CN102300581A - 用于治疗因神经原纤维缠结和β淀粉状蛋白的积聚引起的进行性认知功能障碍的瘦蛋白组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于进行性认知障碍的含有瘦蛋白产物的组合物和临床治疗方法与诊断方法。根据一个方面，所述发明提供用于治疗进行性认知障碍的方法。根据另一个方面，所述发明提供了用于改善有需要的受治疗者中认知功能复原的方法。根据另一个方面，所述发明提供了用于鉴定有效治疗剂的方法，所述的有效治疗剂用于治疗因Aβ积聚、tau过度磷酸化或神经原纤维缠结积聚中至少一种情况引起的进行性认知功能紊乱疾病或障碍。

Description

用于治疗因神经原纤维缠结和β淀粉状蛋白的积聚引起的进行性认知功能障碍的瘦蛋白组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年6月11日提交的第61/186102号美国申请和2008年11月4日提交的第61/111197号美国申请的优先权权益。这些申请的每一份的内容通过引用的方式完整地并入本文。
政府资助声明
本发明是在美国国家衰老研究所和新泽西科技委员会授予的SBIR-1R43AG029670号资助下做出的。美国政府在本发明中持有某些权利。
技术领域
所述发明涉及用于利用瘦蛋白产物治疗因神经原纤维缠结和β淀粉状蛋白的积聚引起的进行性认知功能障碍的组合物和方法。
发明背景
β淀粉状蛋白(Aβ)
β淀粉状蛋白通过序列蛋白酶剪切作用从其大的前体蛋白(APP)衍生。APP是借助其信号肽共翻译地转位至内质网并且随后经分泌途径被翻译后修饰的单次跨膜多肽。它包含异质的一组广泛表达的多肽。这种异质性源自可变剪接(产生具有695、751和770个残基的3种主要同工型)以及多种翻译后修饰作用，包括添加N-联和O-联糖、硫酸盐化和磷酸化。其N-联和O-联糖的获得在生物合成后迅速发生，并且其半寿期相对短暂(45至60分钟)。即便存在这种异质性，APP在进化上仍是高度保守的并且在对其检验的全部哺乳动物中表达；已经在果蝇中找到APP的部分同源物(APPL)。APP是一个更大基因家族的成员，该家族即在大的胞外结构域和胞质尾区内均具有基本同源性、但在Aβ区内趋异的淀粉状前体样蛋白(APLP)。
含有751个或770个氨基酸的APP剪接形式在遍及身体的非神经元细胞中广泛地表达并且也出现在神经元中。然而，神经元表达甚至更高水平的695个残基的同工型，其以极低丰度出现在非神经元细胞中。751/770-残基形式与695-残基形式之间的差异是在751/770-残基同工型中存在编码56个氨基酸基序的外显子，其中，所述的56个氨基酸基序与Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂(KPI)同源，显示这些更长APP同工型的一种潜在功能。在人血小板中存在的APP的含有KPI的同工型充当Xia因子的抑制剂，所述的Xia因子是凝血级联中的丝氨酸蛋白酶。
Aβ产生是正常的代谢事件。通过分泌途径运输APP期间或之后，APP可以经历多种蛋白酶剪切作用以将分泌的衍生物释放至囊泡腔和胞外空间。由根据活性命名的α-分泌酶引起的已确认的第一种蛋白酶剪切在距APP单次跨膜结构域以外朝向NH2端的第12个氨基酸处发生。该过程导致大的可溶性胞外结构域片段(α-APPS)释放至腔体/胞外空间中，并导致83个残基的COOH端片段(CTF)保留在膜中。作为另一种可能，未经α-分泌酶剪切的一些APP分子可以被根据活性命名的β-分泌酶剪切，所述的β-分泌酶主要在距α-剪切位点朝NH2端的第16个残基处剪切，从而产生略微更小的胞外结构域衍生物(β-APPS)并且使始于Aβ区第1残基处的99个残基的CFT(C99)保留在膜中。C99片段因此在跨膜结构域的中间因γ-分泌酶被剪切。尚不知道APP在其复杂的胞内运输期间究竟可以在何处接受α-、β-和γ-分泌酶作用。
基于细胞培养研究，多种功能已经被归因于APP全蛋白质和/或其主要的分泌衍生物(α-APPS)。可溶性α-APPS似乎能够充当自分泌因子和神经保护性因子，并且也可能充当神经营养性因子。体外研究表明751-残基和770-残基同工型(编码KPI基序)抑制丝氨酸蛋白酶，如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。分泌的APP同工型可以在培养下赋予细胞-细胞和细胞-基底黏附性能。仍未在体内证实全部这些被归因的功能。
在极化上皮细胞如Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞中，虽然小部分APP被顶端地定位和加工，但是APP主要定位至基底外侧膜，在那里它可以经历α-分泌酶剪切以在基底外侧释放α-APPS。在作为身体中表达最高水平APP(尤其APP695)的细胞类型之一的神经元中，APP可以在轴突运输的快组分中顺向运输。APP存在于轴突末端内的囊泡中，虽然不是特异性地处于突触囊泡中。细胞生物学研究表明轴突末端中的APP可以沿轴突向上逆向运输至细胞体，并且一些分子随后被充分转位至体-树表面(somatodendritic surface)。在其逆向轴突运输期间，一些APP分子可以再循环至轴膜表面。
虽然已经假定APP轴突端可能是产生Aβ的主要部位，但是这并未被明确地确定，并且在各种神经元亚部位处内体中再循环的APP可能能够经历β-分泌酶和γ-分泌酶依次剪切以释放该肽。虽然APP在神经元中特别丰富地表达并且已经显示神经元分泌大量的Aβ肽，但是也表达APP并释放可变量Aβ的其他脑细胞(包括星形细胞、小胶质细胞、内皮细胞和平滑肌细胞)可能对Aβ的分泌汇集物有贡献，其中，所述的分泌汇集物最终导致胞外沉积。另外，(i)几乎全部外周细胞也表达APP并产生Aβ和(ii)Aβ存在于血浆中的事实提高了循环性Aβ可能穿过血脑屏障并促成脑部Aβ积聚的可能性。
脂筏
通常认为脑脂质错综复杂地参与Aβ相关的致病途径。Aβ肽是AD患者的脑中发现的淀粉状蛋白斑的主要蛋白质组分，并被许多人视为本障碍的元凶。累积的胞外Aβ的量对于AD的病理生物学是至关重要的，并且取决于其产生/分泌及其清除的对抗速率。研究表明神经元依赖于早老蛋白1(“PS1”)和胞质连接蛋白170(“CLIP-170”)之间的相互作用来产生Aβ并且通过脂蛋白受体相关蛋白(“LRP”)途径摄取Aβ。在此要求之上，Aβ的形成取决于关键蛋白质在脂筏(“LR”)中的装配。本文所用的术语“脂筏”指富含胆固醇、鞘糖脂和葡糖基磷脂酰肌醇(GPI)标记的蛋白质的参与信号转导、蛋白质运输和蛋白酶解的膜微域。在LRs内部，认为APP首先被β-分泌酶(BACE)切割以产生APP的C端中间片段(CFT(C99))，后者保持嵌入膜中。CFT(C99)随后在位于脂双层内的部位被γ-分泌酶(一种含有早老蛋白、(PS1/PS2)、呆蛋白、PEN-2、和APH-1或其片段的高分子量多蛋白复合体)切割。Aβ最后释放到细胞外，在那里它可能：i)在寡聚化后开始积聚并且对神经元施加毒性，或ii)通过内吞机制(涉及载脂蛋白-E(apoE)和LRP或清道夫受体)，或通过胞外蛋白酶(包括胰岛素降解酶(IDE)和中性溶酶)降解被清除。
类似于甲基-β-环糊精，瘦蛋白降低神经元细胞中的β-分泌酶活性。此外，瘦蛋白在体外增加依赖于apoE的Aβ摄取。类似于瘦蛋白，甲基-β-环糊精可能(但不受理论限制)通过改变膜LR的脂质组成而降低神经元细胞中的β-分泌酶活性。类似于瘦蛋白，乙酰辅酶A羧化酶(例如TOFA)和脂肪酸合酶(浅蓝菌素)的抑制剂模拟瘦蛋白的作用，即，充当瘦蛋白模拟物。相反，乙莫克舍(肉碱棕榈酰转移酶-1的抑制剂)已知增加Aβ产生。
阿尔茨海默病
阿尔茨海默病(也称“AD”、“阿尔茨海默型老年性痴呆(SDAT)”或“阿尔茨海默病”)是中枢神经系统(“CNS”)的神经变性障碍。基于特征性神经学和神经心理学特征的存在，AD通常因患者病史、源自亲属的间接病史和临床观察被临床诊断。
AD的病理包括但是不限于：(1)APP、PS1和PS2基因中的错义突变；(2)Aβ42的改变的蛋白酶解；(3)Aβ42在脑间质液中的进行性积聚和聚集；(4)聚集的Aβ42沉积为弥散斑(与蛋白聚糖和其他促进淀粉状蛋白的底物缔合)；(5)Aβ40聚集到弥散的Aβ42斑上和某些斑相关蛋白(例如，补体c1q等)的累积；(6)炎症反应，包括(a)小胶质细胞活化和细胞因子释放，(b)星形细胞增生和急性期蛋白释放；(7)在淀粉状蛋白斑内部和神经毡中其他地方的进行性神经炎损伤；(8)神经元代谢性及离子稳态的扰乱；氧化性损伤；(9)改变的激酶/磷酸酶活性，其导致过度磷酸化的tau，后者导致PHF形成；(10)海马和大脑皮质中广泛的神经元/神经炎功能紊乱和死亡，伴有进行性神经递质缺乏；和(11)痴呆。可以进一步在受影响的皮质区中显露的最终效应包括神经炎营养不良、突触丧失、神经元核周体皱缩和选择性神经元丧失。
AD进一步以神经元和突触在大脑皮质和某些皮质下区域内的丧失为特征。这种丧失导致受影响的区域严重萎缩，包括颞叶和顶叶及部分的额叶皮质和扣带回中的变性。银染后，通过显微镜在患有AD的那些患者的脑中清晰可见淀粉状蛋白斑(“Aβ”)和神经原纤维缠结(“NFT”)。
斑
淀粉状蛋白斑是β淀粉状蛋白(“Aβ”)和细胞物质在神经元外部和周围的致密的、大多不溶性的沉积物。含有淀粉状前体蛋白(“APP”)的营养不良性神经突见于创伤性脑损伤中，并且可以伴随拳击员痴呆观察到“弥散斑”，但是AD中淀粉状蛋白斑的外观是独特的。神经炎斑(即，被tau神经原纤维病理包围的含有Aβ肽的胞外损伤)的特殊外观被认为是AD特异的。通常认为淀粉状蛋白斑不是针对神经原纤维病理的非特异性反应，因为非AD tau蛋白病(non-AD tauopathy)缺少淀粉状蛋白斑。对AD型淀粉状蛋白斑特异性的进一步证实在于以下事实：APP基因的突变或如唐氏综合征中那样的重复在临床和病理上产生AD的具体特征。因此，AD涉及神经炎淀粉状蛋白斑和NFT的特定组合，其中神经炎斑似乎对该疾病是更特异的，而NFT似乎更可能诱导神经变性。
神经炎斑
神经炎斑包含因致使神经细胞变性或逆行变性的诸过程所贡献的大致呈球状的胞外淀粉状蛋白沉积物。这些异常树突和轴突含有与NFT中所见的那些原纤维相同的异常tau原纤维。在特定的神经炎斑中，可以存在表达不同神经递质特征的来自多种不同来源的轴突。这些神经突经常扩张并扭曲，并且以包含膨大的溶酶体、众多的线粒体和成对螺旋状丝的超微结构异常为特点，其中，所述的成对螺旋状丝与包含神经原纤维缠结的那些成对螺旋状丝不可区分。此类斑也与小胶质细胞紧密缔合，所述的小胶质细胞表达与活化相关的表面抗原，如CD45和HLA-DR；它们被显示有丰富胶质丝的活跃星形细胞包围。小胶质细胞通常在神经炎斑的中央淀粉状蛋白核内部和附近，而星形细胞经常环绕在该斑的外部，同时它们的突起中的一些突起向心地朝该淀粉状蛋白核心延伸。形成这种神经炎斑所花费的时间是未知的，但是这些损伤可能经过漫长的时间段，可能许多月或年，极为逐进地演化。促成任一斑的周围神经炎可以源自具有多样神经递质类型的局部神经元。神经炎斑中存在的大多数原纤维性Aβ是以第42位氨基酸结尾的种类(Aβ42)，即，特别易于积聚的略微较长的更疏水的形式。然而，以第40位氨基酸结尾的Aβ种类(Aβ40)，其正常状态下由细胞的产出大于Aβ42，通常与Aβ42一起共定位于该斑中。神经炎斑在显微镜脑切片中的横截面直径从10μm至大于120μm不等，并且构成胞外核的淀粉状原纤维的密度和紧实度也在斑之间显示巨大差异。
神经炎斑代表一处胞外淀粉状蛋白斑病理诱导胞内神经原纤维病理和明显结构性与功能性扰乱的病灶。
弥散斑(前淀粉状蛋白沉积物)
许多Aβ沉积物缺少典型神经炎斑的压缩的原纤维状外观。研究已经表明，在边缘皮层及联络皮层中发现的许多斑和在不明确地涉嫌AD的常见症状学的脑区(例如，丘脑、尾状核、豆状核、小脑)中发现的几乎全部斑显示相对轻微的无定形Aβ对诊断性抗体的免疫反应性，其中，所述的诊断性抗体针对以精细颗粒状形式出现而无明确原纤维状压缩中心的内源性Aβ或合成性Aβ产生。在也含有许多神经炎斑的区域中检测到这些斑导致以下假设：这些蛋白斑代表神经炎斑的前体损伤，并且因而称作“弥散斑”或“前淀粉状蛋白沉积物”。在AD脑中沉积的Aβ肽主要以Aβ40或Aβ42结尾。研究已经显示，与在富含原纤维的神经炎斑中通常发现的混合(Aβ42加Aβ40)沉积物相反，以Aβ42结尾的肽是构成弥散蛋白斑的物质的亚单位，具有很少或没有Aβ40免疫反应性。
神经原纤维缠结
AD中常见受影响的脑区域内的许多神经元(内嗅皮质、海马、海马旁回、杏仁核、额叶联络皮层、颞叶联络皮层、顶叶联络皮层和枕叶联络皮层和某些投射至这些区域的皮层下核)含有大的、无膜束缚的占据大部分核周细胞质的异常纤维束。大部分的这些纤维由成对缠绕成螺旋的10nm丝(成对螺旋状丝(PHF))组成，螺旋周期约160nm。一些具有缠结的神经元也含有与PHF交错的10nm至15nm直丝束。神经原纤维缠结(NFT)是微管相关蛋白“tau”的聚集物，所述聚集物已经变得高度磷酸化并且积聚在细胞自身内部。Tau在神经元中相对丰富，但是存在于全部有核细胞中，并且发挥结合微管并稳定微管组装以用于多聚化的生理作用。由超过100千碱基组成并含有16个外显子的tau基因含有转录因子(如AP2和SP1)的共有结合位点。在成人脑中，在外显子2、3和10上转录的tau核RNA的可变剪接产生6种tau同工型，每种同工型(i)在外显子10上编码的C末端区域内具有3个或4个具备31或32个残基的肽重复序列，(ii)包含微管结合结构域或(iii)区别在于表达0、1或2个在外显子2和3上编码的插入片段。这些tau同工型以及它们的磷酸化状态在发育期间变化，从而无插入片段的3重复区(“3R”)tau在胎儿和出生早期婴儿中表达，而异质的同工型在成人脑中表达。RNA剪接中的这种转换也对应于tau磷酸化的减少。
在神经变性期间，tau在脯氨酸控制的丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点处异常磷酸化，这可以使用特异性抗血清加以检测。这些丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)磷酸化位点包括Ser202/Thr205(AT8位点)、Ser214、Ser181和/或Ser212(AT100位点)、Thr231和/或Ser235(TG3位点)和Ser396/Ser404(PHF-1位点)。可变tau剪接谱在病理表型之间不同，从而AD中的tau积聚物是3R tau与4R tau的混合物，皮克病中倾向于是3R tau，皮质基底节变性和进行性核上麻痹中倾向于是4R tau，而所谓的嗜银颗粒病(argyrophilic grain disease)积聚由3R tau组成的小包涵体。上位术语“tau蛋白病”包括积聚磷酸化tau的类型广泛的神经变性疾病。
已经显示多种激酶能够在体外使tau于多个位点处磷酸化。然而，还不清楚一种或多种激酶是否主要负责启动tau的体内过度磷酸化，其中，所述的tau体内过度磷酸化导致tau与微管明显解离并且聚集成不溶性的成对螺旋状丝。
磷酸化tau的区域分布与临床体征之间的关联性提示tau与AD发病机制之间的密切关系。伴随AD的tau磷酸化增加可能导致tau与微管分离，这可能受其他因素(例如，Aβ、氧化应激、炎症介质)辅助，并且可能导致NFT和神经毡线的隔绝。不受理论限制地，正常tau功能(稳定和维持微管)的丧失，连同毒性功能的获得，可能损害轴突运输并促成突触变性。然而，NFT毒性的作用仍不清楚。研究表明表达可抑制型人tau的小鼠模型仍发生NFT、神经元丧失和行为障碍；在tau抑制后，行为缺陷稳定化，然而NFT继续积聚。在另一个AD样模型中，伴有tau积聚的轴突病理早于蛋白斑沉积。NFT(和推测的“中间物”)存在于活神经元的细胞质中。仅在晚期疾病中鉴别到大量的胞外NFT。
NFT不是AD特异性的，尤其是当NFT的更广泛定义包括不同的tau同工型时或当人们扩展对NFT形态学特征的期望时。两类典型的AD损伤，神经炎斑和NFT，可以相互独立地出现。已经在多于12种较不常见的神经变性疾病中描述了生物化学上与AD中的那些缠结相似或在一些情况下与其不可区分的由tau积聚物组成的缠结，其中在几乎全部的所述较不常见神经变性疾病中没有发现Aβ沉积物和神经炎斑。
NFT出现在多种脑病中，并且可能引起多种疾病症态下的神经变性。除了AD外，也在一些额颞痴呆、强直性肌营养不良、病毒性全脑炎、拳击员痴呆、一些朊病毒病和其他脑病中发现了NFT。对于这些疾病中的许多疾病而言，NFT病理的严重性低于终末期AD中观察到的严重性。此外，以泛发性新皮层NFT为特征的病症均不缺少广泛的神经变性和临床痴呆。另一方面，存在许多具有广泛神经变性和临床痴呆而无NFT的慢性脑病亚型，如额颞痴呆的许多亚型、突触核蛋白病、亚急性或慢性梗死、代谢病、脱髓鞘病、发育病和三核苷酸重复序列病。Tau蛋白本身可以直接触发神经变性：tau中的许多种系突变产生伴有NFT的临床痴呆。这些tau蛋白病与AD不同，但是可能涉及共同途径。NFT出现在多种脑病中，并且可能引起多种疾病症态下的神经变性。
神经炎蛋白斑内部和外部的营养不良性皮层神经突
在淀粉状蛋白斑内部或紧邻其周围发现的许多扩大和扭曲的神经突含有PHF，这些PHF在结构上、生物化学上和免疫细胞化学上与那些构成NFT的PHF不可区分。此外，斑通常含有很多对PHF tau无免疫反应性的营养不良性神经突。Tau阳性的营养不良性神经突也以更广泛的分布存在于神经炎斑之外的皮层神经毡中。含有变异形式tau的营养不良性皮层神经突的普遍性和密度在AD患者之间有大幅度差异。研究已经表明NFT特别丰富的AD患者也是显示广泛tau-免疫反应的营养不良性皮层神经突的那些AD患者。一些斑内及斑外营养不良性神经突对磷酸化形式的神经丝亚基蛋白有免疫反应性；因而，磷酸化形式的神经丝亚基蛋白可以与磷酸tau反应性共存。这些观察结果表明对于在携带缠结的神经元和营养不良性神经突中出现的改变的激酶活性和磷酸酶活性可能存在几种底物。
淀粉状微血管病
Aβ最初从通常在AD或唐氏综合征患者的脑外部附近发现的淀粉状蛋白沉积的脑膜小动脉和小静脉中分离。类似地，大脑皮质中的小动脉、小静脉和毛细血管也经常携带淀粉状沉积物。这种微血管性血管病在超微结构水平上以脉管离腔基膜中存在的淀粉状原纤维为特征，有时伴随该原纤维明显延伸至周围的血管周围神经毡(焦虑性血管病(dysphoric angiopathy))中。虽然已有人提出以下证据：在注定形成淀粉状血管病的血管中最初沉积的种类可能是Aβ42，但是基于免疫反应性，作为微血管基膜中的细丝出现的Aβ肽似乎主要是Aβ40种类。淀粉状血管病的程度在具有相对类似实质(parenchmyal)Aβ负荷的AD脑之间有大幅度差异。这种微血管淀粉状变性对于AD中出现的皮层功能紊乱的贡献和淀粉状蛋白改变微血管功能的机制依然是未知的。具有由本质上与AD的那些Aβ沉积物不可区分的Aβ沉积物组成的淀粉状蛋白的血管可以在实质Aβ沉积物几乎不存在的情况下在无AD的年老受治疗者的脑中出现。这种状况(嗜刚果红淀粉状血管病(CAA))下此类携带淀粉状蛋白的血管以及AD中那些携带淀粉状蛋白的血管可能偶尔破裂，导致一处或多处脑出血。然而，大部分AD患者不遭受脑出血，尽管存在一些或许多微血管淀粉状沉积物。
阿尔茨海默病的主要基础性病因依然未知
AD的主要基础性病因依然未知。就富含Aβ肽的斑或NFT是否为主要神经变性要素以及它们是否在病因学上相关的问题持续存在分歧。在解决是否存在最终导致特征性病理的较早生物化学事件的研究工作之间存在高度的不一致。通常认为在斑积聚之前，可溶性Aβ寡聚物产生神经毒作用，从而导致神经变性、突触丧失和痴呆。而且，增加的Aβ水平可能因异常的脂质积聚引起，因而产生改变的膜流动性和脂筏成分。然而+，对于代表极大多数AD病例的散发性AD，仍不存在触发Aβ级联的特定病因的有力证据。
瘦蛋白
瘦蛋白是由脂肪组织分泌的螺旋状蛋白，它作用于下丘脑腹内侧核中的受体位点以在身体脂肪储备增加时抑制食欲并且提高能量消耗。瘦蛋白水平在女性体内高出40％，并且在月经初潮前夕显示进一步升高50％，随后返回至基线水平。瘦蛋白水平因禁食而降低并且因炎症而提高。
消除瘦蛋白或瘦蛋白信号传导足以引起肥胖症，如由以下例子所示：瘦蛋白缺乏的肥胖的血胰岛素过多的小鼠，其具有基因型ob/ob；带有瘦蛋白受体基因中突变的糖尿病小鼠，其具有产生但不应答于瘦蛋白的基因型db/db；基因型fa/fa的大鼠，其具有作为突变瘦蛋白受体的“胖子”肥胖症基因；以及个别罕见遗传病例(Schwartz等人，Nature.404：661-71(2000))。在编码瘦蛋白的ob基因上具有突变的实验小鼠变得病态肥胖、患糖尿病和不育；施用瘦蛋白于这些小鼠改善葡萄糖耐量，提高身体活动性，降低体重30％，并且恢复生育力。带有编码瘦蛋白受体的db基因的突变的小鼠也变得肥胖和患有糖尿病，但是未因施用瘦蛋白而改善。已鉴别出了编码瘦蛋白和瘦蛋白受体位点的人类基因。虽然已经在具有异常进食行为的少数病态肥胖的人类受治疗者中发现瘦蛋白基因和瘦蛋白受体基因的突变，但是大多数肥胖的人不显示此类突变，并且具有正常或升高的瘦蛋白循环水平。饥饿中见到的免疫缺陷可能因减少的瘦蛋白分泌引起。缺少瘦蛋白基因或其受体基因的小鼠显示T细胞功能损坏，并且在实验室研究中，瘦蛋白诱导人CD4淋巴细胞的增殖反应。
与其功能性受体结合的瘦蛋白召集Janus酪氨酸激酶并激活该受体，该受体随后充当胞质衔接物如STAT的停靠位点(Baumann，H.，等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8374 1996))。根据JAK/STAT激活的一般模型，STAT蛋白起初以无活性形式存在于细胞质中。在配体刺激和受体二聚化后，JAK/STAT途径因激活受体结合JAK激酶而活化。这些JAK激酶随后在酪氨酸残基处使该受体磷酸化，这将STAT召集至该受体。STAT随后磷酸化以形成磷酸化STAT，二聚化并且转位至细胞核，在细胞核中磷酸化STAT二聚体与其靶基因的启动子区中的特定序列结合并刺激这些基因的转录(Schindler等人，Ann.Rev.Biochem.64：621-51(1995))，所述基因包括负调节基因，如细胞因子信号传导3的阻抑基因(Bjorbaek，C，K.等人J.Biol.Chem.274：30059(1999))和蛋白酪氨酸磷酸酶1B(Cheng，A.N.等人Dev.Cell2：497(2002)，Schwartz等人，Nature，404：661-71(2000)，Louis A.Tartaglia，J.Biol.Chem.Minireview，272：6093-6096(1997年3月))。
除了JAK-2-STAT-3途径之外，其他途径也涉及介导瘦蛋白在脑中和对免疫细胞的作用。例如，促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径、胰岛素受体底物1(IRS1)途径和磷脂酰肌醇3’-激酶(PI3’K)途径(Martin-Romero，C，V.Sanchez-Margalet.Cell.Immunol.212：83(2001))也介导瘦蛋白的作用(Sanchez-Margalet，V.，C.Martin-Romero，Cell.Immunol.211：30(2001))。
瘦蛋白也可以作为面对热量摄入巨大变动时负责维持胞内稳态的脂质调节激素发挥生理作用(Unger R H.2003.Annu Rev Physiol.65：333-47)。这通过直接刺激脂解作用(意指脂肪分解)并抑制脂肪生成(意指脂肪合成)来实现(Lee Y，等人，J.Biol Chem.276(8)：5629-35(2001))。瘦蛋白也可以通过不完全所知的机制改善胰岛素抵抗和高血糖症(Toyoshima等人，Endocrinology 146：4024-35(2005))，即便存在胰岛素刺激脂肪生成的能力(Kersten，EMBOReports 2(4)：282-286(2001))。瘦蛋白生理作用的这个方面是重要的，因为胰岛素和Aβ共享一套清除机制，即，被胰岛素降解酶(IDE)降解。
瘦蛋白也控制胰岛素敏感性。在中枢神经系统(CNS)内部，瘦蛋白跨过血脑屏障以结合脑中的特异性受体来介导食物摄取、体重和能量消耗。通常而言，(i)瘦蛋白以与体脂成比例的水平循环；(ii)瘦蛋白与其血浆浓度成比例地进入CNS；(iii)瘦蛋白受体发现于参与调节能量摄取和消耗的脑神经元中；和(iv)瘦蛋白通过作用于内侧基底下丘脑中的受体控制食物摄入和能量消耗。
通常认为瘦蛋白抑制含有神经肽Y(NPY)和野灰蛋白相关肽(AgRP)的神经元的活性，并且提高表达α促黑素细胞激素(α-MSH)的神经元的活性。NPY神经元是调节食欲的关键要素；注射到实验动物脑中的小剂量NPY刺激进食，而选择性破坏小鼠中的NPY神经元使它们变得厌食。相反，α-MSH是饱感的重要介质，并且α-MSH在脑中对其起作用的受体的基因的差异与人类肥胖有关。
AMP活化的蛋白激酶(AMPK)
AMP活化的蛋白激酶(AMPK)是系统发育上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其作为由催化性亚基α和两个调节性β和γ亚基组成的异三聚体复合体存在。AMPK的常规丝氨酸/苏氨酸活性由其α亚基支持，该α亚基以一个苏氨酸残基(Thr172)的存在(在激活环中)为特征，其中，所述苏氨酸残基的磷酸化是活化所要求的。α亚基的C端区是与其余两个β亚基和γ亚基缔合所要求的。β亚基含有与α亚基和γ亚基缔合所要求的C端区域和允许AMPK复合体结合糖原的中央区。γ亚基含有4个称作胱硫醚β-合酶(“CBS”)基序的串联重复序列，其以互斥方式与总共2分子的AMP或ATP结合。AMP(在γ亚基上)的结合通过一种复杂机制激活AMPK，其中，所述的机制涉及通过上游激酶如蛋白激酶LKB1(一种肿瘤抑制基因，其在人类中的种系突变是Peutz-Jeghers综合征的病因)、CaMKKIIβ(钙调蛋白-依赖性蛋白激酶激酶IIβ)和可能的TAK1(哺乳动物转化生长因子β活化激酶)直接变构激活并且在Thr172上磷酸化α亚基。
已经在哺乳动物、果蝇(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))、蠕虫(秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans))、酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、植物(拟南芥(Arabidopsis thaliana))和原始原生动物篮氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)中鉴别出全部3种亚基的具有高度保守性的同源物，其中，所述的高度保守性表明这种蛋白质在至少十亿年前演化以调节许多种针对代谢稳态的活动。在哺乳动物中，已知由不同基因编码的每种亚基的2种至3种同工型(α1、α2、β1、β2、γ1、γ2、γ3)，这产生庞杂种类的异三聚体组合，同时剪接变体(对于γ2基因和γ3基因而言)增加这种多样性。此外，已经报道了催化性同工型和调节性同工型的表达图式的组织分布差异。
对人骨骼肌中AMPK复合体的同工型组成的研究发现12种理论上可能的AMPK复合体中仅3种存在(α2β2γ1＞＞α2β2γ3＝α1β2γ1)并且差异性地激活，这取决于锻炼强度和持续时间。另外，已经在骨骼肌和心脏中显示每种催化性同工型对其偏好性上游激酶的专一性；实际上，在LKB1-/-小鼠中，心脏局部缺血和骨骼肌收缩不能够激活AMPKα2亚基，而AMPKα1激活仅轻微受影响。γ3亚基的表达似乎对于糖酵解性骨骼肌是高度特异的，而γ1和γ2显示广泛的组织分布。在骨骼肌中，β2亚基也高度表达，但是β1亚基在肝脏中占多数。含有AMPKα1和α2的复合体各自占肝脏中约半数的总AMPK活性。在脂肪组织中，主要表达含有α1催化亚基的AMPK复合体，而在骨骼肌和心肌中，含有α2催化亚基的AMPK复合体是占多数的。
除了组织分布差异外，通常认为AMPK复合体的分布也在胞内水平受调节。已经在细胞核和细胞质中发现含有AMPKα2的复合体；这增加了直接磷酸化辅激活物和转录因子的可能性。相反，含有AMPKα1的复合体主要位于细胞质中，但是也在气道上皮细胞和颈动脉体细胞中的质膜处观察到该复合体。虽然仍不清楚不同AMPK同工型组合的功能性意义以及每种异三聚体AMPK复合体与其对AMP和ATP的特殊敏感性、亚细胞定位和/或特定靶有关的功能；但是已经假设对于人骨骼肌中锻炼诱导的葡萄糖运输的调节可能与α2β1而非α2β2γ3异三聚体复合体激活有关。已经进一步提出同工型组合也可以决定AMPK的亚细胞靶向并因而决定靶向底物。研究已经显示β1亚基的翻译后修饰可以靶向AMPK复合体至质膜。此外，发现网蛋白(一种已经显示结合γ1亚基的细胞骨架接头蛋白)影响分化的肌管中AMPK复合体的亚基组成。因而，特定AMPK复合体的选择性表达可能决定针对不同代谢胁迫的特化细胞反应和全身性反应。
鲜有针对AD病理生物学中由瘦蛋白所触发的代谢途径的研究，并且仍不清楚5-腺苷一磷酸蛋白激酶(AMPK)在AD病理生物学中的作用。
本发明提供了关于治疗因NFT或Aβ积聚引起的进行性认知功能紊乱的方法，还提供了利用瘦蛋白及其在神经元细胞中借助独特的AMPK依赖性机制调节2条主要AD途径的作用来治疗AD的方法和组合物。瘦蛋白的这种双模作用和AMPK激活剂的潜在双模作用提供了针对AD治疗的新治疗方法。目前批准的疗法不能靶向任何该疾病的AMPK相关方面并且仅提供症状缓解。此外，现有的研究药物最多仅解决一个AMPK相关方面。
发明概述
本发明的目的在于提供用于进行性认知障碍的组合物和临床治疗方法与诊断方法。
根据一个方面，所述发明提供一种用于治疗进行性认知障碍的方法，该方法包括步骤：(a)提供治疗有效量的瘦蛋白组合物，其中，所述瘦蛋白组合物包含：(i)作为第一治疗剂的瘦蛋白或瘦蛋白类似物；(ii)任选地，至少一种第二治疗剂；和(iii)药学上可接受的载体；(b)对有需要的受治疗者施用(a)的组合物；和(c)减少或预防进行性认知障碍的至少一种病理的进展。根据一种实施方案，该组合物减少Aβ产生、增加Aβ的摄取或减少tau蛋白磷酸化。根据另一种实施方案，tau蛋白磷酸化的位点包含以下至少一种：Ser202/Thr205(AT8位点)、Ser214、Ser181、Ser212(AT100位点)、Thr231、Ser235(TG3位点)和Ser396/Ser404(PHF-1位点)。根据另一种实施方案，所述进行性认知障碍是阿尔茨海默病、进行性核上麻痹；痴呆；克-雅病、额颞痴呆、皮克病、伴有帕金森病-17皮质基底节变性的额颞痴呆、额颞叶变性；亨廷顿病；或帕金森病。根据另一种实施方案，所述进行性认知障碍是阿尔茨海默病。根据另一种实施方案，所述病理包含选自以下组的至少一种病理：tau蛋白磷酸化；神经原纤维缠结；APP的改变的蛋白酶解；Aβ42在脑间质液中积聚；Aβ42在脑间质液中聚集；Aβ40在脑间质液中积聚；Aβ40聚集；炎症反应；神经炎损伤；神经元代谢稳态的扰乱；神经元离子稳态的扰乱；氧化性损伤；改变的激酶活性；改变的磷酸酶活性；神经元性功能紊乱；神经元细胞死亡；神经递质缺乏；痴呆；神经炎营养不良；神经元核周体皱缩和突触丧失。根据另一种实施方案，任选的至少一种第二治疗剂从由以下物质所组成的组中选择：抗生素剂、抗真菌剂、激酶抑制剂、抗病毒剂、抗原虫剂、甾体抗炎剂、抗氧化剂、激素、维生素、抗组胺剂和化疗剂组成。根据另一种实施方案，任选第二治疗剂是至少一种激酶抑制剂。根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂从由以下物质所组成的组中选择：钙/钙调蛋白-依赖性蛋白激酶II的激酶抑制剂；蛋白激酶A的激酶抑制剂；GSK-3β的激酶抑制剂；cAMP-依赖性蛋白激酶的激酶抑制剂；5-腺苷一磷酸蛋白激酶的激酶抑制剂；Myr-AIP、LiCl KT5720、6-溴靛玉红-3’-肟((2’Z，3’E)-6-溴靛玉红-3’-肟)；KT5720；K252a；星形孢菌素；KT5252b；白屈菜赤碱和TDZD-8(4-苄基-2-甲基-1，2，4-噻二唑烷-3，5-二酮-8)。根据另一种实施方案，所述组合物以大于该组合物组分(i)、(ii)和(iii)总和的水平提供激酶抑制作用。根据另一种实施方案，瘦蛋白或瘦蛋白类似物在瘦蛋白组合物中的治疗有效量是从约0.0001mg/kg体重至约100g/kg体重的量。根据另一种实施方案，该组合物改善至少一种认知功能。根据另一种实施方案，所述的至少一种认知功能是记忆。根据另一种实施方案，所述的至少一种认知功能是学习。
