JP4227325B2 - Ｏｂ蛋白組成物を用いる非脂肪組織重増加方法 - Google Patents
Ｏｂ蛋白組成物を用いる非脂肪組織重増加方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4227325B2 JP4227325B2 JP2001352728A JP2001352728A JP4227325B2 JP 4227325 B2 JP4227325 B2 JP 4227325B2 JP 2001352728 A JP2001352728 A JP 2001352728A JP 2001352728 A JP2001352728 A JP 2001352728A JP 4227325 B2 JP4227325 B2 JP 4227325B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- amino acid
- seq
- adipose tissue
- human
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/2264—Obesity-gene products, e.g. leptin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/06—Anabolic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
- A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、非脂肪組織重を増加させるためのＯＢ蛋白組成物の使用方法に関するものである。
【０００２】
【発明の背景】
肥満の分子的基礎はかなり不明な部分があるが、「ＯＢ遺伝子」およびそれによりコードされた蛋白（「ＯＢ蛋白」）の特定によって、体が体脂肪蓄積を調節するのに使用している機序についていくらか理解が進んだ（Zhang et al., Nature 372: 425-432(1994); the Correction at Nature 374: 479(1995)も参照）。ＯＢ蛋白は、ｏｂ／ｏｂ突然変異マウス（ＯＢ遺伝子産物の産生欠陥故の肥満マウス）ならびに正常な野生型マウスのいずれにおいても、in vivoで活性である。その生理活性自体は特に、体重減少において発現する（Barinaga,“Obese” Protein Slims Mice, Science 269: 475-476(1995)参照）。
【０００３】
ＯＢ蛋白の他の生理効果については十分な特性決定が行われていない。例えば、ｏｂ／ｏｂ突然変異マウスにおいて、ＯＢ蛋白を投与することで、血清インシュリン濃度および血清グルコース濃度が低下することが知られている。さらに、ＯＢ蛋白投与によって、体脂肪の低下が生じることも知られている。これはｏｂ／ｏｂ突然変異マウスおよび非肥満正常マウスのいずれにおいても認められている（Pelleymounter et al., Science 269: 540-543(1995); Halaas et al., Science 269: 543-546(1995)参照。Campfield et al., Science 269: 546-549(1995)も参照（μｇ量の用量のＯＢ蛋白を末梢および中枢に投与することで、ｏｂ／ｏｂ肥満マウスおよび飼料誘発肥満マウスの飼料摂取および体重が低下したが、ｄｂ／ｄｂ肥満マウスではそれは認められなかった）。これらの報告のいずれにおいても、最高用量であっても毒性は認められていない。
【０００４】
特に、体重減少が有益ではないと考えられるか、あるいは体重減少の必要がないと考えられる動物に対するＯＢ蛋白の他の生理効果を解明することは、ＯＢ蛋白に別の用途を提供するものとなろう。
【０００５】
本発明によって提供されるようなそのような用途は、非脂肪組織（lean tissue）重増加におけるものである。
【０００６】
当然のことながら、食事および運動の調節が、筋肉を大きくする上での一つの方法である。非脂肪重を増加させるのに使用される組成物もある。非脂肪組織重を増加させると考えられている現在の組成物には、テストステロンおよびそれの誘導体などの蛋白同化ステロイドならびにヒト成長ホルモンなどがある。しかしながら、これらは望ましくない副作用を有することが認められている（以下の概要はレミングトンの著作に詳細に説明されている（Remington, Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) Chapter 50, pp.948-1001））。
【０００７】
プロトロピンおよびソマトロピンなどのヒト成長ホルモンは、通常２〜３ヶ月で緩解する高カルシウム尿症を高頻度で起こすことが認められている。高血糖症および臨床的に明らかな糖尿病が起こることも認められている。筋肉痛および早朝頭痛が比較的頻繁であることが認められ、甲状腺機能低下および胆汁におけるコレステロール過飽和が生じる場合もある。骨端が閉じている場合、指骨および顎骨の成長が継続的に刺激されるが他の骨は刺激されないために身体の均整が異常になる場合があることから、そのホルモンは使用してはならない。
【０００８】
蛋白同化ステロイドは運動能力および攻撃性を高める。それの使用は、米国スポーツ医学協会（American College of Sports Medicine）によって禁止されている。女性の能力が向上するが、その代償として男性化およびアクネが生じる。アンドロゲンは男性型多毛症、深い声もしくは嗄れ声、未成熟男性における思春期早発症および骨端閉鎖、性欲亢進（男性および女性の両方）、陰茎強直症、精液減少症および睾丸萎縮、女性における陰核腫脹、潮紅、射精量および精子数の低下、女性化乳房症、過敏症、アクネ、体重増、浮腫ならびに高カルシウム血症を引き起こす。長期使用によって攻撃性がひどく高まる場合があり、多くの暴行がアンドロゲンの乱用によるものであると言われている。偏執症様行動および他の精神病的行動が報告されている。胆汁うっ滞および黄疸が起こる。長期療法後に肝癌が報告された例が数例ある。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従って、現在使用可能な薬剤に見られる副作用のない、非脂肪組織重を増加させる治療用組成物または美容用組成物が得られることが望ましい。
【００１０】
【課題を解決する手段】
本発明は、非肥満動物および肥満動物へのＯＢ蛋白投与によって非脂肪組織重増加が生じるという所見に基づくものである。そのようにＯＢ蛋白は、痩身剤として作用するだけでなく、非脂肪組織重に影響を与える薬剤として作用する能力を有する。それだけでは、体重減が必ずしも有益とは考えられない患者においてすら、多くの非脂肪組織重増加療法が想到される。そこで本発明の１態様は、非脂肪組織重増加のためのＯＢ蛋白（または該蛋白の類縁体もしくは誘導体）の使用である。
【００１１】
別の態様では本発明は、糖尿病治療方法および糖尿病治療に必要なインシュリンレベル低下方法に関するものである。脂肪組織重低下と同時に非脂肪組織重を増加させることで、インシュリンに対する感度が上昇する。従って本発明の方法は、糖尿病治療に必要なインシュリン量低下のためのＯＢ蛋白（または該蛋白の類縁体もしくは誘導体）の使用に関するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
上記のように本発明の方法は、個体における非脂肪組織重増加方法である。この非脂肪組織重増加には、脂肪重低下を伴うことが認められている。そこで、ＯＢ蛋白（または該蛋白の類縁体もしくは誘導体）投与によって所望の体重減が得られない場合であっても、非脂肪重を増加させながら体脂肪を減少させて体型を変える上で、ＯＢ蛋白投与は有用であると考えられる。
【００１３】
さらに、非脂肪組織重増加により、個体のインシュリンに対する感受性を高めることができる。従って本発明のＯＢ蛋白（または該蛋白の類縁体もしくは誘導体）の使用方法は、糖尿病患者におけるインシュリン感受性向上に関するものでもある。詳細な作用形態は不明であるが、脂肪組織と比較して非脂肪組織（例：筋肉）はインシュリンの効果に対する感受性が高いと考えられる。従って、非脂肪組織増加によって、インシュリン感受性の細胞をより多く利用できるようになると考えられる。さらに、脂肪（例：脂肪）組織除去は、循環インシュリンが認められる末梢循環への非脂肪組織の曝露が多くなるという別の効果も有し得る。従って本発明の別の態様は、インシュリンに対する感受性向上方法を提供することである。言い換えれば、糖尿病で必要なインシュリンの用量を低下させる方法も提供される。
【００１４】
非脂肪組織増加は、筋肉組織増加であると考えられる。そのような増加は、特定の部分に局在するものではなく、全身的増加であることが認められる（例：後述の実施例１および２）。それ自体で、全身活力が向上し得る。全身活力向上により、骨吸収低下などの他の効果が生じる場合があり、骨粗鬆症などの脆弱性を逆転または改善できる可能性がある。運動能力向上を望む患者では、全身活力向上がその能力向上に有効であると考えられる。赤血球の産生または有効性上昇、ならびに酸素化血液の増加があり得る。そうして、精神的・肉体的能力を向上させることができる。
【００１５】
ＯＢ蛋白は、以下に記載の組換えマウス蛋白（配列番号２）またはツァンクらの報告（Zhang et al., Nature, supra；引用によって本明細書に含まれるものとする）に記載の組換えヒト蛋白もしくは位置２８のグルタミン残基を持たないものから選択することができる（Zhang et al., Nature, supra, p.428参照）。（１）位置３５のリジンに代えてアルギニンおよび（２）位置７４のイソロイシンに代えてロイシンを有する配列番号４に示した組換えヒトＯＢ蛋白類縁体を用いることもできる（この類縁体についての略称を、組換えヒトＲ→Ｋ３５、Ｌ→Ｉ７４とする）。それらの組換えヒト蛋白類縁体および組換えマウス蛋白のアミノ酸配列を以下に示してあるが、−１の位置にメチオニン残基がある。しかし、本発明のＯＢ蛋白およびその類縁体については、そのメチオニン残基はなくても良い。
【００１６】
上記マウス蛋白は、特に成熟蛋白として、さらには特にＮ末端でヒト蛋白と実質的に相同である。組換えヒト配列において、マウスの配列と異なるアミノ酸を変えることで（アミノ酸残基の置換など）、組換えヒト蛋白の類縁体を得ることができる。この組換えヒト蛋白はマウスで生理活性を有することから、そのような類縁体はヒトにおいて活性である可能性がある。例えば、第１のアミノ酸がバリンで位置１４６のアミノ酸がシステインである配列番号４の番号付けによる位置３５の残基がリジンで位置７４の残基がイソロイシンであるヒト蛋白を用いた場合、位置３２、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７、８９、９７、１００、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の１以上のアミノ酸を別のアミノ酸で置換することができる。マウス蛋白（配列番号２）の相当する位置のアミノ酸または別のアミノ酸を選択することができる。
【００１７】
さらに、ラットＯＢ蛋白配列に基づいて、「コンセンサス」分子を得ることができる（Murakami et al., Biochem.Biophys. Res.Comm.209:944-952(1995)；引用によって本明細書に含まれるものとする）。ラットＯＢ蛋白は、配列番号４の番号割り付けを用いると、４、３２、３３、３５、５０、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０１、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８および１４５の位置でヒトＯＢ蛋白と異なっている。これらの各種位置のアミノ酸の１以上を別のアミノ酸で置換することができる。下線を付した位置は、マウスＯＢ蛋白とラットＯＢ蛋白がヒトＯＢ蛋白と異なっていることから、変えるのに特に適した位置である。これらの位置の１以上で、相当するラットＯＢ蛋白のアミノ酸または別のアミノ酸を置換することができる。
【００１８】
成熟ヒトＯＢ蛋白と異なるラットおよびマウスの両方のＯＢ蛋白の位置は、４、３２、３３、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５である。上記のアミノ酸の１以上が欠失しているか相当するラットもしくはマウスの配列で認められるアミノ酸などの別のアミノ酸で置換されている配列番号４によるヒトＯＢ蛋白（位置３５がリジン、位置７４がイソロイシン）も有効であると考えられる。
【００１９】
さらに、成熟ヒトＯＢ蛋白と異なるアカゲザルＯＢ蛋白で認められるアミノ酸（１文字のアミノ酸略号で括弧内に示してあるもの）は、８（Ｓ）、３５（Ｒ）、４８（Ｖ）、５３（Ｑ）、６０（Ｉ）、６６（Ｉ）、６７（Ｎ）、６８（Ｌ）、８９（Ｌ）、１００（Ｌ）、１０８（Ｅ）、１１２（Ｄ）および１１８（Ｌ）である。組換えヒトＯＢ蛋白はカニクイザルで活性であることから（後述の実施例２に記載）、アカゲザルの各種アミノ酸の１以上が括弧に示したアミノ酸などの別のアミノ酸で置換された配列番号４（位置３５がリジン、位置７４がイソロイシン）によるヒトＯＢ蛋白は有効であると考えられる。ある種のアカゲザルの各種アミノ酸は上記のマウスで認められるもの（位置３５、６８、８９、１００および１１２）でもあることは留意すべき点である。そこで、位置４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５というアミノ酸の１以上が別のアミノ酸によって置換されたマウス／アカゲザル／ヒトコンセンサス分子を得ることができる（位置３５がリジンで位置７４がイソロイシンである配列番号４の番号割り付けを使用）。
【００２０】
この蛋白のアミノ酸配列の一部を欠失させることで、他の類縁体を得ることができる。例えば、成熟蛋白はリーダー配列を持たない（−２２〜−１）。以下の切断型ヒトＯＢ蛋白分子を得ることができる（配列番号４の番号割り付けを使用）：
（ａ）アミノ酸９８〜１４６
（ｂ）アミノ酸１〜３２
（ｃ）アミノ酸４０〜１１６
（ｄ）アミノ酸１〜９９および（それに結合した）１１２〜１４６
（ｅ）アミノ酸９９と１１２の間にアミノ酸１００〜１１１の１以上があるアミノ酸１〜９９および（それに結合した）１１２〜１４６。
【００２１】
さらにこれら切断型は、ヒトＯＢ蛋白と異なる（アカゲザル、ラットまたはマウスのＯＢ蛋白で）アミノ酸の１以上が変わっているものであっても良い。さらに、変更はペプチド類似物またはＤ−アミノ酸などの変更アミノ酸の形であっても良い。
【００２２】
本発明の蛋白（本明細書において「蛋白」という用語は、別段の断りがない限り、以下に引用のような「ペプチド」およびＯＢ類縁体を含むものとして使用される）は、蛋白部分への１以上の化学部分結合によって誘導体化されていても良い。さらに、化学的に修飾された誘導体を、動脈投与、腹腔内投与、筋肉投与、皮下投与、静脈投与、経口投与、経鼻投与、肺投与、局所投与その他の投与経路用に製剤化することもできる。生理活性蛋白の化学修飾は、一定の環境下で、治療効果のある蛋白の安定性向上および循環時間延長ならびに免疫原性の低下などのさらなる利点をもたらすことが認められている（１９７９年１２月１８日発行の米国特許４１７９３３７号（Davis et al.）参照；総説については、Abuchowski et al., Enzymes as Drugs参照（J.S.Holcerberg and J.Roberts, eds.pp.367-383(1981)）；蛋白修飾および融合蛋白について記載した総説論文には、Francis, Focus on Growth Factors 3: 4-10(1992年5月)がある（Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20, OLD, UK出版））。
【００２３】
誘導体化に好適な化学部分は、各種水溶性ポリマーから選択することができる。選択されるポリマーは水溶性であって、それが結合する蛋白が生理環境などの水系の環境で沈殿しないようにするものでなければならない。好ましくは、最終製造品を治療に使用する場合、ポリマーは医薬的に許容されるものとする。当業者であれば、ポリマー／蛋白接合体が治療に使用可能か否か、そして使用可能であれば望ましい用量、循環時間、蛋白分解に対する耐性および他の検討事項などの検討事項に基づいて望ましいポリマーを選択することができる。本発明の蛋白およびペプチドの場合、誘導体化の有効性は、望ましい剤型で（すなわち、浸透ポンプにより、あるいはより好ましくは注射もしくは注入により、さらには例えば経口投与、肺投与もしくは経鼻投与用に製剤されたものにより）誘導体を投与し、本明細書に記載の方法に従ってその有効性を測定することで確認することができる。
【００２４】
水溶性ポリマーは例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸類（ホモポリマーまたはランダム共重合体もしくは非ランダム共重合体）、ならびにデキストリンもしくはポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー類、ポリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイド共重合体、ポリオキシエチル化多価アルコール類、ポリスチレンマレエートならびにポリビニルアルコールから成る群から選択することができる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中で安定であることから、製造において有利であると考えられる。
【００２５】
融合蛋白は、ＯＢ蛋白（または類縁体）部分にポリアミノ酸を結合させることで得ることができる。例えば、ポリアミノ酸は、蛋白の血中半減期を延長する上で役立つ担体蛋白であることができる。本発明の治療上または美容上の目的に関しては、そのようなポリアミノ酸は、中和抗原反応その他の有害応答を起こさないものでなければならない。そのようなポリアミノ酸は、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）、抗体もしくはそれの部分（「Ｆｃ」と称される場合もある抗体の定常領域など）その他のポリアミノ酸からなる群から選択することができる。以下に示すように、ポリアミノ酸の結合位置は、ＯＢ蛋白部分のＮ末端その他の箇所であることができ、ＯＢ蛋白への化学的「リンカー」部分によって結合していても良い。
【００２６】
ポリマーの分子量に制限はなく、分岐であっても直鎖であっても良い。ポリエチレングリコールの場合、好ましい分子量は、取り扱いやすさおよび製造しやすさから、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲である（「約」という用語は、ポリエチレングリコールの製造において、一部の分子の分子量が指定の分子量より大きく、一部の分子ではそれより小さかったりすることを示している）。所望の治療プロファイルに応じて（例：所望の徐放期間、生理活性がある場合はその生理活性に対する効果、取り扱いやすさ、抗原性の程度もしくはその欠如、ならびに治療効果のある蛋白もしくは類縁体に対するポリエチレングリコールの他の既知の効果）、それ以外の大きさのものを用いることができる。
【００２７】
このようにして結合したポリマー分子の数は多様であることができ、当業者であれば、機能に対する効果を確認することができる。モノ誘導体化を行うことができたり、あるいは同一もしくは異なる化学部分によって、ジ、トリ、テトラまたは数個の組み合わせの誘導体化を行うことが可能である（例：分子量の異なるポリエチレングリコール類などのポリマー）。蛋白（もしくはペプチド）分子に対するポリマー分子の割合は、それらの反応混合物中での濃度同様に多様である。一般に、所望の誘導体化程度（例：モノ、ジ、トリなど）、選択されるポリマーの分子量、そのポリマーが分岐であるか直鎖であるか、反応条件などの因子によって、至適比率（過剰の未反応の蛋白やポリマーがない反応の効率に関して）を決定する。
