JP2000505791A

JP2000505791A - 肥満症タンパク質類似体化合物およびその製剤

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Publication number: JP2000505791A
Application number: JP9527039A
Authority: JP
Inventors: ホフマン，ジェイムズ・エイ
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1996-01-25
Filing date: 1997-01-24
Publication date: 2000-05-16
Also published as: AU2246097A; WO1997026916A1; US5831017A; EP0877627A1

Abstract

(57)【要約】本発明は２価金属カチオンと複合体化した肥満症タンパク質類似体からなる新規化合物、その医薬製剤ならびに肥満症、および糖尿病、心臓血管疾患およびがんのような肥満症に関連する障害の処置にこの化合物を用いる方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】肥満症タンパク質類似体化合物およびその製剤本発明はヒト医学分野にあり、特に肥満症および肥満症に関連する障害の処置に関する。さらに詳細には、本発明は肥満症タンパク質類似体の化合物および製剤に関する。肥満症、および特に上半身肥満症は米国および世界中において一般的で非常に深刻な公衆衛生上の問題である。最近の統計によると、米国人口の２５％以上およびカナダ人口の２７％以上が太り過ぎである。Kuczmarski、Amer．J．of Clin .Nutr．55: 495s-502s(1992); Reederら、Can．Med．Ass．J.，23: 226-233（19 92）。上半身肥満症はII型真性糖尿病に対して知られる最も強力な危険因子であり、また心臓血管障害およびがんの強力な危険因子でもある。最近の肥満症医療コストの推定額は世界中で１５０，０００，０００，０００ドルである。公衆衛生局長官が主導してアメリカ社会に蔓延し増加し続ける脂肪症との格闘を開始させるほどこの問題は深刻になってきた。この肥満症を誘発する病因の多くは異脂肪血症（dyslipidemia）、高血圧症およびインシュリン耐性に強い関連をもつ。食事療法および運動によって肥満を減じることがこれらの危険因子を劇的に減らすことが多くの研究で示された。不運なことにこれらの処置はほとんどが失敗し、失敗率は９５％に達する。この失敗は、この状態が食欲の増加、高カロリー食品への嗜好、肉体活動の減少および脂質形成代謝の増大の一因となる遺伝的に受け継がれる因子に強く関連することに由来する。このことはこのような遺伝的特質を受け継いだ人々がこの状態と格闘する彼らの努力に関係なく肥満になりがちであることを示す。それゆえ、遺伝継承にかかわらずにこの脂肪症ハンディキャップを正常にし、内科医が肥満症患者の処置を首尾よく行うことができる薬理活性物が必要とされる。ｏｂ／ｏｂマウスは肥満症および糖尿病のモデルであり、第６染色体上の突然変異にかかわる常染色体劣性特性をもつことが知られる。最近、Yiying Zhang および共同研究者らはこの状態にかかわるマウス遺伝子のポジショナルクローニングを公表した。Yiying Zhangら、Nature372: 425-32（1994）。この報告はマウスおよびヒトの脂肪組織において発現するタンパク質を開示する。同様に、村上らはBiochemical and Biophysical Research Communications 209(3):944-52 （1995）においてラット肥満遺伝子（obese gene）のクローニングおよび発現を報告している。このｏｂ遺伝子にコードされるタンパク質はマウスにおいて脂肪症を効果的に調節する能力を示した。Pelleymounterら、Science269: 540-543（ 1995）。肥満症タンパク質類似体（obesity protein analogs）が開発され、薬理活性が示された。これらの類似体のいくつかは物理的性質および安定性が大きく向上しており、改善された薬理活性物質となっている。本発明中に含まれる類似体は Basinskiら、米国出願番号第０８／３８３，６３８号およびDiMarchiら、米国仮出願番号第６０／０００，４５０号および第６０／００２，１６１号（ＷＯ９６／２３５１５およびＷＯ９６／２３５１７として公開）に開示されている。本発明はこの類似体の効力が大きく高められる条件を提供する。それゆえ、より少ない投与量で有効な医薬処置が達成でき、毒性および他の望ましくない副作用の危険を非常に少なくすることができる。加えて、タンパク質投与量がより少ないため、患者に対する単位投与剤型のコストが下がる。すなわち、本発明は２価金属イオンと複合体化した肥満症タンパク質類似体からなる新規タンパク質− カチオン複合体、その医薬製剤ならびにその化合物を肥満症、および糖尿病、心臓血管疾患およびがんのような肥満症に関連する障害の処置に用いる方法を提供する。本発明は２価金属カチオンと複合体化した肥満症タンパク質類似体からなる化合物を提供する。本発明は加えて、タンパク質−カチオン化合物を含む非経口医薬製剤およびその化合物を肥満症、および糖尿病、心臓血管疾患およびがんのような肥満症に関連する障害の処置に用いる方法を提供する。本発明はさらにｐＨ約４．５〜９．０の水溶液中、肥満症タンパク質類似体および２価金属カチオンを一緒にすることを特徴とする上記化合物の製造方法を提供する。本明細書中にて開示および特許請求している本発明の目的に沿って以下の用語および略語を次のように定義する。「塩基対（ｂｐ）」は、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。ＤＮＡ分子において存在する略語Ａ、Ｃ、ＧおよびＴはそれぞれ５’モノリン酸形態のヌクレオチド、（デオキシ）アデニン、（デオキシ）シチジン、（デオキシ）グアニンおよび（デオキシ）チミンに対応する。ＲＮＡ分子において存在する略語Ｕ、Ｃ、ＧおよびＴは５’モノリン酸形態のヌクレオシド、ウラシル、シチジン、グアニンおよびチミンにそれぞれ対応する。二本鎖ＤＮＡでは、塩基対はＡとＴまたはＣとＧの組み合わせを意味する。ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重らせんでは、塩基対はＴとＵまたはＣとＧの組み合わせを意味する。「肥満症タンパク質類似体」は、式（Ｉ）［ここに、第２８位のＸａａはＧｌｎまたは不存在であり；同タンパク質は少なくとも１つの以下の置換を有する：第４位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第７位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第２２位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第２７位のＴｈｒがＡｌａに置換している；第２８位のＸａａがＧｌｕに置換している；第３４位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第５４位のＭｅｔがメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＡｌａまたはＧｌｙに置換している；第５６位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第６２位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第６３位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第６８位のＭｅｔがメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＡｌａまたはＧｌｙに置換している；第７２位のＡｓｎがＧｌｎ、ＧｌｕまたはＡｓｐに置換している；第７５位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第７７位のＳｅｒがＡｌａに置換している；第７８位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第８２位