根据另一个方面，所述发明提供了一种用于改善有需要的受治疗者中认知功能复原的方法，该方法包括步骤：(a)对有需要的受治疗者施用瘦蛋白组合物，所述瘦蛋白组合物包含：(i)作为第一治疗剂的增强认知功能的量的瘦蛋白或瘦蛋白类似物；(ii)任选地，至少一种第二治疗剂，和(iii)药学上可接受的载体；其中，该组合物减少Aβ产生、增加Aβ的摄取，或降低磷酸化tau的水平；并且(b)改善受治疗者中认知功能的复原。根据一种实施方案，磷酸化tau的丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点包括Ser202/Thr205(AT8位点)、Ser214、Ser181、Ser212(AT100位点)、Thr231、Ser235(TG3位点)和Ser396/Ser404(PHF-1位点)之中至少一种。根据另一种实施方案，所述认知功能是记忆。根据另一种实施方案，记忆是条件性记忆。根据另一种实施方案，记忆是情境记忆。根据另一种实施方案，所述认知功能是记忆保持。根据另一种实施方案，所述认知功能是学习。根据另一种实施方案，学习是情境学习。根据另一种实施方案，学习是条件性学习。根据另一种实施方案，任选第二治疗剂从由以下物质所组成的组中选择：抗生素剂、抗真菌剂、激酶抑制剂、抗病毒剂、抗原虫剂、甾体抗炎剂、抗氧化剂、激素、维生素、抗组胺剂和化疗剂。根据另一种实施方案，任选第二治疗剂是至少一种激酶抑制剂。根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂从由以下物质所组成的组中选择：钙/钙调蛋白-依赖性蛋白激酶II的激酶抑制剂；蛋白激酶A的激酶抑制剂；GSK-3β的激酶抑制剂；cAMP-依赖性蛋白激酶的激酶抑制剂；5-腺苷一磷酸蛋白激酶的激酶抑制剂；Myr-AIP、LiCl KT5720、6-溴靛玉红-3’-肟((2’Z，3’E)-6-溴靛玉红-3’-肟)；KT5720；K252a；星形孢菌素；KT5252b；白屈菜赤碱和TDZD-8(4-苄基-2-甲基-1，2，4-噻二唑烷-3，5-二酮-8)。根据另一种实施方案，所述组合物以大于该组合物组分(i)、(ii)和(iii)总和的水平提供激酶抑制作用。根据另一种实施方案，瘦蛋白或瘦蛋白类似物在瘦蛋白组合物中的增强认知功能的量是从约0.0001mg/kg体重至约100g/kg体重的量。
根据另一个方面，所述发明提供一种用于鉴定有效治疗剂的方法，所述的有效治疗剂用于治疗因Aβ积聚、tau蛋白磷酸化或神经原纤维缠结积聚中至少一种引起的进行性认知功能紊乱疾病或障碍，该方法包括步骤：(a)提供包含神经元细胞的细胞培养物，(b)使包含神经元细胞的细胞培养物与推定性治疗剂接触，(c)确定所述推定性治疗剂是否与蛋白激酶蛋白的活性部分缔合以至它影响该蛋白激酶的活性；并且(d)鉴定所述推定性治疗剂为治疗进行性认知功能紊乱疾病或障碍的有效治疗剂。根据一种实施方案，蛋白激酶是5-腺苷一磷酸蛋白激酶或GSK-3β。根据另一种实施方案，推定性治疗剂或有效治疗剂是重组蛋白。根据另一种实施方案，推定性治疗剂或有效治疗剂是抑制剂。根据另一种实施方案，推定性治疗剂或有效治疗剂是拮抗剂。根据另一种实施方案，推定性治疗剂或有效治疗剂是激动剂。根据另一种实施方案，推定性治疗剂或有效治疗剂是抗体。根据另一种实施方案，推定性治疗剂或有效治疗剂防止瘦蛋白或瘦蛋白类似物与蛋白激酶缔合。根据另一种实施方案，确定性步骤(c)包括相对于对照测量神经元细胞的β淀粉状蛋白的分泌。根据另一种实施方案，相对于对照通过ELISA或免疫印迹法测量神经元细胞的β淀粉状蛋白的分泌。根据另一种实施方案，所述方法进一步包括使用有效治疗剂以治疗β淀粉状蛋白病理的步骤。根据另一种实施方案，所述β淀粉状蛋白的病理包含选自以下组的至少一种病理：tau蛋白磷酸化；神经原纤维缠结；APP的改变的蛋白酶解；Aβ42在脑间质液中积聚；Aβ42在脑间质液中聚集；Aβ40在脑间质液中积聚；Aβ40聚集；炎症反应；神经炎损伤；神经元代谢稳态的扰乱；神经元离子稳态的扰乱；氧化性损伤；改变的激酶活性；改变的磷酸酶活性；神经元功能紊乱；神经元细胞死亡；神经递质缺乏；痴呆；神经炎营养不良；神经元核周体皱缩和突触丧失。根据另一种实施方案，有效治疗剂改善至少一种认知功能。根据另一种实施方案，所述的至少一种认知功能是记忆。根据另一种实施方案，所述的至少一种认知功能是学习。
附图说明
图1显示瘦蛋白、胰岛素和CRP在CRND8和野生型小鼠中的血清浓度。通过ELISA评估来自瘦蛋白处理或盐水处理的CRND8或野生型(“wt”)小鼠的血清中(A)瘦蛋白、(B)胰岛素和(C)CRP的循环水平。结果(n＝6)表达为平均浓度(ng/ml或pg/ml)±标准差(SD)。*相对于盐水处理的CRND8。
图2显示CRND8小鼠脑和野生型小鼠脑中瘦蛋白、瘦蛋白受体(OB-R)和下游信号传导靶的表达。A.从瘦蛋白处理或盐水处理的CRND8小鼠或野生型小鼠收获脑，并且通过免疫印迹法确定(B)瘦蛋白、(C)瘦蛋白受体和(D、E)下游信号传导靶(SOCS3、PPARγ)的表达。
图3显示CRND8小鼠和野生型小鼠中APP C端片段(CTF)和可溶性Aβ1-40的表达。A.从瘦蛋白处理或盐水处理的CRND8小鼠或野生型小鼠收获脑，并且通过免疫印迹法确定APP CTF(C99、C83)的表达。B.归一化的条带(C99/C83与总CTF/α-微管蛋白之比)由光密度测定法分析并且表达为平均密度±标准差。C.通过ELISA确定瘦蛋白处理或盐水处理的CRND8小鼠或野生型小鼠的脑中或(D)血清中存在的可溶性Aβ1-40的水平。
图4显示瘦蛋白处理的TgCRND8小鼠中的淀粉状蛋白斑沉积。A.脑切片用4G8抗体在海马区域中染色；Le-用瘦蛋白处理的转基因动物；Sa-用盐水处理的转基因动物。B.柱形代表蛋白斑的平均大小(μmm2)±标准误差均值(S.E.M.)或(C)该区域中染色的面积的百分数±标准误差均值；n＝8-9每柱形。D.用4G8抗体染色的皮质区。
图5显示TgCRND8小鼠脑和野生型小鼠脑中AD相关的tau磷酸化。A.从瘦蛋白处理或盐水处理的CRND8或野生型小鼠收获脑，并且通过免疫印迹法确定在(B)Ser396、(C)PHF-1(Ser396/404)、(D)AT8(Ser202/204)和(E)Ser181处的tau磷酸化。
图6显示CRND8小鼠和野生型小鼠的认知评估结果。A.物体识别试验，B.恐惧条件化试验。情境：*对于WT相对于Tg+瘦蛋白，p＝0.009；*对于WT相对于Tg+盐水，p＝0.0001；线索：*对于WT相对于Tg+瘦蛋白，p＝0.012；*对于WT相对于Tg+盐水，p＝0.0001；对于Tg+瘦蛋白相对于Tg+盐水，p＝0.004。
图7显示RA-SY5Y中对tau磷酸化的酶促调节。
图8显示瘦蛋白和AICAR对RA-SY5Y中tau特异性激酶活化的影响。RA-SY5Y用瘦蛋白(1600ng/ml)、AICAR(2mM)处理或未处理(运载体)，通过免疫印迹法测量(A)CaMKII(pThr286)、(B)PKA(pThr197)和(C)GSK-3β(pSer9)的磷酸化。
图9显示瘦蛋白和AICAR借助GSK-3β-依赖性机制调节tau磷酸化。(A)RA-SY5Y用GSK-3β-特异性siRNA瞬时转染或未转染(泳道(1))，并且稍后用瘦蛋白(1600ng/ml-泳道4)、AICAR(2mM-泳道5)处理或未处理(运载体-泳道3)。以荧光素缀合的对照siRNA(泳道2)转染的细胞用来评估转染效率并且充当阴性对照。制备并且通过免疫印迹法用GSK-3β-特异性抗体(分图I)或磷酸化tau-特异性抗体(pSer396、PHF-1、AT8或pSer181；分图II)分析全细胞裂解物。将膜剥离并用总GSK-3β抗体(分图I)或总tau抗体(分图II)再探测以归一化。(B)RA-SY5Y用GSK-3β全长cDNA表达载体瞬时转染或未转染(泳道1)，并且稍后用瘦蛋白(1600ng/ml-泳道4)、AICAR(2mM-泳道5)处理或未处理(运载体-泳道3)。用空表达载体转染的细胞(泳道2)充当阴性对照。如A中那样制备、分析并且归一化全细胞裂解物。*相对于阴性对照(泳道2)；**相对于用运载体处理的过量表达GSK-3β的细胞(泳道3)。
图10显示瘦蛋白和AICAR在其他神经元模型中的作用。(A)人类IMR-32细胞；(B)大鼠原代皮质神经元；(C)IMR-32细胞用瘦蛋白(1600ng/ml)、AICAR(2mM)处理或未处理(运载体)。制备并且通过免疫印迹法用磷酸化tau特异性抗体(pSer396，PHF-1，AT8或pSer181)分析全细胞裂解物。IMR-32细胞(C)如(A)中那样处理，并且通过免疫印迹法测量GSK-3β(Ser9)的磷酸化。*相对于未处理(运载体)。
图11显示瘦蛋白和AICAR借助重叠的信号传导途径调节tau磷酸化。(A)RASY5Y与瘦蛋白信号传导的已知下游效应物(STAT3、AMPK、PI3K、Akt、p38)的抑制剂在瘦蛋白(1600ng/ml-泳道3-7)存在的情况下孵育或未处理(运载体-泳道1)。用单独的瘦蛋白处理的细胞充当阳性对照(泳道2)。制备并且通过免疫印迹法用磷酸化tau特异性抗体(pSer396、PHF-1、AT8或pSer181)分析全细胞裂解物。(B)通过免疫印迹法用磷酸化GSK-3β-特异性抗体分析来自(A)的全细胞裂解物，与单独的瘦蛋白相比没有明显改变tau磷酸化的那些全细胞裂解物(STAT3、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K))例外。(C)细胞用瘦蛋白、AICAR处理或未处理(运载体)，并且，通过免疫印迹法用磷酸化-特异性抗体检验参与调节tau磷酸化的信号传导分子(Jak2、AMPK、p38、Akt)的激活。将膜剥离并用α-微管蛋白抗体再探测以归一化。*相对于未处理(运载体-泳道1)；**单独的瘦蛋白(泳道2)
图12显示瘦蛋白和AICAR借助重叠的信号传导途径调节Aβ产生。(A)RA-SY5Y用瘦蛋白(1600ng/ml-泳道2)、AICAR(2mM-泳道6)和/或每种以下信号蛋白——AMPK(泳道3和7)、PPARγ(泳道4和8)或p38(泳道5和9)的抑制剂处理6小时。未处理的(运载体-泳道1)细胞或用单独的抑制剂处理的细胞(泳道10-12)充当对照。收集培养基并通过ELISA对其测定Aβ(1-40)。(B)RA-SY5Y用瘦蛋白、AICAR(2mM)处理或未处理(运载体)，并且通过免疫印迹法测量PPARγ的水平。将膜剥离并用α-微管蛋白抗体再探测以便归一化。*相对于未处理(运载体-泳道1)；**相对于单独的瘦蛋白(泳道2)；#相对于单独的AICAR(泳道6)
图13显示瘦蛋白和AICAR信号传导途径在AMPK的下游不介导tau磷酸化和Aβ产生。(A)RA-SY5Y用单独的瘦蛋白(1600ng/ml)或在Akt抑制剂(1L6HCI)存在的情况下处理6小时。未处理的(运载体)细胞充当对照。收集培养基并通过ELISA对其测定Aβ(1-40)。(B)RA-SY5Y用单独的瘦蛋白(1600ng/ml)或在PPARγ抑制剂(G3335)存在的情况下处理6小时。未处理的(运载体)细胞充当对照。制备并且通过免疫印迹法用磷酸化tau特异性抗体(pSer396、PHF-1、AT8或pSer181)分析全细胞裂解物。(C)描述RA-SY5Y中由瘦蛋白和AICAR激活的信号传导途径的示意图。AMPK被瘦蛋白或AICAR激活减少了Aβ产生和tau磷酸化。然而，所述信号传导途径在AMPK的下游独立地发挥作用以介导tau-或Aβ-特异性效应；*相对于未处理(运载体)。
图14显示因多重激酶抑制作用而减少的tau磷酸化。RASY5Y细胞与单独的或各种组合下的CaMKII、PKA或GSK-3β的抑制剂孵育1小时或未处理(运载体)，并且测量tau的磷酸化。制备并且通过免疫印迹法用磷酸化tau特异性抗体(pSer396)分析全细胞裂解物。*相对于未处理(运载体)；**相对于用任一单独的激酶抑制剂处理。
图15显示瘦蛋白和AICAR没有明显地减少与锂孵育的RA-SY5Y细胞中的tau磷酸化。RA-SY5Y在瘦蛋白(1600ng/ml)、AICAR(2mM)存在的情况下或无另外的处理(运载体)时与或不与锂(10mM)孵育，并且测量tau的磷酸化。
图16显示来自一个模型的说明性数据的曲线，其中，所述模型用于评估酶抑制作用的模式。
具体实施方式
词汇
如本文中所用的术语“活性部分”指肽或蛋白质中能够使该肽或蛋白质发挥作用的区域。
本文所用的术语“施用”指促成服用或分配，包括体内施用以及直接向离体(ex vivo)组织施用。通常，组合物可以含有所需的常规无毒药学上可接受的载体、佐剂和运载体(vehicle)的剂量单位制剂经口地、经颊地、肠胃外地、局部地、通过吸入或吹入(即，经口或经鼻吸入或吹入)或经直肠地全身施用，或者可以通过例如但不限于注射、植入、移植、局部应用或肠胃外施用。
如本文中所用的处于各种语法形式的术语“影响”指具有或产生效果、实质影响、或改变。
本文所用的术语“激动剂”指能够激活受体以诱导全部或部分药理学反应的化学物质。受体可以由内源性或外源性激动剂和拮抗剂激活或失活，导致刺激或抑制生物学反应。生理激动剂是产生相同身体应答，但是不与相同受体结合的物质。特定受体的内源性激动剂是身体天然产生的化合物，其结合至并激活该受体。超级激动剂是一种化合物，它能够产生比靶受体的内源性激动剂更大的最大应答，因此产生大于100％的效率。这实际上并不意指该化合物比内源性激动剂更有效力，而是在受体结合后细胞内可以产生的最大可能应答的比较。完全激动剂结合并激活受体，对该受体展现完全功效。部分激动剂也结合并激活给定受体，但相对于完全激动剂仅对该受体具有部分功效。反向激动剂是作为该受体的激动剂与相同受体结合位点结合并且逆转受体稳定活性的物质。反向激动剂施加受体激动剂的相反药理学作用。不可逆性激动剂是以如此方式与受体永久结合以至于该受体被永久激活的一种激动剂。它与普通激动剂的区别在于激动剂与受体的结合是可逆的，而认为不可逆性激动剂与受体的结合是不可逆的。这使得该化合物产生激动剂活性的短暂突发，随后受体脱敏和内化，其在长期处理的情况下产生更类似拮抗剂的作用。选择性激动剂对一种特定类型受体是特异的。
术语“变构的”涉及效应物结合时构象的变化。术语“变构调节”指通过在酶或其他蛋白质的变构位点处结合效应物分子对该酶或蛋白质的调节作用。变构蛋白的调节位点通常在物理上不同于其活性部位。增强该蛋白质的活性的效应物称为“变构激活剂”，而降低该蛋白质的活性的那些效应物称为“变构抑制剂”。因而，当一种配体的结合增强底物分子与其他结合位点之间的吸引力时，“变构激活”发生；当一种配体的结合降低底物在其他活性部位的亲和力时，“变构抑制”发生。
如本文中所用的术语“变构调制”指受体由变构调质在不同于内源性配体(正位配体(orthosteric ligand))结合位点的调节位点处结合而被调节、变更、修改或调整(调制)，并且增强或抑制所述内源性配体的作用的过程。变构调质正常地通过引起受体分子的构象变化发挥作用，所述的构象变化导致配体的结合亲和力变化。因而，变构配体“调节”初级“配体”对受体的激活，并且可以调节受体激活的强度。许多变构酶受其底物调节；将这种底物视为“同促变构调质”。非底物的调节分子叫做“异促变构调质”。
如本文中所用的术语“改良“意指使得更好或变得更好或改善。
术语“淀粉状肽”、“β淀粉状肽”和“Aβ”在本文中互换地用来指由淀粉状前体蛋白(APP)的蛋白酶解加工生成的肽家族。
本文所用的术语“拮抗剂”指抵消另一种物质之效果的物质。
如本文中所用的短语“贴壁依赖性(贴壁)细胞”指需要基底以分裂和产生单层的细胞。
本文所用的术语“抗生素剂”指主要用于治疗感染性疾病的具有抑制细菌和其他微生物生长或将它们摧毁的能力的任何化学物质。抗生素剂的实例包括但不限于青霉素G；甲氧西林；萘夫西林；苯唑西林；氯唑西林；双氯西林；氨苄西林；阿莫西林；替卡西林；羧苄西林；美洛西林；阿洛西林；哌拉西林；亚胺培南；氨曲南；先锋霉素；头孢克洛；头孢西丁；头孢呋辛；头孢尼西；头孢美唑；头孢替坦；头孢丙烯；氯碳头孢；头孢他美；头孢哌酮；头孢噻肟；头孢唑肟；头孢三嗪；头孢他啶；头孢吡肟；头孢克肟；头孢泊肟；头孢磺啶；氟罗沙星；萘啶酸；诺氟沙星；环丙沙星；氧氟沙星；依诺沙星；洛美沙星；西诺沙星；多西环素；米诺环素；四环素；阿米卡星；庆大霉素；卡那霉素；奈替米星；妥布霉素；链霉素；阿奇霉素；克拉霉素；红霉素；依托红霉素；琥乙红霉素；葡萄庚酸红霉素；乳糖酸红霉素；硬脂酸红霉素；万古霉素；替考拉宁；氯霉素；克林霉素；甲氧苄啶；磺胺甲基异
Figure BPA00001391223900241
唑；呋喃妥因；利福平；莫匹罗星；甲硝唑；头孢氨苄；罗红霉素；Co-amoxiclavuanate；哌拉西林和他唑巴坦的组合；以及它们的各种盐、酸、碱和其他衍生物。抗菌抗生素剂包括但不限于青霉素类、头孢菌素类、碳头孢烯类、头霉素类、碳青霉烯类、单环β内酰胺类、氨基糖甙类、糖肽类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类和氟喹诺酮类。
抗体是血清蛋白，其分子拥有与它们靶上的小化学基团互补的小表面区域。这些互补区(称为抗体结合位点或抗原结合位点)，其中每个抗体分子存在至少2个互补区并且在一些类型的抗体分子中存在10个、8个互补区或在一些种类中存在多达12个互补区，可以与抗体上其对应的互补区(抗原决定簇或表位)反应以将几个多价抗原分子连结起来形成晶格。
完整抗体分子的基本结构单元由构成4条多肽链组成，即两条相同的轻(L)链(每条链含有约220个氨基酸)和两条相同的重(H)链(每条链通常含有约440个氨基酸)。两条重链和两条轻链由非共价键和共价(二硫)键的组合保持在一起。该分子由相同的两半组成，每一半具有由轻链N末端区域和重链N末端区域组成的相同抗原结合位点。轻链和重链通常协作以形成抗原结合表面。
人抗体显示两种类型的轻链，κ和λ；免疫球蛋白的单个分子一般仅是一种或另一种。在正常血清中，已经发现60％的分子具有κ决定簇并且30％的分子具有κ决定簇。已经发现许多其他物种显示两种类型的轻链，但是它们的比例各异。例如，在小鼠和大鼠中，λ链占总量的少数百分比；在犬和猫中，κ链极少；马似乎没有任何κ链；兔可以具有5至40％的λ，这取决于品系和b-基因座同种异型；并且鸡轻链与λ而非κ更同源。
在哺乳动物中，存在5个类型的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，每个类型具有自身类型的重链：α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)和μ(IgM)。此外，存在分别具有γ1、γ2、γ3和γ4重链的4个IgG免疫球蛋白亚类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。在其分泌形式中，IgM是由5个四链单元组成的五聚体，从而赋予其总共10个抗原结合位点。每个五聚体含J链的一个副本，其共价地插于两个毗邻的尾部区域之间。
全部5个免疫球蛋白类别与其他血清蛋白的不同之处在于它们显示宽阔范围的电泳迁移率并且不是均质的。这种异质性——例如，各个IgG分子在净电荷上彼此不同，是免疫球蛋白的固有属性。
抗原决定簇或表位是分子上的抗原位点。顺序抗原决定簇/表位基本上是线形链。在有序结构物如螺旋状聚合物或蛋白质中，抗原决定簇/表位基本上是该结构物内部或其表面上涉及氨基酸侧链的有限区域或小块，其中，所述的氨基酸侧链来自该分子可能彼此靠近的不同部分。它们是构象决定簇。
经常被比作钥匙在锁中配合的互补性原理涉及相对微弱的结合力(疏水键和氢键、范德瓦尔斯力和离子相互作用)，其中仅在两个起反应的分子可能极密切地相互靠近并且实际上如此密切靠近使得一个分子中突出的组成原子或原子团可以配合至另一个分子中的互补性凹槽或凹陷时，所述的结合力能够有效地发挥作用。抗原-抗体相互作用显示高度特异性，这在许多水平上表现出来。就分子水平而言，特异性意指抗体针对抗原的结合位点具有与不相关抗原的抗原决定簇根本不相似的互补性。每当两种不同抗原的抗原决定簇具有一些结构相似性时，可能出现一个决定簇某种程度地配合入针对另一种抗原的一些抗体的结合位点，并且这种现象产生交叉反应。交叉反应在理解互补性或抗原-抗体反应特异性方面是十分重要的。免疫学特异性或互补性使得检测抗原当中的少量杂质/污染物成为可能。
可以通过源自永生化供体的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合以产生在选择性培养基中生长的稳定小鼠杂交瘤克隆而产生单克隆抗体(mAb)。杂交瘤细胞是因分泌抗体的B细胞与骨髓瘤细胞在体外融合产生的永生化杂合细胞。体外永生化，其指初始活化(primaryactivation)培养下的抗原特异性B细胞，是另一项充分建立的产生小鼠单克隆抗体的方法。
来自外周血淋巴细胞的免疫球蛋白重链(VH)和轻链(Vκ和Vλ)可变区基因的多样性库也可以由聚合酶链反应(PCR)扩增法扩增。可以通过使用PCR随机组合重链V基因和轻链V基因而产生编码其中重链可变结构域和轻链可变结构域由多肽间隔区连接的单一多肽链(单链Fv或scFv)的基因。组合库随后可以克隆用于通过与小衣壳蛋白在该噬菌体顶端处融合表现于丝状噬菌体的表面上。
定向选择技术基于采用啮齿类免疫球蛋白V基因的人免疫球蛋白V基因改组。该方法需要(i)将人λ轻链库与对目的抗原反应的小鼠单克隆抗体的重链可变区(VH)结构域混杂；(ii)在该抗原上选择半-人Fab；(iii)使用所选择的λ轻链基因作为第二次改组中人重链库的“对接结构域”来分离具有人轻链基因的克隆Fab片段；(v)采用含有所述基因的哺乳动物细胞表达载体，通过电穿孔法转染小鼠骨髓瘤细胞；和(vi)将与该抗原反应的Fab的V基因在小鼠骨髓瘤中表达为完整IgG1λ抗体分子。
术语“抗原”及其多种语法形式指可以刺激抗体产生并且可以与所述抗体特异性结合的任何物质。如本文中所用的术语“抗原决定簇”或“表位”指分子上的抗原位点。
本文所用的术语“抗真菌剂”指具有抑制真菌生长或将它们摧毁的能力的任何化学物质。抗真菌剂包括但不限于两性霉素B、克念菌素、制皮菌素、非律平、制霉色基素、曲古霉素、哈霉素、光明霉素、美帕曲星、纳他霉素、制霉菌素、培西洛星、培里霉素、偶氮丝氨酸、灰黄霉素、寡霉素、新霉素、硝吡咯菌素、西卡宁、杀结核菌素、绿毛菌素、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬、联苯苄唑、布康唑、氯登妥因、氯米达唑、氯康唑、克霉唑、益康唑、恩康唑、芬替康唑、氟曲马唑、异康唑、酮康唑、拉诺康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、托西拉酯、托林达酯、托萘酯、氟康唑(Fluconawle)、伊曲康唑、沙康唑、特康唑、吖啶琐辛、阿莫罗芬、珍尼柳酯、溴柳氯苯胺、丁氯柳胺、丙酸钙、氯苯甘醚、环吡酮、氯羟喹、艾索帕尔(Coparaffinate)、地马唑、依沙酰胺、氟胞嘧啶、哈利他唑、海克替啶、氯氟卡班、硝呋太尔、碘化钾、丙酸、羟基吡啶硫酮、水杨苯胺、丙酸钠、舒苯汀、替诺尼唑、三醋汀、苄硫噻二嗪乙酸(Ujothion)、十一烯酸和丙酸锌。
如本文所用的“抗组胺剂”指多种能够对抗体内的组胺并用于治疗过敏反应(例如枯草热)和感冒症状(cold symptom)的化合物中的任一种化合物。可用于本发明上下文中的抗组胺剂的非限制性实例包括扑尔敏、溴苯那敏、右氯苯那敏、曲普利啶(tripolidine)、氯马斯汀、苯海拉明、异丙嗪、哌嗪类、哌啶类、阿司咪唑、氯雷他定(loratadine)和特非那定(terfenadine)。
如本文所用的“抗氧化剂”指抑制氧化作用或者由氧或过氧化物所促进的反应的物质。可用于本发明上下文中的抗氧化剂的非限制性实例包括抗坏血酸(维生素C)及其盐、脂肪酸的抗坏血酸酯、抗坏血酸衍生物(例如、抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸磷酸酯钠、抗坏血酸山梨酸酯)、生育酚(维生素E)、生育酚山梨酸酯、生育酚醋酸酯、生育酚的其他酯类、丁基化羟基苯甲酸以及它们的盐、6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(可以Trolox
Figure BPA00001391223900271
的商品名商购)、五倍子酸及其烷基酯、特别是五倍子酸丙酯、尿酸及其盐和烷基酯、山梨酸及其盐、硫辛酸、胺类(例如，N，N-二乙基羟胺、氨基胍)、巯基化合物(例如，谷胱甘肽)、二羟基富马酸及其盐、甘氨酸吡酮酸盐(glycinepidolate)、精氨酸吡酮酸盐(arginine pilolate)、去甲二氢愈创木酸、生物类黄酮、姜黄素、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、超氧化物歧化酶、水飞蓟素、茶提取物、葡萄皮/籽提取物、黑色素和迷迭香提取物。
本文所用的术语“抗原虫剂”指具有抑制原虫生长或将它们摧毁的能力的任何化学物质，主要用于治疗原虫性疾病。抗原虫剂的实例包括但不限于乙胺嘧(Daraprim)、磺胺嘧啶和甲酰四氢叶酸。
本文所用的术语“抗病毒剂”指具有抑制病毒复制或将它们摧毁的能力的任何化学物质，主要用于治疗病毒性疾病。抗病毒剂包括但不限于，阿昔洛韦、西多福韦、阿糖胞苷、双脱氧腺苷、去羟肌苷、依度尿苷、泛昔洛韦、氟尿苷、更昔洛韦、碘苷、异丙肌苷、拉米夫定、MADU、喷昔洛韦、索立夫定、司他夫定、曲氟尿苷、伐昔洛韦、阿糖腺苷、扎西他滨、醋孟南、乙酰亮氨酸、金刚烷胺、脒霉素、地拉韦啶、膦甲酸、茚地那韦、干扰素(例如，IFN-α)、凯托沙、溶菌酶、美替沙腙、吗啉胍、奈韦拉平、鬼臼毒素、利巴韦林、金刚乙胺、利托那韦2、沙奎那韦、Stailimycin、维司托隆(Statolon)、曲金刚胺、齐多夫定(AZT)和珍那佐酸。
如本文中所用的术语“缔合”及其多种语法形式指直接、间接、活性地、非活性地、惰性地、非惰性地、完全地或不完全地接合、连接或结合至。
本文所用的术语“阻滞剂”指抑制另一种物质的生理学作用的物质。
如本文中所用的术语“携带”指通过将某细胞系在含有会维持该细胞系表型和基因型的养分的组织培养基中传代培养而维持该细胞系。
如本文中所用的术语“细胞培养物”指建立和维持从取自原始组织的分散细胞、原代培养物或从细胞系或细胞株衍生的培养物。
如本文中所用的术语“细胞系”指已经发生转化并可以在培养物中无限传代的永生化细胞群。
如本文中所用的术语“细胞株”指可以反复传代但仅持续有限传代次数的细胞。
如本文中所用的术语“克隆”指细胞、细胞产物或有机体，其在遗传上与衍生自身的单元或个体相同。如本文中所用的“克隆性”指细胞或物质衍生自一个来源或其他来源的状态。因而，术语“多克隆”指衍生许多种克隆；“寡克隆”指衍生自少数克隆；并且“单克隆”指衍生自一种克隆。
如本文中所用的术语“原代培养物”指因接种分离的组织而产生的细胞。原代培养物经常在几个代次内丧失它们的表型和基因型。大部分原代细胞培养物具备有限的寿命，一些衍生自肿瘤的原代细胞培养物例外。
如本文中所用的术语“细胞传代”指将单层或细胞悬液分开(稀释)并随后再分布至含有新鲜培养基的培养容器中。
如本文中所用的术语“汇合度”指细胞在培养基中增殖的一个量度。通常而言，培养物在T型瓶或在平板或平皿中的汇合度基于细胞之间的间隔量。例如，100％汇合度意指培养平板或平皿完全被细胞覆盖并且因而没有用于细胞的生长的更多空间留下；50％汇合度意指培养平皿或平板的大约一半被细胞覆盖并且仍有用于生长的空间。
术语“化疗剂”指用于治疗或控制疾病的化学品。可用于本发明上下文中的化疗剂的非限制性实例包括正定霉素、阿霉素、伊达比星、氨柔比星、吡柔比星、表柔比星、米托蒽醌、依托泊苷、替尼泊苷、长春碱、长春新碱、丝裂霉素C、5-FU、紫杉醇、多烯紫杉醇、放线菌素D、秋水仙碱、拓扑替康、伊立替康、吉西他滨、环孢菌素、维拉帕米、valspodor、丙磺舒、MK571、GF120918、LY335979、比立考达(biricodar)、特非那定、奎尼丁、pervilleine A和XR9576。
术语“认知功能”指引起理解、感知、或者明白个体意识的智力过程，及执行脑力任务如思考、学习、判断、记忆、计算、控制动作功能等的能力。
本文所用的术语“增强认知功能的量”指与未施用过增强认知功能的量的组合物或物质的受治疗者相比，增加、改善或提高受治疗者中精神表现(例如，感知、记忆、判断、推理)的治疗有效剂量(即，施用的剂量和频率)。增强认知功能的量是约0.01mg/kg体重至约100g/kg体重。这个量包括本发明组合物的预防或预防性量。
如本文中所用的短语“原初认知功能水平”指由正常健康受治疗者表现的认知功能。
本文所用的术语“病症”指各种健康状态，并且意指包括由任何潜在机制或紊乱、损害以及对健康组织和器官的促进作用引发的障碍或疾病。
如本文中所用的术语“条件性(conditioned)”指为特定行为、事件或过程而准备；通过学习或经验获得。
如本文中所用的术语“接触”及其多种语法形式指接触或处于直接或局部接近的状态或状况。使组合物与靶目的地(如但不限于器官、组织、细胞或肿瘤)接触可以通过技术人员已知的任何施用手段进行。
如本文中所用的术语“背景”及其多种语法形式指某事件发生的场景或环境。
本文所用的术语“痴呆”指因脑内损伤或疾病引起的超出可能因正常老化所预期的认知功能下降或进行性下降。
如本文中所用的短语“密度依赖性生长抑制”指细胞在达到阈密度时降低的生长应答，其中细胞在汇合时借助所述阈密度识别相邻细胞的边界并且取决于生长模式，在体外通过形成单层应答。通常，这些细胞以降低的速率在整个细胞周期期间转变(生长更慢)。
如本文中所用的术语“分化”指特化较低的细胞借以变成特化较高的细胞类型的过程。
本文所用的术语“疾病”或“障碍”或“功能紊乱”指健康损伤或异常发挥机能的状况。
本文所用的术语“药物”指治疗剂或除食物之外的用于预防、诊断、减轻、治疗或治愈疾病中的任何物质。
如本文中所用的术语“效应物”指与蛋白质结合并因而改变该蛋白质活性的分子。
术语“表位”和“抗原决定簇”在本文中互换地用来指分子上抗原结合位点(ACS)识别并且抗体本身与之结合/附着的位点。在一些实施方案中，表位可以是激酶抑制肽上的抗原决定簇/抗原结合位点。表位可以是一级、二级或三级序列相关的。
如本文中所用的术语“片段”指蛋白质、蛋白质复合体、肽、肽复合体、核酸、抗体或其他物质的分离部分。
本文所用的术语“功能等同物”指具有相似或相同效果或用途的物质、分子、蛋白质、肽或多肽。
如本文中所用的术语“半数最大抑制浓度”(“IC”、“IC50”、“50％IC”)指导致某生物学或生物化学活性50％抑制的量或浓度。IC50是指示需要多少特定药物、药剂或其他物质(抑制剂)以半数抑制给定生物过程或某过程的组分(例如酶、细胞、细胞受体或微生物)的定量性量度。
如本文中所用的术语“孵化”(“融化”或“解冻”)指从冰箱取出细胞或指从冷冻储存物开始培养。
如本文所用的“激素”指由身体器官产生的、通过血液输送以在其他部位激发活动的天然物质或它们的合成类似物。可用在本发明上下文中的合适激素包括但不限于由神经分泌细胞产生的任何激素、包括促性腺激素释放激素(GnRH)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促甲状腺素释放激素(TRH)、催乳素抑制激素(多巴胺)和食欲素(下丘脑分泌素)、以及重组激素，所述重组激素意指通过使用DNA并且将此DNA导入宿主细胞中的方法所产生的激素，其中，所述的DNA经工程化以含有正常地不会一起存在的序列。
如本文中所用的术语“抑制剂”指与酶结合因而降低酶活性的分子。酶抑制剂是与酶结合因而降低酶活性的分子。抑制剂的结合可以阻止底物进入该酶的活性中心和/或妨碍该酶催化其反应。抑制剂结合是可逆的或不可逆的。不可逆性抑制剂通常与酶反应并化学地改变该酶，例如，通过修饰酶促活性所需的关键氨基酸残基。相反，可逆性抑制剂非共价地结合并且产生不同类型的抑制作用，这取决于这些抑制剂是否结合该酶、酶-底物复合物或这二者。酶抑制剂经常由其特异性或效力评价。