【００２８】
上記化学部分は、蛋白の機能性または抗原性ドメインに対する効果を考慮して蛋白に結合させなければならない。当業者が使用可能な結合方法が多くある。例えば、ＥＰ０４０１３８４号（引用によって本明細書に含まれるものとする）（ＰＥＧのＧ−ＣＳＦへの結合）、マリクらの報告（Malik et al., Exp.Hematol., 20:1028-1035, 1992；塩化トレシルを用いるＧＭ−ＣＳＦのＰＥＧ化について報告）などがある。例えばポリエチレングリコールは、遊離のアミノ基またはカルボキシル基などの反応性基を介してアミノ酸残基によって共有結合的に結合することができる。反応性基とは、活性化ポリエチレングリコール分子が結合し得る基である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基には、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基などがあり得る。遊離カルボキシル基を有するものには、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、Ｃ末端アミノ酸残基などがあり得る。ポリエチレングリコール分子を付着させるための反応性基として、メルカプト基を使用することもできる。治療のためには、Ｎ末端またはリジン基での結合などのアミノ基での結合が好ましい。受容体結合が望ましい場合、受容体結合にとって重要な残基での結合は避けるべきである。
【００２９】
特にＮ末端で化学修飾された蛋白が望ましい場合がある。ポリエチレングリコールを用いて本発明の組成物を説明すると、各種のポリエチレン分子（分子量、分岐などによって）、反応混合物中の蛋白分子に対するポリエチレングリコール分子の割合、実施するＰＥＧ化反応の種類、選択されたＮ末端ＰＥＧ化蛋白を得る方法を選択することができる。Ｎ末端ＰＥＧ化品を得る方法は（すなわち、必要に応じてこの部分を他のモノＰＥＧ化部分と分離する方法）、ＰＥＧ化蛋白分子群からのＮ末端ＰＥＧ化品の精製による。選択的Ｎ末端化学修飾は、特定蛋白における誘導体化に使用可能な各種１級アミノ基の反応性差（リジンとＮ末端）を利用する還元的アルキル化によって行うことができる。適切な反応条件下で、含カルボニル基ポリマーによるＮ末端での蛋白の実質的に選択的な誘導体化を行う。例えば、リジン残基のε−アミノ基と蛋白のＮ末端残基のα−アミノ基との間のｐＫａ差を利用できるｐＨで反応を行うことで、蛋白をＮ末端で選択的にＰＥＧ化することができる。そのような選択的誘導体化によって、蛋白への水溶性ポリマーの付着が抑制され、ポリマーとの接合が蛋白のＮ末端で支配的に起こり、リジン側鎖アミノ基などの他の反応性基にはほとんど変化が起こらない。還元的アルキル化を用いる場合、水溶性ポリマーは上記の種類のものとすることができ、蛋白への結合のための１個の反応性アルデヒドがなければならない。１個の反応性アルデヒドを有するポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドを使用することができる。
【００３０】
治療薬製造を容易にするには、Ｎ末端モノＰＥＧ化誘導体が好ましい。Ｎ末端ＰＥＧ化により、生成物の特性決定がジ、トリその他の複数ＰＥＧ化生成物の場合と比較して簡単である均質な生成物が得られる。上記のＮ末端生成物製造のための還元的アルキル化方法を用いることが、商業的製造を容易にする上で好ましい。
【００３１】
本発明のさらに別の態様では、蛋白および誘導体の医薬組成物を用いる方法が提供される。そのような医薬組成物は、注射用、あるいは経口投与、肺投与、経鼻投与、経皮投与その他の投与形態用のものであることができる。有効量の本発明の蛋白もしくは誘導体と医薬的に許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、補助剤および／または担体とを含む医薬組成物が本発明に含まれる。そのような組成物は、各種緩衝剤含有量（例：トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；洗剤および可溶化剤（例：Ｔｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、酸化防止剤（例：アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例：チメルゾル（Thimersol）、ベンジルアルコール）および増量剤（例：乳糖、マンニトール）などの添加物を含み、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の粒子状物あるいはリポソームへの材料の取り込みが行われる。ヒアルロン酸も使用することができ、それは循環系における持続期間を延長する効果を有する場合がある。そのような組成物は、本発明の蛋白および誘導体の物理的状態、安定性、in vivoでの放出速度、in vivoでのクリアランス速度に影響を与え得るものである（例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.(1990, Mack Publishing Co.,Easton, PA 18042), pp.1435-1712参照；引用によって本明細書に含まれるものとする）。この組成物は、液体製剤で製造することができるか、あるいは凍結乾燥品などの乾燥粉末とすることができる。経皮製剤のような植え込み可能な徐放製剤も想到される。
【００３２】
経口固体製剤（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.(1990, Mack Publishing Co.,Easton, PA 18042), Chapter 89（引用によって本明細書に含まれるものとする）に記載のもの）が本発明での使用で想到される。固体製剤には、錠剤、カプセル、丸薬、トローチもしくはロゼンジ、カシェ剤またはペレットなどがある。さらに、リポソームカプセル封入またはプロテイノイドカプセル封入を用いて、本発明の組成物を製剤することもできる（例えば、米国特許４９２５６７３号に記載のプロテイノイドミクロスフェアなど）。リポソームカプセル封入を用いることができ、リポソームは各種ポリマーで誘導体化できる（例：米国特許５０１３５５６号）。治療薬用に使用可能な固体製剤についての記載がマーシャルの著作にある（Marshall,K., Modern Pharmaceutics, ed. by G.S.Banker and C.T.Rhodes, Chapter 10, 1979；引用によって本明細書に含まれるものとする）。製剤には、その蛋白（またはそれの類縁体もしくは誘導体）ならびに胃環境に対する保護および腸での生理活性物質の放出を可能とするための不活性成分を含有させる。
【００３３】
具体的には、上記の誘導体化蛋白の経口製剤も想到される。蛋白を化学修飾して、誘導体の経口投与を有効に行えるようにすることができる。一般に、想到される化学修飾は、（ａ）蛋白分解の阻害および（ｂ）胃または腸からの血流への取り込みを可能とする１以上の部分の蛋白（もしくはペプチド）分子自体への付加である。さらに、蛋白の全体的安定性の向上および体内での循環時間の延長も望ましい。そのような部分の例としては、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリプロリンなどがある（Abuchowski and Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, in "Enzymes as Drugs", Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, (1981), pp.367-383; Newmark, et al., J.Appl.Biochem. 4:185-189(1982)）。使用可能な他のポリマーには、ポリ−１，３−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−トリオキソランがある。
【００３４】
蛋白（または誘導体）の場合、放出箇所は胃、小腸（十二指腸、空腸または回腸）または大腸であることができる。当業者であれば、胃では溶けないが十二指腸や腸の他の箇所でその物質を放出する製剤を使用することができる。好ましくはその放出は、蛋白（または誘導体）の保護あるいは腸などの胃環境を過ぎてからの生理活性物質の放出によって、胃環境の悪影響を回避するものである。
【００３５】
胃での十分な耐性を確保するには、少なくともｐＨ５．０まで不透過性のコーティングが必須である。腸溶コーティングとして使用されるより一般的な不活性成分の例としては、セルロース酢酸トリメリテート（ＣＡＴ）、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ５０、ＨＰＭＣＰ５５、ポリビニル酢酸フタレート（ＰＶＡＰ）、ユードラジット（Eudragit）Ｌ３０Ｄ、アクアテリック（Aquateric）、セルロース酢酸フタレート（ＣＡＰ）、ユードラジットＬ、ユードラジットＳおよびシェラック（shellac）がある。これらのコーティングは、混合フィルムとして使用することができる。
【００３６】
コーティングまたはコーティング混合物は、胃に対する保護を目的としない錠剤にも使用することができる、それには、糖衣または錠剤を嚥下しやすくするためのコーティングなどがあり得る。カプセルは、粉剤などの乾燥治療薬投与用の硬殻（ゼラチンなど）から成ることができ、液剤用には軟ゼラチン殻を使用することができる。カシェ剤の殻材料としては、厚いデンプンその他の食用紙があり得る。丸薬、ロゼンジ、成型錠剤または湿製錠剤の場合、湿式塊化法（moist massing techniques）を用いることができる。
【００３７】
治療薬は、粒径約１ｍｍの顆粒またはペレットの形態での微小複合粒子（multiparticulates）としての製剤で含有させることができる。カプセル投与用の材料の製剤は、粉末で軽く加圧したプラグ（plug）または錠剤であることもできる。治療薬は圧縮によって製造することが可能である。
【００３８】
着色剤および芳香剤はいずれも含有させることができる。例えば、蛋白（または誘導体）を製剤し（例えばリポソームカプセル封入またはミクロスフェアカプセル封入によって）、さらに着色剤および芳香剤を含む冷蔵飲料などの食用製品中に含有させることもできる。
【００３９】
不活性材料によって治療薬を希釈したり、増量させることができる。その希釈剤には、特にマンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、ショ糖、修飾デキストリン類およびデンプンのような炭水化物などがあり得る。トリリン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムなどのある種の無機塩類も充填剤として使用することができる。市販の希釈剤を数例挙げると、ファスト−フロ（Fast-Fro）、エムデックス（Emdex）、ＳＴＡ−Ｒｘ １５００、エンコンプレス（Emcompress）およびアビセル（Avicell）などがあり得る。
【００４０】
治療薬の製剤では、固体製剤に崩壊剤を含有させることができる。崩壊剤として使用される材料には、デンプンに基づく市販の崩壊剤であるエクスプロタブ（Explotab）のようなデンプンなどがあるが、それに限定されるものではない。グリコール酸デンプンナトリウム、アンバーライト、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン（ultramylopectin）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、橙皮、酸カルボキシメチルセルロース、天然スポンジおよびベントナイトはいずれも使用可能である。別の形の崩壊剤には、不溶性カチオン交換樹脂がある。粉末ガムを崩壊剤および結合剤として用いることができ、それには寒天、カラヤガムまたはトラガカントガムなどの粉末ガムなどがあり得る。アルギン酸およびそれのナトリウム塩も崩壊剤として有用である。
【００４１】
結合剤を用いて治療薬を保持して硬錠剤を形成することができ、その結合剤には、アカシアガム、トラガカントガム、デンプンおよびゼラチンなどの天然物からの材料などがある。他には、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）などがある。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）をいずれもアルコール溶液で使用して、治療薬の造粒を行うことができる。
【００４２】
減摩剤を治療薬製剤に含有させて、製剤工程中の粘着を防止することができる。治療薬と金型壁との間の層として潤滑剤を用いることができ、それにはステアリン酸（それのマグネシウム塩およびカルシウム塩を含む）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油およびロウなどがあるが、これらに限定されるものではない。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、各種分子量のポリエチレングリコール、カーボワックス（Carbowax）４０００および６０００などの可溶性潤滑剤を使用することもできる。
【００４３】
製剤時の薬剤の流動性を改善したり、圧縮時の再配列を容易にする滑剤を加えることも可能であると考えられる。滑剤には、デンプン、タルク、焼成シリカおよび水和シリコアルミネートなどがあり得る。
【００４４】
治療薬の水系環境への溶解を助けるため、湿展剤として界面活性剤を加えることも考えられる。界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナトリウムなどのアニオン系洗剤などがあり得る。カチオン系洗剤を使用することが可能であり、それには塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムなどがある。界面活性剤として製剤に含有させることができると考えられるノニオン系洗剤を挙げると、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０および６０、モノステアリン酸グリセリン、ポリソルベート４０、６０、６５および８０、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロースならびにカルボキシメチルセルロースがある。これらの界面活性剤は、単独であるいは各種比率での混合物として、蛋白もしくは誘導体の製剤に存在させることができると考えられる。
【００４５】
蛋白（または誘導体）の取り込みを促進する可能性のある添加剤としては例えば、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸などの脂肪酸がある。
【００４６】
徐放製剤が望ましい場合がある。拡散機構または浸出機構による放出を可能とする不活性基剤（すなわちガム）に薬剤を取り込ませることができる。徐々に分解する基剤を製剤に組み入れることもできる。この治療薬の別の形態の徐放は、オロス（Oros）治療薬系（Alza Corp.）に基づく方法によるものである。すなわち、水を浸入させ、浸透圧効果によって１個の小さい開口から薬剤を押し出すことができる半透膜中に、薬剤を封入するものである。一部の腸溶コーティングも遅延性放出効果を有するものである。
【００４７】
製剤には他のコーティングを使用することができる。それには、糖衣器で使用することができる各種糖などがある。治療薬はさらに、フィルムコーティング剤で投与することも可能であり、その場合に使用される材料は２つの群に分けられる。第１の群は、非腸溶性材料であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、プロビドン（providone）およびポリエチレングリコール類などがある。第２の群は腸溶性材料からなり、一般的にはフタル酸のエステルである。
【００４８】
材料を混合することで最適なフィルムコーティングを得ることも考えられる。フィルムコーティングは糖衣器もしくは流動床で、あるいは圧縮コーティングによって行うことができる。
【００４９】
本発明においては、本発明の蛋白またはそれの誘導体を肺投与することも想到される。蛋白（誘導体）は、吸入しながら哺乳動物の肺に投与され、肺上皮内層を通過して血流に入る（これについての他の報告には次のものがある；Adjei et al., Pharmaceutical Research 7:565-569(1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics 63: 135-144(1990)（酢酸ロイプロリド）; Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology 13(suppl.5): s.143-146(1989)（エンドテリン−１）; Hubbard et al., Annals of Internal Medicine 3:206-212(1989)（α１−抗トリプシン）;Smith et al., J.Clin.Invest.84:1145-1146(1989)（α−１−プロテイナーゼ）; Oswein et al., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, 1990（組換えヒト成長ホルモン）; Debs et al., The Journal of Immunology 140:3482-3488(1988)（インターフェロン−γおよび腫瘍壊死因子α）; Platz et al., 米国特許５２８４６５６号（顆粒球コロニー刺激因子））。
【００５０】
本発明の実施においては、治療薬の肺投与用の多種の装置を使用することが想到され、それには噴霧吸入器、用量計量吸入器および粉剤吸入器などの当業者には周知のものなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
本発明の実施に好適な市販装置の具体例をいくつか挙げると、ウルトラベント（Ultravent）噴霧吸入器（製造者：Mallinckrodt, Inc., St.Louis, Missouri）、エーコーン（Acorn）ＩＩ噴霧吸入器（製造者：Marquest Medical Products, Englewood, Colorado）、ベントリン（Ventolin）用量計量吸入器（製造者：Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina）およびスピンヘイラー（Spinhaler）粉剤吸入器（製造者：Fisons Corp., Bedford, Massachusetts）がある。
【００５２】
そのような装置のいずれにおいても、蛋白（または類縁体もしくは誘導体）の投薬に好適な製剤を使用する必要がある。通常、各製剤は使用される装置の種類に固有のものであり、治療に有用な希釈剤、補助剤および／または担体に加えて、適切な墳射剤を使用する場合がある。
【００５３】
蛋白（または誘導体）は最も有利には、遠位肺への最も有効な投与を行うために、平均粒径１０μｍ未満、最も好ましくは０．５〜５μｍの粒子状に製剤しなければならない。
【００５４】
