JP2002522512A - デキストラン−レプチン結合体、医薬組成物および関連方法 - Google Patents
デキストラン−レプチン結合体、医薬組成物および関連方法Info
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Abstract
Description
を含むレプチン蛋白類へのデキストラン部分の付着の分野に関するものである(
本明細書で使用される「蛋白」という用語は別段の断りがない限り、「ポリペプ
チド」または「ペプチド」と同義である)。別の態様において本発明は、デキス
トラン−レプチン結合体を含む医薬組成物に関する。本発明はさらに、関連する
組成物ならびにそのような組成物の製造方法および使用方法も提供するものであ
る。
のコードされた蛋白(「OB蛋白」または「レプチン」)の同定によって、身体
が体脂肪沈着を調節するのに使用する機序について若干理解が進んだ(「Modula
tors of Body Weight, Corresponding Nucleic Acids and Proteins, and Diagn
ostic and Therapeutic Uses Thereof」という名称のPCTWO96/0530
9(引用によってその全内容が本明細書に含まれるものとする);Zhang et al.
, Nature 372: 425-32 (1994)参照;さらにNature 374: 479 (1995)での修正も
参照(後者2文献も引用によって本明細書に含まれる))。OB蛋白はob/o
b突然変異マウス(OB遺伝子産生物の産生における欠陥のために肥満のマウス
)と正常な野生型マウスの両方においてin vivoで活性である。その生理活性は
、特に体重減少において発現される(概論として、Barinaga,″Obese″ Protein
Slims Mice″ Science 269: 475-76 (1995)参照)。OB蛋白、類縁体、誘導体
および哺乳動物およびヒトを含む動物の体重および肥満症抑制のための調節剤と
してのそれの使用については、WO96/05309(前記)に詳細に開示され
ている(PCT国際公開番号WO96/40912、WO97/06816、9
7/18833、WO97/38014、WO98/08512およびWO98
/28427も参照)。OB蛋白または本明細書での呼称でのレプチンは、ヒト
において体重減少を起こす(Greenberg et al., ″Preliminary safety and eff
icacy of recombinant methionyl human leptin (rL) administered by SC inje
ction in lean and obese subjects″;1998年6月14日のイリノイ州シカ
ゴでの第58回Annula Meeting and Scientific Sessions of the American Dia
betes Associationでの発表のポスター)。
的に修飾することで全身循環にレプチン蛋白を連続投与することで、体重減少に
必要な用量を低減することが知られている(例:「OB蛋白組成物および方法」
という名称のPCT WO96/40912(引用によって本明細書に含まれる
))。一般に、蛋白の製剤および化学修飾が追求する利点には、ある一定の環境
下で、治療効果のある蛋白の安定性および循環時間の向上ならびに免疫原性低下
などがあり得る。蛋白修飾および融合蛋白について記述した総説がフランシスに
よって書かれている(Francis, Focus on Growth Factors 3: 4-10 (May 1992)
(Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20, OLD, UKが
出版))。化学部分を結合させるための各種手段が現在利用可能である(例えば
、「N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods」
という名称の特許協力条約(PCT)国際公開番号WO96/11953(引用
によってその全内容が本明細書に含まれる)参照)。このPCT公開には特に、
水溶性ポリマーの蛋白N−末端への選択的付着が開示されている。
ーの一種である(前述のWO96/11953参照。これにはN末端モノペギル
化(monopegylated)顆粒球コロニー刺激因子(「G−CSF」)およびN末端
モノペギル化コンセンサスインターフェロン(「N末端モノペギル化」とは、蛋
白部分がN末端で1個のポリエチレングリコール部分に結合していることを示し
ている)も開示されている。)。ポリエチレングリコール部分を用いて、G−C
SFならびに巨核球成長・発達因子(「MGDF」)などの一部の治療効果を有
する蛋白について非常に良好な成果を得ることができる(Sheridan & Menchaca,
″Overview of the Safety and Biologic Effects of PEG-rHuMGDF in Clinica
l Trials,″ in Stem Cells 16 (suppl.2): 193-98 (1998))。
である。デキストラン類は、主としてα1−6連結によって連結したグルコース
の個々のサブユニットからなる多糖ポリマーである。デキストラン自体は多くの
分子量範囲で入手可能であり、約1キロダルトン(「kD」)から約70kDの
分子量で容易に入手可能である(「約」という用語は、一部のデキストラン分子
は記載の分子量よりわずかに重く、一部はそれ以下である場合があることから、
代表的な市販の医薬用デキストラン製造品における平均分子量を示すのに使用さ
れる)。デキストランは蛋白修飾に好適な水溶性ポリマーである(前述のWO9
6/11953および前述のWO96/05309参照)。治療効果のあるまた
は診断用の免疫グロブリン類に結合したデキストランを使用することも報告され
ている。発明の名称が「Polysaccharide-Modified Immunoglobulins Having Red
uced Immunogenic Potential or Improved Pharmacokinetics」である欧州特許
(「EP」)公開番号0315456(引用によって本明細書に含まれる)には
、デキストラン類などの修飾された低分子量多糖類に連結した免疫グロブリンま
たはそれの断片が報告されている。
がある(例えば、Remington′s Pharmaceutical Sciences, 18th ed., at 804-0
5 (Mack Publishing Co.: Easton, PA (1990)参照;引用によって本明細書に含
まれる)。分子量約40、70および75kDのデキストラン類などの比較的大
きい分子量のデキストラン類を含む溶液は入手可能であり、グラム単位で投与さ
れる。デキストラン−鉄溶液も貧血の治療に使用される。
と報告されている(例えば、Diomi et al., Annals of Surgery 172: 813-24 (1
970)(イヌにおける腎臓空胞化を報告);Maunsbach et al., Laboratory Inves
tigation 11: 421-32 (1962)(ラットにおける腎臓空胞化を報告)参照;さらに
は、Engberg, Acta Chir. Scand., 142: 172-80 (1976)も参照)。特定の例では
ポリエチレングリコール−蛋白結合体も腎臓空胞誘発に関連していた(Bendele
et al., Toxicological Sciences 42: 152-57 (1998))。腎臓空胞は現在では臨
床的に関連あるとは理解されていないが、医薬組成物は許容されない解剖学的変
化を起こさずに有効でなければならない。そこで、分子量の大きいデキストラン
類およびポリエチレングリコールポリマー類は全ての治療効果を有する蛋白の化
学修飾に利用可能であるとは限らない。
るアナフィラキシー反応の可能性である(例えば、総説についてはRichter et a
l., Immunology Today3: 132-38 (1982)(引用によって本明細書に含まれるもの
とする)ならびにそこに引用されている参考文献参照)。ある種の患者は、これ
らの大分子量デキストランに結合する既形成抗体を全身循環に有する場合がある
と考えられている。大分子量の臨床用デキストランをIgGクラスのこれら既形
成デキストラン反応性抗体(「DRA」)力価が高い小さい(しかし予測できな
い)患者小群に投与するとアナフィラキシーショックが生じ、場合によっては死
亡する。臨床用デキストランは有害な免疫複合体を生じ、それが補体を活性化し
て、白血球および血小板の凝集が起こると考えられている。凝集物は肺内に取り
込まれ、血管作用性介在物質の放出によって、アナフィラキシー反応が生じると
考えられる(前述のRichter et al., at 136)。
デキストラン溶液が、既形成DRAのハプテン阻害薬として研究されている。6
グルコース単位のデキストラン断片(分子量990)がin vivo実験用の1価ハ
プテン製造物として好適であることが認められている(前述のRichter et al.,
at 136 et seq)。アナフィラキシー反応低減のためのハプテン阻害の使用は、
血液増量剤について非常に奏功している(例えば、Ljungstrom, Infusionsther
Transfusionsmed 20: 206-10 (1993);引用によって本明細書に含まれる)。1
983年から1992年にかけて、プロミット(Promit;登録商標)という名称
の市販製造品の使用によって重度デキストラン誘発アナフィラキシー反応(「D