本文所用的术语“损伤”指由外部因素或力造成的身体结构或功能的破坏或伤害，它可以是物理或化学的。
本文中所述的组合物含有分离的分子。“分离的分子”是这样的分子，它是基本上纯的并且不含在自然界或体内系统中与该分子一起通常存在的其他物质至就其预期的用途而言可行且适合的程度。特别地，所述组合物足够地纯并且基本上不含宿主细胞的其他生物学组分，从而可用于，例如产生药物制品或测序，如果该组合物是核酸，肽，或多糖的话。由于在药物制品中组合物可以混合药学上可接受的载体，组合物可以仅占该制品的较小重量百分数。虽然如此，组合物是基本上纯的，因为它已经从活的系统中或在合成期间可能相关的物质基本上分离。本文所用的术语“基本上纯的”指如分析方法所测定的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％纯的纯度。此类方法可以包括但不限于，例如FACS、HPLC、凝胶电泳、层析法等等。
本文所用的术语“同工型”指具有与另一个蛋白质相同的功能，但在序列上存在一些小差异的蛋白质形式。
瘦蛋白受体(OB-R)，作为I类细胞因子受体超家族的成员，具有因可变剪接所致的至少6个同工型。OB-R的所有同工型共有相同的胞外配体结合结构域。瘦蛋白的功能受体(OB-Rb)，b同工型，不仅在下丘脑中表达，在下丘脑中它调节能量稳态和神经内分泌功能，而且也在其他脑区并在外周表达，包括所有类型的天然免疫或适应性免疫细胞。全长b同工型(OB-Rb)缺乏固有的酪氨酸激酶活性，并且参与几个下游信号转导途径。
术语“瘦蛋白激动剂”指能够激活瘦蛋白受体和/或下游效应物，以及能够调节受治疗者中的淀粉状肽水平或tau磷酸化的化合物。这类效应物可以包括但不限于，例如AMP依赖性蛋白激酶(“AMPK”)和固醇调节元件结合蛋白(“SREBP”)和GSK-3β。
本文所用的术语“调节”意指调节、改变、适应或调整到某一量度或比例。
如本文中所用的术语“调质分子”或“调质”指变构调节期间与调节位点结合并变构调节蛋白质形状的分子。
如本文中所用的术语“单层”指在培养物中培育的一个细胞厚度的细胞层。
神经原纤维缠结(“NFT”)通常指微管相关蛋白“tau”的聚集物，其中，所述的tau变得过度磷酸化并积聚于细胞自身内部。
短语“非甾体抗炎剂”指一大组作用类似于阿司匹林的药物，包括布洛芬(Advil)
Figure BPA00001391223900331
，萘普生钠(Aleve
Figure BPA00001391223900332
)和对乙酰氨基酚(Tylenol
Figure BPA00001391223900333
)。可用于本发明上下文中的其他非甾体抗炎剂的实例包括但不限于昔康类(oxicams)，例如吡罗昔康、伊索昔康、替诺昔康、舒多昔康和CP-14,304；双水杨酯、扑炎痛、三水杨酸胆碱镁、痛热宁(safapryn)、阿司匹林(solprin)、二氟尼柳和芬度柳；醋酸衍生物，例如双氯芬酸、芬氯酸、吲哚美辛、舒林酸、托美丁、伊索克酸、呋罗芬酸、硫平酸、齐多美辛、阿西美辛、芬替酸、佐美酸、clindanac、奥昔平酸、联苯乙酸和酮咯酸；芬那酸类，例如甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸、尼氟酸和托芬那酸；丙酸衍生物、例如布洛芬、萘普生、苯
Figure BPA00001391223900334
洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、非诺洛芬、芬布芬、吲哚布洛芬、吡洛芬、卡洛芬、奥沙普秦、普拉洛芬、咪洛芬、硫
Figure BPA00001391223900335
洛芬、舒洛芬、阿明洛芬和噻洛芬酸；吡唑类，例如保泰松、羟布宗、非普拉宗、阿扎丙宗和三甲保泰松(trimethazone)。也可以使用这些非甾体抗炎剂的混合物，以及这些药物的皮肤学可用盐和酯类。例如，依托芬那酯，一种氟芬那酸衍生物，特别用于局部应用。
术语“正常的”指大群体的标准物、模型、中位数或平均数。
术语“正常的健康受治疗者”指没有认知障碍的症状或其他临床证据的受治疗者。
术语“肽”在本文中用来指由肽键连接起来的两个或多个氨基酸。
术语“多肽”在其广义上用来指亚基氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的序列。除非指明，亚基由肽键连接。本发明的瘦蛋白多肽或瘦蛋白类似物多肽可以是化学合成或重组表达的。
术语“蛋白质”在本文中用来指由氨基酸组成的庞大复杂分子或多肽。蛋白质中氨基酸的序列由编码该蛋白质的核酸序列中碱基的序列确定。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”也适用于其中的一个或多个氨基酸残基为对应的天然存在氨基酸的人造化学类似物的氨基酸聚合物以及天然存在的氨基酸聚合物。天然存在氨基酸的这些类似物的本质属性是，当添加到蛋白质中时，该蛋白质与针对同一蛋白质所激发的、但完全由天然存在氨基酸组成的抗体特发生异性反应。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”也包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质附着、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。可以认识到，如所熟知的以及如上面所指出的，多肽可以不完全是线性的。例如，多肽可以由于泛素化而分支，并且通常由于翻译后事件而导致它们可以是具有分支或没有分支的环状，所述翻译后事件包括天然加工事件和由不是自然发生的人类操纵引起的事件。环状、分支和具有分支的环状多肽也可以通过非翻译天然过程并通过完全的合成性方法合成。
术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”互换地用来指包含在蛋白质、多肽或肽的氨基酸，包括但不限于天然存在的氨基酸和能够以与天然存在氨基酸相似的方式起作用的天然氨基酸的已知类似物。
在核酸的背景下使用时，术语“变体”、“突变体”和“衍生物”在本文中用来指与参考核苷酸序列具有基本同一性的核苷酸序列。所述序列中的差异可由序列或结构上的自然或设计的变化引起。自然变化可以在自然界中特定核酸序列的正常复制或重复过程中出现。出于特定目的，可以专门设计有计划的变化并引入序列中。可以采用各种诱变技术离体做出这类特定变化。这类专门产生的序列变体可以被称为原始序列的“突变体”或“衍生物”。
本领域的普通技术人员同样能够制备具有一个或者多个氨基酸取代、缺失、添加或置换的多肽变体。这些变体尤其可以包括：(a)其中一个或多个氨基酸残基被保守型或非保守型氨基酸取代的变体；(b)其中添加一个或多个氨基酸的变体；(c)其中至少一个氨基酸包含取代基的变体；(d)其中来自一个物种的氨基酸残基在保守或非保守位置处把另一物种中的相应残基取代的变体；以及(e)其中靶蛋白与另一种肽或多肽例如融合配偶体、蛋白质标记物或可以赋予该靶蛋白有用特性的其他化学部分(例如，抗体表位)融合的变体。用于获得此类变体的技术，包括基因技术(抑制、缺失、突变等)、化学技术和酶技术，是本领域技术人员已知的。如本文所采用的，术语“突变”指在生物体的基因或染色体内DNA序列的变化，其导致在亲代型中不存在的新特征或性状，或指这样的过程，其中这种变化或者通过编码基因的DNA的核苷酸序列中的改变或者通过染色体物理排列的改变而在染色体中发生。三种突变机理包括取代(一个碱基对被另一个交换)、添加(一个或多个碱基插入序列中)和缺失(一个或多个碱基对的丢失)。
术语“取代”在本文中用来指DNA中一个碱基或多个碱基被另外的一个碱基或多个碱基交换。取代可以是同义取代或非同义取代。如本文所用的，“同义取代”指在编码蛋白质的基因的外显子中一个碱基把另一个碱基取代，使得所产生的氨基酸序列未被修改。如本文所用的，“非同义取代”指在编码蛋白质的基因的外显子中一个碱基把另一个碱基取代，使得所产生的氨基酸序列被修改。
术语“缺失”和“缺失突变”在本文中可互换地用来指其中一个碱基或多个碱基从DAN丧失的情形。
在核酸序列的背景下使用时，本文所用的术语“添加”指将一个或多个碱基，或一个或多个氨基酸插入到序列中。
以下内容表示保守性取代另一种的氨基酸的组：
1)丙氨酸(A、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；以及
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
术语“相似的”可以与术语“类似的”、“可比较的”或“比拟的”互换使用，意指具有共同的性状或特征。
在一些实施方案中，本发明的瘦蛋白或瘦蛋白类似物为化学合成。用公知的固相技术、液相技术或肽缩合技术或其任意组合制备的这种合成多肽可以包括天然和非天然氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以是标准Boc(N-α-氨基受保护的N-α-t-丁氧基羰基)氨基酸树脂，利用Merrifield的原始固相法的标准脱保护、中和、偶联和洗涤方案(1963，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154)，或可以是最先由Carpino和Han描述的碱基不稳定性N-α-氨基受保护的9-芴甲氧羰基(Fmoc)氨基酸(1972，J.Org.Chem.37：3403-3409)。Fmoc和Boc N-α-氨基受保护的氨基酸都可以从Sigma，Cambridge Research Biochemical，或本领域技术人员熟悉的其他化学公司获得。此外，瘦蛋白或瘦蛋白多肽可以用本领域技术人员所熟悉的其他N-α-保护基团合成。
固相肽合成可以通过本领域技术人员所熟知的技术完成，例如在Stewart和Young，1984，Solid Phase Synthesis，第2版，Pierce ChemicalCo.，Rockford，I11.；Fields and Noble，1990，Int.J.Pept.Protein Res.35：161-214中提供的技术，或使用自动合成器实现。
术语“肽模拟物”指设计用于模拟或模仿肽的小蛋白质样链。肽模拟物可以包含能够模拟(意为模仿)或拮抗(意为中和或抵消)天然亲本肽的生物学作用的非肽结构元件。术语“瘦蛋白肽模拟物”、“瘦蛋白模拟物”和“瘦蛋白模仿物”在本文中可互换地用于指包含产生生物学效应的瘦蛋白功能域的瘦蛋白衍生物。在化学领域，衍生物是指至少理论上可以由前体化合物形成的化合物。这些衍生物可以与另一个分子组合以产生或增强生物学效应。生物学效应可以包括但不限于，例如，调节受治疗者中的淀粉状肽水平；调节受治疗者中的tau磷酸化水平；降低受治疗者中的淀粉状肽水平；降低受治疗者中的tau磷酸化水平等。如本文中所用的术语“瘦蛋白类似物”指与野生型瘦蛋白蛋白具有相似结构或功能的化合物或物质。例如，与瘦蛋白受体结合、激活瘦蛋白信号传导级联、减少Aβ产生、增加Aβ的摄取或减少tau磷酸化的瘦蛋白衍生物、瘦蛋白模拟物、瘦蛋白激动剂、其药学上可接受的盐或其功能性等同物符合瘦蛋白类似物的要件。
本文所用的术语“调节磷酸化tau积聚的量”指调节tau蛋白磷酸化的瘦蛋白组合物的治疗有效量。调节磷酸化tau积聚的量包括本发明组合物的预防或预防性量。
如本文中所用的术语“铺板”指将细胞等分至培养基中或培养基上的方法。
如本文中所用的术语“效力”指功效、有效性、强度或，一般是解离常数，其表示抑制某酶所需要的浓度。
如本文中所用的术语“重组蛋白”指通过基因工程产生的蛋白质。
如本文中所用的术语“降低”及其多种语法形式指在产生某障碍的风险下限制个体出现该障碍。
本文所用的术语“复原”指在生病、病症、疾病、综合征或障碍之后或期间返回最初形态、位置或功能的能力。
如本文中所用的术语“溶液”指两种或多种物质的均一的分子混合物，所述物质可以是固体、液体、气体或其组合。
如本文中所用的术语“特异性”指一种物质对另一种物质的选择性附着或影响。
如本文中所用的术语“分裂”或“传代”指细胞的继代培养或传代。
如本文中所用的术语“稳定细胞系”指其中异源DNA已经整合入宿主基因组并且被维持经过许多代的细胞。
如本文中所用的术语“悬浮培养物”指不要求贴附至基底以生长即不依赖贴壁的细胞。一般悬浮培育从血液衍生的细胞培养物。悬浮培养物中的细胞可以生长为单个细胞或团块。生长为单个细胞的细胞可以通过稀释所述细胞继代培养。然而，对于生长为团块的细胞，在继代培养该培养物之前，首先必须使团块分散。
如本文所用的“甾体抗炎剂”指含有17-碳-4-环系统的多种化合物中任一种化合物，包括固醇、各种激素(例如促蛋白合成类固醇)和糖苷。甾体抗炎剂代表性的例子包括但不限于皮质类固醇，例如氢化可的松、羟基曲安西龙(hydroxyltriamcinolone)、α甲基地塞米松、地塞米松磷酸盐、二丙酸倍氯米松、戊酸氯倍他索(clobetasolvalerate)、地奈德、去羟米松、醋酸去氧皮质酮、地塞米松、醋酸双氟拉松、双氟可龙戊酸酯、氟氢缩松(fluadrenolone)、氟氯奈德(fluclorolone acetonide)、氟氢可的松、双氟美松叔戊酸酯(flumethasone pivalate)、氟轻松(fluosinolone acetonide)、肤轻松、氟可丁酯(flucortine butylester)、氟可龙、醋酸氟泼尼定(fluprednylidene)、氟氢缩松(flurandrenolone)、哈西奈德、醋酸氢化可的松、丁酸氢化可的松、甲泼尼龙(methylprednisolone)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、可的松、可托多松(cortodoxone)、flucetonide、氟雄诺龙(fluradrenolone)、氟可的素(fludrocortisone)、丙酮化氟雄诺龙(fluradrenolone acetonide)、甲羟松、安西缩松(amcinafel)、安西非特(amcinafide)、倍他米松及其酯的平衡、氯泼尼松、醋酸氯泼尼松、氯可特龙(clocortelone)、clescinolone、二氯松(dichlorisone)、二氟泼尼酯(diflurprednate)、氟氯奈德、氟尼缩松、氟米龙、氟培龙、氟泼尼龙、戊酸氢化可的松、环戊丙酸氢化可的松、氢可他酯、甲泼尼松、帕拉米松、氢化波尼松、强的松、二丙酸倍氯米松、曲安西龙、以及它们的混合物。
术语“受治疗者”或“个体”或“患者”可互换地用来指哺乳动物类动物物种的成员，其中，所述哺乳动物类动物物种包括人类。
如本文所用的短语“患有与积聚的神经原纤维缠结相关的进行性认知疾病的受治疗者”指显现与进行性认知疾病相关的诊断性标记物和/或症状的受治疗者，其中，所述的进行性认知疾病与积聚的神经原纤维缠结有关。短语“与积聚的NFT相关的进行性认知疾病”指因NFT异常积聚引起或作为NFT异常积聚后果的疾病。与NFT积聚相关的进行性认知疾病包括但不限于，进行性核上麻痹；痴呆；拳击员痴呆；AD；克-雅病；额颞痴呆；皮克病；其他tau-阳性病理，包括伴有帕金森综合征-17(FTDP-17)皮质基底节变性的额颞叶痴呆；额颞叶变性(FTLD)和缺少突出组织学的痴呆。
短语“有需要的受治疗者”是指患有或者有患上与积聚的NFT相关的进行性认知疾病的患者。基于存在特征性神经学和神经心理学特征以及不存在可替代状况，通常从患者病史、间接的亲属病史和临床观察结果在临床上诊断与积聚的神经原纤维缠结相关的进行性认知疾病。这些标准要求认知损伤和疑似痴呆综合征的存在应当通过神经心理学试验证实。先进计算机断层成像(CT)医学影像术或核磁共振成像术(MRI)，和单光子发射计算机断层成像术(SPECT)或正电子发射断层成像术(PET)可以用来帮助排除其他脑病理或痴呆亚型。包括记忆力测试在内的智力机能评价能够进一步表征该疾病的状态。对于确定性诊断，可能要求包括显微镜检查脑组织在内的组织病理证实。对于AD，8个认知区域最常见地受损：记忆、语言、知觉技能、注意力、构筑能力、定向力、解决问题的能力和功能性能力。这些区域相当于美国精神病学会出版的《精神疾病诊断与统计手册》(Diagnostic andStatistical Manual of Mental Disorders)(DSM-IV-TR)中列出的NINCDS-ADRDA阿尔茨海默病的标准(其通过引用的方式完整地并入本文)。
本文所用的术语“综合征”指显示某种疾病或病症的症状模式。
本文所用的术语“治疗剂”指提供治疗效果的药物、分子、核酸、蛋白质、组合物或其他物质。本文所用的术语“有活性的”指本发明组合物中起预期治疗效果的成分、组分或组成。术语“治疗剂”和“活性物质”在本文可互换地使用。活性物质可以是治疗有效量的瘦蛋白、瘦蛋白模拟物、瘦蛋白衍生物、瘦蛋白片段、瘦蛋白类似物或瘦蛋白激动剂或者其药学上可接受的盐中的至少一种。
本文所用的术语“治疗组分”指消除、减少或预防一定百分比的群体中某种具体疾病表现进展的治疗有效剂量(即，施用剂量和频率)。常用治疗组分的一个实例是ED50，它描述对50％的群体中特定疾病表现是治疗有效的具体剂量。
本文所用的术语“治疗效果”指判断其结果是期望且有益的治疗的后果。治疗效果可以直接或间接地包括阻止、减少或消除疾病表现。治疗效果也可以直接或间接地包括阻止、减少或消除疾病表现的进展。
术语一种或多种活性物质的“治疗有效量”、“有效量”或“药学有效量”可互换地用来指足以提供预期治疗益处的量。根据本发明可以采用的活性物质的有效量通常范围从一般约0.01mg/kg体重至约100g/kg体重。然而，剂量水平取决于多种因素，包括损伤类型、年龄、体重、性别、患者的医学状况、病症的严重性、施用途径以及所用的具体活性物质。因此，用药方案可以大幅度变动，但是可以由医师通过标准方法常规地决定。另外，术语“治疗有效量”和“药学有效量”包括本发明组合物的预防或预防性量。在本发明的预防或预防性应用中，将药物组合物或药物以足够消除或降低疾病、障碍或病症的风险、减轻其严重性、或延迟其发作的量施用到易于患上或者否则有风险患上由淀粉状肽积聚、NFT积聚或tau过度磷酸化中的至少之一引起的疾病、障碍或病症的患者，其中，所述的疾病、障碍或病症包括该疾病、障碍或病症的生物化学、组织学和/或行为综合征及其并发症，以及在该疾病、障碍或病症发展期间显现的过渡型病理表型。
术语“治疗”或“治疗中”包括消除、基本上抑制、延缓或逆转疾病、病症或障碍的进展、基本上改善病症的临床或美学症状、基本上防止疾病、病症或障碍的临床或美学症状显现并且保护免遭有害或困扰的症状。治疗进一步指实现以下之一或者更多种情形：(a)降低障碍的严重性；(b)限制治疗中的障碍的特征性症状的发展；(c)限制治疗中的障碍的特征性症状的恶化；(d)限制患者曾患的障碍的复发；以及e)限制患者先前曾有的障碍症状的复发。
如本文中所用的术语“瞬时转染”指将外来DNA导入细胞以允许该DNA在宿主细胞中表达，而DNA不整合到基因组中。可获得诸多方案用于在细胞膜中打开允许质粒或siRNA进入细胞的临时“孔洞”。能够被转染的细胞称作“感受态细胞”。
如本文中所用的“维生素”指对大部分动物的营养而言在微小量下必需的多种有机物质中的任一种有机物，它尤其作为调节新陈代谢过程中的辅酶和辅酶前体发挥作用。可用于本发明上下文中的维生素的非限制性实例包括维生素A及其类似物和衍生物：视黄醇、视黄醛、棕榈酸视黄酯、视黄酸、维A酸、异维A酸(通称为类视黄醇)、维生素E(生育酚及其衍生物)、维生素C(L-抗坏血酸及其酯和其他衍生物)、维生素B3(烟酰胺及其衍生物)、α羟基酸(例如乙醇酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸等)和β羟基酸(例如水杨酸等)。
本公开提供用于进行性认知障碍的组合物和临床治疗方法与诊断方法。
(1).用于治疗进行性认知障碍的方法
根据一个方面，所述发明提供用于治疗进行性认知障碍的方法，该方法包括步骤：
(a)提供治疗有效量的瘦蛋白组合物，其中该瘦蛋白组合物包含：
(i)作为第一治疗剂的瘦蛋白或瘦蛋白类似物；
(ii)任选地，第二治疗剂；和
(iii)药学上可接受的载体；
(b)施用步骤(a)的组合物至有需要的受治疗者；以及
(c)减少或防止进行性认知障碍的至少一种病理进展。
根据一些实施方案，所述进行性认知障碍包含但不限于，进行性核上麻痹；痴呆；拳击员痴呆；克-雅病；额颞痴呆；皮克病；其他tau-阳性病理，包括FTDP-17皮质基底节变；额颞叶变性(FTLD)或缺少突出组织学的痴呆。
根据一些此类实施方案，该病理是神经原纤维缠结。
根据一些实施方案，所述进行性认知障碍是阿尔茨海默病(AD)。
根据一些此类实施方案，AD的病理包含APP、早老蛋白1(PS1)或早老蛋白2(PS2)基因中的错义突变。
根据另一种实施方案，AD的病理包含Aβ42的改变的蛋白酶解。
根据另一种实施方案，AD的病理包含Aβ42在脑间质液中的进行性积聚和聚集。
根据另一种实施方案，AD的病理包含积聚的Aβ42沉积为弥散蛋白斑。根据一些此类实施方案，该沉积物进一步包含蛋白聚糖和其他促进淀粉状蛋白的底物。
根据另一种实施方案，AD的病理包含Aβ40积聚到弥散Aβ42蛋白斑上和某些蛋白斑相关蛋白的累积。
根据另一种实施方案，AD的病理包含炎症反应。炎症反应包括但不限于小胶质细胞活化和细胞因子释放，以及星形细胞增生与急性期蛋白释放。
根据另一种实施方案，AD的病理包含淀粉状蛋白斑内部和神经毡中其他处的进行性神经炎损伤。
根据另一种实施方案，AD的病理包含神经元代谢与离子稳态的扰乱。根据另一种实施方案，AD的病理包含氧化性损伤。
根据另一种实施方案，AD的病理包含改变的激酶/磷酸酶活性，其导致过度磷酸化的tau，后者导致PHF形成。
根据另一种实施方案，AD的病理包含海马和大脑皮质中广泛的神经元/神经炎功能紊乱和死亡，伴有进行性神经递质缺乏。
根据另一种实施方案，AD的病理包含痴呆。
根据另一种实施方案，AD的病理涉及皮层区。根据一些此类实施方案，该病理是神经炎营养不良。根据一些此类实施方案，该病理是突触丧失。根据一些此类实施方案，该病理是神经元核周体皱缩。根据一些此类实施方案，该病理是选择性神经元丧失。
根据一种实施方案，瘦蛋白或其瘦蛋白类似物是瘦蛋白片段、有治疗活性的瘦蛋白片段、瘦蛋白模仿物或瘦蛋白模拟物或瘦蛋白衍生物中的至少一种。根据一些此类实施方案，所述瘦蛋白组合物包含包含瘦蛋白模拟物或其药学上可接受的盐。根据一些此类实施方案，所述瘦蛋白组合物包含瘦蛋白衍生物或其药学上可接受的盐。根据一些此类实施方案，瘦蛋白衍生物是瘦蛋白肽或瘦蛋白肽片段。根据一些此类实施方案，瘦蛋白肽或瘦蛋白肽片段是有治疗活性的。
根据另一种实施方案，瘦蛋白或其瘦蛋白类似物是瘦蛋白或瘦蛋白类似物的药学上可接受的盐。
根据另一种实施方案，每日施用瘦蛋白组合物。根据另一种实施方案，每周施用瘦蛋白组合物。根据另一种实施方案，每月施用瘦蛋白组合物。
根据另一种实施方案，本发明提供用于以不间断循环的治疗有效量的瘦蛋白组合物治疗受治疗者中阿尔茨海默病的方法。如本文中所用的术语“不间断“意指反复施用瘦蛋白剂量至受治疗者持续至少2个循环、4个循环、12个循环、24个循环和/或52个循环或更多循环，其中循环的周期性是恒定的，并且其中一个循环的最末给药和下一个循环的最初给药之间的最大持续时间不超过21日、14日、7日和/或1日。在该定义内，短语“循环的周期性是恒定的”意指相应的连续给药之间的持续时间是恒定至12小时范围内的。例如，如果该周期性指明为7日(即，168小时)，则根据本发明，短语“循环的周期性是恒定的”将解释为意指连续循环中相应给药之间的持续时间可以是从162小时至174小时。在一些实施方案中，每个循环中瘦蛋白组合物给药的次数可以是从1至5次，并且每个独立的给药可以包括服用一个或多个独特剂型。在一些实施方案中，每个循环中瘦蛋白组合物给药的次数可以是从1至6次，并且每个独立的给药可以包括服用一个或多个独特剂型。
根据另一种实施方案，周期性是每日(即，一日)。根据另一种实施方案，治疗有效量的瘦蛋白组合物以单个循环施用。根据一些此类实施方案，该循环中的给药次数是1次。
根据另一种实施方案，将1个剂量的瘦蛋白组合物每隔6日施用至受治疗者延续至少2个循环(即，每月两次)。根据另一种实施方案，将1个剂量的瘦蛋白组合物每隔6日施用至受治疗者延续至少4个循环(即，每月一次)。根据另一种实施方案，将1个剂量的瘦蛋白组合物每隔6日施用至受治疗者延续至少52个循环(即，一年)。在这种情况下，每个循环的给药次数仅是单次给药，周期性是7日，并且一个循环的最末给药和下一个循环的最初给药之间的最大持续时间是6日。在另一种实施方案中，例如，1个剂量的瘦蛋白组合物在周一施用并且1个剂量的瘦蛋白组合物在周二施用，延续至少52个循环。在这种情况下，每个循环的给药次数是2，周期性是7日，并且一个循环的最末给药和下一个循环的最初给药之间的最大持续时间是5日(即周三至周日)。在另一种实施方案中，例如，通过服用具有每个剂量的两个片剂，在该周的某特定日，在早晨施用1个剂量的瘦蛋白组合物并且在晚上施用另一剂量的瘦蛋白组合物，该循环随后重复至少52个循环。在这种情况下，每个循环的给药次数是2，其中每次给药包括服用2种剂型；周期性是7日，并且一个循环的最末给药和下一个循环的最初给药之间的最大持续时间是6日(即，给予所述剂量的周的日之间的日数)。可以理解其他方案也在本发明实施方案的范围内。例如，在一种实施方案中，1个剂量的瘦蛋白组合物在周一施用并且1个剂量的瘦蛋白组合物在周三施用，延续至少52个循环。在这种情况下，每个循环的给药次数是2，周期性是7日，并且一个循环的最末给药和下一个循环的最初给药之间的最大持续时间是4日(即周四至周日)。在另一种实施方案中，周期性是每周(即7日)。
在一些实施方案中，本发明的组合物可以与其他治疗剂组合并局部地施用。在一些此类实施方案中，本发明的组合物和其他治疗剂同时施用。当同时施用其他治疗剂时，它们可以在相同或者独立的制剂中施用，但是在相同的时间施用。在一些此类实施方案中，本发明的组合物和其他治疗剂依次施用。当其他治疗剂和抑制剂的施用在时间上分隔时，其他治疗剂彼此且与本发明的组合物依次地施用。这些药物施用之间在时间上的间隔可以是数分钟或可以更长。
根据一些方面，该瘦蛋白组合物进一步包括至少一种第二治疗剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是激酶抑制剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是抗生素剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是抗真菌剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是抗病毒剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是抗原虫剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是甾体抗炎剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是非甾体抗炎剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是抗氧化剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是激素。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是维生素。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是抗组胺剂。根据一些此类实施方案，所述第二治疗剂是化疗剂。
根据一些实施方案，该瘦蛋白组合物包含：
(a)作为第一治疗剂的瘦蛋白或其瘦蛋白类似物；
(b)任选的包含至少一种激酶抑制剂的第二治疗剂，其中，所述的至少一种激酶抑制剂以抑制激酶的量存在，和
(c)载体；
因而该组合物以大于组分(a)、(b)和(c)总和的水平提供激酶抑制作用。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是选自由钙/钙调蛋白-依赖性蛋白激酶II、蛋白激酶A和GSK-3β所组成的组中的激酶抑制剂。
根据一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是选自由钙/钙调蛋白-依赖性蛋白激酶II(CAMK2A，Myr-AIP)的抑制剂。钙信号传导对谷氨酸能突触处可塑性的几个方面是重要的。钙/钙调蛋白依赖性激酶II是属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族并属于钙/钙调蛋白-依赖性蛋白质亚家族的激酶。该酶由4条不同链α、β、Δ和γ组成。α链是海马长时程增强效应和空间学习所要求的。除其钙-钙调蛋白(CaM)依赖活性之外，钙/钙调蛋白依赖性激酶II还可以发生自身磷酸化，从而产生CaM非依赖活性。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是蛋白激酶A的激酶抑制剂。蛋白激酶A(PKA，cAMP-依赖性蛋白激酶)指其活性依赖性于细胞中环腺苷一磷酸(cAMP)水平的酶家族。PKA在细胞中具有几项功能，包括调节糖原、糖和脂质代谢。每种PKA是由2个调节亚基和2个催化亚基组成的全酶。在低水平cAMP的情况下，全酶仍保持完整并且无催化活性。当cAMP的浓度增加时，cAMP与调节亚基的两个结合位点结合，这导致催化亚基的释放。游离的催化亚基随后可以催化ATP末端磷酸盐转移至蛋白质底物的丝氨酸或苏氨酸残基处。这种磷酸化通常导致底物的活性变化。PKA活性的效应随细胞类型变动。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)的激酶抑制剂。GSK-3β的功能未得到完全理解。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂选自由Myr-AIP、LiCl和KT5720所组成的组。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是激酶抑制剂氯化锂(LiCl)。氯化锂通过增加抑制性Ser9残基的磷酸化消弱GSK-3β活性(IC50＝5mM)。根据一些此类实施方案，LiCl浓度是从约1mmol/L至约5×10-2mol/L。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是激酶抑制剂6-溴靛玉红-3’-肟(BIO)。激酶抑制剂6-溴靛玉红-3’-肟((2’Z，3’E)-6-溴靛玉红-3’-肟)是一种有力、可逆性和ATP竞争性GSK-3β抑制剂，并且是被证实维持人胚干细胞和小鼠胚干细胞自我更新的首个药理学物质。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是激酶抑制剂KT5720。KT5720是K525a的细胞可透性半合成性衍生物。它是cAMP-依赖性蛋白激酶(PKA；IC50＝56nM)的选择性抑制剂，但是对蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶G(PKG)或肌球蛋白轻链激酶(MLCK)没有明显作用。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是选自由K252a、星形孢菌素、KT5252b和白屈菜赤碱所组成的组中的激酶抑制剂。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是激酶抑制剂K252a。K252a是从土壤真菌拟诺卡氏菌(Nocardiopisis sp.)分离的生物碱。这种ATP类似物是一种CaM激酶和磷酸化酶激酶的高度有效力的细胞可透性抑制剂(IC50分别是1.8和1.7nM)。在较高浓度上，它也是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的高效抑制剂(IC50＝10至30nM)。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是激酶抑制剂K252b。K252b是从土壤真菌拟诺卡氏菌(Nocardiopisis sp.)分离的生物碱。它是细胞可透性蛋白激酶抑制剂K252a的效力较低的衍生物。该化合物通过未知机制强化某些神经元中的神经营养蛋白-3活性。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是激酶抑制剂星形孢菌素。星形孢菌素是由链霉菌星形孢子产生的真菌生物碱K252a家族的成员。它是最为有力的细胞可透性蛋白激酶抑制剂之一(IC50＝0.7-20nM)。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是激酶抑制剂白屈菜赤碱。白屈菜赤碱是有力的细胞可透性蛋白激酶C抑制剂IC50＝660nM)，其与PKC的催化结构域结合。白屈菜赤碱对PKC的选择性比对其他激酶高至少100倍。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是激酶抑制剂SB216763。SB216763(3-(2，4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3基)-1H-吡咯-2，5-二酮)是抑制GSK-3β活性的可渗透的结构上独特的马来酰亚胺。GSK-3β的这种有力且选择性抑制剂(IC50＝34nM)刺激人肝脏细胞中的糖原合成并且模拟胰岛素的其他作用。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是激酶抑制剂TDZD-8(4-苄基-2-甲基-1，2，4-噻二唑烷-3，5-二酮-8)。TDZD-8是GSK-3β的选择性抑制剂，一种噻二唑烷酮衍生物，GSK-3β的非ATP竞争性抑制剂(IC50＝2μM)。它在100μM不抑制Cdk-1/细胞周期蛋白B、CKII、PKA或PKC。根据一些此类实施方案，TDZD的浓度是约2×10-5mol/L。