担体には、トレハロース、マンニトール、キシリトール、ショ糖、乳糖、ソルビトールのような炭水化物などがある。製剤で使用する他の成分には、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣおよびＤＯＰＣなどがあり得る。天然または合成の界面活性剤を使用することができる。ポリエチレングリコールを使用することができる（蛋白または類縁体の誘導体化での使用以外であっても）。シクロデキストリンなどのデキストリン類を使用することができる。胆汁酸塩および他の関連する相乗剤を使用することができる。セルロースおよびセルロース誘導体を使用することができる。緩衝剤製剤での使用などで、アミノ酸を使用することができる。
【００５５】
さらに、リポソーム、マイクロカプセルもしくはミクロスフェア、包接錯体その他の種類の担体の使用も想到される。
【００５６】
噴射式または超音波式のいずれかの噴霧吸入器での使用に好適な製剤は代表的には、液剤１ｍＬ当たり生理活性蛋白約０．１〜２５ｍｇの濃度となるように水に溶かした蛋白（または誘導体）を含有するものである。その製剤には、緩衝剤および単糖を含有させることもできる（例えば、蛋白の安定化および浸透圧の調節のため）。噴霧吸入器用製剤には界面活性剤を含有させて、エアロゾル形成時の液剤霧化によって生じる蛋白の表面誘発凝集を低減もしくは防止することもできる。
【００５７】
用量計量吸入器で使用する製剤は通常、界面活性剤を用いて噴射剤中に懸濁させた蛋白（または誘導体）を含む微細粉末を含有する。噴射剤は、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボンまたは炭化水素などのその目的に使用される従来の材料とすることができ、それには具体的にはトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノールおよび１，１，１，２−テトラフルオロエタンあるいはそれらの組み合わせなどがある。好適な界面活性剤には、トリオレイン酸ソルビタンおよび大豆レシチンなどがある。オレイン酸も、界面活性剤として有用であると考えられる。
【００５８】
粉剤吸入器からの投薬用の製剤は、蛋白（または誘導体）を含有する微細乾燥粉末を含むものであり、乳糖、ソルビトール、ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはキシリトールのような増量剤を、例えば製剤の５０〜９０重量％のように装置からの粉剤の分散を容易にするような量で含有することもできる。
【００５９】
蛋白（または類縁体もしくは誘導体）の経鼻投与も想到される。経鼻投与によって、治療薬を鼻に投与した直後に蛋白の血流への通過を行うことができ、薬剤を肺に堆積させる必要がない。経鼻投与用の製剤には、デキストリンまたはシクロデキストリンを含むものなどがある。他の粘膜を通っての輸送を介した投与も想到される。
【００６０】
当業者であれば、投与と所望の治療効果を観察することで、有効用量を確認することができる。好ましくは、その分子の製剤は、約０．１０μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日で所望の治療効果が得られるようなものとする。有効用量は、経時的診断手段を用いて決定することができる。例えば、血中（または血漿もしくは血清中）のＯＢ蛋白の量を測定する診断を最初に行って、ＯＢ蛋白の内因性レベルを求めることができる。そのような診断手段は、抗体サンドイッチアッセイなどの抗体アッセイの形態であることができる。内因性ＯＢ蛋白の量を最初に定量し、基底線値を求める。治療中に内因性および外因性のＯＢ蛋白（すなわち、自己産生または投与された体内で認められる蛋白、類縁体または誘導体）の定量を継続することで、治療用量を求める。従って、用量は治療中に変動し得るものであり、治療効果が認められるまで最初は比較的高用量を用い、治療効果の維持には比較的低用量を用いる。
【００６１】
理想的には、非脂肪体重増加のみが望まれる場合は、体重減を行うにはその用量は不十分である。そこで、肥満者の治療の初期では、体重減と同時に脂肪組織減／非脂肪体重増が得られるような用量を投与することができる。十分な体重減が得られたら、体重の再増加を防止するが所望の非脂肪重増加（あるいは非脂肪重低下の防止）を維持するだけの用量を投与することができる。ＯＢ蛋白の効果は可逆的であることから、これらの用量は経験的に決定することができる（例：Campfield et al., Science 269:546-549(1995),p.547）。そこで、体重減少が望ましくない場合に体重減が認められる場合、それより低い用量を投与することで、非脂肪組織重の所望の増加を得て、しかも所望の体重を維持することになろう。
【００６２】
対象者のインシュリンに対する感受性を高めるには、同様の用量検討を考慮することになると考えられる。体重減を伴わない非脂肪重増加が得られれば、対象者に対して糖尿病治療向けに投与されるインシュリン（あるいはアミリンその他の糖尿病治療薬）の量を低下させることができると考えられる。
【００６３】
全身活力を高めるため、同様の用量検討を行うことができる。全身活力の同時向上を伴う非脂肪重増加は、体重減を得るには不十分な用量で得ることができる。赤血球数（および血液における酸素化）増加および骨吸収の低下もしくは骨粗鬆症の軽減などの他の効果も、体重減なく得ることができる。
【００６４】
本発明の方法を、糖尿病治療に有用な薬剤（例：インシュリンおよび可能性としてアミリン）、コレステロールおよび降圧剤（血液脂質濃度を低下させる薬剤その他の心血管薬）ならびに活動性向上薬（例：アンフェタミン類）などの他の薬剤と併用することができる。食欲抑制薬も使用することができる。そのような投与は同時に、または連続的に行うことができる。
【００６５】
さらに本発明の方法を、身体の全体的容貌を変えるための美容手術などの外科手術（例：体重減少のための脂肪吸引またはレーザ手術あるいは身体の見かけを増加させるための移植術）と併用することができる。動脈プラークなどの脂肪沈着物による血管閉塞によって起こる有害な状態を緩和するためのバイパス術その他の手術のような心臓手術の医療上の効果を、本発明の組成物および方法を併用することで高めることができる。超音波法またはレーザ法などの胆石除去方法を、本発明の治療方法の前、途中または後に行うこともできる。さらに、本発明の方法を、骨折、筋肉損傷の手術または治療その他の非脂肪組織重の増加によって改善される可能性のある療法に対する補助手段として行うことができる。
【００６６】
従って本発明の方法は、非脂肪組織重増加方法において、
（ａ）配列番号２（下記）または配列番号４（下記）に示したアミノ酸配列１〜１４６；
（ｂ）位置３５にリジン残基と位置７４にイソロイシン残基を有する配列番号４（下記）に示したアミノ酸配列群１〜１４６；
（ｃ）位置４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５（配列番号４による番号割り付けを用い、位置２８におけるグルタミン残基がなくとも同じ番号割り付けを維持して）のうちの１以上において異なるアミノ酸による置換がある上記下位項目（ｂ）のアミノ酸配列；
（ｄ）位置２８のグルタミン残基が欠失していても良い上記下位項目（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列；
（ｅ）Ｎ末端にメチオニン残基を有する上記下位項目（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列；
（ｆ）（位置３５にリジン残基と位置７４にイソロイシン残基を有する配列番号４の番号割り付けを用いて）
（ｉ）アミノ酸９８〜１４６
（ｉｉ）アミノ酸１〜３２
（ｉｉｉ）アミノ酸４０〜１１６
（ｉｖ）アミノ酸１〜９９および１１２〜１４６
（ｖ）アミノ酸９９と１１２の間にアミノ酸１００〜１１１の１以上がその順序で存在するアミノ酸１〜９９および１１２〜１４６；
（ｖｉ）アミノ酸１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５のうちの１以上が別のアミノ酸によって置換されている上記下位項目（ｉ）の切断ＯＢ類縁体；
（ｖｉｉ）アミノ酸４、８および３２のうちの１以上が別のアミノ酸によって置換されている上記下位項目（ｉｉ）の切断類縁体；
（ｖｉｉｉ）アミノ酸５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１および１１２のうちの１以上が別のアミノ酸によって置換されている上記下位項目（ｉｉｉ）の切断類縁体；
（ｖｉｘ）アミノ酸４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５のうちの１以上が別のアミノ酸によって置換されている上記下位項目（ｉｖ）の切断類縁体；
（ｘ）アミノ酸４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５のうちの１以上が別のアミノ酸によって置換されている上記下位項目（ｖ）の切断類縁体；
（ｘｉ）Ｎ末端メチオニン残基を有する上記下位項目（ｉ）〜（ｘ）のいずれかの切断類縁体から選択される切断ＯＢ蛋白類縁体；
（ｇ）蛋白部分に連結した化学部分を有してなる上記下位項目（ａ）〜（ｆ）のいずれかのＯＢ蛋白もしくは類縁誘導体；
（ｈ）前記化学部分が水溶性ポリマー部分である上記下位項目（ｇ）の誘導体；
（ｉ）前記水溶性ポリマー部分がポリエチレングリコールである上記下位項目（ｈ）の誘導体；
（ｊ）前記水溶性ポリマー部分がポリアミノ酸部分である上記下位項目（ｈ）の誘導体；
（ｋ）前記水溶性ポリマー部分が前記蛋白部分のＮ末端のみに結合している上記下位項目（ｈ）の誘導体；
（ｌ）上記下位項目（ａ）〜（ｋ）のいずれかのＯＢ蛋白、類縁体もしくは誘導体から選択される有効量のＯＢ蛋白、該蛋白の類縁体もしくは誘導体が医薬的に許容される担体に入ったものを投与する段階を有してなる方法を提供するものである。
【００６７】
【実施例】
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。実施例１は、ＯＢ蛋白が非肥満動物における非脂肪重増加に有効であることを示すものである。実施例２は、ＯＢ蛋白が肥満霊長動物における非脂肪重増加に有効であることを示すものである。実施例３〜５は、ヒトでの使用の予想実施例である。材料および方法がそれに続く。
【００６８】
実施例１
以下のデータは、ＯＢ蛋白またはそれの類縁体もしくは誘導体が非脂肪重増加に対して有効であることを示している。
組換えメチオニンマウスＯＢ蛋白（以下に説明）を４週間にわたって浸透ポンプ注入によって連続投与した。表１のデータは、表に示した用量での平均体重組成（ＣＤ１マウスで）を示している。
【００６９】
【表１】
非肥満ＣＤ１マウスでは、０．３または１ｍｇ／ｋｇ／日の用量で組換えメチオニンマウスＯＢ蛋白を連続投与することで、ＰＢＳを投与した対照動物と比較して、非脂肪重の増加を生じることが明らかになった。
【００７０】
実施例２
本実施例は、組換えメチオニンヒトＯＢ蛋白によって、霊長動物で非脂肪組織重増加が生じることを示すものである。
体脂肪率が２０％を超える肥満カニクイザルに、１日用量１ｍｇ蛋白／ｋｇ／日で組換えメチオニンヒトＯＢ蛋白を皮下投与した（以下の材料および方法の欄参照）。対照動物には、リン酸緩衝生理食塩水を投与した。二重エネルギーＸ線吸光光度分析（「ＤＥＸＡ」）を用いて身体組成検査を行った。身体組成の測定は７日間間隔で行った。
表２Ａおよび２Ｂには、脂肪組織または非脂肪組織に関する身体組成分析の結果を示してある。データはグラム単位で表してある。２匹の対照動物についての結果を表２Ａに示してある。４匹の試験動物についてのデータを表２Ｂに示してある（骨質量データも示してある）。表からわかる通り、第２８日で、試験動物は約２６４ｇの脂肪を失い、約１３８ｇの非脂肪重を獲得した。第２８日で、対照動物は３６ｇの脂肪組織を失い、約２５ｇの非脂肪重を獲得した。これは、ＯＢ蛋白が非脂肪組織重の増加を起こすことを示している。
【００７１】
【表２】
【００７２】
実施例３
非肥満ヒト患者は、非脂肪組織重が減少した病気からの回復などの治療目的で、非脂肪組織重増加を望む。患者に対して有効量のＯＢ蛋白、それの類縁体または誘導体を投与することで、非脂肪組織重に所望の増加が得られる。非組織重増加は、ＤＥＸＡ走査を用いてモニタリングする。ＯＢ蛋白（または利用可能な場合は他の抗原性源）に対する抗体アッセイなどの診断キットを用いて、循環ＯＢ蛋白または類縁体もしくは誘導体の濃度をモニタリングすることができる。
【００７３】
実施例４
ヒト対象者は、非脂肪組織増加による容貌向上などの美容上または運動上の目的で、非脂肪組織重増加を望む。対象者に対して有効量のＯＢ蛋白、それの類縁体または誘導体を投与することで、非脂肪組織重に所望の増加が得られる。非脂肪組織重増加は、ＤＥＸＡ走査を用いてモニタリングする。血中酸素濃度が上昇する。ＯＢ蛋白（または利用可能な場合は他の抗原性源）に対する抗体アッセイなどの診断キットを用いて、循環ＯＢ蛋白または類縁体もしくは誘導体の濃度をモニタリングすることができる。
【００７４】
実施例５
ヒト糖尿病患者は、糖尿病治療のために使用するインシュリン用量の低減を望む。患者に対して有効量のＯＢ蛋白、それの類縁体または誘導体を投与することで、非脂肪組織重に増加が得られる。インシュリンに対する患者の感受性が上昇し、糖尿病の症状を緩和するのに必要なインシュリンの用量が、必要なインシュリンの単位数低下または１日当たり必要なインシュリン注射回数の低下のいずれかで低下する。ＯＢ蛋白（または利用可能な場合は他の抗原性源）に対する抗体アッセイなどの診断キットを用いて、循環ＯＢ蛋白または類縁体もしくは誘導体の濃度をモニタリングすることができる。
【００７５】
実施例６
非肥満高齢ヒト対象者は、全身活力の向上を望む。対象者に対して有効量のＯＢ蛋白、それの類縁体または誘導体を投与することで、非脂肪組織重に増加を得て、全身活力を向上させる。骨吸収も低下し、骨粗鬆症状態が改善される。ＯＢ蛋白（または利用可能な場合は他の抗原性源）に対する抗体アッセイなどの診断キットを用いて、循環ＯＢ蛋白または類縁体もしくは誘導体の濃度をモニタリングすることができる。
【００７６】
材料および方法
動物：
齧歯類
実施例１には、野生型ＣＤ１マウスを用いた（表１のデータ）。動物は、愛護的条件下に維持した。
霊長動物：
計６匹のカニクイザルを用いた。サルはいずれも、試験開始時には脂肪率２０％以上であった。動物は体重について無作為化し、動物４匹についてＯＢ蛋白による試験を行い、２匹は対照とした。
【００７７】
蛋白または媒体の投与
齧歯類の場合
実施例１の場合（表１のデータ）、組換えマウス蛋白（以下に記載）または媒体（リン酸緩衝生理食塩水、「ＰＢＳ」、ｐＨ７．４）を、浸透ポンプ注入によって投与した。浸透小型ポンプ（Alzet, Alza, Palo Alto, CA、２００２型）を、各マウスの肩甲下領域の皮下嚢部に手術によって植え込み、２週間後に交換した。ポンプの較正を行って、表１に示した用量で、１時間当たり０．５μ蛋白の溶液を投与するようにした。
霊長動物の場合
実施例２の場合、１ｍｇ／ｍＬＰＢＳで調製した組換えメチオニンヒトＯＢ蛋白（位置３５にリジン、位置７４にイソロイシンを有する配列番号４のもの）を、用量１ｍｇ蛋白／ｋｇ／日で皮下投与した。対照動物には、同じやり方でＰＢＳを投与した。
齧歯類屠体分析
レシュナーらの方法に従って屠体分析を行った（A.I.Leshner, V.A.Litwin and R.L.Squibb, Brain Res. 9:281 (1972)）。４日間の脱水期間の前後での屠体重量差によって、水分組成を求めた。粉砕・乾燥した屠体の予め秤量した一部から、エチルエーテルおよびエチルアルコールで脂肪の抽出を行って、抽出法後に残ったものの量から脂肪パーセントを計算できた。非脂肪重は、脱水およびエーテル抽出後に残った粉砕屠体の割合と定義した。
【００７８】
霊長動物二重エネルギーＸ線吸光光度分析走査
実施例２では、表２Ａおよび２Ｂに示した時点で、「ＤＥＸＡ」走査を行った。
蛋白
配列番号１および２はマウス組換えＯＢ ＤＮＡおよび蛋白を示し、配列番号３および４は類縁の組換えヒトＯＢ ＤＮＡおよび蛋白を示している。実施例１では、配列番号２のマウス組換え蛋白を使用した。実施例２では、位置３５にリジン残基と位置７４にイソロイシン残基を有する配列番号４に示した組換えヒトＯＢ蛋白を用いた。上記のように、以下のマウスおよびヒト類縁の組換え蛋白は、本発明の医薬品の投与方法および製造方法で使用できるＯＢ蛋白を例示するものであって、他のＯＢ蛋白またはそれの類縁体もしくは誘導体を使用することは可能である。
【００７９】
本明細書において、組換え蛋白のアミノ酸配列の最初のアミノ酸を＋１とし、それはバリンであって、位置−１のアミノ酸はメチオニンである。Ｃ末端アミノ酸は番号１４６である（システイン）。
【００８０】
組換えマウスメチオニンＯＢ（二本鎖）ＤＮＡおよびアミノ酸配列（配列番号１および２）
【００８１】
【化１】
【００８２】
組換えヒトメチオニンＯＢ類縁（二本鎖）ＤＮＡおよびアミノ酸配列（配列番号３および４）
【００８３】
【化２】
【００８４】
【製造方法】
以下の製造方法を用いて、生理活性の組換えメチオニンマウスまたはヒト類縁ＯＢ蛋白を製造した。同様の方法を用いて、生理活性組換えメチオニンヒトＯＢ蛋白を製造することができる。
【００８５】
発現ベクターおよび宿主株
使用したプラスミド発現ベクターはｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ寄託番号６９５７６）である。上記のＤＮＡをＸｂａＩおよびＢａｍＨＩによって直線とした発現ベクターｐＣＦＭ１６５６に連結し、大腸菌宿主株ＦＭ５に形質転換した。大腸菌ＦＭ５細胞は、大腸菌Ｋ−１２株（Bachmann et al., Bacteriol.Rev.40:116-167(1976)）からアムジェン（Amgen Inc., Thousand Oaks, CA）で誘導したものであり、組み込みλファージ抑制遺伝子ｃＩ８５７を有する（Sussman et al., C.R.Acad.Sci. 254:1517-1579(1962)）。ベクター製造、細胞形質転換およびコロニー選択は、標準的方法によって行った（例：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。宿主細胞はＬＢ培地で成長させた。
【００８６】
発酵工程
フェド−バッチ培養法として知られる３段階発酵プロトコールを用いた。培地組成は以下の通りである。
【００８７】
バッチ：窒素・リン酸源を発酵槽（Biolafitte、容量１２リットル）で滅菌した（昇温して１２２℃で３５分間、１８〜２０ｐｓｉ）。冷却時に、炭素源、マグネシウム源、ビタミン源および微量金属源を無菌的に加えた。５００ｍＬの上記組換えマウス蛋白産生菌（ＬＢ肉汁で成長させたもの）の終夜培養物（１６時間以上）を発酵槽に入れた。
【００８８】
供給液Ｉ：ＯＤ６００が４．０〜６．０に達した時点で、培地に供給液Ｉを加えた。グルコースの供給は速度を制限しながら行って、成長速度（μ）を制御した。自動システム（分配制御システムと称する）を設定して、成長速度を１時間当たり０．１５世代に制御した。
【００８９】
供給液ＩＩ：ＯＤ６００が３０に達した時点で、培養温度を徐々に上げて４２℃とし、供給液を下記の供給液ＩＩに変えた。２時間ごとにサンプリングを行いながら、発酵を１０時間継続した。１０時間後、発酵槽の内容物を冷却して２０℃以下とし、遠心によって回収した。
【００９０】
培地組成
バッチ：
１０ｇ／Ｌ 酵母抽出物
５．２５ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４
３．５ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４
４．０ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４