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第９７位のＨｉｓがＧｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＰｒｏに置換している；第１００位のＴｒｐがＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換している；第１０１位のＡｌａがＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＴｈｒまたはＶａｌに置換している；第１０２位のＳｅｒがＡｒｇに置換している；第１０３位のＧｌｙがＡｌａに置換している；第１０５位のＧｌｕがＧｌｎに置換している；第１０６位のＴｈｒがＬｙｓまたはＳｅｒに置換している；第１０７位のＬｅｕがＰｒｏに置換している；第１０８位のＡｓｐがＧｌｕに置換している；第１１１位のＧｌｙがＡｓｐに置換している；第１１８位のＧｌｙがＬｅｕに置換している；第１３０位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第１３４位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第１３６位のＭｅｔがメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＡｌａまたはＧｌｙに置換している；第１３８位のＴｒｐがＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈe、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換している；あるいは第１３９位のＧｌｎがＧｌｕに置換している］で示されるタンパク質または医薬的に許容されるその塩を意味する。「プラスミド」は、染色体外の自己複製遺伝子成分である。「読み取り枠」は、翻訳開始点からｔＲＮＡ、リボソームおよび関連する因子の翻訳装置によってトリプレットで「読みとられる」ヌクレオチド配列であり、それぞれのトリプレットは特定のアミノ酸に対応する。それぞれのトリプレットは別個で同じ長さであるため、コーディング配列は３の倍数でなければならない。１塩基対挿入または欠失（フレームシフト突然変異という）は結果として同じＤＮＡセグメントによってコードされる２つの異なったタンパク質を与える。これを防ぐには、所望のポリペプチドに対応するトリプレットコドンは開始コドンから３の倍数でならんでいなければならず、すなわち正しい「読み取り枠」が維持されなければならない。キレーティングペプチドを含有する融合タンパク質を作成する際、構造タンパク質をコードするＤＮＡ配列の読み取り枠はそのキレーティングペプチドをコードするＤＮＡ配列において維持されなければならない。「組換えＤＮＡクローニングベクター」は、１つまたはそれ以上の追加ＤＮＡセグメントを加えることができる、あるいは既に加えられたＤＮＡ分子を含有する自律複製因子であり、これにはプラスミドおよびファージがあるが、これらに限定されない。「組換えＤＮＡ発現ベクター」は、プロモーターが導入されている組換えＤＮＡクローニングベクターである。「レプリコン」は、プラスミドまたは他のベクターの自律複製を制御し、可能にするＤＮＡ配列である。「転写」は、ＤＮＡのヌクレオチド配列に含まれる情報を相補的なＲＮＡ配列に移す過程である。「翻訳」は、メッセンジャーＲＮＡの遺伝情報を用いてポリペプチド鎖の合成を特定化し、指揮する過程である。「ベクター」は、適当な制御配列と組み合わせた場合に形質転換される宿主細胞に特定の性質を与える適当なタンパク質分子に対応するポリヌクレオチド配列を保有する、遺伝子操作の際に細胞の形質転換に用いられるレプリコンである。プラスミド、ウイルスおよびバクテリオファージは本来レプリコンであるので、適切なベクターである。人工ベクターは異なる起源からのＤＮＡ分子を制限酵素およびリガーゼを用いて切断および連結することによって作成される。ベクターには組換えＤＮＡクローニングベクターおよび組換えＤＮＡ発現ベクターが含まれる。「処置」とは、本明細書では、疾患、状態または障害と格闘することを目的とする患者の管理および介護を指し、これには兆候または併発症の発症を予防し、それらを緩和し、あるいは疾患、状態または障害を除去するために本発明のタンパク質を投与することが含まれる。本明細書中に用いている処置は美容目的のために本タンパク質を投与することを含む。美容目的は哺乳類の体重をコントロールして体の見た目を改善することを求める。「等張性試薬」は、細胞膜を透過する正味の水流出を防ぐために製剤に適当な張性を付与する生理的に寛容な試薬を意味する。一般にグリセリンのような化合物が既知の濃度でそのような目的に用いられる。他の可能な等張性試薬は塩、例えば塩化ナトリウム、デキストロースおよびラクトースなどである。「生理的に寛容な緩衝液」は当分野において既知である。生理的に寛容な緩衝液はトリス、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムなどである。緩衝液の選択および濃度は当分野において既知である。「医薬的に許容される保存剤」について。多用途非経口製剤は保存効力のガイドラインに沿って商業的に利用可能な製品にしなければならない。非経口製剤において許容される当分野に既知の医薬的に許容される保存剤は：フェノール、ｍ −クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、クロロブタノール、ｐ− クレゾール、硝酸フェニル水銀、チメローザル（thimerosal）およびこれらの種々の混合物などである。他の保存剤は、例えばWALLHAUSER，K.-H.，DEVEL0P．BI 0L．STANDARD．24，PP．9-28（Basel，S．Krager，1974）にみられる。保存効果を達成するのに必要な濃度は用いる保存剤およびその製剤条件に依存する。本明細書に用いるヌクレオチドおよびアミノ酸の略語は米国特許および商標庁によって３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２（ｂ）（２）（１９９３）の記載として許容される。特に明記しなければ、アミノ酸はＬ体である。上記のように本発明は２価金属カチオンと複合体化した肥満症タンパク質類似体からなる化合物を提供する。肥満症タンパク質類似体は２価金属カチオンと複合体化した場合、大きく効力が高められることが示されている。本発明の好ましいタンパク質は式Ｉ［ここに；第４位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第７位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第２２位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第２７位のＴｈｒがＡｌａに置換している；第２８位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第３４位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第５４位のＭｅｔがメチオニンスルホキシド、ＬｅｕまたはＡｌａに置換している；第５６位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第６２位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第６３位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第６８位のＭｅｔがメチオニンスルホキシドまたはＬｅｕに置換している；第７２位のＡｓｎがＧｌｕまたはＡｓｐに置換している：第７５位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第７８位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第８２位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第１３０位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第１３４位のＧｌｎがＧｌｕに置換している；第１３６位のＭｅｔがメチオニンスルホキシド、ＬｅｕNＩｌｅに置換している；あるいは第１３９位のＧｌｎがＧｌｕに置換している］で示されるものである。