CN116391654B - 一种雌雄同体扇贝规模化杂交育种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种雌雄同体扇贝的规模化杂交育种方法，是使用激酶抑制剂K252a来调节雌雄同体扇贝的性腺发育，实现作为母本的扇贝的规模化催产，并与父本扇贝的精子自由受精，进而提高扇贝杂交育种的效率和规模。本发明使用激酶抑制剂K252a可以显著抑制雌雄同体扇贝的精巢发育和精子活力，而卵质量不受影响，获得雄性不育或低育的扇贝群体。本发明的方法可有效降低雌雄同体扇贝精卵排放时自体受精，提高雌雄同体扇贝杂交育种的效率，从而规模化制备生长优势显著、成活率高、抗逆性强的杂交扇贝苗种。
Description
技术领域
本发明属于贝类育种技术领域，具体涉及一种雌雄同体扇贝规模化杂交育种方法。
背景技术
许多双壳类动物(如牡蛎、蛤、扇贝和贻贝)是重要的经济贝类。在水产养殖过程中，提高贝类的抗逆能力或品质性状，实现品种改良，对推动海水养殖业稳定、健康和持续发展具有重要意义。
杂交育种是一种重要的育种方法，开展种间或种内不同地理群体之间的杂交，可有效利用杂种优势将双亲优良性状结合于一体，或将双亲中控制同一优良性状的不同微效基因积累起来，实现品种改良。
雌雄同体扇贝由于繁殖时精卵几乎同时排放，容易自体受精，在杂交育种中很难获得未受精的卵子，这大大增加了杂交育种的难度。现有方法通过单独产卵、近距离观察和显微观察，收集雌雄同体扇贝的纯配子进行人工授精，实现雌雄同体扇贝的杂交。但是，由于需要对每个个体进行单独催产、镜检，以防止自体受精，增加了操作难度和步骤，极大程度限制了雌雄同体扇贝的育种规模。
发明内容
本发明的目的是解决雌雄同体扇贝杂交育种效率低和育种规模受限的问题，而提出的一种雌雄同体扇贝规模化杂交育种方法，即一种以育性被控制的扇贝为杂交母本的高效规模化育种方法。
本发明首先提供一种从雌雄同体扇贝出发来获得雄性不育/低育的扇贝母本的方法，是使用激酶抑制剂K252a来调节雌雄同体扇贝的性腺发育，获得的雄性不育/低育的海湾扇贝母本；
更进一步的，本发明的方法，是通过闭壳肌注射抑制剂K252a到扇贝体内；
作为实施例的一种具体记载，是在海湾扇贝性腺发育状态为生长期时注射抑制剂K252a，所述的抑制剂K252a的注射量(μg)根据扇贝大小(壳高cm)来进行调整，其一种注射量是0.28-0.36μg/cm。
本发明还提供一种雌雄同体扇贝规模化杂交育种方法，是使用上述方法获得雄性不育/低育的扇贝作为母本来提供卵子，而不同群体和/或不同种属的扇贝作为父本来提供精子，杂交获得杂交子代；
其中母本可以是海湾扇贝北部亚种，父本是海湾扇贝南部；
或母本是海湾扇贝南部亚种，而父本是海湾扇贝北部亚种；
作为一个实施例的具体记载，本发明所提供的雌雄同体扇贝杂交子代的规模化育种方法，是使用海湾扇贝作为母本，母本海湾扇贝使用激酶抑制剂K252a处理后获得的雄性不育或低育的扇贝；而紫扇贝作为父本；
更进一步的，所述的母本、父本扇贝还可以是Pecten属和/或Argopecten属的扇贝；
更具体的，本发明所提供的雌雄同体扇贝规模化杂交育种方法，包括如下的步骤：
1)生长期扇贝第1天通过闭壳肌注射抑制剂K252a；
2)第一次注射后第7天通过闭壳肌第二次注射抑制剂K252a；
3)积温促熟养殖17-18天后，得到雄性不育或低育的成熟扇贝群体；
4)同步促熟的成熟父本扇贝群体催产获得精子；
5)将步骤3)获得的扇贝阴干后，全部置于含有父本扇贝精子的海水中进行诱导催产，然后收集受精卵进行孵化获得杂交子代。
所述的步骤3)中的积温促熟，是将水温由15℃开始逐日升高，每日换水一次，前6天每次换水升温0.5度，后期每次换水升温0.1-0.2度；投喂饵料包括螺旋藻粉、小硅藻、海洋红酵母粉、鸡蛋等，投饵量按需要逐日增加并通过观察摄食、排便情况调整。升温至20℃恒温，此时扇贝成熟待产；
所述步骤4)中，收集精子的具体操作如下：催产后父本扇贝进入排精产卵期，当扇贝开始排放精子时，用500目筛绢过滤收集扇贝精子，避光保存。
所述步骤5)中，受精卵的孵化密度为35个/ml。
按照上述方式以激酶抑制剂K252a处理的雌雄同体海湾扇贝为母本，将海湾扇贝群体置于含有父本扇贝精子的海水中催产，自由受精，既能提高杂交育种的效率和规模，又可以保证苗种的杂交率。
本发明使用激酶抑制剂K252a可以显著抑制雌雄同体的扇贝的精巢发育和精子活力，获得雄性不育或低育的扇贝群体。本发明的方法可显著提高雌雄同体的扇贝杂交育种的效率，从而规模化制备生长优势显著、成活率高、抗逆性强的杂交扇贝苗种。
本发明的方法既可应用于雌雄同体海湾扇贝不同地理群体间的杂交制种，如海湾扇贝北部亚种和南部亚种的杂交，还可应用于雌雄同体海湾扇贝与其他扇贝的杂交，如海湾扇贝和紫扇贝的杂交。
附图说明
图1为抑制剂K252a在海湾扇贝中的处理方法的流程图。
图2为不同浓度抑制剂K252a处理海湾扇贝的个体及精子观察图，其中A：不同浓度下扇贝个体死亡率；B：不同浓度下精子死亡率；C：不同浓度下扇贝的精子活力。A、B、C中的10％、20％、30％、40％表示不同浓度抑制剂K252a处理组扇贝。
图3为抑制剂K252a处理海湾扇贝的形态学观察图，其中A：对照和处理组扇贝个体表型观察；B：对照和处理组扇贝个体精巢组织学观察；C：对照和处理组扇贝个体卵巢组织学观察。
图4为抑制剂K252a处理海湾扇贝的配子质量评估图，其中A：对照和处理组扇贝的精子活力；B：对照和处理组扇贝的卵质量。
图5为抑制剂K252a处理的海湾扇贝的精子形态和线粒体活性图，其中A：对照和处理组扇贝的精子形态观察；B：对照和处理组扇贝的精子鞭毛横切面超微结构观察；C：对照和处理组扇贝的精子线粒体活性。
图6为抑制剂K252a处理的海湾扇贝的配子受精及胚胎发育评估图，其中A：对照和处理组扇贝配子不同组合的受精率；B：对照和处理组扇贝配子不同组合的卵裂率；C：对照和处理组扇贝配子不同组合的畸形率；D：对照和处理组扇贝配子不同组合的D型存活率。
图7为抑制剂K252a处理的海湾扇贝与紫扇贝自由受精杂交育种的效果评估图，其中A：引物在海湾扇贝和紫扇贝中的扩增情况；B：对照和处理组子代杂种鉴定。
具体实施方式
本发明使用激酶抑制剂K252a来调节雌雄同体扇贝的性腺发育，获得的雄性不育/低育的扇贝母本，实现扇贝规模化催产并与父本扇贝精子自由受精，获得高杂合率的子代苗种，进而提高扇贝杂交育种的效率和规模。
在本发明实施例中使用的抑制剂K252a分子式为C27H21N3O5，纯度大于98％，PBS稀释后使用。
本发明方法利用激酶抑制剂K252a，获得雄性不育/低育的扇贝，在催产中降低了扇贝群体的自交受精现象，进而增加与父本扇贝精子杂交的比例，获得高杂种率的苗种，可显著提高杂交育种的育种效率和规模。
在一些具体实施方案中，生长期海湾扇贝的壳高为62-64mm，抑制剂K252a注射量为2μg/只。
本发明还提供抑制剂K252a在扇贝杂交育种的方法，以海湾扇贝♀与紫扇贝♂杂交育种为例，包括如下步骤：