５．０ｇ／Ｌ グルコース
１．０ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
２．０ｍＬ／Ｌ ビタミン溶液
２．０ｍＬ／Ｌ 微量金属溶液
１．０ｍＬ／Ｌ Ｐ２０００消泡剤
供給液Ｉ：
５０ｇ／Ｌ バクトトリプトン
５０ｇ／Ｌ 酵母抽出物
４５０ｇ／Ｌ グルコース
８．７５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
１０ｍＬ／Ｌ ビタミン溶液
１０ｍＬ／Ｌ 微量金属溶液
供給液ＩＩ：
２００ｇ／Ｌ バクトトリプトン
１００ｇ／Ｌ 酵母抽出物
１１０ｇ／Ｌ グルコース。
【００９１】
ビタミン溶液（バッチおよび供給液Ｉ）：ビオチン０．５ｇ、葉酸０．４ｇおよびリボフラビン４．２ｇをＨ２Ｏ ４５０ｍＬおよび１０Ｎ ＮａＯＨ ３ｍＬに溶かし、Ｈ２Ｏを加えて５００ｍＬとした。ピリドキシン−ＨＣｌ １４ｇおよびナイアシン６１ｇをＨ２Ｏ １５０ｍＬおよび１０Ｎ ＮａＯＨ ５０ｍＬに溶かし、Ｈ２Ｏで２５０ｍＬとした。パントテン酸５４ｇをＨ２Ｏ ２００ｍＬに溶かし、２５０ｍＬとした。これら３種類の溶液を混合し、総量１０リットルとした。
【００９２】
微量金属溶液（バッチおよび供給液Ｉ）：
塩化第ＩＩ鉄（ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ）：２７ｇ／Ｌ
塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）：２ｇ／Ｌ
塩化コバルト（ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）：２ｇ／Ｌ
モリブデン酸ナトリウム（ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ）：２ｇ／Ｌ
塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）：１ｇ／Ｌ
硫酸第ＩＩ銅（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）：１．９ｇ／Ｌ
ホウ酸（Ｈ３ＢＯ３）：０．５ｇ／Ｌ
塩化マンガン（ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）：１．６ｇ／Ｌ
クエン酸ナトリウム・２水和物：７３．５ｇ／Ｌ。
【００９３】
マウスＯＢ蛋白の精製方法
以下の段階によって精製を行った（別断の断りがない限り、以下の段階は４℃で行った）。
【００９４】
１．細胞ペースト
大腸菌細胞ペーストを５倍容量の７ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）に懸濁した。ＥＤＴＡ中の細胞をミクロ流動装置に２回通してさらに粉砕した。粉砕細胞をベックマン（Beckman）Ｊ６−Ｂ遠心管中、ＪＳ−４．２ローターを用いて４．２Ｋｒｐｍで１時間遠心した。
２．封入体洗浄１
上記からの上清を除去し、ペレットを５倍容量の７ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）に再懸濁し、均質化した。この混合物を段階１の方法で遠心した。
３．封入体洗浄２
上記からの上清を除去し、ペレットを１０倍容量の２０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ ＤＴＴおよび１％デオキシコレートに再懸濁し、均質化した。この混合物を段階１の方法で遠心した。
４．封入体洗浄３
上記からの上清を除去し、ペレットを１０倍容量の蒸留水に再懸濁し、均質化した。この混合物を段階１の方法で遠心した。
５．巻き戻し
ペレットについて室温で、１５倍容量の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ８．５）、１％サルコシンナトリウム（Ｎ−ラウロイルサルコシン）で巻き戻しを行った。６０分後、溶液を６０μＭ硫酸銅液とし、終夜攪拌した。
６．サルコシンの除去
巻き戻し混合物を、５倍容量の１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈し、段階１の方法に従って遠心した。上清を回収し、希釈巻き戻し混合物の総容量の０．０６６％で、２０〜５０メッシュで塩素型のダウエックス（Dowex）（登録商標）１−Ｘ４樹脂（Dow Chemical Co., Midland MI）と、攪拌下に１時間混合した（ダウエックス（登録商標）の詳細についてはＷＯ ８９／１０９３２の２６頁参照）。この混合物をカラムに注ぎ入れ、溶出液を回収した。サルコシンの除去を、逆相ＨＰＬＣによって確認した。
７．酸沈殿
前段階からの溶出液を回収し、ｐＨを調節してｐＨ５．５とし、室温で３０分間インキュベーションした。この混合物を段階１の方法に従って遠心した。
８．カチオン交換クロマトグラフィー
前段階からの上清のｐＨを調節してｐＨ４．２とし、ＣＭセファロース・ファスト・フロー（Sepharose Fast Flow）に負荷した（７％容量）。２０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ ４．２で、２０倍カラム容量にて０Ｍから１．０ＭＮａＣｌの塩勾配溶離を行った。
９．疎水性相互作用クロマトグラフィー
前段階からのピーク分画のＣＭセファロース蓄積液（紫外線吸光度から確認）を０．２Ｍ硫酸アンモニウム液とした。５ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ ４．２で、２０倍カラム容量にて０．４Ｍから０Ｍ硫酸アンモニウムの逆相勾配溶離を行った。この材料を濃縮し、ＰＢＳに透析濾過した。
【００９５】
組換えヒトＯＢ蛋白類縁体の発酵
上記の宿主細胞の発酵による組換えヒトＯＢ蛋白類縁体（配列番号４）の製造は、組換えマウス材料について前述した条件および組成物を用いて行うことができる。
【００９６】
組換えヒトＯＢ蛋白類縁体の精製
組換えヒト蛋白類縁体の精製は、上記の実施例１に記載の方法に従って、組換えマウス蛋白の精製に用いた方法と同様の方法を用いて行うことができる。組換えヒトＯＢ蛋白類縁体を得るには、段階７からの上清のｐＨをｐＨ５．０に調節し、それをＣＭセファロース・ファスト・フローカラムに負荷することで、段階８を行わなければならない。２０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ ５．５で、２０倍カラム容量にて０Ｍから０．５Ｍ ＮａＣｌの塩勾配溶離を行わなければならない。段階９は、ＣＭセファロース蓄積液を水で４倍に希釈し、ｐＨを７．５に調節することで行わなければならない。この混合物を０．７Ｍ硫酸アンモニウム液としなければならない。５ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ ５．５で、２０倍カラム容量にて０．２Ｍから０Ｍ硫酸アンモニウムの逆相勾配溶離を行わなければならない。それ以外は上記の段階と同じである。実施例２の材料については、位置３５にリジンおよび位置７４にイソロイシンを有する配列番号４の組換えヒトＯＢ蛋白を、１０ｍＭヒスチジン、４．３％アルギニンを含む緩衝液でｐＨ６．０にて製剤した。
【００９７】
以上、好ましい実施態様によって本発明について説明したが、当業者が変更および修正を行ない得ることは明らかである。従って請求の範囲が、特許請求される発明の範囲に含まれるそのような均等な変更全てを含むものである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、非脂肪組織重を増加させるためのＯＢ蛋白組成物の使用方法に関するものである。
【０００２】
【発明の背景】
肥満の分子的基礎はかなり不明な部分があるが、「ＯＢ遺伝子」およびそれによりコードされた蛋白（「ＯＢ蛋白」）の特定によって、体が体脂肪蓄積を調節するのに使用している機序についていくらか理解が進んだ（Zhang et al., Nature 372: 425-432(1994); the Correction at Nature 374: 479(1995)も参照）。ＯＢ蛋白は、ｏｂ／ｏｂ突然変異マウス（ＯＢ遺伝子産物の産生欠陥故の肥満マウス）ならびに正常な野生型マウスのいずれにおいても、in vivoで活性である。その生理活性自体は特に、体重減少において発現する（Barinaga,“Obese” Protein Slims Mice, Science 269: 475-476(1995)参照）。
【０００３】
ＯＢ蛋白の他の生理効果については十分な特性決定が行われていない。例えば、ｏｂ／ｏｂ突然変異マウスにおいて、ＯＢ蛋白を投与することで、血清インシュリン濃度および血清グルコース濃度が低下することが知られている。さらに、ＯＢ蛋白投与によって、体脂肪の低下が生じることも知られている。これはｏｂ／ｏｂ突然変異マウスおよび非肥満正常マウスのいずれにおいても認められている（Pelleymounter et al., Science 269: 540-543(1995); Halaas et al., Science 269: 543-546(1995)参照。Campfield et al., Science 269: 546-549(1995)も参照（μｇ量の用量のＯＢ蛋白を末梢および中枢に投与することで、ｏｂ／ｏｂ肥満マウスおよび飼料誘発肥満マウスの飼料摂取および体重が低下したが、ｄｂ／ｄｂ肥満マウスではそれは認められなかった）。これらの報告のいずれにおいても、最高用量であっても毒性は認められていない。
【０００４】
特に、体重減少が有益ではないと考えられるか、あるいは体重減少の必要がないと考えられる動物に対するＯＢ蛋白の他の生理効果を解明することは、ＯＢ蛋白に別の用途を提供するものとなろう。
【０００５】
本発明によって提供されるようなそのような用途は、非脂肪組織（lean tissue）重増加におけるものである。
【０００６】
当然のことながら、食事および運動の調節が、筋肉を大きくする上での一つの方法である。非脂肪重を増加させるのに使用される組成物もある。非脂肪組織重を増加させると考えられている現在の組成物には、テストステロンおよびそれの誘導体などの蛋白同化ステロイドならびにヒト成長ホルモンなどがある。しかしながら、これらは望ましくない副作用を有することが認められている（以下の概要はレミングトンの著作に詳細に説明されている（Remington, Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) Chapter 50, pp.948-1001））。
【０００７】
プロトロピンおよびソマトロピンなどのヒト成長ホルモンは、通常２〜３ヶ月で緩解する高カルシウム尿症を高頻度で起こすことが認められている。高血糖症および臨床的に明らかな糖尿病が起こることも認められている。筋肉痛および早朝頭痛が比較的頻繁であることが認められ、甲状腺機能低下および胆汁におけるコレステロール過飽和が生じる場合もある。骨端が閉じている場合、指骨および顎骨の成長が継続的に刺激されるが他の骨は刺激されないために身体の均整が異常になる場合があることから、そのホルモンは使用してはならない。
【０００８】
蛋白同化ステロイドは運動能力および攻撃性を高める。それの使用は、米国スポーツ医学協会（American College of Sports Medicine）によって禁止されている。女性の能力が向上するが、その代償として男性化およびアクネが生じる。アンドロゲンは男性型多毛症、深い声もしくは嗄れ声、未成熟男性における思春期早発症および骨端閉鎖、性欲亢進（男性および女性の両方）、陰茎強直症、精液減少症および睾丸萎縮、女性における陰核腫脹、潮紅、射精量および精子数の低下、女性化乳房症、過敏症、アクネ、体重増、浮腫ならびに高カルシウム血症を引き起こす。長期使用によって攻撃性がひどく高まる場合があり、多くの暴行がアンドロゲンの乱用によるものであると言われている。偏執症様行動および他の精神病的行動が報告されている。胆汁うっ滞および黄疸が起こる。長期療法後に肝癌が報告された例が数例ある。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従って、現在使用可能な薬剤に見られる副作用のない、非脂肪組織重を増加させる治療用組成物または美容用組成物が得られることが望ましい。
【００１０】
【課題を解決する手段】
本発明は、非肥満動物および肥満動物へのＯＢ蛋白投与によって非脂肪組織重増加が生じるという所見に基づくものである。そのようにＯＢ蛋白は、痩身剤として作用するだけでなく、非脂肪組織重に影響を与える薬剤として作用する能力を有する。それだけでは、体重減が必ずしも有益とは考えられない患者においてすら、多くの非脂肪組織重増加療法が想到される。そこで本発明の１態様は、非脂肪組織重増加のためのＯＢ蛋白（または該蛋白の類縁体もしくは誘導体）の使用である。
【００１１】
別の態様では本発明は、糖尿病治療方法および糖尿病治療に必要なインシュリンレベル低下方法に関するものである。脂肪組織重低下と同時に非脂肪組織重を増加させることで、インシュリンに対する感度が上昇する。従って本発明の方法は、糖尿病治療に必要なインシュリン量低下のためのＯＢ蛋白（または該蛋白の類縁体もしくは誘導体）の使用に関するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
上記のように本発明の方法は、個体における非脂肪組織重増加方法である。この非脂肪組織重増加には、脂肪重低下を伴うことが認められている。そこで、ＯＢ蛋白（または該蛋白の類縁体もしくは誘導体）投与によって所望の体重減が得られない場合であっても、非脂肪重を増加させながら体脂肪を減少させて体型を変える上で、ＯＢ蛋白投与は有用であると考えられる。
【００１３】
さらに、非脂肪組織重増加により、個体のインシュリンに対する感受性を高めることができる。従って本発明のＯＢ蛋白（または該蛋白の類縁体もしくは誘導体）の使用方法は、糖尿病患者におけるインシュリン感受性向上に関するものでもある。詳細な作用形態は不明であるが、脂肪組織と比較して非脂肪組織（例：筋肉）はインシュリンの効果に対する感受性が高いと考えられる。従って、非脂肪組織増加によって、インシュリン感受性の細胞をより多く利用できるようになると考えられる。さらに、脂肪（例：脂肪）組織除去は、循環インシュリンが認められる末梢循環への非脂肪組織の曝露が多くなるという別の効果も有し得る。従って本発明の別の態様は、インシュリンに対する感受性向上方法を提供することである。言い換えれば、糖尿病で必要なインシュリンの用量を低下させる方法も提供される。
【００１４】
非脂肪組織増加は、筋肉組織増加であると考えられる。そのような増加は、特定の部分に局在するものではなく、全身的増加であることが認められる（例：後述の実施例１および２）。それ自体で、全身活力が向上し得る。全身活力向上により、骨吸収低下などの他の効果が生じる場合があり、骨粗鬆症などの脆弱性を逆転または改善できる可能性がある。運動能力向上を望む患者では、全身活力向上がその能力向上に有効であると考えられる。赤血球の産生または有効性上昇、ならびに酸素化血液の増加があり得る。そうして、精神的・肉体的能力を向上させることができる。
【００１５】
ＯＢ蛋白は、以下に記載の組換えマウス蛋白（配列番号２）またはツァンクらの報告（Zhang et al., Nature, supra；引用によって本明細書に含まれるものとする）に記載の組換えヒト蛋白もしくは位置２８のグルタミン残基を持たないものから選択することができる（Zhang et al., Nature, supra, p.428参照）。（１）位置３５のリジンに代えてアルギニンおよび（２）位置７４のイソロイシンに代えてロイシンを有する配列番号４に示した組換えヒトＯＢ蛋白類縁体を用いることもできる（この類縁体についての略称を、組換えヒトＲ→Ｋ３５、Ｌ→Ｉ７４とする）。それらの組換えヒト蛋白類縁体および組換えマウス蛋白のアミノ酸配列を以下に示してあるが、−１の位置にメチオニン残基がある。しかし、本発明のＯＢ蛋白およびその類縁体については、そのメチオニン残基はなくても良い。
【００１６】
上記マウス蛋白は、特に成熟蛋白として、さらには特にＮ末端でヒト蛋白と実質的に相同である。組換えヒト配列において、マウスの配列と異なるアミノ酸を変えることで（アミノ酸残基の置換など）、組換えヒト蛋白の類縁体を得ることができる。この組換えヒト蛋白はマウスで生理活性を有することから、そのような類縁体はヒトにおいて活性である可能性がある。例えば、第１のアミノ酸がバリンで位置１４６のアミノ酸がシステインである配列番号４の番号付けによる位置３５の残基がリジンで位置７４の残基がイソロイシンであるヒト蛋白を用いた場合、位置３２、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７、８９、９７、１００、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の１以上のアミノ酸を別のアミノ酸で置換することができる。マウス蛋白（配列番号２）の相当する位置のアミノ酸または別のアミノ酸を選択することができる。
【００１７】
さらに、ラットＯＢ蛋白配列に基づいて、「コンセンサス」分子を得ることができる（Murakami et al., Biochem.Biophys. Res.Comm.209:944-952(1995)；引用によって本明細書に含まれるものとする）。ラットＯＢ蛋白は、配列番号４の番号割り付けを用いると、４、３２、３３、３５、５０、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０１、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８および１４５の位置でヒトＯＢ蛋白と異なっている。これらの各種位置のアミノ酸の１以上を別のアミノ酸で置換することができる。下線を付した位置は、マウスＯＢ蛋白とラットＯＢ蛋白がヒトＯＢ蛋白と異なっていることから、変えるのに特に適した位置である。これらの位置の１以上で、相当するラットＯＢ蛋白のアミノ酸または別のアミノ酸を置換することができる。
【００１８】
成熟ヒトＯＢ蛋白と異なるラットおよびマウスの両方のＯＢ蛋白の位置は、４、３２、３３、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５である。上記のアミノ酸の１以上が欠失しているか相当するラットもしくはマウスの配列で認められるアミノ酸などの別のアミノ酸で置換されている配列番号４によるヒトＯＢ蛋白（位置３５がリジン、位置７４がイソロイシン）も有効であると考えられる。
【００１９】
さらに、成熟ヒトＯＢ蛋白と異なるアカゲザルＯＢ蛋白で認められるアミノ酸（１文字のアミノ酸略号で括弧内に示してあるもの）は、８（Ｓ）、３５（Ｒ）、４８（Ｖ）、５３（Ｑ）、６０（Ｉ）、６６（Ｉ）、６７（Ｎ）、６８（Ｌ）、８９（Ｌ）、１００（Ｌ）、１０８（Ｅ）、１１２（Ｄ）および１１８（Ｌ）である。組換えヒトＯＢ蛋白はカニクイザルで活性であることから（後述の実施例２に記載）、アカゲザルの各種アミノ酸の１以上が括弧に示したアミノ酸などの別のアミノ酸で置換された配列番号４（位置３５がリジン、位置７４がイソロイシン）によるヒトＯＢ蛋白は有効であると考えられる。ある種のアカゲザルの各種アミノ酸は上記のマウスで認められるもの（位置３５、６８、８９、１００および１１２）でもあることは留意すべき点である。そこで、位置４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５というアミノ酸の１以上が別のアミノ酸によって置換されたマウス／アカゲザル／ヒトコンセンサス分子を得ることができる（位置３５がリジンで位置７４がイソロイシンである配列番号４の番号割り付けを使用）。
【００２０】