根据另一种实施方案，瘦蛋白组合物的治疗有效量是从约0.0001g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约100g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.0005g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约100g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.001g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约100g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.002g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约95g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.003g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约95g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.004g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约95g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.005g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约95g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.006g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约95g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.007g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约95g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.008g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约95g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.009g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约95g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约95g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约90g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约85g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约80g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约75g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约70g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约65g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约60g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约55g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约50g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约45g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约40g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约35g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约30g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约25g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约20g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约15g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约10g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约5g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约4g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约3g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约2g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约1g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约500g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约250g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，该治疗有效量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约100g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。
(2).用于改善认知功能复原的方法
根据另一个方面，所述发明提供了用于改善有需要的受治疗者中认知功能复原的方法，该方法包括步骤：
(a)施用瘦蛋白组合物至该受治疗者，所述的瘦蛋白组合物包含：
(i)作为第一治疗剂的增强认知功能的量的瘦蛋白或瘦蛋白类似物；
(ii)任选地，至少一种任选第二治疗剂；和
(iii)药学上可接受的载体；以及
(b)改善受治疗者中认知功能的复原。
根据另一种实施方案，瘦蛋白或瘦蛋白类似物包含瘦蛋白、有治疗活性的瘦蛋白片段、瘦蛋白模拟物、瘦蛋白衍生物或其药学上可接受的盐。
根据一些方面，该瘦蛋白组合物进一步包括至少一种任选第二治疗剂。根据一些此类实施方案，所述的任选第二治疗剂是激酶抑制剂。根据另一种实施方案，所述的任选第二治疗剂是抗生素。根据另一种实施方案，所述的任选第二治疗剂是抗真菌剂。根据另一种实施方案，所述的任选第二治疗剂是抗病毒剂。根据另一种实施方案，所述的任选第二治疗剂是抗原虫剂。根据另一种实施方案，所述的任选第二治疗剂是甾体抗炎剂。根据另一种实施方案，所述的任选第二治疗剂是非甾体抗炎剂。根据另一种实施方案，所述的任选第二治疗剂是抗氧化剂。根据另一种实施方案，所述的任选第二治疗剂是激素。根据另一种实施方案，所述的任选第二治疗剂是维生素。根据另一种实施方案，所述的任选第二治疗剂是抗组胺剂。根据另一种实施方案，所述的任选第二治疗剂是化疗剂。
根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.0001g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约100g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.0005g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约100g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.001g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约100g/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.002g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约100g/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.003g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约100g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.004g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约100g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.005g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约100g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.006g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约100g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.007g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约100g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.008g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约100g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.009g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约100g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约95g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约90g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约85g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约80g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约75g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约70g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约65g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约60g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约55g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约50g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约45g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约40g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约35g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约30g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约25g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约20g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约15g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约10g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约5g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约4g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约3g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约2g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约1g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约500g/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g/kg体重至约250g/kg体重。根据另一种实施方案，增强认知功能的量是从约0.01g瘦蛋白或瘦蛋白类似物/kg体重至约100g/kg体重。[000238]根据另一种实施方案，每日施用增强认知功能的量的瘦蛋白组合物。根据另一种实施方案，每周施用增强认知功能的量的瘦蛋白组合物。根据另一种实施方案，每月施用增强认知功能的量的瘦蛋白组合物。
根据另一种实施方案，增强认知功能的量的瘦蛋白组合物增强认知功能，其中，所述认知功能是记忆。根据一些实施方案，增强认知功能的量的瘦蛋白组合物增强认知功能，其中，所述认知功能是条件性记忆。根据一些实施方案，增强认知功能的量的瘦蛋白组合物增强认知功能，其中，所述认知功能是情境记忆。
根据另一种实施方案，增强认知功能的量的瘦蛋白组合物增强认知功能，其中，所述认知功能是学习。根据一些实施方案，增强认知功能的量的瘦蛋白组合物增强认知功能，其中，所述认知功能是情境学习。根据一些实施方案，增强认知功能的量的瘦蛋白组合物增强认知功能，其中，所述认知功能是条件性学习。
根据另一种实施方案，增强认知功能的量的瘦蛋白组合物增强认知功能，其中，所述认知功能是记忆保持。
根据一些实施方案，改善认知功能至其初始认知功能水平是至少约10％的初始认知功能水平。根据一些实施方案，改善认知功能至其初始认知功能水平是至少约25％的初始认知功能水平。根据一些实施方案，改善认知功能至其初始认知功能水平是约50％的初始认知功能水平。根据一些实施方案，改善认知功能至其初始认知功能水平是至少约75％的初始认知功能水平。
(1).用于减少Tau磷酸化的组合物
根据本发明的另一个方面，用于减少Tau磷酸化的本发明组合物包含：
(a)瘦蛋白或瘦蛋白类似物；
(b)任选的包含至少一种激酶抑制剂的第二治疗剂，其中，所述的至少一种激酶抑制剂以抑制激酶的量存在；和
(c)载体；
因而该组合物以大于组分(a)、(b)和(c)总和的水平提供对至少一种激酶的抑制作用。
根据一种实施方案，瘦蛋白或其瘦蛋白类似物是瘦蛋白、有治疗活性的瘦蛋白片段、瘦蛋白模仿物或瘦蛋白模拟物或瘦蛋白衍生物中至少之一。根据一些此类实施方案，所述的瘦蛋白衍生物是瘦蛋白肽或瘦蛋白肽片段。
根据另一种实施方案，瘦蛋白或其瘦蛋白类似物是瘦蛋白或瘦蛋白类似物的药学上可接受的盐。
根据一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是选自由钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II激酶抑制剂、蛋白激酶A激酶抑制剂和GSK-3β激酶抑制剂所组成的组中的至少一种激酶抑制剂。
根据一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是钙/钙调蛋白-依赖性蛋白激酶II(CAMK2A；Myr-AIP)的抑制剂。根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是蛋白激酶A(PKA，cAMP-依赖性蛋白激酶)的激酶抑制剂。根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是GSK-3β的激酶抑制剂。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是选自由Myr-AIP、LiCl和KT5720所组成的组中的至少一种激酶抑制剂。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是激酶抑制剂氯化锂(LiCl)。氯化锂通过增加抑制性Ser9残基的磷酸化消弱GSK-3β活性(IC50＝5mM)。根据一些此类实施方案，LiCl浓度是从约1mmol/L至约5×10-2mol/L。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是激酶抑制剂6-溴靛玉红-3’-肟((2’Z，3’E)-6-溴靛玉红-3’-肟)(BIO)，一种有力、可逆性和ATP竞争性GSK-3β抑制剂。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是激酶抑制剂KT5720，其是K525a的细胞可透性半合成性衍生物和cAMP-依赖性蛋白激酶(PKA；IC50＝56nM)的选择性抑制剂。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是选自由K252a、星形孢菌素、KT5252b和白屈菜赤碱所组成的组中的激酶抑制剂。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是激酶抑制剂K252a，其是ATP类似物和CaM激酶和磷酸化酶激酶的高度有力的细胞可透性抑制剂(IC50分别是1.8nM和1.7nM)，并且在较高浓度上也是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的高效抑制剂(IC50＝10nM至30nM)。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是通过未知机制强化某些神经元中神经营养蛋白-3活性的激酶抑制剂K252b，其是从土壤真菌拟诺卡氏菌分离的生物碱，并且是细胞可透性蛋白激酶抑制剂K252a的效力较低的衍生物。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是激酶抑制剂星形孢菌素，一种细胞可透性蛋白激酶抑制剂(IC50＝0.7nM至20nM)。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是激酶抑制剂白屈菜赤碱，一种与PKC的催化结构域结合的有力的细胞可透性蛋白激酶C抑制剂IC50＝660nM)。根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是激酶抑制剂SB216763(3-(2，4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3基)-1H-吡咯-2，5-二酮)，一种可渗透的结构上独特的马来酰亚胺，它选择性抑制GSK-3β活性(IC50＝34nM)、刺激人肝脏细胞中糖原合成并且模拟胰岛素的其他作用。
根据另一种实施方案，所述的至少一种激酶抑制剂是激酶抑制剂TDZD-8(4-苄基-2-甲基-1，2，4-噻二唑烷-3，5-二酮-8)，它是GSK-3β的选择性、非ATP竞争性抑制剂(IC50＝2μM)，其在100μM不抑制Cdk-1/细胞周期蛋白B、CKII、PKA或PKC。根据一些此类实施方案，TDZD的浓度是约2×10-5mol/L。
根据另一种实施方案，所述的载体是药物载体。
组合物
本文中所述的组合物以治疗有效量递送。结合本文提供的教导，通过在各种活性化合物中选择并权衡多种因素如效力、相对生物利用度、患者体重、不利副作用的严重性和优选施用方式，可以设计出不会引起相当大毒性但仍对治疗特定受治疗者有效的预防性或治疗性处理方案。任何特定应用的有效量可以根据如治疗中的疾病或病症、正在施用的具体有治疗活性的瘦蛋白或瘦蛋白类似物和任选第二治疗剂、受治疗者体格大小或者疾病或病症的严重性等因素而变动。本领域的普通技术人员可以经验性地确定具体瘦蛋白组合物和/或其他治疗剂的有效量，而无须过度实验。通常优选应当使用最大剂量，也就是根据一些医学判断的最高安全剂量。“剂量(dose)”和“剂量(dosage)”在本文中可互换地使用。
对于本文中所描述的任何化合物，治疗有效量最初可以从初步体外研究和/或动物模型确定。对于已经在人体中测试过的有治疗活性的瘦蛋白或瘦蛋白类似物和任选第二治疗剂，以及对于已知表现出类似药学活性的化合物，例如其他有关活性物质，治疗有效剂量也可以从人体数据确定。应用剂量可以基于所施用的化合物或组合物的相对生物利用度和效力调整。基于上述方法和本领域公知的其他方法将剂量调整到最大功效完全在本领域普通技术人员能力之内。
包含瘦蛋白或瘦蛋白类似物和任选第二治疗剂的瘦蛋白组合物的制剂可以在药学上可接受溶液中施用，其可以常规地含有药学上可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体、辅料和任选的其他治疗成分。
对于治疗用途，有效量的包含瘦蛋白或瘦蛋白类似物和任选第二治疗剂的瘦蛋白组合物可以通过将瘦蛋白组合物递送到所期望表面的任何方式施用至受治疗者。可以采用本领域技术人员已知的任何手段实现药物组合物施用。施用途径包括但不限于鞘内、动脉内、肠胃外(例如，静脉内)或肌内、经口、经颊、经鼻、直肠、或局部施用。
所述抑制剂和其他治疗剂可以在治疗因NFT或Aβ的积聚引起的基础病症或病理症状的手术期间递送至受治疗者。
口服组合物
本发明的组合物可以是适合于口服的形式，例如，片剂、糖锭剂、锭剂、水性或油性混悬剂、可分散性散剂或颗粒剂、乳剂、硬胶囊或软胶囊或糖浆或酏剂。如本文所用，术语“经口“或“经口地”指经口腔引入体内，由此吸收在身体的如下一个或多个区域发生：口腔、胃部、小肠、肺(也明确称为吸入)和舌下的小血管(也明确称作舌下施用)。意图口服使用的组合物可以根据任何已知的方法制备，这类组合物可以含有选自由甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂所组成的组中的一种或多种物质，以提供药学上美观且可口的制品。片剂可以含有与适于片剂制造的无毒药学上可接受赋形剂掺合的有效成分。这些赋形剂可以例如是惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如，淀粉、明胶或阿位伯胶树；以及润滑剂，例如，硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的或可以采用已知方法包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，并因此在较长的时间段内提供持续的作用。例如，可以使用如单硬脂酸甘油酯或双硬脂酸甘油酯等时延材料。也可以将它们包衣用于受控释放。
本发明的组合物也可以制成口服硬明胶胶囊，其中有效成分与惰性固体稀释剂(例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或软质明胶胶囊，其中有效成分与水或油类介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
本发明的组合物可以配制为水性混悬剂，其中有效成分与适于制造水性混悬剂的赋形剂掺合。这类赋形剂是悬浮剂，例如，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂，例如，卵磷脂或烯化氧与脂肪酸的缩合产物，例如，聚氧乙烯硬脂酸酯，或者环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物，例如，十七乙基-十六烷氧烯醇(heptadecaethyl-eneoxycetanol)，或者环氧乙烷与从脂肪酸和己糖醇获得的偏酯的缩合产物，例如，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或者环氧乙烷与从脂肪酸和己糖醇酐获得的偏酯的缩合产物，例如，聚乙烯失水山梨糖醇酐单油酸酯。水质混悬剂也可以含有一种或多种着色剂、一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂如蔗糖或糖精。
本发明的组合物可以通过将有效成分混悬于植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)中或者矿物油(例如液体石蜡)中而配制为油性混悬剂。油性混悬剂可以含有增稠剂，例如，蜂蜡、硬石蜡或十六醇。可以加入如上面所述的那些甜味剂，以及调味剂来提供可口的口服制剂。可以通过加入抗氧化剂例如抗坏血酸来保存这些组合物。
本发明的组合物可以制剂成适于通过加入水配制成水性混悬剂的可分散散剂和颗粒剂形式。这类散剂和颗粒剂中的有效成分在与分散剂或润湿剂、悬浮剂及一种或多种防腐剂混合。合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂用上文已经提到的那些物质进行了举例说明。也可以包含另外的赋形剂，例如，甜味剂、调味剂和着色剂。
本发明的组合物也可以为乳剂形式。乳剂为两相体系，通过混合两种不互溶的液态运载体而制备，其中一种载体均匀地分散于另一种载体中，并由直径等于或大于最大胶粒直径的小球构成。小球尺寸非常关键，其必须使得体系能够达到最大稳定性。通常，如果没有第三种物质即乳化剂的掺入，将不会出现两相的分离。因此，基本的乳剂含有至少三种组分，两种不互溶的液态运载体和乳化剂，以及有效成分。大部分乳剂是将水相混入非水相中(或者反之亦然)。然而，制备基本上非水性的乳剂是可能的，例如，甘油和橄榄油非水性不互溶体系的阴离子和阳离子表面活性剂。因此，本发明的组合物可以呈水包油乳剂的形式。油相可以为植物油，例如橄榄油或花生油，或者为矿物油，例如液体石蜡，或者为这两类物质的混合物。合适的乳化剂可以为天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶或黄芪胶，天然存在的磷脂，例如大豆磷脂、卵磷脂和从脂肪酸和己糖醇酐获得的酯类或偏酯，例如山梨糖醇酐单油酸酯，以及偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如，聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。乳剂也可以含有甜味剂和调味剂。
本发明的组合物也可以配制为糖浆和酏剂。糖浆和酏剂的配制也使用甜味剂，例如，甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖。这类制剂还可以含有缓和剂、防腐剂和调味剂及着色剂。缓和剂是主要用来减缓刺激，尤其是粘膜或擦伤(意指划伤或切伤的)组织的保护剂。许多化学物质具有缓和剂性能。这些物质包括藻酸盐、粘质、树胶、糊精、淀粉、某些糖类和聚多羟基乙二醇。其他物质包括阿位伯胶树、琼脂、安息香、卡波姆、明胶、甘油、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、丙二醇、海藻酸钠、黄芪胶、水凝胶等。
颊含组合物(buccal composition)
对于颊含施用，本发明的组合物可以采取由常规方式配制的片剂或锭剂形式。
肠胃外组合物
本文所用的术语“肠胃外”指通过注射的方法引入体内(即，注射施用)，例如包括：皮下注射(即，注射到皮肤之下)，肌内注射(即，注射到肌内)；静脉注射(即，注射入静脉内)，鞘内注射(即，注射到脊髓周围的空间中)，胸骨内注射，或者输注技术。本发明的肠胃外施用组合物使用针递送，例如，外科针。本文所用的术语“外科针”指任何适合于将本发明的流态(即，能够流动)组合物递送入所选择的解剖结构中的针。可注射制剂，例如注射用无菌水性或油性混悬剂，可以利用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂根据公知技术配制。
当希望局部递送瘦蛋白组合物时，可以将它配制成能够通过注射进行肠胃外施用的形式，例如，弹丸式注射(bolus injection)或持续输注。注射剂为单位剂量形式，例如，装入安瓿或多剂量容器中，并加入防腐剂。组合物可以采用如在油性或水性运载体中的混悬剂、溶液剂或乳剂形式，并可以含有配方剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。肠胃外施用的药物制剂包括水溶形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的混悬剂可以制备成适当的油性注射混悬剂。合适的亲油性溶剂或运载体包括脂肪油，例如如芝麻油，或合成性脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射混悬剂可以含有增加混悬剂粘性的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇，或葡聚糖。任选地，混悬剂还可以含有合适的稳定剂或增加化合物溶解性的物质以允许制备高度浓缩溶液。可选地，活性化合物可以是散剂形式，用于在使用前用合适的运载体例如无菌无热原水构建。