IAR」)の発生率が劇的に低下したと報告されている。250万回の投与当た
り1回の発生率で致死反応が報告された。
Dのデキストラン類の使用が報告されている。デキストランに結合した治療上有
用であると考えられるモノクローナル抗体が、所望の免疫反応性を維持しながら
免疫原性を低減させ、所望の薬物動態特性を有し得ることが報告されている(Mi
kolajczyk et al., Bioconjugate Chem. 7: 150-58 (1996)(Fab′−βラク
タマーゼ結合体のFab′成分);Fagnani et al., Nuclear Medicine Comm.,
16:362-69 (1995)(マウス抗癌胎仔抗原モノクローナル抗体のFab′断片);F
agnani et al., Cancer Res., 50: 3638-45 (1990)(マウスおよびウサギの免疫
グロブリン類)も参照)。
ないデキストラン−レプチン結合体を含む医薬組成物を有することが望ましいと
考えられる。さらに、未修飾のレプチンと比較して、長い循環時間、効力および
溶解度の向上という所望の特性を示すデキストラン−レプチン結合体を有するこ
とが特に望ましいと考えられる。本発明は、ポリエチレングリコールまたはアナ
フィラキシー誘発性デキストラン類に関連するリスクがなく、化学修飾レプチン
蛋白の長所を有するデキストラン−レプチン結合体を提供するものである。
べきことに、効力および循環時間の向上という所望の特性を有し、自然のヒトレ
プチンと比較して溶解度上昇および注射部位反応の低減などの他の望ましい特性
を有するという所見に基づいたものである。さらに、ある種のポリエチレングリ
コール−レプチン結合体で認められる腎臓空胞化という欠点は本デキストラン−
レプチン結合体では認められなかった。
etHu−レプチン」)と比較して向上した効力;(b)未修飾のrmetHu
−レプチンと比較した血漿循環時間延長;(c)未修飾rmetHu−レプチン
と比較した生理pHでの水溶解度の向上;(d)注射部位反応が軽度であるか皆
無であること:(e)デキストラン−レプチン結合体の非免疫原性;および(f
)腎臓空胞化誘発がないことという特性を有するデキストラン−レプチン結合体
を示すものである。
の低分子量デキストラン部分を有し、該デキストラン部分が約1kD〜約20k
Dの分子量を有するデキストラン−レプチン結合体を提供する。好ましくは、医
薬品の商業的製造を容易にするため、前記デキストラン部分は約1kD〜約10
kD、より好ましくは約1kD〜約7kDの分子量を有する。特に好ましいデキ
ストラン部分は、以下の実施例に例示しているように、約6kDである。
部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体が提供される。本発明のさら
に別の態様では、1以上の低分子量デキストラン部分が1以上のレプチン部分に
結合しているデキストラン−レプチン結合体が提供される。そこで本発明は、1
)1個のデキストラン部分が1個のレプチン部分に結合しているデキストラン−
レプチン結合体、2)1個のデキストラン部分が2個のレプチン部分に結合して
いるデキストラン−レプチン結合体および3)2個のデキストラン部分が2個の
レプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体であってデキストラ
ン−レプチン結合体対が互いに結合しているものという少なくとも3種類の支配
的なデキストラン−レプチン結合体類の組合せを含むデキストラン−レプチン結
合体混合物をその範囲に含むものである。好ましくは本発明のデキストラン−レ
プチン結合体は主として、1)1個のデキストラン部分が2個のレプチン部分に
結合しているデキストラン−レプチン結合体および2)2個のデキストラン部分
が2個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体であってデ
キストラン−レプチン結合体対が互いに結合しているものを含むものである。
分を付加させる)、アナフィラキシー誘発可能性に関して悪影響を与えることな
く、上記のデキストラン−レプチン結合体の性能特性を高めることができること
が想到される。そこで、複数のデキストラン部分をレプチン部分に結合させたデ
キストラン−レプチン結合体は本発明の範囲に含まれる。そのような複数デキス
トラン−レプチン結合体は、上記のものと同じ望ましい特性を示すものと考えら
れる。
ストラン−レプチン結合体を含む医薬組成物に関するものである。好ましくは本
発明の医薬組成物は、1)1個のデキストラン部分が2個のレプチン部分に結合
しているデキストラン−レプチン結合体および2)2個のデキストラン部分が2
個のレプチン部分に結合しているデキストラン−レプチン結合体であってデキス
トラン−レプチン結合体対が互いに結合しているものを含むものである。特に好
ましいデキストラン部分は、以下のデキストラン−レプチン結合体で例示してい
るように約6kDである。
するものでもある。
合物を用いた患者治療方法に関するものでもある。
ン−rmetHu−レプチン結合体(「デキストラン−レプチン」)のEndo
lys−C消化ペプチドマッピング記録であり;図1Bは、Endoasp−N
消化ペプチドマッピング記録である。各記録における矢印は、未修飾rmetH
u−レプチンのN末端ペプチドを示す。
ことを示す、4〜20%Tris−グリシン還元SDS−PAGE勾配ゲルを示
している。列1は分子量標準であり(Mark 12, Novex, San Diego, CA);列2
は対照としての未修飾rmetHu−レプチンであり;列3はデキストラン−r
metHu−レプチン結合体混合物であり;列4はイオン交換クロマトグラフィ
ー後のデキストラン−rmetHu−レプチン結合体である。
N−末端デキストランrmetHu−レプチン結合体(「dex−レプチン」)
についての、1日1回投与試験で第7日終了後の、用量に対する緩衝液対照と比
較した体重減少量に関するマウスデータを示すグラフである。
Dデキストラン−レプチン結合体の持続的体重減少効果についてのマウスデータ
を示すグラフである。体重減少は、時間(日)に対する緩衝液対照と比較した体
重減少%として測定している。
kDデキストラン−レプチン結合体についての血液循環時間を示すものである。
図5Aは静脈注射データを示しており、図5Bは皮下注射データを示している。
ストラン−レプチン結合体についての、1日1回投与試験で第7日終了後の、時
間に対する緩衝液対照と比較した体重減少パーセントに関するマウスデータを示
すグラフである。
ストラン−レプチン結合体についての、単回投与での、時間に対する緩衝液対照
と比較した体重減少パーセントに関するマウスデータを示すグラフである。
いう長所を有するデキストラン−レプチン結合体を提供するものである。本発明
のデキストラン−レプチン結合体の別の長所には、溶解度の向上および注射部位
反応の低減などがある。
20kDの分子量を有するデキストラン類、より好ましくは約1kD〜約10k
Dの範囲の分子量を有するデキストラン類が含まれる。さらに好ましいものとし
ては、約1kD〜約7kDの分子量を有するデキストランである。ヒト用の医薬
品の商業的製造を容易にする上で特に好ましいデキストランは、約6kDの分子
量を有するものである(「約」という用語は、「背景」の欄で前述した意味で使
用)。平均すると、6kDデキストラン1モルは33.3個のグルコースサブユ
ニットからなる。
ランはリューコノストック属細菌が産生する。「臨床」デキストランは、自然デ
キストランの脱重合によって製造される。場合によっては、α1−3連結によっ
て連結されたグルコース分子のある種の側鎖基が形成されるようにデキストラン
部分を製造することができる。そのような側鎖基の形成は当業界では一般的に「
分岐」と称される。現時点で完全に解明されているわけではないが、そのような
側鎖基を有する大分子量デキストラン部分の方がヒトにおけるアナフィラキシー
を起こしやすいと考えられる。理論に拘束されるものではないが、低分子量デキ
ストランでは分岐、特に複数の分岐すなわちデキストラン1分子当たり複数のα
1−3側鎖基の可能性が低いと考えられている。複数の分岐が、大きい免疫複合
体形成の原因となるデキストラン上の既形成デキストラン反応性抗体の凝集を起
こすと仮定されていることから、その点は非常に重要である。従って好ましくは
、ヒト用治療薬の場合、本発明で想到される組成物におけるデキストラン部分は
、グルコースサブユニット間が主としてα1−6連結であって、α1−3側鎖基
が少ないものである。リューコノストック−メゼンテロイデス株NRRL B
512が産生する臨床デキストランがアナフィラキシー反応を低減することが明
らかになっている(Richter et al.,前述)。
トランの重要な特性は、循環既形成DRAの力価が高い患者に対して非アナフィ
ラキシー性であるという点である。
とができるようにする。そのような活性化法は当業者には公知であり、特にはレ
プチン蛋白上に存在する化学部分と結合を形成することができる化学部分をデキ
ストランに導入するという方法などがある(概論については、Larsen Advanced
Drug Delivery Reviews 3: 103-54 (1989);引用によって本明細書に含まれる)
。「活性化」デキストランという用語は、複数の反応性基を有するデキストラン
を指す。デキストラン上の「活性化」化学部分の種類は、デキストラン部分を蛋
白部分に結合させたい方法によって決まる。例えば、デキストラン部分にアルデ
ヒド基を付加させて、アミン結合を形成するための還元条件下でデキストラン部
分をレプチン部分に結合させることができる。
従ってデキストランを酸化して、複数のアルデヒド基を持たせる(Battersby et
