KR20120024529A - 신경섬유 매듭 및 아밀로이드 베타의 축적으로부터 기인하는 진행성 인지 기능 장애의 치료용 렙틴 조성물 및 치료 방법 - Google Patents

신경섬유 매듭 및 아밀로이드 베타의 축적으로부터 기인하는 진행성 인지 기능 장애의 치료용 렙틴 조성물 및 치료 방법 Download PDF

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니콜라오스 테자프시디스
스티븐 제이 그레코
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니콜라오스 테자프시디스
스티븐 제이 그레코
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Abstract

본 발명은 렙틴 생성물을 함유하는 조성물 및 진행성 인지 장애의 임상적 치료 방법 및 진단 방법을 제공한다. 하나의 양상에 따르면, 본 발명은 진행성 인지 장애의 치료 방법을 제공한다. 또다른 양상에 따르면, 본 발명은 인지 기능의 회복력 개선이 필요한 대상에서의 이의 개선 방법을 제공한다. 또다른 양상에 따르면, 본 발명은 Aβ 의 축적, tau 의 과인산화, 또는 신경섬유 매듭의 축적 중 하나 이상으로부터 기인하는 진행성 인지 기능장애 질환 또는 장애의 치료를 위한 유효한 치료제의 확인 방법이 제공된다.

Description

신경섬유 매듭 및 아밀로이드 베타의 축적으로부터 기인하는 진행성 인지 기능 장애의 치료용 렙틴 조성물 및 치료 방법 {LEPTIN COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING PROGRESSIVE COGNITIVE FUNCTION DISORDERS RESULTING FROM ACCUMULATION OF NEUROFIBRILLARY TANGLES AND AMLYOID BETA}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2009 년 6 월 11 일에 출원된 미국 출원 61/186,102 호 및 2008 년 11 월 4 일에 출원된 미국 출원 61/111,197 호의 우선권을 주장한다. 각각의 상기 출원의 내용은 전체가 본원에 참조로서 인용된다.
정부 지원금
본 발명은 미국 노화연구소 및 뉴저지 과학기술 위원회에서 수여된 SBIR-1R43AG029670 으로 지원을 받아 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 특정 권한이 있다.
기술분야
본 발명은 렙틴 생성물을 이용하는 신경섬유 매듭 또는 아밀로이드 베타의 축적으로부터 기인하는 진행성 인지 기능 장애의 치료용 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다.
아밀로이드 β (Aβ)
아밀로이드 β 는 순차적인 단백질분해 분할에 의해 큰 전구체 단백질 (APP) 로부터 유래된다. APP 는 그것의 신호 펩티드를 통해 소포체 내로 동시번역되어 전위된 다음, 분비 경로를 통해 번역후 개질된 단일 막통과 폴리펩티드이다. 이것은 유비쿼터스하게 발현되는 폴리펩티드의 이질적 그룹을 포함한다. 상기 이질성은 대안적인 스플라이싱 (695, 751 및 770 개 잔기의 3 개의 주요 이소 형태를 낳음) 뿐 아니라, N- 및 O-연결 당 첨가, 황산화, 및 인산화를 비롯한 다양한 번역후 개질 모두로부터 발생한다. N- 및 O-연결 당 습득은 생합성 후 빠르게 일어나며, 이의 반감기는 비교적 짧다 (45 내지 60 분). 상기 이질성에도 불구하고, APP 는 진화적으로 크게 보존되어 있으며, 이에 대해 시험된 모든 포유류에서 발현되었으며, APP 의 부분적인 상동이 드로소필라 (Drosophilia, 초파리) 에서 발견되었다 (APPL). APP 는 큰 엑토도메인과 세포질 꼬리 내 모두에서 실질적인 상동을 갖는 아밀로이드 전구체-유사 단백질 (APLP) 인 보다 큰 유전자 족의 일원이나, Aβ 영역에서는 다양성이 있다.
751 또는 770 개의 아미노산을 함유하는 APP 스플라이싱 형태는 신체 전반의 비-뉴런 세포에서 널리 발현되고 또한 뉴런에서 일어난다. 그러나, 뉴런은 비-뉴런 세포에서는 풍부함이 매우 적게 일어나는 695 잔기 이소형을 더욱 높은 수준으로 발현한다. 751/770-잔기와 695-잔기 형태 사이의 차이는 세린 프로테아제 저해제 (KPI) 의 쿠니츠 (Kunitz) 유형과 상동인 56-아미노산 모티프를 코딩하는 엑손의 751/770-잔기 이소형으로 존재하며, 이것은 상기 더 긴 APP 이소형의 하나의 잠재적인 기능을 나타낸다. 인간 혈소판에서 발견되는 APP 의 KPI-함유 이소형은 응고 캐스케이드 중의 세린 프로테아제인 인자 Xia 의 저해제로서 담당한다.
Aβ 생성은 분비 경로를 통한 APP 의 트래피킹 (trafficking) 동안 및 그 후 모두에서 일어나는 정상적인 대사성 사건이며, APP 는 분비된 유도체를 소포 내강 및 세포외 공간 내로 방출시키는 다양한 단백질가수분해 분할을 겪을 수 있다. 활성이 지정된 α-세크레타아제에 의해 유발되는 확인된 첫번째 단백질가수분해 분할은 APP 단일 막통과 도메인에 대한 12 개의 아미노산 NH2-말단에서 일어난다. 상기 처리가공은 큰 가용성 엑토도메인 조각 (α-APPs) 을 내강/세포외 공간 내로 방출시키고, 83-잔기 COOH-말단 조각 (CTF) 을 막 내에 보유시킨다. 대안적으로는, α-세크레타아제 분할에 적용되지 않은 일부 APP 분자는 α-분할 부위에 대한 16 개의 잔기 NH2-말단을 주로 절단하는 활성이 지정된 β-세크레타아제에 의해 분할되어, 약간 더 작은 엑토도메인 유도체 (β-APPs) 를 생성시키고 Aβ 영역의 잔기 1 에서 시작하는 막 내 99-잔기 CFT (C99) 를 보유할 수 있다. 그 결과 C99 조각은 γ-세크레타아제의 결과로서 막통과 도메인의 중간에서 분할된다. 정확하게는 그 복합 세포내 트래피킹 동안 APP 가 α-, β- 및 γ-세크레타아제를 겪을 수 있는 장소는 아직 알려지지 않은 채로 남아있다.
세포 배양 연구에 근거하여 다수의 기능이 APP 할로단백질 및/또는 이들의 주요 분비된 유도체 (α-APPs) 에 속하는 것으로 생각되어 왔다. 가용성 α-APP 는 자가분비 인자로서 및 신경보호제 (아마도 향신경성 인자) 로서 작용할 수 있는 것으로 보인다. 시험관 내 연구는 751- 및 770-잔기 이소형 (KPI 모티프를 코딩함) 이 트립신 및 케모트립신과 같은 세린 프로테아제를 저해한다는 것을 나타낸다. 분비된 APP 이소형은 배양 시 세포-세포 및 세포-기질 접착 특성을 부여할 수 있다. 모든 상기 귀속되는 기능은 아직 생체 내에서 확인되지는 않았다.
Madin-Darby 개 신장 (MDCK) 세포와 같은 분극화된 상피 세포에서, APP 는 주로 α-세크레타아제 분할을 겪어 α-APPs 를 기저측면으로 방출시킬 수 있는 기저측부막에 표적하나, 적은 분획은 정점으로 표적 및 처리가공된다. 신체에서 가장 높은 수준의 APP (특히 APP695) 를 발현하는 세포 유형 중 하나인 뉴런에서, APP 는 엑손 수송의 빠른 성분에서 전방으로 수송될 수 있다. APP 는 시냅스 소포에 특이적이지는 않지만 엑손 말단 내 소포에 존재한다. 세포 생물학적 연구는 엑손 말단 내 APP 가 엑손을 세포 체내로 역행하여 수송할 수 있고, 그 다음 일부 분자가 세포체수상돌기 표면으로 완전히 이동시킨다는 것을 증명하였다. 역행 엑손 트래피킹 동안, 일부 APP 분자는 측삭형질막 표면으로 재순환될 수 있다.
APP 엑손 말단이 Aβ 생성에 대한 주요 부위일 수 있을 것이라고 가정하여도, 이것은 명백하게 측정되지 않았고, 다양한 뉴런의 서브-부위에 있는 엔도좀에서 재순환되는 APP 는 순차척인 β- 및 γ- 세크레타아제 분할을 겪어 펩티드를 방출할 수 있을 것이다. APP 가 뉴런에서 특히 풍부하게 발현되고, 뉴런이 상당한 양의 Aβ 펩티드를 분비하는 것으로 제시되었지만, 별아교세포, 미세아교세포, 및 내피 및 평활근 세포를 포함하여, APP 를 또한 발현하고 다양한 양의 Aβ 를 방출하는 다른 뇌 세포가 결국 세포외 침전을 초래하는 Aβ 의 분비된 모집물에 기여할 것이다. 게다가, (i) 사실상 모든 말초 세포도 또한 APP 를 발현하고 Aβ 를 발생시킨다는 사실 및 (ii) Aβ 가 혈장에 존재한다는 사실이 순환 Aβ 가 혈액-뇌 장벽을 가로질러 대뇌 Aβ 축적에 기여할 것이라는 가능성을 높여준다.
지질 뗏목
일반적으로는 뇌 지질은 Aβ-관련 발병 경로에 복잡하게 관여한다고 여겨진다. Aβ 펩티드는 AD 환자의 뇌에서 발견되는 아밀로이드 플라크의 주요 단백질성 성분이고 장애의 주범으로서 여러모로 간주된다. 누적된 세포외 Aβ 의 양은 AD 의 병리생물학에 있어서 중요하고, 생성/분비 및 소거의 상쇄 속도에 따라 다르다. Aβ 를 생성하고 이를 리포단백질 수용체 관련 단백질 ("LRP") 경로를 통해 받아들이는 것 모두를 위해서 뉴런은 프레세닐린 1 (Presenilin 1, "PS1") 과 세포질-링커 단백질 170 (Cytoplasmic-Linker Protein 170, "CLIP-170") 사이의 상호작용에 의존한다는 연구가 보고되었다. 여기에 더 요구되는 것은, Aβ 의 형성이 지질 뗏목 (Lipid Raft, "LR") 내 핵심 단백질의 집합에 의존한다는 것이다. 본원에서 사용된 "지질 뗏목" 이라는 용어는 신호 전달, 단백질 트래피킹 및 단백질 분해와 연루되어 있는 콜레스테롤, 글리코스핑고지질, 및 글루코실포스포파티딜-이노시톨 (GPI)-태그 단백질 등이 풍부한 막 마이크로도메인을 말한다. LR 내에서, APP 는 β-세크레타아제 (BACE) 에 의해 처음 분할되어, APP 의 C-말단 중간체 조각 (CFT(C99)) 을 생성하고, 이것은 막에 묻힌 채로 남아있는 것으로 여겨진다. 이어서 CFT(C99) 는 프레세닐린, (PS1/PS2), 니카스트린, PEN-2, 및 APH-I 또는 이들의 조각을 함유하는 고분자량 멀티-단백질 복합체인 γ-세크레타아제에 의해 지질 이중층 내에 존재하는 부위에서 분할된다. 마지막으로 Aβ 는 세포 밖으로 분비되는데, 이것은: i) 올리고머화 후 축적 및 뉴런에 대한 독성을 나타내기 시작하거나, ii) 세포내이입 매카니즘 (아포리포단백질-E (apoE) 및 LRP 또는 스캐빈저 수용체 포함) 에 의해 또는 인슐린-분해 효소 (IDE) 및 네프릴리신을 비롯한 세포외부 프로테아제에 의한 분해에 의해 제거될 수 있다.
메틸-베타-시클로덱스트린과 유사하게 렙틴은 뉴런 세포에서 베타-세크레타아제 활성을 감소시킨다. 또한, 렙틴은 시험관 내 apoE-의존성 Aβ 섭취를 증가시킨다. 렙틴과 유사하게, 메틸-베타-시클로덱스트린은 뉴런 세포에서 베타-세크레타아제 활성을 감소시키나, 이론에 제한됨 없이, 막 LR 의 지질 조성을 변경하여 이루어진다. 렙틴과 유사하게, 아세틸 CoA 카르복실라아제의 저해제 (예를 들어, TOFA) 및 지방산 신타아제의 저해제 (세룰레닌) 는 렙틴의 작용을 모방하며, 즉, 렙틴 모조체로서 작용한다. 반대로, 카르니틴 팔미토일 트랜스페라아제-1 의 저해제인 에톡소미르는 Aβ 생성을 증가시키는 것으로 알려져 있다.
알츠하이머 질환
알츠하이머 질환 (또한 "AD", "알츠하이머 타입 노인성 치매 (senile dementia of the Alzheimer Type: SDAT)" 또는 "알츠하이머" 로도 불림) 은 중추신경계 ("CNS") 의 퇴행성 신경 장애이다. AD 는 통상적으로, 특징적인 신경학적 및 신경심리학적 증상이 존재하는 것을 기초로 하여, 환자의 병력, 주변 친척들의 종합적인 병력, 및 임상적 관찰을 통해서 임상적으로 진단된다.
AD 의 병리학에는, (1) APP, PS1 및 PS2 유전자 내 미스센스 돌연변이; (2) Aβ42 의 변형된 단백질분해; (3) 뇌 간질액 내 Aβ42 의 진행성 축적 및 응집; (4) 분산된 플라크 (프로테오글리칸 및 기타 아밀로이드-촉진 기질과 연관된) 로서의 응집된 Aβ42 의 침전; (5) 분산된 Aβ42 플라크 상의 Aβ40 의 응집 및 특정 플라크-연관 단백질의 증식 (예를 들어, 보체 clq, 등); (6) (a) 미세아교세포 활성화 및 사이토카인 방출, (b) 별아교세포증 및 급성 상 단백질 방출을 포함하는 염증 반응; (7) 아밀로이드 플라크 내 및 신경망 내 그 밖의 곳에서의 진행성 신경증 손상; (8) 뉴런 대사 및 이온 항상성 파괴; 산화 손상; (9) PHF 형성을 야기하는 과인산화된 tau 를 유발하는 변형된 키나아제/포스파타아제 활성; (10) 널리 퍼진 뉴런/초로성 기능장애 및 진행성 신경전달물질 결핍이 있는 대뇌 피질 및 해마의 사망; 및 (11) 치매가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 영향을 받은 피질 영역에 추가로 존재할 수 있는 궁극적인 효과에는 초로성 디스트로피, 시냅스 손실, 뉴런 세포체의 수축, 및 선택적 뉴런 손실이 포함된다.
AD 는 또한 대뇌 피질 및 특정 대뇌 하부 영역에서의 뉴런 및 시냅스의 손실을 특징으로 한다. 이러한 손실은 측두엽과 두정엽, 및 전두엽 피질과 대상이랑 일부의 퇴화를 포함하는, 해당 영역의 전체적인 위축을 가져오게 된다. AD 환자의 뇌에서는 현미경에 의한 실버 염색 후에 아밀로이드 플라크 ("AP") 및 신경섬유 매듭 ("NFT") 을 모두 명백하게 볼 수 있다.
플라크
아밀로이드 플라크는 뉴런 외부 및 주위의 아밀로이드-베타 ("Aβ") 단백질 및 세포 물질의 조밀한, 대부분 불용성인 침전물이다. 아밀로이드 전구체 단백질 ("APP") 을 함유하는 디스트로피 신경돌기는 트라우마성 뇌 손상에서 발견되고, "확산 플라크" 는 권투선수 치매와 연관되어 관찰될 수 있으나, AD 내 아밀로이드 플라크의 출현은 독특하다. 특정 초로성 플라크 (즉, tau 신경섬유 병리학에 의해 둘러싸인 Aβ 펩티드-함유 세포외 병반) 의 출현은 AD 에 특이적인 것으로 고려된다. 일반적으로 비-AD 타우병증에는 아밀로이드 플라크가 결여되기 때문에 아밀로이드 플라크는 신경섬유 병리학에 대한 비특이적 반응이 아닌 것으로 여겨진다. AD-유형 아밀로이드 플라크의 특이성에 대해 추가로 입증할 것은 다운 신드롬에서와 같은 APP 유전자의 돌연변이 또는 복제가 AD 의 특이적 특징을 임상적으로 및 병리학적으로 생성한다는 사실이다. 따라서, AD 는 초로성 아밀로이드 플라크와 NFT 의 특이적 조합에 관여하며, 초로성 플라크는 질병에 더욱 특이인 것으로 보이고 NFT 는 신경퇴행을 좀더 유도할 것으로 보인다.
초로성 플라크
초로성 플라크는 후방 신경 세포 과정의 퇴행 또는 사멸에 의해 연구된 대략 구형의 세포외 아밀로이드 침전물을 포함한다. 상기 비정상 수상돌기 및 엑손은 NFT 에서 발견되는 것과 동일한 비정상 일탈 tau 원섬유를 함유한다. 제시된 초로성 플라크에서, 구별되는 신경전달물질 특징을 발현하는 다양한 상이한 기원으로부터의 엑손이 존재할 수 있다. 상기 초로성은 종종 확장되고, 길고 구불구불하며, 증대된 리소좀, 무수한 미토콘드리아, 및 쌍 나선형 필라멘트를 포함하는 초구조적 비정상 (신경섬유 매듭을 포함하는 것들과 구별하기 어려움) 을 특징으로 한다. 또한 이러한 플라크는 CD45 및 HLA-DR 과 같이 활성화와 관련된 표면 항원을 발현하는 미세아교세포와 밀접하게 연관되어 있으며, 이들은 풍부한 아교세포 필라멘트를 전시하는 반응성 별아교세포에 의해 둘러싸여 있다. 미세아교세포는 통상적으로 초로성 플라크의 중심 아밀로이드 코어 내 그리고 이와 근접한 곳에 있는 반면, 별아교세포는 종종 플라크의 외부에 고리를 형성하며, 이들 과정 중 일부는 아밀로이드 코어를 향해 구심적으로 확장된다. 이러한 초로성 플라크를 발달시키는데 걸리는 시간은 알려져 있지 않으나, 이들 병반은 아마도 상당한 기간의 시간, 아마도 수 개월 또는 수 년에 걸쳐 매우 점차적으로 발달된다. 임의의 하나의 플라크에 기여하는 주변 신경염은 다양한 신경전달물질 계열의 국부 뉴런으로부터 발생될 수 있다. 초로성 플라크에서 발견되는 대부분의 원섬유 Aβ 는, 특히 응집하는 경향이 있는 약간 더 긴, 더욱 소수성인 형태인 아미노산 42 (Aβ42) 에서 종결되는 종류이다. 그러나, 정상적으로는 Aβ42 보다 세포에 의해 더욱 풍부하게 생성되는 아미노산 40 (Aβ40) 에서 종결되는 Aβ 종류는 플라크 내에서 Aβ42 와 공통으로 위치한다. 현미경 뇌 섹션 내 초로성 플라크의 횡단면 직경은 10 ㎛ 내지 120 ㎛ 초과로 매우 다양하며, 세포외 코어를 포함하는 아밀로이드 원섬유의 밀도 및 조밀 정도는 또한 플라크 간에 큰 변이를 보인다.
초로성 플라크는 세포외 아밀로이드 플라크 병리학이 세포내 신경섬유 병리학 및 명백한 구조적 및 기능적 붕괴를 유도하는 병소를 나타낸다.
확산 플라크 (전-아밀로이드 침전물)
많은 Aβ 침전물은 고전적인 초로성 플라크의 조밀한, 원섬유 출현이 결핍되어 있다. 변연 및 연합 피질, 및 AD 의 전형적인 증상학에 명백하게 연루되지 않은 뇌 영역에서 발견되는 것들의 사실상 모두 (예를 들어, 시상, 꼬리엽, 피각, 소뇌) 에서 발견되는 많은 플라크는, 명백한 원섬유의, 조밀한 중심이 없이, 미세한 과립 패턴으로 발생하는 내생 Aβ 또는 합성 Aβ 에 대해 개발된 진단 항체에 대해 비교적 가벼운, 무정형성 Aβ 면역반응성을 보인다는 것이 연구를 통해 확인되었다. 또한 많은 초로성 플라크를 함유하는 영역에서의 상기 플라크의 검출은 상기 플라크가 초로성 플라크의 전구체 병반을 나타내고, 그러므로 "확산 플라크" 또는 "전-아밀로이드 침전물" 로서 불린다는 가설을 도출한다. AD 뇌에 침전된 Aβ 펩티드는 원칙적으로 Aβ40 또는 Aβ42 에서 종결된다. Aβ42 에서 종결되는 펩티드는 원섬유-풍부 초로성 플라크에서 일반적으로 발견되는 혼합된 (Aβ42 + Aβ40) 침전물과는 반대로, Aβ40 면역반응성이 없거나 거의 없는 확산 플라크를 포함하는 물질의 서브유닛이라는 것이 연구를 통해 확인되었다.
신경섬유 매듭
AD 에서 전형적으로 영향을 받은 뇌 영역 내 많은 뉴런 (내후뇌 피질, 해마, 해마방회, 편도체, 전두, 측두, 두정부 및 후두 연합 피질, 및 상기 영역으로 투영되는 특정 피질하 핵) 은 핵 주위 세포질을 대부분 점령하고 있는 비정상 섬유의 큰, 비-막 결합 번들을 함유한다. 대부분의 상기 섬유는 나선 내 10 nm 필라멘트 꼬임의 쌍 (쌍 나선 필라멘트 (PHF)) 으로 이루어지며, 나선 주기는 약 160 nm 이다. 일부 매듭-함유 뉴런은 또한 PHF 로 배치된 직선의, 10 nm 내지 15 nm 필라멘트의 타래를 함유한다. 신경섬유 매듭 (NFT) 은 과인산화되고 세포 자체 내부에 축적되는 미세관-연관 단백질 "tau" 의 응집물이다. Tau 는 뉴런에서 비교적 풍부하나,모든 핵화 세포에 존재하고, 미세관에 결합하고 중합을 위해 미세관 어셈블리를 안정화시키는 생리학적 작용을 한다. 100 킬로베이스가 넘고 16 엑손으로 구성되는 tau 유전자는 AP2 및 SP1 과 같은 전사 인자에 대한 보존 결합 부위를 함유한다. 성인 뇌에서, 엑손 2, 3 및 10 상에 전사된 tau 핵 RNA 의 대안적인 스플라이싱은 6 개의 tau 이소형을 산출하며, 각각은 (i) 엑손 10 상에서 코딩된 C 말단 영역 내 31 또는 32 잔기의 3 또는 4 펩티드 반복부분을 갖고, (ii) 미세관 결합 도메인을 포함하거나 (iii) 엑손 2 및 3 상에서 코딩된 0, 1 또는 2 삽입체의 발현이 상이하다. 상기 tau 이소형 뿐 아니라 그의 인산화 상태는, 삽입체가 없는 3 반복부분 ("3 R") tau 가 태아 및 초기 신생아에서 발현되는 반면 이질성 이소형은 성인 뇌에서 발현되는 식으로 발달 동안 변화된다. 상기 RNA 스플라이싱에서의 전환은 또한 tau 인산화에서의 환원에 상응한다.
신경퇴행 동안, tau 는 특이적 항혈청을 사용하여 검출될 수 있는 프롤린 지정 세린/트레오닌 인산화 부위에서 비정상적으로 인산화된다. 상기 세린/트레오닌 (Ser/Thr) 인산화 부위에는 Ser-202/Thr-205 (AT8 부위), Ser-214 및/또는 Ser-214, Ser-181, 및/또는 Ser-212 (AT100 부위), Thr-231 및/또는 Ser-235 (TG3 부위), 및 Ser-396/Ser-404 (PHF-I 부위) 가 포함된다. 대안적인 tau 스플라이싱 프로파일은, AD 내 tau 축적은 3R 및 4R tau 의 혼합물이고, 픽 (Pick) 질환은 3R tau 인 경향이 있고, 피질 기저핵 변성 및 진행성 핵상마비는 4R tau 인 경향이 있고, 소위 은친화성 (agryrophilic) 낟알 질환은 3R tau 로 구성되는 작은 포함물을 축적하는 식으로 병리학적 표현형에 따라 상이하다. "타우병증" 이라는 일반 명칭은 인산화된 tau 가 축적되는 신경퇴행성 질환의 광범위한 분류를 포함한다.
다양한 키나아제는 다양한 부위에서 시험관 내에서 tau 를 인산화시킬 수 있는 것으로 제시되었다. 그럼에도 불구하고, 하나 이상의 키나아제가 원칙적으로 미세관과 응집물로부터 불용성 쌍 나선 필라멘트 내로의 명백한 해리를 야기하는 생체 내 tau 의 과인산화의 개시를 담당하는지의 여부는 명백해지지 않았다.
인산화된 tau 의 영역 분포와 임상적 징후 사이의 상관관계는 tau 와 AD 발병과의 밀접한 관계를 암시한다. AD 를 동반하는 증가된 tau 인산화는 가능하게는 다른 인자 (예를 들어, Aβ, 산화 스트레스, 염증 매개체) 에 의해 도움을 받은 미세관으로부터의 tau 의 분리, 및 NFT 및 신경섬유망 가닥의 격리를 야기할 수 있다. 이론에 제한됨 없이, 독성인 기능 습득과 함께 정상 tau 기능 (미세관의 안정화 및 유지) 의 손실은, 엑손 수송을 위태롭게 할 수 있고, 시냅스 퇴행에 기여할 수 있다. 그러나 NFT 독성의 역할은 불분명하게 남아있다. 억제성 인간 tau 를 발현하는 마우스 모델이 여전히 NFT, 뉴런 손실, 및 행동 장애를 발병하고; tau 억제 후, 안정화된 행동 결핍을 나타내지만, NFT 는 지속적으로 축적된다는 것이 연구를 통해 제시되었다. 또다른 AD-유사 모델에서, tau 의 축적이 있는 엑손 병리학은 플라크 침전을 진행시켰다. NFT (및 가정적 "중간체") 는 생존가능한 뉴런의 세포질 내에 존재한다. 오직 진행된 질환에서 많은 수의 세포외 NFT 가 확인되었다.
NFT 는 AD 에 특이적이지 않고, 특히 NFT 의 광범위한 정의에 상이한 tau 이소형이 포함되는 경우, 또는 하나가 NFT 의 형태학적 특징의 예상을 넘어서는 경우 그러하다. AD 의 2 가지 고전적인 병반인 초로성 플라크 및 NFT 는 서로 독립적으로 발생할 수 있다. AD 내 것과 생화학적으로 유사한, 또는 일부 경우에서는 구별이 안되는 tau 응집물로 구성된 매듭은 12 가지 초과의 덜 흔한 신경퇴행성 질환에서 설명되어 있고, 이들 거의 모두에서는 Aβ 침전 및 초로성 플라크가 발견되지 않았다.
NFT 는 복합적 되 질환에서 나타나고, 1 개 초과의 질환 상태에서 신경퇴행에 기여할 수 있다. AD 외에도, NFT 는 또한 일부 전두측두 치매, 근육긴장 디스트로피, 바이러스 범뇌염, 권투선수 치매, 일부 프리온 질환, 및 기타 뇌 질환에서 발견된다. 상기 장애 중 많은 경우, NFT 병리학의 심각성은 말기 AD 에서 관찰되는 것보다 덜하다. 게다가, 널리 퍼진 신피질 NFT 를 특징으로 하는 상태는 광범위한 신경퇴행 및 임상적 치매가 결여된다. 반면, NFT 가 없는 광범위한 신경퇴행 및 임상적 치매인 만성 뇌 질환의 많은 부차유형, 예컨대 많은 전두측두 치매의 부차유형, 시누클레인증 (synucleinopathies), 아급성 또는 만성 경색증, 대사성, 탈수초성, 발달성, 및 트리뉴클레오티드 반복 질환이 있다. Tau 단백질 그 자체는 신경퇴행을 직접적으로 촉발시킬 수 있고: 많은 tau 내 생식계열 돌연변이는 NFT 가 있는 임상적 치매를 유발한다. 상기 타우병증은 AD 과 구별되나, but 공통 경로가 포함될 수 있다. NFT 는 복합 뇌 질환에서 나타나고, 1 개 초과의 질환 상태에서 신경퇴행에 기여할 수 있다.
초로성 플라크 내외의 디스트로피 피질 신경돌기
아밀로이드 플라크 내 및 바로 주변에서 발견되는 길게 퍼지고 구불구불한 신경돌기는 NFT 를 포함하는 것과 구조적으로, 생화학적으로 그리고 면역세포화학적으로 구분되지 않는 PHF 를 함유한다. 또한, 플라크는 종종 PHF tau 에 면역반응성이지 않은 수많은 디스트로피 신경돌기를 함유한다. Tau-양성 디스트로피 신경돌기는 초로성 플라크의 외부 피질 신경망에 보다 널리 퍼진 분포로 존재한다. 변형된 형태의 tau 를 함유하는 디스트로피 피질 신경돌기의 유병률 및 밀도는 AD 환자에 따라 상당히 다르다. 연구를 통해 NFT 이 특히 풍부한 AD 환자는 또한 널리 퍼진 tau-면역반응성 디스트로피 피질 신경돌기를 보이는 환자임을 보여주었다. 플라크내 및 프라크외 디스트로피 신경돌기의 일부는 신경필라멘트 서브유닛 단백질의 인산화된 형태에 대해 면역반응성이므로; 신경필라멘트 서브유닛 단백질의 인산화된 형태는 인산화-tau 반응성과 공존할 수 있다. 상기 발견은 매듭-함유 뉴런 및 디스트로피 신경돌기에서 발생하는 변형된 키나아제 및 포스파타아제 활성에 대한 여러 기질이 있을 수 있음을 암시한다.
아밀로이드 미세혈관병증
Aβ 는 본래, AD 또는 다운 신드롬 환자의 뇌 바로 외부에서 종종 발견되는 아밀로이드-적재 수막 세동맥 및 세정맥으로부터 단리되었다. 유사하게, 대뇌 피질 내의 작은 세동맥, 세정맥, 및 모세혈관은 또한 종종 아밀로이드 침전물을 가지고 있다. 본 미세혈관 혈관병증은 혈관의 내강에서 떨어져 있는 기저 막에서 발견되는 아밀로이드 원섬유에 의해 초미세구조 수준에서 특징으로 하며, 종종 주위 주변혈관 신경망 내로의 원섬유의 명백한 확장을 보인다 (불쾌 혈관병증). 미세혈관 기저 막에서 필라멘트로서 발생하는 Aβ 펩티드는 면역반응성에 근거하여, 주로 Aβ40 종류인 것으로 보이나, 아밀로이드 혈관병증을 발달시키는 숙명을 가진 혈관 내에 초기에 침전되는 종류가 Aβ42 일 수 있다는 증거가 제시되었다. 아밀로이드 혈관병증의 범위는 비교적 유사한 적재량의 실질 Aβ 를 갖는 AD 뇌에서 크게 다양하다. AD 에서 발생하는 피질 기능장애에 대한 상기 미세혈관 아밀로이드증의 기여 및 아밀로이드가 미세혈관 기능을 변경시키는 메카니즘은 알려지지 않은 채로 남아있다. AD 와는 본질적으로 구별되지 않는 Aβ 침전물로 구성된 아밀로이드-함유 혈관은 AD 가 없는 노인 대상의 뇌 내 실질 Aβ 침전물의 사실상의 부재에서 발생할 수 있다. 상기 조건 하 (콩고염색성 아밀로이드 혈관병증 (CAA)) 뿐 아니라 AD 하의 이러한 아밀로이드-함유 혈관은 때때로 파열되어, 1 또는 복합 뇌출혈을 일으킬 수 있다. 그럼에도 불구하고, AD 환자의 대다수는 일부 또는 많은 미세혈관 아밀로이드 침전물의 존재에도 불구하고, 뇌출혈을 겪지 않는다.
알츠하이머 질환을 일으키는 주요인은 알려지지 않은 채로 남아있다
AD 를 일으키는 주요인은 알려지지 않은 채로 남아있다. Aβ 펩티드-풍부 플라크 또는 NFT 가 주요한 신경퇴행성 요소인지, 그리고 이들이 병인적으로 관련되어 있는 지에 대한 불일치가 계속되고 있다. 궁극적으로 특징적인 병리학을 일으키는 초기 생화학적 사건이 있는 지를 다루고자 하는 연구 노력 사이에 큰 정도의 차이가 있다. 일반적으로 가용성 Aβ 올리고머가 플라크 적재 전에, 신경퇴행, 시냅스 손실 및 치매를 야기하는 신경독성 영향을 발휘하는 것으로 여겨지고 있다. 또한, 증가된 Aβ 수준은 비정상 지질 축적으로부터 기인하여, 막 유동성 및 지질 뗏목 조성을 변경시킬 수 있다. 그러나, AD 경우의 압도적인 다수를 나타내는 산발적 AD 의 경우, Aβ 캐스케이드를 촉발시키는 특정 요인에 대한 납득할 만한 증거가 여전히 없다.
렙틴
렙틴은 지방 조직에 의해 분비되는 나선형 단백질로서, 체내 지방 저장량이 증가하면 시상하부의 복내측핵에 존재하는 수용체 부위에 작용하여 식욕을 감퇴시키고 에너지 소비를 증가시킨다. 렙틴 수준은 여성에서 40% 더 높고, 월경 시작 바로 직전에 추가 50% 상승을 보이다가, 이후 기준 수준으로 되돌아온다. 렙틴 수준은 금식에 의해 저하되고, 염증에 의해 증가한다.
렙틴 또는 렙틴 신호의 제거는 렙틴-결핍 비만, 유전형 ob/ob 를 갖는 과인슐린혈증 마우스; 유전형 db/db 를 갖는 렙틴 수용체 유전자에서 돌연변이를 갖는 당뇨병 마우스 (렙틴을 생성하나 렙틴에 대해 비-반응성임); 유전형 fa/fa 를 갖는 래트 (돌연변이된 렙틴 수용체인 "지방" 비만 유전자를 가짐); 및 몇몇의 흔치 않은 유전적 경우에 의해 예시되는 바와 같이 비만을 야기하는데 충분하다 (Schwartz et al., Nature. 404: 661-71 (2000)). 렙틴을 코딩하는 ob 유전자에 돌연변이가 있는 실험실 마우스는 병적으로 비만하게 되고, 당뇨를 가지며, 불임이 된다. 상기 마우스에 렙틴을 투여하면 글루코오스 내성이 향상되고, 육체 활동이 증가하고, 체중을 30% 감소시키며, 생식력을 회복하게 된다. 렙틴 수용체를 코딩하는 db 유전자에 돌연변이가 있는 마우스는 또한 비만이 되고, 당뇨를 가지지만, 렙틴 투여로 개선되지는 않는다. 렙틴 및 렙틴 수용체 부위를 모두 코딩하는 인간 유전자가 확인되었다. 비록 렙틴 및 렙틴 수용체 유전자 모두에 돌연변이가 있는 경우는 비정상적인 식습관을 가진, 소수의 병적으로 비만인 인간에서 발견되기는 했지만, 대부분의 비만인 사람들은 그러한 돌연변이를 보이지 않고, 정상이거나 상승된 순환하는 렙틴 수준을 가지고 있다. 기아 상태에서 보여지는 면역 결핍이 감소된 렙틴 분비로부터 초래될 수 있다. 렙틴 또는 그의 수용체에 대한 유전자가 결핍된 마우스는 T-세포 기능 손상을 보이며, 실험실 연구에서 렙틴은 인간 CD4 림프구에서의 증식 반응을 유도하였다.
렙틴의 기능적 수용체에 대한 렙틴의 결합은 Janus 티로신 키나아제를 모집하고 수용체를 활성화시키며, 이것은 그 후 STAT 와 같은 세포질 어댑터에 대한 도킹 부위로서 역할을 한다 (Baumann, H., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8374 1996)). JAK/STAT 활성화에 대한 일반적인 모델에 따르면, STAT 단백질은 초기에는 세포질 내에 비활성 형태로 존재한다. 리간드 자극 및 수용체 이량체화 후, JAK/STAT 경로는 수용체-결합 JAK 키나아제의 활성화에 의해 활성화된다. 이들 JAK 키나아제는 이어서 티로신 잔기에서 수용체를 인산화시키고, 이것은 STAT 를 수용체로 모집한다. 그 다음 STAT 가 인산화되어 인산화-STAT 를 형성하고, 이량체화되고, 핵으로 이동하여, 이곳에서 인산화-STAT 이량체가 표적 유전자의 프로모터 영역 내의 특이적 서열에 결합하고, 음성 조절자, 예컨대 사이토카인 신호 3 의 억제자 (Bjorbaek, C, K. et al. J. Biol. Chem. 274:30059 (1999)) 및 단백질 티로신 포스파타아제 1B (Cheng, A. N. et al. Dev. Cell 2:497 (2002), Schwartz et al., Nature, 404:661-71 (2000), Louis A. Tartaglia, J. Biol. Chem. Minireview, 272:6093-6096 (March 1997)) 을 포함하여 상기 유전자의 전사를 자극한다 (Schindler et al., Ann. Rev. Biochem. 64: 621-51 (1995)).
JAK-2-STAT-3 경로 외에, 다른 경로도 또한 뇌 내 및 면역 세포 상 렙틴의 효과를 매개하는데 관여한다. 예를 들어, 미토젠-활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 경로, 인슐린 수용체 기질 1 (IRS1) 경로, 및 포스파티딜이노시톨 3'-키나아제 (PI3'K) 경로 (Martin-Romero, C, V. Sanchez-Margalet. Cell. Immunol. 212:83 (2001)) 가 또한 렙틴의 작용을 매개한다 (Sanchez-Margalet, V., C. Martin-Romero, Cell. Immunol. 211 :30 (2001)).
렙틴은 또한 칼로리 섭취의 넓은 변화라는 면에서 세포내 항상성을 유지하는 것을 담당하는 지질-조절성 호르몬으로서의 생리학적 역할을 할 수 있다 (Unger R H. 2003. Annu Rev Physiol. 65:333-47). 이것은 직접적으로 지질분해 (지방 분해를 의미) 를 자극하고, 지질합성 (지방 합성을 의미) 을 억제하여 달성된다 (Lee Y, et al, J. Biol Chem. 276(8):5629-35 (2001)). 렙틴은 또한 지질합성을 자극하는 인슐린의 능력에도 불구하고 (Kersten, EMBO Reports 2(4): 282-286 (2001), 완전히 이해되지 안은 메카니즘에 의해 인슐린 내성 및 고혈당증을 개선할 수 있다 (Toyoshima et al., Endocrinology 146: 4024-35 (2005)). 인슐린과 Aβ 가 그들의 소거 메카니즘, 즉 인슐린 분해 효소 (IDE) 에 의한 분해를 공유하기 때문에, 렙틴의 생리학적 역할의 이러한 양상은 중요하다.
또한 렙틴은 인슐린 감수성을 조절한다. 중추 신경계 (CNS) 내에서, 렙틴은 혈액-뇌 장벽을 통과하여 음식 섭취, 체중과 에너지 소비를 매개하는 뇌의 특정 수용체에 결합한다. 일반적으로, (i) 렙틴은 체지방에 비례한 수준으로 순환하고; (ii) 렙틴은 혈장 농도에 비례해서 CNS 로 진입하고; (iii) 렙틴 수용체는 에너지 흡수와 소비를 조절하는데 관련된 뇌 뉴런에서 발견되며; (iv) 렙틴은 중기저부 시상하부에 있는 수용체에 작용하여 음식 섭취와 에너지 소비를 조절한다.
일반적으로 렙틴은 뉴로펩티드 Y (neuropeptide Y: NPY) 및 아고우티-관련 펩티드 (agouti-related peptide: AgRP) 를 함유하는 뉴런의 활성을 저해하고, α-멜라닌세포 자극 호르몬 (α-MSH) 을 발현하는 뉴런의 활성을 증가시킨다고 여겨진다. NPY 뉴런은 식욕 조절에 핵심 요소이고; 적은 투여량의 NPY 를 실험용 동물의 뇌에 주입하면 음식섭취를 자극하는 반면, 마우스의 NPY 뉴런을 선택적으로 파괴하면 신경성 식욕 부진증을 야기하게 된다. 반대로, α-MSH은 포만감 조절의 중요한 중개자이고, α-MSH 가 뇌에서 작용하는데 관여하는 수용체에 대한 유전자의 차이가 인간의 비만과 연결되어 있다.
AMP -활성화 단백질 키나아제 ( AMPK )
AMP-활성화 단백질 키나아제 (AMPK) 는 촉매성 서브유닛 α 및 2 개의 조절성 β 및 γ 서브유닛으로 이루어지는 헤테로삼량체성 복합체로서 존재하는 계통발생적으로 보존된 세린/트레오닌 단백질 키나아제이다. AMPK 의 통상적인 세린/트레오닌 활성은 활성화에 그의 인산화가 필요한 트레오닌 잔기 (Thr172) 의 존재 (활성화 루프 내) 를 특징으로 하는, α 서브유닛에 의해 지지된다. 다른 2 개의 β 와 γ 서브유닛과의 연합에 α 서브유닛의 C-말단 영역이 필요하다. β 서브유닛은 α 와 γ 서브유닛의 연합에 필요한 C-말단 영역 및 AMPK 복합체가 글리코겐에 결합하도록 하는 중심 영역을 함유한다. γ 서브유닛은 상호 배타적인 방식으로, AMP 또는 ATP 의 2 개의 분자에 함께 결합하는 시스타티오닌 β-신타아제 ("CBS") 모티프로서 알려진 4 개의 탠덤 반복부분을 함유한다. AMP 의 결합 (γ 서브유닛 상) 은 단백질 키나아제 LKB1 (인간에서의 생식계열 돌연변이가 Peutz-Jeghers 증후군의 원인이 되는 종양 억제자), CaMKKIIβ (칼모둘린-의존성 단백질 키나아제 키나아제 IIβ) 및 잠재적으로 TAK1 (포유류 형질전환 성장 인자 β-활성화 키나아제) 과 같은 업스트림 키나아제에 의한 Thr172 상의 α 서브유닛의 직접적인 알로스테릭 활성화 및 인산화를 포함하는 복합 메카니즘을 통해 AMPK 를 활성화시킨다.
모든 3 개의 서브유닛의 상동은 포유류, 초파리 (드로소필라 멜라노가스테르 (Drosophila melanogaster), 벌레 (카에노르합디티스 엘레간스 (Caenorhabditis elegans)), 효모 (사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae)), 식물 아라비돕시스 탈리아나 ((Arabidopsis thaliana)) 및 원시적 원충 기아르디아 람블리아 (Giardia lamblia) 에서 확인되었고, 높은 보존 정도는 상기 단백질이 대사 항상성에 대한 넓은 스펙트럼의 작용을 조절하는데 백만년 이상 이전 동안 관여하였다는 것을 암시한다. 포유류에서, 상이한 유전자에 의해 코딩되는 각각의 서브유닛 (α1, α2, β1, β2, γ1, γ2, γ3) 의 2 내지 3 개의 이소형이 큰 다양성의 헤테로삼량체성 조합을 산출하는 것으로 알려져 있고, 스플라이싱 변이체 (γ2 및 γ3 유전자의 경우) 가 다양성에 부가된다. 게다가, 촉매성 및 조절성 이소형의 발현 패턴의 조직 분포에 있어서의 차이가 보고되었다.