この蛋白のアミノ酸配列の一部を欠失させることで、他の類縁体を得ることができる。例えば、成熟蛋白はリーダー配列を持たない（−２２〜−１）。以下の切断型ヒトＯＢ蛋白分子を得ることができる（配列番号４の番号割り付けを使用）：
（ａ）アミノ酸９８〜１４６
（ｂ）アミノ酸１〜３２
（ｃ）アミノ酸４０〜１１６
（ｄ）アミノ酸１〜９９および（それに結合した）１１２〜１４６
（ｅ）アミノ酸９９と１１２の間にアミノ酸１００〜１１１の１以上があるアミノ酸１〜９９および（それに結合した）１１２〜１４６。
【００２１】
さらにこれら切断型は、ヒトＯＢ蛋白と異なる（アカゲザル、ラットまたはマウスのＯＢ蛋白で）アミノ酸の１以上が変わっているものであっても良い。さらに、変更はペプチド類似物またはＤ−アミノ酸などの変更アミノ酸の形であっても良い。
【００２２】
本発明の蛋白（本明細書において「蛋白」という用語は、別段の断りがない限り、以下に引用のような「ペプチド」およびＯＢ類縁体を含むものとして使用される）は、蛋白部分への１以上の化学部分結合によって誘導体化されていても良い。さらに、化学的に修飾された誘導体を、動脈投与、腹腔内投与、筋肉投与、皮下投与、静脈投与、経口投与、経鼻投与、肺投与、局所投与その他の投与経路用に製剤化することもできる。生理活性蛋白の化学修飾は、一定の環境下で、治療効果のある蛋白の安定性向上および循環時間延長ならびに免疫原性の低下などのさらなる利点をもたらすことが認められている（１９７９年１２月１８日発行の米国特許４１７９３３７号（Davis et al.）参照；総説については、Abuchowski et al., Enzymes as Drugs参照（J.S.Holcerberg and J.Roberts, eds.pp.367-383(1981)）；蛋白修飾および融合蛋白について記載した総説論文には、Francis, Focus on Growth Factors 3: 4-10(1992年5月)がある（Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20, OLD, UK出版））。
【００２３】
誘導体化に好適な化学部分は、各種水溶性ポリマーから選択することができる。選択されるポリマーは水溶性であって、それが結合する蛋白が生理環境などの水系の環境で沈殿しないようにするものでなければならない。好ましくは、最終製造品を治療に使用する場合、ポリマーは医薬的に許容されるものとする。当業者であれば、ポリマー／蛋白接合体が治療に使用可能か否か、そして使用可能であれば望ましい用量、循環時間、蛋白分解に対する耐性および他の検討事項などの検討事項に基づいて望ましいポリマーを選択することができる。本発明の蛋白およびペプチドの場合、誘導体化の有効性は、望ましい剤型で（すなわち、浸透ポンプにより、あるいはより好ましくは注射もしくは注入により、さらには例えば経口投与、肺投与もしくは経鼻投与用に製剤されたものにより）誘導体を投与し、本明細書に記載の方法に従ってその有効性を測定することで確認することができる。
【００２４】
水溶性ポリマーは例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸類（ホモポリマーまたはランダム共重合体もしくは非ランダム共重合体）、ならびにデキストリンもしくはポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー類、ポリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイド共重合体、ポリオキシエチル化多価アルコール類、ポリスチレンマレエートならびにポリビニルアルコールから成る群から選択することができる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中で安定であることから、製造において有利であると考えられる。
【００２５】
融合蛋白は、ＯＢ蛋白（または類縁体）部分にポリアミノ酸を結合させることで得ることができる。例えば、ポリアミノ酸は、蛋白の血中半減期を延長する上で役立つ担体蛋白であることができる。本発明の治療上または美容上の目的に関しては、そのようなポリアミノ酸は、中和抗原反応その他の有害応答を起こさないものでなければならない。そのようなポリアミノ酸は、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）、抗体もしくはそれの部分（「Ｆｃ」と称される場合もある抗体の定常領域など）その他のポリアミノ酸からなる群から選択することができる。以下に示すように、ポリアミノ酸の結合位置は、ＯＢ蛋白部分のＮ末端その他の箇所であることができ、ＯＢ蛋白への化学的「リンカー」部分によって結合していても良い。
【００２６】
ポリマーの分子量に制限はなく、分岐であっても直鎖であっても良い。ポリエチレングリコールの場合、好ましい分子量は、取り扱いやすさおよび製造しやすさから、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲である（「約」という用語は、ポリエチレングリコールの製造において、一部の分子の分子量が指定の分子量より大きく、一部の分子ではそれより小さかったりすることを示している）。所望の治療プロファイルに応じて（例：所望の徐放期間、生理活性がある場合はその生理活性に対する効果、取り扱いやすさ、抗原性の程度もしくはその欠如、ならびに治療効果のある蛋白もしくは類縁体に対するポリエチレングリコールの他の既知の効果）、それ以外の大きさのものを用いることができる。
【００２７】
このようにして結合したポリマー分子の数は多様であることができ、当業者であれば、機能に対する効果を確認することができる。モノ誘導体化を行うことができたり、あるいは同一もしくは異なる化学部分によって、ジ、トリ、テトラまたは数個の組み合わせの誘導体化を行うことが可能である（例：分子量の異なるポリエチレングリコール類などのポリマー）。蛋白（もしくはペプチド）分子に対するポリマー分子の割合は、それらの反応混合物中での濃度同様に多様である。一般に、所望の誘導体化程度（例：モノ、ジ、トリなど）、選択されるポリマーの分子量、そのポリマーが分岐であるか直鎖であるか、反応条件などの因子によって、至適比率（過剰の未反応の蛋白やポリマーがない反応の効率に関して）を決定する。
【００２８】
上記化学部分は、蛋白の機能性または抗原性ドメインに対する効果を考慮して蛋白に結合させなければならない。当業者が使用可能な結合方法が多くある。例えば、ＥＰ０４０１３８４号（引用によって本明細書に含まれるものとする）（ＰＥＧのＧ−ＣＳＦへの結合）、マリクらの報告（Malik et al., Exp.Hematol., 20:1028-1035, 1992；塩化トレシルを用いるＧＭ−ＣＳＦのＰＥＧ化について報告）などがある。例えばポリエチレングリコールは、遊離のアミノ基またはカルボキシル基などの反応性基を介してアミノ酸残基によって共有結合的に結合することができる。反応性基とは、活性化ポリエチレングリコール分子が結合し得る基である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基には、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基などがあり得る。遊離カルボキシル基を有するものには、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、Ｃ末端アミノ酸残基などがあり得る。ポリエチレングリコール分子を付着させるための反応性基として、メルカプト基を使用することもできる。治療のためには、Ｎ末端またはリジン基での結合などのアミノ基での結合が好ましい。受容体結合が望ましい場合、受容体結合にとって重要な残基での結合は避けるべきである。
【００２９】
特にＮ末端で化学修飾された蛋白が望ましい場合がある。ポリエチレングリコールを用いて本発明の組成物を説明すると、各種のポリエチレン分子（分子量、分岐などによって）、反応混合物中の蛋白分子に対するポリエチレングリコール分子の割合、実施するＰＥＧ化反応の種類、選択されたＮ末端ＰＥＧ化蛋白を得る方法を選択することができる。Ｎ末端ＰＥＧ化品を得る方法は（すなわち、必要に応じてこの部分を他のモノＰＥＧ化部分と分離する方法）、ＰＥＧ化蛋白分子群からのＮ末端ＰＥＧ化品の精製による。選択的Ｎ末端化学修飾は、特定蛋白における誘導体化に使用可能な各種１級アミノ基の反応性差（リジンとＮ末端）を利用する還元的アルキル化によって行うことができる。適切な反応条件下で、含カルボニル基ポリマーによるＮ末端での蛋白の実質的に選択的な誘導体化を行う。例えば、リジン残基のε−アミノ基と蛋白のＮ末端残基のα−アミノ基との間のｐＫａ差を利用できるｐＨで反応を行うことで、蛋白をＮ末端で選択的にＰＥＧ化することができる。そのような選択的誘導体化によって、蛋白への水溶性ポリマーの付着が抑制され、ポリマーとの接合が蛋白のＮ末端で支配的に起こり、リジン側鎖アミノ基などの他の反応性基にはほとんど変化が起こらない。還元的アルキル化を用いる場合、水溶性ポリマーは上記の種類のものとすることができ、蛋白への結合のための１個の反応性アルデヒドがなければならない。１個の反応性アルデヒドを有するポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドを使用することができる。
【００３０】
治療薬製造を容易にするには、Ｎ末端モノＰＥＧ化誘導体が好ましい。Ｎ末端ＰＥＧ化により、生成物の特性決定がジ、トリその他の複数ＰＥＧ化生成物の場合と比較して簡単である均質な生成物が得られる。上記のＮ末端生成物製造のための還元的アルキル化方法を用いることが、商業的製造を容易にする上で好ましい。
【００３１】
本発明のさらに別の態様では、蛋白および誘導体の医薬組成物を用いる方法が提供される。そのような医薬組成物は、注射用、あるいは経口投与、肺投与、経鼻投与、経皮投与その他の投与形態用のものであることができる。有効量の本発明の蛋白もしくは誘導体と医薬的に許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、補助剤および／または担体とを含む医薬組成物が本発明に含まれる。そのような組成物は、各種緩衝剤含有量（例：トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；洗剤および可溶化剤（例：Ｔｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、酸化防止剤（例：アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例：チメルゾル（Thimersol）、ベンジルアルコール）および増量剤（例：乳糖、マンニトール）などの添加物を含み、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の粒子状物あるいはリポソームへの材料の取り込みが行われる。ヒアルロン酸も使用することができ、それは循環系における持続期間を延長する効果を有する場合がある。そのような組成物は、本発明の蛋白および誘導体の物理的状態、安定性、in vivoでの放出速度、in vivoでのクリアランス速度に影響を与え得るものである（例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.(1990, Mack Publishing Co.,Easton, PA 18042), pp.1435-1712参照；引用によって本明細書に含まれるものとする）。この組成物は、液体製剤で製造することができるか、あるいは凍結乾燥品などの乾燥粉末とすることができる。経皮製剤のような植え込み可能な徐放製剤も想到される。
【００３２】
経口固体製剤（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.(1990, Mack Publishing Co.,Easton, PA 18042), Chapter 89（引用によって本明細書に含まれるものとする）に記載のもの）が本発明での使用で想到される。固体製剤には、錠剤、カプセル、丸薬、トローチもしくはロゼンジ、カシェ剤またはペレットなどがある。さらに、リポソームカプセル封入またはプロテイノイドカプセル封入を用いて、本発明の組成物を製剤することもできる（例えば、米国特許４９２５６７３号に記載のプロテイノイドミクロスフェアなど）。リポソームカプセル封入を用いることができ、リポソームは各種ポリマーで誘導体化できる（例：米国特許５０１３５５６号）。治療薬用に使用可能な固体製剤についての記載がマーシャルの著作にある（Marshall,K., Modern Pharmaceutics, ed. by G.S.Banker and C.T.Rhodes, Chapter 10, 1979；引用によって本明細書に含まれるものとする）。製剤には、その蛋白（またはそれの類縁体もしくは誘導体）ならびに胃環境に対する保護および腸での生理活性物質の放出を可能とするための不活性成分を含有させる。
【００３３】
具体的には、上記の誘導体化蛋白の経口製剤も想到される。蛋白を化学修飾して、誘導体の経口投与を有効に行えるようにすることができる。一般に、想到される化学修飾は、（ａ）蛋白分解の阻害および（ｂ）胃または腸からの血流への取り込みを可能とする１以上の部分の蛋白（もしくはペプチド）分子自体への付加である。さらに、蛋白の全体的安定性の向上および体内での循環時間の延長も望ましい。そのような部分の例としては、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリプロリンなどがある（Abuchowski and Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, in "Enzymes as Drugs", Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, (1981), pp.367-383; Newmark, et al., J.Appl.Biochem. 4:185-189(1982)）。使用可能な他のポリマーには、ポリ−１，３−ジオキソランおよびポリ−１，３，６−トリオキソランがある。
【００３４】
蛋白（または誘導体）の場合、放出箇所は胃、小腸（十二指腸、空腸または回腸）または大腸であることができる。当業者であれば、胃では溶けないが十二指腸や腸の他の箇所でその物質を放出する製剤を使用することができる。好ましくはその放出は、蛋白（または誘導体）の保護あるいは腸などの胃環境を過ぎてからの生理活性物質の放出によって、胃環境の悪影響を回避するものである。
【００３５】
胃での十分な耐性を確保するには、少なくともｐＨ５．０まで不透過性のコーティングが必須である。腸溶コーティングとして使用されるより一般的な不活性成分の例としては、セルロース酢酸トリメリテート（ＣＡＴ）、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ５０、ＨＰＭＣＰ５５、ポリビニル酢酸フタレート（ＰＶＡＰ）、ユードラジット（Eudragit）Ｌ３０Ｄ、アクアテリック（Aquateric）、セルロース酢酸フタレート（ＣＡＰ）、ユードラジットＬ、ユードラジットＳおよびシェラック（shellac）がある。これらのコーティングは、混合フィルムとして使用することができる。
【００３６】
コーティングまたはコーティング混合物は、胃に対する保護を目的としない錠剤にも使用することができる、それには、糖衣または錠剤を嚥下しやすくするためのコーティングなどがあり得る。カプセルは、粉剤などの乾燥治療薬投与用の硬殻（ゼラチンなど）から成ることができ、液剤用には軟ゼラチン殻を使用することができる。カシェ剤の殻材料としては、厚いデンプンその他の食用紙があり得る。丸薬、ロゼンジ、成型錠剤または湿製錠剤の場合、湿式塊化法（moist massing techniques）を用いることができる。
【００３７】
治療薬は、粒径約１ｍｍの顆粒またはペレットの形態での微小複合粒子（multiparticulates）としての製剤で含有させることができる。カプセル投与用の材料の製剤は、粉末で軽く加圧したプラグ（plug）または錠剤であることもできる。治療薬は圧縮によって製造することが可能である。
【００３８】
着色剤および芳香剤はいずれも含有させることができる。例えば、蛋白（または誘導体）を製剤し（例えばリポソームカプセル封入またはミクロスフェアカプセル封入によって）、さらに着色剤および芳香剤を含む冷蔵飲料などの食用製品中に含有させることもできる。
【００３９】
不活性材料によって治療薬を希釈したり、増量させることができる。その希釈剤には、特にマンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、ショ糖、修飾デキストリン類およびデンプンのような炭水化物などがあり得る。トリリン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムなどのある種の無機塩類も充填剤として使用することができる。市販の希釈剤を数例挙げると、ファスト−フロ（Fast-Fro）、エムデックス（Emdex）、ＳＴＡ−Ｒｘ １５００、エンコンプレス（Emcompress）およびアビセル（Avicell）などがあり得る。
【００４０】
治療薬の製剤では、固体製剤に崩壊剤を含有させることができる。崩壊剤として使用される材料には、デンプンに基づく市販の崩壊剤であるエクスプロタブ（Explotab）のようなデンプンなどがあるが、それに限定されるものではない。グリコール酸デンプンナトリウム、アンバーライト、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン（ultramylopectin）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、橙皮、酸カルボキシメチルセルロース、天然スポンジおよびベントナイトはいずれも使用可能である。別の形の崩壊剤には、不溶性カチオン交換樹脂がある。粉末ガムを崩壊剤および結合剤として用いることができ、それには寒天、カラヤガムまたはトラガカントガムなどの粉末ガムなどがあり得る。アルギン酸およびそれのナトリウム塩も崩壊剤として有用である。
【００４１】
結合剤を用いて治療薬を保持して硬錠剤を形成することができ、その結合剤には、アカシアガム、トラガカントガム、デンプンおよびゼラチンなどの天然物からの材料などがある。他には、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）などがある。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）をいずれもアルコール溶液で使用して、治療薬の造粒を行うことができる。
【００４２】
減摩剤を治療薬製剤に含有させて、製剤工程中の粘着を防止することができる。治療薬と金型壁との間の層として潤滑剤を用いることができ、それにはステアリン酸（それのマグネシウム塩およびカルシウム塩を含む）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油およびロウなどがあるが、これらに限定されるものではない。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、各種分子量のポリエチレングリコール、カーボワックス（Carbowax）４０００および６０００などの可溶性潤滑剤を使用することもできる。
【００４３】
製剤時の薬剤の流動性を改善したり、圧縮時の再配列を容易にする滑剤を加えることも可能であると考えられる。滑剤には、デンプン、タルク、焼成シリカおよび水和シリコアルミネートなどがあり得る。
【００４４】