药物组合物也可以包含合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。这类载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖类、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物，例如聚乙二醇。
合适的液体或固体药物制品形式为，例如微胶囊化的，以及根据需要，具有一种或多种赋形剂，螺状形式的(encochleated)、涂覆到显微金粒子上、包含在脂质体中、用于植入组织中的丸或者在对象上干燥以擦入组织。这类药物组合物也可以为颗粒剂、珠剂、散剂、片剂、包衣片剂、(微)胶囊剂、栓剂、糖浆、乳剂、混悬剂、霜剂、滴剂或活性化合物延缓释放的制剂，在制剂中如上所述通常使用赋形剂和添加剂和/或辅料，例如崩解剂、粘合剂、包覆剂、膨胀剂、润滑剂或增溶剂。药物组合物适合多种药物递送系统中的应用。关于药物递送方法的简要综述，参见Langer 1990 Science 249，1527-1533，该文献通过引用的方式并入本文。
包含瘦蛋白或瘦蛋白类似物和任选第二治疗剂的瘦蛋白组合物可以本身(纯净的)施用或以药学上可接受的盐的形式施用。在药物中使用时，盐应当是药学上可接受的，但是非药学上可接受的盐可以方便地用来制备其药学上可接受的盐。这类盐包括但不限于那些从以下酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、醋酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。这类盐也可以制备为碱金属盐或碱土盐，例如羧酸基的钠盐、钾盐或钙盐。“药学上可接受的盐”指这些盐，其中在合理的医学判断范围内，适合与人类和低等动物的组织接触的应用，无不当毒性、刺激性、过敏反应等，并具有合理的益处/风险比。药学上可接受的盐是本领域公知的。例如，P.H.Stahl等在“Handbookof Pharmaceutical Salts：Properties，Selection，and Use”(Wiley VCH，Zurich，Switzerland：2002)中详细描述了药学上可接受的盐。这些盐可以在本发明所描述的化合物的最后分离和纯化期间原位地制备，或者通过使游离的碱官能团与合适的有机酸反应而单独制备。代表性的酸加成盐包括但不限于，醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、延胡索酸盐、盐酸盐、溴酸盐、碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐(羟乙基磺酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐(pamoate)、果胶盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、重碳酸盐、对甲苯磺酸盐和十一酸盐。另外，碱性含氮基团可以用下述物质进行季铵化，如低级烷基卤化物，例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫酸盐，如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸盐；长链卤化物，例如癸基、月桂基、肉豆蔻基和十八烷基氯、溴化物和碘化物；芳烷基卤化物，例如苯甲基溴和苯乙基溴化物及其他。由此获得水溶性或油溶性或可分散的产物。可以用来形成药学上可接受酸加成盐的酸的实例包括无机酸如氢氯酸、氢溴酸、硫酸和磷酸、以及如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸等这类有机酸。碱加成盐可以在本发明描述的化合物的最后的分离和纯化过程中，通过含有羧酸的部分与合适的碱如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或重碳酸盐，或与氨或有机伯胺、仲胺或叔胺反应来原位地制备。药学上可接受的盐包括但不限于基于碱金属或碱土金属的阳离子盐，例如锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铝盐等，以及无毒的季铵和胺阳离子，包括铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺等。用于形成碱加成盐的其他代表性有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。药学上可接受的盐也可以使用本领域公知的标准方法获得，例如通过十分碱性的化合物(如胺)与提供生理上可接受的阴离子的合适酸反应。也可以制备羧酸的碱金属(例如，钠、钾或锂)盐或碱土金属(例如钙或镁)盐。
制剂可以方便地为以单位剂量形式，并可以采用制药领域公知的任何方法制备。所有方法均包括步骤：使包含瘦蛋白或瘦蛋白类似物和任选第二治疗剂(“活性化合物”)的瘦蛋白组合物与构成一种或多种辅剂的载体混合。通常，通过将活性物质与液体载体或精细分散的固体载体或与这两者均一充分地混合来制备制剂，随后，如果需要，可将产品成形为需要的制剂。
药用物质或其药学上可接受的酯、盐、溶剂化物或药物前体可以与不消弱预期作用的其他活性物质或与弥补预期作用的物质混合。用于肠胃外、皮内、皮下、鞘内或局部施用的溶液或混悬剂可以包括但不限于例如以下组分：无菌稀释剂，如注射水、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成性溶剂；抗菌药，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和用于调节张力的物质，如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以封装入由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小药瓶中。静脉内施用的特定载体是生理盐水或磷酸盐缓冲液(PBS)。
用于肠胃外注射的药物组合物包含药学上可接受的无菌水溶液或非水溶液、分散剂、混悬剂或乳剂和用于重构为注射用溶液或分散剂的无菌粉末。通常认为溶液是两种或多种物质的均质混合物；它常常是液体，尽管并非是必要的。在溶液中，溶质(或溶解的物质)的分子均匀地分散在溶剂的分子之间。混悬剂是分散物(混合物)，其中被精细分离的物质与另一种物质组合，并且前者被如此精细地分散和混合，以至于它不会迅速沉下来。在日常生活中，最常见的混悬剂是将固体分散在液态水中的那些。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或运载体的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、它们的合适混合物、植物油(如橄榄油)和注射用有机酯如油酸乙酯。可以通过采用包衣例如例如卵磷脂，在分散剂的情况下通过维持所需的粒径，并且通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
这些组合物也可以含有辅助剂，包括防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以由多种抗菌剂和抗真菌剂例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等确保阻止微生物的作用。也可能希望包括等渗剂，例如，糖类、氯化钠等。注射用药物制剂的延长的吸收可以通过使用延迟吸收的物质例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
除了活性化合物之外，混悬剂还可以含有悬浮剂，例如乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂-琼脂、黄芪胶，以及它们的混合物。
可注射贮库形式(depot form)通过在生物可降解聚合物例如聚丙交酯-聚乙交酯中形成药物的微胶囊基质来制备。取决于药物对聚合物的比率，以及所用特定聚合物的本性，可以控制药物释放速度。这种长时间起作用的制剂可以用合适的聚合物或憎水材料(例如，在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂，或微溶衍生物例如微溶盐来配制。其他生物可降解聚合物的例子包括聚原酸酯和聚酸酐。可注射贮库制剂也可以通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中制备。
局部注射用制剂可以，例如，通过细菌截留过滤器过滤或通过掺入杀菌剂来灭菌，其中，所述杀菌剂为无菌固体组合物形式，其可以在使用前溶于或分散在无菌水或其他无菌注射用介质中。注射剂，例如，注射用无菌水性或油性混悬剂可以根据已知技术采用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌注射剂还可以为无毒的肠胃外可接受稀释液或溶剂中的注射用无菌溶液、混悬剂或乳剂，例如1，3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受运载体和溶剂是水，林格液，U.S.P.和等渗氯化钠溶液。此外，常规地使用无菌固定油或作为溶剂或悬浮介质。为了这一目的，可以使用任何刺激性低的固定油，包括合成的单酸甘油酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸也用于制备可注射药。
肠胃外(包括但不限于，皮下、皮内、肌内、静脉内、鞘内和关节内)施用制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其中可以含有使该制剂与预定接受者的血液等渗的抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质；以及水性和非水性无菌混悬剂，其中可以含有悬浮剂和增稠剂。制剂可以在单位剂量或多剂量容器例如密闭安瓿和小瓶中提供，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)的环境下，仅需要在临用前即刻加入无菌液体载体，例如，盐水、注射水。可以由上述无菌散剂、颗粒剂和片剂制备当场使用的注射液和混悬剂。
另一种配制本文中所述组合物的方法涉及使本文中所述的化合物缀合至增强水溶性的聚合物。合适的聚合物的实例包括但不限于聚乙二醇、聚-d-谷氨酸、聚-l-谷氨酸、聚-d-天冬氨酸、聚-l-天冬氨酸和它们的共聚物。可以使用分子量在约5,000和约100,000之间，以及分子量在约20,000和约80,000之间的聚谷氨酸，也可以使用分子量在约30,000和约60,000之间的聚谷氨酸。
合适的缓冲剂包括：醋酸和盐(1-2％w/v)；柠檬酸和盐(1-3％w/v)；硼酸和盐(0.5-2.5％w/v)；以及磷酸和盐(0.8-2％w/v)。合适的防腐剂包括苯扎氯铵(0.003-0.03％w/v)；氯丁醇(0.3-0.9％w/v)；对羟基苯甲酸酯(0.01-0.25％w/v)和乙基汞硫代水杨酸钠(0.004-0.02％w/v)。
可以在粒子中提供包含瘦蛋白或瘦蛋白类似物和任选第二治疗剂的瘦蛋白组合物的制剂。本文所用的术语“粒子”指纳米粒子或微粒子(或在一些情况下更大的粒子)，其可以完整或部分地含有包含瘦蛋白或瘦蛋白类似物和任选第二治疗剂的瘦蛋白组合物。所述粒子可以在被包衣包围的核芯中含有瘦蛋白或瘦蛋白类似物和任选第二治疗剂。瘦蛋白或瘦蛋白类似物和任选第二治疗剂也可以分散遍及粒子各处。瘦蛋白或瘦蛋白类似物和任选第二治疗剂也可以被吸收入粒子中。粒子可以具有任何级别的释放动力学，包括零级释放、一级释放、二级释放、延迟释放、持续释放、立即释放等，以及它们的任何组合。除瘦蛋白或瘦蛋白类似物和任选第二治疗剂之外，粒子还可以包括药学和医学药领域中常规使用的那些材料中的任一种材料，包括但不限于可蚀性、不可蚀性、生物可降解、或生物不可降解的材料或其组合。粒子可以是微胶囊，其含有在溶液中或半固体状态下的瘦蛋白或瘦蛋白类似物和任选第二治疗剂。粒子实际上可以是任何形状。
生物不可降解和生物可降解的高分子材料都可以用在递送瘦蛋白或瘦蛋白类似物和任选性第二治疗剂的粒子的制造中。这种聚合物可以是天然或合成聚合物。基于所需要的释放时间段周期来选择聚合物。特定目的的生物粘附性聚合物包括如Sawhney等人在Macromolecules(1993)26，581-587中描述的生物可侵蚀性水凝胶，其中的教导合并入本文。这些包括聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酸酐、聚丙烯酸、藻酸盐、壳聚糖、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸异丁酯、聚甲基丙烯酸己酯、聚甲基丙烯酸异癸酯、聚甲基丙烯酸月桂酯、聚甲基丙烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸异丙酯、聚丙烯酸异丁酯和聚丙烯酸十八酯。
吹入组合物
本发明的组合物可以是用于通过吸入或吹入施用(或者通过口或者通过鼻)递送的可分散干粉剂形式。干散剂组合物可以通过本领域已知的工艺制备，例如，如在国际专利公开No.WO 91/16038和美国专利No.6,921,527中公开的冻干法和射流粉碎法，这些文献中所的公开内容通过引用的方式并入本文。例如，喷雾干燥是这样的一种工艺，其中，通过喷嘴(例如，双液体喷嘴)、旋转盘或等同的装置将药物和载体的均匀水性混和物引入热气流中，以使溶液雾化形成微细液滴。水性混和物可以是溶液、混悬液、浆料等，但是需要是均一的，以确保组分在混合物并最终在粉化的组合物中均匀分布。溶剂，通常是水，从液滴迅速蒸发，产生粒子直径约为1μm至5μm的微细干燥粉末。喷雾干燥在导致产生组成基本均匀的无定形粉末的条件下进行，该无定形粉末具有可吸入粒径、较低的含湿量，以及允许容易雾化的流动特征。优选地，得到的粉末中粒径约为10μm或更小的粒子超过约98％质量，且粒径约小于5μm的粒子约90％质量。可选地，约95％质量为粒径小于10μm的粒子，且粒径小于5μm的粒子约80％质量。干散剂组合物也可以通过如WO 91/16038号国际专利公开所公开的冻干法和射流粉碎法制备，其中所公开的内容通过引用的方式并入本文。
术语“可分散性”或“可分散的”是指这样的干散剂，其具有以重量计小于约10％(％w)水、通常低于约5％水和小于约3％水的含湿量；约1.0-5.0μm质量中值直径(MMD)、约1.0-4.0μm MMD和约1.0-3.0μmMMD的粒径；约＞30％、约＞40％、约＞50％和约＞60％的递送剂量；以及约1.0-5.0μm质量中值空气动力学直径(MMAD)，约1.5-4.5μmMMAD和约1.5-4.0μm MMAD。1995年4月14日提交的美国申请序列No.08/423,568披露了用于改善可分散性的方法和组合物，其中所公开的内容通过引用的方式并入。
术语“散剂”指由精细分散的固体粒子所组成的组合物，所述的固体粒子自由流动的并且能够轻易地分散在吸入装置中，随后由受治疗者吸入，从而粒子到达肺，渗透入肺泡。因此，称散剂是“可吸入的”。优选地，平均粒径小于约10微米(μm)，具有相对均匀的球体形分布。更优选地，粒径为小于约7.5μm，最优选地小于约5.0μm。通常，粒径分布在约0.1μm至约5μm之间，特别在约0.3μm至约5μm之间。
术语“干燥”指组合物具有这样的含湿量，从而使所述粒子容易地分散在在吸入装置中以形成气溶胶。这种含湿量通常以重量计低于约10％(％w)水，通常低于约5％w并且优选地小于约3％w。
药学上可接受的载体的量是提供必需的稳定性、可分散性、一致性和体积特性以确保将组合物均匀地递送到有需要的受治疗者肺部所需要的量。用数字表示，该量可以是约0.05％w至约99.95％w，这取决于所用药物的活性。优选地，将使用约5％w至约95％。载体可以是一种或两种或更多种药用赋形剂的组合，但是通常会基本上不含任何“渗透促进剂”。渗透促进剂是促进药物经过粘膜或内衬渗透，并且提出用于鼻内、直肠内和阴道内药物制剂中的表面活性化合物。示例性的渗透促进剂包括胆盐，例如，牛磺胆酸盐、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐；夫西地酸盐(fusidates)，例如，牛磺脱氢夫西地酸盐(taurodehydrofusidate)；和生物相容性去垢剂，例如，吐温、Laureth-9、等。然而，通常不希望在用于肺部的制剂中使用渗透促进剂，因为这种表面活性化合物会对肺上皮血液屏障产生不利影响。本发明的干燥粉末组合物无需使用渗透促进剂就能够容易地吸收到肺中。
用作肺部递送载体的药用赋形剂的类型包括稳定剂，例如人血清白蛋白(HSA)、填充剂，如碳水化合物、氨基酸和多肽；pH调节剂或缓冲剂；盐，例如氯化钠等。这些载体可以是结晶或无定形形式或可以是两者的混合物。
对肺部递送特别有价值的填充剂包括相容性碳水化合物、多肽、氨基酸或其组合。合适的碳水化合物包括单糖，如半乳糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、海藻糖等；环糊精，如2-羟丙基-β-环糊精；和多糖，如棉子糖、麦芽糖糊精、葡聚糖等；糖醇，如甘露醇、木糖醇等。优选的碳水化合物包括乳糖、海藻糖、棉子糖、麦芽糖糊精和甘露醇。合适的多肽包括天冬甜素。氨基酸包括丙氨酸和甘氨酸，优选甘氨酸。
为了喷雾干燥过程中构象稳定性和为了改善粉末的可分散性，可以包括肺递送组合物的小组分的添加剂。这些添加剂包括憎水氨基酸，例如色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等。
为通过吸入或吹入来递送，本发明的组合物以足够向受治疗者提供单位剂量治疗的量装在合适的给药容器中。剂量容器为装配在合适的吸入装置中的剂量容器，以允许干散剂组合物通过分散到气流中而雾化，形成气溶胶，随后将这样产生的气溶胶捕集在具有吹嘴的腔室内，所装的吹嘴用于由需要治疗的受治疗者随后的吸入。这种剂量容器包括本领域已知的任何盛装组合物的容器，例如，带有允许将气流(例如，空气流)引导到容器中以分散干散剂组合物的可拆卸部分的明胶或塑料胶囊。这类容器在第4,227,522号美国专利；第4,192,309号美国专利；以及第4,105,027号美国专利中被举例说明。合适的容器也包括与Glaxo’s Ventolin
Figure BPA00001391223900671
Rotohaler牌粉末吸入器或Fison’s Spinhaler
Figure BPA00001391223900672
牌粉末吸入器组合使用的那些容器。另一种提供优异的防潮性能的合适的单位剂量容器由铝箔塑料层压材料制成。药物基粉末按重量或体积计装入用可成形箔形成的凹窝中，并用箔-塑料层压材料覆盖物气密地密封。这种与散剂吸入装置配合使用的容器在第4,778,054号美国专利中披露，并与Glaxo’s Diskhaler
Figure BPA00001391223900681
(美国专利Nos.4,627,432、4,811,73和5,035,237)结合使用。所有这些文献都通过引用的方式并入本文。
本发明的组合物可以以滴剂或喷雾剂(例如，鼻喷雾、气溶胶喷雾或泵喷雾)或其他鼻施用(鼻内递送)运载体的形式使用。气溶胶喷雾剂可以装在具有合适推进剂的压力容器中，如烃类推进剂。泵喷雾分配器可以分配定量的剂量或具有特定粒径或小滴尺寸的剂量。可以设置任何分配装置来分配仅单一剂量或多剂量。更一般地，本发明的组合物，尤其是为鼻内施用配制的那些，也可以提供为溶液、混悬剂，或粘性组合物(例如，凝胶剂、洗剂、霜剂或膏剂)。
直肠组合物
本发明的组合物可以是用于组合物的直肠施用的栓剂形式。本文所用的术语“直肠的”或“直肠地”指通过直肠导入身体中，在那里经直肠壁发生吸收。这些组合物可以通过将药物与合适的无刺激性赋形剂例如可可脂和聚乙二醇混合来制备，其中，所述的赋形剂在常温下是固体，但是在直肠温度下为液体，因此在直肠中将融化，并释放出药物。当配制成栓剂时，本发明的组合物可以混合常规的粘合剂和载体，例如甘油三酯来配制。
局部组合物
术语“局部的”指在应用点处或紧挨应用点下方施用本发明的组合物。短语“局部应用”描述应用到一种或多种表面上，包括上皮表面。尽管与经皮施用相比，如本文中所用，局部施用通常提供局部而非全身作用，除非另外指出或显示，术语“局部施用”和“经皮施用”可互换地使用。为了该应用的目的，局部应用将包括漱口剂和含漱剂。
局部施用也可以包括经皮施用的使用，例如，根据本领域公知的技术和工艺制备的经皮贴剂或离子电渗疗法装置。术语“经皮递送系统”、“经皮贴剂”或“贴剂”指放置在皮肤上的粘附体系，以递送随时间释放的药物剂量，药物从该剂型中经皮肤穿过，以使药物能经由全身循环而分布。经皮贴剂为用于递送多种药物的广为接受的技术，包括但不限于，用于晕动病的东莨菪碱，用于治疗心绞痛的硝化甘油，用于高血压的可乐定，用于绝经后适应症的雌二醇，和用于戒烟的尼古丁。
适用用于本发明的贴剂包括但不限于：(1)基质贴剂；(2)储库型贴剂(reservoir patch)；(3)多层型药物在粘胶层中的贴剂(multi-laminate drug-in-adhesive patch)；和(4)整体型药物在粘胶层中的贴剂(monolithic drug-in-adhesive patch)；TRANSDERMALAND TOPICAL DRUG DELIVERY SYSTEMS，第249-297页(TapashK.Ghosh等人编著，1997)，其在本文中通过引用的方式并入本文。这些贴剂在本领域中是公知的，而且通常可以从市场上购买到。
载体和其他成分
在一些实施方案中，本发明的组合物可以与赋形剂、运载体或载体来配制，其中，所述赋形剂、运载体或载体选自溶剂、悬浮剂、粘结剂、填充剂、润滑剂、崩解剂和润湿剂/表面活性剂/增溶剂。术语“赋形剂”、“运载体”或“载体”指当与活性化合物混合时，能有助于活性化合物的使用而不会与其发生有害反应的物质。术语“活性”指本发明的组合物起预期疗效的成分、组分或组成。载体必须具有足够高的纯度和足够低的毒性，以使它们适用于被治疗的受治疗者。载体可以是惰性的，或它可以具有药学上的益处。
当与给定组合物的活性组分和其他组分组合时，载体可以是液体或固体，并根据头脑中计划的施用方式进行选择，以提供需要的体积、一致性等。常见的药用载体包括但不限于，粘合剂(包括但不限于，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(包括但不限于，乳糖和其他糖类、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸盐或磷酸氢钙。)；润滑剂(包括但不限于，硬脂酸镁、滑石、硅石、胶态二氧化硅(sollidal silicon dioxide)、硬脂酸、硬脂酸金属盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠)；崩解剂(包括但不限于，淀粉、羟基乙酸淀粉钠)和润湿剂(包括但不限于十二烷基硫酸钠)。其他可用于本发明组合物的合适的载体包括但不限于，水、盐溶液、醇、植物油、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油；单脂肪酸甘油酯和双脂肪酸甘油酯、petroethral脂肪酸酯(petroethral fatty acidesters)、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。药物制剂可以灭菌，如果需要可以混合有不与活性化合物起有害反应的助剂，例如，润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐类、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等。
本文所用的术语“药学上可接受的载体”指常规地对药物施用有用的任何基本无毒的载体，其中的活性组分将保持稳定和生物有效。在一些实施方案中，本发明组合物的药学上可接受的载体包括释放剂，例如，持续释放或延迟释放载体。在这类实施方案中，载体可以是任何能够使瘦蛋白或瘦蛋白类似物和任选第二治疗剂有效成分持续或延迟释放的物质，以提供更有效的施用，从而导致更低的频率和/或减少的有效成分剂量、易于处理，以及延长或延迟的作用。此类载体的非限制性实例包括天然和合成的聚合物的脂质体、微海绵、微球体或微胶囊等。脂质体可以由各种磷脂如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱形成。
在一些实施方案中，本发明的组合物可以进一步包括一种或多种相容的活性成分，目的在于是除由瘦蛋白或瘦蛋白类似物和任选第二治疗剂提供的那种药效之外，还为该组合物提供另外的药效。本文所用的“相容的”是指，以普通使用条件下不存在明显会降低各有效成分或组合物的功效的相互作用的方式，这种组合物的有效成分可以相互组合。在本发明的另一个方面中，该组合物也可以顺次地或与其他组合物联合施用来治疗因淀粉状肽积聚导致的疾病、病症或障碍。例如，不限制地，这类的其他组合物可以包括单克隆抗体(如单克隆抗β淀粉状蛋白和单克隆抗β分泌酶)；以及抗炎化合物(包括但不限于非甾体抗炎剂(NSAID)，如布洛芬、吲哚美辛和氟比洛芬)。抗炎化合物已经在细胞培养物以及AD样淀粉状变性的转基因模型中显示引导降低Aβ的性能。
活性物质的浓度选择应使其发挥疗效，但是在本领域技术人员的知识范围和合理的判断内足够低以避免显著副作用。组合物的有效量可以随治疗中的生物受治疗者的年龄和身体状况，病症的严重性，治疗持续的时间，同步治疗的本性，所用的具体化合物、组合物或其他有效成分，所用的具体载体等因素变化。本领域的技术人员能够容易地评估这些因素并基于该信息，确定本发明组合物用于预期目的具体有效浓度。另外，在本发明的治疗应用中，将组合物或药物以足以治愈或至少部分阻止疾病、障碍或病症的量施用到疑似患上或已经患上或者已经承受着这种疾病、障碍或病症的患者，包括在疾病、障碍或病症发展中的并发症和过渡性病理学表型。在一些方法中，施用本发明的组合物减少或消除还没有发展为疾病、障碍或病症的特征病理的患者的认知损伤。
足够达到治疗性或预防性治疗的量在本文中定义为治疗有效剂量。在预防性和治疗性方案中，本发明组合物的量通常都以数个剂量施用直到达到足够有益的反应。典型地，对该反应进行监控，并且如果该反应开始衰退时给予重复剂量。通过确定以能引起一定作用强度的剂量单位的剂量(意指使用单位)，以下称作“单位剂量”，本领域的技术人员能够确定本发明组合物的药理有效量。术语“剂量-强度关系”指个体接受者体内作用强度与剂量相关的方式。作用强度通常指定为最大强度的50％。相应的剂量称为50％有效剂量或个体ED50。术语“个体”的使用是将在本文中所用的基于作用强度的ED50区别于从群体响应数据的频率确定的半数有效剂量，也简称ED50。本文所用的“功效”指本发明的组合物达到期望反应的性能，“最大功效”指最大可以达到的效果。对治疗特定障碍或病症有效的本发明组合物中的化合物用量取决于障碍或病症的本性，并能够采用标准的临床方法确定。(参见，例如，Goodman和Gilman的THE PHARMACOLOGICALBASIS OF THERAPEUTICS，Joel G.Harman，Lee E.Limbird，Eds.；McGraw Hill，New York，2001；THE PHYSICIAN’S DESKREFERENCE，Medical Economics Company，Inc.，Oradell，N.J.，1995；和DRUG FACTS AND COMPARISONS，FACTS ANDCOMPARISONS，INC.，St.Louis，Mo.，1993)。配方中待采用的精确剂量也取决于施用途径，以及疾病或障碍的严重性，应当根据医师的判断和每个患者的情况确定。各种施用模式对本领域的技术人员是显然的。
本发明组合物施用的剂量范围是足够产生期望疗效的那些范围。本发明组合物的治疗有效量可以在规律的基础上每日施用一次或多次。向受治疗者施用的典型剂量是在约0.0001mg组合物/kg(体重)/日至约10g组合物/kg(体重)/日之间。例如，没有限制地，该组合物的最小剂量确定为约0.0001mg/kg/日、约0.0005mg/kg/日、约0.001mg/kg/日、约0.002mg/kg/日、约0.004mg/kg/日、约0.004mg/kg/日、约0.005mg/kg/日、约0.006mg/kg/日、约0.007mg/kg/日、约0.008mg/kg/日、约0.009mg/kg/日、约0.01mg/kg/日、约0.025mg/kg/日、约0.05mg/kg/日、约0.075mg/kg/日、约0.08mg/kg/日、约0.1mg/kg/日、约0.125mg/kg/日、约0.15mg/kg/日、约0.175mg/kg/日、约0.2mg/kg/日、约0.225mg/kg/日、约0.25mg/kg/日、约0.275mg/kg/日、约0.3mg/kg/日、约0.325mg/kg/日、约0.35mg/kg/日、约0.375mg/kg/日、约0.4mg/kg/日、约0.45mg/kg/日、约0.475mg/kg/日或约0.5mg/kg/日，并且最大剂量确定为约10g/kg/日、约9g/kg/日、约8g/kg/日、约7g/kg/日、约6g/kg/日、约5g/kg/日、约4g/kg/日、约3g/kg/日、约2g/kg/日、约1g/kg/日、约0.5g/kg/日、约0.2g/kg/日、约0.175g/kg/日、约0.15g/kg/日、约0.125g/kg/日、约0.1g/kg/日、约0.08g/kg/日、约0.075g/kg/日、约0.05g/kg/日、约0.025g/kg/日或约0.01g/kg/日。在本发明在人体的一些实施方案中，剂量可以是约0.0001mg至约10g组合物/kg(体重)/日，以及在人体的其他实施方案中，在0.0001和10g组合物/kg(体重)/日之间。
本发明的其他组合物可以采用本领域已知的技术容易地制备，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences中所描述的技术，第18或19版，由宾夕法尼亚州伊士顿的Mack Publishing Company出版，通过引用的方式并入本文。
根据本方法的另一种实施方案，该方法包括步骤：外科植入或注射瘦蛋白组合物凝胶、瘦蛋白组合物缓释固体或瘦蛋白组合物半固体至患者体内以将药物物质递送到目的部位。由于这种瘦蛋白组合物被特定地(局部地)递送到所述部位，治疗进行性认知障碍所需要的剂量可以减少、预防或避免可能阻碍施用更高全身性剂量的任何毒性。
控释系统
本发明的瘦蛋白组合物可以含于控释系统中。为了延长药物的作用，经常需要减缓来自皮下、鞘内或肌内注射的药物吸收。这可以通过使用水溶性差的晶体或无定形材料的液体混悬剂实现。药物的吸收速率于是取决于其溶解速度，所述溶解速度反过来取决于晶体大小和晶型。
术语“控释”用来指任何含有药物的制剂，其中药物从该制剂的释放方式和形态是受控的。这指速释制剂及非速释制剂，非速释制剂包括但不限于，持续释放制剂和延迟释放制剂。在本文中使用的术语“持续释放”(也称为“延迟释放”)常规意义上指提供药物在延长的时间周期内逐渐释放的药物制剂，优选地，尽管不必须，在延长的时间周期内产生基本上恒定的血药水平。可选地，肠胃外施用药物形式的延迟吸收通过将该药物溶解或混悬于油运载体中实现。在本文中使用的术语“延迟释放”常规意义上指制剂的施用和从那里的药物释放之间具有时间延迟的药物制剂。“延迟释放”可以包括或不包括药物在延长的时间期间的逐渐释放，因此可以是或可以不是“持续释放”。