인간 골격근 내 AMPK 복합체의 이소형 조성에 대한 연구는 12 개의 이론적으로 가능한 AMPK 복합체 중 오직 3 개가 존재하였고 (α2β2γl？α2β2γ3=α1β2γ1), 운동 강도 및 기간에 따라 상이하게 활성화되었다는 것을 발견하였다. 게다가, 각각의 촉매적 이소형의 특이성이 골격근 및 심장 모두에서 그의 우선적인 업스트림 키나아제에 대해 제시되었고; 게다가, LKB1-/- 마우스에서, 심장 내 허혈 및 골격근 내 수축은 AMPKα2 서브유닛을 활성화시킬 수 없었으나, AMPKα1 활성화는 다만 약하게 영향을 받았다. γ3 서브유닛의 발현은 당분해 골격근에 매우 특이적인 것으로 나타난 반면, γ1 및 γ2 는 넓은 조직 분포를 보였다. 골격근에서, β2 서브유닛은 또한 높게 발현되나, β1 서브유닛은 간에서 우세하다. AMPKα1 및 α2-함유 복합체는 각각 간 내 총 AMPK 활성의 약 절반에 해당한다. 지방 조직에서는, α1 촉매성 서브유닛을 함유하는 AMPK 복합체가 주로 발현되는 반면, 골격근 및 심장근에서는, α2 촉매성 서브유닛을 함유하는 AMPK 복합체가 우세하다.
조직 분포에서의 차이 외에, 일반적으로 AMPK 복합체의 분포는 또한 세포내 수준에서 조절된다고 여겨진다. AMPKα2-함유 복합체는 핵 및 세포질 모두에서 발견되었으며; 이것은 조-활성화제 및 전사 인자의 직접적 인산화 가능성을 상승시킨다. 반대로, AMPKα1-함유 복합체는 세포질 내에 우세하게 위치하나, 또한 기도 상피 세포 및 경동맥 체세포 내 원형질 막에서도 관찰되었다. 상이한 AMPK 이소형 조합의 기능적 중요성 뿐 아니라, AMP 및 ATP 에 대한 특정 민감성과 관련된 각각의 헤테로삼량체성 AMPK 복합체의 기능, 세포-하위 위치화 및/또는 특이적 표적은 확실치 않음에도 불구하고, 인간 골격근에서 운동 유도 글루코오스 수송 조절이 α2β2γ3 헤테로삼량체성 복합체 활성화 보다는 α2β1 과 연관되어 있을 것이라고 가정한다. 추가로, 이소형 조합은 또한 AMPK 의 세포-하위 표적화를 결정할 수 있고, 그러므로 기질의 표적화를 결정할 수 있는 것으로 암시된다. 연구를 통해 β1 서브유닛의 번역 후 개질이 AMPK 복합체를 원형질 막으로 표적할 수 있다는 것이 제시되었다. 또한, γ1 서브유닛에 결합하는 것으로 보여진 세포골격 링커 단백질인 플렉틴이 분화된 근육대롱세포 내 AMPK 복합체의 서브유닛 조성에 영향을 주는 것으로 나타났다. 그러므로, 특정 AMPK 복합체의 선택적인 발현은 상이한 대사성 스트레스에 대해 특화된 세포 및 전신성 반응을 결정할 수 있다.
AD 병리생물학에서 렙틴에 의해 촉발되는 대사 경로에 대한 연구가 매우 적고, AD 병리생물학에서의 5-아데노신 모노포스페이트 단백질 키나아제 (AMPK) 의 역할은 불분명하게 남아있다.
본 발명은 NFT 또는 Aβ 의 축적으로부터 유발되는 진행성 인지 기능장애의 치료와 관련된 방법을 제공하고, 또한 렙틴을 이용하는 AD 의 치료 방법 및 치료용 조성물 및 뉴런 세포 내 구별되는 AMPK-의존성 메카니즘을 통한 2 가지 주요 AD 경로의 조절에서의 이의 역할을 제공한다. 렙틴, 및 잠재적으로는 AMPK 활성화제의 상기 이중 방식적 작용은 AD 치료에 대한 신규한 치료 접근법을 제공한다. 현행의 승인된 요법은 질환의 AMPK-관련 양상 중 임의의 것에 표적하는데 실패하였으며, 오직 증상 완화만을 제공한다. 또한, 현행의 연구중인 약물은 겨우, 오직 하나의 AMPK-관련 양상을 해결한다.
발명의 요약
본 발명은 진행성 인지 장애에 대한 임상 요법 조성물 및 방법 및 진단 방법을 제공한다.
하나의 양상에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 진행성 인지 장애의 치료 방법을 제공한다: (a) 하기 (i) 내지 (iii) 을 포함하는 렙틴 조성물을 치료학적 유효량으로 제공하는 단계: (i) 제 1 치료제로서의 렙틴 또는 렙틴 유사체; (ii) 임의로, 하나 이상의 제 2 치료제; 및 (iii) 약학적으로 허용가능한 담체; (b) 단계 (a) 의 조성물을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계; 및 (c) 진행성 인지 장애의 하나 이상의 병리학의 진행을 감소 또는 예방하는 단계. 하나의 구현예에 따르면, 조성물은 Aβ 의 생성을 감소시키고, Aβ 의 섭취를 증가시키고, 또는 tau 단백질의 인산화를 감소시킨다. 또다른 구현예에 따르면, tau 단백질의 인산화 부위는 Ser-202/Thr-205 (AT8 부위), Ser-214, Ser-181, Ser-212 (AT100 부위), Thr-231, Ser-235 (TG3 부위), 및 Ser-396/Ser-404 (PHF-1 부위) 중 하나 이상을 포함한다. 또다른 구현예에 따르면, 진행성 인지 장애는 알츠하이머 질환, 진행성 핵상 마비; 치매; 크로이츠펠트-야콥 (Creutzfeldt-Jakob) 질환, 전두측두 치매, 픽 (Pick) 질환, 파킨슨증-17 피질 기저핵 변성이 있는 전두측두엽 치매, 전두측두엽 변성; 헌팅톤 (Huntington) 질환; 또는 파킨슨 질환이다. 또다른 구현예에 따르면, 진행성 인지 장애는 알츠하이머 질환이다. 또다른 구현예에 따르면, 병리학은 tau 단백질의 인산화; 신경섬유 매듭; APP 의 변형된 단백질 가수분해; 뇌 간질액 내 Aβ42 의 축적; 뇌 간질액 내 Aβ42 의 응집; 뇌 간질액 내 Aβ40 의 축적; Aβ40 의 응집; 염증 반응; 신경증 손상; 뉴런 대사 항상성의 붕괴; 뉴런 이온 항상성의 붕괴; 산화 손상; 변형된 키나아제 활성; 변형된 포스파타아제 활성; 뉴런 기능장애; 뉴런 세포 사멸; 신경전달물질 결핍; 치매; 초로성 디스트로피; 뉴런 세포체의 수축, 및 시냅스 손실 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함한다. 또다른 구현예에 따르면, 임의의 하나 이상의 제 2 치료제는 항생제, 항진균제, 키나아제 저해제 항바이러스제, 항원충제, 스테로이드성 항염증제, 항산화제, 호르몬, 비타민, 항히스타민제, 및 화학요법제로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 또다른 구현예에 따르면, 임의의 제 2 치료제는 하나 이상의 키나아제 저해제이다. 또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 칼슘/칼모둘린-의존성 단백질 키나아제 II 의 키나아제 저해제; 단백질 키나아제 A 의 키나아제 저해제; GSK-3β 의 키나아제 저해제; cAMP-의존성 단백질 키나아제의 키나아제 저해제; 5-아데노신 모노포스페이트 단백질 키나아제의 키나아제 저해제; Myr-AIP, LiCl KT5720, 6-브로모인디루빈-3'-옥심 ((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심); KT5720; K252a; 스타우로스포린; KT5252b; 켈레리트린; 및 TDZD-8 (4-벤질-2-메틸-1,2,4-티아디아졸리딘-3,5-디온-8) 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 또다른 구현예에 따르면, 조성물은 조성물 성분 (i), (ii), 및 (iii) 의 합을 초과하는 수준으로 키나아제 저해를 제공한다. 또다른 구현예에 따르면, 렙틴 조성물 내 렙틴 또는 렙틴 유사체의 치료학적 유효량은 약 0.0001 mg/kg 체중 내지 약 100 g/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 조성물은 하나 이상의 인지 기능을 향상시킨다. 또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 인지 기능은 기억력이다. 또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 인지 기능은 학습력이다.
또다른 양상에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에서의 인지 기능 회복력의 개선 방법을 제공한다: (a) 하기 (i) 내지 (iii) 을 포함하는 렙틴 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계: (i) 제 1 치료제로서의 렙틴 또는 렙틴 유사체의 인지 기능을 향상시키는 양; (ii) 임의로, 하나 이상의 제 2 치료제; 및 (iii) 약학적으로 허용가능한 담체; 조성물은 Aβ 생성을 감소시키고, Aβ 의 섭취를 증가시키고, 또는 인산화된 tau 의 수준을 감소시킴; 및 (b) 대상에서 인지 기능 회복력을 개선시키는 단계. 하나의 구현예에 따르면, 인산화된 tau 의 세린/트레오닌 인산화 부위는 Ser-202/Thr-205 (AT8 부위), Ser-214, Ser-181, Ser-212 (AT100 부위), Thr-231, Ser-235 (TG3 부위), 및 Ser-396/Ser-404 (PHF-1 부위) 중 하나 이상을 포함한다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능은 기억력이다. 또다른 구현예에 따르면, 기억력은 조건 기억력이다. 또다른 구현예에 따르면, 기억력은 맥락 기억력이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능은 기억력 유지이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능은 학습력이다. 또다른 구현예에 따르면, 학습력은 맥락 학습력이다. 또다른 구현예에 따르면, 학습력은 조건 학습력이다. 또다른 구현예에 따르면, 임의의 제 2 치료제는 항생제, 항진균제, 키나아제 저해제 항바이러스제, 항원충제, 스테로이드성 항염증제, 항산화제, 호르몬, 비타민, 항히스타민제, 및 화학요법제로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 또다른 구현예에 따르면, 임의의 제 2 치료제는 하나 이상의 키나아제 저해제이다. 또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 칼슘/칼모둘린-의존성 단백질 키나아제 II 의 키나아제 저해제; 단백질 키나아제 A 의 키나아제 저해제; GSK-3β 의 키나아제 저해제; cAMP-의존성 단백질 키나아제의 키나아제 저해제; 5-아데노신 모노포스페이트 단백질 키나아제의 키나아제 저해제; Myr-AIP, LiCl KT5720, 6-브로모인디루빈-3'-옥심 ((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심); KT5720; K252a; 스타우로스포린; KT5252b; 켈레리트린; 및 TDZD-8 (4-벤질-2-메틸-1,2,4-티아디아졸리딘-3,5-디온-8) 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 또다른 구현예에 따르면, 조성물은 조성물 성분 (i), (ii), 및 (iii) 의 합을 초과하는 수준으로 키나아제 저해를 제공한다. 또다른 구현예에 따르면, 렙틴 조성물 내 렙틴 또는 렙틴 유사체의 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.0001 mg/kg 체중 내지 약 100 g/kg 체중이다.
또다른 양상에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, Aβ 의 축적, tau 단백질의 인산화, 또는 신경섬유 매듭의 축적 중 하나 이상으로부터 기인하는 진행성 인지 기능장애 질환 또는 장애의 치료를 위한 유효한 치료제의 확인 방법을 제공한다: (a) 뉴런 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계, (b) 뉴런 세포를 포함하는 세포 배양물을 추정적 치료제와 접촉시키는 단계, (c) 추정적 치료제가 단백질 키나아제의 활성에 영향을 주는 식으로 추정적 치료제가 단백질 키나아제 단백질의 활성 부분과 관련이 있는지를 결정하는 단계; 및 (d) 추정적 치료제를 진행성 인지 기능장애 질환 또는 장애의 치료를 위한 유효한 치료제로서 확인하는 단계. 하나의 구현예에 따르면, 단백질 키나아제는 5-아데노신 모노포스페이트 단백질 키나아제 또는 GSK-3β 이다. 또다른 구현예에 따르면, 추정적 치료제 또는 유효한 치료제는 재조합 단백질이다. 또다른 구현예에 따르면, 추정적 치료제 또는 유효한 치료제는 저해제이다. 또다른 구현예에 따르면, 추정적 치료제 또는 유효한 치료제는 길항제이다. 또다른 구현예에 따르면, 추정적 치료제 또는 유효한 치료제는 아고니스트이다. 또다른 구현예에 따르면, 추정적 치료제 또는 유효한 치료제는 항체이다. 또다른 구현예에 따르면, 추정적 치료제 또는 유효한 치료제는 렙틴 또는 렙틴 유사체가 단백질 키나아제와 연합되는 것을 방해한다. 또다른 구현예에 따르면, 결정 단계 (c) 는 대조군에 비한, 뉴런 세포에 의한 아밀로이드-베타의 분비를 측정하는 것을 포함한다. 또다른 구현예에 따르면, 대조군에 비한, 뉴런 세포에 의한 아밀로이드-베타의 분비를 측정하는 것은 ELISA 또는 면역블롯에 의해서 이루어진다. 또다른 구현예에 따르면, 본 방법은 아밀로이드 베타 병리학의 치료를 위해 유효한 치료제를 사용하는 단계를 추가로 포함한다. 또다른 구현예에 따르면, 아밀로이드 베타 병리학은 tau 단백질의 인산화; 신경섬유 매듭; APP 의 변형된 단백질 가수분해; 뇌 간질액 내 Aβ42 의 축적; 뇌 간질액 내 Aβ42 의 응집; 뇌 간질액 내 Aβ42 의 축적; Aβ40 의 응집; 염증 반응; 신경증 손상; 뉴런 대사 항상성의 붕괴; 뉴런 이온 항상성의 붕괴; 산화 손상; 변형된 키나아제 활성; 변형된 포스파타아제 활성; 뉴런 기능장애; 뉴런 세포 사멸; 신경전달물질 결핍; 치매; 초로성 디스트로피; 뉴런 세포체의 수축, 및 시냅스 손실 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함한다. 또다른 구현예에 따르면, the 유효한 치료제는 하나 이상의 인지 기능을 개선시킨다. 또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 인지 기능은 기억력이다. 또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 인지 기능은 학습력이다.
도 1 은 CRND8 및 야생형 마우스에서의 렙틴, 인슐린 및 CRP 의 혈청 농도를 나타낸다. (A) 렙틴, (B) 인슐린 및 (C) CRP 의 순환 수준을 ELISA 에 의해 렙틴- 또는 식염수-처리된 CRND8 또는 야생형 ("wt") 마우스로부터의 혈청에서 평가하였다. 결과 (n=6) 는 평균 농도 (ng/ml 또는 pg/ml)±SD 로서 제시한다. * 대 식염수-처리된 CRND8.
도 2 는 CRND8 및 야생형 마우스 뇌에서의 렙틴, 렙틴 수용체 (OB-R) 및 다운스트림 신호 표적의 발현을 나타낸다. A. 렙틴- 또는 식염수-처리된 CRND8 또는 야생형 마우스로부터의 뇌를 수확하고, (B) 렙틴, (C) 렙틴 수용체 및 (D, E) 다운스트림 신호 표적 (SOCS3, PPARγ) 의 발현을 면역블롯에 의해 측정하였다.
도 3 은 CRND8 및 야생형 마우스에서의 APP C-말단 조각 (CTF) 및 가용성 Aβ1- 40 의 발현을 나타낸다. A. 렙틴- 또는 식염수-처리된 CRND8 또는 야생형 마우스로부터의 뇌를 수확하고, APP CTF (C99, C83) 의 발현을 면역블롯에 의해 측정하였다. B. 표준화된 밴드 (C99/C83 및 총 CTFs/α-튜불린의 비) 를 밀도계측에 의해 분석하고 평균 밀도 ± SD 로서 제시한다. C. 렙틴- 또는 식염수-처리된 CRND8 또는 야생형 마우스의 뇌 또는 (D) 혈청에 존재하는 가용성 Aβ1- 40 의 수준을 ELISA 에 의해 측정하였다.
도 4 는 렙틴-처리된 TgCRND8 마우스에서의 아밀로이드 플라크 침전을 보여준다. A. 뇌 슬라이스를 해마 영역에서 4G8 항체로 염색하였다; Le - 렙틴으로 처리된 트랜스제닉 동물; Sa - 식염수로 처리된 트랜스제닉 동물. B. 막대는 플라크의 평균 크기 (㎛m2) ± S.E.M. 또는 (C) 영역 내 염색된 % 면적 ± S.E.M. 을 나타낸다; 막대 당 n=8-9. D. 4G8 항체로 염색된 피질 영역.
도 5 는 TgCRND8 및 야생형 마우스 뇌에서의 AD-관련 tau 인산화를 나타낸다. A. 렙틴- 또는 식염수-처리된 CRND8 또는 야생형 마우스로부터의 뇌를 수확하고, (B) Ser396, (C) PHF-1 (Ser396 /404), (D) AT8 (Ser202 /204) 및 (E) Ser181 에서의 tau 인산화를 면역블롯에 의해 측정하였다.
도 6 은 CRND8 및 야생형 마우스의 인지 평가를 나타낸다. A. 물체 인식 시험, B. 공포 조건화 시험. Context: WT 대 Tg+Lep 의 경우 *p=0.009; WT 대 Tg+Sal 의 경우 *p=0.0001; Cued: WT 대 Tg+Lep 의 경우 *p=0.012; WT 대 Tg+Sal 의 경우 *p=0.0001; Tg+Lep 대 Tg+sal 의 경우 *p=0.04.
도 7 은 RA-SY5Y 에서의 tau 인산화의 효소적 조절을 보여준다.
도 8 은 RA-SY5Y 에서의 tau-특이적 키나아제 활성화에 대한 렙틴 및 AICAR 의 효과를 보여준다. RA-SY5Y 를 렙틴 (1600 ng/ml), AICAR (2 mM) 로 처리하거나 미처리 (비히클) 하고, (A) CaMKII (pThr286), (B) PKA (pThr197) 및 (C) GSK-3β (pSer9) 의 인산화를 면역블롯에 의해 측정하였다.
도 9 는 렙틴 및 AICAR 이 GSK-3β-의존적 메카니즘을 통해 tau 인산화를 조절하는 것을 보여준다. (A) RA-SY5Y 를 GSK-3β-특이적 siRNA 로 일시적으로 트랜스펙션시키거나, 비-트랜스펙션시키고 (레인 1), 비-트렌스펙션된 것을 렙틴 (1600 ng/ml - 레인 4), AICAR (2 mM - 레인 5) 으로 처리하거나 미처리 (비히클 - 레인 3) 하였다. 플루오레세인-공액 대조군 siRNA 로 트랜스펙션된 세포 (레인 2) 를 사용하여 트랜스펙션 효율을 평가하고 음성 대조군으로서 사용하였다. 전-세포 용해물을 조제하고, GSK-3β-특이적 (패널 I) 또는 인산화된 tau-특이적 항체 (pSer396, PHF-1, AT8 또는 pSer181; 패널 II) 로의 면역블롯에 의해 분석하였다. 멤브레인을 스트리핑하고, 표준화를 위해 총 GSK-3β (패널 I) 또는 총 tau (패널 II) 항체로 재-탐침하였다. (B) RA-SY5Y 를 GSK-3β 전장 cDNA 발현 벡터로 일시적으로 트랜스펙션시키거나, 비-트랜스펙션시키고 (레인 1), 비-트렌스펙션된 것을 렙틴 (1600 ng/ml - 레인 4), AICAR (2 mM - 레인 5) 으로 처리하거나 미처리 (비히클 - 레인 3) 하였다. 빈 발현 벡터로 트랜스펙션시킨 세포 (레인 2) 를 음성 대조군으로서 사용하였다. 전-세포 용해물을 조제하고, 분석하고, A 에서와 같이 표준화하였다. * 대 음성 대조군 (레인 2); ** 대 비히클로 처리된 GSK-3β-과발현 세포 (레인 3).
도 10 은 다른 뉴런 모델에서의 렙틴 및 AICAR 의 효과를 보여준다. (A) 인간 IMR-32 세포; (B) 래트 초대 피질 뉴런; (C) IMR-32 세포를 렙틴 (1600 ng/ml), AICAR (2 mM) 로 처리하거나, 미처리 (비히클) 하였다. 전-세포 용해물을 조제하고, 인산화된 tau-특이적 항체 (pSer396, PHF-1, AT8 또는 pSer181) 로의 면역블롯에 의해 분석하였다. IMR-32 세포 (C) 를 (A) 에서와 같이 처리하고, GSK-3β 의 인산화 (Ser9) 를 면역블롯에 의해 측정하였다. * 대 미처리 (비히클).
도 11 은 렙틴 및 AICAR 이 중복 신호 경로를 통해 tau 인산화를 조절하는 것을 보여준다. (A) RASY5Y 를 렙틴 (1600 ng/ml - 레인 3-7) 의 존재하에서, 또는 미처리 (비히클 - 레인 1) 하에서 렙틴 신호 (STAT3, AMPK, PI3K, Akt, p38) 의 공지된 다운스트림 효과기에 대한 저해제로 인큐베이션하였다. 렙틴 단독으로 처리된 세포를 양성 대조군으로서 사용하였다 (레인 2). 전-세포 용해물을 조제하고, 인산화된 tau-특이적 항체 (pSer396, PHF-1, AT8 또는 pSer181) 로의 면역블롯에 의해 분석하였다. (B) (A) 로부터의 전-세포 용해물을, 렙틴 단독 (STAT3, 포스포티딜-이노시톨-3 키나아제 (PBK)) 과 비교하여 tau 인산화를 유의하게 변형시키지 않았던 것을 제외하고는, 인산화된 GSK-3P-특이적 항체로의 면역블롯에 의해 분석하였다. (C) 세포를 렙틴, AICAR 로 처리하거나, 또는 미처리하고 (비히클), tau 인산화 조절에 연루되어 있는 신호 분자 (Jak2, AMPK, p38, Akt) 의 활성화를 인산화-특이적 항체를 사용하는 면역블롯에 의해 시험하였다. 멤브레인을 스트리핑하고, 표준화를 위해 a-튜불린 항체로 재-탐침하였다. * 대 미처리 (비히클 - 레인 1); ** 렙틴 단독 (레인 2)
도 12 는 렙틴 및 AICAR 이 중복 신호 경로를 통해 AP 생성을 조절하는 것을 보여준다. (A) RA-SY5Y 에 렙틴 (1600 ng/ml - 레인 2), AICAR (2 mM - 레인 6) 및/또는 하기 신호 단백질 -AMPK (레인 3 및 7), PPARy (레인 4 및 8) 또는 p38 (레인 5 및 9) 각각에 대한 저해제를 6 시간 동안 처리하였다. 미처리된 (비히클 - 레인 1) 세포 또는 저해제 단독으로 처리된 세포 (레인 10-12) 를 대조군으로서 사용하였다. 배양 배지를 수집하고, ELISA 에 의해 AP(1 -40) 에 대해 어세이하였다. (B) RA-SY5Y 를 렙틴, AICAR (2 mM) 로 처리하거나 미처리 (비히클) 하고, PPARy 의 수준을 면역블롯에 의해 측정하였다. 멤브레인을 스트리핑하고, 표준화를 위해 a-튜불린 항체로 재-탐침하였다. * 대 미처리 (비히클 - 레인 1); ** 대 렙틴 단독 (레인 2); # 대 AICAR 단독 (레인 6)
도 13 은 AMPK 의 렙틴 및 AICAR 신호 경로 다운스트림이 tau 인산화 및 Aβ 생성 모두를 매개하지 않는다는 것을 보여준다. (A) RA-SY5Y 를 렙틴 (1600 ng/ml) 단독으로 또는 Akt 저해제 (1L6HCI) 의 존재하에서 6 시간 동안 처리하였다. 미처리된 (비히클) 세포를 대조군으로서 사용하였다. 배양 배지를 수집하고, ELISA 에 의해 AP(1-40) 에 대해 어세이하였다. (B) RA-SY5Y 를 렙틴 (1600 ng/ml) 단독으로 또는 PPARy 저해제 (G3335) 의 존재하에서 6 시간 동안 처리하였다. 미처리된 (비히클) 세포를 대조군으로서 사용하였다. 전-세포 용해물을 조제하고, 인산화된 tau-특이적 항체 (pSer396, PHF-1, AT8 또는 pSer181) 로의 면역블롯에 의해 분석하였다. (C) RA-SY5Y 에서 렙틴 및 AICAR 에 의해 활성화된 신호 경로를 나타내는 개략도. 렙틴 또는 AICAR 에 의한 AMPK 의 활성화는 AP 생성 및 tau 인산화를 모두 감소시킨다. 그러나, AMPK 의 신호 경로 다운스트림은 tau- 또는 AP-특이적 효과를 매개하기 위해 독립적으로 작용한다; * 대 미처리 (비히클)
도 14 는 복합적 키나아제 저해에 의한 tau 의 감소된 인산화를 보여준다. RASY5Y 세포를 CaMKII, PKA 또는 GSK-3P 저해제 단독으로, 또는 다양한 조합으로 1 시간 동안 인큐베이션하거나, 미처리 (비히클) 하고, tau 의 인산화를 측정하였다. 전-세포 용해물을 조제하고, 인산화된 tau-특이적 항체 (pSer396) 로의 면역블롯에 의해 분석하였다. * 대 미처리 (비히클); ** 대 임의의 개별적 키나아제 저해제로의 처리
도 15 는 렙틴 및 AICAR 이 리튬으로 인큐베이션된 RA-SY5Y 세포에서 tau 인산화를 유의하게 감소시키지 않는다는 것을 보여준다. RA-SY5Y 를 렙틴 (1600 ng/ml), AICAR (2 mM) 의 존재하에서 또는 부가적인 처리를 하지 않은 (비히클) 채로 리튬 (10 mM) 으로, 또는 리튬 없이 인큐베이션하고, tau 의 인산화를 측정하였다.
도 16 은 효소의 억제 방식을 평가하기 위한 모델로부터의 예증적 데이터의 그래프를 나타낸다.
상세한 설명
용어 해설
본원에서 사용되는 바와 같은 "활성 부분" 이라는 용어는 펩티드 또는 단백질의 기능을 가능하게 하는 펩티드 또는 단백질의 영역을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "투여하는" 이라는 용어는 복용토록 하거나 배분하는 것을 말하며, 생체 내 투여 뿐 아니라 신체 외 조직 내로의 직접적인 투여도 포함된다. 일반적으로, 조성물은 바람직한 통상적으로 무독성인 약학적으로 허용가능한 담체, 항원보강제, 및 비히클을 함유하는 투여량 단위 제형으로 경구, 구강, 비경구, 국소, 흡입 또는 흡입제에 의해 (즉, 입을 통해 또는 코를 통해), 또는 직장으로 전신적으로 투여될 수 있거나, 주사, 주입, 이식, 국소 적용 또는 비경구와 적은 그러나 이에 제한되지 않는 수단에 의해 국부적으로 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 다양한 문법적 형태의 "~에 영향을 주는" 이라는 용어는 영향을 갖거나 제공하는 것, 물질적 영향 또는 변화를 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "아고니스트" 라는 용어는 완전한 또는 부분적인 약리적 반응을 유도하기 위해 수용체를 활성화시킬 수 있는 화학적 성분을 말한다. 수용체는 내생 또는 외생 아고니스트 및 길항제에 의해 활성화되거나 비활성화되어, 생물학적 반응을 자극 또는 억제할 수 있다. 생리학적 아고니스트는 동일한 신체적 반응을 발생시키나, 동일한 수용체에 결합하지 않는 성분이다. 특정 수용체에 대한 내생 아고니스트는 수용체에 결합하고 이를 활성화시키는 신체에 의해 자연적으로 생성되는 화합물이다. 슈퍼아고니스트는 표적 수용체에 대한 내생 아고니스트보다 더 큰 최대 반응을 생성할 수 있어, 100% 초과의 효율을 갖는 화합물이다. 이것은 내생 아고니스트보다 더욱 강력하나, 오히려 수용체 결합 후 세포 내부에서 생성될 수 있는 최대 가능한 반응의 비교인 것을 반드시 의미하는 것은 아니다. 완전한 아고니스트는 수용체에 결합하고 이를 활성화시켜, 수용체에서 완전한 효율을 나타낸다. 부분적인 아고니스트도 또한 제시된 수용체에 결합하고 이를 활성화시키나, 완전한 아고니스트에 비해 수용체에서 오직 부분적인 효과만을 갖는다. 역 아고니스트는 수용체 및 수용체의 역 구성 활성에 대해 아고니스트와 동일한 수용체 결합-부위에 결합하는 작용제이다. 역 아고니스트는 수용체 아고니스트의 반대 약리적 효과를 발휘한다. 비가역적 아고니스트는 수용체가 영구적으로 활성화되는 방식으로 수용체에 영구적으로 결합하는 아고니스트의 유형이다. 이것은, 수용체에 대한 아고니스트의 회합은 가역적인 반면 수용체에 대한 비가역적 아고니스트의 결합은 비가역적인 것으로 여겨져서 단순한 아고니스트와 구별된다. 이것은 화합물로 하여금 아고니스트 활성의 짧은 폭발 후, 수용체의 탈감각 및 내재화를 일으키게 하며, 이것은 장기간 처리로 길항제와 더욱 유사한 효과를 산출한다. 선택적 아고니스트는 하나의 특정 유형의 수용체에 특이적이다.
"알로스테릭" 이라는 용어는 효과기의 결합시 형태 변화를 말한다. "알로스테릭 조절" 이라는 용어는 효소 또는 단백질의 알로스테릭 부위에 효과기 분자 결합에 의한 효소 또는 기타 단백질의 조절을 말한다. 알로스테릭 단백질의 조절 부위는 일반적으로 그의 활성 부위와는 물리적으로 구별된다. 단백질의 활성을 향상시키는 효과기는 "알로스테릭 활성화제" 라고 부르는 반면, 단백질의 활성을 감소시키는 효과기는 "알로스테릭 저해제" 라고 부른다. 그러므로, "알로스테릭 활성화" 는 하나의 리간드의 결합이 기질 분자와 다른 결합 부위 사이의 끌어당김을 향상시키는 경우 발생하고; "알로스테릭 저해" 는 하나의 리간드의 결합이 다른 활성 부위에서 기질에 대한 친화성을 감소시키는 경우 발생한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "알로스테릭 조절" 이라는 용어는 내생 리간드 (오르토스테릭 리간드) 의 결합 부위와는 상이한 조절 부위에서 알로스테릭 조절자의 결합에 의해 수용체가 조절되고, 변경되고, 채택되거나 조정됨으로써 (조절됨으로써) 내생 리간드의 효과를 향상시키거나 저해시키는 과정을 말한다. 알로스테릭 조절제는 수용체 분자 내 형태 변화를 야기함으로써 정상적으로 작용하고, 이는 리간드의 결합 친화성을 리간드의 결합 친화성 변화를 야기한다. 그러므로, 알로스테릭 리간드는 일차 "리간드" 에 의해 수용체의 활성화를 "조절하고", 수용체의 활성화의 강도를 조정할 수 있다. 많은 알로스테릭 효소는 그들의 기질에 의해 조절되고, 이러한 기질은 "동형자극성 알로스테릭 조절자" 로서 고려된다. 비-기질 조절 분자는 "이형자극성 알로스테릭 조절자" 로 불린다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "개선하다" 라는 용어는 더욱 양호하게 만들거나 더욱 양호하게 되거나 또는 향상시키는 것을 의미한다.
"아밀로이드 펩티드" "아밀로이드 β 펩티드" 및 "Aβ" 라는 용어는 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 의 단백질 가수분해 처리과정을 통해 발생되는 펩티드의 계열을 말하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "길항제" 라는 용어는 또다른 성분의 효과에 반대작용을 하는 성분을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "부착 의존성 (부착된) 세포" 라는 구는 기층이 나뉘는 것을 필요로 하여 단층을 생성하는 세포를 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "항생제" 라는 용어는 감염 질환의 치료에 주로 사용되는, 박테리아 및 다른 미생물의 성장을 억제하거나 이들을 파괴하는 능력을 가진 화학물질의 그룹 중 임의의 것을 의미한다. 항생제의 예에는, 페니실린 G; 메티칠린; 나프실린; 옥사실린; 클록사실린; 디클록사실린; 암피실린; 아목시실린; 티카르실린; 카르베니실린; 메즈로실린; 아즈로실린; 피페라실린; 이미페넴; 아즈트레오남; 세팔로틴; 세파클로르; 세폭시틴; 세퓨록심; 세포니시드; 세프메타졸; 세포테탄; 세프프로질; 로라카르베프; 세페타메트; 세포페라존; 세포탁심; 세프티족심; 세프트리악손; 세프타지다임; 세페파임; 세픽사임; 세프포독사임; 세프술로딘; 프레록사신; 나리딕식 산; 노르플록사신; 시프로플록사신; 오플록사신; 에녹사신; 로메플록사신; 시녹사신; 독시사이클린; 미노사이클린; 테트라사이클린; 아미카신; 젠타마이신; 카나마이신; 네틸마이신; 토브라마이신; 스트렙토마이신; 아지트로마이신; 클라리트로마이신; 에리스로마이신; 에리스로마이신 에스톨레이트; 에리스로마이신 에틸 숙시네이트; 에리스로마이신 글루코헵토네이트; 에리스로마이신 락토바이오네이트; 에리스로마이신 스테아레이트, 반코마이신, 테이코플라닌; 클로람페니콜; 클린다마이신; 트리메토프림; 술파메톡사졸; 니트로퓨란토인; 리팜핀; 뮤피로신; 메트로니다졸; 세파렉신; 록시스로마이신; 코-아목시클래뷰아네이트; 피페라실린과 타조박탐의 조합물; 및 이들의 다양한 염, 산, 염기, 및 다른 유도체가 포함되나 이에 한정되지는 않는다. 항-박테리아성 항생제에는 페니실린, 세팔로스포린, 카바세펨, 세파마이신, 카바페넴, 모노박탐, 아미노글라이코사이드, 글라이코펩타이드, 퀴놀론, 테트라사이클린, 매크롤라이드, 및 플루오로퀴놀론이 포함되나 이에 한정되지는 않는다.
항체는 혈청 단백질로서, 이 분자는 표적 상의 적은 화학적 그룹에 상보적인 그의 표면의 적은 영역을 소유하고 있다. 항체 분자 당 2 개 이상, 일부 유형의 항체 분자에서는 10 개, 8 개 또는 일부 종에서는 12 개 정도로 존재하는 상기 상보성 영역 (항체 조합 부위 또는 항원 결합 부위로서 불림) 은 다원자가 항원의 여러 개의 분자에 함께 연결되는 항원 (항원 결정소 또는 에피토프) 상의 상응하는 상보적 영역과 반응하여 격자형태를 형성할 수 있다.
전체 항체 분자의 기본적 구조 단위는 4 개의 폴리펩티드 사슬, 2 개의 동일한 경쇄 (L) (각각 약 220 개의 아미노산을 함유함) 및 2 개의 동일한 중쇄 (H) (각각 통상 약 440 개의 아미노산을 함유함) 로 이루어진다. 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄는 비공유 및 공유 (디술피드) 결합의 조합에 의해 함께 묶여있다. 분자는 2 개의 동일한 절반으로 구성되며, 각각 경쇄의 N-말단 영역 및 중쇄의 N-말단 영역으로 구성되는 동일한 항원-결합 부위로 구성된다. 두 경쇄 및 중쇄는 통상적으로 협력하여 항원 결합 표면을 형성한다.
인간 항체 2 종류의 경쇄, K 및 λ 를 보이며; 면역글로불린의 개별적인 분자는 일반적으로 오직 하나 또는 다른 것이다. 정상 혈청에서, 60% 의 분자가 K 결정소 및 30% λ 를 갖는 것으로 발견되었다. 많은 다른 종은 2 종류의 경쇄를 갖는 것으로 발견되었으나, 그 비율은 다양하다. 예를 들어, 마우스 및 래트에서, λ 사슬은 그러나 전체의 어느 정도 % 를 포함하며; 개 및 고양이에서는, K 사슬은 매우 적으며; 말은 임의의 K 사슬을 갖는 것으로 보이지 않으며; 래트는 균주 및 b-좌 동종이형에 따라 5 내지 40% λ 를 가질 수 있으며; 및 닭 경쇄는 K 보다 λ 와 더욱 상동이다.
포유류에서는, 5 가지 계열의 항체, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 이 있으며, 각각은 그 스스로의 계열의 중쇄 - α (IgA 의 경우), δ (IgD 의 경우), ε (IgE 의 경우), γ (IgG 의 경우) 및 μ (for IgM 의 경우) 를 가진다. 또한, γ1, γ2, γ3, 및 γ4 중쇄를 각각 갖는 4 가지 하위계열의 IgG 면역글로불린 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 이 있다. 이의 분비된 형태에서, IgM 은 5 개의 4 개-사슬 단위로 구성된 5 량체이고, 총 10 개의 항원 결합 부위를 제공한다. 각각의 5 량체는 2 개의 인접한 꼬리 영역 사이에 공유결합으로 삽입된 J 사슬의 1 개 카피를 함유한다.
모든 5 개의 면역글로불린 계열은 다른 혈청 단백질과, 이들이 광범위한 전기영동 이동성을 보이고 상동이 아닌 식으로 상이하다. 상기 이질성 (개개의 IgG 분자는 예를 들어, 순 전하가 서로 상이함) 은 면역글로불린의 고유의 특성이다.
항원 결정소 또는 에피토프는 분자 상의 항원 부위이다. 순차적인 항원 결정소/에피토프는 본질적으로 선형 사슬이다. 나선형 중합체 또는 단백질과 같은 정렬된 구조에서, 항원 결정소/에피토프는 본질적으로 서로 가까워질 수 있는 분자의 일부와 상이한 아미노산 측쇄를 수반하는 구조의 표면 내 또는 표면 상의 제한된 영역 또는 패치일 것이다. 이들은 형태학적 결정소이다.
자물쇠 내 열쇠의 맞춤과 종종 비교되는 상보성 원리에는 비교적 약한 결합력 (소수성 및 수소 결합, 반 데르 발스력 및 이온 상호작용) 이 관여하고, 이것은 2 개의 반응 분자가 서로 매우 가깝게 전급할 수 있는 경우, 게다가 매우 가까워서 하나의 분자의 돌출 구성 원자 또는 원자 군이 나머지의 상보적 오목부 또는 우묵한 곳 내에 맞추어질 수 있는 경우에만 효과적으로 작용할 수 있다. 항원-항체 상호작용은 높은 정도의 특이성을 보이며, 이것은 많은 수준에서 명백하다. 분자적 수준으로 내려가보면, 특이성은 항원에 대한 항체의 조합 부위가 미관련 항원의 항원 결정소와 상보적으로 전혀 유사하지 않다는 것을 의미한다. 2 개의 상이한 항원의 항원 결정소가 일부 구조적 유사성을 가질 때마다, 다른 것에 대한 일부 항체의 조합 부위 내로의 하나의 결정소의 어느 정도의 맞추어짐이 일어날 수 있고, 상기 현상은 교차 반응을 일으킨다. 교차 반응은 항원-항체 반응의 상보성 또는 특이성을 이해하는데 주요한 중요성을 갖는다. 면역학적 특이성 또는 상보성은 항원 사이의 소량의 불순물/오염물의 검출을 가능하게 한다.
모노클론 항체 (mAb) 는 선별 배지에서 성장하는 성립된 마우스 하이브리도마 클론을 산출하기 위해 마우스 골수종 세포와 면역화된 증여자로부터의 마우스 비장 세포를 융합시켜 생성될 수 있다. 하이브리도마 세포는 항체-분비 B 세포와 골수종 세포의 시험관 내 융합으로부터 산출된 불멸화 잡종 세포이다. 배양 내 항원-특이적 B 세포의 일차 활성화라고 불리는 시험관 내 면역화는 마우스 모노클론 항체의 제조를 위한 또다른 잘 성립된 방식이다.
말초 혈액 림프쿠로부터의 면역글로불린 중쇄 (VH) 및 경쇄 (Vκ 및 Vλ) 가변 유전자의 다양한 라이브러리는 또한 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 의해 증폭될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 폴리펩티드 스페이서 (단쇄 Fv 또는 scFv) 에 의해 연결된 단일 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 유전자는 PCR 을 사용하여 중쇄 및 경쇄 V-유전자를 램덤으로 조합하여 제조될 수 있다. 그 다음 조합적 라이브러리는 파지의 팁에서 부차적 코팅 단백질에 대한 융합에 의해 필라멘트성 박테리오파지의 표면 상에서 전시를 위해 클로닝될 수 있다.
지침된 선별 기술은 설치류 면역글로불린 V 유전자로의 인간 면역글로불린 V 유전자 셔플링에 근거한다. 방법은 entails (i) 관심의 항원과 반응성인 마우스 모노클론 항체의 중쇄 가변 영역 (VH) 도메인으로 인간 λ 경쇄의 레파토리를 셔플링함; (ii) 항원 상의 절반-인간 Fab 를 선별함; (iii) 선별된 λ 경쇄 유전자를 인간 경쇄 유전자를 갖는 클론 Fab 조각을 단리하기 위한 제 2 셔플링에서 인간 중쇄의 라이브러리에 대한 "도킹 도메인" 으로서 사용함; (v) 유전자를 함유하는 포유류 세포 발현 벡터로의 전기천공에 의해 마우스 골수종 세포를 트랜스펙션함; 및 (vi) 마우스 골수종에서 λ 항체 분자인 완전한 IgG1 로서 항원과 반응성인 Fab 의 V 유전자를 발현시킴.
"항원" 이라는 용어 및 이의 다양한 문법학적 형태는 항체의 생성을 자극할 수 있고, 이들과 특이적으로 조합될 수 있는 임의의 성분을 말한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "항원 결정소" 또는 "에피토프" 라는 용어는 분자 상의 항원 부위를 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "항진균제" 라는 용어는 균류의 성장을 억제하거나 이들을 파괴하는 능력을 가진 화학물질 그룹 중 임의의 것을 의미한다. 항진균제에는 암포테리신 B, 칸디시딘, 더모스타틴, 필리핀, 펑지크로민, 하치마이신, 하마이신, 루센소마이신, 메파트리신, 나타마이신, 니스타틴, 페실로신, 페리마이신, 아자세린, 그리세오풀빈, 올리고마이신, 네오마이신, 피롤니트린, 시카닌, 투베르시딘, 비리딘, 부테나핀, 나프티핀, 테르비나핀, 비포나졸, 부토코나졸, 클로단토인, 클로미다졸, 클로코나졸, 클로트리마졸, 에코나졸, 에닐코나졸, 펜티코나졸, 플루트리마졸, 이소코나졸, 케토코나졸, 라노코나졸, 미코나졸, 오모코나졸, 옥시코나졸, 세르타코나졸, 술코나졸, 티오코나졸, 톨시클레이트, 톨린데이트, 톨나프테이트, 플루코나울, 이트라코나졸, 사페르코나졸, 테르코나졸, 아크리소르신, 아모롤파인, 비페나민, 브로모살리실클로라닐라이드, 부클로사마이드, 칼슘 프로피오네이트, 클로페네신, 사이클로피록스, 클록시퀸, 코파라피네이트, 다이암테졸, 엑살라마이드, 플루사이토신, 할레타졸, 헥세티딘, 로플루카반, 니푸라텔, 요오드화칼륨, 프로피온산, 피리티온, 살리실아닐라이드, 나트륨 프로피오네이트, 술벤틴, 테노나이트로졸, 트리아세틴, 유조티온, 운데실렌산, 및 아연 프로피오네이트가 포함되나 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "항히스타민제" 라는 용어는 체내 히스타민에 대항하고 알러지 반응 (예컨대, 건초열) 및 감기 증상을 치료하는데 사용되는 임의의 다양한 화합물을 말한다. 본 발명의 문맥에서 사용 가능한 항히스타민제의 비-제한적인 예에는 클로르페니라민, 브롬페니라민, 덱스클로르페니라민, 트리폴리딘, 클레마스틴, 디펜히드라민, 프로메타진, 피페라진, 피페리딘, 아스테미졸, 로라타딘, 및 테르페나딘이 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "항산화제" 라는 용어는 산화 또는 산소 또는 과산화수소에 의해 촉진되는 반응을 억제하는 물질을 말한다. 본 발명의 문맥에서 사용가능한 항산화제의 비-제한적인 예에는 아스코르브산 (비타민 C) 및 이의 염, 지방산의 아스코르빌 에스테르, 아스코르브산 유도체 (예를들어, 마그네슘 아스코르빌 포스페이트, 나트륨 아스코르빌 포스페이트, 아스코르빌 소르베이트), 토코페롤 (비타민 E), 토코페롤 소르베이트, 토코페롤 아세테이트, 토코페롤의 다른 에스테르, 부틸화 히드록시 벤조산 및 이의 염, 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-1-카르복실릭산 (Trolox？ 라는 상품명으로 시판됨), 갈산 및 이의 알킬 에스테르, 특히 프로필 갈레이트, 요산 및 이의 염 및 알킬 에스테르, 소르브산 및 이의 염, 리포산, 아민 (예를 들어, N.N,-디에틸히드록실아민, 아미노-구아니딘), 술프히드릴 화합물들 (예를 들어, 글루타티온), 디히드록시 푸마르산 및 이의 염, 글리신 피돌레이트, 아르기닌 필로레이트, 노르디히드로구아이레트산, 바이오플라보노이드, 커큐민, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 과산화물 디스뮤타아제, 실리마린, 차 추출물, 포도 껍질/씨 추출물, 멜라닌, 및 로스마리 추출물이 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "항원충제" 라는 용어는 원충 질환의 치료에 주로 사용되는 원충의 성장을 억제하거나 이들을 파괴하는 능력을 가진 화학물질의 그룹 중 임의의 것을 의미한다. 항원충제의 예에는 피리메타민 (Daraprim？) 술파디아젠 및 류코보린이 포함되나 이에 한정되지는 않는다
본원에서 사용되는 바와 같은 "항바이러스제" 라는 용어는 바이러스 질환의 치료에 주로 사용되는, 바이러스의 복제를 억제하거나 이들을 파괴하는 능력을 가진 화학물질의 그룹 중 임의의 것을 의미한다. 항바이러스제에는 아시클로비르, 시도포비르, 사이타라빈, 디데옥시아데노신, 디다노신, 에독수딘, 팜시클로비르, 플록스우리딘, 간시클로비르, 아이독스우리딘, 이노신 프라노벡스, 라미뷰딘, MADU, 펜시클로비르, 소리뷰딘, 스타뷰딘, 트리플루리딘, 발라시클로비르, 비다라빈, 잘시타빈, 지도뷰딘, 아세만난, 아세틸류신, 아만타딘, 아미디노마이신, 델라비르딘, 포스카메트, 인디나비르, 인터페론 (예를 들면, IFN-알파), 케톡살, 라이소자임, 메티사존, 모록시딘, 네비라핀, 포도필로톡신, 리바비린, 리만타딘, 리토나비르2, 사퀴나비르, 스테일리마이신, 스타톨론, 트로만타딘, 지도뷰딘 (AZT) 및 제나조산이 포함되나 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "결부되는" 이라는 용어 및 이의 다양한 문법적 형태는 직접적으로, 간접적으로, 활성적으로, 비활성적으로, 타성적으로, 비타성적으로, 완전하게 또는 불완전하게 접합, 연결 또는 조합되는 것을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "차단제" 라는 용어는 다른 물질의 생리학적 기능을 억제하는 물질을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "캐리하다" 라는 용어는 세포주의 표현형 및 유전형을 유지할 영양분을 함유하는 조직 배양 배지에서 세포주를 계대배양함으로써 세포주를 유지하는 것을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "세포 배양" 이라는 용어는 본래 조직으로부터 채취된 분산된 세포, 초대 배양, 또는 세포주 또는 세포 균주로부터 유래된 배양물을 성립 및 유지하는 것을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "세포주" 라는 용어는 형질전환을 겪어 배양시 무기한으로 계대될 수 있는 불멸화된 세포 집단을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "세포 균주" 라는 용어는 반복되어 계대될 수 있으나, 오직 제한된 수의 계대만이 가능한 세포를 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "클론" 이라는 용어는 그것이 유래된 단위 또는 개체와 유전학적으로 일치하는 세포, 세포 생성물, 또는 유기체를 말한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "클론형성능" 은 하나의 공급원 또는 다른 것으로부터 유래되는 세포 또는 성분의 상태를 말한다. 그러므로, "폴리클론" 이라는 용어는 많은 클론으로부터 유래되는 것을 말하고; "올리고클론" 이라는 용어는 몇 개의 클론으로부터 유래되는 것을 말하고; "모노클론" 이라는 용어는 하나의 클론으로부터 유래되는 것을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "초대 배양" 이라는 용어는 해리된 조직의 파종으로부터 산출된 세포를 말한다. 초대 배양물은 종종 여러 계대가 지나면 그들의 표현형 및 유전형을 상실한다. 대부분의 초대 세포 배양물은 제한된 수명을 갖는다 (종양으로부터 유래된 일부는 제외).
본원에서 사용되는 바와 같은 "세포 계대" 라는 용어는 스플릿팅 (희석) 및 단층 또는 세포 현탁액의 신선한 배지를 함유하는 배지 용기 내로의 후속 재분배를 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "컨플루언시" 라는 용어는 배양 배지 내 세포의 증식을 측정하는 것을 말한다. 일반적으로, T 플라스크 또는 플레이트 또는 디쉬 내의 배양물의 컨플루언시는 세포 사이의 공간의 양에 근거한다. 예를 들어, 100% 컨플루언시는 배양 플레이트 또는 디쉬가 세포로 완전히 덮여, 세포가 성장할 공간이 더 이상 남아있지 않는 것을 의미하고; 50% 컨플루언시는 배양 디쉬 또는 플레이트의 대략 절반이 세포로 덮이고 성장할 공간이 남아있는 것을 의미한다.
"화학요법제" 라는 용어는 질환을 치료하거나 조절하는데 유용한 화학약품을 말한다. 본 발명의 문맥에서 사용가능한 화학요법제의 비제한적 예에는 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신, 암루비신, 피라루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 에토포사이드, 테니포사이드, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 마이토마이신 C, 5-FU, 파클리탁셀, 도세탁셀, 액티노마이신 D, 콜치신, 토포테칸, 이리노테칸, 젬시타빈 사이클로스포린, 베라파밀, 발스포도르, 프로베네시드, MK517, GF120918, LY335979, 비리코다, 테르페나딘, 퀴니딘, 페르빌레인 A, 및 XR9576 이 포함된다.
"인지기능" 이라는 용어는 사고, 학습, 판단, 기억, 계산, 운동 기능 조절 등과 같은 정신 업무를 수행하는 능력 뿐 아니라 본인의 생각에 대한 이해, 지각, 또는 자각을 만들어내는 지적 과정을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "인지 기능을 향상시키는 양" 이라는 용어는 인지 기능을 향상시키는 양의 조성물 또는 물질을 투여받지 않은 대상과 비교하여 대상에서 정신 업무 (예를 들어, 지각, 기억, 판단, 추론) 를 향상 또는 증가시키기 위해 첨가되는 치료학적 유효 투여량 (즉, 투여량 및 투여 빈도) 을 말한다. 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 mg/kg 체중 내지 약 100 g/kg 체중이다. 이 양은 본 발명의 조성물의 예방학적인 양을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "본래의 인지 기능 수준" 이라는 구는 정상의, 건강한 대상에 의해 나타내지는 인지 기능을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "상태" 라는 용어는 다양한 건강 상태를 말하고, 임의의 근원 메카니즘 또는 장애, 상해, 및 건강한 조직 및 기관의 촉진에 의해 야기되는 장애 또는 질환이 포함되는 것으로 의미된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "조건화된" 이라는 용어는 학습 또는 경험에 의해 습득된 특정 작용, 사건 또는 과정에 대해 준비된 것을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "접촉" 이라는 용어 및 이의 다양한 문법학적 형태는 바로 옆의 또는 국부적인 근접성으로 있는 또는 닿아 있는 상태 또는 조건을 말한다. 기관, 조직, 세포 도는 종양과 같은 그러나 이에 제한되지 않는 표적 목적물에 대한 조성물의 접촉은 당업자에게 알려진 임의의 투여 방식에 의해 발생될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "문맥" 이라는 용어 및 이의 다양한 문법학적 형태는 사건이 일어나는 설정 또는 환경을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "치매" 라는 용어는 정상 노화로부터 예상될 수 있는 범위를 벗어난 뇌의 손상 또는 질환으로 인한 인지 기능의 감퇴 또는 진행성 감퇴를 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "성장의 밀도-의존성 억제" 라는 구는 단층을 형성함으로써 성장 패턴에 따라 시험관 내 반응 및 컨플루언시 시 세포가 이웃 세포의 경계를 인지하는 것에 의해 역치 밀도에 도달할 시 세포의 감소된 성장 반응을 말한다. 보통 이러한 세포는 감소된 속도로 (천천히 성장함) 세포 사이클을 통해 이행된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "분화" 라는 용어는 덜 전문화된 세포가 더욱 전문화된 세포 유형이 되도록 하는 과정을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "질환" 또는 "장애" 또는 "기능장애" 라는 용어는 건강의 장애 또는 비정상 작용의 상태를 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "약물" 이라는 용어는 질병을 예방, 진단, 완화, 치료, 또는 치유시키는데 사용되는 치료제 또는 음식 이외의 임의의 물질을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "효과기" 라는 용어는 단백질에 결합하여 단백질의 활성을 변경시키는 분자를 말한다.
"에피토프" 및 "항원 결정소" 라는 용어는 항원 조합 부위 (ACS) 가 인지하는 분자 상의 부위 및 항체가 그 자체에 결합하는/부착하는 부위를 말하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, 에피토프는 키나아제 억제 펩티드 상의 항원 결정소/항원 결합 부위일 수 있다. 에피토프는 관련된 일차, 이차, 또는 삼차-서열일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "조각" 이라는 용어는 단백질, 단백질 복합체, 펩티드, 펩티드 복합체, 핵산, 항체 또는 기타 물질의 단리된 부분을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "기능적 등가물" 이라는 용어는 유사한 또는 동일한 효과 또는 용도를 갖는 성분, 분자, 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드를 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "최대 저해 농도 절반" ("IC", "IC50", "50% IC") 이라는 용어는 생물학적 또는 생화학적 활성의 50% 저해를 야기하는 양 또는 농도를 말한다. IC50 은 얼마나 많은 양의 특정 약물, 작용제 또는 기타 성분 (저해제) 이 예를 들어, 효소, 세포, 세포 수용체, 또는 미생물과 같은 과정의 성분 또는 제시된 생물학적 과정을 절반으로 억제하는데 필요한지를 나타내는 정량적 측정값이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "해치" ("해동" 또는 "탈-동결") 라는 용어는 세포를 냉동고 밖으로 꺼내놓거나 또는, 냉동고 저장액으로부터 배양을 시작하는 것을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "호르몬" 이라는 용어는 신체 기관에 의해 생성되어 혈액을 타고 이동, 다른 위치에서 활성을 촉발시키는 천연 물질 또는 그들의 합성 유사체를 말한다. 본 발명의 문백에서 사용하기에 적합한 호르몬에는 신경분비세포에 의해 생성된 임의의 호르몬, 생식샘 자극 호르몬 방출 호르몬 (GnRH), 코르티코트로핀 방출 호르몬 (CRH), 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬 (TRH), 프로락틴 저해 호르몬 (도파민) 및 오렉신 (히포크레틴) 뿐만 아니라, 재조합 호르몬 (정상적으로는 함께 존재하지 않는 서열을 함유하도록 유전조작된 DNA 를 사용하고 숙주 세포에 그 DNA 를 도입하는 과정을 통해서 생성된 호르몬을 의미함) 이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "저해제" 라는 용어는 효소에 결합하여 효소 활성을 감소시키는 분자를 말한다. 효소 저해제는 효소에 결합하여 효소 활성을 감소시키는 분자이다. 저해제의 결합은 기질이 효소의 활성 부위에 진입하는 것을 정지시키고/거나 효소가 반응을 촉매화시키는 것을 방해할 수 있다. 저해제 결합은 가역적 또는 비가역적이다. 비가역적 저해제는 일반적으로 효소와 반응하거나, 예를 들어, 효소 활성에 필요한 핵심 아미노산 잔기를 개질시킴으로써 화학적으로 변화시킨다. 반대로, 가역적 저해제는 비-공유결합적으로 결합하고, 저해제가 효소, 효소-기질 복합체, 또는 모두에 결합하는 지에 따라 상이한 유형의 저해를 산출한다. 효소 저해제는 종종 그들의 특이성 및 효능에 의해 평가된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "상해" 라는 용어는 물리적 또는 화학적일 수 있는 외부 작용제 또는 힘에 의해 야기되는 신체의 구조 또는 기능에 대한 손상 또는 피해를 말한다.
본원에 기재된 조성물은 단리된 분자를 함유한다. "단리된 분자" 는 실질적으로 순수하고, 의도되는 용도에 적합하고 실시가능한 범위로 시험관 내 시스템에서 또는 자연에서 본래 발견되는 다른 성분이 없는 분자이다. 특히, 조성물은 충분히 순수하고, 조성물이 핵산, 펩티드, 또는 다당류인 경우 예를 들어, 약학적 제제의 제조 또는 서열분석에 유용하도록 숙주 세포의 다른 생물학적 구성성분이 충분히 없다. 조성물이 약학적 제제 내에서 약학적으로 허용가능한 담체와 혼련될 수 있기 때문에, 조성물은 제제의 중량에 대해 오직 적은 % 로만 포함할 수 있다. 그럼에도 불구하고 조성물은 합성 동안 또는 살아있는 계에서 결부될 수 있는 성분으로부터 실질적으로 분리되는 식으로 실질적으로 순수하다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "실질적으로 순수한" 이라는 용어는 분석 프로토콜에 의해 측정된 바와 같이 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상 순수한 순도를 말한다. 이러한 프로토콜에는 예를 들어, FACS, HPLC, 젤 전기영동, 크로마토그래피 등이 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
"이소형" 이라는 용어는 또다른 단백질과 동일한 기능을 갖지만, 그 서열에 있어 일부 적은 차이가 있는 단백질의 형태를 말한다.
계열 I 사이토카인 수용체 슈퍼패밀리의 일원인 렙틴 수용체 (OB-R) 는 대안적인 스플라이싱의 결과로서 6 개 이상의 이소형을 갖는다. OB-R 의 모든 이소형은 동일한 세포외 리간드-결합 도메인을 공유한다. 렙틴의 기능적 수용체 (OB-Rb) 인 b 이소형은 시상하부 (이곳에서 이것은 에너지 항상성 및 신경내분비 기능을 조절함) 뿐 아니라 선천성 및 적응성 면역력의 모든 세포 유형을 포함하는 말초 및 다른 뇌 영역에서 발현된다. 전장 b 이소형 (OB-Rb) 은 고유의 티로신 키나아제 활성이 결핍되고, 여러 다운스트림 신호 전달 경로에 관여되어 있다.
"렙틴 아고니스트" 라는 용어는 렙틴 수용체 및/또는 다운스트림 효과기를 활성화시키고 대상에서 아밀로이드 펩티드 수준 또는 tau 인산화를 조절할 수 있는 화합물을 말한다. 이러한 효과기에는 예를 들어, AMP-의존성 단백질 키나아제 ("AMPK"), 스테롤 조절 요소 결합 단백질 ("SREBP"), 및 GSK-3β 가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "조절하다" 라는 용어는 특정 측정치 또는 비율까지 조절, 변형, 채택 또는 조정하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "조절자 분자" 또는 "조절자" 라는 용어는 알로스테릭 조절 동안 조절 부위에 결합하고 단백질의 형상을 알로스테릭하게 조절하는 분자를 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "단층" 이라는 용어는 배양물에서 성장하는 1 개 세포 두께의 세포의 층을 말한다.
"신경섬유 매듭" ("NFT") 이라는 용어는 일반적으로 미세관-연관 단백질 "tau" 의 응집물을 말하며, 이것이 과인산화되게 되면 세포 자체 내부에 축적된다.
"비-스테로이드성 항염증제" 라는 구는, 이부프로펜 (Advil？), 나프록센 나트륨 (Aleve)？, 및 아세트아미노펜 (Tyrenol)？ 을 포함하는, 그 작용이 아스피린과 유사한 큰 그룹의 작용제를 말한다. 본 발명의 문맥에서 이용가능한 비-스테로이드성 항염증제의 부가적인 예에는 옥시캠 (예컨대, 피록시캠, 이속시캠, 테녹시캠, 수독시캠, 및 CP-14,304); 디스알시드, 베노릴레이트, 트릴리세이트, 사파프린, 솔프린, 디플루니살, 및 펜도살; 디클로페낙, 펜클로페낙, 인도메타신, 술린닥, 톨메틴, 이속세팍, 푸로페낙, 티오피낙, 지도메타신, 아세마타신, 펜티아작, 조메피락, 클린다낙, 옥세피낙, 펠비낙, 및 케토롤락과 같은 아세트산 유도체; 메페나믹, 메클로페나믹, 플루페나믹, 니플루믹, 및 톨페남산과 같은 페남메이트; 이부프로펜, 나프록센, 베녹사프로펜, 플루비프로펜, 케토프로펜, 페노프로펜, 펜부펜, 인도프로펜, 피프로펜, 카프로펜, 옥사프로진, 프라노프로펜, 미로프로펜, 티옥사프로펜, 수프로펜, 아미노프로펜, 및 티아프로페닉과 같은 프로피온산 유도체; 페닐부타존, 옥시펜부타존, 페프라존, 아자프로파존, 및 트리메타존과 같은 피라졸을 제한 없이 포함한다. 이러한 비-스테로이드성 항염증제의 혼합물 뿐 아니라 이들 작용제의 피부학적으로 허용가능한 염 및 에스테르도 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 에토페나메이트, 플루페남산 유도체가 국소 적용에 특히 유용하다.
"정상" 이라는 용어는 큰 그룹의 표준, 모델, 중앙 또는 평균을 말한다.
"정상의 건강한 대상" 이라는 용어는 인지 장애의 증상 또는 다른 임상적 증거가 없는 대상을 말한다.
"펩티드" 라는 용어는 펩티드 결합에 의해 연결되는 2 개 이상의 아미노산을 말하기 위해 본원에서 사용된다.
"폴리펩티드" 라는 용어는 가장 넓은 의미로는 서브유닛 아미노산의 서열, 아미노산 유사체, 또는 펩티드모방체를 말하는 것으로 사용된다. 서브유닛은 표시되는 것을 제외하고는 펩티드 결합에 의해 연결된다. 본 발명의 렙틴 또는 렙틴 유사체 폴리펩티드는 화학적으로 합성되거나 재조합적으로 발현될 수 있다.
"단백질" 이라는 용어는 아미노산으로 구성되는 큰 복합체 분자 또는 폴리펩티드를 말하기 위해 본원에서 사용된다. 단백질 내 아미노산의 서열은 그것을 코딩하는 핵산 서열 내의 염기의 서열에 의해 측정된다.
"펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질" 이라는 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생적 아미노산의 인공적인 화학적 유사체인 아미노산 중합체 뿐 아니라, 자연 발생적 아미노산 중합체에 적용된다. 자연 발생적 아미노산의 이러한 유사체의 본질적인 특징은 단백질 내로 도입되는 경우 그 단백질이 동일한 단백질에 대해 도출되나 자연 발생적 아미노산으로 전체적으로 이루어지는 항체에 특이적으로 반응성이라는 것이다. "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질" 이라는 용어는 또한 글리코실화, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화, 히드록실화 및 ADP-리보실화를 포함하나 이에 제한되지 않는 개질을 포괄한다. 잘 알려진 바와 같이 상기 표시된 바와 같이, 폴리펩티드가 전적으로 선형일 수 없다는 것이 인식될 것이다. 예를 들어, 폴리펩티드는 유비퀴틴화의 결과로서 분지형일 수 있고, 이들은 천연 처리과정 사건 및 자연적으로 발생하지 않는 인간 조작에 의해 야기되는 사건을 포함하여 일반적으로 번역후 사건의 결과로서 환형 (분지 또는 분지 없이) 일 수 있다. 환형의, 분지형 및 분지형 환형의 폴리펩티드는 비-번역 천연 처리과정 뿐 아니라 전체적 합성 방법에 의해서도 합성될 수 있다.
"잔기" 또는 "아미노산 잔기" 또는 "아미노산" 이라는 용어는 자연 발생적 아미노산과 유사한 방식으로 작용할 수 있는 자연 발생적 아미노산 및 자연적 아미노산의 공지된 유사체를 포함하나 이에 제한되지 않는 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드 내로 혼입되는 아미노산을 말하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
핵산의 문맥에서 사용되는 경우 "변이체", "돌연변이체", 및 "유도체" 라는 용어는 참조 뉴클레오티드 서열과 실질적인 일치성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 말하기 위해 본원에서 사용된다. 서열 간의 차이는 서열 또는 구조에서, 자연적으로 또는 디자인에 의한 차이의 결과에 의한 것일 수 있다. 자연적인 변화는 특정 핵산 서열의 특성에서 정상 복제 또는 이중복제 과정 동안 발생할 수 있다. 디자인 변화는 특정 목적을 위해 서열 내로 특이적으로 디자인되고 도입될 수 있다. 이러한 특이적 변화는 다양한 돌연변이생성 기술을 사용하여 시험관 내에서 이루어질 수 있다. 특이적으로 생성된 이러한 서열 변이체는 본래 서열의 "돌연변이체" 또는 "유도체" 로서 언급될 수 있다.
마찬가지로 당업자는 단일 또는 복합 아미노산 치환, 결실, 부가 또는 대체를 갖는 폴리펩티드 변이체를 생성할 수 있다. 상기 변이체에는 특히: (a) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존적 또는 비-보존적 아미노산으로 치환되는 변이체; (b) 하나 이상의 아미노산이 부가되는 변이체; (c) 하나 이상의 아미노산에 치환기가 포함되는 변이체; (d) 하나의 종으로부터의 아미노산 잔기가 보존된 또는 비-보존된 위치에서 또다른 종 내 상응하는 잔기에 대해 치환되는 변이체; 및 (d) 표적 단백질이 예를 들어, 항체에 대한 에피토프와 같은 표적 단백질에 유용한 특성을 부여할 수 있는 융합 파트너, 단백질 태그 또는 다른 화학적 부분과 같은 또다른 펩티드 또는 폴리펩티드와 융합되는 변이체가 포함될 수 있다. 유전적 (억제, 결실, 돌연변이 등), 화학적, 및 효소적 기술을 포함하는 다양한 변이체를 수득하기 위한 기술은 당업자에게 알려져 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "돌연변이" 라는 용어는 모체 유형에서 발견되지 않는 새로운 특성 또는 자취의 제작을 야기하는 유기체의 유전자 또는 염색체 내 DNA 서열 변화, 또는 염색체의 물리적인 배열의 변화를 통해 또는 유전자에 대한 코딩 DNA 의 뉴클레오티드 서열의 변화를 통해, 염색체 내에서 이러한 변화가 일어나는 과정을 말한다. 돌연변이의 상기 메카니즘에는 치환 (하나의 염기쌍이 또다른 것으로 교환됨), 부가 (하나 이상의 염기의 서열 내로의 삽입), 및 결실 (하나 이상의 염기쌍의 상실) 이 포함된다.
"치환" 이라는 용어는 염기(들) 이 DNA 내 또다른 염기(들) 에 대해 교환되는 것을 말하기 위해 본원에서 사용된다. 치환은 동의 치환 또는 비-동의 치환일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은, "동의 치환" 은 생성되는 아미노산 서열이 변형되지 않는 식으로 단백질에 대한 코딩 유전자의 엑손 내에서의 또다른 염기에 대한 하나의 염기의 치환을 말한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "비-동의 치환" 이라는 용어는 생성되는 아미노산 서열이 변형되는 식으로 단백질에 대한 코딩 유전자의 엑손 내에서의 또다른 염기에 대한 하나의 염기의 치환을 말한다.
"결실" 및 "결실 돌연변이" 라는 용어는 염기(들) 이 DNA 로부터 상실된 것을 말하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
핵산 서열의 문맥에서 사용되는 경우 본원에서 사용되는 바와 같은 "부가" 라는 용어는 하나 이상의 염기, 또는 하나 이상의 아미노산의 서열 내로의 삽입을 말한다.
다음은 서로에 대한 보존적인 치환인 아미노산의 그룹을 나타낸다:
1) 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T);
2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E);
3) 아스파라긴 (N), 글루탐산 (Q);
4) 아르기닌 (R), 라이신 (K);
5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 및
6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W).
"유사한" 이라는 용어는 공통으로 자취 또는 특성을 갖는 의미와 유사한, 이에 필적하는 또는 이를 닮은 용어와 상호교환적으로 사용된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 렙틴 또는 렙틴 유사체는 화학적으로 합성된다. 고상, 액상, 또는 펩티드 축합 기술, 또는 이의 임의의 조합의 잘 공지된 기술을 사용하여 제조된 이러한 합성 폴리펩티드에는 천연 및 비천연 아미노산이 포함될 수 있다. 펩티드 합성에 사용되는 아미노산은 Merrifield (1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154) 의 본래의 고상 절차의 표준 탈보호, 중화, 커플링 및 세정 프로토콜로의 표준 Boc (N-α-아미노 보호된 N-α-t-부틸옥시카르보닐) 아미노산 수지, 또는 Carpino and Han (1972, J. Org. Chem. 37:3403-3409) 에서 처음으로 기술된 염기-불안정 N-α-아미노 보호된 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 아미노산일 수 있다. Fmoc 및 Boc N-α-아미노 보호된 아미노산은 모두 Sigma, Cambridge Research Biochemical, 또는 당업자에게 친숙한 다른 화학약품 업체로부터 수득될 수 있다. 또한, 렙틴 또는 렙틴 유사체 폴리펩티드는 당업자에게 친숙한 다른 N-α-보호기로 합성될 수 있다.
고상 펩티드 합성은 예를 들어, Stewart and Young, 1984, Solid Phase Synthesis, Second Edition, Pierce Chemical Co., Rockford, 111.; Fields and Noble, 1990, Int. J. Pept. Protein Res. 35:161-214 에서 제공되고 당업계에 공지된 친숙한 기술에 의해, 또는 자동화 합성기를 사용하여 달성될 수 있다.
"펩티드모방체" 라는 용어는 펩티드를 모사 또는 모방하기 위해 디자인된 작은 단백질-유사 사슬을 말한다. 펩티드모방체는 천연 모체 펩티드의 생물학적 활성(들) 을 모방 (모조를 의미함) 또는 길항 (중화 또는 반대작용을 의미함) 할 수 있는 비-펩티드 구조 요소를 포함할 수 있다. "렙틴 펩티드모방체" "렙틴 모조체", 및 "렙틴 모방체" 라는 용어는 생물학적 효과를 산출하는 렙틴 단백질의 기능적 도메인을 포함하는 렙틴 유도체를 말하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 화학에서 유도체는 전구체 화합물로부터 적어도 이론적으로 형성될 수 있는 화합물이다. 상기 유도체는 생물학적 효과를 산출 또는 향상시키기 위해 또다른 분자와 조합될 수 있다. 생물학적 효과에는 예를 들어, 대상 내 아밀로이드 펩티드 수준 조절; 대상 내 tau 인산화 수준 조절; 대상 내 아밀로이드 펩티드 수준 감소; 대상 내 tau 인산화 수준 감소 등이 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "렙틴 유사체" 라는 용어는 야생형 렙틴 단백질과 유사한 구조 또는 기능의 화합물 또는 성분을 말한다. 예를 들어, 렙틴 수용체에 결합하고, 렙틴 신호 캐스케이드를 활성화시키고; Aβ 생성을 감소시키고, Aβ 의 섭취를 증가시키고, 또는 tau 의 인산화를 감소시키는 렙틴 유도체, 렙틴 모조체, 렙틴 아고니스트, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 기능적 등가물은 렙틴 유사체의 필요사항을 충족시킨다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "인산화된 tau 축적 조절량" 이라는 용어는 tau 단백질의 인산화를 조절하는 렙틴 조성물의 치료학적 유효량을 말한다. 인산화된 tau 축적 조절량에는 본 발명의 조성물의 예방학적인 양을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "플레이팅" 이라는 용어는 배양 배지 내에 또는 그 상에 세포를 분취하는 과정을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "효능" 이라는 용어는 효능, 효율성, 강도 또는 전형적으로는, 해리 상수 (효소를 저해하는데 필요한 농도를 나타냄) 를 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "재조합 단백질" 이라는 용어는 유전자 조작에 의해 생성되는 단백질을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "감소시키는" 이라는 용어 및 이의 다양한 문법학적 형태는 장애 발달 위험이 있는 개인에서 장애의 발생을 제한하는 것을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "회복력" 이라는 용어는 질병, 상태, 질환, 증후군 또는 장애 후 또는 그 동안 본래 형태, 위치 또는 기능으로 되돌려 놓는 능력을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "용액" 이라는 용어는 고체, 액체, 기체 또는 이들의 조합일 수 있는 2 이상의 성분의 균질한, 분자 혼합물을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "특이성" 이라는 용어는 하나의 성분에 대한 또다른 성분의 선별적 부착 또는 영향을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "스플릿" 또는 "계대" 라는 용어는 세포의 계대 또는 계대배양을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "안정적 세포주" 라는 용어는 이종 DNA 가 숙주 게놈 내로 통합되고, 많은 세대를 거쳐 유지되는 세포(들) 을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "현탁 배양" 이라는 용어는 성장을 위해 기층에 부착시키는 것을 필요로 하지 않는, 즉 부착 독립성인 세포를 말한다. 혈액으로부터 유래되는 세포 배양은 전형적으로 현탁액에서 성장된다. 현탁 배양액 내 세포를 단일 세포 또는 무더기로서 성장시킬 수 있다. 단일 세포로서 성장하는 세포는 세포의 희석에 의해 계대배양될 수 있다. 그러나, 무더기로서 성장하는 세포의 경우, 무더기는 먼저 배양물의 계대배양 전에 해리되어야만 한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "스테로이드성 항염증제" 는 17 개의 탄소 4 개의 고리 시스템을 함유하는 많은 화합물 중 임의의 하나를 말하며, 스테롤, 다양한 호르몬 (아나볼릭 스테로이드로서), 및 글리코시드가 포함된다. 스테로이드성 항염증 약물의 대표적인 예에는 제한 없이, 히드로코르티손, 히드록실트리암시놀론, 알파-메틸 덱사메타손, 덱사메타손-포스페이트, 베클로메타손 디프로피오네이트, 클로베타솔 발레레이트, 데소나이드, 데스옥시메타손, 데스옥시코르티코스테론 아세테이트, 덱사메타손, 디클로리손, 디플로라손 디아세테이트, 디플루코르톨론 발레레이트, 플루아드레놀론, 플루클로론 아세토나이드, 플루드로코르티손, 플루메타손, 피발레이트, 플루오시놀론 아세토나이드, 플루오시노나이드, 플루코르틴 부틸에스테르, 플루오코르톨론, 플루프레드니덴 (플루프레드닐리덴) 아세테이트, 플루르아드레놀론, 할시노나이드, 히드로코르티손 아세테이트, 히드로코르티손 부티레이트, 메틸프레드니솔론, 트리암시놀론, 아세토나이드, 코르티손, 코르토독손, 플루세토나이드, 플루드로코르티손, 디플루오로손 디아세테이트, 플루르아드레놀론, 플루드로코르티손, 디플루로손 디아세테이트, 플루아드레놀론 아세토나이드, 메드리손, 암시나펠, 암신나파이드, 베타메타손 및 이의 에스테르의 균형물, 클로로프레드니손, 클로르프레드니손 아세테이트, 클로코르텔론, 클레시놀론, 디클로리손, 디플루프레드네이트, 플루클로로나이드, 플루니소라이드, 플루오로메탈론, 플루퍼롤론, 플루프레드니솔론, 히드로코르티손 발레레이트, 히드로코르티손 시클로펜틸프로피오네이트, 히드로코르타메이트, 메프레드니손, 파라메타손, 프레드니솔론, 프레드니손, 비클로메타손 디프로피오네이트, 트리암신놀론, 및 이의 혼합물이 포함된다.
"대상" 또는 "개인" 또는 "환자" 라는 용어는 인간을 비롯한 포유류 기원의 동물 종의 일원을 말하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "축적된 신경섬유 매듭과 관련된 진행성 인지 질환을 갖는 대상" 이라는 구는 축적된 신경섬유 매듭과 관련된 진행성 인지 질환과 연관된 진단 마커 및/또는 증상을 나타내는 대상을 말한다. "축적된 NFT 와 관련된 진행성 인지 질환" 이라는 구는 NFT 의 비정상 응집에 의해 야기되는, 또는 이의 결과인 질환(들) 을 말한다. NFT 의 축적과 관련된 진행성 인지 질환에는 진행성 핵상 마비; 치매; 권투선수 치매; AD; 크로이츠펠트-야콥 질환; 전두측두엽 치매; 픽 질환; 파킨슨증-17 (FTDP-17) 피질 기저핵 변성이 있는 전두측두엽 치매를 포함하는 기타 tau-양성 병리학; 전두측두엽 퇴행 (FTLD); 및 독특한 조직학이 결여된 치매가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
"이를 필요로 하는 대상" 이라는 구는 축적된 NFT 와 관련된 진행성 인지 질환을 갖는, 또는 가질 위험이 있는 환자이다. related to 축적된 신경섬유 매듭과 관련된 진행성 인지 질환은 일반적으로 환자 기록, 친척의 총체적 병력, 및 특징적인 신경학적 및 신경심리학적인 특징의 존재 및 대안 증상의 부재 등을 기초로 한 임상적인 관찰을 통해 임상적으로 진단된다. 이러한 기준은 인지 손상, 및 의심되는 치매 증후군의 존재를 요구하며, 신경심리학적인 검사를 통해서 확인된다. 다른 대뇌 병리학 또는 부차유형의 치매를 배제하는데 도움을 주도록 컴퓨터 단층촬영술 (CT) 또는 자기 공명 영상 (MRI) 으로의, 및 단일광자방출 컴퓨터 단층촬영술 (SPECT) 또는 양전자 방출 단층촬영 (PET) 로의 진보된 의학 영상기술이 사용될 수 있다. 기억력 검사를 포함하는 지적 기능 평가는 그 질병의 상태를 추가로 특징화할 수 있다. 확정적인 진단을 위해서 뇌 조직 현미경 검사를 포함한 조직 병리학적 확증이 필요할 수도 있다. AD 의 경우에서는 8 개의 인지 도메인이 가장 일반적으로 손상을 입는데 이는 기억력, 언어, 지각 기술, 주의력, 추정 능력, 방향, 문제 해결과 직무 능력이다. 이러한 도메인은 문헌 [Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-IV-TR)) (미국 정신의학회 발행) (본 출원에 참조로서 인용됨) 에 열거된 NINCDS-ADRD 알츠하이머 기준 목록과 동등하다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "증후군" 이라는 용어는 일부 질환 또는 상태를 나타내는 증상 패턴을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "치료제" 라는 용어는 치료 효과를 제공하는 약물, 분자, 핵산, 단백질, 조성물 또는 다른 성분을 말한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "활성인" 이라는 용어는 의도되는 치료 효과를 담당하는 본 발명의 조성물의 성분, 요소 또는 구성성분을 말한다. "치료제" 및 "활성제" 라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 활성제는 렙틴, 렙틴 모조체, 렙틴 유도체, 렙틴 조각, 렙틴 유사체, 또는 렙틴 아고니스트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 중 하나 이상의 치료학적 유효량일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "치료학적 성분" 이라는 용어는 집단의 % 에서 특정 질환 소견의 진행을 제거, 감소 또는 예방하는 치료학적 유효 투여량 (즉, 투여량 및 투여 빈도) 을 말한다. 통상적으로 사용되는 치료학적 성분의 예는, 집단의 50% 에서 특정 질환 소견에 대해 치료학적으로 유효한 특정 투여량의 복용량을 나타내는 ED50 이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "치료 효과" 라는 용어는 치료 결과를 말하고, 그 결과가 바람직하고 유익한 것으로 판단되는 것을 말한다. 치료 효과에는 직접적인 또는 간접적인, 질환 소견의 저지 감소 또는 제거가 포함될 수 있다. 치료 효과에는 또한 직접적인 또는 간접적인, 질환 소견의 진행의 저지 감소 또는 제거가 포함될 수 있다.
하나 이상의 활성제의 "치료학적 유효량", "유효량", 또는 "약학적 유효량" 이라는 용어는 의도된 치료 이득을 제공하기에 충분한 양을 말하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 활성제의 유효량은 일반적으로 약 0.01 mg/kg 체중 내지 약 100 g/kg 체중의 범위이다. 그러나, 투여량 수준은 부상 유형, 연령, 체중, 성별, 환자의 의료적 상태, 상태의 경중도, 투여 경로, 및 사용되는 특정 활성제를 비롯한 다양한 요인에 기반하여 정해진다. 그러므로, 투여량 섭생은 매우 광범위할 수 있으나, 표준 방법을 사용하여 의사에 의해 정규적으로 결정될 수 있다. 부가적으로, "치료학적 유효량" 및 "약학적 유효량" 이라는 용어에는 본 발명의 조성물의 예방학적인 양이 포함된다. 본 발명의 예방학적인 적용에서, 약학 조성물 또는 의약은 아밀로이드 펩티드의 축적, NFT 의 축적, 또는 tau 의 과인산화 중 하나 이상으로 인한 질환, 장애 또는 상태에 취약하거나, 걸릴 위험에 있는 환자에게 그러한 위험을 제거하거나 줄이기에 충분한 양만큼, 병의 경중도를 줄이기에 충분한 양만큼, 또는 질환, 장애 또는 상태의 생화학적, 조직학적 및/또는 행동학적 증상을 포함한 질환, 장애 또는 상태, 그 합병증, 및 질환, 장애 또는 상태의 발병 동안 나타나는 중간 병리학적 표현형의 발병을 지연시키기에 충분한 만큼 투여된다.
"치료하다" 또는 "치료하기" 라는 용어에는 질환, 상태 또는 장애의 진행을 제거, 실절적으로 억제, 저속화 또는 가역화시키는 것, 상태의 임상적 또는 심미적 증상의 출현을 실질적으로 경감시키는 것, 질환, 상태 또는 장애의 임상적 또는 심미적 증상의 출현을 실질적으로 예방하는 것, 및 유해한 또는 귀찬ㅇ흔 증상으로부터 보호하는 것이 포함된다. 또한 "치료하기" 라는 용어는 또한 하기 중 하나 이상을 달성하는 것을 말한다: (a) 장애의 심각성을 감소시키는 것; (b) 치료되는 장애(들) 의 특징적인 증상의 발생을 제한하는 것; (c) 치료되는 장애(들) 의 특징적인 증상 악화를 제한하는 것; (d) 장애(들) 을 이전에 가졌던 환자에서 장애(들) 의 재발을 제한하는 것; 및 (e) 장애(들) 에 대해 이전에 무증상이었던 환자에서 증상의 재발을 제한하는 것.
본원에서 사용되는 바와 같은 "일시적 트랜스펙션" 이라는 용어는 게놈 내로 도입되게 되는 DNA 가 없이 숙주 세포 내로 DNA 의 발현을 허용하게 하는 외래 DNA 의 세포 내로의 도입을 말한다. 프로토콜은 플라스미드, 또는 siRNA 를 세포에 진입시키도록 하는 세포 막 내 일시적 "홀" 개방을 위해 이용가능하다. 트랜스펙션될 수 있는 세포는 종종 "수용능 세포" 라고 불린다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "비타민" 은 대부분의 동물의 영양에 대한 미량의 필수적인 다양한 유기 성분이 대사과정의 조절에 보조효소 및 보조효소의 전구체로서 특히 작용하는 것을 말한다. 본 발명의 문맥에서 사용가능한 비타민의 비-제한적인 예에는 비타민 A 및 그의 유사체 및 유도체; 레티놀, 레티날, 레티닐 팔미테이트, 레티노산, 트레티노인, 이소-트레티노인 (총체적으로 레티노이드라고 알려짐), 비타민 E (토코페롤 및 이의 유도체), 비타민 C (L-아스코르브산 및 이의 에스테르 및 다른 유도체), 비타민 B3 (니아신아미드 및 그의 유도체), 알파 히드록시산 (예컨대, 글리콜산, 락트산, 타르타르산, 말산, 시트르산 등) 및 베타 히드록시산 (예컨대, 살리실산 등) 이 포함된다.
본 발명은 진행성 인지 장애의 임상적 치료용 조성물 및 치료 방법 및 진단 방법을 제공한다.
(1). 진행성 인지 장애의 치료 방법
하나의 양상에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 진행성 인지 장애의 치료 방법을 제공한다:
(a) 하기 (i) 내지 (iii) 을 포함하는 렙틴 조성물을 치료학적 유효량으로 제공하는 단계:
(i) 제 1 치료제로서의 렙틴 또는 렙틴 유사체;
(ii) 임의로, 제 2 치료제; 및
(iii) 약학적으로 허용가능한 담체;
(b) 단계 (a) 의 조성물을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계; 및
(c) 진행성 인지 장애의 하나 이상의 병리학의 진행을 감소 또는 예방하는 단계.
일부 구현예에 따르면, 진행성 인지 장애는 진행성 핵상 마비; 치매; 권투선수 치매; 크로이츠펠트-야콥 질환; 전두측두 치매; 픽 질환; FTDP-17 피질 기저핵 변성을 포함하는 기타 tau-양성 병리학; 전두측두엽 퇴행 (FTLD); 또는 독특한 조직학이 결여된 치매이다.
일부 이러한 구현예에 따르면, 병리학은 신경섬유 매듭이다.
일부 구현예에 따르면, 진행성 인지 장애는 알츠하이머 질환 (AD) 이다.
일부 이러한 구현예에 따르면, AD 의 병리학은 APP, 프레세닐린 1 (PS1) 또는 프레세닐린 2 (PS2) 유전자의 미스센스 돌연변이를 포함한다.
또다른 구현예에 따르면, AD 의 병리학은 Aβ42 의 변형된 단백질 가수분해를 포함한다.
또다른 구현예에 따르면, AD 의 병리학은 뇌 간질액 내 Aβ42 의 진행성 축적 및 응집을 포함한다.
또다른 구현예에 따르면, AD 의 병리학은 확산 플라크로서 응집된 Aβ42 의 침전을 포함한다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 침전은 프로테오글리칸 및 기타 아밀로이드-촉진 기질을 추가로 포함한다.
또다른 구현예에 따르면, AD 의 병리학은 확산 Aβ42 플라크 상의 Aβ40 의 응집 및 특정 플라크-연관 단백질의 증가를 포함한다.
또다른 구현예에 따르면, AD 의 병리학은 염증 반응을 포함한다. 염증 반응에는 미세아교세포 활성화 및 사이토카인 방출, 및 별아교세포증 및 급성 상 단백질 방출이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
또다른 구현예에 따르면, AD 의 병리학은 아밀로이드 플라크 내 그리고 신경망 내 그 밖에 있는 진행성 신경증 손상을 포함한다.
또다른 구현예에 따르면, AD 의 병리학은 뉴런 대사 및 이온 항성성의 붕괴를 포함한다. 또다른 구현예에 따르면, AD 의 병리학은 산화 손상을 포함한다.
또다른 구현예에 따르면, AD 의 병리학은 PHF 형성을 야기하는 과인산화된 tau 를 유발하는 하나 이상의 변형된 키나아제/포스파타아제 활성을 포함한다.
또다른 구현예에 따르면, AD 의 병리학은 진행성 신경전달물질 결핍이 있는 해마 및 대뇌 피질 내의 널리 퍼진 뉴런/초로성 기능장애 및 사멸을 포함한다.
또다른 구현예에 따르면, AD 의 병리학은 치매를 포함한다.
또다른 구현예에 따르면, AD 의 병리학에는 피질 영역이 포함된다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 병리학은 초로성 디스트로피이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 병리학은 시냅스 손실이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 병리학은 뉴런 세포체의 수축이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 병리학은 선택적 뉴런 손실이다.
하나의 구현예에 따르면, 렙틴 또는 그의 렙틴 유사체는 렙틴 조각, 치료학적으로 활성인 렙틴 조각, 렙틴 모조체 또는 렙틴 모방체, 또는 렙틴 유도체 중 하나 이상이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 렙틴 조성물은 렙틴 모방체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 렙틴 조성물은 렙틴 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 렙틴 유도체는 렙틴 펩티드, 또는 렙틴 펩티드 조각이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 렙틴 펩티드 또는 렙틴 펩티드 조각은 치료학적으로 활성이다.
또다른 구현예에 따르면, 렙틴 또는 그의 렙틴 유사체는 렙틴 또는 렙틴 유사체의 약학적으로 허용가능한 염이다.
또다른 구현예에 따르면, 렙틴 조성물은 매일 투여된다. 또다른 구현예에 따르면, 렙틴 조성물은 매주 투여된다. 또다른 구현예에 따르면, 렙틴 조성물은 매달 투여된다.
또다른 구현예에 따르면, 본 발명은 치료학적 유효량의 렙틴 조성물의 중단되지 않는 사이클로의 대상에서의 알츠하이머 질환의 치료 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "중단되지 않는" 이라는 용어는 렙틴이 적어도 2 사이클, 4 사이클, 12 사이클, 24 사이클, 및/또는 52 사이클 이상 동안 대상에게 반복되어 투여되며, 사이클 주기는 일정하고, 한 사이클의 최종 복용량과 다음 사이클의 첫번째 복용량 사이의 최대 기간이 21 일, 14 일, 7 일, 및/또는 1 일을 넘지 않는 것을 의미한다. 상기 정의 내에서, "사이클의 주기가 일정하다" 라는 구는 연속하는 상응하는 투여량 사이의 기간은 12 시간 범주 내에 일정하다는 것을 의미한다. 예를 들어, 주기가 7 일 (즉, 168 시간) 인 것으로 표시되는 경우, 본 발명에 따르면 "사이클의 주기가 일정하다" 라는 구는 연속 사이클 내 상응하는 투여량 사이의 기간이 162 내지 174 시간의 범위일 수 있다는 것을 의미하는 것으로 해석될 것이다. 일부 구현예에서, 각각의 사이클 내 렙틴 조성물 복용량 횟수는 1 내지 5 범위일 수 있고, 각각의 개별 복용량은 1 또는 다수의 개별적인 투여량 형태를 섭취하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 사이클 내 렙틴 조성물 복용량 횟수는 1 내지 6 범위일 수 있고, 각각의 개별 복용량은 1 또는 다수의 개별적인 투여량 형태를 섭취하는 것을 포함할 수 있다.
또다른 구현예에 따르면, 주기는 일일 (즉, 1 일) 이다. 또다른 구현예에 따르면, 렙틴 조성물의 치료학적 유효량은 단일 사이클로 투여된다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 사이클 내 투여량 수는 1 이다.
또다른 구현예에 따르면, 렙틴 조성물의 1 회 복용량은 2 사이클 이상 동안 매 7 일 마다 (즉, 2 개월 마다 1 회) 대상에게 투여된다. 또다른 구현예에 따르면, 렙틴 조성물의 1 회 복용량은 4 사이클 이상 동안 매 7 일 마다 (즉, 매달 1 회) 대상에게 투여된다. 또다른 구현예에 따르면, 렙틴 조성물의 1 회 복용량은 52 사이클 이상 동안 매 7 일 마다 (즉, 년 1 회) 대상에게 투여된다. 이 경우, 사이클 당 복용량 횟수는 오직 단일 복용량이고, 주기는 7 일이고, 한 사이클의 최종 복용량과 다음 사이클의 첫번째 복용량 사이의 최대 기간은 6 일이다. 또다른 구현예에서, 예를 들어, 렙틴 조성물의 1 회 복용량은 52 사이클 이상 동안 월요일, 및 화요일에 1 회 투여된다. 이 경우, 사이클 당 복용량 횟수는 2 이고, 주기는 7 일이고, 한 사이클의 최종 복용량과 다음 사이클의 첫번째 복용량 사이의 최대 기간은 5 일 (즉, 수요일 ~ 일요일) 이다. 또다른 구현예에서, 예를 들어, 렙틴 조성물의 복용량은 각각의 복용량으로 2 개의 정제를 섭취함으로써 한 주의 특정일에 아침 및 또다른 밤에 투여되고, 그 다음 이 사이클은 52 사이클 이상 동안 반복된다. 이 경우, 사이클 당 복용량 횟수는 2 로서, 각각의 복용량은 2 회 투여량 형태를 포함한다, 주기는 7 일이고, 한 사이클의 최종 복용량과 다음 사이클의 첫번째 복용량 사이의 최대 기간은 6 일이다 (즉, 한 주의 날짜 사이의 날이 제시된다). 다른 스케쥴들도 본 발명의 구현예 내에 있는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 렙틴 조성물의 1 회 복용량은 52 사이클 이상 동안 월요일 및, 수요일에 1 회 투여된다. 이 경우, 사이클 당 복용량 횟수는 2 이고, 주기는 7 일이고, 한 사이클의 최종 복용량과 다음 사이클의 첫번째 복용량 사이의 최대 기간은 4 일이다 (즉, 목요일 ~ 일요일). 또다른 구현예에서, 주기는 주 당이다 (즉, 7 일).
일부 구현예에서, 본 발명은 기타 치료제와 조합되고 국부로 투여될 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 기타 치료제(들) 은 동시에 투여된다. 기타 치료제와 동시에 투여되는 경우, 이들은 동일한 또는 별도의 제형으로 투여될 수 있으나, 동시에 투여된다. 일부 이러한 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 기타 치료제(들) 은 순차적으로 투여된다. 기타 치료제는 기타 치료제와 저해제의 투여가 일시적으로 분리되는 경우 서로 그리고 본 발명의 조성물과 순차적으로 투여된다. 상기 작용제들의 투여 사이의 시간 분리는 겨우 몇 분일 수 있거나, 또는 더 길 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 렙틴 조성물은 하나 이상의 제 2 치료제를 추가로 포함한다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 제 2 치료제는 키나아제 저해제이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 제 2 치료제는 항생제이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 제 2 치료제는 항진균제이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 제 2 치료제는 항바이러스제이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 제 2 치료제는 항원충제이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 제 2 치료제는 스테로이드성 항염증제이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 제 2 치료제는 비-스테로이드성 항염증제이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 제 2 치료제는 항산화제이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 제 2 치료제는 호르몬이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 제 2 치료제는 비타민이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 제 2 치료제는 항히스타민제이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 제 2 치료제는 화학요법제이다.
일부 구현예에 따르면, 렙틴 조성물은 하기 (a) 내지 (c) 를 포함한다:
(a) 제 1 치료제로서 렙틴 또는 그의 렙틴 유사체;
(b) 하나 이상의 키나아제 저해제를 포함하는 임의의 제 2 치료제, 하나 이상의 키나아제 저해제는 키나아제 저해 양으로 존재함; 및
(c) 담체;
본 조성물은 키나아제의 저해를 성분 (a), (b) 및 (c) 의 합을 초과하는 수준으로 제공함.
하나의 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는, 칼슘/칼모둘린-의존성 단백질 키나아제 II, 단백질 키나아제 A 및 GSK-3β 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 키나아제 저해제이다.
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 칼슘/칼모둘린-의존성 단백질 키나아제 II (CAMK2A; Myr-AIP) 의 저해제이다. 칼슘 신호는 글루타메이트성 시냅스에서 가소성의 여러 양상에 중요하다. 칼슘/칼모둘린-의존성 키나아제 II 는 세린/트레오닌 단백질 키나아제 계열, 및 칼슘/칼모둘린-의존성 단백질 부차 계열에 속한 키나아제 효소이다. 상기 효소는 4 개의 상이한 사슬: α, β, Δ 및 γ 로 구성된다. α 사슬은 해마의 장기간 강화 및 공간적 학습력에 필요하다. 이의 칼슘-칼모둘린 (CaM)-의존성 활성 외에, 칼슘/칼모둘린-의존성 키나아제 II 는 자가인산화를 겪을 수 있어, CaM-의존성 활성을 산출한다.
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 단백질 키나아제 A 의 키나아제 저해제이다. 단백질 키나아제 A (PKA, cAMP-의존성 단백질 키나아제) 는 그 활성이 세포 내 시클릭 아데노신 모노포스페이트 (cAMP) 의 수준에 따라 다른 효소의 계열을 말한다. PKA 는 글리코겐, 당 및 지질 대사의 조절을 포함하는 세포 내 여러 기능을 갖는다. 각각의 PKA 는 2 개의 조절 및 2 개의 촉매성 서브유닛으로 이루어진 할로효소이다. 저 수준의 cAMP 하에서, 할로효소는 온전한 상태로 남아있고, 촉매적으로 비활성이다. cAMP 의 농도가 증가하는 경우, cAMP 는 조절 서브유닛 상의 2 개의 결합 부위에 결합하고, 이것은 촉매성 서브유닛의 방출을 야기한다. 그 다음 유리 촉매성 서브유닛은 ATP 말단 포스페이트를 세린 또는 트레오닌 잔기에서 단백질 기질로 이동시키는 것을 촉매화할 수 있다. 상기 인산화는 보통 기질의 활성 변화를 야기한다. PKA 활성의 효과는 세포 유형에 따라 다양하다.
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 글리코겐 신타아제 키나아제-3β (GSK-3β) 의 키나아제 저해제이다. GSK-3β 의 기능은 전체적으로 이해되지 않았다.
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 Myr-AIP, LiCl 및 KT5720 으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 키나아제 저해제 염화리튬 (LiCl) 이다. 염화리튬은 저해성 Ser9 잔기의 인산화를 증가시킴으로써 GSK-3β 활성 (IC50= 5 mM) 를 약화시킨다. 일부 이러한 구현예에 따르면, LiCl 농도는 약 5x10-2 mol/L 내지 약 1 mmol/L 이다.
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 키나아제 저해제 6-브로모인디루빈-3'-옥심 (BIO) 이다. 키나아제 저해제 6-브로모인디루빈-3'-옥심 ((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심) 은 강력하고, 가역적이고, ATP-경쟁적 GSK-3β 저해제로서 인간 및 마우스 배아 줄기 세포에서 자가-재생을 유지하는 것으로 제시된 첫번째 약리학제이다.
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 키나아제 저해제 KT5720 이다. KT5720 은 K525a 의 세포-투과성, 반-합성 유도체이다. 이것은 cAMP-의존성 단백질 키나아제의 선택적 저해제 (PKA; IC50=56 nM) 이나, 단백질 키나아제 C (PKC), 단백질 키나아제 G (PKG) 또는 미오신 경쇄 키나아제 (MLCK) 에는 유의한 영향이 없다.
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 K252a, 스타우로스포린, KT5252b 및 켈레리트린으로 이루어지는 군으로부터 선택된 키나아제 저해제이다.
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 키나아제 저해제 K252a 이다. K252a 는 노카르디오피시스 종 (Nocardiopisis sp.) 토양 진균으로부터 단리된 알칼로이드이다. 상기 ATP 유사체는 CaM 키나아제 및 포스포릴라아제 키나아제의 매우 강력한 세포 투과성 저해제 (IC50=1.8 및 1.7 nM, 각각) 이다. 더 높은 농도에서, 이것은 또한 세린/트레오닌 단백질 키나아제의 효과적인 저해제이다 (IC50= 10 내지 30 nM).
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 키나아제 저해제 K252b 이다. K252b 는 노카르디오피시스 종 (Nocardiopisis sp.) 토양 진균으로부터 단리된 알칼로이드이다. 이것은 K252a 세포-투과성 단백질 키나아제 저해제의 보다 덜 강력한 유도체이다. 상기 화합물은 알려지지 않은 메카니즘에 의해 특정 뉴런에서의 뉴로트로핀-3 활성을 강화시킨다.
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 키나아제 저해제 스타우로스포린이다. 스타우로스포린은 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 성상포자에 의해 생성된 진균 알칼로이드의 K252a 계열의 일원이다. 이것은 단백질 키나아제의 가장 강력한, 세포 투과성 저해제 (IC50=0.7-20 nM) 중 하나이다.
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 키나아제 저해제 켈레리트린이다. 켈레리트린은 PKC 의 촉매성 도메인에 결합하는 단백질 키나아제 C 의 강력한, 세포-투과성 저해제 (IC50=66O nM) 이다. 켈레리트린은 다른 키나아제보다 PKC 에 대해 100 배 이상 더욱 선택적이다.
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 키나아제 저해제 SB216763 이다. SB216763 (3-(2,4-디클로로페닐)-4-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온) 은 GSK-3 활성을 억제하는 투과성의, 구조적으로 구별되는 말레이미드이다. GSK-3β 의 상기 강력하고 선택적인 저해제 (IC50= 34 nM) 는 인간 간 세포에서 글리코겐 합성을 촉진하고 인슐린의 다른 작용을 모방한다.
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 키나아제 저해제 TDZD-8 (4-벤질-2-메틸-1,2,4-티아디아졸리딘-3,5-디온-8) 이다. TDZD-8 은 GSK-3 의 선택적 저해제, 티아디아졸리디논 유도체, GSK-3β의 비-ATP 경쟁적 저해제 (IC50=2 μM) 이다. 이것은 Cdk-1/사이클린 B, CKII, PKA, 또는 PKC 를 100 μM 에서 저해하지 않는다. 일부 이러한 구현예에 따르면, TDZD 의 농도는 약 2x10-5 mol/L 이다.
또다른 구현예에 따르면, 렙틴 조성물의 치료학적 유효량은 약 0.0001 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 100 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.0005 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 100 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.001 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 100 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.002 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 95 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.003 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 95 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.004 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 95 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.005 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 95 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.006 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 95 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.007 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 95 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.008 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 95 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.009 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 95 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 95 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 90 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 85 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 80 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 75 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 70 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 65 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 60 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 55 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 50 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 45 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 40 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 35 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 30 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 25 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 20 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 15 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 10 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 5 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 4 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 3 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 2 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 1 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 500 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 250 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 100 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 50 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 25 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 10 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 5 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 치료학적 유효량은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 1 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다.
(2). 인지 기능 회복력의 개선 방법
또다른 양상에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에서의 인지 기능 회복력의 개선 방법을 제공한다:
(a) 하기 (i) 내지 (iii) 을 포함하는 렙틴 조성물을 대상에게 투여하는 단계:
(i) 제 1 치료제로서의 렙틴 또는 렙틴 유사체의 인지 기능을 향상시키는 양;
(ii) 임의로, 하나 이상의 임의의 제 2 치료제; 및
(iii) 약학적으로 허용가능한 담체;
(b) 대상에서 인지 기능 회복력을 개선시키는 단계.
또다른 구현예에 따르면, 렙틴 또는 렙틴 유사체는 렙틴, 치료학적으로 활성인 렙틴 조각, 렙틴 모방체, 렙틴 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 렙틴 조성물은 하나 이상의 임의의 제 2 치료제를 추가로 포함한다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 임의의 제 2 치료제는 키나아제 저해제이다. 또다른 구현예에 따르면, 임의의 제 2 치료제는 항생제이다. 또다른 구현예에 따르면, 임의의 제 2 치료제는 항진균제이다. 또다른 구현예에 따르면, 임의의 제 2 치료제는 항바이러스제이다. 또다른 구현예에 따르면, 임의의 제 2 치료제는 항원충제이다. 또다른 구현예에 따르면, 임의의 제 2 치료제는 스테로이드성 항염증제이다. 또다른 구현예에 따르면, 임의의 제 2 치료제는 비-스테로이드성 항염증제이다. 또다른 구현예에 따르면, 임의의 제 2 치료제는 항산화제이다. 또다른 구현예에 따르면, 임의의 제 2 치료제는 호르몬이다. 또다른 구현예에 따르면, 임의의 제 2 치료제는 비타민이다. 또다른 구현예에 따르면, 임의의 제 2 치료제는 항히스타민제이다. 또다른 구현예에 따르면, 임의의 제 2 치료제는 화학요법제이다.
또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.0001 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 100 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.0005 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 100 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.001 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 100 g/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.002 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg /kg 체중 내지 약 100 g/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.003 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg /kg 체중 내지 약 100 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.004 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 100 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.005 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 100 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.006 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 100 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.007 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 100 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.008 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 100 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.009 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 100 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 95 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 90 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 85 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 80 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 75 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 70 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 65 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 60 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 55 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 50 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 45 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 40 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 35 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 30 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 25 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 20 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 15 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 10 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 5 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 4 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 3 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 2 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 1 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg 체중 내지 약 500 g/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g/kg 체중 내지 약 250 g/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg /kg 체중 내지 약 100 g/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg /kg 체중 내지 약 50 g/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg /kg 체중 내지 약 25 g/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg /kg 체중 내지 약 10 g/kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g/kg 체중 내지 약 5 g 의 렙틴 또는 렙틴 유사체/kg /kg 체중이다. 또다른 구현예에 따르면, 인지 기능을 향상시키는 양은 약 0.01 g/kg 체중 내지 약 1 g/kg 체중이다.
또다른 구현예에 따르면, 렙틴 조성물의 인지 기능을 향상시키는 양은 매일 투여된다. 또다른 구현예에 따르면, 렙틴 조성물의 인지 기능을 향상시키는 양은 매주 투여된다. 또다른 구현예에 따르면, 렙틴 조성물의 인지 기능을 향상시키는 양은 매달 투여된다.
또다른 구현예에 따르면, 렙틴 조성물의 인지 기능을 향상시키는 양은 인지 기능을 향상시키며, 인지 기능은 기억력이다. 일부 구현예에 따르면, 렙틴 조성물의 인지 기능을 향상시키는 양은 인지 기능을 향상시키며, 인지 기능은 조건 기억력이다. 일부 구현예에 따르면, 렙틴 조성물의 인지 기능을 향상시키는 양은 인지 기능을 향상시키며, 인지 기능은 맥락 기억력이다.
또다른 구현예에 따르면, 렙틴 조성물의 인지 기능을 향상시키는 양은 인지 기능을 향상시키며, 인지 기능은 학습력이다. 일부 구현예에 따르면, 렙틴 조성물의 인지 기능을 향상시키는 양은 인지 기능을 향상시키며, 인지 기능은 맥락 학습력이다. 일부 구현예에 따르면, 렙틴 조성물의 인지 기능을 향상시키는 양은 인지 기능을 향상시키며, 인지 기능은 조건 학습력이다.
또다른 구현예에 따르면, 렙틴 조성물의 인지 기능을 향상시키는 양은 인지 기능을 향상시키며, 인지 기능은 기억력 유지이다.
일부 구현예에 따르면, 본래의 인지 기능 수준에 대해 인지 기능을 개선시키는 것은 본래의 인지 기능 수준의 약 10% 이상이다. 일부 구현예에 따르면, 본래의 인지 기능 수준에 대해 인지 기능을 개선시키는 것은 본래의 인지 기능 수준의 약 25% 이상이다. 일부 구현예에 따르면, 본래의 인지 기능 수준에 대해 인지 기능을 개선시키는 것은 본래의 인지 기능 수준의 약 50% 이상이다. 일부 구현예에 따르면, 본래의 인지 기능 수준에 대해 인지 기능을 개선시키는 것은 본래의 인지 기능 수준의 약 75% 이상이다.
(1). Tau 인산화를 감소시키기 위한 조성물
본 발명의 또다른 양상에 따르면, tau 인산화를 감소시키기 위한 본 발명의 조성물은 하기 (a) 내지 (c) 를 포함한다:
(a) 렙틴 또는 렙틴 유사체;
(b) 하나 이상의 키나아제 저해제를 포함하는 임의의 제 2 치료제, 하나 이상의 키나아제 저해제는 키나아제 저해 양으로 존재함; 및
(c) 담체;
본 조성물은 하나 이상의 키나아제의 저해를 성분 (a), (b) 및 (c) 의 합을 초과하는 수준으로 제공함.
하나의 구현예에 따르면, 렙틴 또는 그의 렙틴 유사체는 렙틴, 치료학적으로 활성인 렙틴 조각, 렙틴 모조체 또는 렙틴 모방체, 또는 렙틴 유도체 중 하나 이상이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 렙틴 유도체는 렙틴 펩티드, 또는 렙틴 펩티드 조각이다.
또다른 구현예에 따르면, 렙틴 또는 그의 렙틴 유사체는 렙틴 또는 렙틴 유사체의 약학적으로 허용가능한 염이다.
하나의 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 칼슘/칼모둘린-의존성 단백질 키나아제 II 의 키나아제 저해제, 단백질 키나아제 A 의 키나아제 저해제 및 GSK-3β 의 키나아제 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 키나아제 저해제이다.
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 칼슘/칼모둘린-의존성 단백질 키나아제 II (CAMK2A; Myr-AIP) 의 저해제이다. 또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 단백질 키나아제 A (PKA, cAMP-의존성 단백질 키나아제) 의 키나아제 저해제이다. 또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 GSK-3β 의 키나아제 저해제이다.
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 Myr-AIP, LiCl 및 KT5720 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 키나아제 저해제이다.
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 키나아제 저해제 염화리튬 (LiCl) 이다. 염화리튬은 저해성 Ser9 잔기의 인산화를 증가시킴으로써 GSK-3β 활성 (IC50= 5 mM) 를 약화시킨다. 일부 이러한 구현예에 따르면, LiCl 농도는 약 5x10-2 mol/L 내지 약 1 mmol/L 이다.
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 키나아제 저해제 6-브로모인디루빈-3'-옥심 ((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심) (BIO) 으로 강력하고, 가역적이고, TP-경쟁적 GSK-3β 저해제이다.
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 키나아제 저해제 KT5720, K525a 의 세포-투과성, 반합성 유도체, 및 cAMP-의존성 단백질 키나아제의 선택적 저해제 (PKA; IC50=56 nM) 이다.
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 K252a, 스타우로스포린, KT5252b 및 켈레리트린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 키나아제 저해제이다.
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 키나아제 저해제 K252a, ATP 유사체 및 CaM 키나아제 및 포스포릴라아제 키나아제의 매우 강력한 세포 투과성 저해제 (IC50=1.8 nM 및 1.7 nM, 각각) 이고, 더 높은 농도에서, 이것은 또한 세린/트레오닌 단백질 키나아제의 효과적인 저해제이다 (IC50= 10 내지 30 nM).
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 키나아제 저해제 K252b 로서, 이는 노카르디오피시스 종 (Nocardiopisis sp.) 토양 진균으로부터 단리된 알칼로이드이며, 알려지지 않은 메카니즘에 의해 특정 뉴런에서의 뉴로트로핀-3 활성을 강화시키는 K252a 세포-투과성 단백질 키나아제 저해제의 보다 덜 강력한 유도체이다.
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 단백질 키나아제의 세포 투과성 저해제 (IC50=0.7 nM 내지 20 nM) 인 키나아제 저해제 스타우로스포린이다.
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 키나아제 저해제 켈레리트린으로, PKC 의 촉매성 도메인에 결합하는 단백질 키나아제 C (PKC) 의 강력한, 세포-투과성 저해제 (IC50=66O nM) 이다. 또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 키나아제 저해제 SB216763 (3-(2,4-디클로로페닐)-4-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온) 으로, GSK-3β 를 선택적으로 저해하는 (IC50= 34 nM) 투과성의, 구조적으로 구별되는 말레이미드이고, 인간 간 세포에서 글리코겐 합성을 촉진하고 인슐린의 다른 작용을 모방한다.
또다른 구현예에 따르면, 하나 이상의 키나아제 저해제는 키나아제 저해제 TDZD-8 (4-벤질-2-메틸-1,2,4-티아디아졸리딘-3,5-디온-8) 으로, Cdk-1/사이클린 B, CKII, PKA, 또는 PKC 를 100 μM 에서 저해하지 않는 GSK-3β 의 비-ATP 경쟁적 저해제 (IC50=2 μM) 이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, TDZD 의 농도는 약 2x10-5 mol/L 이다.
또다른 구현예에 따르면, 담체는 약학 담체이다.
조성물
본원에 기재된 조성물은 치료학적 유효량으로 전달된다. 본원에서 제공되는 교시와 함께, 다양한 활성 화합물 중에서 선택하고, 효력, 상대적 생체이용률, 환자의 체중, 부작용의 심각도 및 바람직한 투여 방식 등의 요소들을 고려함으로써, 심각한 독성을 일으키지 않으나 특정 대상을 치료하는데 효과적인, 유효한 예방 또는 치료 요법들을 계획할 수 있다. 임의의 특정 적용을 위한 유효량은 치료되는 질병 또는 상태, 투여되는 특정한 치료학적으로 활성인 렙틴 또는 렙틴 유사체 및 임의의 제 2 치료제, 대상의 크기, 또는 질환 또는 상태의 심각도와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 당업자는 특정 렙틴 조성물 및/또는 기타 치료제의 유효량을 필요 이상의 지나친 실험 없이 결정할 수 있다. 일반적으로 사용되는 최대 투여량, 즉, 일부 의사의 판단에 따라 가장 안전한 복용량이 바람직하다. "복용량" 및 "투여량" 은 본 출원에서 교환적으로 사용된다.
본원에 기재된 임의의 혼합물의 경우 치료학적 유효량은 일차적으로 시험관 내 연구 및/또는 동물 실험을 통해 앞서 결정될 수 있다. 치료학적 유효 투여량은 또한 인간에서 시험된 적이 있는 렙틴 또는 렙틴 유사체 및 임의의 제 2 치료제에 대한, 및 다른 관련된 활성제와 같은 유사한 약리학적 활성을 나타내는 것으로 알려진 화합물에 대한 인간 데이터로부터 결정될 수 있다. 적용된 투여량은 투여된 화합물 또는 조성물의 관련된 생물학적 이용성과 효능에 근거하여 조정될 수 있다. 상기 기재된 방법 및 당업계에 잘 알려진 다른 방법에 근거하여 최대 효과를 거둘 수 있도록 투여량을 조정하는 것은 충분히 당업자의 능력 내에서 이루어질 수 있다.
렙틴 또는 렙틴 유사체 및 임의의 제 2 치료제를 포함하는 렙틴 조성물의 제형은 약학적으로 허용가능한 농도의 염, 완충제, 방부제, 호환성 담체, 항원보강제, 및 임의로 기타 치료적 성분을 정규적으로 함유할 수 있는 약학적으로 허용가능한 용액으로 투여될 수 있다.
요법에서 사용하기 위해, 렙틴 또는 렙틴 유사체 및 임의의 제 2 치료제를 포함하는 렙틴 조성물의 유효량은 원하는 표면으로 렙틴 조성물을 전달하는 임의의 방식에 의해 대상에게 투여될 수 있다. 약학 조성물의 투여는 당업자에게 알려진 임의의 방식에 의해 달성될 수 있다. 투여 경로에는 경막내, 동맥내, 비경구 (예를 들어, 정맥내), 또는 근육내, 경구, 구강내, 비강내, 직장내 또는 국소적이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
저해제 및 다른 치료제는 NFT 또는 Aβ 의 축적으로부터 기인하는 병리학의 근원적인 상태 또는 증상을 치료하기 위해 수술 동안 대상에게 전달될 수 있다.
경구용 조성물
본 발명의 조성물은, 예를 들어, 정제, 트로키, 마름모꼴 정제, 수성 또는 유성 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐, 또는 시럽 또는 엘릭시르의 경구 용도에 적합한 형태일 수 있다. 본원에서 사용되는 "경구" 또는 "경구로" 라는 용어는 입에 의해 신체 내로 도입되는 것을 말하며, 이 과정 동안 다음 신체 부위 중 하나 이상에서 흡수가 일어난다: 입, 위, 소장, 폐 (또한 특히 흡입으로도 언급됨), 및 혀 밑의 미세 혈관들 (또한 특히 설하로도 언급됨). 경구용으로 의도되는 조성물은 임의의 공지된 방법에 따라 제조될 수 있으며, 이러한 조성물은 약학적으로 세련되고 맛이 좋은 제제를 제공하기 위해 감미제, 향제, 착색제, 및 방부제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 작용제를 함유할 수 있다. 정제는 유효 성분(들) 과, 정제 제조에 적합한 무독성인 약학적으로 허용가능한 부형제를 함께 함유할 수 있다. 이러한 부형제는 예를 들어, 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토오스, 인산칼슘, 또는 인산나트륨과 같은 비활성 희석제; 과립화제 및 붕해제, 예를 들어, 옥수수 전분 또는 알긴산; 결합제, 예를 들어, 전분, 젤라틴, 또는 아카시아; 및 윤활제, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 활석일 수 있다. 정제는 코팅되지 않을 수 있고 또는 이들은 붕해나 장관내 흡수를 지연시키기 위해 알려진 기술에 의해 코팅되어 장기간 동안에 걸쳐 지속적인 효과를 제공할 수도 있다. 예들 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연 물질이 사용될 수 있다. 이들은 또한 조절 방출을 위해서 코팅될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 또한 유효 성분(들) 이 비활성 고체 희석제 (예를 들어, 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린) 와 혼합된 경질 젤라틴 캡슐, 또는 유효 성분(들) 이 물 또는 유성 매질 (예를 들어, 땅콩유, 액체 파라핀, 또는 올리브유) 와 혼합된 연질 젤라틴 캡슐로서 경구 용도를 위해 제형화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 유효 성분(들) 이 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼련된 수성 현탁액으로서 제형화될 수 있다. 이러한 부형제는, 예를 들어, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시-프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 및 검 아카시아 같은 현탁화제이고, 분산제 또는 습윤제는 레시틴과 같은 자연 발생적 인지질, 또는 폴리옥시에틸렌 스테아레이트와 같은 지방산과 알킬렌 옥시드의 축합 생성물, 또는 헵타데카에틸-에네옥시세타놀과 같은 장쇄 지방족 알코올과 에틸렌 옥시드의 축합 생성물, 또는 지방산과 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트 같은 헥시톨에서 유래한 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물, 또는 지방산과 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트와 같은 헥시톨 무수물에서 유래된 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물일 수 있다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향제, 및 수크로오스 또는 사카린과 같은 하나 이상의 감미제를 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 유효 성분을 땅콩유, 올리브유, 참기름, 또는 코코넛 오일과 같은 식물성 오일, 또는 액상 파라핀과 같은 광유에 현탁함으로써 유성 현탁액으로서 제형화할 수 있다. 유성 현탁액은, 예를 들어, 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알코올과 같은 증점제를 함유할 수 있다. 상기 기재된 바와 같은 감미제 및 향제는 맛이 좋은 경구용 제제를 제공하기 위해 첨가될 수 있다. 이러한 조성물은 아스코르브산과 같은 항산화제의 첨가를 통해서 보존될 수 있다.
본 발명의 조성물은 물의 첨가에 의해 수성 현탁액의 제조에 적합한 분산성 분말 및 과립의 형태로 제형화될 수 있다. 이러한 분말 및 과립 내의 유효 성분은 분산제 또는 습윤제, 현탁화제, 및 하나 이상의 방부제와 함께 혼련물로 제공된다. 적합한 분산제 또는 습윤제, 및 현탁화제는 이미 상기 언급된 바와 같은 것에 의해 예시하였다. 부가적인 부형제, 예를 들어, 감미제, 향제, 및 착색제가 또한 존재할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 에멀젼의 형태일 수 있다, 에멀젼은 두 가지의 서로 섞이지 않는 액체 담체를 조합하여 제조되는 2 상 시스템으로서, 그 중 하나는 다른 액체 담체에 균일하게 분포되고 가장 큰 콜로이드 입자의 직경 이상의 직경을 갖는작은 구상체로 이루어진다. 구상체 크기는 중요하며 시스템이 최대 안정성을 획득할 정도의 크기여야만 한다. 보통, 두 상의 분리는 3 번째 물질인 유화제가 혼입되지 않는 한 일어나지 않을 것이다. 따라서, 기본 에멀젼은 적어도 세 가지의 구성요소, 두 가지의 서로 섞이지 않는 액체 담체 및 유화제, 및 유효 성분을 포함한다. 대부분의 에멀젼은 비-수성상 내로 수성상이 도입된다 (역도 성립함). 그러나, 기본적으로 비수성인 에멀젼을 제조하는 것도 가능한데, 예를 들면, 비수성의 혼합되지 않은 시스템 글리세린 및 올리브유의 음이온성 및 양이온성 계면활성제가 그러하다. 따라서, 본 발명의 조성물은 수중유 에멀젼의 형태일 수 있다. 유상은 올리브유 또는 땅콩유와 같은 식물성 오일, 또는 액체 파라핀과 같은 광유, 또는 이의 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제는 아카시아 검 또는 트래거캔스 고무, 대두, 레시틴관 같은 자연 발생적 인지질, 및 예를 들어 소르비탄 모노올레에이트와 같은 지방산과 헥시톨 무수물에서 유래한 에스테르 또는 부분 에스테르, 및 예를 들어 폴리옥시 에틸렌 소르비탄 모노올레에이트와 같은 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물일 수 있다. 또한 에멀젼은 감미제와 향제를 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 시럽 및 엘릭시르로서 제형화될 수 있다. 시럽 및 엘릭시르는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨 또는 수크로오스와 같은 감미제로 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 또한 진통제, 방부제, 및 향제 및 착색제를 함유할 수 있다. 진통제는 특히 점막 또는 찰과상 (찢어지거나 베인 것을 의미) 조직의 염증을 가라앉히는데 주로 사용되는 보호제이다. 많은 화학약품이 진통제 특성을 가지고 있다. 이러한 성분에는 알기네이트, 아교, 검, 덱스트린, 전분, 특정 당, 및 중합체성 폴리히드릭 글리콜이 포함된다. 다른 성분에는 아카시아, 한천, 벤조인, 카보머, 젤라틴, 글리세린, 히드록시에틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 프로필렌 글리콜, 알긴산 나트륨, 트래거캔스 고무, 히드로겔 등이 포함된다.
구강용 조성물
구강 투여를 위해서, 본 발명의 조성물은 통상의 방법에 의해 제형화된 정제 또는 마름모꼴 정제의 형태를 취할 수 있다.
비경구용 조성물
본 발명의 조성물은 살균된 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 형태일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "비경구" 라는 용어는 주사를 통해 신체 내로 도입하는 것을 지칭하는데, 예를 들면, 피하주사 (즉, 피부 밑으로의 주사), 근육주사 (즉, 근육내로의 주사), 정맥주사 (즉, 정맥 혈관 내로의 주사), 경막내 주사 (즉, 척수 주위의 공간으로의 주사), 비강내 주사, 또는 주입 기술들을 포함한다. 비경구로 투여되는 본 발명의 조성물은 예를 들어, 수술용 바늘과 같은 바늘을 이용하여 전달된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "수술용 바늘" 과 같은 용어는 본 발명의 조성물의 유체 (즉, 흐를 수 있는) 의 선택된 해부학적 구조 내로 전달하기 위해 채택된 임의의 바늘을 말한다. 예를 들어, 살균된 주사용 수성 또는 유성 현탁액과 같은 주사 제제는 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 따라 제형화될 수 있다.
국부적으로 전달하는 것이 바람직한 경우 렙틴 조성물은 예를 들어, 일시 주사 또는 연속 주입과 같은 주사에 의한 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 예를 들어, 앰플 내에 또는 다중-투여량 용기 내에 (방부제 첨가) 단위 투여량 형태로 제조될 수 있다. 조성물은 현탁액, 용액, 또는 유성 또는 수성 비히클 내의 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있으면, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 비경구 투여용의 약학 제형에는 수용성 형태의 활성 화합물의 수용액이 포함된다. 부가적으로는, 활성 화합물의 현탁액은 적합한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클에는 참기름과 같은 지방산, 또는 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드, 또는 리포좀과 같은 합성 지방산 에스테르가 포함된다. 수성 주사 현탁액은 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점도를 증가시키는 성분을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁액은 또한 적합한 안정화제 또는 고농도 용액의 제조를 가능하게 하기 위한 화합물의 가용성을 증가시키기 위한 작용제를 함유할 수 있다. 대안적으로는, 활성 화합물은 사용 전에, 예를 들어, 살균된 발열물질이 들어있지 않은 물과 같은 적합한 비히클로 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.
약학 조성물은 또한 적합한 고체 또는 젤 상 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 담체의 예에는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당, 전분, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
적합한 액체 또는 고체 약학 제제 형태는 예를 들어, 마이크로캡슐화 (적합한 경우, 하나 이상의 부형제와 함께), 나선형으로 만들기, 미세한 금 입자 상에 코팅하기, 리포좀 내 함유시키기, 조직 내로의 이식용 펠렛 또는 조직 내로 문지르기 위한 물질의 표면에 건조시켜진 것이 있다. 이러한 약학 조성물은 또한 과립, 비이드, 분말, 정제, 코팅된 정제, (미세)캡슐, 좌약, 시럽, 에멀젼, 현탁액, 크림, 방울 또는 활성 화합물의 연장된 방출 제제의 형태일 수 있으며, 붕해제, 결합제, 코팅제, 팽창제, 윤활제 또는 가용화제와 같은 제제 부형제 및 첨가제 및/또는 보조제가 상기 기재된 바와 같이 일반적으로 사용된다. 약학 조성물은 다양한 약물 전달 시스템에서 사용하기에 적합하다. 약물 전달을 위한 방법들의 간단한 리뷰를 위해서는 본원에 참조로서 인용된 문헌 [Langer 1990 Science 249, 1527-1533] 을 참조한다.
렙틴 또는 렙틴 유사체 및 임의의 제 2 치료제를 포함하는 렙틴 조성물은 그 자체로 (순수하게) 또는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 투여될 수 있다. 의약에서 사용되는 경우, 염은 약학적으로 허용가능해야만 하나, 비-약학적으로 허용가능한 염은 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제조하기 위해 편리하게 사용될 수 있다. 이러한 염에는 하기 산으로부터 제조되는 것이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다: 염산, 브롬화 수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, p-톨루엔 술폰산, 타르타르산, 시트르산, 메탄 술폰산, 포름산, 말론산, 숙신산, 나프탈렌-2-술폰산, 및 벤젠 술폰산. 또한, 이러한 염은 카르복실산기의 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염과 같은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염으로서 제조될 수 있다. "약학적으로 허용가능한 염" 이라는 용어는 정상적인 의학적 판단의 범위 안에서 지나친 독성, 염증, 알러지 반응 등이 없이, 합리적인 유익성/위험성 비와 일치하는, 인간 및 하등 동물의 조직에 접촉하여 사용하기에 적합한 염을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 염은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 염은 문헌 "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use" (Wiley VCH, Zurich, Switzerland: 2002) 에 자세히 기술되어 있다. 염은 본 발명 내 기술된 화합물의 최종 단리 및 정제 과정 동안 그 자리에서 제조되거나 또는 적합한 유기산과 자유 염기 작용기를 반응시켜 개별적으로 제조될 수 있다. 대표적인 산 부가 염에는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 비술페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르술포네이트, 디글루코네이트, 글리세로포스페이트, 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 푸마레이트, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로요오다이드, 2-히드록시에탄술포네이트 (이세티오네이트), 락테이트, 말레에이트, 메탄술포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 포스페이트, 글루타메이트, 비카르보네이트, p-톨루엔술포네이트 및 운데카노에이트가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 염기성 질소-함유기 저급 알킬 할라이드, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 및 부틸 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드; 디알킬 술페이트, 예컨대 디메틸, 디에틸, 디부틸 및 디아밀 술페이트s; 장쇄 할라이드, 예컨대 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드; 아릴알킬 할라이드, 예컨대 벤질 및 페네틸 브로마이드 및 기타와 같은 작용제로의 4 차화될 수 있다. 수성 또는 유성 또는 분산성 생성물은 그렇게 수득된다. 약학적으로 허용가능한 산 부가 염을 형성하기 위해 사용될 수 있는 산의 예에는 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산과 같은 무기산 및 옥살산, 말레산, 숙신산, 및 시트르산과 같은 유기산이 포함된다. 염기 부가 염들은 본 발명에 기술된 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 카르복실산-함유 부분과 약학적으로 허용가능한 금속 양이온의 수산화물, 탄산염, 또는 중탄산염과 같은 적합한 염기와 반응시키거나 또는 암모니아 또는 유기 일차, 이차, 또는 삼차 아민과 반응시켜 그 자리에서 제조될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염에는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속에 기반한 양이온, 예컨대 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 및 알루미늄 염 등 및 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 디에틸아민, 에틸아민 등을 포함하는 무독성 4 차 암모늄 및 아민 양이온이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. 염기 부가 염을 형성하는데 유용한 다른 대표적인 유기 아민에는 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페리딘, 피페라진 등이 포함된다. 약학적으로 허용가능한 염은 또한 당업계에 잘 알려진 표준 절차를 이용하여 수득될 수 있는데, 예를 들어, 아민과 같은 충분히 염기성을 띠는 화합물을 생리적으로 허용가능한 음이온을 제공하는 적합한 산과 반응시켜 수득될 수 있다. 또한 카르복실산의 알칼리 금속 (예를 들어, 나트륨, 칼륨, 또는 리튬) 또는 알칼리 토금속 (예를 들어, 칼슘 또는 마그네슘) 염들 또한 만들어 질 수 있다.
제형은 편리하게 단위 투여량 형태로 제조되거나 약학 업계에서 잘 알려진 방법 중 임의의 것을 이용하여 제조될 수 있다. 모든 방법은 렙틴 또는 렙틴 유사체 및 임의의 제 2 치료제 ("활성 화합물") 를 포함하는 렙틴 조성물을 하나 이상의 보조제로 구성되는 담체와 결부시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성제를 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 모두와 균일하고 가까이 결부시킴으로써, 그리고 필요하다면, 생성물을 바람직한 제형으로 성형함으로써 제조된다.
약제 또는 그의 약학적으로 허용가능한 에스테르, 염, 용매화물, 또는 전구약물은 원하는 활성을 손상시키지 않는 다른 활성 물질과 또는 원하는 활성을 보충할 수 있는 물질과 혼합될 수 있다. 비경구용, 피부내, 피하, 구강내, 또는 국소 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액에는 예를 들어, 하기 성분이 포함될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다: 주사용수, 식염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜들, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매와 같은 살균된 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항생제; 아스코르브산 또는 나트륨 비술파이트와 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 긴장 조절제. 비경구용 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 투여량 바이알에 봉해 넣을 수 있다. 정맥내 투여시, 특정 담체는 생리 식염수 또는 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 이다.
비경구용 주사 용의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 살균된 수성 또는 비-수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼과 살균된 주사용액 또는 현탁액으로 재구성하기 위한 살균된 분말을 포함한다. 용액은 일반적으로 2 이상의 성분의 균질 혼합물로서 간주되고, 이것은 종종 반드시 그럴 필요는 없으나 액체이다. 용액에서, 용질 (또는 용해된 성분) 분자는 용매 중에 균일하게 분포되어 있다. 현탁액은 미분된 종류가 또다른 종류와 혼합되어 있는 분산액 (혼합물) 으로서, 상기 미분된 종류는 미분되고 혼합되어 빠르게 정치되지 않는 것이다. 매일의 일상에서, 가장 흔한 현탁액은 액체 물 중의 고체이다. 적합한 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매, 또는 비히클의 예에는 물, 에탄올, 폴리올 (프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤 등), 그들의 적합한 혼합물, 식물성 오일 (예컨대 올리브유) 및 에틸 올레에이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르가 포함된다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 사용해서, 분산제의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면 활성제를 사용함으로써 유지될 수도 있다.
이러한 조성물은 또한 방부제, 습윤제, 유화제, 및 분산제를 비롯한 항원보강제 포함할 수 있다. 미생물 활동은 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등과 같은 다양한 항생제 및 항진균제에 의해 안전하게 방지될 수 있다. 또한, 예를 들어 당, 염화나트륨 등과 같은 등장화제를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사 가능한 약학 형태의 지속적인 흡수는 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 사용하여 가능할 수 있다.
현탁액은 활성 화합물 외에도 예를 들어 에톡시화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미세결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 한천-한천, 트래거캔스 고무, 및 이들의 혼합물과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
주사가능한 저장소 형태는 폴리락타이드-폴리글리콜라이드와 같은 생분해성 중합체 내 약물의 마이크로캡슐화된 매트릭스를 형성함으로써 제조된다. 약물 대 중합체의 비 및 사용되는 특정 중합체의 특성에 따라 약물 방출 속도가 조절될 수 있다. 그러한 장시간 작용하는 제형은 적합한 중합체성 또는 소수성 물질 (예를 들어, 허용가능한 오일 내의 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지 또는, 예를 들어, 거의 용해되지 않는 염과 같은, 거의 용해되지 않는 유도체와 함께 제형화될 수 있다. 생분해성 중합체의 예에는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물) 이 포함된다. 저장소 주사용 제형은 또한 신체 조직에 적합한 리포좀 또는 마이크로에멀젼 내에 약물을 포획시킴으로써 제조될 수 있다.
국소적으로 주사 가능한 제형은 사용 직전에 예를 들어, 세균을 거르는 필터를 이용해 여과하거나 살균된 물 또는 다른 살균된, 주사 가능한 매질에 용해되거나 분산될 수 있는 살균된 고체 조성물 형태의 살균제를 도입함으로써 살균될 수 있다. 주사 가능한 제제, 예를 들어, 살균된 주사 가능한 수성 또는 유성의 현탁액 은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 이용한 당업계에서 알려진 방법에 따라 제형화될 수 있다. 살균된 주사 가능한 제제는 또한 무독성인, 비경구적으로 허용가능한 희석액 또는 1,3-부탄디올 중 용액 같은 용매 내 살균된 주사 가능한 용액, 현탁액, 또는 에멀젼일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매에는, 물, 링거액, U.S.P. 및 등장액 염화나트륨 용액이 있다. 부가적으로, 살균된, 고정유가 용매 또는 현탁화 매질로서 통상적으로 사용된다. 이러한 목적으로 임의의 자극이 없는 고정유, 예를 들어, 합성 모노- 또는 디-글리세라이드 등이 사용될 수 있다. 부가적으로, 올레산과 같은 지방산도 주사용 제제에 사용된다.
비경구 (피하, 피부내, 근육내, 정맥내, 구강내 및 관절내 투여를 포함하나 이에 한정되지는 않는) 투여용 제형은 항산화제, 완충제, 항생제, 및 의도되는 수용자의 혈액 내와 등장용액인 제형을 가능하게 하는 용질 등을 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액; 및 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제형은 단위-복용량 또는 복합-복용량 복용량 용기 내에, 예를 들어, 밀봉된 앰플 및 바이알에 제시될 수 있고, 예를 들어, 사용 전 즉시 식염수, 주사용수와 같은 멸균 액체 담체를 첨가하는 것만을 필요로 하는 동결-건조 상태로 저장될 수 있다. 임시 주사용액 및 현탁액은 이전에 기재된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
본원에 기재된 조성물의 또다른 제형화 방법은 본원에 기재된 화합물을 수-용해도를 증가시키는 중합체에 공액시키는 것과 관계가 있다. 적합한 중합체의 예에는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리-(d-글루탐산), 폴리-(1-글루탐산), 폴리-(d-아스파르트산), 폴리-(1-아스파르트산), 및 이들의 공중합체가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 분자량 약 5,000 내지 약 100,000, 분자량 약 20,000 내지 약 80,000 의 폴리글루탐산이 사용될 수 있고, 분자량 약 30,000 내지 약 60,000 의 폴리글루탐산이 역시 사용될 수 있다.
적당한 완충제에는 아세트산 및 염 (1-2% w/v); 시트르산 및 염 (1-3% w/v); 붕산 및 염 (0.5-2.5% w/v); 및 인산 및 염 (0.8-2% w/v) 이 포함된다. 적합한 방부제에는 벤즈알코늄 클로라이드 (0.003-0.03% w/v); 클로로부탄올 (0.3-0.9% w/v); 파라벤 (0.01-0.25% w/v), 및 티머로살 (0.004-0.02% w/v) 이 포함된다.
렙틴 또는 렙틴 유사체 및 임의의 제 2 치료제를 포함하는 렙틴 조성물은 입자로 제공될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "입자" 라는 용어는 렙틴 또는 렙틴 유사체 및 임의의 제 2 치료제를 포함하는 렙틴 조성물을 전체적으로 또는 부분적으로 함유할 수 있는 나노- 또는 마이크로입자 (또는 일부 예에서는 더 크다) 를 말한다. 입자는 렙틴 또는 렙틴 유사체 및 임의의 제 2 치료제를 코팅에 의해 둘러싸인 코어에 함유할 수 있다. 또한 렙틴 또는 렙틴 유사체 및 임의의 제 2 치료제는 입자 전체에 분산되어 있을 수 있다. 렙틴 또는 렙틴 유사체 및 임의의 제 2 치료제는 또한 입자 내에 흡착될 수 있다. 입자는 임의의 순차 방출 속도로 방출될 수 있는데, 이것들은 영차 방출, 1차 방출, 2차 방출, 지연 방출, 지속적인 방출, 즉각 방출 등 및, 이의 임의의 조합을 포함한다. 입자는 렙틴 또는 렙틴 유사체 및 임의의 제 2 치료제 외에, 의약학 업계에서 통상적으로 사용되는 임의의 모든 물질들을 포함할 수 있으며, 여기에는 침식성, 비-침식성, 생분해성, 혹은 비-생분해성 물질 또는 이들의 조합이 포하되나 이에 제한되지 않는다. 입자는 렙틴 또는 렙틴 유사체 및 임의의 제 2 치료제를 용액 혹은 반고체 상태로 함유하는 마이크로캡슐일 수 있다. 입자는 사실상 임의의 형태일 수 있다.
비-생분해성 및 생분해성 중합체성 물질 모두는 렙틴 또는 렙틴 유사체 및 임의의 제 2 치료제를 전달하는 입자의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 중합체는 천연 또는 합성 중합체일 수 있다. 중합체는 의도하는 방출되는 시간 주기에 근거해서 선택된다. 특히 관심이 가는 생체 결합성 중합체는 그 교시가 본원에 인용된 문헌 [Sawhney et al in Macromolecules (1993) 26, 581-587] 에 의해 기재된 생침식성 히드로겔을 포함한다. 여기에는 폴리히알루론산, 카세인, 젤라틴, 글루틴, 폴리무수물, 폴리아크릴산, 알기네이트, 키토산, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸 메타크릴레이트), 폴리(부틸메타크릴레이트), 폴리(이소부틸 메타크릴레이트), 폴리(헥실메타크릴레이트), 폴리(이소데실 메타크릴레이트), 폴리(라우릴 메타크릴레이트), 폴리(페닐 메타크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 및 폴리(옥타데실 아크릴레이트) 가 포함된다.
통기용 조성물
본 발명의 조성물은 흡입 또는 통기 (입이나 코를 통해서) 에 의한 전달을 위한, 분산 가능한 건조 분말 형태일 수 있다. 건조 분발 조성물은 그 설명이 본원에 참조로서 인용된 국제 특허 공보 번호 WO 91/16038 및 미국 특허 번호 6,921,527 에 기술된 바와 같은 동결건조 및 제트 밀링과 같은 당업계에 알려진 과정을 통해서 제조될 수 있다. 예를 들어, 분사 건조는 약물 및 담체의 균질 수용성 혼합물이 노즐 (예를 들어, 2 개의 유체 노즐), 급회전 디스크 또는 그와 동등한 장치를 통해 뜨거운 기체 스트림 내로 도입되어 미세한 액적을 형성하도록 용액을 미립자로 만드는 과정이다. 수성 혼합물은 용액, 현탁액, 슬러리 등일 수 있으나, 혼합물 및 궁극적으로는 분말 조성물 내 구성성분의 균일한 분포를 확보하기 위해 균질일 필요가 있다. 용매는 (일반적으로 물) 빠르게 액적으로부터 증발하여 약 1 ㎛ 내지 5 ㎛ 의 직경 입자를 가진 미세한 건조 분말을 생성하게 된다. 분사 건조는 흡입가능한 입자 크기, 저습도 함량, 및 신속한 에어로졸화를 가능케 하는 흐름 특성을 가진 균질한 구성물의 사실상 무정형 분말을 만들어내는 조건들 하에서 이루어진다. 바람직하게는 생산된 분말의 입자 크기는 질량의 약 98% 초과가 약 10 ㎛ 이하의 직경을 가진 입자 내에 존재하고, 질량의 약 90% 는 5 ㎛ 미만의 직경을 가진 입자 내에 존재하는 것이다. 대안적으로는, 질량의 약 95% 는 10 ㎛ 미만의 직경을 가진 입자를 가질 것이고, 입자 질량의 약 80% 는 5 ㎛ 미만의 직경을 가진다. 건조 분말 조성물은 또한 그 내용이 본원에 참조로서 인용된 국제 특허 공보 번호 WO 91/16038 에 개시된 바와 같이 동결건조 및 제트 밀링에 의해 제조될 수 있다.
"분산성" 또는 "분산가능한" 이라는 용어는 물 중량 (중량%) 으로 약 10% 미만의 습도 함량을 갖는 건조 분말을 의미하는데, 보통 그 무게는 약 5 중량% 이하 약 3 중량% 미만이며; 입자 크기는 질량 중앙 직경 (mass median diameter, MMD) 약 1.0 내지 5.0 ㎛, 또는 1.0 내지 4.0 ㎛ MMD, 및 약 1.0-3.0 ㎛ MMD 를 가지며; 전달되는 복용량은 약 30% 초과, 약 40% 초과, 약 50% 초과, 및 약 60% 초과이며; 에어로졸 입자 크기 분포는 약 1.0-5.0 ㎛ 의 질량 중앙 공기역학 직경 (mass median aerodynamic diameter, MMAD), 약 1.5-4.5 ㎛ MMAD, 및 약 1.5-4.0 ㎛ MMAD 를 가진다. 분산성을 향상시키기 위한 방법 및 조성물은 그 내용이 본원에 참조로서 인용된 1995년 4월 14일에 출원된 미합중국 특허 출원 일련 번호 08/423,568 에 개시되어 있다.
"분말" 이라는 용어는 자유롭게 유영하고 흡입 장치내에서 즉각 분산될 수 있고 대상에 의해 흡입되었을 때 그 입자들이 폐포 내로 침투가 가능한 미분된 고체 입자로 이루어지는 조성물을 의미한다. 따라서, 그 분말은 "흡입할 수 있는" 것으로 말해진다. 바람직하게는, 평균 입자 크기는 직경이 약 10 마이크론 (㎛) 미만이고, 비교적 균일한 회전 타원체 형태의 분포를 가진다. 더욱 바람직하게는, 직경은 약 7.5 ㎛ 미만이고, 가장 바람직하게는 약 5.0 ㎛ 미만이다. 일반적으로 입자 크기 분포는 직경이 약 0.1 ㎛ 내지 약 5 ㎛, 특히 약 0.3 ㎛ 내지 약 5 ㎛ 이다.
"건조" 라는 용어는 조성물이 입자들이 흡입기 내에서 즉각 분사되어 에어로졸을 형성할 수 있는 습기 함량을 가진 조성물을 의미한다. 습기 함량은 일반적으로 물 중량으로 약 10% 미만 (중량%) 이고, 보통 약 5 중량% 미만이고, 바람직하게는 약 3 중량% 미만이다.
약학적으로 허용가능한 담체의 양은 필요로 하는 대상의 폐 내로 조성물의 균일한 전달을 확실히 하기 위해 요구되는, 안정성, 분산성, 일관성, 및 대량의 특성을 제공하는데 필요한 양이다. 숫자적으로 그 양은 사용되는 약물의 활성에 따라 약 0.05 중량% 내지 약 99.95 중량% 일 수 있다. 바람직하게는, 약 5 중량% 내지 약 95 중량% 가 사용될 것이다. 담체는 2 개 이상의 약학적 부형제의 조합일 수 있으나, 일반적으로 임의의 "침투 증가제" 가 실질적으로 없을 것이다. 침투 증가제는 점막 또는 점막내의 표면으로 약물의 침투를 증가시키고, 비강내, 직장 내, 및 질내 약물 제형으로 사용되도록 고안된 표면 활성 화합물이다. 침투 증가제의 예에는 타우로콜레이트, 글리코콜레이트, 및 데옥시콜레이트와 같은 담즙산염; 타우로데히드로푸지데이트와 같은 푸지데이트; 및 트윈 (tween), 로레트-9 (Laureth-9) 등과 같은 생분해성 세제가 포함된다. 하지만, 폐를 위한 제형 내 침투 증가제의 사용은 일반적으로 바람직하지 않은데, 이는 뇌 내의 상피 혈액 장벽이 그러한 표면 활성 화합물에 의해 역으로 손상을 입을 수 있기 때문이다. 본 발명의 건조 분말 조성물은 폐 내에서 침투 증가제를 사용할 필요 없이 즉각 흡수된다.
폐 내 전달을 위한 담체로서 유용한 약학 부형제의 종류는 인간 혈청 알부민 (HSA) 과 같은 안정화제, 탄수화물, 아미노산, 및 폴리펩티드와 같은 충전제; pH 조정제 또는 완충제; 염화나트륨과 같은 염 등을 포함한다. 이러한 담체는 결정 형태 또는 무정형이거나 두 가지의 혼합물일 수 있다.
폐 내 전달을 위해 특히 중요한 충전제에는 호환성 탄수화물, 폴리펩티드, 아미노산, 또는 이들의 조합이 포함된다. 적합한 탄수화물은 갈락토오스, D-만노오스, 소르보오스 등과 같은 단당류; 락토오스, 트레할로오스 등과 같은 이당류; 2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린과 같은 시클로덱스트린; 및 라피노오스, 말토덱스트린, 덱스트란 등과 같은 다당류; 만니톨, 자일리톨 등과 같은 알디톨을 포함한다. 바람직한 폴리펩티드는 아스파탐을 포함한다. 아미노산에는 알라닌 및 글리신을 포함하며, 글리신이 더 바람직하다.
폐 내 전달을 위한 조성물의 작은 구성성분인 첨가제는 분사 건조 동안 입체형태의 안정성을 위해 그리고 분말의 분산성을 증가시키기 위해 포함될 수도 있다. 이러한 첨가제는 트립토판, 티로신, 류신, 페닐알라닌 등과 같은 소수성 아미노산을 포함한다.
흡입 또는 통기법에 의한 전달을 위해, 본 발명의 조성물은 대상자에게 단위 투여량 치료를 제공하는데 충분한 양으로 적합한 투여량 저장기 안에 보관된다. 투여량 저장기는 기체 스트림으로의 분산에 의해 건조분말 조성물의 에어로졸화를 가능하게 하는 적합한 흡입기 내에 맞춰져서 그 이후 치료를 필요로 하는 대상이 후속 흡입을 위해 부착된 마우스피스가 있는 챔버 내에서 그렇게 생성된 에어로졸을 포획하고 있는 것이다. 이러한 용량 저장기는 기체 스트림 (예를 들어, 공기) 을 그 용기 안으로 유도해서 건조 분말 조성물을 분산시키도록 하는 제거가능한 부분을 가진 젤라틴 또는 플라스틱 캡슐과 같은 당업계에 알려진 조성물을 담고 있는 임의의 용기를 포함한다. 이러한 용기는 미국 특허 번호 4,227,522; 미국 특허번호 4,129,309; 및 미국 특허 번호 4,105,027 에 예시되어 있다. 적합한 용기는 또한 글락소 (Glaxo) 의 벤톨린 (Ventolin？) 로토헤일러 (Rotohaler) 브랜드 분말 흡입기 또는 피손 (Fison) 의 스핀헤일러 (Spinhaler？) 브랜드 분말 흡입기와 함께 사용되는 것을 또한 포함한다. 우수한 습기 차단을 제공하는 또 다른 적합한 단위 투여량 용기는 알루미늄 호일 플라스틱 박편으로부터 형성된다. 약학-기반 분말은 중량 또는 부피로, 형성력 호일 내의 우묵한 곳에 채워지고 호일-플라스틱 박편 덮개로 밀봉된다. 분말 흡입기와 함께 사용할 수 있는 이러한 용기는 미국 특허번호 4,778,054 에 기술되어있고, 글락소 (Glaxo) 의 디스트헤일러 (Diskhaler？) (미국 특허번호 4,627,432; 4,811,731; 및 5,035,237) 와 함께 사용된다. 상기 모든 참조문헌은 본원에 참조로서 인용된다.
본 발명의 조성물은 방울 또는 분무 (예를 들어, 비강 분무, 에어로졸 분무, 또는 펌프 분무) 형태 또는 비강으로의 투여 (비강내 전달) 를 위한 다른 비히클 형태로 사용될 수도 있다. 에어로졸 분무 제제는 탄화수소 추진제와 같은 적합한 추진제와 함께 가압형 용기 안에 포함될 수 있다. 펌프 분무 분사기는 계측된 복용량 또는 특정 입자 또는 액적 크기를 가진 복용량으로 분사할 수 있다. 임의의 분사기는 단지 단일 용량, 또는 다 용량으로 분사할 수 있도록 조정될 수 있다. 더욱 일반적으로, 본 발명의 조성물, 특히 비강내 투여용으로 제형화된 조성물은 또한 용액, 현탁액, 또는 점성 조성물 (예를 들어, 젤, 로션, 크림, 또는 연고) 로서 제공될 수 있다.
직장 내 투여용 조성물
본 발명의 조성물은 조성물의 직장 내 투여를 위한 좌약 형태일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "직장" 혹은 "직장 내" 는 직장을 통해서 신체 내로 도입되는 것을 지칭하는데, 여기서 흡수는 직장 벽을 통해서 일어난다. 이러한 조성물은 약을, 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 염증을 일으키지 않는 부형제와 혼합함으로써 제조될 수 있고, 이 부형제는 보통 온도에서는 고체이지만 직장 온도에서는 액체 상태가 되어 직장 내에서 녹게 되어 약물을 방출하게 될 것이다. 좌약으로서 제형화되는 경우, 본 발명의 조성물은 트리글리세라이드와 같은 담체 및 통상의 결합체로 제형화될 수 있다.
국소 투여용 조성물
"국소의" 라는 용어는 본 발명의 조성물을 의도하고자 하는 지점에 혹은 바로 그 아래에 투여하는 것을 의미한다. "국소적으로 적용하기" 라는 구는 상피 표면을 포함한 하나 이상의 표면(들) 상에의 적용을 설명한다. 경피 투여와 대조되는 국소 투여는 일반적으로 전신적인 영향보다 국부적인 영향을 끼치지만, 여기서 사용된, 달리 말하거나 의미하지 않는 한, 용어 국소 투여 및 경피 투여는 교환적으로 사용된다. 본 출원의 목적을 위해서, 국소 적용은 구강세정 및 양치질을 포함할 것이다.
국소 투여는 또한 당업계에 잘 알려진 기술 및 절차에 따라 제조되는 경피 패치 또는 이온도입기와 같은 경피 투여의 사용과도 연관될 수 있다. "경피 전달 시스템", "경피 패치" 또는 "패치" 라는 용어는 특정 시간 동안 방출되는 복용량의 약물(들) 을 투여량 형태로부터 나와서 피부를 통과, 체순환을 통해서 분배가 가능하도록 피부 위에 놓여지는 접착 시스템을 말한다. 경피 패치는 다양한 종류의 약제를 전달하는데 사용하는 잘 받아들여지고 있는 기술이고, 멀미를 위한 스코폴라민, 협심증을 치료하기 위한 니트로글리세린, 고혈압을 위한 클로니딘, 폐경기 이후 증상들을 위한 에스트라디올, 및 금연을 위한 니코틴을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서의 사용에 적합한 패치는 (1) 매트릭스 패치; (2) 저장소 패치; (3) 다중-박편으로된 약물이 접착제에 들어있는 패치; 및 (4) 단일로 된 약물이 접착제에 들어 있는 패치를 포함하나 이에 한정되지는 않는다; 참조로서 본원에 인용되는 문헌 [Transdermal and Topical Drug Delivery Systems, pp. 249-297 (Tapash K. Ghosh et al. eds., 1997)]. 이러한 패치는 당업계에 잘 알려져 있으며, 일반적으로 시판된다.
담체 및 다른 구성성분
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 용매, 현탁화제, 결합제, 충전제, 윤활제, 붕해제 및 습윤제/계면활성제/가용화제로부터 선택되는 부형제, 비히클 또는 담체로 제형화될 수 있다. "부형제", "비히클", 또는 "담체" 라는 용어는 그것과 함께 혼합하였을 때 활성 화합물(들) 의 사용을 용이하게 하지만 해롭게 반응하지 않는 물질들을 말한다. "활성" 이라는 용어는 의도되는 치료 효과의 책임이 있는 본 발명 조성물의 성분, 구성요소, 또는 구성물을 말한다. 담체는 순도가 충분히 높아야 하며, 독성이 충분히 낮아서 치료받는 대상에게 투여하기에 적합하도록 되어야 한다. 담체는 비활성이거나 또는 약학적 유익을 가질 수 있다.
담체는 액체 또는 고체일 수 있으며, 활성 성분 및 주어진 조성물의 다른 구성성분과 조합되는 경우 바람직한 부피, 경도 등을 제공하기 위해서 계획된 투여방법과 함께 선택된다. 전형적인 약학 담체는 결합제 (미리 젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피로리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스를 포함하나 이에 한정되지 않음); 충전제 (락토오스 및 다른 당, 미세결정성 셀룰로오스, 펙틴, 젤라틴, 황산칼슘, 에틸 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트 또는 칼슘 수소 포스페이트를 포함하나 이에 한정되지 않음); 윤활제 (마그네슘 스테아레이트, 활석, 규소, 교질의 이산화규소, 스테아르산, 금속성 스테아레이트, 수소첨가된 식물성 오일, 옥수수 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트를 포함하나 이에 한정되지 않음); 붕해제 (전분, 나트륨 전분 글리콜레이트를 포함하나 이에 한정되지 않음); 및 습윤제 (나트륨 라우릴 술페이트를 포함하나 이에 한정되지 않음) 를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 조성물들을 위한 부가적인 적합한 담체는 물, 염 용액, 알코올, 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀로오스, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 규산, 점성 파라핀, 향유; 지방산 모노글리세라이드 및 디글리세라이드, 페트로에트랄 지방산 에스테르, 히드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피리로리돈 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 약학 제제는 멸균될 수 있고, 원한다면 윤활제, 방부제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 주기 위한 염, 완충제, 착색제, 감미제 및/또는 방향족 성분 등과 같은, 활성 화합물에 해로운 반응을 일으키지 않는 보조제와 함께 혼합될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "약학적으로 허용가능한 담체" 라는 용어는 활성 성분이 안정적이고 생물학적으로 이용할 수 있는 상태로 존재하는 약물의 투여에 통상적으로 유용한 충분히 비독성인 담체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물의 약학적으로 허용가능한 담체는 지속 방출 혹은 지연 방출 담체와 같은 방출제를 포함한다. 이러한 구현예에서, 담체는 더 짧은 주기 및/또는 감소된 유효 성분의 복용량을 산출하는 더욱 효율적인 투여, 용이한 취급, 및 연장적인 또는 지연적인 효과를 제공하기 위해 렙틴 또는 렙틴 유사체 및 임의의 제 2 치료제 유효 성분을 지속적으로 혹은 지연적으로 방출할 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 이러한 담체의 비제한적인 예에는 천연 및 합성 중합체 등의 리포좀, 마이크로스폰지, 마이크로스피어, 또는 마이크로캡슐을 포함한다. 리포좀은 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린과 같은 다양한 인지질로부터 형성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 렙틴 또는 렙틴 유사체 및 임의의 제 2 치료제에 의해 제공하는 약학적 효과와 더불어 또 다른 약학적 효과를 제공할 목적으로, 하나 이상의 상용성 유효 성분을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "상용성" 은 그러한 한 조성물의 유효 성분이 각각의 유효 성분 또는 보통의 사용 조건하에서의 조성물의 효능을 실질적으로 감소시킬 수 있는 상호작용이 일어나지 않는 방식으로 서로 조합될 수 있다는 것을 의미한다. 본 발명의 또 다른 양상에서, 조성물은 또한 아밀로이드 펩티드의 축적으로부터 기인하는 질환, 상태 또는 장애를 치료하기 위한 다른 조성물과 함께 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 제한 없이, 이러한 다른 조성물은 모노클론 항체 (예컨대, 모노클론 항-β-아밀로이드 및 모노클론 항-β-세크레타아제); 및 항염증 화합물 (이부프로펜, 인도메타신, 및 플루비프로펜과 같은 비-스테로이드성 항-염증 약물 (NSAID) 을 포함하나 이에 한정되지 않음) 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 항 염증 화합물은 세포 배양 뿐만 아니라 AD-유사 아밀로이드증을 가진 트랜스제닉모델에서 Aβ-저하 특성을 유도한다는 것으로 알려졌다.
활성 성분의 농도는 치료 효과를 나타내도록, 그러나 당업자의 정상적인 판단과 범주 내에서 심각한 부작용을 피할 수 있을 정도의 충분히 낮은 농도로 선택된다. 조성물의 유효량은 치료되는 대상의 연령 및 신체 조건, 질환의 심각도, 치료 기간, 현행 요법의 특성, 특정 화합물, 조성물 또는 사용되는 유효 성분, 사용되는 특정 담체 등의 인자에 따라 다양해질 수 있다. 당업자는 그러한 인자를 이런 정보에 기초로 쉽게 평가해서 의도된 목적을 위해 사용되는 본 발명의 조성물의 특정 유효 농도를 결정할 수 있다. 부가적으로는, 본 발명의 치료적 적용에서, 조성물 또는 의약은 특정 질환, 장애 또는 상태가 의심되거나, 가지고 있는, 혹은 이미 겪고 있는 환자에게 그 질환, 장애 또는 상태의 증상을 (합병증과 그 질환, 장애 또는 상태 발생의 중간 병리 표현형을 포함함) 치료하거나 적어도 부분적으로 중지시킬 수 있는 충분한 양만큼 투여된다. 일부 방법에서, 본 발명의 조성물의 투여는 아직 질환, 장애 또는 상태의 특징적인 병리를 발생하지 않은 환자의 인지 손상을 줄이거나 제거한다.
치료 또는 예방 치료를 달성하는데 적당한 양은 본 출원에서 치료학적 유효 복용량으로 정의된다. 예방 그리고 치료 요법 모두에서, 본 발명의 조성물의 양은 충분한 유익한 반응을 얻을 때까지 보통 몇 차례의 투여량으로 투여된다. 전형적으로, 반응을 모니터링하고 만약 그 반응이 줄어들기 시작하면 반복적인 투여량이 제시된다. 당업자는 여기서 이후에 "단위 투여량" 이라고 지칭되는, 특정 효과의 강도를 일으키는 투여량 단위 (사용 단위를 의미하는) 로 복용량을 결정함으로써 본 발명 조성물을 약학적 유효량을 결정할 수 있다. "복용량-강도 관계" 라는 용어는 한 개인 수용자 내 효과의 강도가 복용량과 관련되는 방식을 말한다. 일반적으로 지칭된 효과 강도는 50% 의 최대 강도이다. 상응하는 복용량이 50% 유효 복용량 또는 개인 ED50 이라고 불린다. "개인" 이라는 용어의 사용은 본원에서 사용되는 바와 같은 효과의 강도에 근거한 ED50 을 집단 내 반응 주기 데이터로부터 결정되는 평균 효과 복용량 (또한 ED50 으로 축약됨) 과 구별하기 위해 사용된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "효능" 은 바라는 반응을 달성하기 위한 본 발명 조성물들의 특성을 말하며, "최대 효능"은 최대한 성취 가능한 효과를 말한다. 특정 장애 또는 상태를 치료하는데 효과적일 것인 본 발명의 조성물 내 화합물의 양은 장애 또는 상태의 특성에 따라 다를 것이며, 표준 임상 기술로 결정될 수 있다. (예를 들어, Goodman and Gilman's THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, Joel G. Harman, Lee E. Limbird, Eds.; McGraw Hill, New York, 2001; THE PHYSICIAN'S DESK REFERENCE, Medical Economics Company, Inc., Oradell, N.J., 1995; and DRUG FACTS AND COMPARISONS, FACTS AND COMPARISONS, INC., St. Louis, Mo., 1993 참조). 제형에서 사용되는 정확한 복용량은 또한 투여 경로, 및 질환 또는 장애의 심각도에 좌우될 것이고, 진료의사의 판단과 각 환자의 상황에 맞추어 결정되어야 한다. 다양한 투여 패턴은 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 조성물의 투여를 위한 투여량 범위는 원하는 치료 효과를 산출하기에 충분히 넓은 범위이다. 본 발명의 조성물의 치료학적 유효량은 정기적으로 일일 1 회 이상 투여될 수 있다. 대상에 투여되는 전형적인 투여량은 약 0.0001 mg 의 조성물/kg (체중)/일 내지 약 1O g 의 조성물/kg (체중)/일이다. 예를 들어, 제한 없이, 조성물의 최소 투여량은 약 0.0001 mg/kg/일, 약 0.0005 mg/kg/일, 약 0.001 mg/kg/일, 약 0.002 mg/kg/일, 약 0.004 mg/kg/일, 약 0.004 mg/kg/일, 약 0.005 mg/kg/일, 약 0.006 mg/kg/일, 약 0.007 mg/kg/일, 약 0.008 mg/kg/일, 약 0.009 mg/kg/일, 약 0.01 mg/kg/일, 약 0.025 mg/kg/일, 약 0.05 mg/kg/일, 약 0.075 mg/kg/일, 약 0.08 mg/kg/일, 약 0.1 mg/kg/일, 약 0.125 mg/kg/일, 약 0.15 mg/kg/일, 약 0.175 mg/kg/일, 약 0.2 mg/kg/일, 약 0.225 mg/kg/일, 약 0.25 mg/kg/일, 약 0.275 mg/kg/일, 약 0.3 mg/kg/일, 약 0.325 mg/kg/일, 약 0.35 mg/kg/일, 약 0.375 mg/kg/일, 약 0.4 mg/kg/일, 약 0.45 mg/kg/일, 약 0.475 mg/kg/일, 또는 약 0.5 mg/kg/일로서 고려되고, 최대 투여량은 약 10 g/kg/일, 약 9 g/kg/일, 약 8 g/kg/일, 약 7 g/kg/일, 약 6 g/kg/일, 약 5 g/kg/일, 약 4 g/kg/일, 약 3 g/kg/일, 약 2 g/kg/일, 약 1 g/kg/일, 약 0.5 g/kg/일, 약 0.2 g/kg/일, 약 0.175 g/kg/일, 약 0.15 g/kg/일, 약 0.125 g/kg/일, 약 0.1 g/kg/일, 약 0.08 g/kg/일, 약 0.075 g/kg/일, 약 0.05 g/kg/일, 약 0.025 g/kg/일, 또는 약 0.01 g/kg/일로서 고려된다. 인간에서의 본 발명의 일부 구현예에서는, 투여량은 약 0.0001 mg 내지 약 10 g 의 조성물/kg (체중)/일, 인간에서의 다른 구현예에서는, 0.0001 내지 10 g 의 조성물/kg (체중)/일일 수 있다.
본 발명의 부가적인 조성물은, 예를 들어 본원에 참조로서 인용되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th or 19th editions, Mack Publishing Company of Easton 출판, Pennsylvania] 에 기재된 바와 같은 당업계에 알려진 기술을 이용하여 쉽게 제조될 수 있다.
방법의 또다른 구현예에 따르면, 방법은 약물 성분을 관심의 부위에 전달하기 위해서 렙틴 조성물을 젤, 저속-방출 고체 또는 반고체 형태로 수술을 통해 환자에 이식하거나 혹은 주사로 환자에게 주입하는 단계를 포함한다. 상기 렙틴 조성물이 부위에 특이적으로 (국부적으로) 전달되기 때문에, 진행성 인지 장애를 치료하는데 요구되는 투여량은 높은 전신 복용량의 투여를 방지할 수 있는 임의의 독성을 줄이고, 방지하거나 혹은 회피할 수 있을 것이다.
통제된 방출 시스템
본 발명의 렙틴 조성물은 통제된 방출 시스템 안에 포함될 수 있다. 약물의 효과를 지속시키기 위해서, 피하, 구강, 또는 근육내 주사로부터 약물의 흡수를 늦추는 것이 종종 바람직하다. 이것은 낮은 수용성을 가진 결정형 또는 무정형 물질의 액체 현탁액을 사용함으로써 이루어질 수 있다. 그러면 약물의 흡수 속도는 용해 속도에 달려 있는데, 이것은 결정의 크기와 결정의 형태에 따라 좌우될 것이다.
"통제된 방출" 이라는 용어는 제형으로부터 약물이 방출되는 방식 및 프로파일이 조절되는 임의의 약물-함유 제형을 말하는 것으로 의도된다. 이것은 비-즉각적 방출 제형 뿐만 아니라 즉각 방출도 지칭하는데, 비-즉각적 방출 제형은 지속적 방출과 지연적 방출 제형을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 본원에서 사용되는 "지속적 방출" (또한 "연장적 방출" 이라고도 부름) 이라는 용어는 상식적 의미에서 오랜 기간에 걸친 약물의 점진적 방출을 제공하는 약물 제형을 말하는데, 바람직하게는, 반드시 그렇지는 않지만, 장기간에 걸쳐 약물의 거의 일정 혈중 수준을 유지하는 결과를 가져온다. 대안적으로는, 비경구로 투여된 약물 형태의 지연된 흡수는 약물을 오일 비히클 내에 용해하거나 현탁시킴으로써 달성된다. 본원에서 사용되는 "지연적 방출" 이라는 용어는 상식적 의미에서 제형의 투여와 그로부터 약물의 방출 사이에 시간 지연이 있는 약물 제형을 말한다. "지연 방출은" 장기간에 걸친 점진적인 약물의 방출을 수반할 수도 또는 수반하지 않을 수도 있으며, 따라서 "지속적 방출" 일 수도 또는 아닐 수도 있다.
장기간의 지속적 방출 이식은 만성 상태의 치료에 특히 적합할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "장기간" 방출이라는 용어는 약 7 일 이상, 약 10 일 이상, 약 14 일 이상, 약 21 일 이상, 약 30 일 이상, 약 45 일 이상, 내지 약 60 일 동안 유효 성분의 치료 수준을 전달하도록 이식이 만들어지고 배열되는 것을 의미한다. 장기간 지속적 방출 이식은 당업자에게 잘 알려져 있으며 위에 기술된 방출 시스템 중 일부를 포함한다.
또다른 구현예에 따르면, 본 발명의 약학적으로 허용가능한 담체는 지속적 방출 또는 지연적 방출 담체를 포함한다. 담체는 적은 투여주기 및/또는 화합물의 줄어든 투용량, 취급의 용이, 및 상피-연관 상태에서 연장적인 또는 지연적인 효과를 야기하는 더욱 효과적인 투여 방법을 제공하기 위한 지속적이거나 지연적으로 화합물을 방출할 수 있는 임의의 물질일 수 있다.
당업자는 본 발명의 조성물의 적합한 치료적 투여량의 초기 징후가 시험관 내 및 생체 내 동물 모델 시스템, 및 인간 임상시험을 통해 결정될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 당업자는 독성이나 다른 부작용을 일으키지 않고 안전하게 투여할 수 있는 투여량을 알아내는데 동물 연구 및 인간 경험을 어떻게 사용하는지 알 것이다. 급성 치료를 위해서는, 치료적 투여량이 최대 허용 복용량에 가까운 양을 사용하는 것이 바람직하다. 만성 예방 사용을 위해서는 장기간 영향에 따른 우려 때문에 더 낮은 복용량이 바람직할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법의 유효성은 다양한 프로토콜을 이용하여 평가할 수 있다. 인간 대상 내의 인지 기능 증가에 대한 영향은 당업자에게 전형적인 방법들에 의해 결정될 수 있는데, 이는 종이와 연필을 이용한 시험과 컴퓨터를 이용한 시험 모두를 포함하나 이것들에 한정되지는 않는다. 당업자는 또한 동물 모델에서 아밀로이드 펩티드 축적 수준, 신경섬유 매듭 형성 및 신경퇴행을 직접 측정할 수 있다. 더 나아가서, 아밀로이드 펩티드는 요추 천자에 의해 얻어진 대상의 뇌척수액 (CSF) 샘플에서 측정될 수도 있다. 아밀로이드 펩티드의 축적을 측정하는 하나의 방법은 대상의 혈액 내 순환하는 수준의 증가를 측정하는 것이다. 이러한 수준은 하나는 포획용이고 다른 하나는 탐지용인 한 쌍의 항체를 사용하는, 샌드위치 효소 결합 면역 흡착 어세이 (ELISA) 를 통해서 측정될 수 있다. 이러한 방법들은 당업자들에게 잘 알려져 있다.
III . 약물 발견
AD 병리생물학에서 렙틴에 의해 촉발되는 대사 경로의 연구가 거의 이루어지지 않았기 때문에, 본 발명은 또한, tau 인산화 및 Aβ 방출을 감소시키는 렙틴의 능력을 매개하는 대사 및 스트레스 센서로사 생리학적으로 기능하는 5-아데노신 모노포스페이트 단백질 키나아제 (AMPK) 의 발견을 사용하여, NFT 또는 Aβ 의 축적으로부터 야기되는 진행성 인지 기능장애 질환 또는 장애를 치료하기 위해 관련된 약물 발견 방법을 제공한다.
(1). 인지 기능장애 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 치료제의 확인 방법
또다른 양상에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, Aβ 축적, tau 과인산화, 또는 NFT 축적 중 하나 이상으로부터 기인하는 진행성 인지 기능장애 질환 또는 장애의 치료를 위한 유효한 치료제의 확인 방법을 제공한다:
a) 뉴런 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계;
b) 뉴런 세포를 포함하는 세포 배양물을 추정적 치료제와 접촉시키는 단계;
c) 추정적 치료제가 추정적 치료제와 접촉된 AMPK 의 활성에 영향을 주는 식으로 추정적 치료제가 AMPK 단백질의 활성 부분과 관련이 있는지를 결정하는 단계; 및
d) 추정적 치료제를, 대조군에 비한 세포 배양물 내 뉴런 세포에 의한 아밀로이드-베타의 분비를 측정함으로써, Aβ 축적, tau 과인산화, 또는 NFT 축적 중 하나 이상으로부터 기인하는 진행성 인지 기능장애 질환 또는 장애의 치료를 위한 유효한 치료제로서 확인하는 단계.
하나의 구현예에 따르면, 진행성 인지 기능장애는 신경섬유 매듭의 축적으로부터 기인한다. 또다른 구현예에 따르면, the 진행성 인지 기능장애는 아밀로이드 β 의 축적으로부터 기인한다.
일부 구현예에 따르면, Aβ 축적, tau 과인산화, 또는 NFT 축적 중 하나 이상으로부터 기인하는 진행성 인지 질환 또는 장애에는 알츠하이머 질환, 진행성 핵상 마비; 치매; 권투선수 치매; 크로이츠펠트-야콥 질환; 전두측두 치매; 픽 질환; FTDP-17 피질 기저핵 변성을 포함하는 기타 tau-양성 병리학; 전두측두엽 퇴행 (FTLD); 및 독특한 조직학이 결여된 치매가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 또다른 구현예에 따르면, 진행성 인지 장애는 알츠하이머 질환이다. 또다른 구현예에 따르면, 진행성 인지 장애는 진행성 핵상 마비이다. 또다른 구현예에 따르면, 진행성 인지 장애는 치매이다. 또다른 구현예에 따르면, 진행성 인지 장애는 권투선수 치매이다. 또다른 구현예에 따르면, 진행성 인지 장애는 크로이츠펠트-야콥 질환이다. 또다른 구현예에 따르면, 진행성 인지 장애는 전두측두 치매이다. 또다른 구현예에 따르면, 진행성 인지 장애는 픽 질환이다. 또다른 구현예에 따르면, 진행성 인지 장애는 FTDP-17 피질 기저핵 변성이다. 또다른 구현예에 따르면, 진행성 인지 장애는 전두측두엽 퇴행 (FTLD) 이다. 또다른 구현예에 따르면, 진행성 인지 장애는 독특한 조직학이 결여된 치매이다.
또다른 구현예에 따르면, 추정적 치료제는 AMPK 단백질을 저해하기에 충분한 양이다. 또다른 구현예에 따르면, 추정적 치료제는 약 1 ng/ml 내지 약 100 ㎍/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 추정적 치료제는 약 5 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 추정적 치료제는 약 25 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 추정적 치료제는 약 50 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 추정적 치료제는 약 75 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 추정적 치료제는 약 100 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 추정적 치료제는 약 250 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 추정적 치료제는 약 500 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 추정적 치료제는 약 750 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 추정적 치료제는 약 1 ㎍/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 추정적 치료제는 약 25 ㎍/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 추정적 치료제는 약 50 ㎍/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 추정적 치료제는 약 75 ㎍/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 추정적 치료제는 약 100 ㎍/ml 의 양이다.
또다른 구현예에 따르면, 추정적 치료제는 재조합 단백질이다. 또다른 구현예에 따르면, 재조합 단백질인 추정적 치료제는 재조합 DNA 에 의해 발현된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "발현되는" 이라는 용어는 DNA 서열과 같은 유전자로부터의 유전적 정보가 기능적 유전자 생성물로 만들어지는 과정을 말한다. 재조합 DNA (rDNA) 는 2 개의 비-상동 DNA 분자의 연결 (일반적으로는 시험관 내에서) 에 의해 형성된 DNA 서열이다. 일부 구현예에 따르면, 재조합 단백질은 AMPK 와 연합되는 단백질이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 재조합 단백질은 AMPK 의 저해제이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 재조합 단백질은 AMPK 길항제이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 재조합 단백질은 AMPK 아고니스트이다.
또다른 구현예에 따르면, 추정적 치료제는 저해제이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 저해제는 AMPK 저해제이다. 또다른 구현예에 따르면, 추정적 치료제는 길항제이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 추정적 치료제는 AMPK 길항제이다.
일부 구현예에 따르면, 길항제는 기능적 길항제 어세이를 사용하여 확인될 수 있다. 기능적 길항제 어세이에서, 약물의 IC50 은 투여량-반응 곡선을 작성하고 아고니스트 활성 역행을 위한 상이한 농도의 길항제의 효과를 시험함으로써 측정될 수 있다. IC50 값은 아고니스트의 최대 생물학적 반응의 절반을 억제하는데 필요한 농도를 측정함으로써 제시된 길항제에 대해 계산될 수 있다. IC50 값은 그 값이 측정되는 조건에 따라 상이하다. 일반적으로, IC50 값은 효소 농도가 증가할수록 증가하고, 저해제의 농도가 높을수록, 아고니스트 활성이 더욱 감소할 것이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 25 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 10 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 1 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 500 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 250 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 100 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 50 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 25 nM 이다.
일부 구현예에 따르면, 길항제는 경쟁 결합 어세이를 사용하여 확인될 수 있다. 경쟁 결합 어세이에서, 단일 농도의 방사성리간드 (통상 아고니스트) 가 각각의 어세이 웰에서 사용된다. 리간드는 저농도로, 통상 그의 해리 상수 (Kd) 값으로 또는 그 미만으로 사용된다. 그 다음 방사성리간드의 특이적 결합 수준은 방사성리간드의 결합에 대해 경쟁하는 능력을 측정하기 위해, 다른 경쟁 비-방사성 화합물 (통상 길항제) 의 농도 범위의 존재하에서 측정한다. 또한 경쟁 곡선은 직접적 핏에 기술된 바와 같이 로그 함수에 대해 컴퓨터로 핏팅될 수 있다. 이 상황에서, IC50 은 방사성리간드의 특이적 결합의 50% 를 나타내는 경쟁 리간드의 농도이다. IC50 값은 쳉-프루소프 (Cheng-Prusoff) 방정식 Ki = ((IC50)/(1+([S]/Rm))) [식 중, Ki 는 저해제의 결합 친화성이고, IC50 은 저해제의 기능적 강도이고, [S] 는 기질 농도이고, Km 은 효소에 대한 기질의 친화성임] 을 사용하여 절대 저해 상수 (Ki) 로 전환된다. 화합물에 대한 IC50 값은 방사성리간드 농도에 의존적으로 실험에 따라 다를 수 있으나, Ki 는 절대값이다. Ki 는 약물의 저해 상수이고; 경쟁 어세이 내 경쟁 리간드의 농도는 방사성리간드가 존재하지 않는다면 수용체의 50% 를 점유할 것이다. 일부 구현예에 따르면, 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 25 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 10 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 1 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 500 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 250 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 100 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 50 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 25 nM 이다.
또다른 구현예에 따르면, 추정적 치료제는 아고니스트이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 추정적 치료제는 AMPK 아고니스트이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, AMPK 아고니스트는 AICAR 펩티드모방체이다. 아고니스트 및 자극제 어세이에 대해, 가장 흔한 간략한 측정은 EC50 이다. 아고니스트의 효능은 그의 최대 효과 농도 절반 (EC50) 에 반비례한다. 농도 측정은 전형적으로는 S 자 곡선을 따르고, 농도가 비교적 적게 변해도 빠르게 증가한다. 일부 구현예에 따르면, 길항제의 EC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 25 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 길항제의 EC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 50 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 길항제의 EC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 100 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 길항제의 EC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 250 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 길항제의 EC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 500 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 길항제의 EC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 1 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 길항제의 EC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 10 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 길항제의 EC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 25 μM 이다.
또다른 구현예에 따르면, 추정적 치료제는 항체이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 항체는 AMPK 에 대한 항체이다. 또다른 구현예에 따르면, 단계 (c) 에서의 대조군에 비한 배양물 내 뉴런 세포에 의한 아밀로이드-베타의 분비를 측정하는 것은 ELISA 어세이에 의한 것이다. 또다른 구현예에 따르면, 단계 (c) 에서의 대조군에 비한 배양물 내 뉴런 세포에 의한 아밀로이드-베타의 분비를 측정하는 것은 면역블롯에 의한 것이다.
또다른 구현예에 따르면, 본 방법은 아밀로이드-베타 병리학을 치료하기 위해 유효한 치료제를 사용하는 단계를 추가로 포함한다.
하나의 이러한 구현예에 따르면, 아밀로이드-베타 (Aβ) 병리학은 알츠하이머 질환이다. 일부 구현예에 따르면, AD 의 아밀로이드-베타 병리학은 APP, 프레세닐린 1 (PS1) 또는 프레세닐린 2 (PS2) 유전자에서의 미스센스 돌연변이를 포하한다.
일부 구현예에 따르면, AD 의 아밀로이드-베타 병리학은 Aβ42 의 변형된 단백질 가수분해를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, AD 의 아밀로이드-베타 병리학은 뇌 간질액 내 Aβ42 의 진행성 축적 및 응집을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, AD 의 아밀로이드-베타 병리학은 확산 플라크로서 응집된 Aβ42 의 침전을 포함한다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 침전은 프로테오글리칸 및 기타 아밀로이드-촉진 기질을 추가로 포함한다.
일부 구현예에 따르면, AD 의 아밀로이드-베타 병리학은 확산 Aβ42 플라크 상의 Aβ40 의 응집을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, AD 의 아밀로이드-베타 병리학은 특정 플라크-연관 단백질의 증가를 포함한다
일부 구현예에 따르면, AD 의 아밀로이드-베타 병리학은 염증 반응을 포함한다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 염증 반응은 미세아교세포 활성화, 사이토카인 방출, 별아교세포증, 및 급성 상 단백질 방출 중 하나이다.
일부 구현예에 따르면, AD 의 아밀로이드-베타 병리학은 진행성 신경증 손상을 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 진행성 신경증 손상은 아밀로이드 플라크 내에 있다. 일부 이러한 구현예에서, 진행성 신경증 손상은 아밀로이드 플라크 내에 그리고 신경망 내 그 밖의 곳에 있다.
일부 구현예에 따르면, AD 의 아밀로이드-베타 병리학은 뉴런 대사 항상성의 붕괴를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, AD 의 아밀로이드-베타 병리학은 이온 항상성의 붕괴를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, AD 의 아밀로이드-베타 병리학은 산화 손상을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, AD 의 아밀로이드-베타 병리학은 PHF 형성을 야기하는 과인산화된 tau 를 유발하는 하나 이상의 변형된 키나아제/포스파타아제 활성을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, AD 의 병리학은 진행성 신경전달물질 결핍이 있는 해마 및 대뇌 피질 내의 널리 퍼진 뉴런/초로성 기능장애 및 사멸을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, AD 의 아밀로이드-베타 병리학은 치매를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, AD 의 아밀로이드-베타 병리학은 피질 영역에 영향을 준다. 일부 이러한 구현예에 따르면, AD 의 아밀로이드-베타 병리학은 초로성 디스트로피를 포함한다. 일부 이러한 구현예에 따르면, AD 의 아밀로이드-베타 병리학은 시냅스 손실을 포함한다. 일부 이러한 구현예에 따르면, AD 의 아밀로이드-베타 병리학은 뉴런 세포체의 수축을 포함한다. 일부 이러한 구현예에 따르면, AD 의 아밀로이드-베타 병리학은 선택적 뉴런 손실을 포함한다.
또다른 구현예에 따르면, Aβ 병리학은 헌팅톤 질환이다 [McGowan, DP, et al, Neuroscience 100(4): 677-80 (2000)]. 헌팅톤 질환 (무도병) 은 근육 조화 및 일부 인지 기능에 영향을 주는 신경퇴행성 장애이다. 종종 심리학적 검사와 조합된 신체 검사는 질환의 발병이 시작되었는지를 측정할 수 있다. 신체 임의의 부분의 과도한 비고의적인 움직임은 종종 의료 상담을 받아볼 이유가 된다. 이들이 갑작스럽고, 랜덤한 타이밍과 분포를 보인다면, 이것은 HD 으로 진단될 것으로 제안된다. 인지 또는 정신의학적 증상은 거의 첫번째로 진단된다; 이들은 보통은 지나고 나서 또는 더욱 진행된 후에나 인지된다. 얼마나 진행이 진행되었는지는 운동, 행동, 인지, 및 기능적 평가에 근거한 전체적인 등급 시스템을 제공하는 통일된 헌팅톤 질환 등급 스케일을 사용하여 측정될 수 있다. 컴퓨터 단층촬영술 (CT) 및 자기 공명 영상 (MRI) 과 같은 의료적 영상술은 일반적으로 진행된 상태의 질환에서의 가시적인 대뇌 위축을 보여준다. fMRI 및 PET 와 같은 기능적 신경영상 기술은 신체적 증상의 발병 전에 뇌 활성의 변화를 보여줄 수 있다. 가장 특징적인 초기의 신체적 증상은 무도병이라고 불리는 경련을 일으키고, 램덤하고 통제할 수 없는 움직임이다. 무도병은 처음에는 일반적인 안절부절, 작은 의도적이지 않게 시작되거나 불완전한 움직임, 조화의 결핍, 또는 느려진 씰룩대는 눈 움직임으로서 나타낼 수 있다. 이러한 미약한 운동 비정상은 통상적으로 운동 기능장애의 더욱 명백한 징후를 적어도 3 년 앞서간다. 경직된, 비틀린 움직임 또는 비정상 자세와 같은 증상의 명백한 출현이 장애가 진행될수록 나타난다. 이들은 움직임을 담당하는 뇌 내 시스템이 영향을 받은 징후이다. 근육 통제를 필요로 하는 임의의 작용이 영향을 받은 식으로, 정신운동 기능이 점차적으로 손상되어 진다. 통상의 결과는 신체적 불안정성, 비정상 안면 표정 및 씹기, 삼키기 및 말하기의 어려움이다. 섭식 어려움은 통상 체중 손실을 일으키고, 영양실조를 초래할 수 있다. 수면 장애도 관련 증상이다. 청년 HD 는 일반적으로 진행이 빠르고 무도병이 간략하게 나타나는, 만약 있다면 경직성이 주요한 증상으로 나타난다는 점이 상기 증상들과 상이하다. 발작은 또한 상기 유형의 HD 의 공통적인 증상이다. 인지 능력은 점진적으로 손상된다. 특히 영향을 받는 것은 계획, 인지 유연성, 추상적 사고, 규칙 습득, 적합한 행동 개시 및 부적합한 행동 억제를 포함하는 실행 기능이다. 질환이 진행됨에 따라, 기억력 결핍이 나타나는 경향이 있다. 보고된 손상은 에피소드 (일생의 기억력), 절차 (행동을 어떻게 수행하는지에 대한 신체의 기억력) 및 작업 기억력의 결핍을 포함하는 단기간 기억력 결핍에서 장기간 기억력 장애까지의 범위이다. 인지 문제는 시간이 지남에 따라 악화되는 경향이 있고 궁극적으로는 치매를 초래한다. 이러한 패턴의 결핍은 알츠하이머 질환과 같은 "피질 치매" 의 전형적인 영향과 구별하여 "피질하부 치매" 증후군이라고 부른다.
또다른 구현예에 따르면, Aβ 병리학은 파킨슨 질환이다 (예를 들어, Conway, KA, et al, Biochemistry 39: 2552-63 (2000); Hardy, J. and Selkoe, DJ, Science 297: 353-56 (2002) 참조). 파킨슨 질환 (PD) 은 중추 신경계의 신경퇴행적 장애이다. PD 는 움직임에 영향을 주어 운동 증상을 생성한다. 비-운동 증상에는 자율신경계 기능장애, 인지 및 신경행동학적 문제, 및 감각 및 수면 장애가 포함된다. PD 의 4 가지 주요 증상에는 떨림, 경직, 운동완서 및 운동불능, 및 자세 불안정성이 포함된다. 부가적인 증상에는 느려진 반응 시간, 실행 기능장애, 치매, 및 단기간 기억력 상실이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
또다른 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 AMPK 단백질을 저해하기에 충분한 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 약 1 ng/ml 내지 약 100 ㎍/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 약 5 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 약 25 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 약 50 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 약 75 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 약 100 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 약 250 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 약 500 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 약 750 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 약 1 ㎍/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 약 25 ㎍/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 약 50 ㎍/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 약 75 ㎍/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 약 100 ㎍/ml 의 양이다.
또다른 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 재조합 단백질이다. 일부 구현예에 따르면, 재조합 단백질은 AMPK 와 연합되는 단백질이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 재조합 단백질은 AMPK 의 저해제이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 재조합 단백질은 AMPK 아고니스트이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 재조합 단백질은 AMPK 길항제이다.
또다른 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 저해제이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 AMPK 저해제이다.
또다른 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 길항제이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 AMPK 길항제이다.
일부 구현예에 따르면, 길항제는 기능적 길항제 어세이를 사용하여 확인될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 25 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 10 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 1 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 500 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 250 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 100 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 50 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 25 nM 이다.
일부 구현예에 따르면, 길항제는 경쟁 결합 어세이를 사용하여 확인될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 25 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 10 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 1 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 500 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 250 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 100 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 50 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 25 nM 이다.
또다른 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 아고니스트이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 AMPK 아고니스트이다.
또다른 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 항체이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 AMPK 에 대한 항체이다.
또다른 구현예에 따르면, 유효한 치료제는 하나 이상의 AMPK 기능을 저해한다.
(2). Tau 인산화의 효과기의 확인 방법
NFT 는 AD 의 현저한 홀마크이고, 직선 및 PHF 로 중합되는 과인산화된 tau 단백질로 주로 구성된다. Tau 단백질은 보통은 매우 가용성이고 뉴런의 미세관 역동성을 조절하는 기능을 한다. 정상적으로는 tau 의 기능이 조절된 인산화 및 탈인산화를 통해 조절되지만, tau 인산화의 병리학적 탈조절은 일반적으로 AD 내 치매와 연관성이 있는 것으로 여겨지고, 추가로 중합 및 NFT 형성을 선행하는 것으로 보인다. tau 가 수많은 키나아제에 의해 빠르게 인산화되지만, AD 내 tau 의 과인산화를 담당하는 키나아제(들) 이 확인되지는 않았다.
글리코겐 신타아제 키나아제 3β (GSK3β) 는 특정의 세포 기질 내 특정 세린 및 트레오닌 아미노산 중의 포스페이트 분자의 부가를 매개하는 지속적으로 활성인 프롤린-유도 세린-트레오닌 키나아제이다. 이것은 일반적으로 GSK-3β 가 인산화를 통해 상기 기질을 저해한다는 것으로 여겨진다. 대부분의 GSK-3β 기질은 음성 조절하에 있고, 이것은 단백질 키나아제 C (PKC), 단백질 키나아제 A (PKA) 및 단백질 키나아제 B (Akt) 와 같은 다른 키나아제를 통한 Ser9 인산화에 의해 경감된다.
비정상적으로 중합되는 것 외에, tau 는 AD 병리학에서 과인산화되는 것으로 제시되어 있다. GSK-3β 가 역할을 할 수도 있지만, 과인산화된 tau 가 어떻게 발생되는지에 대해서는 아직 알려지지 않았다.
또다른 양상에 따르면, 본 발명은 하기 a) 내지 d) 단계를 포함하는, tau 인산화의 하나 이상의 효과기의 확인 방법을 제공한다:
a) 뉴런 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계;
b) 세포 배양물을 효과기-후보자와 접촉시키는 단계,
c) 효과기-후보자에 의해 접촉되는 GSK-3β 단백질의 활성에 영향을 주는 식으로, 효과기-후보자가 GSK-3β 단백질의 활성 부분과 결부되는 지의 여부를 측정하는 단계; 및
d) 대조군과 비교하여 배양물 내 뉴런 세포에 의한 GSK-3β 단백질 활성을 측정함으로써 tau 인산화의 효과기로서 효과기-후보자를 화인하는 단계;
하나의 구현예에 따르면, 효과기는 GSK-3β 단백질을 저해하는데 충분한 양이다. 또다른 구현예에 따르면, 효과기는 약 1 ng/ml 내지 약 100 ㎍/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 효과기는 약 5 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 효과기는 약 25 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 효과기는 약 50 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 효과기는 약 75 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 효과기는 약 100 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 효과기는 약 250 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 효과기는 약 500 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 효과기는 약 750 ng/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 효과기는 약 1 ㎍/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 효과기는 약 25 ㎍/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 효과기는 약 50 ㎍/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 효과기는 약 75 ㎍/ml 의 양이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 효과기는 약 100 ㎍/ml 의 양이다.
또다른 구현예에 따르면, 효과기는 재조합 단백질이다. 일부 구현예에 따르면, 재조합 단백질은 GSK-3β 와 연합되는 효과기이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 재조합 단백질은 GSK-3β 를 억제하는 효과기이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 재조합 단백질은 GSK-3β 의 아고니스트인 효과기이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 재조합 단백질은 GSK-3β 의 길항제인 효과기이다.
또다른 구현예에 따르면, 효과기는 저해제이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 효과기는 GSK-3β 의 저해제이다.
또다른 구현예에 따르면, 효과기는 길항제이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 효과기는 GSK-3β 길항제이다.
일부 구현예에 따르면, 길항제는 기능적 길항제 어세이를 사용하여 확인될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 25 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 10 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 1 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 500 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 250 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 100 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 50 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 25 nM 이다.
일부 구현예에 따르면, 길항제는 경쟁 결합 어세이를 사용하여 확인될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 25 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 10 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 1 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 500 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 250 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 100 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 50 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 25 nM 이다.
또다른 구현예에 따르면, 효과기는 아고니스트이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 효과기는 GSK-3β 아고니스트이다.
또다른 구현예에 따르면, 효과기는 항체이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 효과기는 GSK-3β 에 대한 항체이다.
또다른 구현예에 따르면, 확인 단계 (c) 는 ELISA 어세이에 의해 이루어진다. 또다른 구현예에 따르면, 확인 단계 (c) 는 면역블롯에 의해 이루어진다.
(4). 렙틴 차단제의 확인 방법
합성 펩티드는 단백질-펩티드 상호작용이 일어나는 곳을 확인하기 위한 탐침으로서 사용될 수 있다. 저해성 펩티드 (차단제) 는 단백질 키나아제, 암 단백질 및 기타 장애의 저해에 대한 펩티드의 영향을 측정하기 위한 임상 시험에 사용될 수 있다.
예를 들어, 세포외 신호-조절 키나아제 (ERK) 인 MAPK 단백질 키나아제 [세포외 자극 (항원) 에 반응하고 다양한 세포 활동을 조절하는 단백질 세린/트레오닌 키나아제의 그룹 중 임의의 것을 의미함] 는 세포의 증식 및 분화에 필수적이다. MAPK 의 활성화는 MAPK 가 업스트림 MAPKK (MEK) 에 의해 인산화된 다음, 제 3 키나아제 MAPKKK (MEKK) 에 의해 인산화되는 캐스캐이드 메카니즘을 필요로 한다. MEK1 의 아미노-말단 13 아미노산을 함유하고 ERK 에 결합하는 MAPK 는 ERK 에 대한 결합에 의해 MEK 데코이로서 기능한다. ERK 가 MEK 와 상호작용할 수 없으므로, MAPK 결합은 MEK 에 의한 ERK 활성화를 차단한다.
오토캄티드-2 관련 저해성 펩티드 (AIP) 는 차단 펩티드의 또다른 예이다. 상기 합성 펩티드는 Ca2 +/칼모둘린-의존성 단백질 키나아제 II (CaMKII) 의 고도로 특이적이고 강력한 저해제이다. AIP 는 CaMKII 에 대한 고도로 선택적인 펩티드 기질인 오토캄티드-2 의 비-인산화가능 유사체이다. AIP 는 CaMKII 를 100 nM 의 IC50 (IC50 은 50% 저해를 달성하는데 필요한 저해제의 농도임) 로 저해한다. AIP 저해는 신티드-2 (CaMKII Peptide Substrate) 및 ATP 와 관련해서는 비-경쟁적이나 오토캄티드-2 에 관해서는 경쟁적이다. AIP 저해는 Ca2 +/칼모둘린의 존재 또는 부재에 의해 영향을 받지 않는다. CaMKII 활성은 1 μM AIP 에 의해 완전히 저해되나; PKA, PKC 및 CaMKIV 는 영향을 받지 않는다.
사이클린-의존성 키나아제 5 (Cdk5) 저해성 펩티드 (CIP) 는 또다른 차단 펩티드의 예이다. Cdk5 는 p25 조절 성분과 결부되는 경우 알츠하이머 질환 (AD)-특이적 포스포-에피토프에서 tau 를 인산화시킨다. p25 는 Cdk-p25 헤테로이량체 (미세관 연관 단백질) 의 절단된 활성화제로서, 이것은 아밀로이드-베타 펩티드에 노출시 생리학적 Cdk5 활성화제 p35 로부터 생성된다. CIP 는 p25/Cdk5 활성을 선택적으로 저해하고, 피질 뉴런 내의 일탈적인 tau 인산화를 억제한다. CIP 에 의해 증명되는 특이성에 대한 이유는 완전히 이해되지 않았다.
부가적인 차단 펩티드가 ERK2, ERK3, p38/HOG1, 단백질 키나아제 C, 카세인 키나아제 II, Ca2 +/칼모둘린 키나아제 IV, 카세인 키나아제 II, Cdk4, Cdk5, DNA-PK, PAK3, PI-3 키나아제, PI-5 키나아제, PSTAIRE, 리보솜 S6 키나아제, GSK-4, GCK, SAPK, SEK1, 및 FAK 에 대해 확인되었다.
또다른 양상에 따르면, 본 발명은 하기 (a) 내지 (d) 단계를 포함하는, 렙틴의 차단제의 확인 방법을 제공한다:
(a) 뉴런 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계;
(b) 세포 배양물 내 뉴런 세포를 렙틴 또는 렙틴 유사체와 접촉시키는 단계;
(c) 세포 배양물 내 뉴런 세포를 렙틴의 추정적 차단제와 접촉시키는 단계로서, 추정적 차단제가 렙틴 또는 렙틴 유사체의 활성 부분과 결부됨, 및
(d) 뉴런 세포 GSK-3β 활성을 측정함으로써 추정적 차단제를 렙틴의 활성 차단제로서 확인하는 단계;
(d) 하나의 구현예에 따르면, 차단제는 렙틴을 저해하는데 충분한 양이다. 또다른 구현예에 따르면, 차단제는 약 1 ng/ml 내지 약 100 ㎍/ml 이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 차단제는 약 5 ng/ml 이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 차단제는 약 25 ng/ml 이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 차단제는 약 50 ng/ml 이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 차단제는 약 75 ng/ml 이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 차단제는 약 100 ng/ml 이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 차단제는 약 250 ng/ml 이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 차단제는 약 500 ng/ml 이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 차단제는 약 750 ng/ml 이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 차단제는 약 1 ㎍/ml 이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 차단제는 약 25 ㎍/ml 이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 차단제는 약 50 ㎍/ml 이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 차단제는 약 75 ㎍/ml 이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 차단제는 약 100 ㎍/ml 이다.
또다른 구현예에 따르면, 차단제는 재조합 단백질이다. 일부 구현예에 따르면, 재조합 단백질은 렙틴과 연합되는 차단제이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 재조합 단백질은 렙틴을 억제하는 차단제이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 재조합 단백질은 렙틴의 아고니스트인 차단제이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 재조합 단백질은 렙틴의 길항제인 차단제이다.
또다른 구현예에 따르면, 차단제는 저해제이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 차단제는 렙틴의 저해제이다.
또다른 구현예에 따르면, 차단제는 길항제이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 차단제는 렙틴 길항제이다.
일부 구현예에 따르면, 길항제는 기능적 길항제 어세이를 사용하여 확인될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 25 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 10 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 1 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 500 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 250 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 100 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 50 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 25 nM 이다.
일부 구현예에 따르면, 길항제는 경쟁 결합 어세이를 사용하여 확인될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 25 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 10 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 1 μM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 500 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 250 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 100 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 50 nM 이다. 일부 구현예에 따르면, 확인된 길항제의 IC50 값은 약 0.001 nM 내지 약 25 nM 이다.
또다른 구현예에 따르면, 차단제는 아고니스트이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 차단제는 렙틴 아고니스트이다.
또다른 구현예에 따르면, 차단제는 항체이다. 일부 이러한 구현예에 따르면, 차단제는 렙틴 또는 렙틴 유사체에 대한 항체이다.
또다른 구현예에 따르면, 단계 (d) 에서 뉴런 세포 GSK-3β 활성을 측정하는 것은 ELISA 어세이에 의해 이루어진다. 또다른 구현예에 따르면, 단계 (d) 에서 뉴런 세포 GSK-3β 활성을 측정하는 것은 면역블롯에 의해 이루어진다.
다르게 정의되지 않는 경우, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기재된다. 본원에 언급된 모든 공개문헌은 본원에, 공개문헌이 언급된 것과 연관되는 방법 및/또는 물질을 기재 및 설명하기 위한 참조로서 인용된다.
값의 범위가 제시되는 경우, 범위의 상한과 하한 사이에 존재하는 값과 (문맥상 명백하게 다르게 말하지 않는 한, 하한의 단위의 10 분의 1 까지) 다르게 언급된 또는 언급된 범위 내 사이의 임의의 값이 본 발명 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 독립적으로 작은 범위 내에 포함될 수 있는 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한 또한 본 발명 내에 포함되는데, 이는 언급된 범위 내 임의의 특히 배제되는 제한에 따른다. 언급된 범위가 하나 또는 그 제한 모두를 포함하는 경우, 이러한 포함된 제한을 배제한 범위 또한 본 발명에 포함된다.
본원에서, 그리고 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형태는 문맥에서 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 그에 해당하는 복수형을 포함한다는 것으로 알아야 한다. 본원에서 사용되는 모든 기술 및 화학적 용어는 동일한 의미를 갖는다.
본원에서 논의된 공개문헌은 단지 본 출원의 출원일자 이전에 개시된 것들만 제공된다. 본원의 어느 것도 본 발명이 이전 발명에 의한 그러한 공개문헌을 날짜적으로 앞설 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 파악되서는 안된다. 또한, 제시된 출판일은 실제 출판일과 상이할 수 있어 별도로 확인할 필요가 있을 수도 있다.
본 발명은 본 발명의 취지 및 본질적인 요소에서 벗어나지 않고 다른 특정 형태들로 구현화될 수도 있고, 따라서, 발명의 범주는 지시되는 바와 같이 하기 명세서보다는 첨부된 청구항들을 참조하여 이루어져야 한다.
실시예
하기 실시예는 당업자에게 본 발명을 어떻게 만들고 사용하는지의 완전한 명세 및 설명을 제공하기 위해 제시되었고, 발명자가 간주하는 발명의 범위를 제한하도록 의도된 것이 아니며, 하기 실험이 전체 또는 유일하게 수행된 실험들을 나타내도록 의도된 것도 아니다. 사용된 숫자 (예를 들어, 양, 온도 등) 에 대해서 정확성을 확보하려고 노력하였으나, 일부 실험적 오류 및 편차가 고려되어야만 한다. 다르게 제시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨이고, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.
실시예 1. 트랜스제닉 CRND8 마우스 모델 시스템을 사용하는 AD -유사 병리생물학 및 인지 저하에 대한 만성 렙틴 -치료 효과
1.1. 물질 및 방법
1.1 (a). 시약 및 항체
알츠하이머 전구체 단백질 (APP) 643-695 모노클론 항체 (mAb) 를 Millipore (Billerica, MA) 에서 구입하였다. 토끼 항-PPARγ 및 -SOCS3, Tau (pSer396) mAb 및 tau (tau46) mAb 를 Cell Signaling 에서 구입하였다. PHF-tau mAb (clone AT8) 를 Pierce Biotechnology (Rockford, IL) 에서 구입하였다. PHF-1 mAb 는 Dr. Peter Davies, Albert Einstein College of Medicine (Bronx, NY) 로부터 제공받았다. 토끼 항-tau (pThr181) 를 Sigma-Aldrich 에서 구입하였다. 토끼 항-α-튜불린, -렙틴 및 -렙틴 수용체 (OB-R) 를 Affinity BioReagents (Golden, CO) 에서 구입하였다.
1.1 (b). 동물 및 사육
이 연구를 위해 C3H/He-C57BL/6 백그라운드 상에 V717F (인도 돌연변이) 와 함께 KM670/671/NL (스위스 돌연변이) 에서의 이중 돌연변이를 갖는 APP695 유전자를 보유하는 CRND8 마우스 (n=22) 및 야생형 마우스 (n=20) 를 사용하였다. 도착하면 모든 동물을 그룹을 지어 거주시키고, 음식과 물에 자유롭게 접근하도록 두고, 12 시간 광/암 주기로 유지하였다. 모든 동물을 [Case Western Reserve University] 동물실험 윤리위원회 (IACUC) 에 의해 승인된 프로토콜에 따라 처리하고, 실험군을 랜덤한 방식으로 결정하였다. 모든 동물은 건강 상태의 일반적인 측정을 위해 실험 동안 3 회 칭량하였다.
1.1 (c). 렙틴 펌프 이식
펌프 이식을 하기와 같이 실시하였다. 간략하게는, 마우스에 아버틴을 복강내 주사하여 마취시킨 다음, 피하 Alzet 미니삼투압 펌프 (모델 2004, Durect Corp., Cupertino, CA, USA) 를 수술적으로 장착시켰다. 13 마리의 CRND8 동물에게 PBS 내 20 ㎍ 렙틴의 일일 복용량 (0.25 ㎕/h of 3.33 mg/ml 재조합 쥣과 렙틴) 을 주었고; 및 9 마리에는 PBS 를 주입하고; 모든 야생형 마우스에는 PBS 를 주입하였다. 총 8 주의 처리 동안 4 주에 오래된 펌프를 다시 채워진 삼투압 펌프로 대체하였다.
1.1(d). ELISA
모든 어세이는 제조자의 특정 지침에 따라 수행하였다. 모든 혈청 마커의 수준은 450 nm 에서의 OD 대 공지된 농도의 일련 희석물로 작성된 표준 곡선으로부터 계산하였다.
혈청 내 마우스 인슐린 수준을 마우스 인슐린 ELISA 키트 (Millipore) 를 사용하여 측정하였다. 간략하게는, 본 어세이는, 순차적으로: 1) 미리-적정된 양의 모노클론 마우스 항-래트 인슐린 항체로 코팅된 마이크로타이터 플레이트의 웰에 샘플로부터의 인슐린 분자의 포획 및 포획된 인슐린에 대한 비오티닐화된 폴리클론 항체의 결합, 2) 샘플로부터 미결합된 물질의 세정 제거, 3) 고정화된 비오티닐화 항체에 대한 호스래디쉬 퍼옥시다아제의 결합, 4) 유리 효소 접합체의 세정 제거, 및 5) 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘의 존재하에서의 호스래디쉬 퍼옥시다아제 활성의 모니터링에 의한 고정된 항체-효소 접합체의 정량에 근거한 샌드위치 ELISA 이다. 효소 활성은 형성된 생성물의 산성화 후 450 nm 에서의 증가된 흡광도에 의해 분광 광도계로 측정하고, 590 nm 에서의 흡광도로 교정하였다. 흡광도 증가는 미공지된 샘플 내 포획된 인슐린의 양과 직접적으로 비례하므로, 미공지된 샘플 내 포획된 인슐린의 양은 알려진 농도의 래트 인슐린의 참조 표준으로의 동일한 어세이에서 발생되는 참조 곡선으로부터의 내삽에 의해 유도될 수 있다.
혈청 내 마우스 α-TNF 수준은 마우스 TNFα ELISA 키트 (R&D Systems; Minneapolis, MN) 를 사용하여 측정하였다. 간략하게는, 본 어세이는 정량적 샌드위치 효소 면역어세이 기술을 사용한다. 마이크로플레이트를 마우스 TNF-α 에 특이적인 폴리클론 항체로 미리 코팅한다. 표준, 대조군 및 샘플을 웰 내로 파이펫으로 옮기고, 존재하는 임의의 마우스 TNF-α 는 고정화된 항체에 의해 결합된다. 임의의 미결합된 성분을 세정 제거한 후, 마우스 TNF-α 에 특이적인 효소-연결 폴리클론 항체를 웰에 첨가한다. 임의의 미결합 항체-효소 시약을 제거하기 위해 세정한 후, 기질 용액을 웰에 첨가한다. 효소 반응은 청색 생성물을 산출하고, 정지 용액을 첨가하였을 때 황색으로 변한다. 측정된 색상의 강도는 초기 단계에서 결합된 마우스 TNF-α 의 양에 비례한다. 그 후 샘플 값을 표준 곡선에 대해 읽는다.
혈청 내 마우스 C-반응성 단백질 (CRP) 수준을 마우스 C-반응성 단백질 ELISA 정량 키트 (Genway; San Diego, CA) 를 사용하여 측정하였다. 간략하게는, 혈청 샘플 내에 존재하는 CRP 는 폴리스티렌 마이크로타이터 웰의 표면 상에 흡착된 항-CRP 항체와 반응한다. 세정에 의해 미결합 혈청 단백질을 제거한 후, 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP) 와 공액된 항-CRP 항체를 첨가한다. 상기 효소-표지된 항체 형태는 미리 결합된 혈청 CRP 와 복합체를 형성한다. 또다른 세정 단계 후, 면역흡착물질에 결합된 효소를 색원체 기질인 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 의 첨가에 의해 어세이한다. 결합된 효소의 양은 시험된 샘플 내 CRP 의 농도에 따라 직접적으로 달라지므로, 450 nm 에서의 흡광도는 시험된 샘플 내 CRP 의 농도의 측정값이다. 시험 샘플 내 CRP 의 양은 표준으로부터 구축된 표준 곡선으로부터 내삽되고, 혈청 희석에 대해 교정될 수 있다.
혈청 내 마우스 렙틴 수준을 Quantikine 마우스 렙틴 면역어세이 (R&D Systems; Minneapolis, MN) 를 사용하여 측정하였다. 간략하게는, Quantikine 마우스 렙틴 면역어세이는 정량적 샌드위치 효소 면역어세이 기술을 사용한다. 마이크로플레이트를 마우스 렙틴에 특이적인 친화성 정제 폴리클론 항체로 미리 코팅한다. 표준, 대조군 및 샘플을 웰 내로 파이펫으로 옮기고, 존재하는 임의의 마우스 렙틴은 고정화된 항체에 의해 결합된다. 임의의 미결합된 성분을 세정 제거한 후, 마우스 렙틴에 특이적인 효소-연결 폴리클론 항체를 웰에 첨가한다. 임의의 미결합 항체-효소 시약을 제거하기 위해 세정한 후, 기질 용액을 웰에 첨가한다. 효소 반응은 청색 생성물을 산출하고, 정지 용액을 첨가하였을 때 황색으로 변한다. 측정된 색상의 강도는 초기 단계에서 결합된 마우스 렙틴의 양에 비례한다. 그 후 샘플 값을 표준 곡선에 대해 읽는다.
인간 Aβ1-40 혈청 수준을 Aβ1-40 비색 면역어세이 키트 (Invitrogen; Carlsbad, CA) 를 사용하여 측정하였다. 간략하게는, 인간 아밀로이드 β (Hu Aβ) 의 NH2 말단에 특이적인 모노클론 항체를 마이크로타이터 스트립의 웰 상에 미리 코팅하였다. 첫번째 인큐베이션 동안, 공지된 Hu Aβ 함량의 표준, 대조군 및 미공지된 샘플을 1-40 Aβ 서열의 COOH-말단에 대해 특이적인 토끼 항체와 함께 인큐베이션하였다. 상기 COOH-말단 서열은 분석된 전구체의 분할시 생성된다. 결합된 토끼 항체는 호스래디쉬 퍼옥시다아제-표지 항-토끼 항체를 사용하여 검출된다. 세정 후, 호스래디쉬 퍼옥시다아제-표지 항-토끼 (효소) 를 첨가한다. 두번째 인큐베이션 및 모든 미결합된 효소를 제거하기 위한 세정 후, 기질 용액을 첨가하고, 이것은 결합된 효소에 의해 작용할 시 색상을 나타낸다. 상기 색상을 나타내는 생성물의 강도는 본래 시편에 존재하는 Hu Aβ40 의 농도에 직접적으로 비례한다.
1.1(e). 조직 수집, 처리, 추출 및 면역어세이
부검시, 뇌를 제거하고 2 개 반구 내 중앙선을 따라 나누었다. 하나의 반구를 드라이 아이스 상에서 동결시키고 나머지 반구를 10% 중성 완충 포르말린에 함침 고정시키고, 파라핀 왁스 내에 처리하였다.
1.1(e)(i) 면역화학
파라핀 블록 내 뇌를 해마를 가로질러 연속적으로 (50 ㎛) 시상면으로 섹션하고, 일차 항체로서 4G8 (이것은 Aβ 내의 17 내지 24 아미노산 조각을 인지함) 을 사용하여 면역염색하였다. 세정 후, 염소 항-마우스 이차 항체를 실온에서 부가적인 30 분 동안 인큐베이션하고, 섹션을 아비딘-비오틴-HRP 복합체 (Vectastain Elite ABC kit, Vector, Burlingame, CA) 및 H2O2 중의 디아미노벤지딘 테트라히드라클로라이드 (DAB) 로 가시화하였다. Aβ 침전의 정량은 Zeiss Axiocam (Munchen-Hallbergmoss, Germany) 및, 혼용가능한 이미지 분석 소프트웨어, Axiovision (Carl Zeiss Vision GmbH, Munchen-Hallbergmoss, Germany) 를 사용하여 수행하였다. 각각의 동물을 Aβ 침전에 대해 정량화하였다. 간략하게는, 5X 대물렌즈를 사용하여, 전체 해마를 포함하는 단일 시야영역을 선택하고, 양성 염색을 시야영역을 가로질러 염색된 % 영역으로서 표현하였다. 동물 당 모둔 섹션으로부터 수득된 값을 평균내었다. 섹션을 플라크의 수, 플라크의 크기, 및 아밀로이드 적재량 (항체에 의해 염색된 영역의 % 로서 정의됨) 에 대해 분석하였다.
1.1(e)( ii ) 면역블롯팅
동결된 뇌 샘플을 칭량하고, 메스로 다진 다음, 동일 부피의 10% PBS (pH 7.4) 로 옮겼다. 조직을 다운스 호모게나이저를 사용하여 균질화하고, 10 mL 추출 시약 당 1 그램 조직의 비로, 프로테아제/포스파타아제 저해제 (Pierce) 가 보충된 T-PER 조직 추출 시약 (Pierce) 을 사용하여 단백질을 추출하였다. 10,000 rpm 에서 5 분 동안 샘플을 간단히 원심분리하고, 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. 각각의 샘플에 DNase (Pierce) 를 첨가하고, 37℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 총 단백질을 Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit (Pierce) 로 측정하고 샘플 (25 ㎍) 을 면역블롯에 의해 분석하였다. tau-pSer396 을 제외한 모든 일차 항체, 총 tau (모두 1:500), 및 PHF-tau AT8 (1:200), 및 이차 항체를 각각 1:10,000 의 최종 희석물로서 사용하였다.
1.1(f) 행동 측정
인지 수행력의 성립된 측정에 대한 행동 시험을 처리 4 및 8 주 후에 수행하였다.
1.1(f)(i) 추적 공포 조건화
맥락 및 단서 공포 조건화 시험은 불쾌한 (조건화된) 자극을 기억하고, 이것을 특정 환경 (맥락) 과 연결시키는 능력을 측정하는 것이다. 맥락 공포 조건화는 일반적으로 해마-의존성인 것으로 여겨지는 학습력의 형태인 반면, 단서 공포 조건화는 일반적으로 해마-독립성인 것으로 여겨진다. 본 프로토콜은 2 일에 걸쳐 수행된다.
제 1 일 - 훈련: 제 1 일에 동물은 2 분 동안 챔버 (Med Associates, Burlington, VT) 내에서 풀어놓은 다음, 백색 노이즈 (80 dB) 를 30 초간 제시하였고, 이 자극을 조건화된 자극 (CS) 으로서 지칭한다. 2 초 간격 후, 동물에게 0.5 mA 쇼크를 제공하며; 이것을 비조건화된 자극 (US) 으로서 지칭한다. 본 절차를 4 회 반복한다.
제 2 일 - 맥락/변형된 맥락/단서 시험: 훈련 후 24 시간에, 동물을 본래의 챔버로 되돌려놓고, 한차례 얼어붙음을 US 와 맥락 사이의 (맥락) 연관성을 측정하기 위해 5 분 동안 점수화한다. 얼어붙음은 5 분 동안의 30 회 관찰을 모은 것으로 디자인된 적합한 소프트웨어 (Med Associates, Burlington VT) 를 사용하여 자동적으로 측정된다. 맥락 얼어붙음을 측정한 후, 동물을 그들의 우리로 1 시간 동안 되돌려놓는다. 챔버 환경을 변경시키고 (새로운 벽, 바닥 및 체취 실마리), 동물을 "새로운" 챔버에 6 분 동안 도입한다. 얼어붙는 비율을 CS 의 부재하에서 (변형된 맥락) 3 분 동안 맥락 시험에서 상기 기재된 바와 같이 정량화하였다. 나머지 3 분 동안 동물에게 변형된 맥락에서 CS 와 함께 제시하고, 이전에 기재된 바와 같이 얼어붙는 행동에 대해 점수를 내서 단서 공포 조건화 점수를 측정하였다.
