JP2000500492A - Ｏｂ蛋白組成物を用いる非脂肪組織重増加方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 非脂肪組織重増加のためのＯＢ蛋白組成物の使用方法が提供される。インシュリン感受性向上ならびに全身活力向上および骨吸収低下のためのＯＢ蛋白組成物の使用方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 ＯＢ蛋白組成物を用いる非脂肪組織重増加方法 発明の属する技術分野 本発明は、非脂肪組織重を増加させるためのＯＢ蛋白組成物の使用方法に関す るものである。発明の背景 肥満の分子的基礎はかなり不明な部分があるが、「ＯＢ遺伝子」およびそれに よりコードされた蛋白（「ＯＢ蛋白」）の特定によって、体が体脂肪蓄積を調節 するのに使用している機序についていくらか理解が進んだ（Zhang et al.，Natu re 372:425-432(1994); the Correction at Nature 374: 479(1995)も参照）。 ＯＢ蛋白は、ｏｂ／ｏｂ突然変異マウス（ＯＢ遺伝子産生物の産生欠陥故の肥満 マウス）ならびに正常な野生型マウスのいずれにおいても、in vjvoで活性であ る。その生理活性自体は特に、体重減少において発現する（Barinaga，“Obese ”Protein Slims Mice，Science 269: 475-476(1995)参照）。 ＯＢ蛋白の他の生理効果については十分な特性決定が行われていない。例えば 、ｏｂ／ｏｂ突然変異マウスにおいて、ＯＢ 蛋白を投与することで、血清インシュリン濃度および血清グルコース濃度が低下 することが知られている。さらに、ＯＢ蛋白投与によって、体脂肪の低下が生じ ることも知られている。これはｏｂ／ｏｂ突然変異マウスおよび非肥満正常マウ スのいずれにおいても認められている（Pelleymounter et al.，Science 269: 5 40-543(1995); Halaas et al.，Science 269: 543-546(1995)参照。Campfield e t al.，Science 269:546-549(1995)も参照（μｇ量の用量のＯＢ蛋白を末梢およ び中枢に投与することで、ｏｂ／ｏｂ肥満マウスおよび飼料誘発肥満マウスの飼 料摂取および体重が低下したが、ｄｂ／ｄｂ肥満マウスではそれは認められなか った）。これらの報告のいずれにおいても、最高用量であっても毒性は認められ ていない。 特に、体重減少が有益ではないと考えられるか、あるいは体重減少の必要がな いと考えられる動物に対するＯＢ蛋白の他の生理効果を解明することは、ＯＢ蛋 白に別の用途を提供するものとなろう。 本発明によって提供されるようなそのような用途は、非脂肪組織（lean tissu e）重増加におけるものである。 当然のことながら、食事および運動の調節が、筋肉を大きく する上での一つの方法である。非脂肪重を増加させるのに使用される組成物はも ちろんある。非脂肪組織重を増加させると考えられている現在の組成物には、テ ストステロンおよびそれの誘導体などの蛋白同化ステロイドならびにヒト成長ホ ルモンなどがある。しかしながら、これらは望ましくない副作用を有することが 認められている（以下の概要はレミングトンの著作に詳細に説明されている（Re mington，Pharmaceutical Sciences，18th Ed．（1990，Mack Publishing Co.， Easton，PA 18042）Chapter 50，pp.948-1001））。 プロトロピンおよびソマトロピンなどのヒト成長ホルモンは、通常２〜３ヶ月 で緩解する高カルシウム尿症を高頻度で起こすことが認められている。高血糖症 および臨床的に明らかな糖尿病が起こることも認められている。筋肉痛および早 朝頭痛が比較的頻繁であることが認められ、甲状腺機能低下および胆汁における コレステロール過飽和が生じる場合もある。骨端が閉じている場合、指骨および 顎骨の成長が継続的に刺激されるが他の骨は刺激されないために身体の均整が異 常になる場合があることから、そのホルモンは使用してはならない。 蛋白同化ステロイドは運動能力および攻撃性を高める。それ の使用は、米国スポーツ医学協会（American College of Sports Medicine）に よって禁止されている。女性の能力が向上するが、その代償として男性化および アクネが生じる。アンドロゲンは男性型多毛症、深い声もしくは嗄れ声、未成熟 男性における思春期早発症および骨端閉鎖、性欲亢進（男性および女性の両方） 、陰茎強直症、精液減少症および睾丸萎縮、女性における陰核腫脹、潮紅、射精 量および精子数の低下、女性化乳房症、過敏症、アクネ、体重増、浮腫ならびに 高カルシウム血症を引き起こす。長期使用によって攻撃性がひどく高まる場合が あり、多くの暴行がアンドロゲンの乱用によるものであると言われている。偏執 症様行動および他の精神病的行動が報告されている。胆汁うっ滞および黄疸が起 こる。長期療法後に肝癌が報告された例が数例ある。 従って、現在使用可能な薬剤に見られる副作用のない、非脂肪組織重を増加さ せる治療用組成物または美容用組成物が得られることが望ましい。発明の概要 本発明は、非肥満動物および肥満動物へのＯＢ蛋白投与によって非脂肪組織重 増加が生じるという所見に基づくものである。 そのようにＯＢ蛋白は、痩身剤として作用するだけでなく、非脂肪組織重に影響 を与える薬剤として作用する能力を有する。それだけでは、体重減が必ずしも有 益とは考えられない患者においてすら、多くの非脂肪組織重増加療法が想到され る。そこで本発明の１態様は、非脂肪組織重増加のためのＯＢ蛋白（または該蛋 白の類縁体もしくは誘導体）の使用である。 別の態様では本発明は、糖尿病治療方法および糖尿病治療に必要なインシュリ ン濃度低下方法に関するものである。脂肪組織重低下と同時に非脂肪組織重を増 加させることで、インシュリンに対する感度が上昇する。従って本発明の方法は 、糖尿病治療に必要なインシュリン量低下のためのＯＢ蛋白（または該蛋白の類 縁体もしくは誘導体）の使用に関するものである。発明の詳細な説明 上記のように本発明の方法は、個体における非脂肪組織重増加方法である。こ の非脂肪組織重増加には、脂肪重低下を伴うことが認められている。そこで、Ｏ Ｂ蛋白（または該蛋白の類縁体もしくは誘導体）投与によって所望の体重減が得 られない場合であっても、非脂肪重を増加させながら体脂肪を減少させて体型を 変える上で、ＯＢ蛋白投与は有用であると考えられる。 さらに、非脂肪組織重増加により、個体のインシュリンに対する感受性を高め ることができる。従って本発明のＯＢ蛋白（または該蛋白の類縁体もしくは誘導 体）の使用方法は、糖尿病患者におけるインシュリン感受性向上に関するもので もある。詳細な作用形態は不明であるが、脂肪組織と比較して非脂肪組織（例： 筋肉）はインシュリンの効果に対する感受性が高いと考えられる。従って、非脂 肪組織増加によって、インシュリン感受性の細胞をより多く利用できるようにな ると考えられる。さらに、脂肪（例：脂肪）組織除去は、循環インシュリンが認 められる末梢循環への非脂肪組織の曝露が多くなるという別の効果も有し得る。 従って本発明の別の態様は、インシュリンに対する感受性向上方法を提供するこ とである。言い換えれば、糖尿病で必要なインシュリンの用量を低下させる方法 も提供される。 非脂肪組織増加は、筋肉組織増加であると考えられる。そのような増加は、特 定の部分に局在するものではなく、全身的増加であることが認められる（例：後 述の実施例１および２）。それ自体で、全身活力が向上し得る。全身活力向上に より、骨吸収低下などの他の効果が生じる場合があり、骨粗鬆症などの 脆弱性を逆転または改善できる可能性がある。運動能力向上を望む患者では、全 身活力向上がその能力向上に有効であると考えられる。赤血球の産生または有効 性上昇、ならびに酸素化血液の増加があり得る。そうして、精神的・肉体的能力 を向上させることができる。 ＯＢ蛋白は、以下に記載の組換えマウス蛋白（配列番号２）またはツァンクら の報告（Zhang et al.，Nature，supra；引用によって本明細書に含まれるもの とする）に記載の組換えヒト蛋白もしくは位置２８のグルタミン残基を持たない ものから選択することができる（Zhang et al.，Nature，supra，p.428参照）。 １）位置３５のリジンに代えてアルギニンおよび２）位置７４のイソロイシンに 代えてロイシンを有する配列番号４に示した組換えヒトＯＢ蛋白類縁体を用いる こともできる（この類縁体についての略称を、組換えヒトＲ→Ｋ³⁵、Ｌ→Ｉ⁷⁴と する）。それらの組換えヒト蛋白類縁体および組換えマウス蛋白のアミノ酸配列 を以下に示してあるが、−１の位置にメチオニン残基がある。しかし、本発明の ＯＢ蛋白およびその類縁体については、そのメチオニン残基はなくても良い。 上記マウス蛋白は、特に成熟蛋白として、さらには特にＮ末 端でヒト蛋白と実質的に相同である。