1)生长期海湾扇贝第1天通过闭壳肌注射抑制剂K252a；
2)第7天通过闭壳肌第二次注射抑制剂K252a；
3)积温促熟法养殖17-18天后，得到雄性不育或低育的成熟海湾扇贝群体；
4)同步促熟的成熟紫扇贝群体催产获得精子；
5)将步骤3)获得的海湾扇贝阴干后，全部置于含有紫扇贝精子的海水中进行诱导催产，然后收集受精卵进行孵化工序，进而获得杂交子代高占比的苗种。
所述步骤3)中，海湾扇贝养殖步骤如下：扇贝在亲贝培育车间喂养促熟，整个过程严格遵循生产技术流程。促熟采用积温促熟的方法，置于30m3水池中。水温由15℃开始逐日升高，每日换水一次，前6天每次换水升温0.5度，后期每次换水升温0.1-0.2度。投喂饵料包括螺旋藻粉、小硅藻、海洋红酵母粉、鸡蛋等，投饵量按需要逐日增加并通过观察摄食、排便情况调整。升温至20℃恒温，此时扇贝成熟待产。
所述步骤4)中，收集精子的具体操作如下：催产后紫扇贝进入排精产卵期，当紫扇贝开始排放精子时，用500目筛绢过滤收集紫扇贝精子，避光保存。
所述步骤5)中，受精卵的孵化密度为35个/ml。
按照上述方式以激酶抑制剂K252a处理的雌雄同体海湾扇贝为母本，将海湾扇贝群体在含有紫扇贝精子的海水中催产，自由受精，既能提高杂交育种的效率和规模，又可以保证苗种的杂交率。
本发明采用抑制剂K252a控制海湾扇贝育性的方法，该方法处理周期短、操作简单。
本发明采用的抑制剂K252a可通过短期处理影响同时雌雄同体海湾扇贝的精巢发育，而不影响卵子质量，进而获得雄性不育/低育的海湾扇贝群体，在催产中降低了海湾扇贝的自交受精现象。
本发明方法以雄性不育或低育的海湾扇贝为母本，将海湾扇贝群体在含有紫扇贝精子的海水中催产，自由受精，免去了雌雄同体海湾扇贝在杂交育种中扇贝独立催产、逐个配子收集镜检和人工授精的步骤，既保证苗种的高杂交率，又提高了海湾扇贝和紫扇贝的杂交育种效率，实现了雌雄同体海湾扇贝和紫扇贝的高效、大规模杂交育种。
本发明的方法也应用于雌雄同体海湾扇贝不同地理群体间的杂交育种，例如海湾扇贝北部亚种和南部亚种的杂交。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：
抑制剂K252a浓度对海湾扇贝个体和精子活力的影响，包括如下步骤：
1)抑制剂K252a购自Sigma-Aldrich，并用PBS稀释用于注射，共设置了四个稀释的浓度梯度：10％、20％、30％、40％(将抑制剂K252a用PBS溶液按照体积比稀释)。抑制剂通过闭壳肌注射两次，一次在第1天，另一次在7天，注射量为20μL/只(壳高62-64mm)，每组注射约10-20只扇贝。
2)17天后将海湾扇贝养殖至性腺成熟。
3)计算海湾扇贝存活率，并催产评估精子质量。扇贝分别置于装有海水的2L量杯中催产，人工催产采用常规的阴干升温法。收集精子的具体操作如下：催产后海湾扇贝进入排精产卵期，当海湾扇贝开始排放精子时，用500目筛绢过滤收集海湾扇贝精子，在显微镜下观察。精子活力观察在显微镜下进行，精子活力参照WHO，具体标准如下：Ⅰ级是不动精子，Ⅱ级是抖动精子，Ⅲ级是缓慢运动精子，Ⅳ级是快速运动精子。
结果见图2，显示20％、30％和40％抑制剂组的扇贝死亡率略有增加(图2A)。5组之间的精子死亡率没有显著差异，但30％和40％抑制剂组的精子死亡率相对较高(15％～20％)(图2B)。与未治疗组相比，抑制剂治疗后，Ⅳ级精子减少，Ⅰ级精子增加。Ⅰ级精子随着抑制剂浓度的增加而增加，Ⅲ+Ⅳ级精子相对稳定(图2C)。根据结果，几种浓度的抑制剂均能抑制海湾扇贝的精子活力，因此在下述实施例中选择浓度为20％的K252a处理海湾扇贝。
实施例2：
抑制剂K252a对海湾扇贝育性控制的应用，包括如下步骤：
1)抑制剂K252a购自Sigma-Aldrich，并用PBS稀释至20％注射。抑制剂通过闭壳肌注射两次，一次在第1天，另一次在7天，注射量为20μL/只(壳高62-64mm)，共注射50只扇贝。
2)18天后，将海湾扇贝养殖至性腺成熟。养殖步骤如下：扇贝在亲贝培育车间喂养促熟，整个过程严格遵循生产技术流程。促熟采用积温促熟的方法，置于30m3水池中。水温由15℃开始逐日升高，每日换水一次，前6天每次换水升温0.5度，后期每次换水升温0.1-0.2度。投喂饵料包括螺旋藻粉、小硅藻、海洋红酵母粉、鸡蛋等，投饵量按需要逐日增加并通过观察摄食、排便情况调整。升温至20℃恒温，此时扇贝成熟待产。
3)一部分扇贝被解剖，记录表型后，它们的精巢和卵巢在Bouin’s固定液中固定过夜，并在70％乙醇中脱水保存，石蜡切片后，用H-E法染色，最后在显微镜下观察。结果见图3，显示，对照组和抑制剂处理组海湾扇贝表型无明显区别，无处理对照组扇贝的精巢和卵巢均发育良好，但处理组扇贝精巢滤泡较空，卵巢无明显异常。
4)一部分扇贝被催产，精子和卵子镜检后，收集纯配子，用于配子质量评估。扇贝分别置于装有海水的2L量杯中催产，人工催产采用常规的阴干升温法。收集精子的具体操作如下：催产后海湾扇贝进入排精产卵期，当海湾扇贝开始排放精子时，用500目筛绢过滤收集海湾扇贝精子，避光保存。精子活力观察在显微镜下进行，精子活力参照WHO，具体标准如下：Ⅰ级是不动精子，Ⅱ级是抖动精子，Ⅲ级是缓慢运动精子，Ⅳ级是快速运动精子。向前运动精子包括Ⅲ级精子和Ⅳ级精子。
收集卵子的具体操作如下：催产后海湾扇贝进入排精产卵期，当海湾扇贝开始排放卵子时，将扇贝取出并用过滤海水冲洗2-3遍后，放入盛有新鲜无菌海水的待产池中，每隔十分钟用500目筛绢过滤浓缩海湾扇贝卵子，直到海湾扇贝开始排放精子，显微镜镜检并保留未受精的卵，避光保存。
配子质量结果见图4，精子活力结果显示(图4A)，处理组海湾扇贝Ⅳ级精子比例显著低于对照组，而Ⅰ级精子增多。处理组海湾扇贝的精子向前运动率(Ⅲ和Ⅳ总和)显著低于无处理对照组，其卵子质量和无处理对照组相比无明显异常(图4B)，表明抑制剂处理不影响卵巢发育。
5)抑制剂处理后精子活力降低表明其结构可能存在缺陷。因此，通过电子显微镜和免疫荧光显微镜对对照组和抑制剂组的精子进行比较。用于电子显微镜观察的成熟扇贝被解剖，并在3×磷酸盐缓冲液中切碎。收集精子，然后在4℃磷酸盐缓冲液中的2.5％(W/V)戊二醛溶液中固定过夜。透射电子显微镜样品经过锇酸后固定、树脂包埋、切片，然后用乙酸铀酰和柠檬酸铅复染，最后在透射电子显微镜下观察。扫描电子显微镜样品经过锇酸后固定、丙酮系列(10-100％)脱水、干燥、溅镀金后，在扫描电子显微镜下观察。
扫描电镜结果(图5A)显示，对照组和抑制剂组的精子头部在形态上相似，然而，抑制剂处理组的鞭毛存在形态缺陷。统计发现，抑制剂组共有84.48％的精子存在形态缺陷，比未治疗组(13.37％)高出5倍。透射电镜进一步观察到精子鞭毛的超微结构缺陷(图5B)，精子鞭毛的横截面显示，两组中都存在典型的“9+2”微管结构。然而，在抑制剂组的轴丝微管双峰异常地排列成椭圆形，与对照组中的正常圆柱形阵列不同。
线粒体活力鉴定采用免疫荧光法，扇贝去除海水后收集精子，并在室温下与含有50nM MitoTracker Red CMXRos的PBS孵育15分钟。经过PBS洗涤、4％多聚甲醛室温固定15分钟、含有Hoechst的PBS室温孵育20分钟，然后用抗荧光淬灭封片液封片，在荧光显微镜下观察。线粒体荧光染色结果(图5C)显示，对照组和抑制剂组之间没有明显差异，表明抑制剂组精子线粒体供能正常。
6)海湾扇贝催产收集纯配子，组合受精，用于受精和胚胎发育评估。人工授精的具体操作如下：将收集的卵倒入装有1.8L海水的量杯中，卵密度为30个/ml，然后加入精子，使精卵比例约为4：1，约30分钟后受精的卵子可以观察到极体，此时统计受精率。孵化步骤如下：将受精卵置于温度28℃的水体中进行孵化，受精卵放置密度为35个/ml，统计受精率、卵裂率、畸形率和D型幼虫存活率。
结果发现(图6)，第1组(正常卵子×正常精子)的受精率和D期存活率分别为83.21％和69.50％。第2组(20％抑制剂处理的卵子×正常精子)的这些值和第1组没有太大差异。然而，第3组(20％抑制剂处理的精子×正常卵子)的受精率(38.24％)和卵裂率(83.42％)显著降低。与第1组(13.96％)相比，畸形率(37.99％)高1.72倍。所有这些都导致第3组D期生存率(15.93％)显著降低，比第1组低3.36倍(69.50％)。
以上结果表明抑制剂K252a处理导致海湾扇贝的精巢发育缓慢和精子活力下降，进而造成扇贝雄性不育/低育。因此，通过注射抑制剂K252a，可以抑制海湾扇贝的精巢发育和精子活力，而不影响雌配子产生，从而获得雄性不育/低育的海湾扇贝群体。
实施例3：
抑制剂K252a在海湾扇贝杂交育种应用，以抑制剂K252a在海湾扇贝♀与紫扇贝♂杂交育种为例，包括如下步骤：
1)抑制剂K252a购自Sigma-Aldrich，并用PBS稀释至20％注射。抑制剂通过闭壳肌注射两次，一次在第1天，另一次在7天，抑制剂浓度为20％，注射量为20μL/只(壳高62-64mm)，共注射50只扇贝。
2)18天后，将海湾扇贝养殖至性腺成熟。养殖步骤如下：扇贝在亲贝培育车间喂养促熟，整个过程严格遵循生产技术流程。促熟采用积温促熟的方法，置于30m3水池中。水温由15℃开始逐日升高，每日换水一次，前6天每次换水升温0.5度，后期每次换水升温0.1-0.2度。投喂饵料包括螺旋藻粉、小硅藻、海洋红酵母粉、鸡蛋等，投饵量按需要逐日增加并通过观察摄食、排便情况调整。升温至20℃恒温，此时扇贝成熟待产。
3)选取性腺发育成熟的紫扇贝作为父本，催产获得精子。人工催产采用常规的阴干升温法，特别的是，紫扇贝放置在同一个桶中催产，收集精子。收集精子的具体操作如下：催产后紫扇贝进入排精产卵期，当紫扇贝开始排放精子时，用500目筛绢过滤收集紫扇贝精子，避光保存。
4)选取性腺成熟的海湾扇贝作为母本，本实施例方法处理的海湾扇贝为处理组，以普通养殖的海湾扇贝作为对照组，将每组海湾扇贝(7只/组)放入一个装有紫扇贝精子的海水的200L水桶中催产，自由受精。人工催产采用常规的阴干升温法，特别的是，将海湾扇贝放入含有事先准备好的紫扇贝精子的海水中进行催产，并自由受精。约30分钟后收集受精卵，置于温度28℃的水体中，受精卵放置密度为35个/ml，并进行苗种培养。大约一个月后，收集幼贝(壳高1-2mm)，立即冷冻在液氮中，并在-80℃下储存。
5)上述幼贝材料进行DNA分离，基于表1中的引物，通过PCR对大约40-50个个体进行亲本鉴定，测试子代中杂交扇贝和海湾扇贝的比例。
表1：用于亲本鉴定的引物序列信息表
引物可用性验证及子代物种鉴定结果见图7，显示，上述引物可以有效区分海湾扇贝和海紫杂交贝，抑制剂处理后的海湾扇贝与对照组相比，群体自由受精后子代杂交贝比例(66.67％)显著增高。
上述结果表明，K252a可通过短期处理影响同时雌雄同体海湾扇贝的精巢发育，而不影响卵子质量，进而获得雄性不育/低育的海湾扇贝群体，在群体育种中显著提高杂交率，免去了雌雄同体海湾扇贝在杂交育种中扇贝独立催产、逐个配子收集镜检和人工授精的步骤，具有周期短、操作简单的优点，适用于养殖贝类的大规模处理，从而实现同时雌雄同体海湾扇贝的杂交种的大规模生产，提高杂交育种的经济效益。
Claims (9)
1.一种从雌雄同体扇贝出发来获得雄性不育或低育的扇贝母本的方法，其特征在于，所述的方法是使用激酶抑制剂K252a来调节雌雄同体扇贝的性腺发育，获得的雄性不育或低育的扇贝母本，其中抑制剂K252a的注射量，以扇贝壳高为基准，注射浓度为0.28-0.36μg/cm。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法，是通过闭壳肌注射抑制剂K252a到扇贝体内。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的方法，是在扇贝性腺发育状态为生长期时注射抑制剂K252a。
4.一种雌雄同体扇贝规模化杂交育种方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1或2所述的方法获得雄性不育或低育的扇贝作为母本来提供卵子，而不同群体和/或不同种属的扇贝作为父本来提供精子，杂交获得杂交子代。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的母本为海湾扇贝北部亚种，父本是海湾扇贝南部；或母本是海湾扇贝南部亚种，而父本是海湾扇贝北部亚种。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法是使用海湾扇贝作为母本，而紫扇贝作为父本。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法中，母本、父本扇贝分别是Pecten属和/或Argopecten属的扇贝。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)生长期扇贝通过闭壳肌注射抑制剂K252a；
2)第一次注射后第7天通过闭壳肌第二次注射抑制剂K252a；
3)积温促熟养殖17-18天后，得到雄性不育或低育的成熟扇贝群体；
4)同步促熟的成熟父本扇贝群体催产获得精子；
5)将步骤3)获得的扇贝阴干后，全部置于含有父本扇贝精子的海水中进行诱导催产，然后收集受精卵进行孵化获得杂交子代。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中的积温促熟，是将水温由15℃开始逐日升高，每日换水一次，前6天每次换水升温0.5℃，后期每次换水升温0.1-0.2℃；投喂饵料包括螺旋藻粉、小硅藻、海洋红酵母粉、鸡蛋。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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