他の好ましいタンパク質は式Ｉ［ここに：第２２位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第２７位のＴｈｒがＡｌａに置換している；第５４位のＭｅｔがメチオニンスルホキシド、ＬｅｕまたはＡｌａに置換している；第６８位のＭｅｔがメチオニンスルホキシドまたはＬｅｕに置換している；第７２位のＡｓｎがＧｌｕまたはＡｓｐに置換している；第７８位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第８２位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；あるいは第１３６位のＭｅｔがメチオニンスルホキシド、Ｌｅｕ、またはＩｌｅに置換している］で示されるものである。さらに加えて好ましいタンパク質は式Ｉ［ここに：第２２位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第２７位のＴｈｒがＡｌａに置換している；第５４位のＭｅｔがＬｅｕまたはＡｌａに置換している；第６８位のＭｅｔがＬｅｕに置換している；第７２位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第７８位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；第８２位のＡｓｎがＧｌｎまたはＡｓｐに置換している；あるいは第１３６位のＭｅｔがＬｅｕ、またはＩｌｅに置換している］で示されるものである。式Ｉの範囲内の好ましい種類は配列番号２および配列番号３：の種類を含む。最も重要なことに、本発明の他の好ましいタンパク質は配列番号１のタンパク質のアミノ酸残基９７〜１１１および／または１３８の特異的置換体である。これらの置換体は結果として付加的なタンパク質安定性をもち、より優れた治療物質である。したがって、好ましい態様は式II：［ここに、第２８位のＸａａはＧｌｎまたは不存在であり；同タンパク質は：第９７位のＨｉｓがＧｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＰｒｏに置換している；第１００位のＴｒｐがＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換している；第１０１位のＡｌａがＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＴｈｒまたはＶａｌに置換している；第１０２位のＳｅｒがＡｒｇに置換している；第１０３位のＧｌｙがＡｌａに置換している；第１０５位のＧｌｕがＧｌｎに置換している；第１０６位のＴｈｒがＬｙｓまたはＳｅｒに置換している；第１０７位のＬｅｕがＰｒｏに置換している；第１０８位のＡｓｐがＧｌｕに置換している；第１１１位のＧｌｙがＡｓｐに置換している；あるいは第１３８位のＴｒｐがＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換している；からなる群から選択される少なくとも１つの置換を有する］で示されるタンパク質またはその医薬的に許容される塩を含む化合物である。好ましいタンパク質は式III：［同タンパク質は：第９７位のＨｉｓがＧｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＰｒｏに置換している；第１００位のＴｒｐがＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換している；第１０１位のＡｌａがＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＴｈｒまたはＶａｌに置換している；第１０２位のＳｅｒがＡｒｇに置換している；第１０３位のＧｌｙがＡｌａに置換している；第１０５位のＧｌｕがＧｌｎに置換している；第１０６位のＴｈｒがＬｙｓまたはＳｅｒに置換している；第１０７位のＬｅｕがＰｒｏに置換している；第１０８位のＡｓｐがＧｌｕに置換している；第１１１位のＧｌｙがＡｓｐに置換している；あるいは第１３８位のＴｒｐがＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換している；からなる群から選択される少なくとも１つの置換を有する］で示されるタンパク質またはその医薬的に許容される塩である。より好ましいタンパク質は式III ［ここに：第９７位のＨｉｓがＧｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＰｒｏに置換している；第１００位のＴｒｐがＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、ＧｌｎまたはＬｅｕに置換している；第１０１位のＡｌａがＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、ＴｈｒまたはＶａｌに置換している；第１０５位のＧｌｕがＧｌｎに置換している；第１０６位のＴｈｒがＬｙｓまたはＳｅｒに置換している；第１０７位のＬｅｕがＰｒｏに置換している；第１０８位のＡｓｐがＧｌｕに置換している；第１１１位のＧｌｙがＡｓｐに置換している；あるいは第１３８位のＴｒｐがＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換している］で示されるものである。他の好ましいタンパク質は式III ［ここに：第９７位のＨｉｓがＳｅｒまたはＰｒｏに置換している；第１００位のＴｒｐがＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕに置換している；第１０１位のＡｌａがＴｈｒに置換している；あるいは第１３８位のＴｒｐがＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＬｅｕに置換している］で示されるものである。さらに加えて好ましいタンパク質は式III ［ここに：第９７位のＨｉｓがＳｅｒまたはＰｒｏに置換している；第１００位のＴｒｐがＡｌａ、ＧｌｎまたはＬｅｕに置換している；第１０１位のＡｌａがＴｈｒに置換している；あるいは第１３８位のＴｒｐがＧｌｎに置換している］で示されるものである。本発明の最も好ましい種類は第９６位のＣｙｓおよび第１４６位のＣｙｓの間にジスルフィド結合を有する本タンパク質である。最も好ましい種類の例は配列番号６〜１３の種類を含む: ［同タンパク質は第９６位のＣｙｓおよび第１４６位のＣｙｓの間にジスルフィド結合を有する］またはその医薬的に許容される塩。［同タンパク質は第９６位のＣｙｓおよび第１４６位のＣｙｓの間にジスルフィド結合を有する］またはその医薬的に許容される塩。［同タンパク質は第９６位のＣｙｓおよび第１４６位のＣｙｓの間にジスルフィド結合を有する］またはその医薬的に許容される塩。［同タンパク質は第９６位のＣｙｓおよび第１４６位のＣｙｓの間にジスルフィド結合を有する］またはその医薬的に許容される塩。［同タンパク質は第９６位のＣｙｓおよび第１４６位のＣｙｓの間にジスルフィド結合を有する］またはその医薬的に許容される塩。［同タンパク質は第９６位のＣｙｓおよび第１４６位のＣｙｓの間にジスルフィド結合を有する］またはその医薬的に許容される塩。［同タンパク質は第９６位のＣｙｓおよび第１４６位のＣｙｓの間にジスルフィド結合を有する］またはその医薬的に許容される塩。［同タンパク質は第９６位のＣｙｓおよび第１４６位のＣｙｓの間にジスルフィド結合を有する］またはその医薬的に許容される塩。特許請求している化合物は２価金属カチオンと複合体化した肥満症タンパク質類似体からなる。２価金属カチオンには、例えばＺｎ⁺⁺、Ｍｎ⁺⁺、Ｆｅ⁺⁺、Ｃｏ⁺⁺ 、Ｃｄ⁺⁺、Ｎｉ⁺⁺などがある。２つまたはそれ以上の２価金属カチオンを組み合わせて利用することもできるが、好ましい化合物は単一種の金属カチオン、最も好ましくはＺｎ⁺⁺を含む。２価金属カチオンは過剰にするのが好ましいが、各１０分子の肥満症タンパク質類似体に対し、２価金属カチオンが少なくとも１分子のモル比であれば実施可能である。化合物は肥満症タンパク質類似体１分子につき１〜１００の２価金属カチオンを含むのが好ましい。本化合物は非晶または結晶固形物であり得る。金属カチオンの適当な形態は本発明の肥満症タンパク質類似体分子と複合体を形成するのに利用可能な２価金属カチオンのあらゆる形態である。