組換えヒト配列において、マウスの配列と 異なるアミノ酸を変えることで（アミノ酸残基の置換など）、組換えヒト蛋白の 類縁体を得ることができる。この組換えヒト蛋白はマウスで生理活性を有するこ とから、そのような類縁体はヒトにおいて活性である可能性がある。例えば、第 １のアミノ酸がバリンで位置１４６のアミノ酸がシステインである配列番号４の 番号付けによる位置３５の残基がリジンで位置７４の残基がイソロイシンである ヒト蛋白を用いた場合、位置３２、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７ 、８９、９７、１００、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１ ３６、１３８、１４２および１４５の１以上のアミノ酸を別のアミノ酸で置換す ることができる。マウス蛋白（配列番号２）の相当する位置のアミノ酸または別 のアミノ酸を選択することができる。 さらに、ラットＯＢ蛋白配列に基づいて、「コンセンサス」分子を得ることが できる（Murakami et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.209:944-952(1995)；引 用によって本明細書に含まれるものとする）。ラットＯＢ蛋白は、配列番号の番 号割り付けを用いると、４、３２、３３、３５、５０、６８、７１、７４、７７ 、７８、８９、９７、１００、１０１、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８ 、１１１、１１８、１３６、１３８および１４５の位置でヒトＯＢ蛋白と 異なっている。これらの各種位置のアミノ酸の１以上を別のアミノ酸で置換する ことができる。太字で記載した位置は、マウスＯＢ蛋白とラットＯＢ蛋白がヒト ＯＢ蛋白と異なっていることから、変えるのに特に適した位置である。これらの 位置の１以上で、相当するラットＯＢ蛋白からのアミノ酸または別のアミノ酸に 置換することができる。 成熟ヒトＯＢ蛋白と異なるラットおよびマウスの両方のＯＢ蛋白からの位置は 、４、３２、３３、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７、７８、８９、 ９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１ ３６、１３８、１４２および１４５である。上記のアミノ酸の１以上が欠失して いるか相当するラットもしくはマウスの配列で認められるアミノ酸などの別のア ミノ酸で置換されている配列番号４によるヒトＯＢ蛋白（位置３５がリジン、位 置７４がイソロイシン）も有効であると考えられる。 さらに、成熟ヒトＯＢ蛋白と異なるアカゲザルＯＢ蛋白で認 められるアミノ酸（１文字のアミノ酸略号で括弧内に示してあるもの）は、８（ Ｓ）、３５（Ｒ）、４８（Ｖ）、５３（Ｑ）、６０（Ｉ）、６６（Ｉ）、６７（ Ｎ）、６８（Ｌ）、８９（Ｌ）、１００（Ｌ）、１０８（Ｅ）、１１２（Ｄ）お よび１１８（Ｌ）である。組換えヒトＯＢ蛋白はカニクイザルで活性であること から（後述の実施例２に記載）、アカゲザルの各種アミノ酸の１以上が括弧に示 したアミノ酸などの別のアミノ酸で置換された配列番号４（位置３５がリジン、 位置７４がイソロイシン）によるヒトＯＢ蛋白は有効であると考えられる。ある 種のアカゲザルの各種アミノ酸は上記のマウスで認められるもの（位置３５、６ ８、８９、１００および１１２）でもあることは留意すべき点である。そこで、 位置４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８ 、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６ 、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１ ４５というアミノ酸の１以上が別のアミノ酸によって置換されたマウス／アカゲ ザル／ヒトコンセンサス分子を得ることができる（位置３５がリジンで位置７４ がイソロイシンである配列番号４の番号割り付けを使用）。 この蛋白のアミノ酸配列の一部を欠失させることで、他の類縁体を得ることが できる。例えば、成熟蛋白はリーダー配列を持たない（−２２〜−１）。以下の 切断型ヒトＯＢ蛋白分子を得ることができる（配列番号４の番号割り付けを使用 ）。 （ａ）アミノ酸９８〜１４６ （ｂ）アミノ酸１〜３２ （ｃ）アミノ酸４０〜１１６ （ｄ）アミノ酸１〜９９および（それに結合した）１１２〜１４６ （ｅ）アミノ酸９９と１１２の間にアミノ酸１００〜１１１の１以上があるア ミノ酸１〜９９および（それに結合した）１１２〜１４６ さらにこれら切断型は、ヒトＯＢ蛋白と異なる（アカゲザル、ラットまたはマ ウスのＯＢ蛋白で）アミノ酸の１以上が変わっているものであっても良い。さら に、変更はペプチド類似物またはＤ−アミノ酸などの変更アミノ酸の形であって も良い。 本発明の蛋白（本明細書において「蛋白」という用語は、別段の断りがない限 り、以下に引用のような「ペプチド」およびＯＢ類縁体を含むものとして使用さ れる）は、蛋白部分への１ 以上の化学部分結合によって誘導体化されていても良い。さらに、化学的に修飾 された誘導体を、動脈投与、腹腔内投与、筋肉投与、皮下投与、静脈投与、経口 投与、経鼻投与、肺投与、局所投与その他の投与経路用に製剤化することもでき る。生理活性蛋白の化学修飾は、一定の環境下で、治療効果のある蛋白の安定性 向上および循環時間延長ならびに免疫原性の低下などのさらなる利点をもたらす ことが認められている（１９７９年１２月１８日発行の米国特許４１７９３３７ 号（Davis et al.）参照；総説については、Abuchowski et al.，Enzymes as Dr ugs参照（J.S.Holcerberg and J.Roberts，eds.pp.367-383(1981)）；蛋白修飾 および融合蛋白について記載した総説論文には、Francis，Focuson Growth Fact ors 3: 4-10(1992年5月)がある（Mediscript，Mountview Court，Friern Barnet Lane,London N20，OLD，UK出版））。 誘導体化に好適な化学部分は、各種水溶性ポリマーから選択することができる 。選択されるポリマーは水溶性であって、それが結合する蛋白が生理環境などの 水系の環境で沈殿しないようにするものでなければならない。好ましくは、最終 製造品を治療に使用する場合、ポリマーは医薬的に許容されるものとす る。当業者であれば、ポリマー／蛋白接合体が治療に使用可能か否か、そして使 用可能であれば望ましい用量、循環時間、蛋白分解に対する耐性および他の検討 事項などの検討事項に基づいて望ましいポリマーを選択することができる。本発 明の蛋白およびペプチドの場合、誘導体化の有効性は、望ましい剤型で（すなわ ち、浸透ポンプにより、あるいはより好ましくは注射もしくは注入により、さら には例えば経口投与、肺投与もしくは経鼻投与用に製剤されたものにより）誘導 体を投与し、本明細書に記載の方法に従ってその有効性を測定することで確認す ることができる。 水溶性ポリマーは例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プ ロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、 ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、 ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリ アミノ酸類（ホモポリマーまたはランダム共重合体もしくは非ランダム共重合体 ）、ならびにデキストリンもしくはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレン グリコール、プロピレングリコールホモポリマー類、ポリプロピレンオキサイド ／エ チレンオキサイド共重合体、ポリオキシエチル化多価アルコール類、ポリマロン 酸スチレンならびにポリビニルアルコールから成る群から選択することができる 。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中で安定であることから 、製造において有利であると考えられる。 融合蛋白は、ＯＢ蛋白（または類縁体）部分にポリアミノ酸を結合させること で得ることができる。例えば、ポリアミノ酸は、蛋白の循環半減期を延長する上 で役立つ担体蛋白であることができる。本発明の治療上または美容上の目的に関 しては、そのようなポリアミノ酸は、中和抗原反応その他の有害応答を起こさな いものでなければならない。そのようなポリアミノ酸は、血清アルブミン（ヒト 血清アルブミンなど）、抗体もしくはそれの部分（「Ｆ_c」と称される場合もあ る抗体の恒常領域など）その他のポリアミノ酸からなる群から選択することがで きる。