al., J. Contr. Rel., 42: 143-56 (1996); Fabnani et al., (1990), supra;
引用によって本明細書に含まれる)。好ましい酸化方法は、後述の実施例に開示
されている。過ヨウ素酸塩のグルコースサブユニットに対するモル比は、所望の
酸化程度に応じて変動し得る。一般に、過ヨウ素酸塩のグルコースサブユニット
に対するモル比は、約0.02:1〜約3:1、好ましくは約0.1:1〜約1
.5:1で変動し得る。デキストランのグルコースサブユニットの約5%〜約5
0%を酸化することが想到される。このパーセントは総反応混合物についての平
均を表し、個々のデキストラン部分はそれより低いまたはそれより高いパーセン
トを有し得る。約10%のグルコースサブユニットがアルデヒド基を有すること
が特に好ましい。「酸化」デキストランという用語は、複数のアルデヒド基を有
するデキストランを指す。
して、レプチン部分に結合しなければならない。デキストラン部分の結合方法は
変わり得るものであって、多くの方法を当業者は利用できる。例えば、デキスト
ランを蛋白部分に共有結合的に結合させることができる。共有結合は、遊離アミ
ンまたはカルボキシル基などの反応性基を介してアミノ酸残基で形成することが
できる。好適なアミン基を有するアミノ酸残基には、レジン残基およびレプチン
蛋白部分のN末端アミノ酸残基などがあり得る。遊離カルボキシル基を有するア
ミノ酸には、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基および蛋白部分のC末端ア
ミノ酸残基などがあり得る。スルフヒドリル基もデキストラン部分の結合のため
の反応性基として使用することができる。別法として、例えば挿入または部位指
向性突然変異原性によって、蛋白部分に反応性基を導入することができる。商業
的製造を容易にする上で、蛋白部分のN末端での結合のように、アミノ基での結
合が好ましい。
レプチン部分に結合することができる(Larsen, supra;Fagnani et al. (1990)
, supra参照;PCTWO96/11953も参照)。デキストラン部分のレプ
チン部分に対するモル比は約5:1〜約100:1の範囲であり、好ましくは約
20:1である。好ましくは反応混合物のpHを約4.8程度に維持して、酸化
デキストラン部分とレプチン部分の結合がN末端部位特異的となるようにする。
pHは、レプチン部分のアミノ末端アミンがまだプロトン化されないことで、レ
プチン部分の他の位置にあるアミノ基がプロトン化されて非反応性となっている
中で反応性であるようにするだけの酸性でなければならない。
プチン部分に別の反応性基を導入して、反応混合物のpH上昇のように反応パラ
メータを変えることで複数反応性レプチン部分を得ることが可能であることが想
到される。当業者であれば、いくつかの公知の化学的結合方法のいずれかを組み
合わせて複数反応性レプチン部分を得る方法は明らかであろう。
ミノ酸のいずれであっても、「連結基」部分によってレプチン部分に結合させる
こともできる。そのような化学的連結基は当業界では公知であり、同種二官能性
化学連結基(すなわち、連結基の各端部に同じ反応性基)および異種二官能性化
学連結基(すなわち、連結基の各端部に異なる反応性基)などがある。当業者で
あれば十分に理解しているように、反応性基の種類、反応性末端間の距離、レプ
チン部分からのデキストラン部分の開裂を生じさせ得る内部代謝可能結合などの
連結基の他の有用な特徴などを考慮して、化学連結基の選択を行うことができる
(例えば、架橋試薬のリストについてのPierce Product Catalog, 1997 (Pierce
Chemical Co., Rockford, IL)およびそれに引用されている参考文献参照)。
化学連結基は、本セクションで前述したいずれかの反応性基を介してレプチン部
分に結合させることができる。当業者であれば十分に理解しているように、立体
配座すなわち可撓性ならびにペプチドの大きさを考慮して、ペプチド連結基を選
択することができる(例えば、Neve et al., Cytokine 8: 365-70 (1996);Hall
ewell et al., J. Biol. Chem., 264: 5260-68 (1989)参照;概論については、C
hou & Fasman, Ann. Rev. Biochem., 47: 251-76 (1978)参照)。アミノ酸連結
基配列には以下のものなどがあるが、これらに限定されるものではない。
ン部分のN末端またはC末端のいずれかに結合させることができる。
、RP−HPLCペプチドマッピングおよびN末端配列分析などの当業界で公知
の方法を用いて特性決定することができる。一般に、上記の方法に従ってレプチ
ン部分にデキストランを結合させた後には、反応混合物中に少なくとも3種類の
N末端デキストラン−レプチン結合体が存在することが認められている。その3
種類とは、1)1個のデキストラン部分が1個のレプチン部分に結合しているも
の、2)1個のデキストラン部分が2個のレプチン部分に結合しているものおよ
び3)2個のデキストラン部分が2個のレプチン部分に結合しているものである
。デキストラン2個−レプチン2個の化学種は1対のデキストラン−レプチン結
合体が互いに結合することで形成されると考えられている。代表的には、最後の
2種類が反応混合物の約65〜85%を構成しており、第1の化学種は代表的に
は反応混合物の5〜10%に相当する。残りの少量の化学種はSDS−PAGE
分析で、未反応のレプチンおよび比較的高分子量のものである。これらは公知の
方法を用いて混合物から除去することができる。精製後、上記2種類の二量体が
代表的にはデキストラン−レプチン結合体の約70〜90%を構成する。
は、当業者であれば、二量体形成への指向性が低い前記のようなレプチン類縁体
を製造できることが想到される。
で引用し、引用によって全内容が本明細書に含まれるPCT国際公開番号WO9
6/05309に記載のものから選択することができる。その公開の図3(その
明細書では配列番号4としている)には、ヒトレプチン(ヒト「OB」蛋白と称
する)について誘導された推定アミノ酸配列全長を示してある。アミノ酸には1
〜167の番号を付してある。信号配列開裂部位はアミノ酸21(Ala)の後
に位置することから、成熟(mature)蛋白はアミノ酸22(Val)からアミノ
酸167(Cys)に広がる。本発明の開示において、本明細書では異なる番号
割り付けを行っており、アミノ酸位置1は成熟蛋白の始点にあるバリン残基であ
る。成熟組換えメチオニルヒトレプチンについてのアミノ酸配列は本明細書では
配列番号1として示してあり、成熟蛋白の最初のアミノ酸はバリンであり、メチ
オニル残基は位置−1にある(以下の配列には含まれていない)。
ル残基は存在していなくても良い。
と比較して位置28のグルタミンが存在しないヒトレプチンの自然変異体を用い
ることができる。
ができる(以下の動物レプチンも参照)。そこで、活性を経験的に調べて、どの
レプチン部分を用いることができるかを決定することができる。WO96/05
309に記載のように、自然型でのレプチン蛋白または断片(酵素開裂産物など
)その他の切断型ならびに類縁体におけるレプチン蛋白はいずれも生理活性を保
持し得る。そのような形を本発明のデキストラン−レプチン結合体のレプチン部
分として用いることができる。ただし、そのような変化した形については試験を
行って、所望の特性を調べなければならない(PCT国際公開番号WO96/4
0912、WO97/06816、97/18833、WO97/38014、
WO98/08512およびWO98/28427(これらは引用によってその
全内容が本明細書に含まれる)も参照)。
ミノ酸残基を変えることで、組換えヒトレプチンの類縁体を製造することができ
る。マウスレプチンは、特に成熟蛋白として、さらには特にN末端でヒトレプチ
ンとかなり相同性が高い。組換えヒト蛋白はマウスにおいて生理活性を有するこ
とから、そのような類縁体はヒトにおいて活性である可能性が高いと考えられる
。例えば、配列番号1で表される自然ヒトレプチンのアミノ酸配列では、位置3
2、35、50、64、68、71、74、77、89、97、100、101
、105、106、107、108、111、118、136、138、142
および145における1以上のアミノ酸を別のアミノ酸に置き換えることができ
る。マウス蛋白の相当する位置のアミノ酸(Zhang et al., 1994, supra参照)
または別のアミノ酸を選択することができる。
できる(Murakami et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 209: 944-52 (1995
);引用によって本明細書に含まれる)。ラットOB蛋白は4、32、33、3
5、50、68、71,74、77、78、89、97、100、101、10
2、105、106、107、108、111、118、136、138および 145 の位置(配列番号1の番号割り付けを使用)でヒトOB蛋白と異なる。こ
れらの各種位置の1以上のアミノ酸を別のアミノ酸で置換することができる。下
線を施した位置は、マウスOB蛋白とラットOB蛋白がヒトOB蛋白と異なって
おり、従って変更に特に好適であるものである。これらの位置の1以上で、相当
するラットOB蛋白からのアミノ酸または別のアミノ酸を置き換えることができ
る。
は、4、32、33、35、50、64、68、71、74、77、78、89
、97、100、101、102、105、106、107、108、111、
118、136、138、142および145である。相当するラットまたはマ
ウス配列で認められるアミノ酸などの別のアミノ酸で1以上の上記アミノ酸が置
