die Lösung auf 60 μM Kupfersulfat eingestellt und dann über Nacht gerührt.
6. Entfernung von Sarcosin. Die Rückfaltungsmischung wurde mit 5 Volumina 10 mM Tris Puffer, pH 7,5, verdünnt und wie in Schritt 1 zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und unter Rühren für 1 Stunde mit Dowex^® 1-X4-Harz gemischt (Dow Chemical Co, Midland MI), 20–50 Mesh, Chloridform bei 0,066% Gesamtvolumen an verdünnter Rückfaltungsmischung. Siehe WO 89/10932 auf Seite 26 für mehr Information über Dowex^®. Diese Mischung wurde in eine Säule gegossen, und das Elutionsmittel gesammelt. Die Entfernung von Sarcosin wurde mittels Umkehrphasen-HPLC bestätigt.
7. Säurefällung. Das Elutionsmittel aus dem vorherigen Schritt wurde gesammelt und der pH auf pH 5,5 eingestellt und für 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Diese Mischung wurde wie in Schritt 1 zentrifugiert.
8. Kationenaustauschchromatographie. Der pH des Überstands aus dem vorherigen Schritt wurde auf pH 4,2 eingestellt und auf eine CM-Sepharose-Fast Flow geladen (bei 7% Volumen). 20 Säulenvolumina an Salzgradient wurden bei 20 mM NaOAC, pH 4,2, 0 M bis 1,0 M NaCl durchgeführt.
9. Hydrophobe Wechselwirkungschromatographie. Der CM-Sepharose-Pool der Spitzenfraktionen (bestätigt anhand der Ultraviolet-Absorption) aus dem obigen Schritt wurde auf 0,2 M Ammoniumsulfat eingestellt. Ein 20-Säulen-Volumen-Umkehrsalzgradient wurde bei 5 mM NaOAC, pH 4,2, mit 0,4 M bis 0 M Ammoniumsulfat durchgeführt. Dieses Material wurde konzentriert und in PBS diafiltriert.

Fermentation des rekombinanten menschlichen OB-Protein-Analog: Fermentation der obigen Wirtszellen, um rekombinantes humanes OB-Protein-Analog (SEQ ID NO: 4) zu produzieren, kann unter Verwendung der Bedingungen und Zusammensetzungen, wie oben beschrieben, für rekombinantes murines Material, erzielt werden.
Aufreinigung des rekombinanten humanen OB-Protein-Analogs: Rekombinantes humanes Protein-Analog kann unter Verwendung von Verfahren aufgereinigt werden, die ähnlich denjenigen sind, die zur Aufreinigung von rekombinantem murinem Protein verwendet werden, wie in Beispiel 1, oben. Zur Herstellung von rekombinantem humanem OB-Protein-Analog sollte Schritt 8 durch Einstellen des pHs des Überstands aus Schritt 7 auf pH 5,0 durchgeführt werden und durch Laden hiervon auf eine CM-Sepharose-Fast-Flow-Säule. Der 20-Säulenvolumina-Salzgradient sollte bei 20 mM NaOAC, pH 5,5, 0 M bis 0,5 M NaCl, durchgeführt werden. Schritt 9 sollte durch vierfache Verdünnung mit Wasser des CM-Sepharose-Pools und Einstellen des pHs auf 7,5 durchgeführt werden. Diese Mischung sollte auf 0,7 M Ammoniumsulfat eingestellt werden. 20 Säulenvolumina Umkehr-Salzgradient sollten bei 5 mM NaOAC, pH 5,5, 0,2 M bis 0 M Ammoniumsulfat durchgeführt werden. Ansonsten sind die obigen Schritte identisch. Für das Material aus Beispiel 2 wurde das rekombinante humane OB-Protein aus SEQ ID NO: 4 mit Lysin 35 und Isoleucin 74 in einem Puffer, enthaltend 10 mM Histidin, 4,3% Arginin bei pH 6,0 formuliert werden.
Während die vorliegende Erfindung hinsichtlich der bevorzugten Ausführungsformen beschrieben worden ist, ist es klar, daß Variationen und Modifizierungen Fachleuten einfallen werden. Deshalb ist beabsichtigt, daß die angehängten Ansprüche alle solchen äquivalenten Variationen abdecken, die innerhalb des Umfangs der beanspruchten Erfindung fallen.

Claims

Verwendung eines OB-Proteins, Analogs oder Derivats davon, ausgewählt aus: (a) der Aminosäuresequenz 1–146, wie dargestellt in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4, (b) der Aminosäuresequenz 1–146, wie dargestellt in SEQ ID NO: 4, mit einem Lysinrest an Position 35 und einem Isoleucinrest an Position 74; (c) der Aminosäuresequenz des Teils (b) mit einer unterschiedlichen Aminosäure substituiert an einer oder mehreren der folgenden Positionen (unter Verwendung der Numerierung gemäß SEQ ID NO: 4): 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142, und 145; (d) der Aminosäuresequenz der Teile (a), (b) oder (c), der fakultativ ein Glutaminrest an Position 28 fehlt; (e) der Aminosäuresequenz der Teile (a), (b), (c), oder (d) mit einem Methionylrest am N-Terminus; (f) einem trunkiertem OB-Proteinanalog, ausgewählt aus: (unter Verwendung der Numerierung von SEQ ID NO: 4 mit einem Lysinrest an Position 35 und einem Isoleucinrest an Position 74): (i) Aminosäuren 98–146 (ii) Aminosäuren 1–32 (iii) Aminosäuren 40–116 (iv) Aminosäuren 1–99 und 112–146 (v) Aminosäuren 1–99 und 112–146 mit einer oder mehreren der Aminosäuren 100–111 aufeinanderfolgend eingebracht zwischen Aminosäuren 99 und 112; und (vi) dem trunkierten OB-Analog des Teils (f) (i) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 und 145 substituiert mit einer anderen Aminosäure; (vii) dem trunkierten Analog des Teils (f) (ii) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 4, 8 und 32 substituiert mit einer anderen Aminosäure; (viii) dem trunkierten Analog des Teils (f) (iii) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 und 112 ersetzt durch eine andere Aminosäure; (vix) dem trunkierten Analog des Teils (f) (iv) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142, und 145 ersetzt durch eine andere Aminosäure; (x) dem trunkierten Analog des Teils (f) (v) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142, und 145 ersetzt durch eine andere Aminosäure; (xi) dem trunkierten Analog eines der Teile (f) (i)–(x) mit einem N-terminalen Methionylrest; und (g) dem OB-Protein oder Analogderivat von einem der Teile (a) bis (f), umfassend eine chemische Gruppe, die an die Proteingruppe geknüpft ist; (h) einem Derivat des Teils (g), wobei besagte chemische Gruppe eine wasserlösliche Polymergruppe ist; (i) einem Derivat des Teils (h), wobei besagte wasserlösliche Polymergruppe Polyethylenglycol ist; (j) einem Derivat des Teils (h), wobei besagte wasserlösliche Polymergruppe eine Polyaminosäuregruppe ist; (k) einem Derivat des Teils (h), wobei besagte wasserlösliche Polymergruppe nur an den N-Terminus der besagten Proteingruppe angehängt ist; (l) einem OB-Protein, Analog oder Derivat von einem der Teile (a) bis (k) in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger; zur Herstellung eines Medikaments zum Erhöhen der mageren Körpermasse (lean tissue mass).
Verwendung nach Anspruch 1, wobei besagte Verwendung ebenso für eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Insulin sorgt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei besagte Verwendung ebenso für ein Anwachsen der Körperkraft insgesamt sorgt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei besagte Verwendung ebenso für eine verringerte Knochenresorption sorgt.
Verfahren zur kosmetischen Behandlung durch Erhöhen der Magergewebemasse, um das äußere Erscheinungsbild zu verbessern, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge eines OB-Proteins, Analogs oder Derivats davon, ausgewählt aus: (a) der Aminosäuresequenz 1–146, wie dargestellt in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4, (b) der Aminosäuresequenz 1–146, wie dargestellt in SEQ ID NO: 4, mit einem Lysinrest an Position 35 und einem Isoleucinrest an Position 74; (c) der Aminosäuresequenz des Teils (b) mit einer unterschiedlichen Aminosäure substituiert an einer oder mehreren der folgenden Positionen (unter Verwendung der Numerierung gemäß SEQ ID NO: 4): 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142, und 145; (d) der Aminosäuresequenz der Teile (a), (b) oder (c), der fakultativ ein Glutaminrest an Position 28 fehlt; (e) der Aminosäuresequenz der Teile (a), (b), (c), oder (d) mit einem Methionylrest am N-Terminus; (f) einem trunkiertem OB-Proteinanalog, ausgewählt aus: (unter Verwendung der Numerierung von SEQ ID NO: 4 mit einem Lysinrest an Position 35 und einem Isoleucinrest an Position 74): (i) Aminosäuren 98–146 (ii) Aminosäuren 1–32 (iii) Aminosäuren 40–116 (iv) Aminosäuren 1–99 und 112–146 (v) Aminosäuren 1–99 und 112–146 mit einer oder mehreren der Aminosäuren 100–111 aufeinanderfolgend eingebracht zwischen Aminosäuren 99 und 112; und (vi) dem trunkierten OB-Analog des Teils (f) (i) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 und 145 substituiert mit einer anderen Aminosäure; (vii) dem trunkierten Analog des Teils (f) (ii) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 4, 8 und 32 substituiert mit einer anderen Aminosäure; (viii) dem trunkierten Analog des Teils (f) (iii) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 und 112 ersetzt durch eine andere Aminosäure; (vix) dem trunkierten Analog des Teils (f) (iv) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142, und 145 ersetzt durch eine andere Aminosäure; (x) dem trunkierten Analog des Teils (f) (v) mit einer oder mehreren der Aminosäuren 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142, und 145 ersetzt durch eine andere Aminosäure; (xi) dem trunkierten Analog eines der Teile (f) (i)–(x) mit einem N-terminalen Methionylrest; und (g) dem OB-Protein oder Analogderivat von einem der Teile (a) bis (f), umfassend eine chemische Gruppe, die an die Proteingruppe geknüpft ist; (h) einem Derivat des Teils (g), wobei besagte chemische Gruppe eine wasserlösliche Polymergruppe ist; (i) einem Derivat des Teils (h), wobei besagte wasserlösliche Polymergruppe Polyethylenglycol ist; (j) einem Derivat des Teils (h), wobei besagte wasserlösliche Polymergruppe eine Polyaminosäuregruppe ist; (k) einem Derivat des Teils (h), wobei besagte wasserlösliche Polymergruppe nur an den N-Terminus der besagten Proteingruppe angehängt ist; (l) einem OB-Protein, Analog oder Derivat von einem der Teile (a) bis (k) in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.