1.1(f)( ii ) 신규 물체 인지
신규 물체 인식 시험을 복합 개방-시야 박스 (20" x 20" x 17" x 4) (San Diego Instruments, San Diego, CA) 에서 수행하였다. 훈련 전에, 마우스를 시험 전날에 5 분 동안 개방-시야 박스를 탐험하게 하여 개별적으로 길들였다. 훈련 세션 동안, 2 개의 동일한 신규 물체를 개방-시야 내에 서로 16" 떨어지게 두고, 동물이 10 분 동안 탐험하게 하였다. 동물의 머리가 물체로부터 ½ cm 마주하고 있거나, 물체를 건드리는 경우 물체를 탐험하고 있다고 간주하였다. 동물이 물체를 환경을 탐험하기 위한 버팀목으로서 사용하는 경우에는, 이것은 탐험으로 고려하지 않았다. 각각의 동물이 각각의 물체를 탐험하는데 소비한 시간을 기록하였다. 훈련 직후에 동물을 그들의 우리로 되돌려놓았다. 훈련 후 1 시간에, 동물을 1 개의 신규한 물체 및 1 개의 이전에 탐험한 물체를 담고 있는 개방-시야 박스 내로 재도입하였다. 물체는 유사한 탐험적 수준/물리적 복잡성 (즉, 이전의 물체가 구멍을 가지고 있었다면, 새로운 물체도 역시 그러하였음) 및 유사한 크기를 가지고 있었다. 기억 시험 동안, 동물을 개방-시야 박스 내로 도입하고 5 분 동안 자유롭게 탐험하게 하였다. 양육 및 몸단장 빈도 및 기간외에 모든 물체에 대해 소비한 시간 및 소비한 빈도를 기록하였다. 가능한 고유의 체취를 피하기 위해 각 세션 후에 개방-시야 박스 및 물체를 70% 에탄올로 전체적으로 세정하였다. 차별 지수 (새로운 물체에 소비한 총 시간/물체 탐험 총 시간) 를 사용하여 인식 기억력을 측정하였다.
1.1 (g) 통계 분석
통계 데이터 분석을 분산 분석 및 터키-크래머 (Turkey-Kramer) 다중 비교 검정으로 수행하였다. 밀도계측 분석은 UN-SCAN-IT 젤 6.1 소프트웨어 (Silk Scientific; Orem, UT) 를 이용하여 수행하였다. p<0.05 는 통계적으로 유의미한 것으로 고려되었다.
실시예 1.2. 인슐린 및 전-염증성 단백질에 대한 렙틴 투여의 효과
첫번째 세트의 연구에서는 TgCRND8 마우스의 혈청 내 검출가능한 렙틴의 수준을 시험하였다. 도 1 은 ELISA 에 의한, 렙틴- 또는 식염수 -처리된 CRND8 또는 야생형 마우스로부터의 혈청에서 측정된 CRND8 및 야생형 마우스 내 렙틴, 인슐린 및 CRP 의 혈청 농도 (ng/ml) 의 막대 그래프를 보여준다. 렙틴-처리된 트랜스제닉 동물은 식염수-처리된 동물 (좌측, 어두운 회색 막대) 에 비해 유의하게 (p<0.05) 상승된 렙틴 수준 (도 1A; 죄측, 우측 회색 막대) 을 보였다. 식염수-처리된 TgCRND8 에서 검출가능한 수준은 야생형 (wt) 한배새끼 (우측 막대) 에 필적하였다. 렙틴- 또는 식염수-처리된 마우스에서 관찰되는 인슐린 수준에서는 유의한 차이가 없었다 (도 1B).
체내에서 염증 과정 동안 현저하게 수준이 상승하는 단백질인 C-반응성 단백질 (CRP) 은 염증에 대한 바이오마커로서 사용된다. 렙틴- 또는 식염수-처리된 동물에서 CRP 수준에 있어 검출가능한 차이가 없었다 (도 1C). 이러한 결과는 렙틴 처리에 대한 반응에서 변화가 없었던 다른 염증 단백질, 특히 TNFα 및 코티솔 (데이터는 제시되지 않음) 로의 발견과도 유사하였다.
실시예 1.3. 뇌 내 렙틴 투여에 의해 조절되는 경로
일반적으로, 렙틴의 수용체-후 결합이 중앙 및 말초 조직 내 Janus 티로신 키나아제 2 (JAK2), 신호 전달자 및 활성화제 3 (STAT3), 및 사이토카인 신호 3 의 억제자 (SOC3) 의 활성화를 통해 유전자 전사 변화를 유도하는 JAK/STAT 경로를 촉발시킨다고 여겨져 왔다. 렙틴-처리된 및 식염수-처리된 마우스의 뇌 내 렙틴의 수준을 조사하고, 렙틴의 추정적 다운스트림 효과기, 구체적으로는 SOCS3 및 페록시좀 증식자-활성화 수용체-γ (PPARγ) 를 시험하여 이들이 증가되었는지를 측정하였다.
도 2 는 렙틴-처리된 또는 식염수-처리된 CRND8 또는 야생형 (wt) 마우스로부터의 뇌에서의 렙틴, OB-R(긴것), SOCS3, PPARγ 및 α-튜불린을 보여주는 면역블롯을 나타낸다. 멤브레인을 스트리핑하고, 표준화를 위해 α-튜불린 항체로 재-탐침하였다. 대표적인 블롯을 제시한다 (n=3). 표준화된 밴드를 밀도계측에 의해 분석하고 평균 밀도 ± SD 로 제시한다. * 대 마차가지로 식염수-처리된 것. 렙틴 수준은 식염수-처리된 것에 비해 렙틴-처리된 동물의 뇌에서 유의하게 (p<0.05) 더 높았다 (도 2A, 최상위 열; 도 2B, 밝은 회색 막대). 대조군에 비해 렙틴-처리된 뇌에서 렙틴 수용체 (OB-R)b 의 긴 이소형의 발현에는 큰 변화가 없었다 (도 2A, 두번째 열; 도 2C). 렙틴-처리된 TgCRND8 동물에서 SOCS3 의 발현에는 (도 2A, 세번째 열) 유의한 증가가 없었다 (p>0.05) (도 2D) .
β-세크레타아제 (BACE) 를 조절하는 것으로 알려진 전사 인자인 PPARγ 는 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 프로세싱에 핵심 효소이고 렙틴 작용을 조절하는데 관여하는 것으로 여겨진다. 렙틴-처리된 트랜스제닉 동물은 대조군에 비해 PPARγ 수준의 유의한 (p<0.05) 증가를 나타내었다 (도 2A, 네번째 열; 도 2E, 밝은 회색 막대).
실시예 1.4. 렙틴 -처리된 TgCRND8 마우스에서의 Aβ 수준 및 플라크 침전
플라크 형태의 Aβ 의 세포외 축적은 AD 의 틀림없는 병리학적 특징이고, 축적된 양은 그것의 생성, 분비, 응집 및 소거 속도에 따라 다르다.
TgCRND8 마우스는 스위스 (K670N 및 M671L) 및 인도 (V717F) 가족력 AD (FAD) 돌연변이를 함유하는 인간 APP 유전자를 과발현한다. 상기 언급된 렙틴 처리는 전형적으로는 총 뇌 Aβ 수준이 올라가기 시작하는 10 개월령에서 개시되었고 Tg2576 마우스에서 첫번째 Aβ 침전물이 출현하는 12 개월령에서 완료되었다. TgCRND8 마우스로의 상기 연구에서, 전체 처리 (4 개월령 내지 6 개월령) 는 대략 3 개월령에서 시작하는 플라크-후 기간 동안 수행하였다.
도 3 은 CRND8 및 야생형 마우스에서 APP C-말단 조각 (CTF) 및 가용성 Aβ1-40 의 발현을 나타낸다. (A) 에서 렙틴- 또는 식염수-처리된 CRND8 또는 야생형 마우스로부터의 뇌를 수확하고, APP CTF (C99, C83) 의 발현을 면역블롯에 의해 측정하였다. 멤브레인을 스트리핑하고, 표준화를 위해 α-튜불린 항체로 재-탐침하였다. 대표적인 블롯을 제시한다 n=3. (B) 에서, 표준화된 밴드 (C99/C83 및 총 CTF/α-튜불린의 비) 를 밀도계측에 의해 분석하고 평균 밀도 ± SD 로 제시한다. 렙틴- 또는 식염수-처리된 CRND8 또는 야생형 마우스의 혈청 (D) 에서 또는 뇌에 존재하는 가용성 Aβ1- 40 의 수준을, (C) 에서, ELISA 에 의해 측정하였다. 가용성 뇌 Aβ1- 40 의 수준을 가용성 뇌 단백질의 총 양에 대해 표준화하였다. 결과를 평균 농도 (뇌 - pg/mg 총 단백질, n=5; 혈청 - pg/ml, n=10) ± SD 로서 나타낸다. * 대 식염수-처리된 TgCRND8 세포. 렙틴-처리된 TgCRND8 마우스의 뇌 (도 3A, 회색 막대) 및 혈청 (도 3B, 회색 막대) 모두에서 Aβ1-40 수준의 유의한 (p<0.05) 감소가 관찰되었다.
렙틴 처리는 렙틴 처리가 뇌 APP 가, BACE 의 작용에 의해 유도되고 Aβ 의 직접적 전구체인 APP 의 C99 C-말단 조각 (CTF) (도 3C), 또는 α-세크레타아제의 작용에 의해 유도되는 비-아밀로이드원성 생성물인 APP 의 C83 CTF 로의 가공처리를 변경할 수 있는지를 측정하기 위해 연구되었다. C99 조각 대 C83 종류의 비 (도 3D, 상부 패널) 및 총 CTF (하부 패널) 의 유의한 (p<0.05) 감소가 렙틴-처리된 동물 대 식염수-처리된 대조군에서 관찰되었다. 이것은 BACE 활성 조절에서의 렙틴의 관여와 일치한다.
도 4 는 렙틴-처리된 TgCRND8 마우스 내 아밀로이드 플라크 침전을 보여준다. A 에서, 뇌 슬라이스를 해마 영역에서 4G8 항체로 염색하였다; Le - 렙틴으로 처리된 트랜스제닉 동물; Sa - 식염수로 처리된 트랜스제닉 동물. B 에서, 막대는 플라크의 평균 크기 (㎛m2) ± S.E.M. 또는 (C) 영역 내 염색된 % 면적 ± S.E.M. 을 나타낸다; 막대 당 n=8-9. D. 4G8 항체로 염색된 피질 영역.
파라핀-함침 뇌 섹션의 면역조직학적 시험 (도 4) 은 8 주의 렙틴 처리가 연령 및 성별이 부합된 식염수-처리된 트랜스제닉 마우스과 비교하여 6 개월 령 TgCRND8 마우스의 해마 내 아밀로이드 적재량을 유의하게 (p<0.05) 감소시켰다 (도 4A) 는 것을 보여주다. 이것은 기능적 (OB-Rb) 렙틴 수용체에 특히 풍부한 영역이다. 해마 내에서 유의하게 감소된 아밀로이드 적재량 (4G8 항체로 염색된 영역 % 로서 정량화됨) 은 플라크의 평균 크기 감소와 비례하였다 (도 4B 및 4C); 상기 영역 내 플라크의 전체적인 수에서의 유의한 변화는 없었다 (데이터는 제시하지 않음). 피질과 같은 다른 뇌 영역의 검사 (도 4D) 는 유사한 염색 패턴을 제시하였다.
실시예 1.5. 렙틴 -처리된 트랜스제닉 동물은 감소된 Tau 인산화를 보인다
신경섬유 매듭 (NFT) 은 AD 에서의 인지 상실과 밀접하게 관련되는 고도로 인산화된 tau 단백질의 뉴런내 축적물이다. 일반적으로 tau 단백질의 비정상 인산화는 붕괴된 미세관 기능, 비정상 단백질 트래피킹, NFT 의 형성 및 결과적인 뉴런 사멸을 야기하는 것으로 여겨진다.
TgCRND8 또는 Tg2576 마우스는 NFT 를 발달시키지 않는데, 일부 연구에서는 Tg2576 마우스에서의 증가된 뇌 tau 인산화를 보고하고 있다. 렙틴-처리된 또는 식염수-처리된 트랜스제닉 또는 야생형 (wt) 마우스의 뇌 내 인산화-tau 수준을 평가하였다. 도 5 는 TgCRND8 및 야생형 마우스 뇌 내 AD-관련 tau 인산화를 보여준다. A 에서, 렙틴- 또는 식염수-처리된 CRND8 또는 야생형 마우스로부터의 뇌를 수확하고, (B) Ser396, (C) PHF-1 (Ser396 /404), (D) AT8 (Ser202 /204) 및 (E) Ser181 에서의 tau 인산화를 면역블롯에 의해 분석하였다. 멤브레인을 스트리핑하고, 표준화를 위해 tau 항체로 재-탐침하였다. 대표적인 블롯을 제시한다 (n=3). 표준화된 밴드를 밀도계측에 의해 분석하고 평균 밀도 ± SD 로 제시한다. * 대 식염수-처리된 CRND8 마우스.
식염수-처리된, 트랜스제닉 마우스는 시험된 모든 에피토프에서 비교적 높은 수준의 인산화-tau 를 발현하였다 (도 5A; 도 5B-5E, 좌측 어두운 회색 막대). 렙틴-처리는 야생형 동물의 뇌에서 관찰된 수준보다 (우측 막대) 각각의 AD-관련 에피토프에서 인산화-tau 를 유의하게 (p<0.05) 감소시켰다 (좌측 밝은 회색 막대) . 이 결과는 tau 가 TgCRND8 마우스에서 과인산화된 것을 보여준다.
실시예 1.6. 렙틴으로 처리된 TgCRND8 마우스의 행동 개선
1.6(i) 신규 물체 인지
a) 렙틴으로 처리된 TgCRND8, b) 식염수로 처리된 TgCRND8 및 c) 식염수로 처리된 야생형의, 3 개의 그룹의 동물을 4 및 8 주 처리 기간 후에 신규 물체 인식 시험으로 시험하였다.
도 6 은 CRND8 및 야생형 마우스의 인지 평가를 나타낸다. 신규 물체 인식 시험 (A) 에서, 작업 기억력을 야생형 및 4- 또는 8-주, 렙틴- 또는 식염수- 처리된 트랜스제닉 마우스에서 친숙한 물체 대 신규한 물체를 탐험하는데 소비되는 시간으로서 점수를 매겼다. 점선은 동물 기억력을 나타내고 (두 물체 사이의 총 소비 시간의 ½ 을 초과하는 시간을 새로운 대상에 대해 소비함); 그 선 아래의 임의의 것은 기억력 손상을 나타낸다. Tg-Lep 대 Tg-식염수의 경우 *p=0.01; Tg-sal 대 WT 의 경우 *p=0.003. 공포 조건화 시험 (B) 에서, 회피 학습력 과제를 사용하여 야생형 및 렙틴- 또는 식염수-처리된 트랜스제닉 마우스에서 불쾌한 자극에 대한 공포 반응을 측정하였다. 얼어붙음을 맥락 공포 조건화에 대한 여러 훈련 세션 (경미한 발쇼크) 전 후 본래 챔버에서 또는 발쇼크와 이전에 짝지워진 청각 단서를 포함하는 신규 환경에서 정량화하였다. Context: WT 대 Tg+Lep 의 경우 *p=0.009; WT 대 Tg+Sal 의 경우 *p=0.0001; Cued: WT 대 Tg+Lep 의 경우 *p=0.012; WT 대 Tg+Sal 의 경우 *p=0.0001; Tg+Lep 대 Tg+sal 의 경우 *p=0.04.
렙틴-처리된 TgCRND8 및 야생형 마우스는 식염수로 처리된 트랜스제닉과 비교하여 신규 물체에서 유의하게 (p<0.05) 더 많은 시간을 소비하였다 (도 6A). 이것은 식염수 처리된 TgCRND8 에 비해, 렙틴 4 내지 8 주 처리한 후 TgCRND8 마우스의 작업 기억력 수행력의 개선이 있었음을 나타냈다. 렙틴-처리된 트랜스제닉 동물은 이 시험에서 야생형 마우스와 구별할 수 없었으나, 식염수-처리된 TgCRND8 마우스는 모든 다른 그룹과 비교하였을 때 매우 열악하게 수행하였다 (도 6A). 그러므로, 1-2 개월의 만성 렙틴 처리는 6 개월 령 TgCRND8 마우스에서 본 인지 과제에서의 손상된 수행력을 제거하였다.
1.6( ii ) 공포 조건화 ( FC )
본 시험에서, CS (청각 단서) 와 US (경미한 발쇼크) 의 반복되는 쌍 후에 맥락 및 단서 공포 관련 기억력의 훈련 및 측정을 위해 회피 훈련 챔버를 사용하였다. 동물을 본래 챔버에 맥락 공포 조건화를 시험하기 위한 훈련 후 24 시간에 두거나 단서 공포 조건화에 대해 시험하기 위해 CS 의 존재하의 신규 환경하에 두었다. 도 6B (도에서, x-축은 % 얼어붙은 시간을 나타냄) 에서 제시되는 바와 같이, TgCRND8 마우스는 식염수-처리된 동물과 비교하여 8 주 렙틴 처리 후에 맥락 공포 조건화 시험에서 더욱 잘 수행하였다. 이 발견은 통계학적으로 유의하였다 (p<0.06). 부가적으로, 렙틴 처리는 통계학적으로 유의한 (p<0.05) 단서 공포 조건화에서의 수행력 개선을 야기하였다. 변형된 맥락에서 시험하였을 때의 통계학적 유의성이 없던 것과 적은 얼어붙음 반응 (데이터는 제시하지 않음) 은 동물이 변형된 맥락을 인지하지 않았다는 것을 나타낸다.
1.7. 요약:
결과는 식염수 대조군과 비교하였을 때 트랜스제닉 CRND8 마우스 모델 시스템을 사용하는 AD-유사 병리생물학 및 인지 저하에 대한 만성 렙틴-처리의 효과를 증명한다. 렙틴-처리된 동물은 뇌 및 혈청 모두에서 감소된 Aβ1-40 수준을 갖는 것으로 발견되었다. 뇌에서, 아밀로이드원성 경로를 통한 APP 의 처리과정 감소가 관찰되었다. 또한, 렙틴-처리된 동물은 해마에서 아밀로이드 적재량의 유의한 감소를 보였고, 이것은 4G8-염색된 아밀로이드 플라크의 평균 크기의 감소 (수가 아님) 와 연관이 있었다 (도 4). 뇌 추출물 중 총 가용화된 Aβ1- 40 의 양의 현저한 감소에도 불구하고 (렙틴 처리 8 주 후 세제-추출성 Aβ1- 40 에서의 52% 감소), 피질 영역은 처리에 의해 덜 영향을 받았다.
렙틴은 식염수 처리와 비교하여 CRP (도 1C), TNFα 또느 코티솔 (데이터는 제시하지 않음) 의 수준을 유의하게 변경시키지 않았다.
일반적으로, 렙틴은 연장된 수용체 (OB-R) 활성화에 따라 Jak2/STAT3 신호를 저해하는 음성 사이토카인 조절자인 SOCS3 과 피드백 루프를 형성하는 것으로 여겨진다. SOCS3 신호의 과활성화는 염증 경로의 지속되는 억압을 야기하므로, 면역억제에 대한 위험을 증가시킬 수 있다. 렙틴-처리된 TgCRND8 및 야생형 동물은 증가된 SOC3 발현을 보이지 않았고 (도 2D), 렙틴의 만성 투여가 면역 결핍을 야기하지는 않는 것 같다고 암시된다.
PPARγ 는 렙틴 신호의 다운스트림 표적이다. 렙틴-처리된 트랜스제닉 마우스는 PPARγ 발현의 큰 증가를 나타내었다 (도 2E). 렙틴-처리된 TgCRND8 마우스는 뇌 및 혈청 모두에서 아밀로이드원성 C99 APP 조각의 수준 및 Aβ1-40 수준의 감소를 나타내었다 (도 3).
TgCRND8 마우스의 렙틴 처리는 모든 시험된 에피토프에서 인산화-tau 의 수준을 현저히 감소시켰다 (도 5). 일반적으로, tau 의 과인산화 유도 (그러나 tau 올리고머화는 아님) 가 APP 를 발현하는 트랜스제닉 마우스에서 공통적이라는 것으로 여겨진다.
렙틴-처리된 TgCRND8 마우스는 식염수-처리된 한배새끼와 비교하여 신규 물체 인지 및 공포 조건화 시험에서 개선된 인지 수행력을 나타내었다 (도 6). 렙틴-처리된 트랜스제닉 마우스의 해마에서 감소된 아밀로이드 적재량이 발견되었다 (도 4A).
본 발명은 렙틴의 (i) AD-유사 병리학적 경로를 경감할 수 있는 능력; 및 (ii) TgCRND8 마우스의 인지 퇴행의 복귀 또는 방지 효험을 증명한다. 렙틴 처리는 염증과 연관성이 없었다.
실시예 2.
2.1. 물질 및 방법
2.1(a). 배지
최소 필수 배지 (Minimum Essential Medium, MEM) 를 ATCC (Manassas, VA) 에서 구입하였다. 신경기초 배지 (Neurobasal medium), B27 보충제, 및 L-글루타민을 Gibco (Carlsbad, CA) 에서 구입하였다. 트립신-EDTA 및 페니실린 용액을 MP Biomedicals (Solon, Ohio) 에서 구입하였다. 우태 혈청 (FBS), 모든 트랜스형의 레티노산 (RA), 및 인간 재조합 렙틴을 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 에서 구입하였다. 5-아미노이미다졸-4-카르복시아미드 리보뉴클레오시드 (AICAR) 를 Cell Signaling Technology (Danvers, MA) 에서 구입하였다. 미리스톨화-AIP (Myr-AIP) (CaM 키나아제 II 저해제 - 1 μM) 를 Biomol International (Plymouth Meeting, PA) 에서 구입하였다. 화합물 C (AMPK 저해제 - 1 μM), D-에리트로-스핑고신, N-아세틸-(C2 세라마이드) (PP2A 활성화제 - 1 μM), 염화리튬 (LiCl) (GSK-3β 저해제 - 10 mM), N4-(6-아미노피리미딘-4-일)-술파닐아미드, HCl (N6A4S) (CDK5 저해제 - 2 μM), 푸라닐-니트로아미노구아니딘 (FNG) (ERK 저해제 - 20 μM), 안트라[1,9-코]피라졸-6(2H)-온 1,9-피라졸로안트론 (SP600125) (JNK 저해제 - 100 nM), KT5720 (PKA 저해제 - 100 nM), 2-히드록시-4-(((4-메틸페닐)술포닐옥시)아세틸)아미노)-벤조산 (S3I-201) (STAT3 저해제 - 100 μM), 5-(2,2-디플루오로-벤조[1,3]디옥솔-5-일메틸렌)-티아졸리딘-2,4-디온 (522DB 13D) (PI3K 저해제 - 20 μM), lL6-히드록시메틸-키로-이노시톨-2-(R)-2-0-메틸-3-0-옥타데실-sn-글리세로카보네이트 (1L6HCI) (Akt 저해제 - 5 μM), 2-(4-클로로페닐)-4-(4-플루오로페닐)-5-피리딘-4-일-1,2-디히드로피라졸-3-온 (24C44F5P) (p38 MAP 키나아제 저해제 - 100 nM) 및 H-Trp-Glu-OH (G3335) (PPARy 길항제 - 30 μM) 를 EMD Chemicals (Gibbstown, NJ) 에서 구입하였다. 모든 저해제 또는 활성화제에 사용되는 최종 농도 및 인큐베이션 시간은 이전 보고서에 기초하였다 (예를 들어, Ishida, A., and Fujisawa, H. (1995) J. Biol. Chem., 270:2163-2170; Zhou, G., et al. (2001) J. Clin. Invest., 108:1167-1174; Ballou, L., et al (1992) J. Biol. Chem., 267:20044-20050; Klein, P.S., and Melton, D.A. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:8455-8459; Clare, P., et al. (2001) J. Biol. Chem., 276:48292-48299; Chen, F., et al. (2006) Bioorg. Med. Chem. Lett., 16:6281- 6287; Han, Z., et al. (2001) J. Clin. Invest., 108:73-81; Kase, H., et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun., 142:436-440; Siddiquee, K., et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104:7391-7396; Bilancio, A., et al. (2006) Blood, 107:642-650; Hu, Y., et al. (2000) J. Med. Chem., 43:3045-3051; de Laszlo, S.E., et al., (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:2689-2694; Ye, F., et al, (2006), Chembiocem., 7:74-82 참조). 상기 참조문헌의 각각의 내용은 본원에 참조로서 인용된다.
2.1(b). 항체
토끼 항-Akt (pSer473), -Jak2 pTyr1007 /1008, -AMPKα (pThr172), GSK-3β (pSer9), -CaMKII (pThr286), -PKA (pThr197), -PPARγ (81B8), p38 MAPK (pThr180/Tyr182) (28B10) mAb, tau (pSer396) mAb 및 tau (tau46) mAb 를 Cell Signaling 에서 구입하였다. PHF-tau mAb (클론 AT8) 를 Pierce Biotechnology (Rockford, IL) 에서 구입하였다. PHF-1 mAb 는 Dr. Peter Davies, Albert Einstein College of Medicine (Bronx, NY) 로부터 제공받았다. 항-알츠하이머 전구체 단백질 (APP) 643-695 mAb 를 Millipore (Billerica, MA) 에서 구입하였다. 토끼 항-tau (pThr181) 를 Sigma-Aldrich 에서 구입하였다. 토끼 항-α-튜불린 mAb 를 Affinity BioReagents (Golden, CO) 에서 구입하였다.
2.1(c). 세포주의 배양 및 뉴런 유도
인간 신경모세포종인 SH-SY5Y 및 IMR-32 세포주를 ATCC 에서 구입하였다. 세포 배양은 제조사의 특정 지침에 따라 수행하였다. 간략하게는, 세포를 10% FBS 함유 MEM 내에서 80-90% 컨플루언시에 도달할 때까지 증식시킨 다음, 플라스크로부터 0.1%의 트립신-EDTA 에 의해 플라스크로부터 이탈시키고, 1:5 의 비율로 계대배양하였다.
뉴런 분화를 위해서, 1 x 106 개의 SY5Y 또는 NT2 세포를 10 μM RA 가 보충된 2% FBS 함유 MEM 으로 이루어진 뉴런 유도 배지 (NIM) 에서 성장시켰다. 세포를 NIM 에서 6 일 동안 인큐베이션하고, 제 7 일에의 처리 및 수확 전에 무혈청 NIM 로 전환시켰다.
2.1(d). 래트 초대 뉴런의 배양
초대 래트 피질 뉴런을 BrainBits LLC (Sprinfield, IL) 에서 구입하였고, 제조사의 지침에 따라 배양하였다. 간략하게는, 조직을 분산시킨 후, 상청액을 새로운 시험관으로 옮기고, 1100 rpm 에서 1 분간 원심분리하였다. 그다음 뉴런을 폴리-D-라이신으로 코팅된 Ewell 플레이트 (BD Biosciences; San Jose, CA) 에 파종하고, B27 및 0.5 mM L-글루타민이 보충된 신경기초 배지 (Neurobasal medium) 에서 성장시켰다. 4 일 후에 배지를 교체하였고, 배양 제 7 일째에 뉴런을 하기 기술된 바와 같이 처리하고 수확하였다.
2.1(d). 단백질 추출 및 면역블롯팅
뉴런 세포를 렙틴 (1600 ng/ml) 으로 4 시간 동안 또는 AICAR (2 mM) 또는 특이적 저해제로 1 시간 동안 (다르게 구체적으로 지시되지 않느다면) 처리한 다음, 긁어내서 수확하였다. 세포 펠렛을 프로테아제 및 포스파타아제 저해제가 보충된 1X 방사능면역침전 어세이 (RIPA) 용해/추출 완충액 (Pierce) 에 재현탁시킨 다음, 드라이 아이스/에탄올 배스에서 동결/해동 사이클에 적용시켰다. 코마시 (Bradford) 단백질 어세이 키트 (Pierce) 를 사용하여 총 단백질을 측정하였다. 전 세포 추출물 (25 ㎍) 을 10% 또는 4 ~ 20% 트리스-글리신 SDS-PAGE 미리 제조된 젤 (Lonza; Rockland, ME) 을 사용하여 면역블롯에 의해 분석하고, 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인 (Millipore) 상으로 옮겼다. 멤브레인을 밤새 4℃ 에서 일차 항체와 함께 인큐베이션시킨 다음, 다음날 HRP-공액 이차 IgG 로 검출하였다. tau-pSer396 을 제외한 모든 일차 항체, 총 tau, APP (모두 1:500) 및 PHF-tau AT8 (1:200), 및 이차 항체를 각각 1:1,000 및 1:10,000 의 최종 희석물로서 사용하였다. HRP 를 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce) 로 현상하고, BioRad (Hercules, CA) ChemiDoc XRS System 을 사용하여 이미지화하였다. 멤브레인을 다른 항체로 재탐침하기 위해 Restore PLUS Western Blot Stripping Buffer (Pierce) 로 스트리핑하였다.
2.1(e). GSK -3β 과발현 및 녹아웃
글리코겐 신타아제 키나아제-3β (GSK-3β) 의 녹아웃을 위해, 분화된 SY5Y 를 TranslT-TKO 트랜스펙션 시약 (Minis; Madison, WI) 을 사용하여 50 nM SignalSilence GSK-3β siRNA (Cell Signaling) 로 48 시간 동안 일시적으로 트랜스펙션하였다. 간략하게는, 트랜스펙션 전 대략 24 시간에, 세포를 다음날 약 60 ~ 80% 컨플루언시를 수득하기에 적합한 세포 밀도로 플레이팅하였다 (세포 크기 및 특징에 따라, 24 웰 플레이트의 웰 당 3x104 내지 1.2x105 세포). 부착된 세포를 웰 당 500 ㎕ 의 완전한 성장 배지 내에 플레이팅하고, 밤새 인큐베이션하였다. 대안적으로는, 현탁액 중의 세포의 경우, 트랜스펙션 직전에, 세포를 트랜스펙션시 약 60 ~ 80% 컨플루언시를 수득하기에 적합한 밀도 (웰 당 3 ~ 5x105 세포) 로 웰 당 0.25 ml 의 완전 성장 배지 내에 플레이팅한다. 대안적으로는, 세포를 트랜스펙션시 약 60 ~ 80% 컨플루언시를 수득하기에 적합한 밀도 (웰 당 1.5 ~ 2.5x105 세포) 로 트랜스펙션 전날에 플레이팅할 수 있다. 멸균된 플라스틱 튜브에, 50 ㎕ 의 무혈청 배지를 첨가한다. 그 다음 무혈청 배지 내에 TranslT-TKO Transfection Reagent 을 직접 첨가하고 (웰 당 1 ~ 4 ㎕), 현탁액을 파이펫 또는 볼텍스에 의해 전체적으로 혼합하고, 실온에서 5 내지 20 분 동안 인큐베이션시켰다. siRNA (웰 내 최종 농도가 약 25 nM 이 되는 농도로) 를 희석된 TransIT-TKO Reagent 에 첨가하고, 파이펫으로 부드럽게 혼합한 다음, 실온에서 5 내지 20 분 동안 인큐베이션시켰다. 부착 세포 유형을 위해서는, 웰 내 부피는 본래 플레이트 배지의 약 250 ㎕ (절반) 을 제거하여 250 ㎕ 의 완전 성장 배지로 조정한다. TranIT-TKO Reagent/siRNA 복합체 혼합물을 세포에 적가한다. 디쉬를 앞뒤로 양옆으로 (빙빙 돌리지는 않음) 부드럽게 흔들어, 복합체를 디쉬 전반에 골고루 분포시킨 다음, 24 내지 72 시간 동안 인큐베이션시킨다. 그 다음 세포를 표적 유전자 발현의 녹아웃에 대해 어세이한다. 50 nM SignalSilence Control siRNA (플루오레세인 접합체) (Cell Signaling) 로 트랜스펙션된 세포를 음성 대조군으로서 그리고 트랜스펙션 효율 측정을 위해 사용하였다.
GSK-3β 과발현을 위해서는, 분화된 SY5Y 를 GSK-3β 전장 cDNA 서열 (접근 번호: NM 002093.2) (OriGene; Rockville, MD) 을 함유하는 2 ㎍ 의 발현 벡터 (pCMV6-XL4) 로 48 시간 동안 제조사의 특정한 지침에 따라 TurboFectin 8.0 트랜스펙션 시약 (OriGene) 을 사용하여 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 간략하게는, 발현 벡터에 노출되기 전에 세포 배지에 트랜스펙션 시약을 첨가한다. 2 ㎍ 빈 pCMV6-XL4 (OriGene) 로 트랜스펙션된 세포를 음성 대조군으로서 사용한다.
트랜스펙션 후, 세포를 수확하고, GSK3β 의 녹아웃 또는 과발현을 면역블롯에 의해 확인하였다.
2.1(f). GSK -3β 및 β-아밀로이드 (1-40) 정량
세포 추출물 내 GSK-3β 수준 및 세포 배양 배지 내 Aβ(1-40) 수준을 각각 PhosphoDetect GSK-3β (pSer9) ELISA 키트 (EMD Chemicals) 및 Human β-Amyloid 1-40 Colorimetric Immunoassay 키트 (Invitrogen; Carlsbad, CA) 를 제조사의 특정 지침에 따라 사용하여 측정하였다. GSK-3β 및 Aβ(1-40) 수준을 450 nm 에서의 OD 및 공지된 농도의 8 개의 일련 희석물로 작성된 표준 곡선으로부터 계산하였다.
2.1(g). 통계 분석
통계 데이터 분석을 분산 분석 및 터키-크래머 (Turkey-Kramer) 다중 비교 검정으로 수행하였다. 밀도계측 분석은 UN-SCAN-IT 젤 6.1 소프트웨어 (Silk Scientific; Orem, UT) 를 이용하여 수행하였다. p<0.05 는 통계적으로 유의미한 것으로 고려되었다.
실시예 2.2. 분화된 SY5Y 에서의 Tau 인산화의 조절
연구에서는 인간 신경모세포종 SY5Y 세포에서 AD-관련 부위에서의 Tau 인산화가 RA-유도 분화 (RA-SY5Y) 와 함께 증가되었다는 것을 보여주었다. 이 변화는 단백질의 과인산화보다는 분화 동안 절대적 tau 수준의 증가에 기여하였다. 이러한 증가된 기본수준의 발현으로 인해, RA-SY5Y 세포는 인간 tau 인산화에서의 변화를 모니터링하기 위한 통상의 배양 시스템을 나타낸다.
tau 를 직접적으로 인산화하는데 연루되어 있는 키나아제 (도 7 및 표 1) 를 연구하였다. 특이적인 상응하는 키나아제 저해제를 사용하여 세포를 1 시간 동안 처리하고 (상기 2.1, 물질 및 방법에 기재됨), AD-관련 부위에서의 tau 인산화에 대한 효과를 측정하였다. 비교를 위해, 세포를 1 시간 동안 C2 세라마이드, 단백질 포스파타아제 2 A (PP2A) 활성화제로 처리하였고, 이것은 인산화-tau 의 수준에 유의하게 영향을 주지 않았다 (도 7 및 표 1).
도 7 은 RA-SY5Y 에서의 tau 인산화의 효소적 조절을 나타낸다. RA-SY5Y 를 PP2A 활성화제, C2 세라마이드 또는 상이한 키나아제 저해제로 1 시간 동안 인큐베이션하거나 미처리 (비히클) 하고, 다양한 부위에서 tau 의 인산화를 측정하였다. 렙틴 (1600 ng/ml) 또는 AICAR (2 mM) 로의 처리는 양성 대조군으로 담당하였다. 전-세포 용해물을 조제하고, 인산화 tau-특이적 항체 (pSer396, PHF-1, AT8 또는 pSer181) 로의 면역블롯에 의해 분석하였다. 멤브레인을 스트리핑하고, 표준화를 위해 총 tau 항체로 재-탐침하였다. 대표적인 블롯을 제시한다 (n=3). 반-정량적 밴드 밀도 분석을 표 1 에 제시한다. 도 7 로부터의 표준화된 밴드를 밀도계측에 의해 분석하고, 결과를 비히클에 대한 평균 ± SD % 배 변화로서 표 1 에 제시한다 (이것은 0 의 값으로 임의로 할당됨); 대 비히클.
표 1. RA-SY5Y 에서 키나아제s/포스파타아제에 의한 tau 인산화의 조절
Figure pct00001
결과는 칼슘/칼모둘린-의존성 단백질 키나아제 II (CaMKII) (Myr-AIP), 단백질 키나아제 A (PKA) (KT5720) 또는 GSK-3β (LiCl) 의 저해가 대조군 (비히클-처리된 세포) 에 비해 다중 부위에서 tau 인산화의 가장 유의한 (p<0.05) 감소를 산출함을 (도 7 및 표 1) 보여주었다. 렙틴 (1600 ng/ml, 4 시간) 또는 AICAR (2 mM, 1 시간) 으로의 처리는 tau 인산화를 감소시키므로, 양성 대조군으로서 포함되었다.
도 14 는 다중 키나아제 저해에 의한 tau 의 인산화 감소를 보여준다. RASY5Y 를 CaMKII, PKA 또는 GSK-3P 저해제 단독으로 또는 다양한 조합으로 1 hr 동안 인큐베이션하거나, 미처리 (비히클) 하고, tau 의 인산화를 측정하였다. 전-세포 용리물을 조제하고, 인산화된 tau-특이적 항체 (pSer396) 로의 면역블롯에 의해 분석하였다. 멤브레인을 스트리핑하고, 표준화를 위해 총 tau 항체로 재-탐침하였다. 대표적인 블롯을 제시한다 (n=3). 표준화된 밴드를 밀도계측에 의해 분석하고, 결과를 미처리된 샘플에 대한 평균 ± SD % 배 변화로서 제시한다 (이것은 0 의 값으로 임의로 할당됨); * 대 미처리 (비히클); ** 대 임의의 개별적 키나아제 저해제로의 처리. 도 14 는 CaMKII-, PKA- 및 GSK-3β-특이적 저해제를 이용하는 조합 저해는 저해제 단독과 비교하여 tau 인산화 감소에서 시너지 효과를 발휘하는 것을 보여준다.
이 데이터는 tau 가 다수의 키나아제에 대한 기질임을 나타낸다.
상기 키나아제 중 임의의 것의 인산화 상태에 대한 렙틴 및/또는 AICAR 의 효과를 연구하였다. 전형적으로는, 상기 키나아제의 인산화는 재폴딩을 야기하고, 이것은 활성 변화를 촉발한다. 도 8 은 RA-SY5Y 에서의 tau-특이적 키나아제 활성화에 대한 렙틴 및 AICAR 의 효과를 보여준다. RA-SY5Y 를 렙틴 (1600 ng/ml), AICAR (2 mM) 로 처리하거나 미처리 (비히클) 하고, (A) CaMKII (pThr286), (B) PKA (pThr197) 및 (C) GSK-3β (pSer9) 의 인산화를 면역블롯에 의해 측정하였다. 멤브레인을 스트리핑하고, 표준화를 위해 (A,B) α-튜불린 또는 (C) 총 GSK-3β 로 재-탐침하였다. 대표적인 블롯을 제시한다 (n=3). 표준화된 밴드를 밀도계측에 의해 분석하고, 결과를 미처리 샘플에 대한 평균 ± SD % 배 변화로서 제시한다 (이것은 0.D 의 값으로 임의로 할당됨). 전-세포 용해물을 조제하고, GSK-3β (pSer9) 에 대한 ELISA 에 의해 분석하였다. 세포를 1 시간 동안 GSK-3β 저해제인 LiCl (10 mM) 로 인큐베이션하고 양성 대조군으로서 사용하였다. 결과 (n=3) 를 미처리 샘플에 대한 평균 표준화 GSK-3β (pSer9) 농도 (Units/mg 총 단백질) ± SD 로서 제시한다 (이것은 0 의 값으로 임의로 할당됨). * 대 미처리 (비히클).
일반적으로, tau 인산화가 따라서 영향을 받을 것이라고 여겨진다. 일반적으로, 인산화는 연구된 키나아제의 활성을 증가시킨다 (GSK-3β 는 제외함, 이것은 저해된다). 렙틴 또는 AICAR 로 처리된 RA-SY5Y 은 미처리 세포에 비해 CaMKII 의 인산화를 유의하게 (p>0.05) 변화시키지 않았고 (도 8A), 오직 렙틴만이 PKA 인산화를 유의하게 (p<0.05) 증가시킬 수 있었다 (도 8B, 중간 막대). 그러나, 모든 처리는 대조군과 비교하여 Ser9 에서 GSK-3β 인산화를 유의하게 (p<0.05) 증가시켰다 (도 8C, 백색 막대). 이 발견은 ELISA 에 의해 확인되었으며, 렙틴 (도 8D, 좌측으로부터 두번째 막대) 및 AICAR (우측으로부터 두번째 막대) 에 의해 유도된 GSK-3β (pSer9) 의 양의 유의한 (p<0.05) 증가를 보였다. 이 증가는 공지된 GSK-3β 저해제인 LiCl 로 관찰된 수준의 것/또는 이를 초과하였다 (먼 우측 막대). 그러므로, 렙틴이 GSK-3β 의 저해를 통해 tau 의 인산화를 감소시키는 것으로 보인다.
실시예 2.3. 렙틴 및 AICAR 은 GSK -3β 을 통해 Tau 인산화를 조절한다
렙틴 및/또는 AICAR 이 tau 의 인산화를 조절하기 위해 GSK-3β 를 필요로 하는지를 측정하기 위해 GSK-3β 활성을 조절하면서 상기 실험을 반복하였다. 효소 저해제 또는 siRNA 기술을 사용하여 GSK-3β 활성을 차단하였다. 도 9 는 렙틴 및 AICAR 이 GSK-3β-의존성 메카니즘을 통해 tau 인산화를 조절한다는 것을 보여준다. (A) RA-SY5Y 를 GSK-3β-특이적 siRNA 로 일시적으로 트랜스펙션시키거나, 비-트랜스펙션시키고 (레인 1), 비-트렌스펙션된 것을 렙틴 (1600 ng/ml - 레인 4), AICAR (2 mM - 레인 5) 으로 처리하거나 미처리 (비히클 - 레인 3) 하였다. 플루오레세인-공액 대조군 siRNA 로 트랜스펙션된 세포 (레인 2) 를 사용하여 트랜스펙션 효율을 평가하고 음성 대조군으로서 사용하였다. 전-세포 용해물을 조제하고, GSK-3β-특이적 (패널 I) 또는 인산화된 tau-특이적 항체 (pSer396, PHF-1, AT8 또는 pSer181; 패널 II) 로의 면역블롯에 의해 분석하였다. 멤브레인을 스트리핑하고, 표준화를 위해 총 GSK-3β (패널 I) 또는 총 tau (패널 II) 항체로 재-탐침하였다. 대표적인 블롯을 제시한다 (n=3). 표준화된 밴드를 밀도계측에 의해 분석하고, 결과 (패널 III-IV) 를 음성 대조군 샘플에 대한 평균 ± SD % 배 변화로서 제시한다 (이것은 0 의 값으로 임의로 할당됨). (B) RA-SY5Y 를 GSK-3β 전장 cDNA 발현 벡터로 일시적으로 트랜스펙션시키거나, 비-트랜스펙션시키고 (레인 1), 비-트렌스펙션된 것을 렙틴 (1600 ng/ml - 레인 4), AICAR (2 mM - 레인 5) 으로 처리하거나 미처리 (비히클 - 레인 3) 하였다. 빈 발현 벡터로 트랜스펙션시킨 세포 (레인 2) 를 음성 대조군으로서 사용하였다. 전-세포 용해물을 조제하고, 분석하고, A 에서와 같이 표준화하였다. 결과 (n=3) 를 A 로서 제시한다. * 대 음성 대조군 (레인 2); ** 대 비히클로 처리된 GSK-3β-과발현 세포 (레인 3).