治療薬の水系環境への溶解を助けるため、湿展剤として界面活性剤を加えることも考えられる。界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナトリウムなどのアニオン系洗剤などがあり得る。カチオン系洗剤を使用することが可能であり、それには塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムなどがある。界面活性剤として製剤に含有させることができると考えられるノニオン系洗剤を挙げると、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０および６０、モノステアリン酸グリセリン、ポリソルベート４０、６０、６５および８０、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロースならびにカルボキシメチルセルロースがある。これらの界面活性剤は、単独であるいは各種比率での混合物として、蛋白もしくは誘導体の製剤に存在させることができると考えられる。
【００４５】
蛋白（または誘導体）の取り込みを促進する可能性のある添加剤としては例えば、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸などの脂肪酸がある。
【００４６】
徐放製剤が望ましい場合がある。拡散機構または浸出機構による放出を可能とする不活性基剤（すなわちガム）に薬剤を取り込ませることができる。徐々に分解する基剤を製剤に組み入れることもできる。この治療薬の別の形態の徐放は、オロス（Oros）治療薬系（Alza Corp.）に基づく方法によるものである。すなわち、水を浸入させ、浸透圧効果によって１個の小さい開口から薬剤を押し出すことができる半透膜中に、薬剤を封入するものである。一部の腸溶コーティングも遅延性放出効果を有するものである。
【００４７】
製剤には他のコーティングを使用することができる。それには、糖衣器で使用することができる各種糖などがある。治療薬はさらに、フィルムコーティング剤で投与することも可能であり、その場合に使用される材料は２つの群に分けられる。第１の群は、非腸溶性材料であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、プロビドン（providone）およびポリエチレングリコール類などがある。第２の群は腸溶性材料からなり、一般的にはフタル酸のエステルである。
【００４８】
材料を混合することで最適なフィルムコーティングを得ることも考えられる。フィルムコーティングは糖衣器もしくは流動床で、あるいは圧縮コーティングによって行うことができる。
【００４９】
本発明においては、本発明の蛋白またはそれの誘導体を肺投与することも想到される。蛋白（誘導体）は、吸入しながら哺乳動物の肺に投与され、肺上皮内層を通過して血流に入る（これについての他の報告には次のものがある；Adjei et al., Pharmaceutical Research 7:565-569(1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics 63: 135-144(1990)（酢酸ロイプロリド）; Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology 13(suppl.5): s.143-146(1989)（エンドテリン−１）; Hubbard et al., Annals of Internal Medicine 3:206-212(1989)（α１−抗トリプシン）;Smith et al., J.Clin.Invest.84:1145-1146(1989)（α−１−プロテイナーゼ）; Oswein et al., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, 1990（組換えヒト成長ホルモン）; Debs et al., The Journal of Immunology 140:3482-3488(1988)（インターフェロン−γおよび腫瘍壊死因子α）; Platz et al., 米国特許５２８４６５６号（顆粒球コロニー刺激因子））。
【００５０】
本発明の実施においては、治療薬の肺投与用の多種の装置を使用することが想到され、それには噴霧吸入器、用量計量吸入器および粉剤吸入器などの当業者には周知のものなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
本発明の実施に好適な市販装置の具体例をいくつか挙げると、ウルトラベント（Ultravent）噴霧吸入器（製造者：Mallinckrodt, Inc., St.Louis, Missouri）、エーコーン（Acorn）ＩＩ噴霧吸入器（製造者：Marquest Medical Products, Englewood, Colorado）、ベントリン（Ventolin）用量計量吸入器（製造者：Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina）およびスピンヘイラー（Spinhaler）粉剤吸入器（製造者：Fisons Corp., Bedford, Massachusetts）がある。
【００５２】
そのような装置のいずれにおいても、蛋白（または類縁体もしくは誘導体）の投薬に好適な製剤を使用する必要がある。通常、各製剤は使用される装置の種類に固有のものであり、治療に有用な希釈剤、補助剤および／または担体に加えて、適切な墳射剤を使用する場合がある。
【００５３】
蛋白（または誘導体）は最も有利には、遠位肺への最も有効な投与を行うために、平均粒径１０μｍ未満、最も好ましくは０．５〜５μｍの粒子状に製剤しなければならない。
【００５４】
担体には、トレハロース、マンニトール、キシリトール、ショ糖、乳糖、ソルビトールのような炭水化物などがある。製剤で使用する他の成分には、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣおよびＤＯＰＣなどがあり得る。天然または合成の界面活性剤を使用することができる。ポリエチレングリコールを使用することができる（蛋白または類縁体の誘導体化での使用以外であっても）。シクロデキストリンなどのデキストリン類を使用することができる。胆汁酸塩および他の関連する相乗剤を使用することができる。セルロースおよびセルロース誘導体を使用することができる。緩衝剤製剤での使用などで、アミノ酸を使用することができる。
【００５５】
さらに、リポソーム、マイクロカプセルもしくはミクロスフェア、包接錯体その他の種類の担体の使用も想到される。
【００５６】
噴射式または超音波式のいずれかの噴霧吸入器での使用に好適な製剤は代表的には、液剤１ｍＬ当たり生理活性蛋白約０．１〜２５ｍｇの濃度となるように水に溶かした蛋白（または誘導体）を含有するものである。その製剤には、緩衝剤および単糖を含有させることもできる（例えば、蛋白の安定化および浸透圧の調節のため）。噴霧吸入器用製剤には界面活性剤を含有させて、エアロゾル形成時の液剤霧化によって生じる蛋白の表面誘発凝集を低減もしくは防止することもできる。
【００５７】
用量計量吸入器で使用する製剤は通常、界面活性剤を用いて噴射剤中に懸濁させた蛋白（または誘導体）を含む微細粉末を含有する。噴射剤は、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボンまたは炭化水素などのその目的に使用される従来の材料とすることができ、それには具体的にはトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノールおよび１，１，１，２−テトラフルオロエタンあるいはそれらの組み合わせなどがある。好適な界面活性剤には、トリオレイン酸ソルビタンおよび大豆レシチンなどがある。オレイン酸も、界面活性剤として有用であると考えられる。
【００５８】
粉剤吸入器からの投薬用の製剤は、蛋白（または誘導体）を含有する微細乾燥粉末を含むものであり、乳糖、ソルビトール、ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはキシリトールのような増量剤を、例えば製剤の５０〜９０重量％のように装置からの粉剤の分散を容易にするような量で含有することもできる。
【００５９】
蛋白（または類縁体もしくは誘導体）の経鼻投与も想到される。経鼻投与によって、治療薬を鼻に投与した直後に蛋白の血流への通過を行うことができ、薬剤を肺に堆積させる必要がない。経鼻投与用の製剤には、デキストリンまたはシクロデキストリンを含むものなどがある。他の粘膜を通っての輸送を介した投与も想到される。
【００６０】
当業者であれば、投与と所望の治療効果を観察することで、有効用量を確認することができる。好ましくは、その分子の製剤は、約０．１０μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日で所望の治療効果が得られるようなものとする。有効用量は、経時的診断手段を用いて決定することができる。例えば、血中（または血漿もしくは血清中）のＯＢ蛋白の量を測定する診断を最初に行って、ＯＢ蛋白の内因性レベルを求めることができる。そのような診断手段は、抗体サンドイッチアッセイなどの抗体アッセイの形態であることができる。内因性ＯＢ蛋白の量を最初に定量し、基底線値を求める。治療中に内因性および外因性のＯＢ蛋白（すなわち、自己産生または投与された体内で認められる蛋白、類縁体または誘導体）の定量を継続することで、治療用量を求める。従って、用量は治療中に変動し得るものであり、治療効果が認められるまで最初は比較的高用量を用い、治療効果の維持には比較的低用量を用いる。
【００６１】
理想的には、非脂肪体重増加のみが望まれる場合は、体重減を行うにはその用量は不十分である。そこで、肥満者の治療の初期では、体重減と同時に脂肪組織減／非脂肪体重増が得られるような用量を投与することができる。十分な体重減が得られたら、体重の再増加を防止するが所望の非脂肪重増加（あるいは非脂肪重低下の防止）を維持するだけの用量を投与することができる。ＯＢ蛋白の効果は可逆的であることから、これらの用量は経験的に決定することができる（例：Campfield et al., Science 269:546-549(1995),p.547）。そこで、体重減少が望ましくない場合に体重減が認められる場合、それより低い用量を投与することで、非脂肪組織重の所望の増加を得て、しかも所望の体重を維持することになろう。
【００６２】
対象者のインシュリンに対する感受性を高めるには、同様の用量検討を考慮することになると考えられる。体重減を伴わない非脂肪重増加が得られれば、対象者に対して糖尿病治療向けに投与されるインシュリン（あるいはアミリンその他の糖尿病治療薬）の量を低下させることができると考えられる。
【００６３】
全身活力を高めるため、同様の用量検討を行うことができる。全身活力の同時向上を伴う非脂肪重増加は、体重減を得るには不十分な用量で得ることができる。赤血球数（および血液における酸素化）増加および骨吸収の低下もしくは骨粗鬆症の軽減などの他の効果も、体重減なく得ることができる。
【００６４】
本発明の方法を、糖尿病治療に有用な薬剤（例：インシュリンおよび可能性としてアミリン）、コレステロールおよび降圧剤（血液脂質濃度を低下させる薬剤その他の心血管薬）ならびに活動性向上薬（例：アンフェタミン類）などの他の薬剤と併用することができる。食欲抑制薬も使用することができる。そのような投与は同時に、または連続的に行うことができる。
【００６５】
さらに本発明の方法を、身体の全体的容貌を変えるための美容手術などの外科手術（例：体重減少のための脂肪吸引またはレーザ手術あるいは身体の見かけを増加させるための移植術）と併用することができる。動脈プラークなどの脂肪沈着物による血管閉塞によって起こる有害な状態を緩和するためのバイパス術その他の手術のような心臓手術の医療上の効果を、本発明の組成物および方法を併用することで高めることができる。超音波法またはレーザ法などの胆石除去方法を、本発明の治療方法の前、途中または後に行うこともできる。さらに、本発明の方法を、骨折、筋肉損傷の手術または治療その他の非脂肪組織重の増加によって改善される可能性のある療法に対する補助手段として行うことができる。
【００６６】
従って本発明の方法は、非脂肪組織重増加方法において、
（ａ）配列番号２（下記）または配列番号４（下記）に示したアミノ酸配列１〜１４６；
（ｂ）位置３５にリジン残基と位置７４にイソロイシン残基を有する配列番号４（下記）に示したアミノ酸配列群１〜１４６；
（ｃ）位置４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５（配列番号４による番号割り付けを用い、位置２８におけるグルタミン残基がなくとも同じ番号割り付けを維持して）のうちの１以上において異なるアミノ酸による置換がある上記下位項目（ｂ）のアミノ酸配列；
（ｄ）位置２８のグルタミン残基が欠失していても良い上記下位項目（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列；
（ｅ）Ｎ末端にメチオニン残基を有する上記下位項目（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列；
（ｆ）（位置３５にリジン残基と位置７４にイソロイシン残基を有する配列番号４の番号割り付けを用いて）
（ｉ）アミノ酸９８〜１４６
（ｉｉ）アミノ酸１〜３２
（ｉｉｉ）アミノ酸４０〜１１６
（ｉｖ）アミノ酸１〜９９および１１２〜１４６
（ｖ）アミノ酸９９と１１２の間にアミノ酸１００〜１１１の１以上がその順序で存在するアミノ酸１〜９９および１１２〜１４６；
（ｖｉ）アミノ酸１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５のうちの１以上が別のアミノ酸によって置換されている上記下位項目（ｉ）の切断ＯＢ類縁体；
（ｖｉｉ）アミノ酸４、８および３２のうちの１以上が別のアミノ酸によって置換されている上記下位項目（ｉｉ）の切断類縁体；
（ｖｉｉｉ）アミノ酸５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１および１１２のうちの１以上が別のアミノ酸によって置換されている上記下位項目（ｉｉｉ）の切断類縁体；
（ｖｉｘ）アミノ酸４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５のうちの１以上が別のアミノ酸によって置換されている上記下位項目（ｉｖ）の切断類縁体；
（ｘ）アミノ酸４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５のうちの１以上が別のアミノ酸によって置換されている上記下位項目（ｖ）の切断類縁体；
（ｘｉ）Ｎ末端メチオニン残基を有する上記下位項目（ｉ）〜（ｘ）のいずれかの切断類縁体から選択される切断ＯＢ蛋白類縁体；
（ｇ）蛋白部分に連結した化学部分を有してなる上記下位項目（ａ）〜（ｆ）のいずれかのＯＢ蛋白もしくは類縁誘導体；
（ｈ）前記化学部分が水溶性ポリマー部分である上記下位項目（ｇ）の誘導体；
（ｉ）前記水溶性ポリマー部分がポリエチレングリコールである上記下位項目（ｈ）の誘導体；
（ｊ）前記水溶性ポリマー部分がポリアミノ酸部分である上記下位項目（ｈ）の誘導体；
（ｋ）前記水溶性ポリマー部分が前記蛋白部分のＮ末端のみに結合している上記下位項目（ｈ）の誘導体；
（ｌ）上記下位項目（ａ）〜（ｋ）のいずれかのＯＢ蛋白、類縁体もしくは誘導体から選択される有効量のＯＢ蛋白、該蛋白の類縁体もしくは誘導体が医薬的に許容される担体に入ったものを投与する段階を有してなる方法を提供するものである。
【００６７】
【実施例】
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。実施例１は、ＯＢ蛋白が非肥満動物における非脂肪重増加に有効であることを示すものである。実施例２は、ＯＢ蛋白が肥満霊長動物における非脂肪重増加に有効であることを示すものである。実施例３〜５は、ヒトでの使用の予想実施例である。材料および方法がそれに続く。
【００６８】
実施例１
以下のデータは、ＯＢ蛋白またはそれの類縁体もしくは誘導体が非脂肪重増加に対して有効であることを示している。
組換えメチオニンマウスＯＢ蛋白（以下に説明）を４週間にわたって浸透ポンプ注入によって連続投与した。表１のデータは、表に示した用量での平均体重組成（ＣＤ１マウスで）を示している。
【００６９】
【表１】
【００７０】
実施例２
本実施例は、組換えメチオニンヒトＯＢ蛋白によって、霊長動物で非脂肪組織重増加が生じることを示すものである。
体脂肪率が２０％を超える肥満カニクイザルに、１日用量１ｍｇ蛋白／ｋｇ／日で組換えメチオニンヒトＯＢ蛋白を皮下投与した（以下の材料および方法の欄参照）。対照動物には、リン酸緩衝生理食塩水を投与した。二重エネルギーＸ線吸光光度分析（「ＤＥＸＡ」）を用いて身体組成検査を行った。身体組成の測定は７日間間隔で行った。
表２Ａおよび２Ｂには、脂肪組織または非脂肪組織に関する身体組成分析の結果を示してある。データはグラム単位で表してある。２匹の対照動物についての結果を表２Ａに示してある。４匹の試験動物についてのデータを表２Ｂに示してある（骨質量データも示してある）。表からわかる通り、第２８日で、試験動物は約２６４ｇの脂肪を失い、約１３８ｇの非脂肪重を獲得した。第２８日で、対照動物は３６ｇの脂肪組織を失い、約２５ｇの非脂肪重を獲得した。これは、ＯＢ蛋白が非脂肪組織重の増加を起こすことを示している。
【００７１】
【表２】
実施例３
非肥満ヒト患者は、非脂肪組織重が減少した病気からの回復などの治療目的で、非脂肪組織重増加を望む。患者に対して有効量のＯＢ蛋白、それの類縁体または誘導体を投与することで、非脂肪組織重に所望の増加が得られる。非組織重増加は、ＤＥＸＡ走査を用いてモニタリングする。ＯＢ蛋白（または利用可能な場合は他の抗原性源）に対する抗体アッセイなどの診断キットを用いて、循環ＯＢ蛋白または類縁体もしくは誘導体の濃度をモニタリングすることができる。
【００７３】
実施例４
ヒト対象者は、非脂肪組織増加による容貌向上などの美容上または運動上の目的で、非脂肪組織重増加を望む。対象者に対して有効量のＯＢ蛋白、それの類縁体または誘導体を投与することで、非脂肪組織重に所望の増加が得られる。非脂肪組織重増加は、ＤＥＸＡ走査を用いてモニタリングする。血中酸素濃度が上昇する。ＯＢ蛋白（または利用可能な場合は他の抗原性源）に対する抗体アッセイなどの診断キットを用いて、循環ＯＢ蛋白または類縁体もしくは誘導体の濃度をモニタリングすることができる。
【００７４】
実施例５
ヒト糖尿病患者は、糖尿病治療のために使用するインシュリン用量の低減を望む。患者に対して有効量のＯＢ蛋白、それの類縁体または誘導体を投与することで、非脂肪組織重に増加が得られる。インシュリンに対する患者の感受性が上昇し、糖尿病の症状を緩和するのに必要なインシュリンの用量が、必要なインシュリンの単位数低下または１日当たり必要なインシュリン注射回数の低下のいずれかで低下する。ＯＢ蛋白（または利用可能な場合は他の抗原性源）に対する抗体アッセイなどの診断キットを用いて、循環ＯＢ蛋白または類縁体もしくは誘導体の濃度をモニタリングすることができる。
【００７５】
実施例６
非肥満高齢ヒト対象者は、全身活力の向上を望む。対象者に対して有効量のＯＢ蛋白、それの類縁体または誘導体を投与することで、非脂肪組織重に増加を得て、全身活力を向上させる。骨吸収も低下し、骨粗鬆症状態が改善される。ＯＢ蛋白（または利用可能な場合は他の抗原性源）に対する抗体アッセイなどの診断キットを用いて、循環ＯＢ蛋白または類縁体もしくは誘導体の濃度をモニタリングすることができる。
【００７６】
材料および方法
動物：
齧歯類
実施例１には、野生型ＣＤ１マウスを用いた（表１のデータ）。動物は、愛護的条件下に維持した。
霊長動物：