金属カチオンは固形形態で加えることができるし、あるいは溶液として加えることもできる。本発明にはいくつかの異なるカチオン塩を用いることができる。金属塩の代表例は酢酸、臭化物、塩化物、フッ化物、ヨウ化物および硫酸の塩形態である。本発明の化合物の製造に用いることができる他の金属塩がたくさん存在することは当業者であれば認識するところであろう。好ましくは、酢酸亜鉛または塩化亜鉛を用いて本発明の亜鉛−肥満症タンパク質類似体化合物を作成する。最も好ましくは、２価金属カチオンは塩化亜鉛である。一般に、特許請求している化合物は当分野に既知の技術によって製造する。例えば簡便な製造法は水溶液中、ｐＨ約４．５〜９．０、好ましくはｐＨ約５．５〜８、最も好ましくはｐＨ６．５〜７．６で肥満症タンパク質類似体を所望の２価金属カチオンと一緒にすることである。特許請求している化合物は溶液から結晶もしくは非晶性固形物として沈殿する。重要なことに、本化合物は濾過および遠心を含めた当分野に認められる通常の分離技術によって容易に単離精製できる。重要なことに、タンパク質−金属カチオン複合体は安定であり、固形物または水性懸濁物として都合よく保存できる。本発明はさらに本発明の化合物および水を含む医薬製剤を提供する。製剤中における肥満症タンパク質類似体の濃度は約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ；好ましくは約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５０．０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５．０ｍｇ／ｍｌである。本製剤は保存効力を維持するために必要な濃度の医薬的に許容される保存剤を含むのが好ましい。保存効力を維持するために必要な保存剤の相対量は用いる保存剤によって変化する。一般に必要量は、引用によって本明細書に包含されるWA LLHAUSER，K.-H.，DEVELOP．BI0L．STANDARD．24，PP．9-28（Basel，S．Krager ，1974）中にみることができる。等張性試薬、好ましくはグリセリンをさらに製剤に加えることができる。等張性試薬の濃度は非経口製剤に対して当分野に既知の範囲内であり、好ましくは約１６ｍｇ／ｍｌグリセリンである。また製剤のｐＨは生理的に寛容な緩衝液を用いて緩衝化することができる。許容される生理的に寛容な緩衝液はトリス、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムなどである。緩衝液の選択および濃度は当分野において既知である。他の添加剤、例えばトゥウィーン（Tween）２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、トゥウィーン４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、トゥウィーン８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、プルロニック（Pluronic）Ｆ６８（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー）、ブリッジ（BRIJ）３５（ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル）およびペグ（PEG）（ポリエチレングリコール）のような医薬的に許容される賦形剤を凝集を減らすために製剤に加えることもできる。特許請求している医薬製剤は当分野に既知の手法によって製造し、単独で、あるいは他の治療薬と組み合わせて投与する。本発明の製剤は、通常の溶解および混合手順を用いて製造することができる。特許請求している製剤は非経口用途に合うように水溶液中にて製造するのが好ましい。すなわち、タンパク質溶液は注射用水、緩衝液および保存剤を混合することによって製造する。２価金属カチオンを加えて総カチオン濃度約０．００１〜５．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５〜１．５ｍｇ／ｍｌとする。肥満症タンパク質類似体−亜鉛複合体が完全に沈殿するように溶液のｐＨを調節することができる。患者に投与する前、本化合物を再懸濁するのは容易である。本化合物の１日の非経口投与量は約１ｎｇ〜約１０ｍｇ／体重ｋｇの範囲にあるが、それよりも少量または多量を投与することもできる。必要な投与量は患者の状態の重篤度、および患者の身長、体重、性別、年齢および治療履歴のような基準に基づいて医師によって決定される。この方法のバリエーションは当業者によって認識されるところであろう。例えば、界面活性剤を用いる場合の成分を加える順番、製剤を調製する温度およびｐＨは用いる濃度および投与手段に応じて最適とすることができる。本製剤のｐＨは一般的にｐＨ４．５〜９．０、好ましくは５．５〜８．０、最も好ましくは６．５〜７．６であるが、一部またはすべてのタンパク質−金属カチオン複合体が溶解しているような場合、より酸性ｐＨでもよい。本発明にしたがって調製される製剤はシリンジ、注射器、ポンプまたは当分野において非経口投与用と認識される他の器具中にて用いることができる。本化合物に用いるタンパク質は古典（溶液）法、固相法、半合成法およびより最近の組換えＤＮＡ法を含め、認識されるいかなる種類のペプチド合成技術によっても調製することができる。高い収量を望む場合には組換え法が好ましい。タンパク質の組換え製造における基本工程は次の通りである：ａ）肥満症タンパク質をコードする合成または半合成ＤＮＡの構築（または天然起源からの単離）、ｂ）単独または融合タンパク質のいずれかのタンパク質発現に適した手法によるコーディング配列の発現ベクターへの組み込み、ｃ）この発現ベクターを用いた適当な真核生物または原核生物宿主細胞の形質転換、およびｄ）組換え的に生産したタンパク質の回収および精製。インビトロまたはインビボにおいて転写および翻訳された結果、本タンパク質を与える合成遺伝子は当分野に周知の技術によって構築することができる。遺伝コードの天然の縮重のせいで、所望のタンパク質をコードする、相当な数ではあるが限られた数のＤＮＡ配列を構築することができることは当業者であれば認識するところであろう。本発明の好ましい実施態様において、合成は組換えＤＮＡ技術によって行う。合成遺伝子構築の方法論は当分野に周知である。例えば、Brownら、（1979）M ethods in Enzymology，Academic Press，N．Y.，Vol．68，pgs．109-151参照。本請求タンパク質合成遺伝子に相当するＤＮＡ配列はアプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）モデル380Aまたは380B合成機（Applied Biosystems， Inc.，850 Lincoln Center Drive，Foster City，CA 94404から商業的に入手可能）のような通常のＤＮＡ合成装置を用いて製造できる。いくつかの適用において、例えば融合タンパク質構築物からシグナルペプチドを切除することを制御するために、シグナルペプチドおよび構造タンパク質間に都合のよいプロテアーゼ感受性切断部位を包含するように肥満症タンパク質をコードする配列を修飾することが望ましいことがある。また肥満症タンパク質をコードする遺伝子はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることによって作成することもできる。鋳型はｃＤＮＡライブラリー（CL 0NETECHまたはSTRATAGENEより商業的に入手可能）または所望のアライバル脂肪組織から単離したｍＲＮＡとすることができる。そのような方法論は当分野Mani atis,ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New Yo rk（1989）において周知である。構築または単離したＤＮＡ配列は肥満症タンパク質を直接発現か、あるいは融合タンパク質としてかのどちらかによって発現するのに有用である。この配列を融合遺伝子として用いる場合には、その産物は酵素的または化学的切断を必要とする。ポリペプチドを特異的部位で切断する、あるいはペプチドをペプチド鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端から消化する種々のペプチダーゼ（例えばジアミノペプチダーゼ）が知られる。