GSK-3β 을 강한 프로모터를 갖는 포유류 발현 벡터를 사용하여 뉴런 세포에서 과발현시켜 (도 9) 활성을 증가시켰다. 구체적으로는, RA-SY5Y 세포를 GSK-3β-특이적 siRNA 로 일시적으로 트랜스펙션시킨 다음, 렙틴, AICAR 또는 비히클로 처리하였다 (도 9A). 이것을 대조군 siRNA 로 트랜스펙션된 세포 또는 트랜스펙션되지 않은 세포와 비교하였다. 세포를 총 GSK-3β (활성 + 비활성 형태) 발현 및 인산화된 GSK-3β (비활성 형태) 에 대해 어세이하여 특이적 단백질의 녹다운 (도 9A, 패널 I) 및, 상이한 형태의 인산화된 tau 의 수준에 의해 측정되는 바와 같이 키나아제 활성에 대한 효과 (도 9A, 패널 II-IV) 를 확인하였다. GSK-3β 녹다운 (패널 I, 레인 3-5) 은 대조군과 비교하여 (레인 1-2) 모든 부위 (패널 II-IV, 레인 3-5) 에서 tau 인산화의 유의한 (p<0.05) 감소를 보였다. 렙틴 (AICAR 은 아님) 의 존재하에서 녹다운 후 잔존 GSK3β 의 인산화가 증가된 것은 (패널 I, 레인 4), pSer396 tau (패널 레인 4 백색 막대) 및 pThr181 tau 의 인산화의 추가 감소와 (패널 II 및 IV, 레인 4 흑색 막대) 연관이 있었지만, 이것은 유의하지는 않았다.
LiCl 처리에 의한 GSK-3β 활성의 제거 후 유사한 결과가 수득되었다. 도 15 는 렙틴 및 AICAR 이 리튬으로 인큐베이션된 RA-SY5Y 세포에서 tau 인산화를 유의하게 감소시키지 않는다는 것을 보여준다. RA-SY5Y 를 렙틴 (1600 ng/ml), AICAR (2 mM) 의 존재하에서 또는 부가적인 처리를 하지 않은 (비히클) 채로 리튬 (10 mM) 으로, 또는 리튬 없이 인큐베이션하고, tau 의 인산화를 측정하였다. 전-세포 용해물을 조제하고, 인산화된 tau-특이적 항체 (pSer396) 로의 면역블롯에 의해 분석하였다. 멤브레인을 스트리핑하고, 표준화를 위해 총 tau 항체로 재-탐침하였다. 대표적인 블롯을 제시한다 (n=3). 표준화된 밴드를 밀도계측에 의해 분석하고, 결과를 미처리 샘플에 대한 평균 ± SD % 배 변화로서 제시한다 (이것은 0 의 값으로 임의로 할당됨).
부가적으로는, GSK-3β 를 과발현하는 RA-SY5Y 세포로의 연구는 추가의 메카니즘적 시야를 제공하였다 (도 9B). 세포를 GSK-3β 발현 벡터로 일시적으로 트랜스펙션시키고, 비-트랜스펙션된 세포 또는 빈 벡터로 트랜스펙션된 세포 (패널 I, 레인 1-2) 에 비해 상응하는 단백질의 유의하게 더 높은 수준이 생성되었다 (패널 I, 레인 3). 상기 세포의 레틴 또는 AICAR 처리는 비히클 및 트랜스펙션 대조군에 비해 GSK-3β 인산화 (pSer9) 의 수준이 유의하게 증가하였다 (패널 I, 레인 4-5). GSK-3β 의 과발현은 시험된 모든 인산화-tau 부위의 증가와 일치했으나 (패널 II-IV, 레인 3), 렙틴 및 AICAR 처리 모두는 상기 증가를 유의하게 (p<0.05) 감소시켰다 (패널 II-IV, 레인 4-5). 이 효과는 비활성 GSK-3β 의 수준 증가로 인한 것일 수 있다.
요약하면, 이러한 발견은 렙틴 및 이의 다운스트림 신호 단백질인 AMPK (AICAR 을 통해) 가 GSK-3β 의 저해를 통해 tau 의 인산화를 감소시킨다는 것을 암시한다.
실시예 2.4. 다른 세포 유형에서의 렙틴 및 AICAR
렙틴 및 AICAR 을 다른 뉴런 세포에서 연구하였다. 도 10 은 다른 뉴런 세포 모델에서의 렙틴 및 AICAR 의 효과를 보여준다. (A) 인간 IMR-32 세포 및 (B) 래트 초대 피질 뉴런을 렙틴 (1600 ng/ml), AICAR (2 mM) 로 처리하거나, 미처리 (비히클) 하였다. 전-세포 용해물을 조제하고, 인산화된 tau-특이적 항체 (pSer396, PHF-1, AT8 또는 pSer191) 로의 면역블롯에 의해 분석하였다. 멤브레인을 스트리핑하고, 표준화를 위해 총 tau 항체로 재-탐침하였다. 대표적인 블롯을 제시한다 (n=3). 반-정량적 밴드 밀도 분석을 표 2 에 제시한다. (C) IMR-32 세포를 (A) 에서와 같이 처리하고, GSK-3β 의 인산화 (Ser9) 를 면역블롯에 의해 측정하였다. 멤브레인을 스트리핑하고, 표준화를 위해 총 GSK-3β 로 재-탐침하였다. 대표적인 블롯을 제시한다 (n=3). 표준화된 밴드를 밀도계측에 의해 분석하고, 결과를 미처리 샘플에 대한 평균 ± SD % 배 변화로서 제시한다 (이것은 0 의 값으로 임의로 할당됨). * 대 미처리 (비히클).
RA-유도된, 인간 신경모세포종 IMR-32 세포 (도 10A) 및 래트 초대 피질 뉴런 (도 10B) 을 렙틴, AICAR 로 처리하거나 미처리하였다. 다시, 렙틴 및 AICAR 은 비히클-처리된 세포와 비교하여 모든 부위에서 tau 인산화의 유의한 (p<0.05) 감소를 유도하였다 (표 2). 표 2 에서, 도 10 으로부터의 표준화된 tau 밴드를 밀도계측에 의해 분석하고, 결과를 비히클에 대한 평균 ± SD % 배 변화로서 제시한다 (이것은 0 의 값으로 임의로 할당됨); * 대 비히클.
표 2. 처리된 뉴런 배양물 중 상대적 tau 인산화
Figure pct00002
다른 모델에서의 tau 인산화 에 대한 렙틴 및 AICAR 의 효과가 RA-SY5Y 과 메카니즘적으로 유사하다는 것을 확인하기 위해 (도 8 및 도 9), GSK-3β 의 인산화를 분화된 IMR-32 세포에서 측정하였다 (도 10C). 렙틴 및 AICAR 은 비히클 대조군 (회색 막대) 에 비해 GSK-3β 인산화를 유의하게 (p<0.05) 증가시켰다.
상기 발견은 렙틴 및 AICAR 이 RA-SY5Y 세포에서 및 또한 분화된 IMR-32 세포에서 관찰된 바와 같이 GSK-3β 의 비활성화를 통해 tau 를 지속적으로 조절한다는 것을 암시한다 (도 10).
실시예 2.5. Tau 인산화를 조절하는 업스트림 신호 사건
GSK-3β 비활성화의 AMPK 업스트림에 대한 역할을 시험하였다; 더욱 상세하게는, GSK-3β 의 비활성화를 위해 렙틴이 그의 수용체에 결합하는 것을 초래하는 업스트림 신호 사건. 도 11 은 렙틴 및 AICAR 이 중복 신호 경로를 통해 tau 인산화를 조절하는 것을 보여준다. (A) RASY5Y 세포를 렙틴 (1600 ng/ml - 레인 3-7) 의 존재하에서, 또는 미처리 (비히클 - 레인 1) 하에서 렙틴 신호 (STAT3, AMPK, PI3K, Akt, p38) 의 공지된 다운스트림 효과기에 대한 저해제로 인큐베이션하였다. 렙틴 단독으로 처리된 세포를 양성 대조군으로서 사용하였다 (레인 2). 전-세포 용해물을 조제하고, 인산화된 tau-특이적 항체 (pSer396, PHF-1, AT8 또는 pSer181) 로의 면역블롯에 의해 분석하였다. 멤브레인을 스트리핑하고, 표준화를 위해 총 tau 항체로 재-탐침하였다. 대표적인 블롯을 제시한다 (n=3). 표준화된 tau 밴드를 밀도계측에 의해 분석하고, 결과를 미처리 샘플에 대한 평균 ± SD % 배 변화로서 제시한다 (이것은 0 의 값으로 임의로 할당됨). (B) (A) 로부터의 전-세포 용해물을, 렙틴 단독 (STAT3, 포스포티딜-이노시톨-3 키나아제 (PBK)) 과 비교하여 tau 인산화를 유의하게 변형시키지 않았던 것을 제외하고는, 인산화된 GSK-3P-특이적 항체로의 면역블롯에 의해 분석하였다. 멤브레인을 스트리핑하고, 표준화를 위해 총 GSK-3O 으로 재-탐침하였다. 결과 (n=3) 를 (A) 에서와 같이 제시한다. (C) 세포를 렙틴, AICAR 또는 비히클로 처리하고, tau 인산화 조절에 연루되어 있는 신호 분자 (Jak2, AMPK, p38, Akt) 의 활성화를 인산화-특이적 항체를 사용하는 면역블롯에 의해 시험하였다. 멤브레인을 스트리핑하고, 표준화를 위해 a-튜불린 항체로 재-탐침하였다. 대표적인 블롯을 제시한다 (n=3). * 대 미처리 (비히클 - 레인 1); ** 렙틴 단독 (레인 2)
RA-SY5Y 세포를 렙틴이 그의 수용체에 결합한 후 활성화되는 공지된 신호 단백질에 대한 저해제의 존재 또는 부재하에서 렙틴으로 처리하였다 (농도는 상기 섹션 2.1, 물질 및 방법을 참조함) (도 11A). 여러 상이한 에피토프에서의 tau 의 인산화는 다시 실험 종결점으로서 사용하였다. 렙틴 단독 또는비히클로 처리된 세포에 대해 비교하였다. AMPK 의 저해제인 Akt (단백질 키나아제 B) 또는 p38 MAP 키나아제는 tau 인산화를 감소시키기 위한 렙틴의 능력을 유의하게 (p<0.05) 방해하였고 (패널 I-III, 레인 4, 6 및 7), 일부 예에서, 비히클-처리된 대조군에 비해 인산화를 증가시켰다 (즉, 패널 II, 레인 4 회색 막대). 렙틴의 부재하에서 특이적 저해제로 처리된 세포로부터 유사한 데이터가 수득되었다 (데이터는 제시되지 않음).
렙틴-매개 GSK-3β 비활성화 내 AMPK, Akt 및/또는 p38 의 관여 (도 11B) 를 연구하였다. AMPK, Akt 또는 p38 MAP 키나아제의 저해 (레인 3-5) 는 GSK-3β 인산화의 렙틴-유도 증가를 유의하게 (p<0.05) 역전시켰다 (레인 2). 렙틴의 부재하에서 특이적 저해제로 처리된 세포는 비히클 대조군에 비해 GSK-3β 인산화에 유의하게 영향을 주지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).
렙틴 처리 후 상기 키나아제의 인산화 (도 11C) 를 연구하였다. RA-SY5Y 세포의 렙틴 처리는 모든 시험된 키나아제의 인산화를 초래하였다 (중간 레인). 유사한 결과가 AMPK 활성화제, AICAR 에 대해, Janus 키나아제 2 (Jak2) 는 제외하고 관찰되었고 (상부 열, 우측 레인), 그러므로 AMPK 가 신호 캐스캐이드에서 Jak2 의 다운스트림인 것을 확인하였다.
요약하면, 데이터는 렙틴의 그의 수용체에 대한 결합과 tau 인산화를 연결하는 신호 경로와 관련된 실질적인 정보를 제공한다. 상기 경로는 AMPK, p38 MAP 키나아제, Akt 및 GSK-3 13 를 포함하나 이에 제한되지 않는 여러 주요한 키나아제에 위해 조절되는 것으로 보인다.
실시예 2.6. 렙틴은 AMPK 를 통한 모든 방출을 조절한다
Aβ 생성 및 tau 인산화를 야기하는 경로의 (모두 렙틴에 의해 조절됨) 상호연관성을 연구하였다.
Aβ 방출 조절에서의 페록시좀 증식자-활성화 수용체 γ (PPARγ), p38 및 렙틴-AMPK 경로의 역할을 연구하였다.
도 12 는 렙틴 및 AICAR 이 중복 신호 경로를 통해 AP 생성을 조절하는 것을 보여준다. (A) RA-SY5Y 에 렙틴 (1600 ng/ml - 레인 2), AICAR (2 mM - 레인 6) 및/또는 하기 신호 단백질 -AMPK (레인 3 및 7), PPARy (레인 4 및 8) 또는 p38 (레인 5 및 9) 각각에 대한 저해제를 6 시간 동안 처리하였다. 미처리된 (비히클 - 레인 1) 세포 또는 저해제 단독으로 처리된 세포 (레인 10-12) 를 대조군으로서 사용하였다. 배양 배지를 수집하고, ELISA 에 의해 AP(1 -40) 에 대해 어세이하였다. 결과를 세포 용해물 내 총 단백질에 대해 표준화하고, 평균 AP 농도 (pg/ml) ± SD 로서 제시한다. (B) RA-SY5Y 를 렙틴, AICAR (2 mM) 로 처리하거나 미처리 (비히클) 하고, PPARy 의 수준을 면역블롯에 의해 측정하였다. 멤브레인을 스트리핑하고, 표준화를 위해 a-튜불린 항체로 재-탐침하였다. 대표적인 블롯을 제시한다 (n=3). * 대 미처리 (비히클 - 레인 1); ** 대 렙틴 단독 (레인 2); # 대 AICAR 단독 (레인 6)
렙틴 (레인 2) 또는 AICAR (레인 6) 로 처리된 세포에서 가용성 Aβ 내 유의한 (p<0.05) 감소가 관찰되었다. 이 효과는 AMPK (레인 3 및 7) 또는 PPARγ (레인 4 및 8) 저해제로 함께 처리함으로써 효력이 상실되었다 (그러나 p38 저해제는 아님 (레인 5 및 9)).
부가적으로는, 렙틴 또는 AICAR 로 6 시간 동안 처리된 세포는 미처리 대조군과 비교하여 PPARγ 의 발현이 증가하였으므로 (도 12B), 렙틴, AMPK 및 PPARγ 사이의 연결성을 입증하였다.
이 결과는 Aβ 생성이 tau 의 인산화에 연결된 에너지 조절자인 AMPK 에 의해 조절될 수 있음을 보여준다.
실시예 2.7. Tau 및 Ali 경로는 AMPK 의 다운스트림에 중복되지 않는다
AMPK 너머의 렙틴-매개 tau 및 Aβ 경로 사이의 중복 (도 13) 을 연구하였다. 도 13 은 AMPK 의 렙틴 및 AICAR 신호 경로 다운스트림이 tau 인산화 및 Aβ 생성 모두를 매개하지 않는다는 것을 보여준다. (A) RA-SY5Y 를 렙틴 (1600 ng/ml) 단독으로 또는 Akt 저해제 (1L6HCI) 의 존재하에서 6 시간 동안 처리하였다. 미처리된 (비히클) 세포를 대조군으로서 사용하였다. 배양 배지를 수집하고, ELISA 에 의해 AP(1-40) 에 대해 어세이하였다. 결과를 세포 용해물 내 총 단백질에 대해 표준화하고, 평균 AP 농도 (pg/ml) ± SD 로서 제시한다. (B) RA-SY5Y 를 렙틴 (1600 ng/ml) 단독으로 또는 PPARy 저해제 (G3335) 의 존재하에서 6 시간 동안 처리하였다. 미처리된 (비히클) 세포를 대조군으로서 사용하였다. 전-세포 용해물을 조제하고, 인산화된 tau-특이적 항체 (pSer396, PHF-1, AT8 또는 pSer181) 로의 면역블롯에 의해 분석하였다. 멤브레인을 스트리핑하고, 표준화를 위해 총 tau 항체로 재-탐침하였다. 대표적인 블롯을 제시한다 (n=3). 표준화된 tau 밴드를 밀도계측에 의해 분석하고, 결과를 미처리 샘플에 대한 평균 ± SD % 배 변화로서 제시한다 (이것은 0 의 값으로 임의로 할당됨). (C) RA-SY5Y 에서 렙틴 및 AICAR 에 의해 활성화된 신호 경로를 나타내는 개략도. 렙틴 또는 AICAR 에 의한 AMPK 의 활성화는 AP 생성 및 tau 인산화를 모두 감소시킨다. 그러나, AMPK 의 신호 경로 다운스트림은 tau- 또는 AP-특이적 효과를 매개하기 위해 독립적으로 작용한다; * 대 미처리 (비히클)
RA-SY5Y 세포를 Akt (도 13A) 또는 PPARγ (도 13B) 저해제의 존재 또는 부재하에서 렙틴으로 처리하였다. AICAR 은 Akt 의 인산화 (도 11C) 및 PPARγ 의 발현 (도 12B) 을 증가시켰으나, Akt 의 저해는 가용성 Aβ 방출의 렙틴-유도 감소를 유의하게 (p>0.05) 역전시킬 수 없었다 (도 13A, 어두운 회색 막대). 마찬가지로, PPARγ 의 저해는 모든 시험된 부위에서 tau 인산화의 렙틴 유도 감소를 유의하게 (p>0.05) 역전시키지 않았다 (도 13B, 우측 막대 세트). 그러므로, 2 개의 경로에 의해 공유되는 추가의 성분은 확인되지 않았다.
요약하면, 렙틴은 뉴런 세포에서 별대의 신호 경로를 통해 tau 의 인산화 및 Aβ 생성을 조절한다. 상기 경로는 렙틴-매개 AMPK 활성화의 다운스트림으로 나뉘어져 특이적인 효과를 산출한다.
본 발명은 이의 특정 구현예를 참조하여 기술되었으나, 당업자는 본 발명의 참 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변화가 이루어질 수 있고 동등물리 대체될 수도 있음을 이해해야만 한다. 또한, 특정 상황, 재료, 물질 조성, 과정, 과정 단계(들) 을 기재된 본 발명의 객관적인 취지 및 범주에 적용하기 위한 많은 변형이 이루어질 수 있다. 이러한 모든 변형들은 하기 특허청구범위의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.

Claims (43)

  1. 하기 (a) 내지 (c) 단계를 포함하는, 진행성 인지 장애의 치료 방법:
    (a) 하기 (i) 내지 (iii) 을 포함하는 렙틴 조성물을 치료학적 유효량으로 제공하는 단계:
    (i) 제 1 치료제로서의 렙틴 또는 렙틴 유사체;
    (ii) 임의로, 하나 이상의 제 2 치료제; 및
    (iii) 약학적으로 허용가능한 담체;
    (b) 단계 (a) 의 조성물을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계; 및
    (c) 진행성 인지 장애의 하나 이상의 병리학의 진행을 감소 또는 예방하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 조성물이 Aβ 의 생성을 감소시키고, Aβ 의 섭취를 증가시키고, 또는 tau 단백질의 인산화를 감소시키는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, tau 단백질의 인산화 부위가 Ser-202/Thr-205 (AT8 부위), Ser-214, Ser-181, Ser-212 (AT100 부위), Thr-231, Ser-235 (TG3 부위), 및 Ser-396/Ser-404 (PHF-1 부위) 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 진행성 인지 장애가 알츠하이머 질환, 진행성 핵상 마비; 치매; 크로이츠펠트-야콥 질환, 전두측두 치매, 픽 질환, 파킨슨증-17 피질 기저핵 변성이 있는 전두측두엽 치매, 전두측두엽 변성; 헌팅톤 질환; 또는 파킨슨 질환인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 진행성 인지 장애가 알츠하이머 질환인 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 알츠하이머 질환의 병리학이 tau 단백질의 인산화; 신경섬유 매듭; APP 의 변형된 단백질 가수분해; 뇌 간질액 내 Aβ42 의 축적; 뇌 간질액 내 Aβ42 의 응집; 뇌 간질액 내 Aβ40 의 축적; Aβ40 의 응집; 염증 반응; 신경증 손상; 뉴런 대사 항상성의 붕괴; 뉴런 이온 항상성의 붕괴; 산화 손상; 변형된 키나아제 활성; 변형된 포스파타아제 활성; 뉴런 기능장애; 뉴런 세포 사멸; 신경전달물질 결핍; 치매; 초로성 디스트로피; 뉴런 세포체의 수축, 및 시냅스 손실 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 임의의 하나 이상의 제 2 치료제가 항생제, 항진균제, 키나아제 저해제 항바이러스제, 항원충제, 스테로이드성 항염증제, 항산화제, 호르몬, 비타민, 항히스타민제, 및 화학요법제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 임의의 제 2 치료제가 하나 이상의 키나아제 저해제인 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 하나 이상의 키나아제 저해제가 칼슘/칼모둘린-의존성 단백질 키나아제 II 의 키나아제 저해제; 단백질 키나아제 A 의 키나아제 저해제; GSK-3β 의 키나아제 저해제; cAMP-의존성 단백질 키나아제의 키나아제 저해제; 5-아데노신 모노포스페이트 단백질 키나아제의 키나아제 저해제; Myr-AIP, LiCl KT5720, 6-브로모인디루빈-3'-옥심 ((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심); KT5720; K252a; 스타우로스포린; KT5252b; 켈레리트린; 및 TDZD-8 (4-벤질-2-메틸-1,2,4-티아디아졸리딘-3,5-디온-8) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 조성물이 조성물 성분 (i), (ii), 및 (iii) 의 합을 초과하는 수준으로 키나아제 저해를 제공하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 렙틴 조성물 내 렙틴 또는 렙틴 유사체의의 치료학적 유효량이 약 0.0001 mg/kg 체중 내지 약 100 g/kg 체중인 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 조성물이 하나 이상의 인지 기능을 향상시키는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 하나 이상의 인지 기능이 기억력인 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 하나 이상의 인지 기능이 학습력인 방법.
  15. 하기 (a) 및 (b) 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에서의 인지 기능 회복력의 개선 방법:
    (a) 하기 (i) 내지 (iii) 을 포함하는 렙틴 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계:
    (i) 제 1 치료제로서의 렙틴 또는 렙틴 유사체의 인지 기능을 향상시키는 양;
    (ii) 임의로, 하나 이상의 제 2 치료제; 및
    (iii) 약학적으로 허용가능한 담체;
    조성물은 Aβ 생성을 감소시키고, Aβ 의 섭취를 증가시키고, 또는 tau 단백질의 인산화를 감소시킴; 및
    (b) 대상에서 인지 기능 회복력을 개선시키는 단계.
  16. 제 15 항에 있어서, tau 단백질의 인산화 부위가 Ser-202/Thr-205 (AT8 부위), Ser-214, Ser-181, Ser-212 (AT100 부위), Thr-231, Ser-235 (TG3 부위), 및 Ser-396/Ser-404 (PHF-1 부위) 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  17. 제 15 항에 있어서, 인지 기능이 기억력인 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 기억력이 조건 기억력인 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 기억력이 맥락 기억력인 방법.
  20. 제 15 항에 있어서, 인지 기능이 기억력 유지인 방법.
  21. 제 15 항에 있어서, 인지 기능이 학습력인 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 학습력이 맥락 학습력인 방법.
  23. 제 21 항에 있어서, 학습력이 조건 학습력인 방법.
  24. 제 15 항에 있어서, 임의의 제 2 치료제가 항생제, 항진균제, 키나아제 저해제 항바이러스제, 항원충제, 스테로이드성 항염증제, 항산화제, 호르몬, 비타민, 항히스타민제, 및 화학요법제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 임의의 제 2 치료제가 하나 이상의 키나아제 저해제인 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 하나 이상의 키나아제 저해제가 칼슘/칼모둘린-의존성 단백질 키나아제 II 의 키나아제 저해제; 단백질 키나아제 A 의 키나아제 저해제; GSK-3β 의 키나아제 저해제; cAMP-의존성 단백질 키나아제의 키나아제 저해제; 5-아데노신 모노포스페이트 단백질 키나아제의 키나아제 저해제; Myr-AIP, LiCl KT5720, 6-브로모인디루빈-3'-옥심 ((2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심); KT5720; K252a; 스타우로스포린; KT5252b; 켈레리트린; 및 TDZD-8 (4-벤질-2-메틸-1,2,4-티아디아졸리딘-3,5-디온-8) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  27. 제 25 항에 있어서, 조성물이 조성물 성분 (i), (ii), 및 (iii) 의 합을 초과하는 수준으로 키나아제 저해를 제공하는 방법.
  28. 제 15 항에 있어서, 렙틴 조성물 내 렙틴 또는 렙틴 유사체의 인지 기능을 향상시키는 양이 약 0.0001 mg/kg 체중 내지 약 100 g/kg 체중인 방법.
  29. 하기 (a) 내지 (d) 단계를 포함하는, Aβ 의 축적, tau 단백질의 인산화, 또는 신경섬유 매듭의 축적 중 하나 이상으로부터 기인하는 진행성 인지 기능장애 질환 또는 장애의 치료를 위한 유효한 치료제의 확인 방법:
    (a) 뉴런 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계,
    (b) 뉴런 세포를 포함하는 세포 배양물을 추정적 치료제와 접촉시키는 단계,
    (c) 추정적 치료제가 단백질 키나아제의 활성에 영향을 주는 식으로 추정적 치료제 가 단백질 키나아제 단백질의 활성 부분과 관련이 있는지를 결정하는 단계; 및
    (d) 추정적 치료제를 진행성 인지 기능장애 질환 또는 장애의 치료를 위한 유효한 치료제로서 확인하는 단계.
  30. 제 29 항에 있어서, 단백질 키나아제가 5-아데노신 모노포스페이트 단백질 키나아제 또는 GSK-3β 인 방법.
  31. 제 29 항에 있어서, 추정적 치료제 또는 유효한 치료제가 재조합 단백질인 방법.
  32. 제 29 항에 있어서, 추정적 치료제 또는 유효한 치료제가 저해제인 방법.
  33. 제 29 항에 있어서, 추정적 치료제 또는 유효한 치료제가 길항제인 방법.
  34. 제 29 항에 있어서, 추정적 치료제 또는 유효한 치료제가 아고니스트인 방법.
  35. 제 29 항에 있어서, 추정적 치료제 또는 유효한 치료제가 항체인 방법.
  36. 제 29 항에 있어서, 추정적 치료제 또는 유효한 치료제가, 렙틴 또는 렙틴 유사체가 단백질 키나아제와 연합되는 것을 방해하는 방법.
  37. 제 29 항에 있어서, 결정 단계 (c) 가 대조군에 비한, 뉴런 세포에 의한 아밀로이드-베타의 분비를 측정하는 것을 포함하는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 대조군에 비한, 뉴런 세포에 의한 아밀로이드-베타의 분비를 측정하는 것이 ELISA 또는 면역블롯에 의한 것인 방법.
  39. 제 29 항에 있어서, 아밀로이드 베타 병리학의 치료를 위해 유효한 치료제를 사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 아밀로이드 베타 병리학이 tau 단백질의 인산화; 신경섬유 매듭; APP 의 변형된 단백질 가수분해; 뇌 간질액 내 Aβ42 의 축적; 뇌 간질액 내 Aβ42 의 응집; 뇌 간질액 내 Aβ40 의 축적; Aβ40 의 응집; 염증 반응; 신경증 손상; 뉴런 대사 항상성의 붕괴; 뉴런 이온 항상성의 붕괴; 산화 손상; 변형된 키나아제 활성; 변형된 포스파타아제 활성; 뉴런 기능장애; 뉴런 세포 사멸; 신경전달물질 결핍; 치매; 초로성 디스트로피; 뉴런 세포체의 수축, 및 시냅스 손실 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 방법.
  41. 제 39 항에 있어서, 유효한 치료제가 하나 이상의 인지 기능을 향상시키는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 하나 이상의 인지 기능이 기억력인 방법.
  43. 제 41 항에 있어서, 하나 이상의 인지 기능이 학습력인 방법.
KR1020117012911A 2008-11-04 2009-11-04 신경섬유 매듭 및 아밀로이드 베타의 축적으로부터 기인하는 진행성 인지 기능 장애의 치료용 렙틴 조성물 및 치료 방법 KR20120024529A (ko)

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WO (1) WO2010054017A1 (ko)
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8227408B2 (en) * 2005-09-07 2012-07-24 Neurotez, Inc. Leptin as an anti-amyloidogenic biologic and methods for delaying the onset and reducing Alzheimer's disease-like pathology
EP2326339A4 (en) * 2008-05-21 2012-06-20 Neurotez Inc METHOD FOR TREATING PROGRESSIVE COGNITIVE DISORDER IN CONNECTION WITH NEUROFIBRILLARY TANGLES
WO2010054017A1 (en) 2008-11-04 2010-05-14 Nikolaos Tezapsidis Leptin compositions and methods for treating progressive cognitive function disorders resulting from accumulation of neurofibrillary tangles and amlyoid beta
CA3065694A1 (en) * 2010-11-10 2012-05-18 Inregen Methods of forming injectable formulations for providing regenerative effects to an organ such as a kidney
CN103764166B (zh) 2011-06-22 2017-10-24 通用医疗公司 蛋白质病的治疗
CA2843775A1 (en) * 2011-10-04 2013-04-11 Psychnostics, Llc Methods for diagnosing and identifying modulators of membrane potentials in bipolar disorder and attention deficit hyperactivity disorder
US20140088000A1 (en) * 2012-09-27 2014-03-27 Neurotez, Inc. Leptin Rescues Neurons from Alzheimer's Disease Related Pathways Triggered by Lipid Burden
US20140220036A1 (en) * 2013-02-01 2014-08-07 Rodolfo R. Llinas Methods for treating neurodegenerative diseases and for identifying agents useful for treating neurodegenerative diseases
US20160058839A1 (en) * 2013-05-02 2016-03-03 University Of Vermont And State Agricultural College Leptin for treating systemic inflammatory response syndrome
WO2018085653A1 (en) * 2016-11-04 2018-05-11 The Regents Of The University Of California Compositions targeting 3-repeat tau for the treatment of neurodegenerative disorders, and methods for making and using them
BR112019022571B1 (pt) 2017-05-11 2024-02-06 Ecolab Usa Inc Composição de tratamento de piso, e, método para limpar ou restaurar um piso
US11471482B2 (en) 2017-12-19 2022-10-18 Nanobiotix S.A. Nanoparticles for use in enhancing brain performances or in treating stress
KR20200110321A (ko) 2017-12-19 2020-09-23 나노비오띡스 신경 장애의 치료에서 사용하기 위한 나노입자
CN108834900B (zh) * 2018-07-31 2022-03-11 安徽农业大学 抑制茶树组培中外植体氧化褐变和内生菌污染的培养方法
JP7417322B2 (ja) * 2019-11-04 2024-01-18 シーケー・リジョン・インコーポレイテッド 神経変性疾患及び／又はその臨床的状態を抑制及び／又は治療するための組成物及び方法
CN116391654B (zh) * 2023-03-30 2023-11-03 中国海洋大学 一种雌雄同体扇贝规模化杂交育种方法

Family Cites Families (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1521000A (en) * 1975-06-13 1978-08-09 Syntex Puerto Rico Inc Inhalation device
US4227522A (en) * 1978-09-05 1980-10-14 Syntex Puerto Rico, Inc. Inhalation device
US4192309A (en) * 1978-09-05 1980-03-11 Syntex Puerto Rico, Inc. Inhalation device with capsule opener
GR79615B (ko) * 1982-10-08 1984-10-31 Glaxo Group Ltd
US4778054A (en) * 1982-10-08 1988-10-18 Glaxo Group Limited Pack for administering medicaments to patients
PH26882A (en) * 1985-07-30 1992-11-16 Glaxo Group Ltd Devices for administering medicaments to patients
JPH05963A (ja) 1990-04-13 1993-01-08 Toray Ind Inc ポリペプチド類組成物
US6582728B1 (en) * 1992-07-08 2003-06-24 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Spray drying of macromolecules to produce inhaleable dry powders
US5837672A (en) * 1992-07-10 1998-11-17 Athena Neurosciences, Inc. Methods and compositions for the detection of soluble β-amyloid peptide
US6001968A (en) * 1994-08-17 1999-12-14 The Rockefeller University OB polypeptides, modified forms and compositions
US20020107211A1 (en) * 1995-06-07 2002-08-08 The Rockefeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US6048837A (en) * 1994-08-17 2000-04-11 The Rockefeller University OB polypeptides as modulators of body weight
US6309853B1 (en) * 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US6471956B1 (en) * 1994-08-17 2002-10-29 The Rockefeller University Ob polypeptides, modified forms and compositions thereto
US6429290B1 (en) * 1994-08-17 2002-08-06 The Rockefeller University OB polypeptides, modified forms and derivatives
EP0725079A1 (en) 1995-01-31 1996-08-07 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5552523A (en) 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5559208A (en) 1995-01-31 1996-09-24 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5552524A (en) * 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5605886A (en) 1995-01-31 1997-02-25 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
AU4766096A (en) 1995-01-31 1996-08-21 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5554727A (en) 1995-01-31 1996-09-10 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5521283A (en) * 1995-01-31 1996-05-28 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5552522A (en) * 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
AU5524896A (en) * 1995-03-20 1996-10-08 Institut Pasteur De Lille Modulators of ob gene and screening methods therefor
EP0741187A2 (en) * 1995-05-05 1996-11-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant obese (Ob) proteins
WO1997002004A2 (en) * 1995-06-30 1997-01-23 Eli Lilly And Company Methods for treating diabetes
US5698389A (en) * 1995-11-16 1997-12-16 Tularik, Inc. Transcriptional promoter of the murine obesity gene
US6936439B2 (en) * 1995-11-22 2005-08-30 Amgen Inc. OB fusion protein compositions and methods
CA2238307A1 (en) 1995-12-27 1997-07-10 Genentech, Inc. Ob protein derivatives having prolonged half-life
US7074397B1 (en) * 1996-01-08 2006-07-11 Genentech, Inc. Method for enhancing proliferation or differentiation of a cell using ob protein
US6025324A (en) * 1996-05-15 2000-02-15 Hoffmann-La Roche Inc. Pegylated obese (ob) protein compositions
US5830450A (en) * 1996-06-19 1998-11-03 Lallone; Roger L. Compositions of leptin bound to an apolipoprotein
JP2000514422A (ja) 1996-06-20 2000-10-31 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド 肥満のための遺伝子治療
US6001816A (en) * 1996-06-20 1999-12-14 Merck & Co., Inc. Gene therapy for leptin deficiency
US6630346B1 (en) * 1996-06-20 2003-10-07 Merck & Co., Inc. Gene therapy for obesity
US20060205660A1 (en) * 1996-06-20 2006-09-14 Sauvage Frederic D OB protein-immunoglobulin chimeras
EP0954579A1 (en) 1996-06-20 1999-11-10 Merck & Co., Inc. Gene therapy for obesity
AU5654998A (en) 1996-12-06 1998-06-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Muteins of obese protein
US20020019352A1 (en) * 1997-04-17 2002-02-14 David N. Brems Stable, active, human ob protein compositions and methods
US6020004A (en) * 1997-04-17 2000-02-01 Amgen Inc. Biodegradable microparticles for the sustained delivery of therapeutic drugs
HU226175B1 (en) 1997-04-17 2008-06-30 Amgen Inc Human ob protein suspension, process for producing thereof and use for production of pharmaceutical composition
IL120733A0 (en) * 1997-04-29 1997-08-14 Yeda Res & Dev Leptin as an inhibitor of cell proliferation
EP0950417A3 (en) * 1998-02-23 2000-02-23 Pfizer Products Inc. Treatment of skeletal disorders
JP4215857B2 (ja) * 1998-03-26 2009-01-28 裕 大村 学習・記憶能力改善剤
GB9807062D0 (en) 1998-04-02 1998-06-03 Imp College Innovations Ltd Immune response
ATE278952T1 (de) * 1998-07-28 2004-10-15 Vlaams Interuniv Inst Biotech Leptin vermittelte geninduktion
JP4199421B2 (ja) 1998-08-10 2008-12-17 アムジエン・インコーポレーテツド デキストラン−レプチン結合体、医薬組成物および関連方法
US6777388B1 (en) * 1998-08-21 2004-08-17 Clf Medical Technology Acceleration Program, Inc. Leptin-related peptides
US7208572B2 (en) * 1998-08-21 2007-04-24 Albany Medical College Leptin-related peptides
JP2002526780A (ja) 1998-10-02 2002-08-20 アムジエン・インコーポレーテツド レプチン処置に対する素因の決定方法
US6716810B1 (en) * 1998-12-09 2004-04-06 Eleanor Roosevelt Institute Composition and method for regulation of body weight and associated conditions
MXPA01005818A (es) 1998-12-09 2003-07-21 Eleanor Rooseveltl Inst Composicion y metodo para la regulacion del peso del cuerpo y condiciones asociadas.
BR0007414A (pt) 1999-01-07 2001-10-16 Lexigen Pharm Corp Expressão e exportação de proteìnas antiobesidade como proteìnas de fusão fc
WO2000047741A1 (en) 1999-02-12 2000-08-17 Amgen Inc. Glycosylated leptin compositions and related methods
US20030215423A1 (en) * 1999-04-01 2003-11-20 Merck & Co., Inc. Gene therapy for obesity
US6475984B2 (en) * 1999-04-29 2002-11-05 The Nemours Foundation Administration of leptin
AU767068B2 (en) * 1999-06-11 2003-10-30 Baylor College Of Medicine Methods and compositions for control of bone formation via modulation of leptin activity
EP1191945A4 (en) 1999-06-11 2003-04-23 Baylor College Medicine METHODS AND COMPOSITIONS FOR CONTROLLING BONE FORMATION BY MODULATING LEPTIN ACTIVITY
WO2001013935A2 (en) 1999-08-23 2001-03-01 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Modulation of the blood-brain barrier transporter for leptin
US7582292B2 (en) * 2000-02-26 2009-09-01 Artecel, Inc. Adipose tissue derived stromal cells for the treatment of neurological disorders
US6972867B1 (en) * 2000-11-10 2005-12-06 Xerox Corporation Patch codes for color calibration job identification encoding
US20050065078A1 (en) * 2001-08-29 2005-03-24 Cawthorne Anthony Michael Use of leptin for infant with low birth weight for prevention of obesity
EP2219031B1 (en) * 2001-10-22 2013-04-24 Amgen, Inc. Use of leptin for treating human lipoatrophy and method of determining predisposition to said treatment
EP1542719A4 (en) * 2001-12-05 2006-06-21 Baylor College Medicine METHODS AND COMPOSITIONS FOR REGULATING OS FORMATION BY MODULATING THE SYMPATHETIC TONUS
US7642281B2 (en) * 2002-08-07 2010-01-05 Helicon Therapeutics, Inc. Indolone compounds useful to treat cognitive impairment
DE10353593A1 (de) * 2003-11-17 2005-06-23 Klinikum der Universität München Großhadern-Innenstadt Leptinantagonist und Verfahren zur quantitativen Messung von Leptin
US7407929B2 (en) 2004-05-07 2008-08-05 Boston Biomedical Research Institute Leptin peptide antagonists
WO2005110468A2 (en) 2004-05-10 2005-11-24 The Burnham Institute Treatment of insulin resistance/metabolic syndrome to alleviate the risks of dementia
WO2005109002A2 (en) * 2004-05-12 2005-11-17 Galapagos N.V. Methods, compositions and compound assays for inhibiting amyloid-beta protein production
US7863240B2 (en) * 2004-10-08 2011-01-04 Enzo Therapeutics, Inc. Methods and uses of leptin in hepatocellular carcinoma
US8043619B2 (en) * 2004-10-08 2011-10-25 Yaron Ilan Methods and uses of leptin in immune modulation
US7307142B2 (en) 2004-11-26 2007-12-11 Yissum Research And Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Leptin antagonists
US7629315B2 (en) 2005-03-09 2009-12-08 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Compositions for blocking the inhibitory effect of human CRP on human leptin
US8227408B2 (en) * 2005-09-07 2012-07-24 Neurotez, Inc. Leptin as an anti-amyloidogenic biologic and methods for delaying the onset and reducing Alzheimer's disease-like pathology
EP1937296A2 (en) * 2005-09-16 2008-07-02 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Compounds for improving nutritional status, cognition and survival
EP1795895A1 (en) * 2005-12-08 2007-06-13 KeyNeurotek AG A tissue-based assay system for Alzheimer-specific degeneration and pathology
US20070218504A1 (en) * 2006-03-09 2007-09-20 University Of Pittsburgh Human leptin-derived polypeptides and uses thereof
US8729067B2 (en) * 2006-05-22 2014-05-20 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Pharmacological treatment of cognitive impairment
WO2008048691A2 (en) 2006-10-18 2008-04-24 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Use of leptin for treating post-lipectomy ectopic fat deposition and other post-lipectomy associated disorders
WO2008115880A2 (en) 2007-03-21 2008-09-25 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Use of leptin for the treatment or prevention of parkinson's disease
WO2008155403A2 (en) 2007-06-20 2008-12-24 Universitat De Les Illes Balears Use of leptin in the prevention of unhealthy food habits and cardiovascular diseases
US8889622B2 (en) * 2007-07-25 2014-11-18 Washington University Methods of inhibiting seizure in a subject
US20090031434A1 (en) * 2007-07-26 2009-01-29 Weiping Han Animal models for obesity and neurodegenerative diseases
GB0715216D0 (en) 2007-08-03 2007-09-12 Asterion Ltd Leptin
US8470772B2 (en) 2008-02-27 2013-06-25 Temple University—Of the Commonwealth System of Higher Education Leptin agonist and methods of use
WO2009138762A2 (en) 2008-05-15 2009-11-19 Regen Therapeutics Plc Therapeutic use of peptides
EP2326339A4 (en) * 2008-05-21 2012-06-20 Neurotez Inc METHOD FOR TREATING PROGRESSIVE COGNITIVE DISORDER IN CONNECTION WITH NEUROFIBRILLARY TANGLES
WO2010054017A1 (en) 2008-11-04 2010-05-14 Nikolaos Tezapsidis Leptin compositions and methods for treating progressive cognitive function disorders resulting from accumulation of neurofibrillary tangles and amlyoid beta

Also Published As

Publication number Publication date
JP2012508242A (ja) 2012-04-05
AU2009313562B2 (en) 2012-11-15
EP2352510A4 (en) 2012-08-29
ZA201104144B (en) 2014-03-26
CA2742600A1 (en) 2010-05-14
CN102300581A (zh) 2011-12-28
AU2009313562A1 (en) 2010-05-14
US20150038409A1 (en) 2015-02-05
US8716220B2 (en) 2014-05-06
WO2010054017A1 (en) 2010-05-14
EP2352510A1 (en) 2011-08-10
US20100113358A1 (en) 2010-05-06
CN102300581B (zh) 2016-12-21

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