以下に示すように、ポリアミノ酸の結合位置は、ＯＢ蛋白部分のＮ末端そ の他の箇所であることができ、ＯＢ蛋白への化学的「リンカー」部分によって結 合していても良い。 ポリマーの分子量に制限はなく、分岐であっても直鎖であっても良い。ポリエ チレングリコールの場合、好ましい分子量は、 取り扱いやすさおよび製造しやすさから、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲で ある（「約」という用語は、ポリエチレングリコールの製造において、一部の分 子の分子量が指定の分子量より大きく、一部の分子ではそれより小さかったりす ることを示している）。所望の治療プロファイルに応じて（例：所望の徐放期間 、生理活性がある場合はその生理活性に対する効果、取り扱いやすさ、抗原性の 程度もしくはその欠如、ならびに治療効果のある蛋白もしくは類縁体に対するポ リエチレングリコールの他の既知の効果）、それ以外の大きさのものを用いるこ とができる。 このようにして付着したポリマー分子の数は多様であることができ、当業者で あれば、機能に対する効果を確認することができる。モノ誘導体化を行うことが できたり、あるいは同一もしくは異なる化学部分によって、ジ、トリ、テトラま たは数個の組み合わせの誘導体化を行うことが可能である（例：分子量の異なる ポリエチレングリコール類などのポリマー）。蛋白（もしくはペプチド）分子に 対するポリマー分子の割合は、それらの反応混合物中での濃度同様に多様である 。一般に、所望の誘導体化程度（例：モノ、ジ、トリなど）、選択されるポリマ ー の分子量、そのポリマーが分岐であるか直鎖であるか、反応条件などの因子によ って、至適比率（過剰の未反応の蛋白やポリマーがない反応の効率に関して）を 決定する。 上記化学部分は、蛋白の機能性または抗原性ドメインに対する効果を考慮して 蛋白に付着させなければならない。当業者が使用可能な付着方法が多くある。例 えば、ＥＰ０４０１３８４号（引用によって本明細書に含まれるものとする）（ ＰＥＧのＧ−ＣＳＦへの結合）、マリクらの報告（Malik et al.，Exp.Hematol. ，20-:1028-1035，1992；塩化トレシルを用いるＧＭ−ＣＳＦのＰＥＧ化につい て報告）などがある。例えばポリエチレングリコールは、遊離のアミノ基または カルボキシル基などの反応性基を介してアミノ酸残基によって共有結合的に結合 することができる。反応性基とは、活性化ポリエチレングリコール分子が結合し 得る基である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基には、リジン残基およびＮ末 端アミノ酸残基などがあり得る。遊離カルボキシル基を有するものには、アスパ ラギン酸残基、グルタミン酸残基、Ｃ末端アミノ酸残基などがあり得る。ポリエ チレングリコール分子を付着させるための反応性基として、メルカプト基を使用 することもできる。治療のため には、Ｎ末端またはリジン基での付着などのアミノ基での付着が好ましい。受容 体結合が望ましい場合、受容体結合にとって重要な残基での付着は避けるべきで ある。 特にＮ末端で化学修飾された蛋白が望ましい場合がある。ポリエチレングリコ ールを用いて本発明の組成物を説明すると、各種のポリエチレン分子（分子量、 分岐などによって）、反応混合物中の蛋白分子に対するポリエチレングリコール 分子の割合、実施するＰＥＧ化反応の種類、選択されたＮ末端ＰＥＧ化蛋白を得 る方法を選択することができる。Ｎ末端ＰＥＧ化品を得る方法は（すなわち、必 要に応じてこの部分を他のモノＰＥＧ化部分と分離する方法）、ＰＥＧ化蛋白分 子群からのＮ末端ＰＥＧ化品の精製による。選択的Ｎ末端化学修飾は、特定蛋白 における誘導体化に使用可能な各種１級アミノ基の反応性差（リジンとＮ末端） を利用する還元的アルキル化によって行うことができる。適切な反応条件下で、 含カルボニル基ポリマーによるＮ末端での蛋白の実質的に選択的な誘導体化を行 う。例えば、リジン残基のε−アミノ基と蛋白のＮ末端残基のα−アミノ基との 間のｐＫａ差を利用できるｐＨで反応を行うことで、蛋白をＮ末端で選択的にＰ ＥＧ化することができる。そのような選 択的誘導体化によって、蛋白への水溶性ポリマーの付着が抑制され、ポリマーと の接合が蛋白のＮ末端で支配的に起こり、リジン側鎖アミノ基などの他の反応性 基にはほとんど変化が起こらない。還元的アルキル化を用いる場合、水溶性ポリ マーは上記の種類のものとすることができ、蛋白への結合のための１個の反応性 アルデヒドがなければならない。１個の反応性アルデヒドを有するポリエチレン グリコールプロピオンアルデヒドを使用することができる。 治療薬製造を容易にするには、Ｎ末端モノＰＥＧ化誘導体が好ましい。Ｎ末端 ＰＥＧ化により、生成物の特性決定がジ、トリその他の複数ＰＥＧ化生成物の場 合と比較して簡単である均質な生成物が得られる。上記のＮ末端生成物製造のた めの還元的アルキル化方法を用いることが、商業的製造を容易にする上で好まし い。 本発明のさらに別の態様では、蛋白および誘導体の医薬組成物を用いる方法が 提供される。そのような医薬組成物は、注射用、あるいは経口投与、肺投与、経 鼻投与、経皮投与その他の投与形態用のものであることができる。有効量の本発 明の蛋白もしくは誘導体と医薬的に許容される希釈剤、保存剤、可溶化 剤、乳化剤、補助剤および／または担体とを含む医薬組成物が本発明に含まれる 。そのような組成物は、各種緩衝剤含有量（例：トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン 酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；洗剤および可溶化剤（例：Ｔｗｅｅｎ ８０、ポリソルベート８０）、酸化防止剤（例：アスコルビン酸、メタ重亜硫酸 ナトリウム）、保存剤（例：チメルゾル(Thimersol)、ベンジルアルコール）お よび増量剤（例：乳糖、マニトール）などの添加物を含み、ポリ乳酸、ポリグリ コール酸などのポリマー化合物の粒子状物あるいはリポソームへの材料の取り込 みが行われる。ヒアルロン酸も使用することができ、それは循環系における持続 期間を延長する効果を有する場合がある。そのような組成物は、本発明の蛋白お よび誘導体の物理的状態、安定性、in vivoでの放出速度、in vivoでのクリアラ ンス速度に影響を与え得るものである（例えばRemington's Pharmaceutical Sci ences，18th Ed.(1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA 18042)，pp.1435-17 12参照；引用によって本明細書に含まれるものとする）。この組成物は、液体製 剤で製造することができるか、あるいは凍結乾燥品などの乾燥粉末とすることが できる。経皮製剤のような植え込み可能な徐放製剤 も想到される。 経口固体製剤（Remington's Pharmaceutical Sciences，18th Ed.(1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA 18042)，Chapter 89（引用によって本明細書に含 まれるものとする）に記載のもの）が本発明での使用で想到される。固体製剤に は、錠剤、カプセル、丸薬、トローチもしくはロゼンジ、カシェ剤またはペレッ トなどがある。さらに、リポソームカプセル封入またはプロテイノイドカプセル 封入を用いて、本発明の組成物を製剤することもできる（例えば、米国特許４９ ２５６７３号に記載のプロテイノイドミクロスフェアなど）。リポソームカプセ ル封入を用いることができ、リポソームは各種ポリマーで誘導体化できる（例： 米国特許５０１３５５６号）。治療薬用に使用可能な固体製剤についての記載が マーシャルの著作にある（Marshall，K.，Modern Pharmaceutics，ed．by G.S.B anker and C.T.Rhodes，Chapter 10，1979；引用によって本明細書に含まれるも のとする）。製剤には、その蛋白（またはそれの類縁体もしくは誘導体）ならび に胃環境に対する保護および腸での生理活性物質の放出を可能とするための不活 性成分を含有させる。 具体的には、上記の誘導体化蛋白の経口製剤も想到される。 蛋白を化学修飾して、誘導体の経口投与を有効に行えるようにすることができる 。一般に、想到される化学修飾は、（ａ）蛋白分解の阻害および（ｂ）胃または 腸からの血流への取り込みを可能とする１以上の部分の蛋白（もしくはペプチド ）分子自体への付加である。さらに、蛋白の全体的安定性の向上および体内での 循環時間の延長も望ましい。そのような部分の例としては、ポリエチレングリコ ール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチ ルセルロース、デキストリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンお よびポリプロリンなどがある（Abuchowski and Davis，Soluble Polymer-Enzyme Adducts，in ″Enzymes as Drugs″，Hocenberg and Roberts，eds.，Wiley-In terscience，New York，NY，(1981)，pp.367-383; Newmark，et al.，J.Appl.Bi ochem．4:185-189(1982)）。使用可能な他のポリマーには、ポリ−１，３−ジオ キソランおよびポリ−１，３，６−トリオキソランがある。 蛋白（または誘導体）の場合、放出箇所は胃、小腸（十二指腸、空腸または回 腸）または大腸であることができる。当業者であれば、胃では溶けないが十二指 腸や腸の他の箇所でその物質を放出する製剤を使用することができる。好ましく はその放 出は、蛋白（または誘導体）の保護あるいは腸などの胃環境を過ぎてからの生理 活性物質の放出によって、胃環境の悪影響を回避するものである。 胃での十分な耐性を確保するには、少なくともｐＨ５．０まで不透過性のコー ティングが必須である。腸溶コーティングとして使用されるより一般的な不活性 成分の例としては、セルロース酢酸トリメリテート（ＣＡＴ）、フタル酸ヒドロ キシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ５０、ＨＰＭＣＰ５ ５、ポリビニル酢酸フタレート（ＰＶＡＰ）、ユードラジット（Eudragit）Ｌ３ ０Ｄ、アクアテリック（Aquateric）、セルロース酢酸フタレート（ＣＡＰ）、 ユードラジットＬ、ユードラジットＳおよびシェラック（shellac）がある。こ れらのコーティングは、混合フィルムとして使用することができる。 コーティングまたはコーティング混合物は、胃に対する保護を目的としない錠 剤にも使用することができる、それには、糖衣または錠剤を嚥下しやすくするた めのコーティングなどがあり得る。カプセルは、粉剤などの乾燥治療薬投与用の 硬殻（ゼラチンなど）から成ることができ、液剤用には軟ゼラチン殻を使用する ことができる。カシェ剤の殻材料としては、厚いデン プンその他の食用紙があり得る。丸薬、ロゼンジ、成型錠剤または湿製錠剤の場 合、湿式塊化法（moist massing techniques）を用いることができる。 治療薬は、粒径約１ｍｍの顆粒またはペレットの形態での微小複合粒子（mult iparticulates）としての製剤で含有させることができる。カプセル投与用の材 料の製剤は、粉末で軽く加圧したプラグ（plug）または錠剤であることもできる 。治療薬は圧縮によって製造することが可能である。 着色剤および芳香剤はいずれも含有させることができる。例えば、蛋白（また は誘導体）を製剤し（例えばリポソームカプセル封入またはミクロスフェアカプ セル封入によって）、さらに着色剤および芳香剤を含む冷蔵飲料などの食用製品 中に含有させることもできる。 不活性材料によって治療薬を希釈したり、増量させることができる。その希釈 剤には、特にマニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、ショ 糖、修飾デキストリン類およびデンプンのような炭水化物などがあり得る。トリ リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムなどのある種の無機 塩類も充填剤として使用することができる。市販の希 釈剤を数例挙げると、ファスト−フロ（Fast-Fro）、エムデックス（Emdex）、 ＳＴＡ−Ｒｘ １５００、エンコンプレス（Emcompress）およびアビセル（Avic ell）などがあり得る。 治療薬の製剤では、固体製剤に崩壊剤を含有させることができる。崩壊剤とし て使用される材料には、デンプンに基づく市販の崩壊剤であるエクスプロタブ（ Explotab）のようなデンプンなどがあるが、それに限定されるものではない。グ リコール酸デンプンナトリウム、アンバーライト、カルボキシメチルセルロース ナトリウム、ウルトラミロペクチン（ultramylopectin）、アルギン酸ナトリウ ム、ゼラチン、橙皮、酸カルボキシメチルセルロース、天然スポンジおよびベン トナイトはいずれも使用可能である。別の形の崩壊剤には、不溶性カチオン交換 樹脂がある。粉末ガムを崩壊剤および結合剤として用いることができ、それには 寒天、カラヤガムまたはトラガカントガムなどの粉末ガムなどがあり得る。アル ギン酸およびそれのナトリウム塩も崩壊剤として有用である。 結合剤を用いて治療薬を保持して硬錠剤を形成することができ、その結合剤に は、アカシアガム、トラガカントガム、デンプンおよびゼラチンなどの天然物か らの材料などがある。他に は、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）およびカルボキシメ チルセルロース（ＣＭＣ）などがある。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）および ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）をいずれもアルコール溶液で 使用して、治療薬の造粒を行うことができる。 減摩剤を治療薬製剤に含有させて、製剤工程中の粘着を防止することができる 。治療薬と金型壁との間の層として潤滑剤を用いることができ、それにはステア リン酸（それのマグネシウム塩およびカルシウム塩を含む）、ポリテトラフルオ ロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油およびロウなどがあるが、こ れらに限定されるものではない。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネ シウム、各種分子量のポリエチレングリコール、カーボワックス（Carbowax）４ ０００および６０００などの可溶性潤滑剤を使用することもできる。 製剤時の薬剤の流動性を改善したり、圧縮時の再配列を容易にする滑剤を加え ることも可能であると考えられる。滑剤には、デンプン、タルク、焼成シリカお よび水和シリコアルミネートなどがあり得る。 治療薬の水系環境への溶解を助けるため、湿展剤として界面 活性剤を加えることも考えられる。界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、 スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナトリウムな どのアニオン系洗剤などがあり得る。カチオン系洗剤を使用することが可能であ り、それには塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムなどがある。界面 活性剤として製剤に含有させることができると考えられるノニオン系洗剤を挙げ ると、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシ エチレン硬化ヒマシ油１０、５０および６０、モノステアリン酸グリセリン、ポ リソルベート４０、６０、６５および８０、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセル ロースならびにカルボキシメチルセルロースがある。これらの界面活性剤は、単 独であるいは各種比率での混合物として、蛋白もしくは誘導体の製剤に存在させ ることができると考えられる。 蛋白（または誘導体）の取り込みを促進する可能性のある添加剤としては例え ば、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸などの脂肪酸がある。 徐放製剤が望ましい場合がある。拡散機構または浸出機構による放出を可能と する不活性基剤（すなわちガム）に薬剤を取 り込ませることができる。徐々に分解する基剤を製剤に組み入れることもできる 。この治療薬の別の形態の徐放は、オロス（Oros）治療薬系（Alza Corp.）に基 づく方法によるものである。すなわち、水を浸入させ、浸透圧効果によって１個 の小さい開口から薬剤を押し出すことができる半透膜中に、薬剤を封入するもの である。一部の腸溶コーティングも遅延性放出効果を有するものである。 製剤には他のコーティングを使用することができる。それには、糖衣器に塗布 することができる各種糖などがある。治療薬はさらに、フィルムコーティング剤 で投与することも可能であり、その場合に使用される材料は２つの群に分けられ る。第１の群は、非腸溶性材料であり、メチルセルロース、エチルセルロース、 ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシ プロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボ キシメチルセルロース、プロビドン（providone）およびポリエチレングリコー ル類などがある。第２の群は腸溶性材料からなり、一般的にはフタル酸のエステ ルである。 材料を混合することで最適なフィルムコーティングを得るこ とも考えられる。フィルムコーティングは糖衣器もしくは流動床で、あるいは圧 縮コーティングによって行うことができる。 本発明においては、本発明の蛋白またはそれの誘導体を肺投与することも想到 される。蛋白（誘導体）は、吸入しながら哺乳動物の肺に投与され、肺上皮内層 を通過して血流に入る（これについての他の報告には次のものがある；Adjei et al.，Pharmaceutical Research 7:565-569(1990); Adjei et al.，Internation al Journal of Pharmaceutics 63: 135-144(1990)（酢酸ロイプロリド）；Braqu et et al.，Journal of Cardiovascular Pharmacology 13(suppl.5): s.143-146 (1989)（エンドテリン−１）；Hubbard et al.，Annals of Internal Medicine 3 :206-212(1989)(α１−抗トリプシン);Smith et al.，J.Clin.Invest.84:1145- 1146(1989)（α−１−プロテイナーゼ）；Oswein et al.，″Aerosolization of Proteins″，Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II，K eystone，Colorado，March，1990（組換えヒト成長ホルモン）；Debs et al.，T he Journal of Immunology 140:3482-3488(1988)（インターフェロン−γおよび 腫瘍壊死因子α）；Platz et al.，米国特許５２８４６５６号（顆粒球コロニー 刺激因子））。 本発明の実施においては、治療薬の肺投与用の多種の装置を使用することが想 到され、それには噴霧吸入器、用量計量吸入器および粉剤吸入器などの当業者に は周知のものなどがあるが、これらに限定されるものではない。 本発明の実施に好適な市販装置の具体例をいくつか挙げると、ウルトラベント (Ultravent)噴霧吸入器(製造者:Mallinckrodt，Inc.，St.Louis，Missouri)、エ ーコーン（Acorn）ＩＩ噴霧吸入器（製造者：Marquest Medical Products，Engl ewood，Colorado）、ベントリン（Ventolin）用量計量吸入器（製造者：Glaxo I nc.，Research Triangle Park，North Carolina）およびスピンヘイラー（Spinh aler）粉剤吸入器（製造者：Fisons Corp.，Bedford，Massachusetts）がある。 そのような装置のいずれにおいても、蛋白（または類縁体もしくは誘導体）の 投薬に好適な製剤を使用する必要がある。通常、各製剤は使用される装置の種類 に固有のものであり、治療に有用な希釈剤、補助剤および／または担体に加えて 、適切な墳射剤を使用する場合がある。 蛋白（または誘導体）は最も有利には、遠位肺への最も有効な投与を行うため に、平均粒径１０μｍ未満、最も好ましくは ０．５〜５μｍの粒子状に製剤しなければならない。 担体には、トレハロース、マニトール、キシリトール、ショ糖、乳糖、ソルビ トールのような炭水化物などがある。製剤で使用する他の成分には、ＤＰＰＣ、 ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣおよびＤＯＰＣなどがあり得る。天然または合成の界面活性 剤を使用することができる。ポリエチレングリコールを使用することができる（ 蛋白または類縁体の誘導体化での使用以外であっても）。シクロデキストリンな どのデキストリン類を使用することができる。胆汁酸塩および他の関連する相乗 剤を使用することができる。セルロースおよびセルロース誘導体を使用すること ができる。緩衝剤製剤での使用などで、アミノ酸を使用することができる。 さらに、リポソーム、マイクロカプセルもしくはミクロスフェア、包接錯体そ の他の種類の担体の使用も想到される。 噴射式または超音波式のいずれかの噴霧吸入器での使用に好適な製剤は代表的 には、液剤１ｍＬ当たり生理活性蛋白約０．１〜２５ｍｇの濃度となるように水 に溶かした蛋白（または誘導体）を含有するものである。その製剤には、緩衝剤 および単糖を含有させることもできる（例えば、蛋白の安定化および浸透 圧の調節のため）。噴霧吸入器用製剤には界面活性剤を含有させて、エアロゾル 形成時の液剤霧化によって生じる蛋白の表面誘発凝集を低減もしくは防止するこ ともできる。 用量計量吸入器で使用する製剤は通常、界面活性剤を用いて噴射剤中に懸濁さ せた蛋白（または誘導体）を含む微細粉末を含有する。噴射剤は、クロロフルオ ロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボンまたは炭 化水素などのその目的に使用される従来の材料とすることができ、それには具体 的にはトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラ フルオロエタノールおよび１，１，１，２−テトラフルオロエタンあるいはそれ らの組み合わせなどがある。好適な界面活性剤には、トリオレイン酸ソルビタン および大豆レシチンなどがある。オレイン酸も、界面活性剤として有用であると 考えられる。 粉剤吸入器からの投薬用の製剤は、蛋白（または誘導体）を含有する微細乾燥 粉末を含むものであり、乳糖、ソルビトール、ショ糖、マニトール、トレハロー スまたはキシリトールのような増量剤を、例えば製剤の５０〜９０重量％のよう に装置からの粉剤の分散を容易にするような量で含有することもできる。 蛋白（または類縁体もしくは誘導体）の経鼻投与も想到される。経鼻投与によ って、治療薬を鼻に投与した直後に蛋白の血流への通過を行うことができ、薬剤 を肺に堆積させる必要がない。経鼻投与用の製剤には、デキストリンまたはシク ロデキストリンを含むものなどがある。他の粘膜を通っての輸送を介した投与も 想到される。 当業者であれば、投与と所望の治療効果を観察することで、有効用量を確認す ることができる。好ましくは、その分子の製剤は、約０．１０μｇ／ｋｇ／日〜 １０ｍｇ／ｋｇ／日で所望の治療効果が得られるようなものとする。有効用量は 、経時的診断手段を用いて決定することができる。例えば、血中（または血漿も しくは血清中）のＯＢ蛋白の量を測定する診断を最初に行って、ＯＢ蛋白の内因 性レベルを求めることができる。そのような診断手段は、抗体サンドイッチアッ セイなどの抗体アッセイの形態であることができる。内因性ＯＢ蛋白の量を最初 に定量し、基底線値を求める。治療中に内因性および外因性のＯＢ蛋白（すなわ ち、自己産生または投与された体内で認められる蛋白、類縁体または誘導体）の 定量を継続することで、治療用量を求める。従って、用量は治療中に変動し得る ものであ り、治療効果が認められるまで最初は比較的高用量を用い、治療効果の維持には 比較的低用量を用いる。 理想的には、非脂肪体重増加のみが望まれる場合は、体重減を行うにはその用 量は不十分である。そこで、肥満者の治療の初期では、体重減と同時に脂肪組織 減／非脂肪体重増が得られるような用量を投与することができる。十分な体重減 が得られたら、体重の再増加を防止するが所望の非脂肪重増加（あるいは非脂肪 重低下の防止）を維持するだけの用量を投与することができる。ＯＢ蛋白の効果 は可逆的であることから、これらの用量は経験的に決定することができる（例： Campfield et al.,Science 269:546-549(1995),p.547）。そこで、体重減少が望 ましくない場合に体重減が認められる場合、それより低い用量を投与することで 、非脂肪組織重の所望の増加を得て、しかも所望の体重を維持することになろう 。 対象者のインシュリンに対する感受性を高めるには、同様の用量検討を考慮す ることになると考えられる。体重減を伴わない非脂肪重増加が得られれば、対象 者に対して糖尿病治療向けに投与されるインシュリン（あるいはアミリンその他 の糖尿病治療薬）の量を低下させることができると考えられる。 全身活力を高めるため、同様の用量検討を行うことができる。全身活力の同時 向上を伴う非脂肪重増加は、体重減を得るには不十分な用量で得ることができる 。赤血球数（および血液における酸素化）増加および骨吸収の低下もしくは骨粗 鬆症の軽減などの他の効果も、体重減なく得ることができる。 本発明の方法を、糖尿病治療に有用な薬剤（例：インシュリンおよび可能性と してアミリン）、コレステロールおよび降圧剤（血液脂質濃度を低下させる薬剤 その他の心血管薬）ならびに活動性向上薬（例：アンフェタミン類）などの他の 薬剤と併用することができる。食欲抑制薬も使用することができる。そのような 投与は同時に、または連続的に行うことができる。 さらに本発明の方法を、身体の全体的容貌を変えるための美容手術などの外科 手術（例：体重減少のための脂肪吸引またはレーザ手術あるいは身体の見かけを 増加させるための移植術）と併用することができる。動脈プラークなどの脂肪沈 着物による血管閉塞によって起こる有害な状態を緩和するためのバイパス術その 他の手術のような心臓手術の医療上の効果を、本発明の組成物および方法を併用 することで高めることができる。超音波法またはレーザ法などの胆石除去方法を 、本発明の治療方 法の前、途中または後に行うこともできる。さらに、本発明の方法を、骨折、筋 肉損傷の手術または治療その他の非脂肪組織重の増加によって改善される可能性 のある療法に対する補助手段として行うことができる。 従って本発明の方法は、非脂肪組織重増加方法において、 （ａ）配列番号２（下記）または配列番号４（下記）に示したアミノ酸配列１ 〜１４６； （ｂ）位置３５にリジン残基と位置７４にイソロイシン残基を有する配列番号 ４（下記）に示したアミノ酸配列群１〜１４６； （ｃ）位置４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６ 、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５ 、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２ および１４５（配列番号４による番号割り付けを用い、位置２８におけるグルタ ミン残基がなくとも同じ番号割り付けを維持して）のうちの１以上において異な るアミノ酸による置換がある上記下位項目（ｂ）のアミノ酸配列； （ｄ）位置２８のグルタミン残基が欠失していても良い上記下位項目（ａ）、 （ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列； （ｅ）Ｎ末端にメチオニン残基を有する上記下位項目（ａ）、（ｂ）、（ｃ） または（ｄ）のアミノ酸配列； （ｆ）（位置３５にリジン残基と位置７４にイソロイシン残基を有する配列番 号４の番号割り付けを用いて） （ｉ）アミノ酸９８〜１４６ （ｉｉ）アミノ酸１〜３２ （ｉｉｉ）アミノ酸４０〜１１６ （ｉｖ）アミノ酸１〜９９および１１２〜１４６ （ｖ）アミノ酸９９と１１２の間にアミノ酸１００〜１１１の１以上がその 順序で存在するアミノ酸１〜９９および１１２〜１４６； （ｖｉ）アミノ酸１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１ １、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５のうちの１以上が別 のアミノ酸によって置換されている上記下位項目（ｉ）の切断ＯＢ類縁体； （ｖｉｉ）アミノ酸４、８および３２のうちの１以上が別のアミノ酸によっ て置換されている上記下位項目（ｉｉ）の切断類縁体； （ｖｉｉｉ）アミノ酸５０、５３、６０、６４、６６、６７、 ６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６ 、１０７、１０８、１１１および１１２のうちの１以上が別のアミノ酸によって 置換されている上記下位項目（ｉｉｉ）の切断類縁体； （ｖｉｘ）アミノ酸４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、 ６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１１２、１１ ８、１３６、１３８、１４２および１４５のうちの１以上が別のアミノ酸によっ て置換されている上記下位項目（ｉｖ）の切断類縁体； （ｘ）アミノ酸４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４ 、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、 １０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、 １４２および１４５のうちの１以上が別のアミノ酸によって置換されている上記 下位項目（ｖ）の切断類縁体； （ｘｉ）Ｎ末端メチオニン残基を有する上記下位項目（ｉ）〜（ｘ）のいず れかの切断類縁体から選択される切断ＯＢ蛋白類縁体； （ｇ）蛋白部分に連結した化学部分を有してなる上記下位項 目（ａ）〜（ｆ）のいずれかのＯＢ蛋白もしくは類縁誘導体； （ｈ）前記化学部分が水溶性ポリマー部分である上記下位項目（ｇ）の誘導体 ； （ｉ）前記水溶性ポリマー部分がポリエチレングリコールである上記下位項目 （ｈ）の誘導体； （ｊ）前記水溶性ポリマー部分がポリアミノ酸部分である上記下位項目（ｈ） の誘導体； （ｋ）前記水溶性ポリマー部分が前記蛋白部分のＮ末端のみに結合している上 記下位項目（ｈ）の誘導体； （ｌ）上記下位項目（ａ）〜（ｋ）のいずれかのＯＢ蛋白、類縁体もしくは誘 導体から選択される有効量のＯＢ蛋白、該蛋白の類縁体もしくは誘導体が医薬的 に許容される担体に入ったものを投与する段階を有してなる方法を提供するもの である。 以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するためのものであって、本発明の 範囲を限定するものと解釈すべきではない。実施例１は、ＯＢ蛋白が非肥満動物 における非脂肪重増加に有効であることを示すものである。実施例２は、ＯＢ蛋 白が肥満霊長動物における非脂肪重増加に有効であることを示すものである。実 施例３〜５は、ヒトでの使用の予想実施例である。材 料および方法がそれに続く。実施例１ 以下のデータは、ＯＢ蛋白またはそれの類縁体もしくは誘導体が非脂肪重増加 に対して有効であることを示している。 組換えメチオニンマウスＯＢ蛋白（以下に説明）を４週間にわたって浸透ポン プ注入によって連続投与した。表１のデータは、表に示した用量での平均体重組 成（ＤＣ１マウスで）を示している。 非肥満ＣＤ１マウスでは、０．３または１ｍｇ／ｋｇ／日の用量で組換えメチ オニンマウスＯＢ蛋白を連続投与することで、ＰＢＳを投与した対照動物と比較 して、非脂肪重の増加を生じることが明らかになった。実施例２ 本実施例は、組換えメチオニンヒトＯＢ蛋白によって、霊長動物で非脂肪組織 重増加が生じることを示すものである。 体脂肪率が２０％を超える肥満カニクイザルに、１日用量１ｍｇ蛋白／ｋｇ／ 日で組換えメチオニンヒトＯＢ蛋白を皮下投与した（以下の材料および方法の欄 参照）。対照動物には、リン酸緩衝生理食塩水を投与した。二重エネルギーＸ線 吸光光度分析（「ＤＥＸＡ」）を用いて身体組成検査を行った。身体組成の測定 は７日間間隔で行った。 表２Ａおよび２Ｂには、脂肪組織または非脂肪組織に関する身体組成分析の結 果を示してある。データはグラム単位で表してある。２匹の対照動物についての 結果を表２Ａに示してある。４匹の試験動物についてのデータを表２Ｂに示して ある（骨質量データも示してある）。表からわかる通り、第２８日で、試験動物 は約２６４ｇの脂肪を失い、約１３８ｇの非脂肪重を獲得した。第２８日で、対 照動物は３６ｇの脂肪組織を失い、約２５ｇの非脂肪重を獲得した。これは、Ｏ Ｂ蛋白が非脂肪組織重の増加を起こすことを示している。*繰り返し測定値ＡＮＯＶＡのｐ値が０．０５未満であることを示す。実施例３ 非肥満ヒト患者は、非脂肪組織重が減少した病気からの回復などの治療目的で 、非脂肪組織重増加を望む。患者に対して有効量のＯＢ蛋白、それの類縁体また は誘導体を投与することで、非脂肪組織重に所望の増加が得られる。非組織重増 加は、ＤＥＸＡ走査を用いてモニタリングする。ＯＢ蛋白（または利用可能な 場合は他の抗原性源）に対する抗体アッセイなどの診断キットを用いて、循環Ｏ Ｂ蛋白または類縁体もしくは誘導体の濃度をモニタリングすることができる。実施例４ ヒト対象者は、非脂肪組織増加による容貌向上などの美容上または運動上の目 的で、非脂肪組織重増加を望む。対象者に対して有効量のＯＢ蛋白、それの類縁 体または誘導体を投与することで、非脂肪組織重に所望の増加が得られる。非組 織重増加は、ＤＥＸＡ走査を用いてモニタリングする。血中酸素濃度が上昇する 。ＯＢ蛋白（または利用可能な場合は他の抗原性源）に対する抗体アッセイなど の診断キットを用いて、循環ＯＢ蛋白または類縁体もしくは誘導体の濃度をモニ タリングすることができる。実施例５ ヒト糖尿病患者は、糖尿病治療のために使用するインシュリン用量の低減を望 む。患者に対して有効量のＯＢ蛋白、それの類縁体または誘導体を投与すること で、非脂肪組織重に増加が得られる。インシュリンに対する患者の感受性が上昇 し、糖尿病の症状を緩和するのに必要なインシュリンの用量が、必要な インシュリンの単位数低下または１日当たり必要なインシュリン注射回数の低下 のいずれかで低下する。ＯＢ蛋白（または利用可能な場合は他の抗原性源）に対 する抗体アッセイなどの診断キットを用いて、循環ＯＢ蛋白または類縁体もしく は誘導体の濃度をモニタリングすることができる。実施例６ 非肥満高齢ヒト対象者は、全身活力の向上を望む。対象者に対して有効量のＯ Ｂ蛋白、それの類縁体または誘導体を投与することで、非脂肪組織重に増加を得 て、全身活力を向上させる。骨吸収も低下し、骨粗鬆症状態が改善される。ＯＢ 蛋白（または利用可能な場合は他の抗原性源）に対する抗体アッセイなどの診断 キットを用いて、循環ＯＢ蛋白または類縁体もしくは誘導体の濃度をモニタリン グすることができる。材料および方法 動物 齧歯類 実施例１には、野生型ＣＤ１マウスを用いた（表１のデータ）。動物は、愛護 的条件下に維持した。霊長動物 計６匹のカニクイザルを用いた。サルはいずれも、試験開始時には脂肪率２０ ％以上であった。動物は体重について無作為化し、動物４匹についてＯＢ蛋白に よる試験を行い、２匹は対照とした。蛋白または媒体の投与 齧歯類の場合 実施例１の場合（表１のデータ）、組換えマウス蛋白（以下に記載）または媒 体（リン酸緩衝生理食塩水、「ＰＢＳ」、ｐＨ７．４）を、浸透ポンプ注入によ って投与した。浸透小型ポンプ（Alzet，Alza，Palo Alto，CA、２００２型）を 、各マウスの肩甲下領域の皮下嚢部に手術によって植え込み、２週間後に交換し た。ポンプの較正を行って、表１に示した用量で、１時間当たり０．５μ蛋白の 溶液を投与するようにした。霊長動物の場合 実施例２の場合、１ｍｇ／ｍＬＰＢＳで調製した組換えメチオニンヒトＯＢ蛋 白（位置３５にリジン、位置７４にイソロイシンを有する配列番号４のもの）を 、用量１ｍｇ蛋白／ｋｇ／日で皮下投与した。対照動物には、同じやり方でＰＢ Ｓを投与 した。齧歯類屠体分析 レシュナーらの方法に従って屠体分析を行った(A.I.Leshner，V.A.Litwin and R.L.Squibb，Brain Res．9:281(1972))。４日間の脱水期間の前後での屠体重量 差によって、水分組成を求めた。粉砕・乾燥した屠体の予め秤量した一部から、 エチルエーテルおよびエチルアルコールで脂肪の抽出を行って、抽出法後に残っ たものの量から脂肪パーセントを計算できた。非脂肪重は、脱水およびエーテル 抽出後に残った粉砕屠体の割合と定義した。霊長動物二重エネルギーＸ線吸光光度分析走査 実施例２では、表２Ａおよび２Ｂに示した時点で、「ＤＥＸＡ」走査を行った 。蛋白 配列番号１および２はマウス組換えＯＢ ＤＮＡおよび蛋白を示し、配列番号 ３および４は類縁の組換えヒトＯＢ ＤＮＡおよび蛋白を示している。実施例１ では、配列番号２のマウス組換え蛋白を使用した。実施例２では、位置３５にリ ジン残基と位置７４にイソロイシン残基を有する配列番号４に示した組換えヒト ＯＢ蛋白を用いた。上記のように、以下のマウスおよ びヒト類縁の組換え蛋白は、本発明の医薬品の投与方法および製造方法で使用で きるＯＢ蛋白を例示するものであって、他のＯＢ蛋白またはそれの類縁体もしく は誘導体を使用することは可能である。 本明細書において、組換え蛋白のアミノ酸配列の最初のアミノ酸を＋１とし、 それはバリンであって、位置−１のアミノ酸はメチオニンである。Ｃ末端アミノ 酸は番号１４６である（システイン）。組換えマウスメチオニンＯＢ（二本鎖）ＤＮＡおよびアミノ酸配列 （配列番号１ および２） 組換えヒトメチオニンＯＢ類縁（二本鎖）ＤＮＡおよびアミノ酸配列（配列番号 ３および４） 製造方法 以下の製造方法を用いて、生理活性の組換えメチオニンマウスまたはヒト類縁 ＯＢ蛋白を製造した。同様の方法を用いて、生理活性組換えメチオニンヒトＯＢ 蛋白を製造することができる。発現ベクターおよび宿主株 使用したプラスミド発現ベクターはｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ寄託番号６９ ５７６）である。上記のＤＮＡをＸｂａＩおよびＢａｍＨＩによって直線とした 発現ベクターｐＣＦＭ１６５６に連結し、大腸菌宿主株ＦＭ５に形質転換した。 大腸菌ＦＭ５細胞は、大腸菌Ｋ−１２株（Bachmann et al.，Bacteriol.Rev.40: 116-167(1976)）からアムゲン(Amgen Inc.，Thousand Oaks，CA) で誘導したものであり、組み込みλファージ抑制遺伝子ｃＩ₈₅₇を有する（Sussm an et al.，C.R.Acad.Sci．254:1517-1579(1962)）。ベクター製造、細胞形質転 換およびコロニー選択は、標準的方法によって行った（例：Sambrook et al.，M olecular Cloning:A Laboratory Manual，2d Edition，Cold Spring Harbor Lab oratory Press，Cold Spring Harbor，NY）。宿主細胞はＬＢ培地で成長させた 。発酵工程 フェドーバッチ培養法として知られる３段階発酵プロトコールを用いた。培地 組成は以下の通りである。 バッチ：窒素・リン酸源を発酵槽（Biolafitte、容量１２リットル）で滅菌し た（昇温して１２２℃で３５分間、１８〜２０ｐｓｉ）。冷却時に、炭素源、マ グネシウム源、ビタミン源および微量金属源を無菌的に加えた。５００ｍＬの上 記組換えマウス蛋白産生菌（ＬＢ肉汁で成長させたもの）の終夜培養物（１６時 間以上）を発酵槽に入れた。 供給液Ｉ：ＯＤ₆₀₀が４．０〜６．０に達した時点で、培地に供給液Ｉを加え た。グルコースの供給は速度を制限しながら行って、成長速度（μ）を制御した 。自動システム（分配制御 システムと称する）を設定して、成長速度を１時間当たり０．１５世代に制御し た。 供給液ＩＩ：ＯＤ₆₀₀が３０に達した時点で、培養温度を徐々に上げて４２℃ とし、供給液を下記の供給液ＩＩに変えた。２時間ごとにサンプリングを行いな がら、発酵を１０時間継続した。１０時間後、発酵槽の内容物を冷却して２０℃ 以下とし、遠心によって回収した。 培地組成 バッチ： １０ｇ／Ｌ 酵母抽出物 ５．２５ｇ／Ｌ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ３．５ｇ／Ｌ Ｋ₂ＨＰＯ₄ ４．０ｇ／Ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄ ５．０ｇ／Ｌ グルコース １．０ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ２．０ｍＬ／Ｌ ビタミン溶液 ２．０ｍＬ／Ｌ 微量金属溶液 １．０ｍＬ／Ｌ Ｐ２０００消泡剤 供給液Ｉ： ５０ｇ／Ｌ バクトトリプトン ５０ｇ／Ｌ 酵母抽出物 ４５０ｇ／Ｌ グルコース ８．７５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １０ｍＬ／Ｌ ビタミン溶液 １０ｍＬ／Ｌ 微量金属溶液 供給液ＩＩ： ２００ｇ／Ｌ バクトトリプトン １００ｇ／Ｌ 酵母抽出物 １１０ｇ／Ｌ グルコース ビタミン溶液（バッチおよび供給液Ｉ）：ビオチン０．５ｇ、葉酸０．４ｇお よびリボフラビン４．２ｇをＨ₂Ｏ ４５０ｍＬおよび１０Ｎ ＮａＯＨ ３ｍ Ｌに溶かし、Ｈ₂Ｏを加えて５００ｍＬとした。ピリドキシン−ＨＣｌ １４ｇ およびナイアシン６１ｇをＨ₂Ｏ １５０ｍＬおよび１０Ｎ ＮａＯＨ ５０ｍ Ｌに溶かし、Ｈ₂Ｏで２５０ｍＬとした。パントテン酸５４ｇをＨ₂Ｏ ２００ｍ Ｌに溶かし、２５０ｍＬとした。これら３種類の溶液を混合し、総量１０リット ルとした。 微量金属溶液（バッチおよび供給液Ｉ）： 塩化第ＩＩ鉄（ＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ）：２７ｇ／Ｌ 塩化亜鉛（ＺｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ）：２ｇ／Ｌ 塩化コバルト（ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ）：２ｇ／Ｌ モリブデン酸ナトリウム（ＮａＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ）：２ｇ／Ｌ 塩化カルシウム（ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ）：１ｇ／Ｌ 硫酸第ＩＩ銅（ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ）：１．９ｇ／Ｌ ホウ酸（Ｈ₃ＢＯ₃）：０．５ｇ／Ｌ 塩化マンガン（ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ）：１．６ｇ／Ｌ クエン酸ナトリウム・２水和物：７３．５ｇ／ＬマウスＯＢ蛋白の精製方法 以下の段階によって精製を行った（別断の断りがない限り、以下の段階は４℃ で行った）。 １．細胞ペースト 大腸菌細胞ペーストを５倍容量の７ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）に懸濁し た。ＥＤＴＡ中の細胞をミクロ流動装置に２回通してさらに粉砕した。粉砕細胞 をベックマン（Beckman）Ｊ６−Ｂ遠心管中、ＪＳ−４．２ローターを用いて４ ．２Ｋｒｐｍ で１時間遠心した。 ２．封入体洗浄１ 上記からの上清を除去し、ペレットを５倍容量の７ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７ ．０）に再懸濁し、均質化した。この混合物を段階１の方法で遠心した。 ３．封入体洗浄２ 上記からの上清を除去し、ペレットを１０倍容量の２０ｍＭトリス（ｐＨ８ ．５）、１０ｍＭ ＤＴＴおよび１％デオキシコレートに再懸濁し、均質化した 。この混合物を段階１の方法で遠心した。 ４．封入体洗浄３ 上記からの上清を除去し、ペレットを１０倍容量の蒸留水に再懸濁し、均質 化した。この混合物を段階１の方法で遠心した。 ５．巻き戻し ペレットについて室温で、１５倍容量の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５ ）、１％サルコシンナトリウム（Ｎ−ラウロイルサルコシン）で巻き戻しを行っ た。６０分後、溶液を６０μＭ硫酸銅液とし、終夜攪拌した。 ６．サルコシンの除去 巻き戻し混合物を、５倍容量の１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈 し、段階１の方法に従って遠心した。上清を回収し、希釈巻き戻し混合物の総容 量の０．０６６％で、２０〜５０ Chemical Co.，Midland MI）と、攪拌下に１時間混合した（ダ頁参照）。この混合物をカラムに注ぎ入れ、溶出液を回収した。サルコシンの除 去を、逆相ＨＰＬＣによって確認した。 ７．酸沈殿 前段階からの溶出液を回収し、ｐＨを調節してｐＨ５．５とし、室温で３０ 分間インキュベーションした。この混合物を段階１の方法に従って遠心した。 ８．カチオン交換クロマトグラフィー 前段階からの上清のｐＨを調節してｐＨ４．２とし、ＣＭセファロース・フ ァスト・フロー（Sepharose Fast Flow）に負荷した（７％容量）。２０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．２で、２０倍カラム容量にて０Ｍから１．０ＭＮａＣｌの 塩勾配溶離を行った。 ９．疎水性相互作用クロマトグラフィー 前段階からのピーク分画のＣＭセファロース蓄積液（紫外線吸光度から確認 ）を０．２Ｍ硫酸アンモニウム液とした。５ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．２で、 ２０倍カラム容量にて０．４Ｍから０Ｍ硫酸アンモニウムの逆相勾配溶離を行っ た。この材料を濃縮し、ＰＢＳに透析濾過した。組換えヒトＯＢ蛋白類縁体の発酵 上記の宿主細胞の発酵による組換えヒトＯＢ蛋白類縁体（配列番号４）の製造 は、組換えマウス材料について前述した条件および組成物を用いて行うことがで きる。組換えヒトＯＢ蛋白類縁体の精製 組換えヒト蛋白類縁体の精製は、上記の実施例１に記載の方法に従って、組換 えマウス蛋白の精製に用いた方法と同様の方法を用いて行うことができる。組換 えヒトＯＢ蛋白類縁体を得るには、段階７からの上清のｐＨをｐＨ５．０に調節 し、それをＣＭセファロース・ファスト・フローカラムに負荷することで、段階 ８を行わなければならない。２０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５で、２０倍カラ ム容量にて０Ｍから０．５ＭＮａＣｌの塩勾配溶離を行わなければならない。段 階９は、ＣＭセファロ ース蓄積液を水で４倍に希釈し、ｐＨを７．５に調節することで行わなければな らない。この混合物を０．７Ｍ硫酸アンモニウム液としなければならない。５ｍ Ｍ ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５で、２０倍カラム容量にて０．２Ｍから０Ｍ硫酸ア ンモニウムの逆相勾配溶離を行わなければならない。それ以外は上記の段階と同 じである。実施例２の材料については、位置３５にリジンおよび位置７４にイソ ロイシンを有する配列番号４の組換えヒトＯＢ蛋白を、１０ｍＭヒスチジン、４ ．３％アルギニンを含む緩衝液でｐＨ６．０にて製剤した。 以上、好ましい実施態様によって本発明について説明したが、当業者が変更お よび修正を行ない得ることは明らかである。従って請求の範囲が、特許請求され る発明の範囲に含まれるそのような均等な変更全てを含むものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 トウームス・クリストフアー・フランシス アメリカ合衆国、カリフオルニア93012、 カマリロ ラデーラ・ビスタ・ドライブ・ 5076

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 非脂肪組織重増加方法において、 （ａ）配列番号２または配列番号４に示したアミノ酸配列１〜１４６； （ｂ）位置３５にリジン残基と位置７４にイソロイシン残基を有する配列番号 ４に示したアミノ酸配列群１〜１４６； （ｃ）位置４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６ 、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５ 、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２ および１４５（配列番号４による番号割り付けを使用）のうちの１以上において 異なるアミノ酸による置換がある上記下位項目（ｂ）のアミノ酸配列； （ｄ）位置２８のグルタミン残基が欠失していても良い上記下位項目（ａ）、 （ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列； （ｅ）Ｎ末端にメチオニン残基を有する上記下位項目（ａ）、（ｂ）、（ｃ） または（ｄ）のアミノ酸配列； （ｆ）（位置３５にリジン残基と位置７４にイソロイシン残 基を有する配列番号４の番号割り付けを使用して） （ｉ）アミノ酸９８〜１４６ （ｉｉ）アミノ酸１〜３２ （ｉｉｉ）アミノ酸４０〜１１６ （ｉｖ）アミノ酸１〜９９および１１２〜１４６ （ｖ）アミノ酸９９と１１２の間にアミノ酸１００〜１１１の１以上がその 順序で存在するアミノ酸１〜９９および１１２〜１４６； （ｖｉ）アミノ酸１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１ １、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５のうちの１以上が別 のアミノ酸によって置換されている上記下位項目（ｆ）（ｉ）の切断ＯＢ類縁体 ； （ｖｉｉ）アミノ酸４、８および３２のうちの１以上が別のアミノ酸によっ て置換されている上記下位項目（ｆ）（ｉｉ）の切断類縁体； （ｖｉｉｉ）アミノ酸５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、 ７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１ ０８、１１１および１１２のうちの１以上が別のアミノ酸によって置換されてい る上記下位項目 （ｆ）（ｉｉｉ）の切断類縁体； （ｖｉｘ）アミノ酸４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、 ６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１１２、１１ ８、１３６、１３８、１４２および１４５のうちの１以上が別のアミノ酸によっ て置換されている上記下位項目（ｆ）（ｉｖ）の切断類縁体； （ｘ）アミノ酸４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４ 、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、 １０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、 １４２および１４５のうちの１以上が別のアミノ酸によって置換されている上記 下位項目（ｆ）（ｖ）の切断類縁体； （ｘｉ）Ｎ末端メチオニン残基を有する上記下位項目（ｆ）（ｉ）〜（ｘ） のいずれかの切断類縁体から選択される切断ＯＢ蛋白類縁体； （ｇ）蛋白部分に連結した化学部分を有してなる上記下位項目（ａ）〜（ｆ） のいずれかのＯＢ蛋白もしくは類縁誘導体； （ｈ）前記化学部分が水溶性ポリマー部分である上記下位項目（ｇ）の誘導体 ； （ｉ）前記水溶性ポリマー部分がポリエチレングリコールである上記下位項目 （ｈ）の誘導体； （ｊ）前記水溶性ポリマー部分がポリアミノ酸部分である上記下位項目（ｈ） の誘導体； （ｋ）前記水溶性ポリマー部分が前記蛋白部分のＮ末端のみに結合している上 記下位項目（ｈ）の誘導体； （ｌ）上記下位項目（ａ）〜（ｋ）のいずれかのＯＢ蛋白、類縁体もしくは誘 導体から選択される有効量のＯＢ蛋白、該蛋白の類縁体もしくは誘導体が医薬的 に許容される担体に入ったものを投与する段階を有してなる方法。 ２． 前記方法によって、インシュリンに対する感受性向上も得られる請求項１ に記載の方法。 ３． 前記方法によって全身活力向上も得られる請求項１に記載の方法。 ４． 前記方法によって、骨吸収低下も得られる請求項１に記載の方法。