さらに、特定の化学物質（例えば臭化シアン）はポリペプチド鎖を特異的部位で切断する。部位特異的内部切断部位を含ませるためにアミノ酸配列（および組換え法を用いるならば合成または半合成コーディング配列）に必要とされる修飾は当業者であれば認識するところであろう。米国特許第５，１２６，２４９号；Carter P.，Site Specific Proteolysis of Fusi on Protein，Ch．13 in Protein Purification:From Molecular Mechanisms to Large Scale Processes，American Chemical Soc.，Washington，D.C．（1990）参照。所望のコーディングおよび制御配列を含有する適当なベクターの構築には標準的連結技術を用いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡ断片を切断し、仕立て、再連結して必要とされるプラスミドを生成するような形にする。所望のタンパク質を効果的に翻訳するために、設計された合成ＤＮＡ配列を適した制限エンドヌクレアーゼを利用して過剰の適当な組換ＤＮＡ発現ベクターに挿入する。合成コーディング配列はこれらの発現プラスミドおよび増幅発現プラスミドからの単離およびそれらへの組み込みを容易にするために転写体末端の一方に制限エンドヌクレアーゼ切断部位を保有するように設計することができる。単離したｃＤＮＡコーディング配列は合成リンカーを用いることによって、この配列を当分野に周知の技術によって所望のクローニングベクターへ包含するように容易に修飾することができる。使用する特定の制限エンドヌクレアーゼは用いる親発現ベクターの制限エンドヌクレアーゼ切断パターンによって規定される。制限部位は制御配列に対しコーディング配列が正しい方向になるように選択し、正しい読み取り枠で本タンパク質が発現されるようする。一般に、宿主細胞と適合する種由来のプロモーターおよび制御配列を含有するプラスミドベクターをこれらの宿主と共に用いる。通常、ベクターは複製開始点および形質転換細胞において表現型選択を可能にするマーカー配列を保持する。例えば、大腸菌は典型的に、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２（Bo livar，ら、Gene 2:95(1977)）を用いて形質転換する。プラスミドｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含有するため形質転換細胞の容易な同定手段を提供する。また、このｐＢＲ３２２プラスミド、または他の微生物プラスミドは組換えＤＮＡ技術に用いられるプロモーターおよび他の制御要素を含有していなければならず、あるいは含有するように修飾されなければならない。所望のコーディング配列は、タンパク質が発現する宿主細胞において機能的であるべきプロモーターおよびリボソーム結合部位から転写が開始されるように正しい方向で発現ベクターへ挿入する。そのような発現ベクターの例としてBelaga jeら、米国特許第５，３０４，４９３号（その教示内容は引用により本明細書に包含される）に記載のプラスミドがある。米国特許第５，３０４，４９３号に記載のＡ−Ｃ−Ｂプロインシュリンをコードする遺伝子は制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いてプラスミドｐＲＢ１８２から取り除くことができる。単離したＤＮＡ配列はＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ制限断片カセット上にてプラスミド骨格に挿入することができる。本発明において有用なベクターを構築する際、一般に原核生物をＤＮＡのクローニングに用いる。例えば、大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣＮｏ．３１４４６）は特に有用である。用いることができる他の細菌株には大腸菌Ｂおよび大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣＮｏ．３１５３７）などがある。これらの例は制限するものではなく例示にすぎない。また原核生物は発現にも有用である。前記株および大腸菌Ｗ３１１０（原栄養株、ＡＴＣＣＮｏ．２７３２５）、枯草菌（Bacillus subtilis）のようなバチルス、およびサルモネラ・ティフィリウム（Salmonera typhimurium）またはセラチア・マルセスセンス（Serratia marcescans）のような他の腸内細菌科、および種々のシュードモナス種を用いることができる。原核生物の宿主と共に用いるのに適したプロモーターにはβ−ラクタマーゼ（ベクターｐＧＸ２９０７［ＡＴＣＣ３９３４４］はレプリコンおよびβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有する）およびラクトースプロモーター系（Changら、Nature 275:615(1978);およびGoedde lら、Nature 281:544(1979)）、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（ベクターｐＡＴＨ１［ＡＴＣＣ３７６９５］はｔｒｐプロモーターの制御下にｔｒｐＥ融合タンパク質としてのオープン読み取り枠の発現を容易にするように設計されている）およびｔａｃプロモーター（プラスミドｐＤＲ５４０ＡＴＣＣ−３７２８２から単離可能）のようなハイブリッドプロモーターなどがある。しかし、ヌクレオチド配列が一般的に既知の他の機能性細菌プロモーターであっても必要な制限部位を付与するリンカーまたはアダプターを用いてタンパク質をコードするＤＮＡに連結することが可能である。また細菌系用プロモーターはタンパク質をコードするＤＮＡに作動可能に連結したシャイン・ダルガルノ配列を含有するであろう。またＤＮＡ分子は真核生物発現系において組換え的に生産することもできる。哺乳類宿主細胞における転写を制御する好ましいプロモーターは種々の起源、例えばポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはサイトメガロウイルスのようなウイルスゲノムから、あるいは例えばβ−アクチンプロモーターのような異種哺乳類プロモーターから得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターはＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限断片として容易に得られる。Fiers，ら、Nature，273:113（1978）。ＳＶ４０全ゲノムはプラスミドｐＢＲＳＶ，ＡＴＣＣ４５０１９から得られる。ヒトサイトメガロウイルスの即時初期プロモーターはプラスミドｐＣＭＢｂ（ＡＴＣＣ７７１７７）から得ることができる。もちろん宿主細胞または関連種からのプロモーターもまたここに有用である。高等真核生物によるＤＮＡの転写はエンハンサ−配列をベクターに挿入することによって増加する。エンハンサーは通常約１０〜３００塩基対のＤＮＡのシス作用性要素であり、プロモーターに作用してその転写を増大させる。エンハンサーは比較的独立した方向および位置に置かれるものであり、イントロン中（Bane rji，J．L．ら、Cell 33:729(1983)）およびコーディング配列自体中（Osborne, T．F．ら、Mol．Cell Bio．4:1293(1984)）、転写ユニットに対して５’側（Lai mins，L．ら、PNAS 78:993(1981)）および3’側（Lusky，M．L．ら、Mol．Cell Bio．3:1108(1983)）に認められている。現在、多くの哺乳類遺伝子（グロビン、ＲＳＶ、ＳＶ４０、ＥＭＣ、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン）由来のエンハンサー配列が知られている。しかし、典型的には真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを用いる。例としてはＳＶ４０後期エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーなどがある。また真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物由来有核細胞）にて用いられる発現ベクターはｍＲＮＡ発現に影響し得る転写終結に必要な配列を含有するであろう。これらの領域はタンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分のポリアデニル化セグメントとして転写される。３’ 側の非翻訳領域もまた転写終結部位を含む。発現べクターは選択マーカーと呼ばれることもある選択遺伝子を含有していてよい。哺乳類細胞に適当な選択マーカーの例にはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ、これはｐＪＯＤ−１０［ＡＴＣＣ６８８１５］のＢｇｌII／ＨｉｎｄII I制限断片から誘導することができる）、チミジンキナーゼ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼはｖＰ−５クローン［ＡＴＣＣ２０２８］のＢａｍＨＩ断片に含まれる）またはネオマイシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子（ｐＮＮ４１４酵母人工染色体ベクター［ＡＴＣＣ３７６８２］から得られる）がある。そのような選択マーカーが哺乳類宿主細胞中に首尾よく転移すると、トランスフェクションされた噛乳類宿主細胞は選択圧下に置かれても生存することができる。広く用いられる２つの異なるカテゴリーの選択的体制が存在する。第１のカテゴリーは細胞の代謝および補足培地なしに生育する能力が欠如した突然変異細胞株の利用に基づくものである。２つの例は：ＣＨＯＤＨＦＲ-細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ −９０９６）およびマウスＬＴＫ-細胞（Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）ＡＴＣＣＣＣＬ−２．３）である。これらの細胞はチミジンまたはヒポキサンチンのような栄養素を加えることなしに生育する能力を欠いている。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経路に必要な特定の遺伝子を欠いているために、欠失ヌクレオチドが補足培地中に供給されなければ生存できない。培地を補足することの代替法は完全なＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子をそれぞれの遺伝子を欠いている細胞へ導入することであり、これによりこれらの細胞の生育要求性を変える。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子によって形質転換されなかった個々の細胞は補足されていない媒地中では生存能力がない。第２のカテゴリーは優性選択であって、いかなる細胞タイプにおいても用いられる選択機構を意味し、突然変異細胞株の利用を必要としない。これらの機構では典型的に薬剤をもちいて宿主細胞の生育を阻止する。新規遺伝子を有するこれらの細胞は薬物耐性を付与するタンパク質を発現し、その選択に生き残るであろう。そのような優性選択の例では薬物ネオマイシン（Southern P．およびBerg,P ．J．Molec．Appl．Genet．1:327(1982)）、ミコフェノール酸（Mu11igan,R．C ．およびBerg，P.，Science 209:1422(1980)）、またはハイグロマイシン(Sugde n，B．ら、Mo1．Ce11．Bio1．5:410-413(1985)）を用いる。上記の３例は真核生物性調節下に細菌遺伝子を用いてそれぞれ適当な薬剤Ｇ４１８またはネオマイシン（ジェネチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性をもたらす。真核生物性発現に好ましいベクターはｐＲｃ／ＣＭＶである。ｐＲｃ／ＣＭＶはインビトロジェン・コーポレーション、3985 Sorrento Valley Blvd.，San Di ego，CA 92121から商業的に入手可能である。構築したプラスミド中の配列が正しいかを確認するため、連結反応混合物を用いて大腸菌Ｋ１２株ＤＨ１０Ｂ（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換し、抗生物質耐性によって上首尾の形質転換体を適切に選択する。形質転換体由来プラスミドを調製し、制限および／またはＭ essing，ら、Nucleic Acids Res．9:309（1981）の手法による配列によって分析する。宿主細胞は本発明の発現ベクターを用いて形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択または遺伝子の増幅に適当であるように修飾した慣用的栄養培地において培養することができる。その培養条件、例えば温度、ｐＨなどは以前に発現に対して選択した宿主細胞で用いた条件であり、これは当業者には明らかであろう。細胞を上記ベクターを用いて形質転換する技術は当分野に周知であり、Maniatis,ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor ,New York（1989）、またはCurrent Protocols in Mo1ecular Biology（1989）および補遺のような概説参考文献に記載されている。高等真核生物において特許請求しているタンパク質をコードするベクターの発現に好ましい適当な宿主細胞は：ＳＶ４０によって形質転換されるアフリカミドリザル腎細胞株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ−１６５１）；形質転換ヒト初期胚腎細胞株２９３（Graham，F．L．ら、J．Gen Virol．36:59-72（1977）、Viro logy 77:319-329、Virology 86:10-21）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）、ＡＴＣＣＣＣＬ−１０、Virology 16:147(1962)）；チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ−ＤＨＦＲ^-（ＡＴＣＣＣＲＬ−９０９６）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、ＡＴＣＣＣＲＬ−１７１５、Biol．Reprod．23:24 3-250(1980)）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ７６、ＡＴＣＣＣＲＬ− １５８７）；ヒト頚部上皮がん腫細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣＣＣＬ−２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ−３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ−１４４２）、ヒト２倍体肺細胞（ＷＩ−３８、ＡＴＣＣＣＣＬ−７５）、ヒト肝細胞がん腫細胞（ＨｅｐＧ２、ＡＴＣＣＨＢ −８０６５）、およびマウス乳腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）などを含む。原核生物に加えて、酵母培養物のような単細胞真核生物もまた用いられる。たくさんの他の株も一般に利用可能であるがサッカロミセスセレビシエ（すなわち一般パン酵母）が最も一般的に用いられる真核微生物である。サッカロミセスにおける発現には、例えばプラスミドＹＲｐ７（ＡＴＣＣ−４００５３、Stinchco mb,ら、Nature 282:39(1979);Kingsmanら、Gene 7:141(1979);Tschemperら、Gen e 10:157(1980)）が一般的に用いられる。このプラスミドはトリプトファン中で生育する能力の欠如した酵母突然変異株、例えばＡＴＣＣｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１（Jones，Genetics 85:12(1977)）に対する選択マーカーを供給するｔｒｐ遺伝子をすでに含有している。酵母宿主と共に用いる適当なプロモーター配列には３−ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（プラスミドｐＡＰ１２ＢＤＡＴＣＣ５３２３１上に見られ、米国特許第４，９３５，３５０号、１９９０年６月１９日に記載されている）または他の解糖系酵素、例えばエノラーゼ（プラスミドｐＡＣ１ＡＴＣＣ３９５３２上に見られる）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（プラスミドｐＨｃＧＡＰＣ１ＡＴＣＣ５７０９０、５７０９１に由来）、ジモモナスモビリス（１９９１年５月１９日発行の米国特許第５，０００，０００号）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのプロモーターがある。生育条件によって制御されるさらに別の転写上の利点をもつ誘導性プロモーターを含有する他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン（プラスミドベクターｐＣＬ２８ＸｈｏＬＨＢＰＶＡＴＣＣ３９４７５上に含まれる、米国特許第４，８４０，８９６号）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼおよびマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素（プラスミドｐＲＹ１２１ＡＴＣＣ３７６５８上に見られるＧＡＬ１）のプロモーター領域である。酵母での発現に用いる適当なベクターおよびプロモーターはR．Hitzemanら、欧州特許公開第７３，６５７Ａ号にさらに記載されている。サッカロミセスセレビシエ由来ＵＡＳＧａｌ（プラスミドＹＥｐｓｅｃ−−ｈＩ１ｂｅｔａＡＴＣＣ６７０２４上のＣＹＣ１プロモーターと連結して見られる）のような酵母エンハンサーもまた酵母プロモーターと共に都合よく用いられる。製造例１所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドをＰｍｌＩおよびＢｓｕ３６Ｉを用いて消化する。これらの酵素の認識配列は同タンパク質のコーディング領域内のヌクレオチド第２７５位および第３６０位にそれぞれ存在する。クローニングベクターはこれらの認識配列を含まない。結果的に、ＰｍｌＩおよびＢｓｕ３６Ｉを用いた制限酵素消化後、２つの断片のみがみられ、そのうち１つはベクター断片に相当し、もう１つはタンパク質コーディング配列内から遊離した〜８５塩基対断片に相当する。この配列は本発明の第９１位および第１１６位の間のアミノ酸置換体をコードするいかなるＤＮＡ配列によっても置き換えることができる。これらのＤＮＡ配列は相補的塩基と、ＰｍｌＩおよびＢｓｕ３６Ｉによる消化によって生成される末端と適合する末端とを有する２つのオリゴヌクレオチドとして化学的に合成する。これらの化学的に合成したオリゴヌクレオチドを等モル量（１〜１０ピコモル／μｌ）で混合し、９５℃にまで加熱し、２０〜２５℃にまでゆっくりと温度を下げることによってアニーリングする。このアニーリングしたオリゴヌクレオチドを標準的連結反応に用いる。実施例１に記載の通りに連結産物によって形質転換し、分析する。他の置換体は適当な制限部位を用いる類似の手法で行うのが好ましい。製造例２ＭｅｔＡｒｇリーダー配列をもつ配列番号６をコードするＤＮＡ配列を製造例１に記載のプラスミドおよび手法を用いて得た。このプラスミドをＰｍｌＩおよびＢｓｕ３６Ｉで消化した。配列５”−配列番号１４：の合成ＤＮＡ断片を配列５'−配列番号１５：とアニーリングし、ＰｍｌＩおよびＢｓｕ３６Ｉ部位の間に挿入した。連結、形質転換およびプラスミドの単離に続いて、合成断片の配列をＤＮＡ配列分析によって確認した。上記ベクターを用いて細胞を形質転換する技術は当分野に周知であり、Maniat is,ら、（1988）Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor,New Yorkまたは Current Protocols in Molecular Biology（1989）および補遺のような概説参考文献に記載されている。本明細書に例示するような本発明の好ましい実施態様において用いる大腸菌細胞の形質転換を含む技術は当分野に周知である。形質転換した大腸菌細胞を培養する正確な条件は大腸菌宿主細胞株の性質および用いる発現ベクターもしくはクローニングベクターに依存する。例えば、ｃ１８５７熱誘導性ラムダファージプロモーターオペレーター領域のような熱誘導性プロモーターオペレーター領域を包含するベクターはタンパク質合成を誘導するために培養条件の温度を約３０℃から約４０℃に変える必要がある。本発明の好ましい態様において、大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８細胞を宿主細胞として用いたが、多数の他の細胞株、例えば大腸菌Ｋ１２Ｌ２０１、Ｌ６８７、Ｌ６９３、Ｌ５０７、Ｌ６４０、Ｌ６４１、Ｌ６９５、Ｌ８１４（大腸菌Ｂ）（これに限定されないが）も利用できる。次いで形質転換した宿主細胞を発現プラスミドに存在する耐性遺伝子に対応する抗生物質の選択圧下、適当な培地のプレートにまく。次いで用いた宿主細胞株に適当な時間および温度で培養物をインキュベートする。大量細菌発現系において発現されるタンパク質は大量の過剰発現タンパク質を含有する細粒または封入体に凝集することが特徴である。Kreugerら、in Prote in Folding，Gierasch and King，eds.，pgs 136-142（1990），American Assoc iation for the Advancement of Science Publication No．89-18S，Washington ,D．C．。そのようなタンパク質凝集体はさらに精製したり、所望のタンパク質産物を単離したりするために溶解しなければならない。（前掲）。タンパク質を溶解するためには、グアニジン塩酸のような強い変性溶液および／または尿素のような弱い変性溶液を用いる種々の技術が用いられる。溶液中の変性試薬を徐々に除去すること（しばしば透析によって）によって変性タンパク質に天然のコンフォメーションをとらせることができる。変性および折りたたみ状態に対する特定の条件は、特定のタンパク質発現系および／または問題のタンパク質によって決まる。製造例３ＭｅｔＡｒｇリーダー配列を伴う配列番号６のタンパク質を大腸菌内で発現させ、得られた細粒を８Ｍ尿素および５ｍＭシステイン中で単離した。このタンパク質を８Ｍ尿素中、陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製し、８Ｍ尿素（５ｍＭシステインを含む）中への希釈およびＰＢＳに対する完全透析によって折りたたませた。サイズ排除クロマトグラフィーによる最終精製後、このタンパク質をＰＢＳ中３〜３．５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。製造例４配列番号２のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を化学的に合成した一本鎖オリゴヌクレオチドから組立て、二本鎖ＤＮＡ配列を製造した。このＤＮＡ配列の組立てに用いたオリゴヌクレオチドは以下の通りである：オリゴヌクレオチド１６〜２２を用いてコーディング配列内の第２２０位におけるＮｄｅＩ部位からＸｂａＩ部位まで広がるおよそ２２０塩基対セグメントを調製した。オリゴヌクレオチド２３〜２９を用いてＸｂａＩ部位からＢａｍＨＩ部位まで広がるおよそ２４０塩基対セグメントを製造した。２２０および２４０塩基対断片を組立てるために、それぞれのオリゴヌクレオチドを等モル量、通常は濃度約１〜２ピコモル／μｌで混合した。組立ての前に、標準キナーゼ緩衝液中、Ｔ４ＤＮＡキナーゼをその供給元によって規定される条件下に用い、得られるセグメントの５”−末端におけるオリゴヌクレオチド以外のすべてをリン酸化した。この混合物を９５℃にまで加熱し、オリゴヌクレオチドの適正なアニーリングを保証するために１〜２時間かけてゆっくりと室温にまで冷却した。次いでオリゴヌクレオチドを相互に連結してクローニングベクター（ここにＰＵＣ１９を用いたが、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いる他のものも利用できる）に挿入した。ＰＵＣ１９緩衝液および条件は酵素の供給元によって推薦されるものである。使用前に２２０塩基対断片用のベクターはＮｄｅＩおよびＸｂａＩによって消化し、一方２４０塩基対断片用のベクターはＸｂａＩおよびＢａｍＨＩによって消化した。連結混合物を用いて大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬより商業的に入手可能）を形質転換し、形質転換細胞を１００μｇ／ｍlアンピシリン、Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有するトリプトン−酵母（ＴＹ）プレートにまいた。一晩生育したコロニーを１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む液体ＴＹ培地中で培養し、プラスミドの単離およびＤＮＡ配列分析に用いた。正しい配列をもったプラスミドを完全な遺伝子の組立てのために保管した。これは２２０塩基対および２４０塩基対断片のゲル精製ならびにこれら２つの断片のＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで線状化したＰＵＣ１９への連結によって行われる。連結混合物で大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換し、上記のようにプレートにまいた。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、ＮｄｅＩおよびＢａｌ IIによって消化した。大きいベクター断片をゲル−精製し、以下に示すような６つの化学的に合成したオリゴヌクレオチドから上記のようにして組立てたおよそ１９５塩基対セグメントと連結した。上記のようにして連結物で大腸菌細胞を形質転換した。得られた形質転換体からＤＮＡを単離し、その配列をＤＮＡ配列分析によって確認した。正しい配列をもつプラスミドをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、およそ４５０塩基対挿入物を発現ベクター中へ再クローニングした。このタンパク質を大腸菌内で発現させ、単離し、ＰＢＳ中あるいは８Ｍ尿素中（両者とも５ｍＭシステインを含む）いずれかへの希釈およびＰＢＳに対する完全透析によって折りたたませた。サイズ排除クロマトグラフィーによる最終精製に続いて、タンパク質をＰＢＳ中３〜３．５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。アミノ酸組成を確認した。製造例５上記のようにしてＭｅｔＡｒｇリーダー配列を伴う配列番号６のタンパク質を大腸菌内で発現させ、単離し、折りたたませた。６〜１０ミリユニットｄＤＡＰ／ｍｇタンパク質を加えることによってＭｅｔＡｒｇリーダー配列を切断した。この変換反応は室温で２〜８時間進行させた。反応の進行は高速逆相クロマトグラフィーによってモニターした。反応は水酸化ナトリウムでｐＨを８に調節することによって停止した。脱（Ｍｅｔ−Ａｒｇ）タンパク質（des(Met-Arg)）をさらに７〜８Ｍ尿素中で陽イオン交換クロマトグラフィーによってならびに、ＰＢＳ中でサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。サイズ排除クロマトグラフィーによるタンパク質の最終精製に続いて、タンパク質をＰＢＳ中３〜３．５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ＤＮＡ配列は米国特許第５，１２６，２４９号（これは引用によって本明細書に包含される）に記載のようにＭｅｔ−ＡｒｇまたはＭｅｔ−Ｔｙｒをコードするジペプチドのリーダー配列を伴って発現されるのが好ましい。このアプローチにより、タンパク質が効率的に発現され、カテプシンＣまたは他のジペプチジルペプチダーゼを用いて敏速に活性タンパク質型に変換することができる。タンパク質の精製は当分野に既知の逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除などの技術によって行う。以下の実施例は単に本発明製剤の調製をさらに例示するためのものである。本発明の範囲は単に以下の実施例のみからなると考えるべきではない。実施例１亜鉛製剤の製造１６ｍｇ／ｍｌグリセリンおよび２ｍｇ／ｍｌフェノールを含有する水溶液３２ｍｌ中に配列番号６のタンパク質（２０ｍｇ）（以後、タンパク質番号６とする）を完全に溶解し、滅菌０．２μフィルターに通した。塩化亜鉛から亜鉛１００ｍｇ／ｍｌを含む水溶液を調製した。希釈して１０ｍｇ／ｍｌ亜鉛溶液および１ｍｇ／ｍｌ亜鉛溶液を作成した。６ｍｌのタンパク質番号６溶液５つを表Ｉに示すように改変した。少量の２Ｎおよび５Ｎ水酸化ナトリウムを用いて各製剤をｐＨ７．４８±０．０３に調節し、４℃で保存した。標品Ｂ〜Ｅは濁った懸濁液であったが標品Ａは完全に透明であった。実施例２亜鉛製剤の分析実施例１の標品Ａ〜Ｅの遠心上清をサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。これらの分析のためにこの上清１００μlをＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝塩類溶液、GibcoBRL）で平衡化した分析用Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５（Pharmacia）カラム上に注入した。このカラムを環境温度にて０．５ｍｌ／分で溶出し、溶出液中のタンパク質を２１４ｎｍでモニターした。この分析の結果を表IIに示す。実施例３亜鉛製剤の生物学的活性それぞれタンパク質番号６を３０μｇ含有する実施例１の５つの標品すべての投与量（５０μｌ）を１日１回、４日間ｏｂ／ｏｂマウスに皮下注射した。加えて、コントロールとしてｐＨ７．４に調節した１６ｍｇ／ｍｌグリセリン−２ｍｇ／ｍｌフェノール溶液の投与量５０μlを皮下注射した。ｏｂ／ｏｂマウスにおける１日の平均餌摂取量および０時間からの体重の累積変化を表IIIに示す。得られたデータは本発明の化合物が肥満症の処置に有用な強力かつ効果的物質であることを示す。金属カチオン錯体として投与された場合には、このタンパク質の効力が大きく高められた。また製剤の総亜鉛濃度を増加させることによっても効力が高められ、ｏｂ／ｏｂマウスにおける生物学的効果が改善される。したがって、本発明は２価金属カチオンと複合体化した肥満症タンパク質類似体からなる化合物、その医薬製剤ならびに肥満症、および糖尿病（特に非インシュリン依存真性糖尿病）、心臓血管疾患およびがんのような肥満症に関連する障害の処置にこの化合物を用いる方法を提供する。本発明の原理、好ましい態様および実施様式は前記の明細書に記載したとおりである。しかし、開示した特定の形態は制限的よりむしろ例示的とみなされるべきであり、本明細書中保護を意図する発明はこれに限定されると考えるべきではない。本発明の概念から離れることなく当業者によってバリエーションおよび変化を加えることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ

Claims

【特許請求の範囲】１．２価金属カチオンと複合体化した肥満症タンパク質類似体からなる化合物。２．２価金属カチオンがＺｎ＋＋である請求項１に記載の化合物。３．類似体が式：［同タンパク質は第９６位のＣｙｓおよび第１４６位のＣｙｓの間にジスルフィド結合を有している］で示される請求項１または２に記載の化合物。４．類似体が式：［同タンパク質は第９６位のＣｙｓおよび第１４６位のＣｙｓの間にジスルフィド結合を有している］で示される請求項１または２に記載の化合物。５．請求項１〜４のいずれかに記載の化合物および水を含む非経口医薬製剤。６．さらに医薬的に許容される保存剤を含む請求項５に記載の製剤。７．さらに等張性試薬を含む請求項６に記載の製剤。８．さらに生理的に許容される緩衝液を含む請求項７に記載の製剤。９．総カチオン濃度が０．０５〜１．５ｍｇ／ｍｌである請求項８に記載の製剤。１０．製剤のｐＨがｐＨ４．５〜９．０である請求項９に記載の製剤。１１．製剤のｐＨがｐＨ６．５〜７．６である請求項１０に記載の製剤。１２．肥満症の処置を必要としている患者に請求項１〜４のいずれかに記載の化合物の有効量を投与することを特徴とする肥満症の処置方法。１３．肥満症の処置を必要としている患者に請求項５〜１１のいずれかに記載の製剤の有効量を投与することを特徴とする肥満症の処置方法。１４．肥満症タンパク質類似体および２価金属カチオンを水溶液中、ｐＨ約４．５〜９．０で混合することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の化合物の製造方法。１５．肥満症の処置に用いるための請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。１６．肥満症の処置に用いるための請求項５〜１１のいずれかに記載の製剤。