計６匹のカニクイザルを用いた。サルはいずれも、試験開始時には脂肪率２０％以上であった。動物は体重について無作為化し、動物４匹についてＯＢ蛋白による試験を行い、２匹は対照とした。
【００７７】
蛋白または媒体の投与
齧歯類の場合
実施例１の場合（表１のデータ）、組換えマウス蛋白（以下に記載）または媒体（リン酸緩衝生理食塩水、「ＰＢＳ」、ｐＨ７．４）を、浸透ポンプ注入によって投与した。浸透小型ポンプ（Alzet, Alza, Palo Alto, CA、２００２型）を、各マウスの肩甲下領域の皮下嚢部に手術によって植え込み、２週間後に交換した。ポンプの較正を行って、表１に示した用量で、１時間当たり０．５μ蛋白の溶液を投与するようにした。
霊長動物の場合
実施例２の場合、１ｍｇ／ｍＬＰＢＳで調製した組換えメチオニンヒトＯＢ蛋白（位置３５にリジン、位置７４にイソロイシンを有する配列番号４のもの）を、用量１ｍｇ蛋白／ｋｇ／日で皮下投与した。対照動物には、同じやり方でＰＢＳを投与した。
齧歯類屠体分析
レシュナーらの方法に従って屠体分析を行った（A.I.Leshner, V.A.Litwin and R.L.Squibb, Brain Res. 9:281 (1972)）。４日間の脱水期間の前後での屠体重量差によって、水分組成を求めた。粉砕・乾燥した屠体の予め秤量した一部から、エチルエーテルおよびエチルアルコールで脂肪の抽出を行って、抽出法後に残ったものの量から脂肪パーセントを計算できた。非脂肪重は、脱水およびエーテル抽出後に残った粉砕屠体の割合と定義した。
【００７８】
霊長動物二重エネルギーＸ線吸光光度分析走査
実施例２では、表２Ａおよび２Ｂに示した時点で、「ＤＥＸＡ」走査を行った。
蛋白
配列番号１および２はマウス組換えＯＢ ＤＮＡおよび蛋白を示し、配列番号３および４は類縁の組換えヒトＯＢ ＤＮＡおよび蛋白を示している。実施例１では、配列番号２のマウス組換え蛋白を使用した。実施例２では、位置３５にリジン残基と位置７４にイソロイシン残基を有する配列番号４に示した組換えヒトＯＢ蛋白を用いた。上記のように、以下のマウスおよびヒト類縁の組換え蛋白は、本発明の医薬品の投与方法および製造方法で使用できるＯＢ蛋白を例示するものであって、他のＯＢ蛋白またはそれの類縁体もしくは誘導体を使用することは可能である。
【００７９】
本明細書において、組換え蛋白のアミノ酸配列の最初のアミノ酸を＋１とし、それはバリンであって、位置−１のアミノ酸はメチオニンである。Ｃ末端アミノ酸は番号１４６である（システイン）。
【００８０】
組換えマウスメチオニンＯＢ（二本鎖）ＤＮＡおよびアミノ酸配列（配列番号１および２）
【００８１】
【化１】
組換えヒトメチオニンＯＢ類縁（二本鎖）ＤＮＡおよびアミノ酸配列（配列番号３および４）
【００８３】
【化２】
【製造方法】
以下の製造方法を用いて、生理活性の組換えメチオニンマウスまたはヒト類縁ＯＢ蛋白を製造した。同様の方法を用いて、生理活性組換えメチオニンヒトＯＢ蛋白を製造することができる。
【００８５】
発現ベクターおよび宿主株
使用したプラスミド発現ベクターはｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ寄託番号６９５７６）である。上記のＤＮＡをＸｂａＩおよびＢａｍＨＩによって直線とした発現ベクターｐＣＦＭ１６５６に連結し、大腸菌宿主株ＦＭ５に形質転換した。大腸菌ＦＭ５細胞は、大腸菌Ｋ−１２株（Bachmann et al., Bacteriol.Rev.40:116-167(1976)）からアムジェン（Amgen Inc., Thousand Oaks, CA）で誘導したものであり、組み込みλファージ抑制遺伝子ｃＩ８５７を有する（Sussman et al., C.R.Acad.Sci. 254:1517-1579(1962)）。ベクター製造、細胞形質転換およびコロニー選択は、標準的方法によって行った（例：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。宿主細胞はＬＢ培地で成長させた。
【００８６】
発酵工程
フェド−バッチ培養法として知られる３段階発酵プロトコールを用いた。培地組成は以下の通りである。
【００８７】
バッチ：窒素・リン酸源を発酵槽（Biolafitte、容量１２リットル）で滅菌した（昇温して１２２℃で３５分間、１８〜２０ｐｓｉ）。冷却時に、炭素源、マグネシウム源、ビタミン源および微量金属源を無菌的に加えた。５００ｍＬの上記組換えマウス蛋白産生菌（ＬＢ肉汁で成長させたもの）の終夜培養物（１６時間以上）を発酵槽に入れた。
【００８８】
供給液Ｉ：ＯＤ６００が４．０〜６．０に達した時点で、培地に供給液Ｉを加えた。グルコースの供給は速度を制限しながら行って、成長速度（μ）を制御した。自動システム（分配制御システムと称する）を設定して、成長速度を１時間当たり０．１５世代に制御した。
【００８９】
供給液ＩＩ：ＯＤ６００が３０に達した時点で、培養温度を徐々に上げて４２℃とし、供給液を下記の供給液ＩＩに変えた。２時間ごとにサンプリングを行いながら、発酵を１０時間継続した。１０時間後、発酵槽の内容物を冷却して２０℃以下とし、遠心によって回収した。
【００９０】
培地組成
バッチ：
１０ｇ／Ｌ 酵母抽出物
５．２５ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４
３．５ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４
４．０ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４
５．０ｇ／Ｌ グルコース
１．０ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
２．０ｍＬ／Ｌ ビタミン溶液
２．０ｍＬ／Ｌ 微量金属溶液
１．０ｍＬ／Ｌ Ｐ２０００消泡剤
供給液Ｉ：
５０ｇ／Ｌ バクトトリプトン
５０ｇ／Ｌ 酵母抽出物
４５０ｇ／Ｌ グルコース
８．７５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
１０ｍＬ／Ｌ ビタミン溶液
１０ｍＬ／Ｌ 微量金属溶液
供給液ＩＩ：
２００ｇ／Ｌ バクトトリプトン
１００ｇ／Ｌ 酵母抽出物
１１０ｇ／Ｌ グルコース。
【００９１】
ビタミン溶液（バッチおよび供給液Ｉ）：ビオチン０．５ｇ、葉酸０．４ｇおよびリボフラビン４．２ｇをＨ２Ｏ ４５０ｍＬおよび１０Ｎ ＮａＯＨ ３ｍＬに溶かし、Ｈ２Ｏを加えて５００ｍＬとした。ピリドキシン−ＨＣｌ １４ｇおよびナイアシン６１ｇをＨ２Ｏ １５０ｍＬおよび１０Ｎ ＮａＯＨ ５０ｍＬに溶かし、Ｈ２Ｏで２５０ｍＬとした。パントテン酸５４ｇをＨ２Ｏ ２００ｍＬに溶かし、２５０ｍＬとした。これら３種類の溶液を混合し、総量１０リットルとした。
【００９２】
微量金属溶液（バッチおよび供給液Ｉ）：
塩化第ＩＩ鉄（ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ）：２７ｇ／Ｌ
塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）：２ｇ／Ｌ
塩化コバルト（ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）：２ｇ／Ｌ
モリブデン酸ナトリウム（ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ）：２ｇ／Ｌ
塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）：１ｇ／Ｌ
硫酸第ＩＩ銅（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）：１．９ｇ／Ｌ
ホウ酸（Ｈ３ＢＯ３）：０．５ｇ／Ｌ
塩化マンガン（ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）：１．６ｇ／Ｌ
クエン酸ナトリウム・２水和物：７３．５ｇ／Ｌ。
【００９３】
マウスＯＢ蛋白の精製方法
以下の段階によって精製を行った（別断の断りがない限り、以下の段階は４℃で行った）。
【００９４】
１．細胞ペースト
大腸菌細胞ペーストを５倍容量の７ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）に懸濁した。ＥＤＴＡ中の細胞をミクロ流動装置に２回通してさらに粉砕した。粉砕細胞をベックマン（Beckman）Ｊ６−Ｂ遠心管中、ＪＳ−４．２ローターを用いて４．２Ｋｒｐｍで１時間遠心した。
２．封入体洗浄１
上記からの上清を除去し、ペレットを５倍容量の７ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）に再懸濁し、均質化した。この混合物を段階１の方法で遠心した。
３．封入体洗浄２
上記からの上清を除去し、ペレットを１０倍容量の２０ｍＭトリス（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ ＤＴＴおよび１％デオキシコレートに再懸濁し、均質化した。この混合物を段階１の方法で遠心した。
４．封入体洗浄３
上記からの上清を除去し、ペレットを１０倍容量の蒸留水に再懸濁し、均質化した。この混合物を段階１の方法で遠心した。
５．巻き戻し
ペレットについて室温で、１５倍容量の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ８．５）、１％サルコシンナトリウム（Ｎ−ラウロイルサルコシン）で巻き戻しを行った。６０分後、溶液を６０μＭ硫酸銅液とし、終夜攪拌した。
６．サルコシンの除去
巻き戻し混合物を、５倍容量の１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈し、段階１の方法に従って遠心した。上清を回収し、希釈巻き戻し混合物の総容量の０．０６６％で、２０〜５０メッシュで塩素型のダウエックス（Dowex）（登録商標）１−Ｘ４樹脂（Dow Chemical Co., Midland MI）と、攪拌下に１時間混合した（ダウエックス（登録商標）の詳細についてはＷＯ ８９／１０９３２の２６頁参照）。この混合物をカラムに注ぎ入れ、溶出液を回収した。サルコシンの除去を、逆相ＨＰＬＣによって確認した。
７．酸沈殿
前段階からの溶出液を回収し、ｐＨを調節してｐＨ５．５とし、室温で３０分間インキュベーションした。この混合物を段階１の方法に従って遠心した。
８．カチオン交換クロマトグラフィー
前段階からの上清のｐＨを調節してｐＨ４．２とし、ＣＭセファロース・ファスト・フロー（Sepharose Fast Flow）に負荷した（７％容量）。２０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ ４．２で、２０倍カラム容量にて０Ｍから１．０ＭＮａＣｌの塩勾配溶離を行った。
９．疎水性相互作用クロマトグラフィー
前段階からのピーク分画のＣＭセファロース蓄積液（紫外線吸光度から確認）を０．２Ｍ硫酸アンモニウム液とした。５ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ ４．２で、２０倍カラム容量にて０．４Ｍから０Ｍ硫酸アンモニウムの逆相勾配溶離を行った。この材料を濃縮し、ＰＢＳに透析濾過した。
【００９５】
組換えヒトＯＢ蛋白類縁体の発酵
上記の宿主細胞の発酵による組換えヒトＯＢ蛋白類縁体（配列番号４）の製造は、組換えマウス材料について前述した条件および組成物を用いて行うことができる。
【００９６】
組換えヒトＯＢ蛋白類縁体の精製
組換えヒト蛋白類縁体の精製は、上記の実施例１に記載の方法に従って、組換えマウス蛋白の精製に用いた方法と同様の方法を用いて行うことができる。組換えヒトＯＢ蛋白類縁体を得るには、段階７からの上清のｐＨをｐＨ５．０に調節し、それをＣＭセファロース・ファスト・フローカラムに負荷することで、段階８を行わなければならない。２０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ ５．５で、２０倍カラム容量にて０Ｍから０．５Ｍ ＮａＣｌの塩勾配溶離を行わなければならない。段階９は、ＣＭセファロース蓄積液を水で４倍に希釈し、ｐＨを７．５に調節することで行わなければならない。この混合物を０．７Ｍ硫酸アンモニウム液としなければならない。５ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ ５．５で、２０倍カラム容量にて０．２Ｍから０Ｍ硫酸アンモニウムの逆相勾配溶離を行わなければならない。それ以外は上記の段階と同じである。実施例２の材料については、位置３５にリジンおよび位置７４にイソロイシンを有する配列番号４の組換えヒトＯＢ蛋白を、１０ｍＭヒスチジン、４．３％アルギニンを含む緩衝液でｐＨ６．０にて製剤した。
【００９７】
以上、好ましい実施態様によって本発明について説明したが、当業者が変更および修正を行ない得ることは明らかである。従って請求の範囲が、特許請求される発明の範囲に含まれるそのような均等な変更全てを含むものである。
Claims (3)
- ヒトＯＢ蛋白のＮ末端に結合した抗体の定常領域またはその一部分を含み、場合によりＮ末端メチオニンを含有していてもよい融合蛋白であって、前記融合蛋白が、前記ヒトＯＢ蛋白の循環半減期に比べ長い循環半減期を有し、前記ＯＢ蛋白が、
（ａ）配列番号４に示したアミノ酸配列１〜１４６であって、ここで配列番号４の配列の位置２のバリンをアミノ酸の位置１と定義する配列；
（ｂ）位置３５にリジン残基と位置７４にイソロイシン残基を有する配列番号４に示したアミノ酸配列１〜１４６であって、ここで配列番号４の配列の位置２のバリンをアミノ酸の位置１と定義する配列；
（ｃ）位置２８のグルタミン残基が欠失している上記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列；ならびに
（ｄ）位置３２、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７、８９、９７、１００、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の２１箇所のうちの１〜２１箇所のアミノ酸が配列番号２中に存在する対応するアミノ酸で置換されているか、または対応する保存アミノ酸で置換されている上記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列から成る群から選択される前記融合蛋白。 - 請求項１に記載の融合蛋白および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 肥満の治療またはインシュリン感受性の向上に使用する請求項２に記載の医薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US56173295A | 1995-11-22 | 1995-11-22 | |
| US08/561,732 | 1995-11-22 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51974597A Division JP4173914B2 (ja) | 1995-11-22 | 1996-11-04 | Ｏｂ蛋白組成物を用いる非脂肪組織重増加方法 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002206000A JP2002206000A (ja) | 2002-07-23 |
| JP2002206000A5 JP2002206000A5 (ja) | 2007-04-05 |
| JP4227325B2 true JP4227325B2 (ja) | 2009-02-18 |
Family
ID=24243198
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51974597A Expired - Fee Related JP4173914B2 (ja) | 1995-11-22 | 1996-11-04 | Ｏｂ蛋白組成物を用いる非脂肪組織重増加方法 |
| JP2001352728A Expired - Fee Related JP4227325B2 (ja) | 1995-11-22 | 2001-11-19 | Ｏｂ蛋白組成物を用いる非脂肪組織重増加方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51974597A Expired - Fee Related JP4173914B2 (ja) | 1995-11-22 | 1996-11-04 | Ｏｂ蛋白組成物を用いる非脂肪組織重増加方法 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (3) | EP0866720B1 (ja) |
| JP (2) | JP4173914B2 (ja) |
| AT (2) | ATE455554T1 (ja) |
| AU (3) | AU7607496A (ja) |
| CA (2) | CA2236163A1 (ja) |
| DE (2) | DE69638119D1 (ja) |
| DK (1) | DK0866720T3 (ja) |
| ES (2) | ES2217327T3 (ja) |
| IL (2) | IL124442A0 (ja) |
| MX (1) | MX9803992A (ja) |
| NZ (3) | NZ512083A (ja) |
| PT (1) | PT866720E (ja) |
| SI (1) | SI0866720T1 (ja) |
| WO (1) | WO1997018833A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA969605B (ja) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6001968A (en) * | 1994-08-17 | 1999-12-14 | The Rockefeller University | OB polypeptides, modified forms and compositions |
| US20030040467A1 (en) | 1998-06-15 | 2003-02-27 | Mary Ann Pelleymounter | Ig/ob fusions and uses thereof. |
| ES2217327T3 (es) * | 1995-11-22 | 2004-11-01 | Amgen Inc., | Proteina ob para aumentar la masa de tejido magro. |
| US6936439B2 (en) | 1995-11-22 | 2005-08-30 | Amgen Inc. | OB fusion protein compositions and methods |
| US6620413B1 (en) | 1995-12-27 | 2003-09-16 | Genentech, Inc. | OB protein-polymer chimeras |
| US6541604B1 (en) | 1996-01-08 | 2003-04-01 | Genentech, Inc. | Leptin receptor having a WSX motif |
| US7074397B1 (en) | 1996-01-08 | 2006-07-11 | Genentech, Inc. | Method for enhancing proliferation or differentiation of a cell using ob protein |