き換わった配列番号1によるOB蛋白も有効である場合がある。
酸(括弧内で、1文字のアミノ酸略称で識別)は、8(S)、35(R)、48
(V)、53(Q)、60(I)、66(I)、67(N)、68(L)、89
(L)、100(L)、108(E)、112(D)および118(L)である
。組換えヒトOB蛋白はカニクイザルにおいて活性であることから、1以上のア
カゲザルの各種アミノ酸が括弧内のアミノ酸などの別のアミノ酸に置き換わった
配列番号1によるヒトOB蛋白は有効である可能性がある。留意すべき点として
、ある種のアカゲザル各種アミノ酸も上記のマウスおよびラット類で認められる
ものである(位置35、68、89、100、108および118)。そこで、
位置4、8、32、33、35、48、50、53、60、64、66、67、 68 、71、74、77、78、89、97、100、102、105、106
、107、108、111、112、118、136、138、142および1
45の位置で、1以上のアミノ酸配列が別のアミノ酸によって置き換わっている
マウス/ラット/アカゲザル/ヒトコンセンサス分子(配列番号1の番号割り付
けを使用)を得ることができる。下線を施した位置は、3種類の動物全てがヒト
OB蛋白と異なっているものである。特に好ましいヒトレプチン類縁体は、位置
100(Trp)または138(Trp)、より好ましくはその両方の位置のア
ミノ酸が別のアミノ酸、好ましくはGlnによって置き換わったものである。
。例えば、成熟蛋白はリーダー配列(−22〜−1)を欠いている。
ミノ酸100〜111がアミノ酸99とアミノ酸112の間で順番通りに置き換
わっているもの という切断型のヒトOB蛋白分子(配列番号1の番号割り付けを使用)を得る
ことができる。
ザルOB蛋白で)変化した1以上のアミノ酸を有することもできる。さらに変更
は、ペプチド様体またはD−アミノ酸類などの変化させたアミノ酸の形であるこ
とができる。
特性に従って「保存的」であるアミノ酸置換を有する上記の蛋白も含まれる。こ
れらを以下の表1に示す(概論として、Creighton, Proteins, passim (W. H. F
reeman and Company, N.Y., 1984);Ford et al., Protein Expression and Pur
ification 2: 95-107 (1991)参照;これらは引用によって本明細書に含まれる)
。
示したアミノ酸配列に従って)、 (a)位置28のグルタミニル残基がなくても良く、さらにはN末端にメチオ
ニル残基を有していても良い配列番号1のアミノ酸配列; (b)位置4、8、32、33、35、48、50、53、60、64、66
、67、68、71、74、77、78、89、97、100、102、105
、106、107、108、111、112、118、136、138、142
および145の1以上で置換された異なるアミノ酸を有する小項目(a)のアミ
ノ酸配列; (c)位置100および138のアミノ酸がGlnで置換された小項目(b)
のアミノ酸配列; (d) (i)アミノ酸98〜146; (ii)アミノ酸1〜99および112〜146; (iii)アミノ酸1〜99および112〜146で1以上のアミノ酸10
0〜111がアミノ酸99とアミノ酸112の間で順番通りに置き換わっている
もの; (iv)1以上のアミノ酸100、102、105、106、107、10
8、111、112、118、136、138、142および145が別のアミ
ノ酸によって置換されている小項目(i)の切断レプチン類縁体; (v)1以上のアミノ酸4、8、32、33、35、48、50、53、6
0、64、66、67、68、71、74、77、78、89、97、112、
118、136、138、142および145が別のアミノ酸に置き換わってい
る小項目(iii)の切断レプチン類縁体; (vi)1以上のアミノ酸4、8、32、33、35、48、50、53、
60、64、66、67、68、71、74、77、78、89、97、100
、102、106、107、108、111、112、118、136、138
、142および145が別のアミノ酸に置き換わっている小項目(iii)の切
断レプチン類縁体; (vii)N末端メチオニル残基を有する小項目(i)〜(vi)の切断レ
プチン類縁体 から選択される切断レプチン蛋白類縁体; (e)1以上の保存アミノ酸置換を有する小項目(a)〜(d)のいずれかの
レプチン蛋白; から選択することができる。
しかしながら、報告の組成物の活性に関しては記載がない。
522号;5552523号;5552524号;5554727号;5559
208号;5563243号;5563244号;5563245号;5567
678号;5567803号;5569743号;5569744号;5574
133号;5580954号;5594101号;5594104号;5605
886号;5614379号;5691309号;5719266号(Eli Lill
y and Company); PCT WO96/23513;WO96/23514;WO96/2351
5;WO96/23516;WO96/23517;WO96/23518;W
O96/23519;WO96/23520;WO96/23815;WO96
/27385;WO96/34111;WO96/37517;WO97/00
886;EP725078;EP725079;EP744408;EP745
610;EP835879(Eli Lilly and Company); PCT WO96/22308(Zymogenetics); PCT WO96/31526(Amylin Pharmaceuticals, Inc.); PCT WO96/34885;WO97/46585(Smithlkine Beecham
PLC); PCT WO96/35787(Chiron Corporation); PCT WO97/16550(Bristol-Myers Squibb); PCT WO97/20933(Schering Corporation); EP736599(Takeda); EP741187(F. Hoffman LaRoche)。
物もしくは方法を提供する限りにおいて、そのような組成物および/または方法
を、併用投与(特定の投与計画で一緒にまたは別個に)などの本発明のデキスト
ラン−レプチン結合体と組み合わせて用いることができる。上記の条件で、これ
ら刊行物は引用によって本明細書に含まれるものとする。
く、さらには(a)N末端のみでデキストラン部分にまたは(b)レプチン蛋白
のN末端以外の位置で別のデキストラン部分との組合せでN末端でデキストラン
部分に結合したN末端メチオニル残基を有していても良い配列番号1のアミノ酸
配列である組換えヒトレプチン(「rHu−レプチン」)というデキストラン−
レプチン結合体がある。特に、本発明のデキストラン−レプチンのデキストラン
部分は、約1kD〜約20kD、詳細には約1kD〜約10kD、さらに詳細に
は約1kD〜約7kDの範囲の分子量、最も詳細には約6kDの分子量を有する
ことができる。具体的に想到されるものとしては、rmetHu−レプチンにN
末端で結合した6kDデキストラン部分から構成されるデキストラン−レプチン
結合体がある。本発明のデキストラン−レプチン結合体のデキストラン部分は好
ましくは、α1−3分岐を低減する菌株から得られるものである。
ラン−レプチン結合体 (b)1個のデキストラン部分が2個のレプチン部分に結合しているデキスト
ラン−レプチン結合体および (c)2個のデキストラン部分が2個のレプチン部分に結合しているデキスト
ラン−レプチン結合体であってデキストラン−レプチン結合体対が互いに結合し
ているもので、 前記デキストラン部分が、位置28のグルタミニル残基を欠いていても良く、
さらにはN末端にメチオニル残基を有していても良い配列番号1のアミノ酸配列
を有するレプチン部分にN末端で結合しているものを組み合わせて含むデキスト
ラン−レプチン結合体混合物もある。
治療用に利用可能である。ネコレプチンがWO97/32022に開示されてい
る(これは引用によって本明細書に含まれる)。他の動物種がWO96/366
44、EP743321(ブタおよびウシ);WO98/04288(ウシ);
WO98/04690(ブタ)(これらはいずれも引用によって本明細書に含ま
れるものとする)に開示されている。
組成物ならびに治療用にそのような医薬組成物を用いる治療方法が提供される。
そのような医薬組成物は、ボラス注射または注入(例:静注または皮下注射)に
よって投与することができたり、あるいは経口、経鼻、経皮その他の形態で投与
することができる。概して本発明には、医薬的に許容される希釈剤、保存剤、可
溶化剤、乳化剤、補助剤および/または担体とともに有効量の本発明のデキスト
ラン−レプチン結合体を含む医薬組成物が含まれる。そのような医薬組成物には
、各種緩衝剤含有量(例:Tris−HCl、酢酸塩、リン酸塩)、pHおよび
イオン強度の希釈剤;洗浄剤および可溶化剤(例:Tween80、ポリソルベ
ート80)、酸化防止剤(例:アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、保
存剤(例:チメルソル(Thimersol)、ベンジルアルコール)および増量物質(
例:乳糖、マニトール)などの添加剤が含まれ、ポリ酢酸、ポリグリコール酸な
どのポリマー化合物の粒子状製造物へのあるいはリポソーム類への材料の組み込
みを行う(例えば、PCT WO96/29989参照;引用によって本明細書
に含まれるものとする)。ヒアルロン酸も用いることができ、それは循環中での
持続期間延長の効果を有すると考えられる。そのような組成物は、物理的状態、
安定性、in vivo放出の速度、ならびに本発明のデキストラン−レプチン結合体
のin vivoクリアランス速度に影響を与え得る(例えば、Remington′s Pharmace
utical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042)
pp.1435-1712参照;引用によって本明細書に含まれる)。組成物は液体の形で製
造することができるか、あるいは凍結乾燥品などの乾燥粉末で製造することがで
きる。埋め込み式徐放製剤も想到され、経皮製剤などがある。
のとする)に記載のような経口製剤が想到される。そのPCT公開には、デキス
トラン部分によって修飾された蛋白を含む化学修飾された蛋白の経口投与につい
て記載されている。そこに開示の組成物および方法は本発明に応用して、本発明
のデキストラン−レプチン結合体の経口投与製剤を得ることができる。
トラン−レプチン結合体の製剤および使用についてはPCT WO94/200
69に開示の組成物および方法が有用である。化学修飾G−CSFの肺投与を開
示しているWO94/20069は引用によって本明細書に含まれるものとする
。
満、最も好ましくは0.5〜5μmの粒剤で製剤することで、遠位肺に最も有効
に搬送するようにしなければならない。
よって、肺に薬剤を堆積させる必要なく、鼻に治療薬を投与することで、血流に
蛋白を直接入れることができる。経鼻投与用製剤には、デキストランまたはシク
ロデキストリンなどのデキストリンを含むものなどがある。他の粘膜を通る輸送
を介した投与も想到される。
認することができる。好ましくは結合体の製剤は、レプチン部分約0.01μg
/kg/日〜レプチン部分10mg/kg/日が所望の治療効果を生じるような
ものとする。有効用量は、経時的に診断手段を用いて求めることができる。例え
ば、血液中(または血漿もしくは血清中)のレプチン量を測定する診断手段を最
初に用いて、レプチン蛋白の内因性レベルを求めることができる。そのような診
断手段は、抗体サンドイッチアッセイなどの抗体アッセイの形のものとすること
ができる。内因性レプチン蛋白の量を最初に定量し、基底線値を求める。治療用
量は、内因性および外因性レプチン蛋白部分(すなわち、自己産生もしくは投与
のいずれかで身体内に認められる蛋白、類縁体または誘導体)の量が治療期間に
わたって継続するように決定する。従って用量は、治療期間を通じて変動し得る
ものであり、例えば最初は治療効果が認められるまで相対的に高い用量を用い、
相対的に低い用量を用いて治療効果を維持する。
よび関連する状態の治療)、除脂肪体重増加およびインシュリン感受性向上など
がある。さらに本発明の組成物は、上記状態の治療または改善のための1以上の
医薬品の製造に使用することができる。
と本発明の組成物を所望の体重または脂肪症レベルの維持に用いることができる
。マウスモデルで示されているように(下記参照)、本発明のデキストラン−レ
プチン結合体を投与することで体重が減少する。体重低下は主として脂肪組織す
なわち脂肪のものである。そのような体重減少は、以下に示すような併用条件の
治療に関連し得るものであることから、治療的応用を構成するものである。さら
に、体重調節が専ら容姿改善のためのものである場合には、本発明において美容
上の使用が提供される。
ことができる。II型糖尿病と肥満との間に相関がある可能性があることから、
本発明を用いて体重を減少させることによって(または所望の体重を維持したり
、あるいは脂肪レベルを低下もしくは維持することで)、糖尿病の進行を緩和ま
たは予防することもできる。さらに、体重低下を生じるだけの用量がなくとも、
本発明の組成物を用いて、糖尿病を予防または改善することができる。
。高脂血症(脂肪血症;異脂肪症とも称される)は、循環血中に異常に多量の脂
質が存在する状態である。理想的には、血中脂質レベルの低下のみが望ましい状
況あるいは血中脂質レベルの維持が望まれる状況では、用量は体重減少を生じる
ほどのものとはならない。そこで、肥満患者の療法の初期においては、体重減少
と同時に血中脂質レベルの低下が得られるような用量を投与することができる。
十分な体重減少が得られたら、体重の再増加を防止することができるが、所望の
血中脂質レベルまたは他の本明細書に記載の状態を維持することができるだけの
用量を投与することができる。それらの用量は、レプチン蛋白の効果が可逆的で
あることから経験的に求めることができる(例:Campfield et al., Science 26
9,: 546-549 (1995) at 547)。そこで、体重減少が望ましくない場合に体重減
少を生じる用量が認められる場合には、それより低い用量を投与して、所望の血
中脂質レベルを得るようにし、しかも所望の体重を維持するようにすることがで
きる(例えば、PCT公開WO97/06816参照;引用によって本明細書に
含まれる)。
い程度のものとなる。そこで、肥満者の治療の初期においては、体重減少と同時
に脂肪組織減少/除脂肪体重増加が得られるような用量を投与することができる
。十分な体重減少が得られたら、体重の再増加を防止することはできるが、所望
の除脂肪体重増加を維持(または除脂肪体重減少の防止)できる用量を考慮する
ことができる。体重低下を伴わない除脂肪体重増加は、患者が糖尿病治療のため
に投与を受けるインシュリン(または可能性として、アミリン、アミリン拮抗薬
もしくは作働薬、あるいはチアゾリジンジオン類その他の可能な糖尿病治療薬)
量を減らすように行うことができる。全体的な強さを高めるには、同様の用量面
での検討が可能である。全体的強さの上昇を同時に伴う除脂肪体重増加は、体重
低減を生じないだけの用量で得ることができる。赤血球(および血中酸素)増加
および骨吸収低下もしくは骨粗鬆症低下などの他の利点も、体重減少を伴わずに
得ることができる(例えば、PCT公開WO97/18833参照;引用によっ
て本明細書に含まれるものとする)。
ることができる。糖尿病治療に有用なものなどの他の医薬品(例:インシュリン
および可能性としてアミリン、それらの拮抗薬もしくは作働薬、チアゾリジンジ
オン類(例えば、PCT公開番号WO98/08512参照;引用によって本明
細書に含まれる)、あるいは他の可能性のある糖尿病治療薬など)、コレステロ
ールおよび血圧低下薬(血中脂質レベルを低下させるものまたは他の心血管薬な
ど)、活動向上薬(例;アンフェタミン類)、利尿薬(脂質排出用)ならびに食
欲抑制剤(ニューロペプチドY受容体に作用する薬剤またはセロトニン再取り込
み阻害薬など)が使用可能である。そのような投与は同時に行うことができるか
、あるいは順次行うことができる。さらに本発明の方法を、身体の全体的外観を
変えるための美容手術(例:体重減少のための脂肪吸引もしくはレーザー手術、
あるいは身体の見かけ上の大きさを増すための埋込手術など)の手術と併用する
ことができる。バイパス術などの心臓手術または動脈閉塞などの脂肪沈着物によ
る血管の閉塞が原因である有害な状態を緩和するための他の手術の健康上の利点
を、本発明の組成物および方法を併用することで高めることができる。超音波法
またはレーザー法などの胆石除去法も、本発明の治療法の前、最中または後に行
うことができる。さらに本発明の方法を、骨折の手術もしくは治療、筋肉損傷の
手術もしくは治療、その他の除脂肪組織体重増加によって改善されると考えられ
る治療法に対する補助的方法として用いることができる。
ができる。ただし、後述の実施例で使用されるレプチン部分については、商業的
製造上容易であることから細菌が好ましい。さらには、所望の蛋白をコードする
内因性遺伝子の調節に影響を与える自然もしくは導入調節要素を制御することで
得られるものなどの、ヒト細胞で産生されるレプチンを使用することもできる。
本発明のデキストラン−レプチン結合体で有用なレプチン部分の組換え発現につ
いては、WO96/40912に記載されており、それは引用によって、そこに
引用されている全てのベクターおよび宿主株寄託物とともに本明細書に含まれる
ものとする。
公知の方法を用いて、デキストラン−レプチン結合体混合物から単離することが
できる。カチオン交換クロマトグラフィーを行うことで、1段階精製法を容易に
行うことができる(例えば、Ralph et al., Biochemistry 34: 4889-97 (1995)
参照;引用によって本明細書に含まれるものとする)。本発明のデキストラン−
レプチン結合体の精製において有用な別の公知の精製方法では、疎水性相互作用
クロマトグラフィーが関与する(例えば、Pharmacia Biotech′s HiTrap HIC Te
st Kit Instructions, 71-7147-00, ed. AF. at 1-19 (1993; Uppsala, Sweden)
参照;引用によって本明細書に含まれる)。
プチン結合体を用いて、(1)活性;(2)自然rmetHu−レプチンと比較
したin vivoでの循環時間増加;(3)生理的条件下での溶解度上昇(自然rm
etHu−レプチンとの比較);(4)注射部位反応のない点;(5)霊長類に
おける免疫原性応答の少ない点;ならびに(6)腎臓空胞化がない点を示してあ
る。以下の実施例の第2の群では、17.5kDデキストラン−rmetHu−
レプチン結合体を用いて、上記と同じ性能特性の一部を示してある。
合ケージ当たり2匹で飼育した。いずれの動物にも自由に飼料摂取させた。実験
期間を通じて12時間明/暗サイクルを維持した。動物に関しては、実験動物ケ
アに関する許容規範に従ってケアを行った。
下(「sc」)注射によって、あるいは留置カテーテルを介して尾静脈へ静脈注
射することで(「iv」)行った。デキストラン−レプチン結合体の用量はいず
れも、結合体のレプチン蛋白濃度を測定することで計算した。
いた。
である。
した(Fluka Chemical Corp., Ronkonkoma, NY)。デキストランを活性化して、
アルデヒド基を付加した。すなわち、0.35M過ヨウ素酸ナトリウムを氷上で
10mM四ホウ酸ナトリウムにゆっくり加え、pHをpH3.0に調節した。6
kDデキストラン120gを上記溶液400mLに加え、混合物を室温で24時
間撹拌した。過ヨウ素酸塩のグルコースサブユニットに対するモル比は0.26
:1であった。撹拌を継続しながら、エチレングリコール73.6mLを加え、
混合物をさらに2時間撹拌した。酸化デキストランを蒸留・脱イオンH2Oに対
して強く透析した。
ンを調べて、デキストラン部分の安定性を確認した。活性化後、活性化デキスト
ラン部分上のアルデヒド数を、当業者に公知の方法を用いて定量した(Zhao & H
eindel, Pharm. Res., 8, 400-02 (1991))。他のデキストラン類も同様にして
分析・活性化した。
mM酢酸ナトリウム溶液(pH4.8)と混合した40mM酢酸ナトリウム緩衝
液(pH4.8)中で約1mg/mLの濃度の溶液とした。デキストラン部分の
レプチン部分に対する最終モル比は20:1であった。混合物を室温で1時間に
わたって回転台上で撹拌した。1mg/mLNaBH3CNの40mM酢酸ナト
リウム(pH4.8)溶液をNaBH3CN/デキストランのモル比10:1で
加えた。混合物を室温で2時間撹拌し、低温室(4℃)に移し、撹拌を続けた。
10mg/mLNaBH4の40mM酢酸ナトリウム(pH4.8)溶液で、N
aBH4/酸化グルコース単位のモル比2.5:1(10%または3.3モルの
酸化グルコース単位/6kDデキストラン1モル)にてデキストラン−レプチン
結合体を処理した。氷上での撹拌を続けながらNaBH4溶液を滴下した。
純度および大体の分子量をSDS−PAGE分析によって測定した。
結合したことを確認した。すなわち、デキストラン−rmetHu−レプチン結
合体および未修飾のrmetHu−レプチンを、2つの別個の実験でエンドプロ
テアーゼによって、それぞれレジン残基(EndoLys−C)またはアスパラ
ギン酸残基(EndoAsp−N)で切断した。サンプルを、それぞれ酵素/基
質比1:50および1:75で、25℃にてそれぞれ8時間および7時間消化さ
せた。得られたペプチド断片について、YMC C−8カラム(内径2.1mm
)を用いてRP−HPLCによってマッピングし、溶媒A)0.1%TFAのH
PLC用水溶液および溶媒B)0.1%TFAの90%HPLC用アセトニトリ
ルという2種類の溶媒の勾配を用いて、100%Aで5分間;90%Aと10%
Bで80分間;50%Aと50%Bで5分間;10%Aと90%Bで10分間溶
離を行った。カラムは25℃に維持し、0.2mL/分で溶離した(Ralph et a
l., supra)。未修飾rmetHu−レプチンと比較して、Endolys−C
消化したデキストラン−rmetHu−レプチン結合体のペプチドマッピング(
図1A)は、約14分で1個のピークが消失していることを示していた。同様に
、Endoasp−N消化でのペプチドマッピング(図1B)は、約16分で1
個のピークが消失していることを示していた。未修飾rmetHu−レプチンか
らのこれらペプチドについてはN末端で配列決定を行って同定し、プロテアーゼ
消化によって生じたN末端ペプチドであることを確認した。そこで、レプチン部
分へのデキストラン部分の結合は、N末端ペプチド選択的であった。さらに、N
末端配列決定から約98.6%遮断N末端が明らかになり、デキストランがrm
etHu−レプチンに結合していることを示していた。
ン部分への1個のデキストラン部分に付加または2個のレプチン部分への2個の
デキストラン部分の付加があったことを、SDS−PAGE分析によって確認し
た。図2からわかる通り、かなりの割合のデキストラン−レプチン結合体が二量
体の形を取っている(列3は、デキストラン−rmetHu−レプチン結合体混
合物である)。基材としてシナピン酸を用いる遅延抽出MALDI−TOF質量
分析によって、列3の主要帯域が両方の二量体物(すなわち、1個のデキストラ
ン部分−2個のレプチン部分、2個のデキストラン部分−2個のレプチン部分)
からなることが確認された。未反応のrmetHu−レプチンおよび微量に形成
された相対的に高分子量の化学種の一部は、イオン交換クロマトグラフィーによ
って、二量体結合体の大半およびモノマー結合体の少量から分離した(列4はイ
オン交換クロマトグラフィー後のデキストラン−rmetHu−レプチン結合体
を示している)。
metHu−レプチンと比較して向上していることを示すものである。実施例1
のデキストラン−レプチン結合体について、正常マウスでの体重減少誘発におけ
る効力を調べた。
r Laboratories, Wilmington, MA)に、1日1回7日間にわたって、被験デキス
トラン−レプチン結合体(上記の実施例1に記載のもの)、未修飾レプチンまた
はプラシーボ(リン酸緩衝生理食塩水「PBS」)のいずれかを注射した。デキ
ストラン−レプチン結合体と未修飾レプチンの両方について、用量1mg/kg
、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kgおよび100mg/kgを
調べた。試験期間を通じて体重をモニタリングした。
変化を未修飾レプチン投与群と比較した。体重減少を、緩衝液対照に対する体重
減少量として計算した((緩衝液群体重−サンプル群体重)/緩衝液群体重×1
00)。デキストラン−レプチン結合体の効力は、用量10mg/kg、25m
g/kg、50mg/kgおよび100mg/kgで未修飾レプチンと比較して
有意に高かった。さらに、デキストラン−レプチン結合体には用量−応答が認め
られた。PBS緩衝液対照と比較した試験終了後の体重減少パーセントを、デキ
ストラン−レプチン結合体および未修飾レプチンの両方についてmg/kgでの
用量に対してプロットした。単純対数曲線に対してデータを適合させ、7%体重
減少を得る上でのED50(50%最大体重減少を得るのに必要な用量)を仮定
することで、図3に示したように、デキストラン−レプチン結合体および未修飾
レプチンについてのED50値がそれぞれ4mg/kgおよび20mg/kgで
あると近似することができる。従ってデータから、本発明のデキストラン−レプ
チン結合体の効力が未修飾レプチンのほぼ5倍であることがわかる。
効果を示すものである。8〜10週齢で体重約20gの正常な雌C57BL/6
マウスに、デキストラン−レプチン結合体または未修飾レプチンのいずれかを用
量100mg/kgで、第0日のみに皮下注射した。図4でわかる通り、デキス
トラン−レプチン結合体の体重減少効果は4〜5日間続いてピーク体重減少は2
倍増加したが、未修飾レプチンの体重減少効果は1〜2日しか続かなかった。
プチンよりかなり長く血中に留まることが明らかになった。体重200〜250
gのカテーテルを取り付けた雄ラット(Wistar Kyoto)に、被験デキストラン−
レプチン結合体(上記の実施例1に記載のもの)または未修飾レプチンを皮下注
射または静脈注射(「iv」)で10mg/kgの単一用量で注射した。注射後
一定の間隔で留置カテーテルから採血を行った。図5Aからわかる通り、静脈注
射したデキストラン−レプチン結合体は注射後72時間にわたって血中に留まっ
たが、未修飾レプチンは注射後約8〜12時間で完全に消失した。いずれの分子
も二相クリアランスを示したが、デキストラン−レプチン結合体についての初期
相半減期と特に後期相半減期のいずれも有意に長くなっており、結合デキストラ
ンが血流からのレプチン蛋白のクリアランスを遅延させることを示している。そ
こで、デキストラン−レプチン結合体のin vivoでの血漿循環時間は、未修飾r
metHu−レプチンの循環時間と比較して長くなった。
体は注射後96時間にわたって血中に留まったが、未修飾レプチンについては注
射後約18〜24時間という比較的急速なクリアランスであった。
ストラン−レプチン結合体が生理的条件下で高い溶解度を有することを示すもの
である。デキストラン−レプチン結合体と未修飾レプチンのサンプルを蛋白精製
後に取った。サンプルをpH7のダルベッコのPBS中に4℃で終夜透析した。
未修飾rmetHu−レプチンおよびデキストラン−rmetHu−レプチン結
合体のそれぞれの希釈液(約1〜2mg/mLのレプチン蛋白)を、アミコン・
セントリプレプ(Amicon Centriprep;登録商標)10(Beverly, MA)濃縮シス
テムを用いて濃縮した。約0.5mLの容量が得られるまで、4℃で3400r
pmにて期間を短縮した繰り返しサイクルでサンプルを遠心した。バイオラッド
(BioRad)試薬(Hercules, CA)を用いるブラッドフォード(Bradford)アッセ
イ(Anal. Biochem., 72: 248-54 (1976))によって、蛋白濃度を三連で測定し
た。未収色rmetHu−レプチン溶液は中性pHのPBS中で約2〜3mg/
mLで蛋白沈殿を示し始めると考えられるが、デキストラン−レプチン結合体は
80mg/mLでなお可溶であった。さらに高い濃度では、デキストラン−レプ
チン結合体溶液は取り扱いが困難になった。当業者には明らかなように、緩衝系
、温度、界面活性材およびイオン強度などのパラメータを調節することで、溶解
度条件を至適化することができる。
軽減されることを示すものである。正常な雌C57BL/6マウス(群当たり3
匹のマウス)に、実施例1で製造したデキストラン−レプチン結合体(PBS溶
液、pH7.1)および未修飾rmetHu−レプチン(10mM酢酸ナトリウ
ム緩衝液、5%ソルビトール、pH4.0溶液)を25mg/kgまたは100
mg/kg(それぞれ5mg/mLおよび20mg/mLの濃度)の用量で1日
1回7日間にわたって注射した。注射部位サンプルを8日目に採取した。動物の
注射部位をいくつかの組織病理学的パラメータ、すなわち壊死、炎症(単核と化
膿)、沈着レプチン、線維増殖および巨大細胞について分析した。そのような評
価に基づくと、デキストラン−レプチン結合体は、20mg/mLの濃度で注射
した場合であっても、注射部位で非常に良好に耐容された。レプチン沈着を示す
証拠や注射跡周囲の組織壊死はなかった。未修飾レプチンと比較して、未修飾レ
プチンの臨床的に許容される濃度より高い濃度で注射部位反応は良好に耐容され
た。デキストラン−レプチン結合体の許容される注射部位反応についての上限濃
度はまだ求めていない。
免疫原性応答がないことを示すものである。チンパンジーに、実施例1で製造し
た6kDデキストラン−レプチン結合体を毎週3回4週間にわたって0.1mg
/kgで皮下注射投与し、チンパンジーの血清をELISAによって分析した。
デキストラン−レプチン結合体には、IgG応答もIgM応答もほとんど認めら
れなかった。高いバックグラウンド抗体レベルが認められたことから、阻害試験
を行ってそれらの抗体がデキストラン(6kDまたは70kD)、6kDデキス
トラン−レプチン結合体またはレプチン蛋白自体に対して反応性であるか否かを
調べた。採血前サンプルおよび試験終了(29日目)サンプルを用いた阻害試験
で阻害に有意差は示されず、抗体反応性が既形成抗体指向性であることが示され
た。詳細には、70kDデキストランは完全阻害を示し、6kDデキストランは
部分阻害を示した。さらに、デキストラン−レプチン結合体も完全阻害を示し、
未修飾レプチン蛋白単独では阻害を示さなかった。これらの結果は、抗体活性が
デキストランに対してのものであったことを示している。最も可能性の高いもの
としては、分岐デキストラン(70kD)のエピトープが標的であった。その結
果は、抗体活性がレプチン蛋白自体に対するもののではなかったことを明瞭に示
している。
よる水溶性ポリマー結合体と比較して、本発明の6kDデキストラン−レプチン
結合体に腎臓空胞形成がないことを示すものである。すなわち、マウス(群当た
り3匹)に、実施例1で製造した6kDデキストラン−レプチン結合体および未
修飾rmetHu−レプチンを1mg/kgまたは10mg/kgのいずれかの
用量で1日1回7日間にわたって注射した。第8日にサンプルを回収した。管状
空胞形成の評点を行った。いずれの用量でもデキストラン−レプチン結合体では
腎臓空胞形成の誘発はなかった。組織病理学的所見は、未修飾レプチンで認めら
れるものと同等であった。それとは対照的に、用量1mg/kgおよび10mg
/kgのモノペギル化レプチンは、同じ条件下でそれぞれ軽度および顕著な空胞
形成を誘発した。
少特性を示すものである。デキストランレプチン結合体を、6kDデキストラン
に代えて17.5kDデキストランを用いた以外、実施例1の方法に従って製造
した。17.5kDデキストランはフルカケミカル(Fluka Chemical Corp.)か
ら購入した。
少誘発における効力を調べた。8〜10週齢で体重約20gの正常な雌C57B
L/6マウスに、被験17.5kDデキストラン−レプチン結合体、未修飾rm
etHu−レプチンまたはプラシーボ(リン酸緩衝生理食塩水、「PBS」)の
いずれかを1日1回7日間にわたって注射した。17.5kDデキストラン−レ
プチン結合体および未修飾レプチンの両方について、10mg/kg用量を調べ
た。試験期間を通じて体重をモニタリングした。
重減少を、未修飾レプチン投与群と比較した。図6からわかる通り、デキストラ
ン−レプチン結合体の効力は、10mg/kgの用量で未修飾レプチンより高か
った。
効果についても調べた。17.5kDデキストラン−rmetHu−レプチン結
合体または未修飾rmetHu−レプチンのいずれかを用量100mg/kgの
みで第0日に皮下注射した。図7からわかるように、デキストラン−レプチン結
合体の体重減少効果は5〜6日続き、ピーク体重減少では1倍および1.5倍の
増加があったのに対して、未修飾レプチンの体重減少効果は3〜4日間だけ続い
た。
して本発明の17.5kDデキストラン−レプチン結合体では効力が高くなって
いることがわかる。
よる水溶性ポリマー結合体と比較して、本発明の17.5kDデキストラン−レ
プチン結合体に腎臓空胞形成がないことを示すものである。マウスに、実施例7
の手順に従って、17.5kDデキストラン−レプチン結合体または未修飾rm
etHu−レプチンを1mg/kgまたは10mg/kgのいずれかの用量で注
射した。いずれの用量でも17.5kDデキストラン−レプチン結合体では腎臓
空胞形成の誘発はなかった。組織病理学的所見は、未修飾レプチンで認められる
ものと同等であった。
らのヒト抗体について、本発明のデキストラン−レプチン結合体に応答がないこ
とを推定するものである。実験を行って、本発明のデキストラン−レプチン結合
体が、循環する既形成デキストラン反応性抗体の力価が高い患者に対して非アナ
フィラキシー性であることを示す。
DRAの力価が高い患者から血清を採取する。正常者からの血清も対照として採
取する。
法がある(例えば、Hedin et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 52: 1
45-49 (1976)参照;引用によって本明細書に含まれるものとする)。DRAの力
価はARの重度と正の相関関係にあることが明らかになっている(Richter et a
l., supra, at 134-35参照)。
RA反応性血清が本発明のデキストラン−レプチン結合体と反応するか否かを調
べる。すなわち、本発明のデキストラン−レプチン結合体が表面に吸収されてい
る赤血球ならびに陰性対照として別個に未修飾レプチンおよび低分子量デキスト
ランと陽性対照としての70kDデキストランを吸収した赤血球をDRA血清と
インキュベートし、凝集の徴候について赤血球を観察する。DRA血清は本発明
の実施で使用される低分子量デキストランに対する親和性が低くなっており、な
いしは低分子量デキストランは抗体凝集およびカスケード効果を起こさないこと
から、赤血球の凝集は起こらない。
合体を用いた場合のDRA反応性を求める。最初に、アナフィラキシーを誘発す
るだけの用量で、デキストラン交差反応性抗血清および/または高分子量デキス
トラン(例:70kDデキストラン)に対する抗血清を用いて動物を感作する。
次に動物について、本発明のデキストラン−レプチン結合体に曝露する。皮膚発
現、急速な血圧降下、呼吸促迫、心停止などのアナフィラキシー反応の徴候を観
察する。既形成DRAは本発明の実施で使用される低分子量デキストランとは反
応性でないことから、アナフィラキシー反応の徴候は認められない。
tHu−レプチン結合体(「デキストラン−レプチン」)のEndolys−C
消化ペプチドマッピング記録である。
は、未修飾rmetHu−レプチンのN末端ペプチドを示す。
す。
デキストランrmetHu−レプチン結合体(「dex−レプチン」)について
の、1日1回投与試験で第7日終了後の、用量に対する緩衝液対照と比較した体
重減少量に関するマウスデータを示すグラフである。
トラン−レプチン結合体の持続的体重減少効果についてのマウスデータを示すグ
ラフである。体重減少は、時間(日)に対する緩衝液対照と比較した体重減少%
として測定している。
ストラン−レプチン結合体についての血液循環時間を示すものであり、静脈注射
データを示している。
ストラン−レプチン結合体についての血液循環時間を示すものであり、皮下注射
データを示している。
−レプチン結合体についての、1日1回投与試験で第7日終了後の、時間に対す
る緩衝液対照と比較した体重減少パーセントに関するマウスデータを示すグラフ
である。
−レプチン結合体についての、単回投与での、時間に対する緩衝液対照と比較し
た体重減少パーセントに関するマウスデータを示すグラフである。
Claims (30)
- 【請求項1】 1以上のレプチン部分に結合した1以上の低分子量デキスト
ラン部分を有し、該デキストラン部分が約1kD〜約20kDの分子量を有する
デキストラン−レプチン結合体。 - 【請求項2】 前記デキストラン部分が約1kD〜約10kDの分子量を有
する請求項1に記載のデキストラン−レプチン結合体。 - 【請求項3】 前記デキストラン部分が約1kD〜約7kDの分子量を有す
る請求項2に記載のデキストラン−レプチン結合体。 - 【請求項4】 前記デキストラン部分が約6kDの分子量を有する請求項1
に記載のデキストラン−レプチン結合体。 - 【請求項5】 1個のデキストラン部分が1以上のレプチン部分に結合して
いる請求項1に記載のデキストラン−レプチン結合体。 - 【請求項6】 2個以上のデキストラン部分が1以上のレプチン部分に結合
している請求項1に記載のデキストラン−レプチン結合体。 - 【請求項7】 複数のデキストラン部分が1個のレプチン部分に結合してい
る請求項1に記載のデキストラン−レプチン結合体。 - 【請求項8】 前記レプチン部分が(配列番号1のアミノ酸配列に従って)
、 (a)位置28のグルタミニル残基がなくても良く、さらにはN末端にメチオ
ニル残基を有していても良い配列番号1のアミノ酸配列; (b)位置4、8、32、33、35、48、50、53、60、64、66
、67、68、71、74、77、78、89、97、100、102、105
、106、107、108、111、112、118、136、138、142
および145の1以上で置換された異なるアミノ酸を有する小項目(a)のアミ
ノ酸配列; (c)位置100および138のアミノ酸がGlnで置換された小項目(b)
のアミノ酸配列; (d) (i)アミノ酸98〜146; (ii)アミノ酸1〜99および112〜146; (iii)アミノ酸1〜99および112〜146で1以上のアミノ酸10
0〜111がアミノ酸99とアミノ酸112の間で順番通りに置き換わっている
もの; (iv)1以上のアミノ酸100、102、105、106、107、10
8、111、112、118、136、138、142および145が別のアミ
ノ酸によって置換されている小項目(i)の切断レプチン類縁体; (v)1以上のアミノ酸4、8、32、33、35、48、50、53、6
0、64、66、67、68、71、74、77、78、89、97、112、
118、136、138、142および145が別のアミノ酸に置き換わってい
る小項目(iii)の切断レプチン類縁体; (vi)1以上のアミノ酸4、8、32、33、35、48、50、53、
60、64、66、67、68、71、74、77、78、89、97、100
、102、105、106、107、108、111、112、118、136
、138、142および145が別のアミノ酸に置き換わっている小項目(iv
)の切断レプチン類縁体; (vii)N末端メチオニル残基を有する小項目(i)〜(vi)のいずれ
かの切断レプチン類縁体 から選択される切断レプチン蛋白類縁体; (e)1以上の保存アミノ酸置換を有する小項目(a)〜(d)のいずれかの
レプチン蛋白; からなる群から選択される請求項1に記載のデキストラン−レプチン結合体。 - 【請求項9】 (a)1個のデキストラン部分が1個のレプチン部分に結合しているデキスト
ラン−レプチン結合体; (b)1個のデキストラン部分が2個以上のレプチン部分に結合しているデキ
ストラン−レプチン結合体; (c)2個以上のデキストラン部分が1個のレプチン部分に結合しているデキ
ストラン−レプチン結合体;ならびに (d)2個以上のデキストラン部分が2個以上のレプチン部分に結合している
デキストラン−レプチン結合体 をいずれかの組合せで含むデキストラン−レプチン結合体混合物。 - 【請求項10】 (a)1個のデキストラン部分が1個のレプチン部分に結合しているデキスト
ラン−レプチン結合体; (b)1個のデキストラン部分が2個のレプチン部分に結合しているデキスト
ラン−レプチン結合体;および (c)2個のデキストラン部分が2個のレプチン部分に結合しているデキスト
ラン−レプチン結合体であってデキストラン−レプチン結合体対が互いに結合し
ているもの をいずれかの組合せで含む請求項9に記載のデキストラン−レプチン結合体混
合物。 - 【請求項11】 主として (a)1個のデキストラン部分が2個のレプチン部分に結合しているデキスト
ラン−レプチン結合体;および (b)2個のデキストラン部分が2個のレプチン部分に結合しているデキスト
ラン−レプチン結合体であってデキストラン−レプチン結合体対が互いに結合し
ているもの からなる請求項10に記載のデキストラン−レプチン結合体混合物。 - 【請求項12】 (a)約1kD〜約20kDの分子量を有するデキストラン部分を活性化する
段階; (b)アミノ末端アミンがまだプロトン化されず、レプチン蛋白上の他の位置
のアミン基はプロトン化されるだけの酸性のpHで、還元条件下にレプチン部分
に活性化デキストラン部分を結合させてアミン結合を形成する段階; (c)デキストラン−レプチン結合体を得る段階;および (d)適宜にデキストラン−レプチン結合体を精製する段階 を有する方法によって製造されるデキストラン−レプチン結合体。 - 【請求項13】 医薬的に許容される担体中に請求項1ないし8のいずれか
に記載のデキストラン−レプチン結合体を含む医薬組成物。 - 【請求項14】 医薬的に許容される担体中に請求項9ないし11のいずれ
かに記載のデキストラン−レプチン結合体混合物を含む医薬組成物。 - 【請求項15】 肥満、糖尿病および高脂血症から選択される状態の患者の
治療方法であって、有効量の請求項1ないし8のいずれかに記載のデキストラン
−レプチン結合体を投与する段階を有する方法。 - 【請求項16】 肥満、糖尿病および高脂血症から選択される状態の患者の
治療方法であって、有効量の請求項9ないし11のいずれかに記載のデキストラ
ン−レプチン結合体混合物を投与する段階を有する方法。 - 【請求項17】 配列番号1のアミノ酸配列を有し、位置28のグルタミニ
ル残基が欠落していても良く、さらにはN末端にメチオニル残基を有していても
良い1以上のレプチン部分にN末端で結合した約1kD〜約20kDの分子量を
有する1以上のデキストラン部分を有するデキストラン−レプチン結合体。 - 【請求項18】 前記デキストラン部分が約6kDの分子量を有する請求項
17に記載のデキストラン−レプチン結合体。 - 【請求項19】 (a)1個のデキストラン部分が1個のレプチン部分に結合しているデキスト
ラン−レプチン結合体; (b)1個のデキストラン部分が2個のレプチン部分に結合しているデキスト
ラン−レプチン結合体;および (c)2個のデキストラン部分が2個のレプチン部分に結合しているデキスト
ラン−レプチン結合体であってデキストラン−レプチン結合体対が互いに結合し
ているもの をいずれかの組合せで含むデキストラン−レプチン結合体混合物であって、 該デキストラン−レプチン結合体の該デキストラン部分が約1kD〜約20kD
の分子量を有し、 配列番号1のアミノ酸配列を有し、位置28のグルタミニル残基が欠落していて
も良く、さらにはN末端にメチオニル残基を有していても良い前記レプチン部分
に、N末端で結合していることを特徴とするデキストラン−レプチン結合体混合
物。 - 【請求項20】 前記デキストラン部分が約6kDの分子量を有する請求項
19に記載のデキストラン−レプチン結合体混合物。 - 【請求項21】 医薬的に許容される担体中に請求項17又は18のいずれ
かに記載のデキストラン−レプチン結合体を含む医薬組成物。 - 【請求項22】 (a)約1kD〜約20kDの分子量を有するデキストラン部分を活性化する
段階; (b)アミノ末端アミンがまだプロトン化されず、レプチン蛋白上の他の位置
のアミン基はプロトン化されるだけの酸性のpHで、還元条件下にレプチン部分
に活性化デキストラン部分を結合させてアミン結合を形成する段階; (c)デキストラン−レプチン結合体を得る段階;および (d)適宜にデキストラン−レプチン結合体を精製する段階 を有する方法によって製造されるデキストラン−レプチン結合体であって、 配列番号1のアミノ酸配列を有し、位置28のグルタミニル残基が欠落してい
ても良く、さらにはN末端にメチオニル残基を有していても良い前記レプチン部
分に、前記デキストラン部分がN末端で結合しているデキストラン−レプチン結
合体。 - 【請求項23】 肥満、糖尿病および高脂血症から選択される状態の患者の
治療方法であって、有効量の請求項17又は18のいずれかに記載のデキストラ
ン−レプチン結合体を投与する段階を有する方法。 - 【請求項24】 配列番号1のアミノ酸配列を有する1以上のレプチン部分
にN末端で結合した約1kD〜約20kDの分子量を有する1以上のデキストラ
ン部分を有するデキストラン−レプチン結合体であって、位置100および13
8のアミノ酸がグルタミンで置き換わっており、位置28のグルタミル残基が欠
落していても良く、さらにはN末端にメチオニル残基を有していても良いデキス
トラン−レプチン結合体。 - 【請求項25】 前記デキストラン部分が約6kDの分子量を有する請求項
24に記載のデキストラン−レプチン結合体。 - 【請求項26】 (a)1個のデキストラン部分が1個のレプチン部分に結合しているデキスト
ラン−レプチン結合体; (b)1個のデキストラン部分が2個のレプチン部分に結合しているデキスト
ラン−レプチン結合体;および (c)2個のデキストラン部分が2個のレプチン部分に結合しているデキスト
ラン−レプチン結合体であってデキストラン−レプチン結合体対が互いに結合し
ているもの をいずれかの組合せで含むデキストラン−レプチン結合体混合物であって、 前記デキストラン−レプチン結合体の前記デキストラン部分が約1kD〜約2
0kDの分子量を有し;位置100および138のアミノ酸がグルタミンで置き
換わっている配列番号1のアミノ酸配列を有し、位置28のグルタミニル残基が
欠落していても良く、さらにはN末端にメチオニル残基を有していても良い前記
レプチン部分にN末端で結合しているデキストラン−レプチン結合体混合物。 - 【請求項27】 前記デキストラン部分が約6kDの分子量を有する請求項
26に記載のデキストラン−レプチン結合体混合物。 - 【請求項28】 医薬的に許容される担体中に請求項24ないし25のいず
れかに記載のデキストラン−レプチン結合体を含む医薬組成物。 - 【請求項29】 (a)約1kD〜約20kDの分子量を有するデキストラン部分を活性化する
段階; (b)アミノ末端アミンがまだプロトン化されず、レプチン蛋白上の他の位置
のアミン基はプロトン化されるだけの酸性のpHで、還元条件下にレプチン部分
に活性化デキストラン部分を結合させてアミン結合を形成する段階; (c)デキストラン−レプチン結合体を得る段階;および (d)適宜にデキストラン−レプチン結合体を精製する段階 を有する方法によって製造されるデキストラン−レプチン結合体であって、 位置100および138のアミノ酸がグルタミンで置き換わっている配列番号
1のアミノ酸配列を有し、位置28のグルタミニル残基が欠落していても良く、
さらにはN末端にメチオニル残基を有していても良い前記レプチン部分に、前記
デキストラン部分がN末端で結合しているデキストラン−レプチン結合体。 - 【請求項30】 肥満、糖尿病および高脂血症から選択される状態の患者の
治療方法であって、有効量の請求項24又は25のいずれかに記載のデキストラ
ン−レプチン結合体を投与する段階を有する方法。
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