使用长期持续释放植入物可以特别适合于治疗慢性病症。在本文中所用的术语“长期”释放指构建并安置植入物以递送有效成分的治疗水平至少约7日，至少约10日，至少约14日，至少约21日，至少约30日，至少约45日，直到至少约60日。长期持续释放植入物是本领域普通技术人员公知的，包括如上所述的一些释放系统。
根据另一种实施方案，本发明的药学上可接受的载体包括持续释放或延迟释放载体。载体可以是任何能够使化合物持续或延迟释放的材料，以提供更有效的施用，从而降低化合物的施用频率和/或减少其剂量，易于处理，并延长或延迟对上皮相关病症的作用。
本领域技术人员会认识到本发明组合物的合适治疗剂量的初始适应症能够在体外和体内动物模型系统，以及人类临床试验中确定。本领域技术人员将知道使用动物研究和人类经验确定可以安全地施用而不产生毒性或其他副作用的剂量。对于急性治疗，优选治疗剂量接近最大的耐受剂量。对于慢性预防用途，由于考虑到长期作用，最好采用较低的剂量。
本发明组合物和方法的效果可以由多种方案进行评价。增强人受治疗者认知功能的效果可以通过对本领域技术人员来说常规的方法确定，包括但不限于，纸笔试验(paper and pencil)和计算机试验。本领域技术人员也可以直接测定动物模型中淀粉状肽积聚水平、神经原纤维缠结的形成和神经变性。此外，淀粉状肽可以由脊髓开孔导出液体(spin tap)中获得的受治疗者的脑脊液(CSF)样品进行测定。淀粉状肽积聚的一个度量值是受治疗者血液中循环水平的增加。这类水平可以采用一对抗体，一个用于捕集，另一个用于检测，通过夹心酶联免疫吸附试验(ELISAs)测定。这些方法对本领域普通技术人员是公知的。
III.药物发现
由于关于AD病理生物学中由瘦蛋白触发的代谢途径的研究很少，故本发明还提供了涉及利用以下研究结果治疗因NFT或Aβ的积聚所致的进行性认知功能紊乱疾病或障碍的药物发现方法：生理上作为代谢和应激传感蛋白发挥功能的5-腺苷一磷酸蛋白激酶(AMPK)介导了瘦蛋白减少tau磷酸化和Aβ释放的能力。
(1).用于鉴定治疗或预防认知功能紊乱疾病或障碍的治疗剂的方法
根据另一个方面，所述发明提供用于鉴定有效治疗剂的方法，所述的有效治疗剂用于治疗因Aβ积聚、tau过度磷酸化或NTF积聚中至少之一引起的进行性认知功能紊乱疾病或障碍，所述方法包括步骤：
a)提供包含神经元细胞的细胞培养物；
b)使包含神经元细胞的细胞培养物与推定性治疗剂接触；
c)确定所述推定性治疗剂是否与AMPK蛋白的活性部分缔合以至它影响与推定性治疗剂接触的AMPK蛋白的活性；并且
d)相对于对照通过测量培养物中神经元细胞的β淀粉状蛋白的分泌，鉴定所述推定性治疗剂为治疗因Aβ积聚、tau过度磷酸化或NTF积聚中至少之一引起的进行性认知功能紊乱疾病或障碍的有效治疗剂。
根据一种实施方案，该进行性认知功能紊乱因神经原纤维缠结的积聚引起。根据另一种实施方案，该进行性认知功能紊乱因β淀粉状蛋白的积聚引起。
根据一些实施方案，因Aβ积聚、tau过度磷酸化或NTF积聚中至少之一引起的进行性认知疾病或障碍包括但不限于阿尔茨海默病、进行性核上麻痹；痴呆；拳击员痴呆；克-雅病；额颞痴呆；皮克病；其他tau-阳性病理，包括FTDP-17皮质基底节变性；额颞叶变性(FTLD)；和缺少突出组织学的痴呆。根据另一种实施方案，所述进行性认知障碍是阿尔茨海默病。根据另一种实施方案，所述进行性认知障碍是进行性核上麻痹。根据另一种实施方案，所述进行性认知障碍是痴呆。根据另一种实施方案，所述进行性认知障碍是拳击员痴呆。根据另一种实施方案，所述进行性认知障碍是克-雅病。根据另一种实施方案，所述进行性认知障碍是额颞痴呆。根据另一种实施方案，所述进行性认知障碍是皮克病。根据另一种实施方案，所述进行性认知障碍是FTDP-17皮质基底节变性。根据另一种实施方案，所述进行性认知障碍是额颞叶变性(FTLD)。根据另一种实施方案，所述进行性认知障碍是缺少突出组织学的痴呆。
根据另一种实施方案，推定性治疗剂具有足以抑制AMPK蛋白的量。根据另一种实施方案，推定性治疗剂具有从约1ng/ml至约100μg/ml的量。根据一些此类实施方案，推定性治疗剂具有约5ng/ml的量。根据一些此类实施方案，推定性治疗剂具有约25ng/ml的量。根据一些此类实施方案，推定性治疗剂具有约50ng/ml的量。根据一些此类实施方案，推定性治疗剂具有约75ng/ml的量。根据一些此类实施方案，推定性治疗剂具有约100ng/ml的量。根据一些此类实施方案，推定性治疗剂具有约250ng/ml的量。根据一些此类实施方案，推定性治疗剂具有约500ng/ml的量。根据一些此类实施方案，推定性治疗剂具有约750ng/ml的量。根据一些此类实施方案，推定性治疗剂具有约1μg/ml的量。根据一些此类实施方案，推定性治疗剂具有约25μg/ml的量。根据一些此类实施方案，推定性治疗剂具有约50μg/ml的量。根据一些此类实施方案，推定性治疗剂具有约75μg/ml的量。根据一些此类实施方案，推定性治疗剂具有约100μg/ml的量。
根据另一种实施方案，推定性治疗剂是重组蛋白。根据另一种实施方案，推定性治疗剂是由重组DNA表达的重组蛋白。如本文中所用的术语“表达”指将源自基因如DNA序列的遗传信息借以变成功能性基因产物的过程。重组DNA(rDNA)是通过两个非同源性DNA分子(通常是体外)接合所形成的DNA序列。根据一些实施方案，该重组蛋白是与AMPK缔合的蛋白质。根据一些此类实施方案，该重组蛋白是AMPK的抑制剂。根据一些此类实施方案，该重组蛋白是AMPK拮抗剂。根据一些此类实施方案，该重组蛋白是AMPK激动剂。
根据另一种实施方案，所述推定性治疗剂是抑制剂。根据一些此类实施方案，该抑制剂是AMPK抑制剂。根据另一种实施方案，所述推定性治疗剂是拮抗剂。根据一些此类实施方案，所述推定性治疗剂是AMPK拮抗剂。
根据一些实施方案，可以使用功能性拮抗剂测定法鉴定拮抗剂。在功能性拮抗剂测定法中，药物的IC50可以通过构建剂量-反应曲线并且检验不同浓度的拮抗剂对逆转激动剂活性的作用来测定。可以通过测定为抑制该激动剂半数最大生物学反应所需要的浓度来计算特定拮抗剂IC50的值。IC50值依赖于测量它们的条件。通常，IC50值随酶浓度提高而增加，并且抑制剂的浓度越高，激动剂活性将减少得越多。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约25μM。根据一些实施方案，该拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约10μM。根据一些实施方案，该拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约1μM。根据一些实施方案，该拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约500nM。根据一些实施方案，该拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约250nM。根据一些实施方案，该拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约100nM。根据一些实施方案，该拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约50nM。根据一些实施方案，该拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约25nM。
根据一些实施方案，可以使用竞争结合测定法鉴定拮抗剂。在竞争结合测定法中，在每个验定孔中使用单一浓度的放射配体(通常是激动剂)。配体在低浓度上使用，通常在其解离常数(Kd)值上或低于此值上使用。随后在一系列浓度的其他竞争性非放射化合物(通常是拮抗剂)的存在的情况下测定放射配体的特异性结合的水平，以测量这些化合物竞争结合放射配体的效力。竞争曲线也可以用计算机拟合成如直接拟合下所述的逻辑函数。在这种情况下，IC50是替换放射配体50％特异性结合的竞争性配体的浓度。使用Cheng-Prusoff等式，将IC50值换算成绝对抑制常数(Ki)：Ki＝((IC50)/(1+([S]/Km)))，其中Ki是抑制剂的结合亲和力，IC50是抑制剂的功能性强度，[S]是底物浓度，并且Km是底物对酶的亲和力。取决于放射配体浓度，一种化合物的IC50值可以在实验之间变动，然而，Ki是绝对值。Ki是药物的抑制常数；其为竞争性测定法中如果无放射配体存在，本会占据50％受体的竞争性配体的浓度。根据一些实施方案，该拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约25μM。根据一些实施方案，该拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约10μM。根据一些实施方案，该拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约1μM。根据一些实施方案，该拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约500nM。根据一些实施方案，该拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约250nM。根据一些实施方案，该拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约100nM。根据一些实施方案，该拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约50nM。根据一些实施方案，该拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约25nM。
根据另一种实施方案，所述推定性治疗剂是激动剂。根据一些此类实施方案，所述推定性治疗剂是AMPK激动剂。根据一些此类实施方案，该AMPK激动剂是AICAR肽模拟物。对于激动剂和刺激物测定，最常见的综合量度是EC50。激动剂的效力与其半数最大有效浓度(EC50)成反比关系。浓度量值一般遵循S型曲线，在相对小的浓度变化范围内迅速增加。根据一些实施方案，该拮抗剂的EC50值是从约0.001nM至约25nM。根据一些实施方案，该拮抗剂的EC50值是从约0.001nM至约50nM。根据一些实施方案，该拮抗剂的EC50值是从约0.001nM至约100nM。根据一些实施方案，该拮抗剂的EC50值是从约0.001nM至约250nM。根据一些实施方案，该拮抗剂的EC50值是从约0.001nM至约500nM。根据一些实施方案，该拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约1μM。根据一些实施方案，该拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约10μM。根据一些实施方案，该拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约25μM。
根据另一种实施方案，所述推定性治疗剂是抗体。根据一些此类实施方案，该抗体是针对AMPK的抗体。根据另一种实施方案，相对于对照通过ELISA测定法测量步骤(C)中培养物中神经元细胞的β淀粉状蛋白的分泌。根据另一种实施方案，相对于对照通过免疫印迹法测量步骤(C)中培养物中神经元细胞的β淀粉状蛋白的分泌。
根据另一种实施方案，所述方法进一步包括使用有效治疗剂以治疗β淀粉状蛋白病理的步骤。
根据一种这样的实施方案，所述β淀粉状蛋白(Aβ)病理是阿尔茨海默病。根据一些实施方案，AD的β淀粉状蛋白病理包含APP、早老蛋白1(PS1)或早老蛋白2(PS2)基因中的错义突变。
根据另一种实施方案，AD的β淀粉状蛋白病理包含Aβ42的改变的蛋白酶解。
根据一些实施方案，AD的β淀粉状蛋白病理包含Aβ42在脑间质液中的进行性积聚和聚集。
根据一些实施方案，AD的β淀粉状蛋白病理包含聚集的Aβ42沉积物为弥散斑。根据一些此类实施方案，该沉积物进一步包含蛋白聚糖和其他促淀粉状蛋白的底物。
根据一些实施方案，AD的β淀粉状蛋白病理包含Aβ40聚集到弥散性Aβ42斑上。根据一些实施方案，AD的β淀粉状蛋白病理包含某些斑相关蛋白的累积。
根据一些实施方案，AD的β淀粉状蛋白病理包含炎症反应。根据一些此类实施方案，炎症反应是小胶质细胞活化、细胞因子释放、星形细胞增生和急性期蛋白释放中至少之一。
根据一些实施方案，AD的β淀粉状蛋白病理包含进行性神经炎损伤。在一些此类实施方案中，所述进行性神经炎损伤处于淀粉状蛋白斑内部。在一些此类实施方案中，所述进行性神经炎损伤处于淀粉状蛋白斑内部和神经毡中的其他地方。
根据一些实施方案，AD的β淀粉状蛋白病理包含神经元代谢稳态的扰乱。根据一些实施方案，AD的β淀粉状蛋白病理包含离子稳态的扰乱。根据一些实施方案，AD的β淀粉状蛋白病理包含氧化性损伤。
根据一些实施方案，AD的β淀粉状蛋白病理包含至少一种改变的激酶/磷酸酶活性，其导致过度磷酸化的tau，后者导致PHF形成。
根据一些实施方案，AD的病理包含海马和大脑皮质中广泛的神经元/神经炎功能紊乱和死亡，伴有进行性神经递质缺乏。
根据一些实施方案，AD的β淀粉状蛋白病理包含痴呆。
根据一些实施方案，AD的β淀粉状蛋白病理影响皮层区。根据一些此类实施方案，AD的β淀粉状蛋白病理包含神经炎营养不良。根据一些此类实施方案，AD的β淀粉状蛋白病理包含突触丧失。根据一些此类实施方案，AD的β淀粉状蛋白病理包含神经元核周体皱缩。根据一些此类实施方案，AD的β淀粉状蛋白病理包含选择性神经元丧失。
根据另一种实施方案，Aβ病理是亨廷顿病。McGowan，DP，等人，Neuroscience 100(4)：677-80(2000)。亨廷顿病(舞蹈病)是影响肌肉协调和一些认知功能的神经变性病。身体检查，有时联合心理学检查，可以确定该疾病的发作是否已经开始。身体任何部分的过多无意识运动往往是寻求医学会诊的原因。如果这些运动是骤起的并且具有随机的时序和分布，则提示HD诊断。很少首先诊断到认知或精神病症状；它们通常仅在事后或这些症状进一步发展时才被识别。使用基于运动、行为、认知和功能评估提供总体评定系统的亨廷顿病统一评定量表，可以测量该疾病已经进展到何种程度。医学成像术，如计算机化断层显像术(CT)和磁共振成像术(MRI)，通常显示该疾病晚期中可视的脑萎缩。功能性神经成像技术如fMRI和PET可以显示身体症状发作之前脑活动的改变。最有特征的最初身体症状是猛然、随机和不可控的运动，称作舞蹈病。舞蹈病可以起初表现为一般的不安感、细小的无意识发动的动作或未完成的动作、缺少协调性或者迟缓的眼扫视运动。这些细微的运动异常通常先于更明显的运动障碍体征至少三年出现。症状的更清晰表现如强直、扭动运动或异常姿态随障碍进展而显现。这些是脑中负责运动的系统受影响的征兆。精神性运动功能变得日益受损，从而任何需要肌肉控制的动作受到影响。常见后果是身体不稳定、异常面部表情和咀嚼、吞咽与说话困难。进食困难通常造成体重下降并且可以导致营养不良。睡眠障碍也是伴随的症状。青少年HD不同于这些症状，在于它一般进展更快并且舞蹈病表现短暂，如果确实有的话，而强直是主要的症状。癫痫发作(Seizure)也是这种形式HD的常见症状。认知能力渐进性受损。尤其影响执行功能，这包括计划、认知灵活性、抽象思维、规则获取、发动适宜动作和抑制不适宜动作。随着该疾病进展，记忆缺损倾向于出现。报道的损害的范围从短期记忆缺损至长期记忆困难，包括场景记忆(某人生活的记忆)、过程记忆(身体如何执行一项活动的记忆)和工作记忆的缺损。认知问题倾向于随时间恶化，最终导致痴呆。这种缺损模式已经被叫做“皮层下痴呆”综合征以将它与“皮层痴呆”如阿尔茨海默病的典型表现相区别。
根据另一种实施方案，Aβ病理是帕金森病。(例如，见Conway，KA，等人，Biochemistry 39：2552-63(2000)；Hardy，J.和Selkoe，DJ，Science297：353-56(2002))。帕金森病(PD)是中枢神经系统的变性障碍。PD影响运动，产生运动症状。非运动症状包括自主神经失调、认知与神经行为问题和感觉与睡眠困难。PD的四种主要症状包括：震颤、强直、运动迟缓与运动不能和姿态不稳定。额外的症状包括但不限于，迟缓的反应时间、执行功能紊乱、痴呆和短期记忆丧失。
根据另一种实施方案，所述有效治疗剂具有足以抑制AMPK蛋白的量。根据一些此类实施方案，所述有效治疗剂具有从约1ng/ml至约100μg/ml的量。根据一些此类实施方案，所述有效治疗剂具有约5ng/ml的量。根据一些此类实施方案，所述有效治疗剂具有约25ng/ml的量。根据一些此类实施方案，所述有效治疗剂具有约50ng/ml的量。根据一些此类实施方案，所述有效治疗剂具有约75ng/ml的量。根据一些此类实施方案，所述有效治疗剂具有约100ng/ml的量。根据一些此类实施方案，所述有效治疗剂具有约250ng/ml的量。根据一些此类实施方案，所述有效治疗剂具有约500ng/ml的量。根据一些此类实施方案，所述有效治疗剂具有约750ng/ml的量。根据一些此类实施方案，所述有效治疗剂具有约1μg/ml的量。根据一些此类实施方案，所述有效治疗剂具有约25μg/ml的量。根据一些此类实施方案，所述有效治疗剂具有约50μg/ml的量。根据一些此类实施方案，所述有效治疗剂具有约75μg/ml的量。根据一些此类实施方案，所述有效治疗剂具有约100μg/ml的量。
根据另一种实施方案，有效治疗剂是重组蛋白。根据一些实施方案，该重组蛋白是与AMPK缔合的蛋白质。根据一些此类实施方案，该重组蛋白是AMPK的抑制剂。根据一些此类实施方案，该重组蛋白是AMPK激动剂。根据一些此类实施方案，该重组蛋白是AMPK拮抗剂。
根据另一种实施方案，所述有效治疗剂是抑制剂。根据一些此类实施方案，所述有效治疗剂是AMPK抑制剂。
根据另一种实施方案，所述有效治疗剂是拮抗剂。根据一些此类实施方案，所述有效治疗剂是AMPK拮抗剂。
根据一些实施方案，可以使用功能性拮抗剂测定法鉴定该拮抗剂。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约25μM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约10μM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约1μM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约500nM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约250nM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约100nM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约50nM。
根据一些实施方案，可以使用竞争结合测定法鉴定拮抗剂。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约25μM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约10μM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约1μM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约500nM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约250nM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约100nM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约50nM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约25nM。
根据另一种实施方案，所述有效治疗剂是激动剂。根据一些此类实施方案，所述有效治疗剂是AMPK激动剂。
根据另一种实施方案，所述有效治疗剂是抗体。根据一些此类实施方案，所述有效治疗剂是针对AMPK的抗体。
根据另一种实施方案，有效治疗剂意指至少一种AMPK功能。
(2).用于鉴定tau磷酸作用的效应物的方法
NFT是AD的突出标志并且主要由已经聚合成直链和PHF的过度磷酸化的tau蛋白组成。Tau蛋白通常是极可溶的并且发挥调节神经元微管动力学的作用。虽然tau的功能借助受控的磷酸化和去磷酸化作用正常调节，但是通常认为tau磷酸化的病态失调与AD中的痴呆相关，并且它进一步似乎是聚合作用和NFT形成的前奏。尽管tau容易被许多激酶磷酸化，但未鉴定到负责AD中tau过度磷酸化的激酶。
糖原合酶激酶3β(GSK3β)是具有稳定活性的脯氨酸导向的丝氨酸-苏氨酸激酶，其介导磷酸盐分子添加在特定细胞底物中的某些丝氨酸和苏氨酸氨基酸处。通常认为GSK-3β通过磷酸化作用抑制这些底物。大部分GSK-3β底物受到负调节，这通过其他激酶如蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶B(Akt)的Ser9磷酸化作用缓解。
除异常聚合之外，已经显示tau在AD病理中过度磷酸化。虽然GSK-3β可能具有某种作用，但并不清楚过度磷酸化的tau如何产生。
根据另一个方面，本发明提供了鉴定至少一种tau磷酸化作用的效应物的方法，该方法包括步骤：
a)提供包含神经元细胞的细胞培养物；
b)使细胞培养物与候选效应物接触，
c)确定所述候选效应物是否与GSK-3β蛋白的活性部分缔合以至它影响与候选效应物接触的GSK-3β蛋白的活性；以及
d)相对于对照通过测量培养物中神经元细胞的GSK-3β蛋白活性，鉴定所述候选效应物为tau磷酸化作用的效应物。
根据一种实施方案，所述效应物具有足以抑制GSK-3β蛋白的量。根据另一种实施方案，该效应物具有从约1ng/ml至约100μg/ml的量。根据一些此类实施方案，该效应物具有约5ng/ml的量。根据一些此类实施方案，该效应物具有约25ng/ml的量。根据一些此类实施方案，该效应物具有约50ng/ml的量。根据一些此类实施方案，该效应物具有约75ng/ml的量。根据一些此类实施方案，该效应物具有约100ng/ml的量。根据一些此类实施方案，该效应物具有约250ng/ml的量。根据一些此类实施方案，该效应物具有约500ng/ml的量。根据一些此类实施方案，该效应物具有约750ng/ml的量。根据一些此类实施方案，该效应物具有约1μg/ml的量。根据一些此类实施方案，该效应物具有约25μg/ml的量。根据一些此类实施方案，该效应物具有约50μg/ml的量。根据一些此类实施方案，该效应物具有约75μg/ml的量。根据一些此类实施方案，该效应物具有约100μg/ml的量。
根据另一种实施方案，该效应物是重组蛋白。根据一些实施方案，该重组蛋白是与GSK-3β缔合的效应物。根据一些此类实施方案，该重组蛋白是抑制GSK-3β的效应物。根据一些此类实施方案，该重组蛋白是作为GSK-3β激动剂的效应物。根据一些此类实施方案，该重组蛋白是作为GSK-3β拮抗剂的效应物。
根据另一种实施方案，该效应物是抑制剂。根据一些此类实施方案，该效应物是GSK-3β的抑制剂。
根据另一种实施方案，该效应物是拮抗剂。根据一些此类实施方案，该效应物是GSK-3β拮抗剂。
根据一些实施方案，可以使用功能性拮抗剂测定法鉴定拮抗剂。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约25μM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约10μM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约1μM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约500nM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约250nM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约100nM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约50nM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约25nM。
根据一些实施方案，可以使用竞争结合测定法鉴定拮抗剂。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约25μM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约10μM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约1μM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约500nM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约250nM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约100nM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约50nM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约25nM。
根据另一种实施方案，该效应物是激动剂。根据一些此类实施方案，该效应物是GSK-3β激动剂。
根据另一种实施方案，该效应物是抗体。根据一些此类实施方案，该效应物是针对GSK-3β的抗体。
根据另一种实施方案，通过ELISA测定法进行鉴定步骤(c)。根据另一种实施方案，通过免疫印迹法进行鉴定步骤(c)。
(3).用于鉴定瘦蛋白阻滞剂的方法
合成肽可以用作探针来观察在何处发生蛋白质-肽相互作用。抑制肽(阻滞剂)可以在临床研究中用来检验肽对抑制蛋白激酶、癌蛋白和其他障碍的影响。
例如，胞外信号调节激酶(ERK)，一种MAPK蛋白激酶[意指应答于胞外刺激物(抗原)并且调节各种细胞活动的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶类中的任何一种激酶]，对细胞增殖与分化是必需的。MAPK的活化要求一种级联机制，由此MAPK由上游MAPKK(MEK)磷酸化，其中，所述的上游MAPKK转而由第三种激酶MAPKKK(MEKK)磷酸化。MAPK，其含有MEK1氨基端的13个氨基酸并与ERK结合，作为MEK诱饵通过与ERK结合而发挥作用。MAPK结合作用阻碍MEK激活ERK，因为ERK不能与MEK相互作用。
Autocamtide-2相关抑制肽(AIP)是阻滞肽的另一个实例。这种合成肽是Ca2+/钙调蛋白-依赖性蛋白激酶II(CaMKII)的高度特异性和有力抑制剂。AIP是autocamtide-2(CaMKII的高度选择性肽底物)的不可磷酸化类似物。AIP以100nM的IC50抑制CaMKII(IC50是获得50％抑制所需要的抑制剂浓度)。AIP抑制作用对于syntide-2(CaMKII肽底物)和ATP是非竞争性的，但是对于autocamtide-2是竞争性的。AIP抑制作用不受Ca2+/钙调蛋白的存在或不存在影响。CaMKII活性被1μM AIP完全抑制；PKA、PKC和CaMKIV不受影响。
周期蛋白依赖性激酶5(Cdk5)抑制肽(CIP)是阻滞肽的另一个实例。当Cdk5与p25调节性组分缔合时，它在阿尔茨海默病(AD)-特异性磷酸表位处使tau磷酸化。p25是Cdk-p25异二聚体的截短型激活剂(微管相关蛋白)，其中当暴露于β淀粉状肽时，从Cdk5生理激活剂p35产生所述的p25。CIP选择性地抑制p25/Cdk5活性并阻抑皮质神经元中的反常tau磷酸化作用。CIP显示的特异性的原因未被充分理解。
已经鉴定到ERK2、ERK3、p38/HOG1、蛋白激酶C、酪蛋白激酶II、Ca2+/钙调蛋白激酶IV、酪蛋白激酶II、Cdk4、Cdk5、DNA-PK、PAK3、PI-3激酶、PI-5激酶、PSTAIRE、核糖体S6激酶、GSK-4、GCK、SAPK、SEK1和FAK的额外阻滞肽。
根据另一个方面，本发明提供用于鉴定瘦蛋白的阻滞剂的方法，该方法包括步骤：
(a)提供包含神经元的细胞培养物；
(b)使细胞培养物中的神经元细胞与瘦蛋白或瘦蛋白类似物接触；
(c)使细胞培养物中的神经元细胞与瘦蛋白的推定阻滞剂接触，其中推定的阻滞剂与瘦蛋白或瘦蛋白类似物的活性部分缔合，以及
(d)通过测量神经元细胞的GSK-3β活性而鉴定所述推定阻滞剂为瘦蛋白的有效阻滞剂。
根据一种实施方案，所述阻滞剂具有足以抑制瘦蛋白的量。根据另一种实施方案，所述阻滞剂具有从约1ng/ml至约100μg/ml的量。根据一些此类实施方案，所述阻滞剂具有约5ng/ml的量。根据一些此类实施方案，所述阻滞剂具有约25ng/ml的量。根据一些此类实施方案，所述阻滞剂具有约50ng/ml的量。根据一些此类实施方案，所述阻滞剂具有约75ng/ml的量。根据一些此类实施方案，所述阻滞剂具有约100ng/ml的量。根据一些此类实施方案，所述阻滞剂具有约250ng/ml的量。根据一些此类实施方案，所述阻滞剂具有约500ng/ml的量。根据一些此类实施方案，所述阻滞剂具有约750ng/ml的量。根据一些此类实施方案，所述阻滞剂具有约1μg/ml的量。根据一些此类实施方案，所述阻滞剂具有约25μg/ml的量。根据一些此类实施方案，所述阻滞剂具有约50μg/ml的量。根据一些此类实施方案，所述阻滞剂具有约75μg/ml的量。根据一些此类实施方案，所述阻滞剂具有约100μg/ml的量。
根据另一种实施方案，该阻滞剂是重组蛋白。根据一些实施方案，该重组蛋白是与瘦蛋白缔合的阻滞剂。根据一些此类实施方案，该重组蛋白是与抑制瘦蛋白的阻滞剂。根据一些此类实施方案，该重组蛋白是作为瘦蛋白激动剂的阻滞剂。根据一些此类实施方案，该重组蛋白是作为瘦蛋白拮抗剂的阻滞剂。
根据另一种实施方案，该阻滞剂是抑制剂。根据一些此类实施方案，该阻滞剂是瘦蛋白的抑制剂。
根据另一种实施方案，该阻滞剂是拮抗剂。根据一些此类实施方案，该阻滞剂是瘦蛋白拮抗剂。
根据一些实施方案，可以使用功能性拮抗剂测定法鉴定该拮抗剂。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约25μM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约10μM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约1μM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约500nM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约250nM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约100nM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约50nM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约25nM。
根据一些实施方案，可以使用竞争结合测定法鉴定拮抗剂。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约25μM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约10μM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约1μM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约500nM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约250nM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约100nM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约50nM。根据一些实施方案，鉴定的拮抗剂的IC50值是从约0.001nM至约25nM。
根据另一种实施方案，该阻滞剂是激动剂。根据一些此类实施方案，该阻滞剂是瘦蛋白激动剂。
根据另一种实施方案，该阻滞剂是抗体。根据一些此类实施方案，该阻滞剂是针对瘦蛋白或瘦蛋白类似物的抗体。
根据另一种实施方案，通过ELISA测定法测量步骤(d)中神经元细胞的GSK-3β活性。根据另一种实施方案，通过免疫印迹法测量步骤(d)中神经元细胞的GSK-3β活性。
除非另外限定，本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然也可以在本发明的实施和试验中使用与本文中所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。本文中提及的全部公开出版物通过引用的方式并入本文，以结合引用的公开出版物披露和描述这些方法和/或材料。
在提供数值范围的情况下，除非文中另外指明，应当理解为该范围及任一其他所描述范围的上限和下限之间的每一个中间值，到下限单位的十分之一，或在所描述范围内的中间值包括在本发明的范围内。独立地包括在这些较小范围的上限和下限也包括在本发明的范围内，在所描述的范围内可以明确地排除任何界限。当所描述的范围包括一个或者两个界限时，排除这些所包括的界限的两者中任一个的范围也包括在本发明中。
必须注意的是，除非上下文另外明确地指明，本文中和在所附权利要求中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式。本文中所用的全部技术和科学术语具有相同的含义。
本文中讨论的公开出版物的提供仅是因为它们公开于本申请的申请日之前。本文中并没有内容可以解释为承认本发明由于在先发明而不能早于这样的出版物。此外，所提供的公开日可能不同于需要独立核实的实际公开日。
本发明可以在不脱离其精神或实质特点的其他具体形式中体现，因此，应当参照所附的权利要求而非前面的说明书来确定本发明的范围。
实施例
提出以下的实施例，从而为本领域普通技术人员提供如何做出和使用本发明的完整公开和描述，并不意图限制本发明人认为的其发明的范围，也不意图代表下面的实验是所进行的全部或唯一实验。已经作出努力以确保所用数字(例如量、温度等)方面的准确度，但是应当考虑一些实验误差和偏差。除非另外指明，份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。
实施例1.使用转基因CRND8小鼠模型系统时，长期瘦蛋白处理对AD样病理生物学和认知下降的影响
1.1.材料与方法
1.1(a).试剂和抗体
Alzheimer前体蛋白(APP)643-695单克隆抗体(mAb)从Millipore(Billerica，MA)购买。兔抗PPARγ和SOCS3、Tau(pSer396)mAb和tau(tau46)mA从Cell Signaling购买。PHF-tau mAb(克隆AT8)从PierceBiotechnology(Rockford，IL)购买。PHF-1 mAb是来自阿尔伯特爱因斯坦医学院Peter Davies(Bronx，NY)博士的馈赠。兔抗-tau(pThr181)从Sigma-Aldrich购买。兔抗-α-微管蛋白、兔抗-瘦蛋白和兔抗-瘦蛋白受体(OB-R)从Affinity BioReagents(Golden，CO)购买。
1.1(b).动物与圈养
该研究中使用了CRND8小鼠(n＝22)和野生型小鼠(n＝20)，其中，所述的CRND8小鼠携带在C3H/He-C57BL/6背景上KM670/671/NL(瑞典突变)和V717F(印地安那突变)处具有双突变的APP695基因。一旦抵达，将全部动物分组圈养并无限制地提供食物和水，并且在12小时光照/黑暗周期下维持。全部动物按照Case Western Reserve大学机构动物护理与使用委员会(IACUC)批准的方案处理，并且以随机方式决定实验分组。全部动物在本研究期间称重3次作为健康状态的总体量度。
1.1(c).瘦蛋白泵植入
如下实施泵植入。简而言之，小鼠用腹膜内注射阿佛丁麻醉，并且随后外科地配备皮下Alzet微量渗透泵(2004型，Durect Corp.，Cupertino，CA，USA)。CRND8动物中13只接受PBS中20μg瘦蛋白(0.25μl/小时的3.33mg/ml重组鼠瘦蛋白)的日剂量；并且9只以PBS输注；全部野生型小鼠以PBS输注。在第4周用再充满的渗透泵替换旧渗透泵，持续处理总共8周。
1.1(d).ELISA
全部测定根据制造商的具体说明进行。从标准曲线计算全部血清标记的水平，所述的标准曲线用450nm处OD的对已知浓度的连续稀释物形成。
使用小鼠胰岛素ELISA试剂盒(Millipore)测定血清中的小鼠胰岛素水平。简而言之，该测定是依次基于以下步骤的夹心ELISA：1)将来自样品的胰岛素分子捕获至预滴定量单克隆小鼠抗大鼠胰岛素抗体包被的微量滴定板的孔并且使生物素酰化的多克隆抗体与捕获的胰岛素结合，2)洗去来自样品的未结合物质；3)使辣根过氧化物酶与固定的生物素酰化抗体结合，4)洗去游离的酶缀合物，和5)通过在底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺存在的情况下监测辣根过氧化物酶活性而量化固定的抗体γ-酶缀合物。在酸化所形成的产物后，对590nm处的吸光度进行校正，通过450nm处增加的吸光度以分光光度法测量酶活性。由于吸光度的增加直接与未知样品中捕获的胰岛素的量成比例，故胰岛素的量可以通过插值法从相同测定中用具有已知浓度大鼠胰岛素的参比标准物所产生的参比曲线导出。
使用小鼠TNFαELISA试剂盒(R&D Systems；Minneapolis，MN)测定血清中的小鼠α-TNF水平。简而言之，该测定使用定量夹心酶免疫测定技术。微量平板用小鼠TNF-α特异性多克隆抗体预包被。将标准物、对照和样品吸取至各孔中，并且存在的任何小鼠TNF-α被固定的抗体结合。在洗去任何未结合的物质后，将小鼠TNF-α特异性酶联多克隆抗体添加至各孔。在洗涤以除去任何未结合的抗体-酶试剂后，将底物溶液添加至各孔。酶反应产生添加终止液时变黄的蓝色产物。测量到的颜色强度与初始步骤中结合的小鼠TNF-α的量成比例。随后从标准曲线读出样品值。
使用小鼠C反应蛋白ELISA定量试剂盒(Genway；San Diego，CA)测定血清中的小鼠C反应蛋白(CRP)水平。简而言之，血清样品中存在的CR与已经吸附至聚苯乙烯微量滴定孔的表面的抗CRP抗体反应。在通过洗涤除去未结合的血清蛋白后，添加与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗CRP抗体。这些酶标记的抗体与先前结合的血清CRP形成复合物。在另一个洗涤步骤后，通过添加生色底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)测定与免疫吸附物结合的酶。结合的酶的量直接随检测样品中CRP的浓度变化；因而，在450nm处的吸光度是检测样品中CRP浓度的量度。可以从标准曲线内推出检验样品中CRP的量，所述的标准曲线从标准物构建，并对血清稀释度进行校正。
使用Quantikine小鼠瘦蛋白免疫测定法(R&D Systems；Minneapolis，MN)测定血清中的小鼠瘦蛋白水平。简而言之，Quantikine小鼠瘦蛋白免疫测定法使用定量夹心酶免疫测定技术。微量平板用亲和纯化的小鼠瘦蛋白特异性多克隆抗体预包被。将标准物、对照和样品吸取至各孔中，并且存在的任何小鼠瘦蛋白被固定的抗体结合。洗去任何未结合的物质后，将小鼠瘦蛋白特异性酶联多克隆抗体添加至各孔。在洗涤以除去任何未结合的抗体-酶试剂后，将底物溶液添加至各孔。酶反应产生添加终止液时变黄的蓝色产物。测量到的颜色强度与初始步骤中结合的小鼠瘦蛋白的量成比例。随后从标准曲线读出样品值。
使用Aβ1-40比色免疫测定试剂盒(Invitrogen；Carlsbad，CA)测定人Aβ1-40血清水平。简而言之，人类β淀粉状蛋白(Hu Aβ)NH2末端特异性单克隆抗体预包被到微量滴定板条的孔上。在第一次孵育期间，吸取已知Hu Aβ含量的标准物、对照和未知样品到孔中，并且与对1-40Aβ序列COOH末端特异性兔抗体共孵育。这个COOH末端序列在剪切所分析的前体时产生。通过使用辣根过氧化物酶标记的抗兔抗体检测结合的兔抗体。在洗涤后，添加辣根过氧化物酶标记的抗兔抗体(酶)。在第二次孵育和洗涤以除去全部结合的酶后，添加底物溶液，其中，所述底物溶液被结合的酶作用以产生颜色。这种有色产物的强度直接与原始标本中存在的Hu Aβ40的浓度成比例。
1.1(e).组织收集、加工、提取和免疫测定法
在尸体剖检时，将脑取出并沿中线分成两半。将一半在干冰上冷冻，并且另一半浸没固定在10％中性缓冲福尔马林中并在石蜡中处理。
1.1(e)(i)免疫化学
将石蜡块中的脑横穿海马矢状地连续切片(50μm)，并使用4G8(其识别Aβ内的第17-24位氨基酸节段)作为第一抗体进行免疫染色。洗涤后，将山羊抗小鼠第二抗体在室温孵育额外的30分钟，并且切片用抗生物素蛋白-生物素-HRP复合物(Vectastain Elite ABC试剂盒，Vector，Burlingame，CA)和H2O2中的四盐酸二氨基联苯胺(DAB)显影。Aβ沉积的量化用蔡司Axiocam(Munchen-Hallbergmoss，德国)和兼容性图像分析软件Axiovision(Carl Zeiss Vision GmbH，Munchen-Hallbergmoss，德国)进行。将每只动物的Aβ沉积量化。简而言之，使用5倍物镜，手工选择包括完整海马的单个视野并且将阳性染色表达为横跨该视野的染色面积百分数。将从每只动物全部切片获得的值平均。对切片分析斑数目、斑大小和淀粉状蛋白积存量，其中，所述的淀粉状蛋白积存量定义为被所述抗体染色的面积的百分数。
1.1(e)(i)免疫印迹
将冷冻的脑样品称重、用手术刀切碎，并且随后转移至等体积的10％PBS(pH 7.4)。使用杜恩斯匀浆器将组织搅匀，并且以1克组织/10mL提取试剂的比率，使用补充有蛋白酶/磷酸酶抑制剂(Pierce)的T-PER组织提取试剂(Pierce)提取蛋白质。样品以10,000转/分钟短暂离心5分钟，并将上清液转移至新管。将DNA酶(Pierce)添加至每份样品，并且在37℃孵育30分钟。用Coomassie(Bradford)蛋白质分析试剂盒(Pierce)测定总蛋白，并且通过免疫印迹法分析样品(25μg)。除tau-pSer396、总tau(全部为1∶500)及PHF-tau AT8(1∶200)之外的全部第一抗体和第二抗体分别以最终稀释度1∶10,000使用。
1.1(f)行为评估
在处理4周和8周后对建立的认知表现量度进行行为试验。
1.1(f)(i)痕迹恐惧条件化
情境性和线索恐惧(cued fear)条件化试验测量记住不快(条件化)刺激和将其与某种环境(情境)联系的能力。通常认为情境性恐惧条件化是具有海马依赖性的学习形式，而通常认为线索恐惧条件化是海马非依赖性的。该方案实施2日。
第1日-训练：在第1日，允许动物在居室(Med Associates，Burlington，VT)中习惯2分，并且随后向其提供白噪声(80dB)，持续30秒，将这种刺激命名为条件性刺激(CS)。在2秒间隔后，对动物施用0.5mA电击；将这种刺激命名为非件性刺激(US)。该过程重复4次。
第2日-情境/改变的情境/线索测验：训练后24小时，将动物放回原来的居室，并且在5分钟期间评定僵直发作(freezing bout)以确定US与情境的(情境)联系。使用设定在5分钟内收集30个观察结果的适宜软件(Med Associates，Burlington VT)，自动测量僵直。在测量情境性僵直后，将动物返回它们的居住笼，保持1小时。调整居室环境(新的墙壁、地板和气味线索)，并且将动物引入“新”的居室，保持6分钟。将僵直率如情境试验中所述在CS(改变的情境)不存在的情况下量化3分钟。对于剩余3分钟，向动物提供在改变情境下的CS，并且如先前所述评定其僵直行为以确定线索恐惧条件化评分。
1.1(f)(ii)新物体识别
新物体识别试验在一个多旷场箱(multiple open-fieldbox)(20”×20”×17”×4)(San Diego Instruments，San Diego，CA)中实施。在训练前，通过允许小鼠在测试之前当日探索旷场盒5分钟，使小鼠各自习惯。在训练时间期间，将两个相同的新物体彼此相距16”安置到该旷场中，并且允许动物探索10分钟。当动物头部距离1/2cm面对该物体或触及该物体时，视为探索该物体。如果动物使用该物体作为探索环境的支撑物，则不将此视为探索。记录每只动物探索每个物体花费的时间。训练后立即将动物返回其居住笼。训练后1小时，将动物再引导至含有一个新物体和一个先前探索过的物体的旷场。这些物体具有相似的探索性水平/物理复杂度(即，如果旧物体具有一个洞，则新物体也具有一个洞)和相似的大小。在停留试验期间，将动物引导至旷场盒中，并允许其自由探索5分钟。除直立和刷毛的频度和持续时间之外，还记录对两个物体所花费的时间和花费的频度。在每个时间段后，旷场盒和物体用70％乙醇彻底清洁以避免任何本能气味。用区分指数(对新物体花费的总时间/物体探索总时间)测量识别记忆。
1.1(g)统计分析
用方差分析和Tukey-Kramer多重比较检验进行统计数据分析。使用UN-SCAN-IT gel 6.1软件(Silk Scientific；Orem，UT)进行光密度分析。p＜0.05视为统计显著。
实施例1.2瘦蛋白施用对胰岛素和促炎蛋白的影响
第一组研究检验TgCRND8小鼠血清中可检测的瘦蛋白水平。图1显示瘦蛋白、胰岛素和CRP在CRND8小鼠和野生型小鼠中的血清浓度(ng/ml)的柱形图，其中通过ELISA评估来自瘦蛋白处理或盐水处理的CRND8小鼠或野生型小鼠的血清中的所述血清浓度。与盐水处理的动物(左，深灰色柱形)相比，瘦蛋白处理的转基因动物显示显著(p＜0.05)升高的瘦蛋白水平(图1A；左，浅灰色柱形)。盐水处理的TgCRND8中可检测的水平与野生型(wt)同窝仔鼠(右侧柱形)相容。在瘦蛋白处理或盐水处理的小鼠中观察到的胰岛素水平不存在显著差异(图1B)。
C反应蛋白(CRP)(一种水平在体内出现炎症过程的期间大幅上升的蛋白质)充当炎症的生物标志物。在瘦蛋白处理或盐水处理的动物中观察到的CRP水平不存在可检测的差异(图1C)。这些结果与采用不应答瘦蛋白处理而变化的其他炎性蛋白(尤其是TNFα和皮质醇)(数据未显示)的研究结果相似。
实施例1.3脑中受瘦蛋白施用调节的途径
通常认为瘦蛋白的受体后结合作用触发JAK/STAT途径以通过激活中枢和外周组织中的Janus酪氨酸激酶2(JAK2)、信号转导和激活蛋白3(STAT3)以及细胞因子信号传导3(SOC3)抑制基因而诱导基因转录变化。研究了瘦蛋白在瘦蛋白处理和盐水处理的小鼠的脑中的水平，并且检验瘦蛋白的推定性下游效应物，尤其是SOCS3和过氧化物酶体增殖剂激活受体-γ(PPARγ)。
图2显示来自瘦蛋白处理或盐水处理的CRND8小鼠或野生型(wt)小鼠的脑的瘦蛋白、OB-R(长)、SOCS3、PPARγ和α-微管蛋白的免疫印迹。将膜剥离并用α-微管蛋白抗体再探测以归一化。显示了代表性印迹(n＝3)。归一化的条带由光密度测定法分析并且表达为平均密度±SD。*相对于类似盐水处理。与盐水处理相比，瘦蛋白水平在瘦蛋白处理的动物的脑中显著(p＜0.05)更高(图2A，顶行；图2B，浅灰色柱形)。与对照相比，瘦蛋白受体长同工型(OB-R)在瘦蛋白处理的脑中的表达不存在显著变化(图2A，第二行；图2C)。SOCS3在瘦蛋白处理的TgCRND8动物中的表达(图2A，第三行)存在非显著性增加(p＞0.05)(图2D)。
PPARγ，一种已知调节β-分泌酶(BACE)的转录因子，是淀粉状前体蛋白(APP)加工中的关键酶，并且通常认为它参与调节瘦蛋白的作用。与对照相比，瘦蛋白处理的转基因动物显示PPARγ水平显著(p＜0.05)增加(图2A，第四行；图2E，浅灰色柱形)。
实施例1.4瘦蛋白处理的TgCRND8小鼠中的Aβ水平和斑沉积
Aβ以斑形式的胞外积聚是AD的标识性病理特征，并且沉积的量取决于其产生、分泌、聚集和清除的速率。
TgCRND8小鼠过量表达含有瑞典(K670N和M671L)和印地安那(V717F)家族性AD(FAD)突变的人类APP基因。前述的瘦蛋白处理在10月龄时启动，此时总脑Aβ水平一般开始上升并且截至12月龄结束，就在此时首次Aβ沉积物出现于Tg2576小鼠中。在采用TgCRND8小鼠的这些研究中，整个处理(4月龄至6月龄)在约3月龄开始的后斑时间期间进行。
图3显示CRND8小鼠和野生型小鼠中APP C端片段(CTF)和可溶性Aβ1-40的表达。在(A)中，从瘦蛋白处理或盐水处理的CRND8小鼠或野生型小鼠收获脑，并且通过免疫印迹法确定APP CTF(C99、C83)的表达。将膜剥离并用α-微管蛋白抗体再探测以归一化。显示了代表性印迹，n＝3。在(B)中，归一化的条带(C99/C83与总CTF/α-微管蛋白之比)由光密度测定法分析并且表达为平均密度±SD。在(C)中，通过ELISA确定在瘦蛋白处理或盐水处理的CRND8小鼠或野生型小鼠的脑或(D)血清中存在的可溶性Aβ1-40的水平。将可溶性脑Aβ1-40的水平对可溶性脑蛋白的总量归一化。结果表达为平均浓度(脑-pg/mg总蛋白，n＝5；血清-pg/ml，n＝10)±SD。*相对于盐水处理的TgCRND8细胞。在瘦蛋白处理的TgCRND8小鼠的脑(图3A，灰色柱形)和血清(图3B，灰色柱形)中均发现Aβ1-40水平显著(p＜0.05)降低。
对瘦蛋白处理进行研究以确定所述瘦蛋白处理是否改变了脑APP加工成APP的C99C端片段(CTF)，所述的C99C端片段因BACE的作用而衍生并且是Aβ的直接前体(图3C)，或加工成APP的C83CTF，所述的C83CTF是因α-分泌酶的作用而衍生的非促淀粉状变产物。相对于盐水处理的对照，在瘦蛋白处理的动物中观察到C99片段至C83种类(图3D，顶部图)与总CTF(底部图)之比的显著(p＜0.05)降低。这与瘦蛋白参与调节BACE活性相一致。
图4显示瘦蛋白处理的TgCRND8小鼠中的淀粉状蛋白斑沉积。在(A)中，脑切片用4G8抗体在海马区域中染色；Le-用瘦蛋白处理的转基因动物；Sa-用盐水处理的转基因动物。在(B)中，柱形代表蛋白斑的平均大小(μmm2)±S.E.M.或在(C)中该区域中染色的面积的百分数±S.E.M.；n＝8-9/柱形。D.用4G8抗体的染色皮质区。
石蜡包埋的脑切片的免疫化学检验(图4)揭示与年龄和性别匹配的盐水处理的转基因小鼠相比，瘦蛋白处理8周显著地(p＜0.05)减少6月龄TgCRND8小鼠的海马(图4A)中的淀粉状蛋白积存量。海马是功能性(OB-Rb)瘦蛋白受体特别丰富的区域。海马中显著减少的淀粉状蛋白积存量(量化为用4G8抗体染色的面积的百分数)平行于蛋白斑平均大小的减少(图4B和图4C)；该区域中斑的总数存在非显著性变化(数据未显示)。对其他脑区域如皮层(图4D)的检验表明了相似的染色模式。
实施例1.5瘦蛋白处理的转基因动物显示减少的Tau磷酸化
神经原纤维缠结(NFT)是高度磷酸化的Tau蛋白的神经元内聚集物，其与AD中的认知丧失密切相关。通常认为tau蛋白的异常磷酸化导致微管功能破坏、异常的蛋白质运输、NFT形成和最终的神经元死亡。
TgCRND8小鼠或Tg2576小鼠不形成NFT；一些研究已经报道Tg2576小鼠中脑tau磷酸化增加。评估了瘦蛋白处理或盐水处理的转基因小鼠或野生型(wt)小鼠的脑中的磷酸-tau水平。图5显示TgCRND8小鼠脑和野生型小鼠脑中AD相关的tau磷酸化。在A中，从瘦蛋白处理或盐水处理的CRND8小鼠或野生型小鼠收获脑，并且通过免疫印迹法确定在(B)Ser396、(C)PHF-1(Ser396/404)、(D)AT8(Ser202/204)和(E)Ser181处的tau磷酸化。将膜剥离并用总tau抗体再探测以归一化。显示了代表性印迹，n＝3。归一化的条带由光密度测定法分析并且表达为平均密度±SD。*相对于盐水处理的CRND8小鼠。
盐水处理的转基因小鼠在全部所检验的表位处表达相对高水平的磷酸-tau(图5A；图5B-5E，左侧深灰色柱形)。相对于野生型动物脑中观察到的水平(右侧柱形)，瘦蛋白处理显著地(p＜0.05)减少在每个AD相关表位处的磷酸-tau(左侧浅灰色柱形)。这些结果显示tau在TgCRND8小鼠中过度磷酸化。
实施例1.6用瘦蛋白处理的TgCRND8小鼠的行为改善
1.6(i)新物体识别
在4周和8周处理时间后，在新物体识别试验中测试3个组的动物：a)用瘦蛋白处理的TgCRND8、b)用盐水处理的TgCRND8和c)用盐水处理的野生型。
图6显示CRND8小鼠和野生型小鼠的认知评估结果。在新物体识别试验(A)中，将野生型和瘦蛋白处理或盐水处理4周或8周的转基因小鼠中的工作记忆评定为探索熟悉物体相对于探索新物体所花费的时间。虚线表明动物记住(超过1/2的在两个物体之间所花费的总时间用在新物体上)；低于该线的任何数字显示记忆损伤。*对于Tg-瘦蛋白与Tg-盐水，p＝0.01；*对于Tg-盐水与WT，p＝0.003。在恐惧条件化试验(B)中，使用嫌恶性学习任务来测量野生型和瘦蛋白处理或盐水处理的转基因小鼠中对不快刺激的恐惧应答。在针对情境性恐惧条件化的几次训练时间(轻微足部电击)之前和之后的原始居室中或在含有与足部电击先前配对的听觉线索的新环境中量化僵直。情境：*对于WT与Tg+瘦蛋白，p＝0.009；*对于WT相对于Tg+盐水，p＝0.0001；线索：*对于WT相对于Tg+瘦蛋白，p＝0.012；*对于WT相对于Tg+盐水，p＝0.0001；*对于Tg+瘦蛋白相对于Tg+盐水，p＝0.04。
与用盐水处理的转基因动物相比，瘦蛋白处理的TgCRND8小鼠和野生型小鼠对新物体花费统计上(p＜0.05)更多的时间(图6A)。这表明与盐水处理的TgCRND8相比，瘦蛋白处理4-8周后TgCRND8小鼠的工作记忆表现存在改善。瘦蛋白处理的转基因动物在该试验中与野生型小鼠不可区分，同时与其他两个组相比，盐水处理的TgCRND8小鼠表现很差(图6A)。因而，1-2月长期瘦蛋白处理消除了6月龄TgCRND8小鼠在这项认知任务中受损的表现。
1.6(ii)恐惧条件化(FC)
在这项试验中，使用嫌恶性训练室以在重复配对CS(听觉线索)和US(轻微足部电击)后训练并测量情境性和线索恐惧相关记忆。将动物在训练后置于原始居室中24小时以测验情境性恐惧条件化或置于CS存在下的新环境中以测验线索恐惧条件化。如图6B中所示(其中x轴代表僵直时间％)，与盐水处理的动物相比，TgCRND8小鼠在瘦蛋白处理8周后在情境性恐惧条件化试验中表现更好。这一研究结果接近统计显著性(p＜0.06)。此外，瘦蛋白处理导致线索恐惧条件化的表现统计显著(p＜0.05)地改善。在改变的情境和低僵直应答下测验时不存在统计显著性(数据未显示)，这表明动物未识别改变的情境。
1.7.总结：
所述结果显示，与盐水对照相比，使用转基因CRND8小鼠模型系统时长期瘦蛋白处理对AD样病理生物学和认知下降的影响。发现瘦蛋白处理的动物具有脑和血清中均降低的Aβ1-40水平。在脑中，观察到APP经淀粉状蛋白生成途径的加工减少。另外，瘦蛋白处理的动物显示出海马中的淀粉状蛋白积存量明显减少，这与4G8染色的淀粉状蛋白斑的平均大小(但非数目)减少有关(图4)。尽管脑提取物中总溶解的Aβ1-40的量明显下降(瘦蛋白处理8周后去垢剂可提取的Aβ1-40减少52％)，但是皮层区域受该处理影响较少。
与盐水处理相比，瘦蛋白未明显改变CRP(图1C)、TNFα或皮质醇(数据未显示)的水平。
通常认为瘦蛋白与SOCS3(一种在延长的受体(OB-R)激活后抑制Jak2/STAT3信号传导的负向细胞因子调节物)一起形成反馈环。SOCS信号传导的过量激活可能导致炎症途径延长的阻遏作用并且因而增加免疫抑制风险。瘦蛋白处理的TgCRND8动物和野生型动物未显示升高的SOC3表达(图2D)，这表明长期施用瘦蛋白不大可能导致免疫缺陷。
PPARγ是瘦蛋白信号传导的下游靶。瘦蛋白处理的转基因小鼠显示出PPARγ表达大的增加(图2E)。瘦蛋白处理的TgCRND8小鼠显示脑和血清中均降低的促淀粉状变的C99APP片段水平和Aβ1-40水平(图3)。
TgCRND8小鼠的瘦蛋白处理明显地降低在全部所检验表位处的磷酸-tau水平(图5)。通常认为在表达APP的转基因小鼠中tau的过度磷酸化(但不是tau寡聚化)的诱导是常见的。
与盐水处理的同窝仔鼠相比，瘦蛋白处理的TgCRND8小鼠在新物体识别试验和恐惧条件化试验中显示出改善的认知表现(图6)。在瘦蛋白处理的转基因小鼠的海马中发现减少的淀粉状蛋白载量(图4A)。
本公开内容显示了瘦蛋白的(i)改良AD样病理途径的能力；和(ii)逆转或防止TgCRND8小鼠认知衰退的功效。瘦蛋白处理与炎症无关。
实施例2
2.1.材料与方法
2.1(a).培养基
极限必需培养基(MEM)从ATCC(Manassas，VA)购买。神经元基础(Neurobasal)培养基、B27补充物和L-谷氨酰胺从Gibco(Carlsbad，CA)购买。胰蛋白酶-EDTA和青霉素溶液从MP Biomedicals(Solon，Ohio)购买。胎牛血清(FBS)、全反式视黄酸(RA)和人重组瘦蛋白从Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)购买。5-氨基咪唑-4-羧基酰胺核糖核苷(AICAR)从Cell Signaling Technology(Danvers，MA)购买。肉豆蔻酰化-AIP(Myr-AIP)(CaM激酶II抑制剂-1μM)从BiomolInternational(Plymouth Meeting，PA)购买。化合物C(AMPK抑制剂-1μM)、D-赤型-鞘氨醇、N-乙酰-(C2神经酰胺)(PP2A激活剂-1μM)、氯化锂(LiCl)(GSK-3β抑制剂-10mM)、N4-(6-氨基嘧啶-4-基)-磺胺、HCl(N6A4S)(CDK5抑制剂-2μM)、呋喃基-硝基氨基胍(FNG)(ERK抑制剂-20μM)、蒽[1，9-co]吡唑-6(2H)-酮，1，9-吡唑蒽酮(SP600125)(JNK抑制剂-100nM)、KT5720(PKA抑制剂-100nM)、2-羟基-4-(((4-甲基苯基)磺酰氧)乙酰)氨基)-苯甲酸(S3I-201)(STAT3抑制剂-100μM)、5-(2，2-二氟-苯并[1，3]二氧杂环戊烯-5-基亚甲基)-噻唑烷-2，4-二酮(522DB13D)(PI3K抑制剂-20μM)、lL6-羟甲基-手性-肌醇-2-(R)-2-O-甲基-3-O-十八烷基-sn-甘油碳酸酯(1L6HCI)(Akt抑制剂-5μM)、2-(4-氯苯基)-4-(4-氟苯基)-5-吡啶-4-基-1，2-二氢吡唑-3-酮(24C44F5P)(p38MAP激酶抑制剂-100nM)和H-Trp-Glu-OH(G3335)(PPARy拮抗剂-30μM)从EMD Chemicals(Gibbstown，NJ)购买。对全部抑制剂或激活剂所用的终浓度和孵育时间基于先前报道(例如，见Ishida，A.，和Fujisawa，H.(1995)J.Biol.Chem.，270：2163-2170；Zhou，G.，等人(2001)J.Clin.Invest.，108：1167-1174；Ballou，L.，等人(1992)J.Biol.Chem.，267：20044-20050；Klein，P.S.，和Melton，D.A.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：8455-8459；Clare，P.，等人(2001)J.Biol.Chem.，276：48292-48299；Chen，F.，等人(2006)Bioorg.Med.Chem.Lett.，16：6281-6287；Han，Z.，等人(2001)J.Clin.Invest.，108：73-81；Kase，H.，等人(1987)Biochem.Biophys.Res.Commuti，142：436-440；Siddiquee，K.，等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，104：7391-7396；Bilancio，A.，等人(2006)Blood，107：642-650；Hu，Y.，等人(2000)J.Med.Chem.，43：3045-3051；de Laszlo，S.E.，等人，(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.，8：2689-2694；Ye，F.，等人，(2006)Chembiocem.，7：74-82)。这些文献中每篇文献的内容通过引用的方式并入本文中。
2.1(b).抗体
兔抗-Akt(pSer473)、-Jak2 pTyr1007/1008、-AMPKα(pThr172)、GSK-3β(pSer9)、-CaMKII(pThr286)、-PKA(pThr197)、-PPARγ(81B8)、p38 MAPK(pThr180/Tyr182)(28B10)mAb、tau(pSer396)mAb和tau(tau46)mAb从Cell Signaling购买。PHF-tau mAb(克隆AT8)从PierceBiotechnology(Rockford，IL)购买。PHF-1mAb是来自阿尔伯特爱因斯坦医学院Peter Davies(Bronx，NY)博士的馈赠。抗Alzheimer前体蛋白(APP)643-695mAb从Millipore(Billerica，MA)购买。兔抗-tau(pThr181)从Sigma-Aldrich购买。兔抗-α-微管蛋白mAb从AffinityBioReagents(Golden，CO)购买。
2.1(c).细胞系的培养和神经元诱导
人成神经细胞瘤、SH-SY5Y和IMR-32细胞系从ATCC购买。细胞培养根据生产商的具体指导进行。简单而言，在含有10％FBS的MEM中增殖细胞直至80-90％汇合度，随后通过胰蛋白酶-EDTA使之脱离培养瓶并以1∶5的比率传代培养。
为了神经元分化，将1×106个SY5Y或IMR-32细胞在由补充有10μM RA的含有2％FBS的MEM组成的神经元诱导培养基(NIM)中培育。细胞在NIM中孵育6日，并在处理前转换为无血清的NIM并且在第7日收获。
2.1(d).大鼠原代神经元的培养
原代大鼠皮质神经元从BrainBits LLC(Sprinfield，IL)购买，并且根据制造商的说明书进行培养。简单而言，将组织分散，并且将上清液转移到一个新的管中并以1100转/分钟离心1分钟。将神经元随后接种在用多聚-D-赖氨酸包被的Ewell平板(BD Biosciences；San Jose，CA)中，并且在补充有B27和0.5mM L-谷氨酰胺的神经元基础培养基中培育。在4日后更换培养基，并且在培养的第7日，如下所述处理神经元并收获。
2.1(d).蛋白质提取和免疫印迹
除非另外指明，神经元细胞用瘦蛋白(1600ng/ml)处理4小时或用AICAR(2mM)或特异性抑制剂处理1小时，并且随后通过刮取法收获。将细胞沉淀物重悬于补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的1X放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解/提取缓冲液(Pierce)中，并且随后进行干冰/乙醇浴中的冻/融循环。总蛋白用考马斯(Bradford)蛋白质分析试剂盒(Pierce)测定。使用10％或4-20％tris-甘氨酸SDS-PAGE预铸凝胶(Lonza；Rockland，ME)，通过免疫印迹法分析全细胞提取物(25μg)，并且将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore)上。膜在4℃与第一抗体孵育过夜，并且随后在次日用HRP-缀合的第二IgG检测。除tau-pSer396、总tau、APP(全部为1∶500)及PHF-tau AT8(1∶200)之外的全部第一抗体和第二抗体分别以最终稀释度1∶1,000和1∶10,000使用。HRP用SuperSignalWest Pico化学发光底物(Pierce)显影，并且使用BioRad(Hercules，CA)ChemiDoc XRS系统成像。用Restore PLUS Western Blot剥离缓冲液(Pierce)剥离膜以便用其他抗体再探测。
2.1(e).GSK-3β过量表达和敲减
为敲减糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)，使用TranslT-TKO转染试剂(Minis；Madison，WI)，50nM SignalSilence GSK-3βsiRNA(CellSignaling)瞬时转染分化的SY5Y48小时。简而言之，在转染前大约24小时，按适宜的细胞密度铺种细胞以在次日获得约60-80％的汇合度(24-孔平板每孔3×104至1.2×105个细胞，这取决于细胞大小和特征)。将贴壁细胞铺种于每孔500μl的完全生长培养基中并孵育过夜。可选地，对于悬浮下的细胞，在紧邻转染前，将细胞在每孔0.25ml的完全生长培养基中以适宜密度铺种以在转染时获得约60-80％的汇合度(每孔3-5×105个细胞)。可选地，细胞可以在转染前当日铺种以在转染时获得约60-80％的汇合度(每孔1.5-2.5×105个细胞)。在无菌的塑料管中，添加50μl无血清培养基。随后将TranslT-TKO转染试剂直接添加(每孔1-4μl)到无血清培养基中，将该悬浮液通过吸取或涡旋充分混合，并且在室温孵育5至20分钟。将siRNA(其处于使得孔内的终浓度是约25nM的浓度)添加至稀释的TransIT-TKO试剂，通过吸取柔和地混合，随后在室温孵育5至20分钟。对于贴壁细胞类型，通过移走约250μl(一半)最初的铺板培养基，将孔中的体积调节至250μl完全生长培养基。将TranlT-TKO试剂/siRNA复合混合物逐滴添加至细胞。通过柔和地来回且从一边到一边(无旋转)摇动该平皿，使复合物均匀地分布至平皿，随后孵育24至72小时。随后对细胞分析靶基因表达的敲减。使用以50nM SignalSilence Control siRNA(荧光素缀合物)(Cell Signaling)转染的细胞作为阴性对照并用于测量转染效率。
为了GSK-3β过量表达，使用TurboFectin 8.0转染试剂(OriGene)，根据制造商的具体说明，将分化的SY5Y用2μg含有GSK-3β全长cDNA序列(登录号NM 002093.2)(OriGene；Rockville，MD)的表达载体(pCMV6-XL4)瞬时转染48小时。简而言之，在暴露于表达载体前，将所述转染试剂添加至细胞培养基。用2μg空白pCMV6-XL4(OriGene)转染的细胞充当阴性对照。
转染后，收获细胞并且通过免疫印迹法证实GSK3β的敲减或过量表达。
2.1(f).GSK-3β和β淀粉状蛋白(1-40)量化
根据制造商的具体说明，分别使用PhosphoDetectGSK-3β(pSer9)ELISA试剂盒(EMD Chemicals)和人类β淀粉状蛋白1-40比色免疫测定试剂盒(Invitrogen；Carlsbad，CA)，测定细胞提取物中的GSK-3β水平和细胞培养基中的Aβ(1-40)水平。从标准曲线计算GSK-3β水平和Aβ(1-40)水平，所述的标准曲线用450nm处OD的对浓度已知的8份连续稀释物形成。
2.1(g).统计分析
用方差分析和Tukey-Kramer多重比较检验进行统计数据分析。使用UN-SCAN-IT gel 6.1软件(Silk Scientific；Orem，UT)进行光密度分析。p＜0.05视为统计显著。
实施例2.2调节分化的SY5Y中的tau磷酸化
研究已经显示在人成神经细胞瘤SY5Y细胞中AD相关部位处的Tau磷酸化伴随RA-诱导的分化(RA-SY5Y)而增加。这些变化已经被归因于tau的绝对水平在分化期间增加，而非该蛋白质的过度磷酸化。由于这种增加的基础表达，故RA-SY5Y细胞代表一种监测人类tau磷酸化变化的便利培养系统。
研究了涉及直接磷酸化tau的激酶(图7和表1)。使用相应的特异性激酶抑制剂来处理细胞1小时(在上文2.1材料和方法中描述)，并且测量对AD相关位点处tau磷酸化的影响。为了比较，细胞用C2神经酰胺(一种不明显影响磷酸-tau水平的蛋白磷酸酶2A(PP2A)激活剂)处理1小时(图7和表1)。
图7显示RA-SY5Y中对tau磷酸化的酶促调节。RA-SY5Y与PP2A激活剂、C2神经酰胺或不同的激酶抑制剂孵育1小时，或不作处理(运载体)，并测量多个位点处的tau磷酸化。用瘦蛋白(1600ng/ml)或AICAR(2mM)的处理充当阳性对照。制备并且通过免疫印迹法用磷酸化tau特异性抗体(pSer396、PHF-1、AT8或pSer181)分析全细胞裂解物。将膜剥离并用总tau抗体再探测以归一化。显示了代表性印迹(n＝3)。表1中提供了半定量条带密度分析结果。通过光密度测定法分析来自图7的归一化条带，并且相对于任意赋予值0的运载体，结果在表1中表达为平均±SD倍数变化百分数；相对于运载体。
表1.通过激酶/磷酸酶调节RA-SY5Y中的tau磷酸化
Figure BPA00001391223901061
其中
Figure BPA00001391223901062
＝激酶抑制剂。
结果显示与对照(运载体处理的细胞)相比，对钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)(Myr-AIP)、蛋白激酶A(PKA)(KT5720)或GSK-3β(LiCl)的抑制导致多个位点处tau磷酸化的极为显著(p＜0.05)减少(图7和表1)。用瘦蛋白(1600ng/ml，4小时)或AICAR(2mM，1小时)的处理减少tau磷酸化，因此纳入作为阳性对照。
图14显示因多重激酶抑制作用而减少的tau磷酸化。RASY5Y与单独或各种组合下的CaMKII、PKA或GSK-3β抑制剂孵育1小时或未处理(运载体)，并且测量tau的磷酸化。制备并且通过免疫印迹法用磷酸化tau特异性抗体(pSer396)分析全细胞裂解物。将膜剥离并用总tau抗体再探测以归一化。显示了代表性印迹，n＝3。通过光密度测定法分析归一化的条带，并且相对于任意赋予值0的未处理样品，结果表达为平均±SD倍数变化百分数；*相对于未处理(运载体)；**相对于用任何单独的激酶抑制剂处理。图14显示与任一种抑制剂单独相比，利用CaMKII-、PKA-和GSK-3β特异性抑制剂的联合作用产生了减少tau磷酸化的协同效应。
这些数据表明tau是许多激酶的底物。
研究了瘦蛋白和/或AICAR对这些激酶中任何激酶的磷酸化状态的影响。一般而言，这些激酶的磷酸化导致再折叠，并且这触发活性的改变。图8显示瘦蛋白和AICAR对RA-SY5Y中tau特异性激酶活化的影响。RA-SY5Y用瘦蛋白(1600ng/ml)、AICAR(2mM)处理或未处理(运载体)，通过免疫印迹法测量(A)CaMKII(pThr286)、(B)PKA(pThr197)和(C)GSK-3β(pSer9)的磷酸化。将膜剥离并用(A，B)α-微管蛋白(C)或总GSK-3β抗体再探测以归一化。显示了代表性印迹，n＝3。通过光密度测定法分析归一化的条带，并且相对于任意赋予值为O.D.的未处理样品，结果表达为平均±SD倍数变化百分数。制备全细胞裂解物并且通过ELISA分析GSK-3β(pSer9)。细胞与GSK-3β抑制剂LiCl(10mM)孵育1小时，充当阳性对照。相对于任意赋予值0的未处理样品，结果(n＝3)表达为归一化的平均GSK-3β(pSer9)浓度(单位/mg总蛋白)±SD。*相对于未处理(运载体)。
通常认为tau磷酸化因而会受影响。通常，磷酸化增加所研究激酶的活性，GSK-3β例外，它被抑制。与未处理的细胞相比，用瘦蛋白或AICAR处理的RA-SY5Y没有显著(p＞0.05)改变CaMKII的磷酸化(图8A)，并且仅瘦蛋白能够显著地(p＜0.05)增加PKA磷酸化(图8B，中间柱形)。然而，与对照相比，两种处理均显著地(p＜0.05)增加在Ser9处的GSK-3β磷酸化(图8C，白色柱形)。这些研究结果被ELISA证实，所述的ELISA显示出由瘦蛋白(图8D，左起第二柱形)和AICAR(右起第二柱形)诱导的GSK-3β(pSer9)的量显著(p＜0.05)增加。这种增加处于/或高于用LiCl(一种已知GSK-3β抑制剂)(最右边的柱形)所观察到的水平。因而，瘦蛋白似乎通过抑制GSK-3β减少tau的磷酸化。
实施例2.3瘦蛋白和AICAR通过GSK-3β调节Tau磷酸化
重复以上实验，同时调节GSK-3β活性以确定瘦蛋白和/或AICAR是否要求GSK-3β来调节tau的磷酸化。用酶抑制剂或siRNA技术阻断GSK-3β活性。图9显示瘦蛋白和AICAR借助GSK-3β依赖性机制调节tau磷酸化。(A)RA-SY5Y用GSK-3β-特异性siRNA瞬时转染或未转染(泳道(1))，并且稍后用瘦蛋白(1600ng/ml-泳道4)、AICAR(2mM-泳道5)处理或未处理(运载体-泳道3)。以荧光素缀合的对照siRNA(泳道2)转染的细胞用来评估转染效率并且充当阴性对照。制备并且通过免疫印迹法用GSK-3β-特异性抗体(分图I)或磷酸化tau-特异性抗体(pSer396、PHF-1、AT8或pSer181；分图II)分析全细胞裂解物。将膜剥离并用总GSK-3β抗体(分图I)或总tau抗体(分图II)再探测以归一化。显示了代表性印迹(n＝3)。通过光密度测定法分析归一化的tau条带，并且相对于任意赋予值0的阴性对照样品，结果(分图III-IV)表达为平均±SD倍数变化百分数。(B)RA-SY5Y用GSK-3β全长cDNA表达载体瞬时转染或未转染(泳道1)，并且稍后用瘦蛋白(1600ng/ml-泳道4)、AICAR(2mM-泳道5)处理或未处理(运载体-泳道3)。用空表达载体转染的细胞(泳道2)充当阴性对照。如A中那样制备全细胞裂解物、分析并且归一化。结果(n＝3)如A中那样表述。*相对于阴性对照(泳道2)；**相对于用运载体处理的过量表达GSK-3β的细胞(泳道3)。
使用带有增加活性的强启动子(图9)的哺乳动物表达载体，在神经元细胞中过量表达GSK-3β。具体而言，RA-SY5Y细胞用GSK-3β特异性siRNA瞬时转染并且随后用瘦蛋白、AICAR或运载体处理(图9A)。这些细胞与用对照siRNA转染的细胞或与不作转染的细胞比较。对细胞分析总GSK-3β(有活性形式与无活性形式)表达和磷酸化的GSK-3β(无活性形式)以证实特定蛋白质的敲减(图9A，分图I)及其对激酶活性的影响，如不同形式的磷酸化tau的水平所度量(图9A，分图II-IV)。与对照(泳道1-2)相比，GSK-3β敲减(分图I，泳道3-5)显示tau磷酸化在全部位点处显著(p＜0.05)减少(分图II-IV，泳道3-5)。在瘦蛋白存在(但是AICAR不存在)的情况下，残余GSK-3β在敲减后增加的磷酸化(分图I，泳道4)与pSer396 tau(分图I，泳道4，白色柱形)和pThr181 tau(分图II和IV，泳道4，黑色柱形)的磷酸化进一步减少相关，但这不是显著的。
通过LiCl处理消除GSK-3β活性后获得相似的结果。图15显示瘦蛋白和AICAR没有明显地减少与锂孵育的RA-SY5Y中的tau磷酸化。RA-SY5Y在瘦蛋白(1600ng/ml)、AICAR(2mM)存在的情况下或无额外处理(运载体)时与或不与锂(10mM)孵育，并且测量tau的磷酸化。制备并且通过免疫印迹法用磷酸化tau特异性抗体(pSer396)分析全细胞裂解物。将膜剥离并用总tau抗体再探测以归一化。显示了代表性印迹，n＝3。通过光密度测定法分析归一化的条带，并且相对于任意赋予值0的未处理样品，结果表达为平均±SD倍数变化百分数。
此外，采用过量表达GSK-3β的RA-SY5Y细胞的研究进一步提供对机制的深入认识(图9B)。细胞用GSK-3β表达载体瞬时转染，并且与未转染的细胞或用空载体转染的细胞(分图I，泳道1-2)相比，产生明显更高水平的相应蛋白质(分图I，泳道3)。与运载体和转染对照相比，这些细胞的瘦蛋白或AICAR处理显著地增加了GSK-3β磷酸化(pSer9)的水平(分图I，泳道4-5)。GSK-3β的过量表达与所检验的全部磷酸-tau位点的增加一致(分图II-IV，泳道3)，然而，瘦蛋白处理和AICAR处理均显著地(p＜0.05)减少这些增加(分图II-IV，泳道4-5)。这种效应可以归因于无活性的GSK-3β水平增加。
综上所述，这些研究结果表明瘦蛋白和其下游信号蛋白AMPK(通过AICAR)通过抑制GSK-3β而减少tau的磷酸化。
实施例2.4其他细胞类型中的瘦蛋白和AICAR
研究了其他神经元细胞中的瘦蛋白和AICAR。图10显示瘦蛋白和AICAR在其他神经元细胞模型中的作用。(A)人类IMR-32细胞和(B)大鼠原代皮质神经元用瘦蛋白(1600ng/ml)、用AICAR(2mM)或用运载体处理(无处理的对照)。制备并且通过免疫印迹法用磷酸化tau特异性抗体(pSer396、PHF-1、AT8或pSer191)分析全细胞裂解物。将膜剥离并用总tau抗体再探测以归一化。显示了代表性印迹(n＝3)。半定量条带密度分析结果在表2中提供。(C)IMR-32细胞如(A)中那样处理并且通过免疫印迹法测量GSK-3β(Ser9)的磷酸化。将膜剥离并用总GSK-3β抗体再探测以归一化。显示了代表性印迹(n＝3)。通过光密度测定法分析归一化的条带，并且相对于任意赋予值0的未处理样品，结果表达为平均±SD倍数变化百分数。*相对于未处理(运载体)。
RA诱导的人成神经细胞瘤IMR-32细胞(图10A)和大鼠原代皮质神经元(图10B)用瘦蛋白、AICAR处理或不作处理。再次，与运载体处理的细胞相比，瘦蛋白和AICAR诱导tau磷酸化在全部位点处显著(p＜0.05)减少(表2)。在表2中，通过光密度测定法分析来自图10的归一化条带，并且相对于任意赋予值0的运载体，结果表达为平均±SD倍数变化百分数；*相对于运载体。
表2.在处理的神经元培养物中的相对tau磷酸化
Figure BPA00001391223901101
为证实瘦蛋白和AICAR对其他模型中tau磷酸化的影响在机制上与RA-SY5Y相似(图8和图9)，在分化的IMR-32细胞中测量GSK-3β的磷酸化(图10C)。与运载体对照(灰色柱形)相比，瘦蛋白和AICAR显著地(p＜0.05)增加GSK-3β磷酸化。
这些研究结果表明如RA-SY5Y细胞中，以及还如分化的IMR-32细胞中所观察那样，瘦蛋白和AICAR一致地通过GSK-3β失活来调节tau(图10)。
实施例2.5调节Tau磷酸化的上游信号传导事件
对AMPK在GSK-3β失活过程上游的作用进行了研究；更具体地，从瘦蛋白与其受体结合导致GSK-3β失活的上游信号传导事件。图11显示瘦蛋白和AICAR借助重叠的信号传导途径调节tau磷酸化。(A)RASY5Y细胞与瘦蛋白信号传导的已知下游效应物(STAT3、AMPK、PI3K、Akt、p38)的抑制剂在瘦蛋白(1600ng/ml-泳道3-7)存在的情况下孵育或未处理(运载体-泳道1)。用单独的瘦蛋白处理的细胞充当阳性对照(泳道2)。制备并且通过免疫印迹法用磷酸化tau特异性抗体(pSer396、PHF-1、AT8或pSer181)分析全细胞裂解物。将膜剥离并用总tau抗体再探测以归一化。显示了代表性印迹，n＝3。通过光密度测定法分析归一化的条带，并且相对于任意赋予值0的未处理样品，结果表达为平均±SD倍数变化百分数。(B)通过免疫印迹法用磷酸化GSK-3β-特异性抗体分析来自(A)的全细胞裂解物，与单独的瘦蛋白相比没有明显改变tau磷酸化的那些全细胞裂解物(STAT3、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K))例外。将膜剥离并用总GSK-3β抗体再探测以归一化。结果(n＝3)如A中那样表述。(C)细胞用瘦蛋白、AICAR或运载体处理，并且通过免疫印迹法用磷酸化-特异性抗体检验参与调节tau磷酸化的信号传导分子(Jak2、AMPK、p38、Akt)的激活。将膜剥离并用α-微管蛋白抗体再探测以归一化。显示了代表性印迹，n＝3。*相对于未处理(运载体-泳道1)；**单独的瘦蛋白(泳道2)
RA-SY5Y细胞在针对已知信号蛋白的抑制剂存在或不存在的情况下用瘦蛋白处理，其中，所述的已知信号蛋白在瘦蛋白与其受体结合后激活(对于浓度，见(上文的第2.1节材料与方法)(图11A)。Tau在几个不同表位处的磷酸化再次充当实验终点。相对于用单独的瘦蛋白处理或用运载体处理的细胞做出比较。与运载体处理的对照(即，分图II，泳道4，灰色柱形)相比，AMPK、Akt(蛋白激酶B)或p38 MAP激酶的抑制剂显著地(p＜0.05)妨碍瘦蛋白减少tau磷酸化(分图I-III，泳道4、6和7)的能力，并在一些情况下增加磷酸化。在瘦蛋白不存在的情况下从用特异性抑制剂处理的细胞获得相似的数据(数据未显示)。
研究了AMPK、Akt和/或p38参与瘦蛋白介导的GSK-3β失活作用(图11B)。对AMPK、Akt或p38 MAP激酶的抑制(泳道3-5)显著地(p＜0.05)逆转瘦蛋白诱导的GSK-3β磷酸化增加(泳道2)。与运载体对照相比，在瘦蛋白不存在的情况下用特异性抑制剂处理的细胞没有显著地影响GSK-3β磷酸化(数据未显示)。
研究了瘦蛋白处理后(图11C)上述激酶的磷酸化。RA-SY5Y细胞的瘦蛋白处理导致全部所检验激酶的磷酸化(中间泳道)。对AMPK激活剂AICAR观察到相似的结果，例外是Janus激酶2(Jak2)(顶行，右侧泳道)，从而证实AMPK在信号传导级联中位于Jak2的下游。
综上所述，所述数据提供了关于将瘦蛋白与其受体结合和tau磷酸化关联的信号传导途径方面的大量信息。该途径似乎受几种主要激酶调节，所述激酶包括包括但是不限于AMPK、p38 MAP激酶、Akt和GSK-3β。
实施例2.6瘦蛋白通过AMP调节全部释放
研究了导致均受瘦蛋白调节的Aβ产生和tau磷酸化的诸途径的相互联系。
研究了过氧化物酶体增殖剂活化的受体γ(PPARγ)、p38和瘦蛋白-AMPK途径在调节Aβ释放中的作用。图12显示瘦蛋白和AICAR借助重叠的信号传导途径调节Aβ产生。(A)RA-SY5Y用瘦蛋白(1600ng/ml-泳道2)、AICAR(2mM-泳道6)和/或每种以下信号蛋白-AMPK(泳道3和7)、PPARγ(泳道4和8)或p38(泳道5和9)的抑制剂处理6小时。未处理的(运载体-泳道1)细胞或用单独的抑制剂处理的细胞(泳道10-12)充当对照。收集培养基并通过ELISA对其测定Aβ(1-40)。将结果对细胞裂解物中的总蛋白归一化，并表达为平均Aβ浓度(pg/ml)±SD。(B)RA-SY5Y用瘦蛋白、AICAR(2mM)处理或未处理(运载体)，并且通过免疫印迹法测量PPARγ的水平。将膜剥离并用α-微管蛋白抗体再探测以归一化。显示了代表性印迹，n＝3。*相对于未处理(运载体-泳道1)；**相对于单独的瘦蛋白(泳道2)；#相对于单独的AICAR(泳道6)。
在用瘦蛋白(泳道2)或AICAR(泳道6)处理的细胞中观察到可溶性Aβ显著(p＜0.05)减少。这些效果用AMPK(泳道3和7)或PPARγ(泳道4和8)抑制剂共同处理消除，但不能用p38抑制剂(泳道5和9)消除。
此外，与未处理的对照(图12B)相比，用瘦蛋白或AICAR处理6小时的细胞增加PPARγ的表达，因而证实瘦蛋白、AMPK和PPARγ之间的联系。
这些结果显示Aβ产生可以受AMPK(一种与tau磷酸化联系的能量调节物)调节。
实施例2.7Tau途径和Ali途径在AMPK的下游不重叠
研究了超出AMPK之外的瘦蛋白介导的tau途径和Aβ途径之间的重叠(图13)。图13显示瘦蛋白和AICAR信号传导途径在AMPK的下游不介导tau磷酸化和Aβ产生。(A)RA-SY5Y用单独的瘦蛋白(1600ng/ml)或在Akt抑制剂(1L6HCI)存在的情况下处理6小时。未处理的(运载体)细胞充当对照。收集培养基并通过ELISA对其测定Aβ(1-40)。将结果对细胞裂解物中的总蛋白归一化并表达为平均Aβ浓度(pg/ml)±SD。(B)RA-SY5Y用单独的瘦蛋白(1600ng/ml)或在PPARγ抑制剂(G3335)存在的情况下处理6小时。未处理的(运载体)细胞充当对照。制备并且通过免疫印迹法用磷酸化tau特异性抗体(pSer396、PHF-1、AT8或pSer181)分析全细胞裂解物。将膜剥离并用总tau抗体再探测以归一化。显示了代表性印迹，n＝3。通过光密度测定法分析归一化的条带，并且相对于任意赋予值0的未处理样品，结果表达为平均±SD倍数变化百分数。(C)描述RA-SY5Y中由瘦蛋白和AICAR激活的信号传导途径的示意图。AMPK被瘦蛋白或AICAR激活减少了Aβ产生和tau磷酸化。然而，所述信号传导途径在AMPK的下游独立地发挥作用以介导tau-或Aβ-特异性效应；*相对于未处理(运载体)。
RA-SY5Y细胞用瘦蛋白在Akt(图13A)或PPARγ(图13B)抑制剂存在或不存在的情况下处理。AICAR增加Akt的磷酸化(图11C)和PPARγ的表达(图12B)，然而，对Akt的抑制不能够显著地(p＞0.05)逆转瘦蛋白诱导的可溶性Aβ释放的减少(图13A，深灰色柱形)。类似地，对PPARγ的抑制未显著(p＞0.05)逆转瘦蛋白诱导的在全部检验位点处tau磷酸化的减少(图13B，右侧柱形组)。因而，未鉴定到由这两条途径共享的其他组分。
综上所述，瘦蛋白通过神经元细胞中的不同信号传导途径调节tau的磷酸化和Aβ产生和释放。这些途径在瘦蛋白介导的AMPK激活的下游趋异以产生特定效应。
尽管已经参照本发明的具体实施方案描述了本发明，然而本领域技术人员应当理解，可以做出各种改变并且可以替换等同物而不脱离本发明的真实精神和范围。此外，可以做出许多修改以针对本发明的客观精神和范围调整具体的情况、材料、物质组成、方法、工艺步骤或步骤。所有这些修改均意图涵盖在所附权利要求的范围之内。

Claims (43)

1.一种用于治疗进行性认知障碍的方法，该方法包括步骤：
(a)提供治疗有效量的瘦蛋白组合物，其中，所述瘦蛋白组合物包含：
(i)作为第一治疗剂的瘦蛋白或瘦蛋白类似物；
(ii)任选地，至少一种第二治疗剂；和
(iii)药学上可接受的载体；
(b)施用(a)的组合物至有需要的受治疗者；以及
(c)减少或防止进行性认知障碍的至少一种病理进展。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物减少Aβ的产生、增加Aβ的摄取或减少tau蛋白磷酸化。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，tau蛋白磷酸化的位点包含Ser202/Thr205(AT8位点)、Ser214、Ser181、Ser212(AT 100位点)、Thr231、Ser235(TG3位点)和Ser396/Ser404(PHF-1位点)中的至少之一。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述进行性认知障碍是阿尔茨海默病、进行性核上麻痹；痴呆；克-雅病、额颞痴呆、皮克病、伴有帕金森综合征-17皮质基底节变性的额颞痴呆、额颞叶变性；亨廷顿病；或帕金森病。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述进行性认知障碍是阿尔茨海默病。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，阿尔茨海默病的病理包含选自以下组的至少一种病理：tau蛋白磷酸化；神经元纤维缠结；APP的改变的蛋白酶解；Aβ42在脑间质液中积聚；Aβ42在脑间质液中聚集；Aβ40在脑间质液中积聚；Aβ40聚集；炎症反应；神经炎损伤；神经元代谢稳态的扰乱；神经元离子稳态的扰乱；氧化性损伤；改变的激酶活性；改变的磷酸酶活性；神经元功能紊乱；神经元细胞死亡；神经递质缺乏；痴呆；神经炎营养不良；神经元核周体皱缩，和突触丧失。
7.据权利要求1所述的方法，其中，所述任选的至少一种第二治疗剂选自由抗生素剂、抗真菌剂、激酶抑制剂、抗病毒剂、抗原虫剂、甾体抗炎剂、抗氧化剂、激素、维生素、抗组胺剂和化疗剂所组成的组。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述任选第二治疗剂是至少一种激酶抑制剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述至少一种激酶抑制剂选自由钙/钙调蛋白-依赖性蛋白激酶II的激酶抑制剂；蛋白激酶A的激酶抑制剂；GSK-3β的激酶抑制剂；cAMP-依赖性蛋白激酶的激酶抑制剂；5-腺苷一磷酸蛋白激酶的激酶抑制剂；Myr-AIP、LiCl KT5720、6-溴靛玉红-3’-肟((2’Z，3’E)-6-溴靛玉红-3′-肟)；KT5720；K252a；星形孢菌素；KT5252b；白屈菜赤碱和TDZD-8(4-苄基-2-甲基-1，2，4-噻二唑烷-3，5-二酮-8)所组成的组。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述组合物以大于该组合物组分(i)、(ii)和(iii)总和的水平提供激酶抑制作用。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述瘦蛋白或瘦蛋白类似物在瘦蛋白组合物中的治疗有效量是从约0.0001mg/kg体重至约100g/kg体重的量。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物改善至少一种认知功能。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述至少一种认知功能是记忆。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述至少一种认知功能是学习。
15.一种用于改善有需要的受治疗者中认知功能复原的方法，该方法包括步骤：
(a)施用瘦蛋白组合物至有需要的受治疗者，所述瘦蛋白组合物包含：
(i)作为第一治疗剂的增强认知功能的量的瘦蛋白或瘦蛋白类似物；
(ii)任选地，至少一种第二治疗剂，和
(iii)药学上可接受的载体；
其中，所述组合物减少Aβ产生、增加Aβ的摄取或减少tau蛋白磷酸化；以及
(b)改善受治疗者中认知功能的复原。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述tau蛋白磷酸化的位点包含Ser202/Thr205(AT8位点)、Ser214、Ser181、Ser212(AT 100位点)、Thr231、Ser235(TG3位点)和Ser396/Ser404(PHF-1位点)中的至少之一。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述认知功能是记忆。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述记忆是条件性记忆。
19.根据权利要求17所述的方法，其中，所述记忆是情境记忆。
20.根据权利要求15所述的方法，其中，所述认知功能是记忆保持。
21.根据权利要求15所述的方法，其中，所述认知功能是学习。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述学习是情境学习。
23.根据权利要求21所述的方法，其中，所述学习是条件性学习。
24.根据权利要求15所述的方法，其中，所述任选第二治疗剂选自由抗生素剂、抗真菌剂、激酶抑制剂、抗病毒剂、抗原虫剂、甾体抗炎剂、抗氧化剂、激素、维生素、抗组胺剂和化疗剂所组成的组。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述任选第二治疗剂是至少一种激酶抑制剂。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述至少一种激酶抑制剂选自由钙/钙调蛋白-依赖性蛋白激酶II的激酶抑制剂；蛋白激酶A的激酶抑制剂；GSK-3β的激酶抑制剂；cAMP-依赖性蛋白激酶的激酶抑制剂；5-腺苷一磷酸蛋白激酶的激酶抑制剂；Myr-AIP、LiCl KT5720、6-溴靛玉红-3’-肟((2’Z，3’E)-6-溴靛玉红-3’-肟)；KT5720；K252a；星形孢菌素；KT5252b；白屈菜赤碱和TDZD-8(4-苄基-2-甲基-1，2，4-噻二唑烷-3，5-二酮-8)所组成的组。
27.根据权利要求25所述的方法，其中，所述组合物以大于该组合物组分(i)、(ii)和(iii)总和的水平提供激酶抑制作用。
28.根据权利要求15所述的方法，其中，所述瘦蛋白或瘦蛋白类似物在瘦蛋白组合物中的增强认知功能的量是从约0.0001mg/kg体重至约100g/kg体重的量。
29.一种用于鉴定有效治疗剂的方法，所述有效治疗剂用于治疗因Aβ积聚、tau蛋白磷酸化或神经元纤维缠结积聚中的至少之一引起的进行性认知功能紊乱疾病或障碍，该方法包括步骤：
(a)提供包含神经元细胞的细胞培养物，
(b)使包含神经元细胞的细胞培养物与推定性治疗剂接触，
(c)确定所述推定性治疗剂是否与蛋白激酶蛋白的活性部分缔合以至它影响该蛋白激酶的活性；以及
(d)鉴定所述推定性治疗剂为治疗进行性认知功能紊乱疾病或障碍的有效治疗剂。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述蛋白激酶是5-腺苷一磷酸蛋白激酶或GSK-3β。
31.根据权利要求29所述的方法，其中，所述推定性治疗剂或有效治疗剂是重组蛋白。
32.根据权利要求29所述的方法，其中，所述推定性治疗剂或有效治疗剂是抑制剂。
33.根据权利要求29所述的方法，其中，所述推定性治疗剂或有效治疗剂是拮抗剂。
34.根据权利要求29所述的方法，其中，所述推定性治疗剂或有效治疗剂是激动剂。
35.根据权利要求29所述的方法，其中，所述推定性治疗剂或有效治疗剂是抗体。
36.根据权利要求所述29的方法，其中，所述推定性治疗剂或有效治疗剂防止瘦蛋白或瘦蛋白类似物与蛋白激酶缔合。
37.根据权利要求29所述的方法，其中，确定性步骤(c)包括相对于对照测量神经元细胞的β淀粉状蛋白的分泌。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，相对于对照测量神经元细胞的β淀粉状蛋白的分泌通过ELISA或免疫印迹法进行。
39.根据权利要求29所述的方法，进一步包括使用有效治疗剂以治疗β淀粉状蛋白病理的步骤。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述β淀粉状蛋白病理包含选自以下组的至少之一种病理：tau蛋白磷酸化；神经原纤维缠结；APP的改变的蛋白酶解；Aβ42在脑间质液中积聚；Aβ42在脑间质液中聚集；Aβ40在脑间质液中积聚；Aβ40聚集；炎症反应；神经炎损伤；神经元代谢稳态的扰乱；神经元离子稳态的扰乱；氧化性损伤；改变的激酶活性；改变的磷酸酶活性；神经元功能紊乱；神经元细胞死亡；神经递质缺乏；痴呆；神经炎营养不良；神经元核周体皱缩和突触丧失。
41.根据权利要求39所述的方法，其中，所述有效治疗剂改善至少一种认知功能。
42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述至少一种认知功能是记忆。
43.根据权利要求41所述的方法，其中，所述至少一种认知功能是学习。
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