| US20050019325A1 (en) | 1996-01-08 | 2005-01-27 | Carter Paul J. | WSX receptor agonist antibodies |
| JP2000505791A (ja) * | 1996-01-25 | 2000-05-16 | イーライ・リリー・アンド・カンパニー | 肥満症タンパク質類似体化合物およびその製剤 |
| CA2251808A1 (en) * | 1996-04-19 | 1997-10-30 | Zymogenetics, Inc. | Methods for inducing bone formation |
| CA2274799A1 (en) * | 1996-12-20 | 1998-07-02 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
| ES2280083T3 (es) * | 1996-12-20 | 2007-09-01 | Amgen Inc. | Composiciones de proteinas de fusion ob y metodos. |
| US20020019352A1 (en) * | 1997-04-17 | 2002-02-14 | David N. Brems | Stable, active, human ob protein compositions and methods |
| EP0950417A3 (en) * | 1998-02-23 | 2000-02-23 | Pfizer Products Inc. | Treatment of skeletal disorders |
| AU3863699A (en) * | 1998-04-20 | 1999-11-08 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Treatment of osteoporosis with leptin |
| US6210924B1 (en) | 1998-08-11 | 2001-04-03 | Amgen Inc. | Overexpressing cyclin D 1 in a eukaryotic cell line |
| US6420339B1 (en) | 1998-10-14 | 2002-07-16 | Amgen Inc. | Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility |
| WO2000024418A1 (en) * | 1998-10-27 | 2000-05-04 | Eli Lilly And Company | Prevention of muscle mass loss with leptin receptor ligands |
| ATE323766T1 (de) * | 1999-02-12 | 2006-05-15 | Amgen Inc | Glykosylierte leptinzusammensetzungen und zugehörige verfahren |
| US8106098B2 (en) | 1999-08-09 | 2012-01-31 | The General Hospital Corporation | Protein conjugates with a water-soluble biocompatible, biodegradable polymer |
| DE60237100D1 (de) | 2001-10-22 | 2010-09-02 | Amgen Inc | Verwendung von leptin zur behandlung von lipoatropr prädisposition gegenüber der behandlung |
| EP1496838B1 (en) | 2002-03-12 | 2010-11-03 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Substituted amides |
| MXPA06015234A (es) * | 2004-06-30 | 2007-11-22 | Nektar Therapeutics Al Corp | Conjugados de fraccion polimero-factor ix. |
| DK1814590T4 (da) | 2004-11-01 | 2014-02-24 | Amylin Pharmaceuticals Llc | Behandling af obesitet og beslægtede sygdomme. |
| US8394765B2 (en) | 2004-11-01 | 2013-03-12 | Amylin Pharmaceuticals Llc | Methods of treating obesity with two different anti-obesity agents |
| WO2008048691A2 (en) * | 2006-10-18 | 2008-04-24 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Use of leptin for treating post-lipectomy ectopic fat deposition and other post-lipectomy associated disorders |
| WO2009149379A2 (en) | 2008-06-05 | 2009-12-10 | Regents Of The University Of Michigan | Use of leptin for the treatment of fatty liver diseases and conditions |
| CA2813087C (en) | 2010-09-28 | 2020-07-21 | Amylin Pharmaceuticals, Llc | Engineered polypeptides having enhanced duration of action |
| RU2650646C2 (ru) | 2012-09-27 | 2018-04-16 | Дзе Чилдрен'З Медикал Сентер Корпорейшн | Соединения, предназначенные для лечения ожирения, и способы их применения |
| TR201901299T4 (tr) | 2013-11-26 | 2019-02-21 | Childrens Medical Ct Corp | Obezite tedavisine yönelik bileşikler ve bunların kullanım yöntemleri. |
| US20170209408A1 (en) | 2014-04-03 | 2017-07-27 | The Children's Medical Center Corporation | Hsp90 inhibitors for the treatment of obesity and methods of use thereof |
| ES2959990T3 (es) | 2016-09-12 | 2024-02-29 | Amryt Pharmaceuticals Inc | Métodos de detección de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra la leptina |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1228925B (it) * | 1987-08-07 | 1991-07-10 | Eniricerche Spa | Procedimento per la preparazione dell'ormone della crescita umano |
| DK173142B1 (da) * | 1988-08-24 | 2000-02-07 | Natinco Nv | Fremgangsmåde til forbedring af kødkvaliteten og foderomsætningseffektiviteten for grise |
| US5028440A (en) * | 1990-01-30 | 1991-07-02 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Method of raising meat producing animals to increase lean tissue development |
| CA2169351A1 (en) * | 1993-08-13 | 1995-02-23 | Martin Wanner | Process and device for treating the surface of large objects |
| US6309853B1 (en) * | 1994-08-17 | 2001-10-30 | The Rockfeller University | Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| GB9511935D0 (en) * | 1995-06-13 | 1995-08-09 | Smithkline Beecham Plc | Novel compound |
| ES2217327T3 (es) * | 1995-11-22 | 2004-11-01 | Amgen Inc., | Proteina ob para aumentar la masa de tejido magro. |
| JP4037905B2 (ja) * | 1995-12-27 | 2008-01-23 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 半減期の長いｏｂタンパク質誘導体 |
| ES2280083T3 (es) * | 1996-12-20 | 2007-09-01 | Amgen Inc. | Composiciones de proteinas de fusion ob y metodos. |
| AU7132798A (en) * | 1997-04-17 | 1998-11-11 | Amgen, Inc. | Compositions comprising conjugates of stable, active, human ob protein with antibody fc chain and methods |
-
1996
- 1996-11-04 ES ES96938773T patent/ES2217327T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-04 AU AU76074/96A patent/AU7607496A/en not_active Abandoned
- 1996-11-04 AT AT02011474T patent/ATE455554T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-11-04 WO PCT/US1996/017718 patent/WO1997018833A1/en active IP Right Grant
- 1996-11-04 DK DK96938773T patent/DK0866720T3/da active
- 1996-11-04 AT AT96938773T patent/ATE259243T1/de active
- 1996-11-04 CA CA002236163A patent/CA2236163A1/en active Pending
- 1996-11-04 SI SI9630675T patent/SI0866720T1/xx unknown
- 1996-11-04 IL IL12444296A patent/IL124442A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-11-04 PT PT96938773T patent/PT866720E/pt unknown
- 1996-11-04 ES ES02011474T patent/ES2339846T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-04 CA CA002358862A patent/CA2358862A1/en not_active Abandoned
- 1996-11-04 DE DE69638119T patent/DE69638119D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-04 EP EP96938773A patent/EP0866720B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-04 EP EP02011474A patent/EP1285664B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-04 EP EP98119160A patent/EP0956862A1/en not_active Withdrawn
- 1996-11-04 JP JP51974597A patent/JP4173914B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-04 NZ NZ512083A patent/NZ512083A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-11-04 NZ NZ511617A patent/NZ511617A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-11-04 DE DE69631544T patent/DE69631544T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-04 NZ NZ527007A patent/NZ527007A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-11-15 ZA ZA969605A patent/ZA969605B/xx unknown
-
1998
- 1998-05-20 MX MX9803992A patent/MX9803992A/es not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-01-05 IL IL127926A patent/IL127926A/en not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-06-23 AU AU42652/00A patent/AU763755B2/en not_active Ceased
- 2000-06-23 AU AU42653/00A patent/AU763769B2/en not_active Ceased
-
2001
- 2001-11-19 JP JP2001352728A patent/JP4227325B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4227325B2 (ja) | Ｏｂ蛋白組成物を用いる非脂肪組織重増加方法 | |
| JP4173913B2 (ja) | Ｏｂタンパク質組成物を用いて血中脂質レベルを減少させ又は減少した血中脂質レベルを維持する方法 | |
| JP4659068B2 (ja) | Ｏｂ融合タンパク質組成物および方法 | |
| US7718400B2 (en) | Methods of increasing lean tissue mass using OB protein compositions | |
| US7112659B2 (en) | OB fusion protein compositions and methods | |
| JP2001501177A (ja) | Ｏｂタンパク質受容体をアップレギュレートすることによりｏｂタンパク質に対する個体の感受性を増加させる方法 | |
| AU2006201747B2 (en) | Methods of Increasing Lean Tissue Mass Using OB Protein Compositions | |
| AU2004200516B2 (en) | Methods of Increasing Lean Tissue Mass Using OB Protein Compositions | |
| AU2003201360B2 (en) | Methods of Reducing or Maintaining Reduced Levels of Blood Lipids Using OB Protein Compositions | |
| MXPA99001875A (en) | Methods of increasing sensitivity of an individual to ob protein by upregulating ob protein receptor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060815 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20061108 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20061113 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070215 |
|
| A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20070215 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20080205 |
|
| RD13 | Notification of appointment of power of sub attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7433 Effective date: 20080205 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080415 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080812 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20081016 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20081111 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20081128 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111205 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121205 Year of fee payment: 4 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |