JPH10513450A

JPH10513450A - 抗肥満症タンパク質

Info

Publication number: JPH10513450A
Application number: JP8523610A
Authority: JP
Inventors: バシンスキー，マーグレット・ビー; ディマーチ，リチャード・ディ; ヒース，ウィリアム・エフ・ジュニア; ショーナー，ブリジット・イー
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1995-01-31
Filing date: 1996-01-29
Publication date: 1998-12-22
Also published as: WO1996023515A1; AR002024A1; EP0725078A1; EP0725079A1; PE15297A1; CO4480036A1; CA2211664A1; AU4766196A; WO1996023517A1; TR199600084A2; YU5396A

Abstract

(57)【要約】本発明は抗肥満症タンパク質を提供するものであり、該タンパク質は患者に投与したときに脂肪組織を制御する。従って、かかる薬剤は患者が肥満症という悪条件を克服して正常な生活を送ることを可能にし、II型糖尿病、心血管疾患および癌に対するリスクをはるかに減少させる。

Description

【発明の詳細な説明】抗肥満症タンパク質本発明は、ヒトの医学の分野、特に肥満症および肥満症に関連した障害の処置に属する。最も詳しくは、本発明は患者に投与すると脂肪組織を制御する抗肥満症タンパク質に関する。肥満症および特に上体の肥満症は、米国および全世界中において共通でありまた非常に深刻な公衆衛生問題である。最近の統計によると、米国の人口の２５％以上およびカナダの人口の２７％以上が太り過ぎである。ククツマルスキ（Ｋuc zmarski）、Ａmer.Ｊ.of Ｃ1in.Ｎut. ５５：４９５Ｓ−５０２Ｓ（１９９２）；リーダー（Ｒeeder）ら、Ｃan.Ｍed.Ａss.Ｊ.、２３：２２６−２３３（１９９２）。上体の肥満症はII型真性糖尿病に対して知られた最強の危険因子であり、心血管障害および癌の対する強い危険因子でもある。肥満症の医療費の最近の推定額は、全世界で１５０,０００,０００,０００ドルである。この問題は、米国社会において増加し続けている脂肪症の蔓延に対して公衆衛生局長官が闘いの指揮をとるほど深刻になってきている。この肥満症を誘発する病理の多くは、異脂肪症（dyslipidemia）、高血圧およびインシュリン耐性との強い関連に帰することができる。多くの研究は、食事療法および運動による肥満症の減少がこれらの危険因子を劇的に減少させることを証明している。不幸にも、これらの処置は大概は不成功に終わっており、失敗率は９５％に達している。この失敗は、該状態が、増進した食欲、高カロリー食品の嗜好、肉体活動の減少および脂質形成代謝の昂進に貢献する遺伝的規定因子に強く関連しているという事実によるものである。このことは、これらの遺伝的特性を遺伝している人々が該状態と格闘する努力にもかかわらず肥満症になりがちであることを示している。それゆえ、遺伝的性質にかかわらずこの脂肪症という悪条件を癒すことができ、内科医が肥満症患者をうまく処置することを可能にする新規の医薬製剤が必要である。ｏｂ／ｏｂマウスは肥満症および糖尿病のモデルであり、第６染色体における突然変異に連鎖した常染色体劣性特性を保持することが知られている。最近、イイン・ツァン（Ｙiying Ｚhang）およびその共同研究者たちは、この状態に連鎖したマウスの遺伝子のポジショナルクローニングを出版した。イイン・ツァンら、Ｎature ３７２：４２５−３２（１９９４）。この報告は、脂肪組織にのみ発現している２１アミノ酸のシグナルペプチドを有する１６７アミノ酸のタンパク質をコードする遺伝子を開示している。生理学者は何年もの間、哺乳動物が過食すると過剰となった脂肪が脳に体が肥満症になるというシグナルを伝達し、そのことが今度は体に食べることを減らさせ、一層多くの燃料を燃やすようにするという仮説を立てている。ハーベイ（Ｇ .Ｒ.Ｈervey）、Ｎature ２２７：６２９−６３１（１９６９）。この「フィードバック」モデルはパラビオーゼ実験により支持されており、これは肥満症を制御する循環ホルモンを示唆している。このモデルに基づき、ｏｂ遺伝子によりコードされていると思われる上記タンパク質が今や脂肪症制御ホルモンであると推測される。生物学的に活性で該タンパク質の活性を模倣した薬剤は、患者が食欲および代謝を制御し、それによって脂肪症を制御することを助けるのに有用である。本発明以前には、かかる薬剤は知られていなかった。本発明は、生物学的に活性な抗肥満症タンパク質を提供するものである。かかる薬剤は、それゆえ、患者が肥満症という悪条件を克服し、II型糖尿病、心血管疾患および癌に対するリスクを一層正常化して通常の生活を送ることを可能にする。発明の要約本発明は、式（Ｉ）で示される生物学的に活性な抗肥満症タンパク質に関する。ここで、４位のＸaaはＧlnまたはＧlu；７位のＸaaはＧlnまたはＧlu；２２位のＸaaはＧln、ＡsnまたはＡsp；２７位のＸaaはＴhrまたはＡla；２８位のＸaaはＧln、Ｇluまたは不在；３４位のＸaaはＧlnまたはＧlu；５４位のＸaaはＭet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖal、ＡlaまたはＧly；５６位のＸaaはＧlnまたはＧlu；６２位のＸaaはＧlnまたはＧlu；６３位のＸaaはＧlnまたはＧlu；６８位のＸaaはＭet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖal、ＡlaまたはＧly；７２位のＸaaはＧln、ＡsnまたはＡsp；７５位のＸaaはＧlnまたはＧlu；７８位のＸaaはＧln、ＡsnまたはＡsp；８２位のＸaaはＧln、ＡsnまたはＡsp；１００位のＸaaはＧlu、Ｔrp、Ｐhe、Ｉle、ＶalまたはＬeu；１０８位のＸaaはＡspまたはＧlu；１３０位のＸaaはＧlnまたはＧlu；１３４位のＸaaはＧlnまたはＧlu；１３６位のＸaaはＭet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖal、ＡlaまたはＧly；１３８位のＸaaはＧln、Ｔrp、Ｔyr、Ｐhe、Ｉle、ＶalまたはＬeu；１３９位のＸaaはＧlnまたはＧluである；ただし、４位のＸaaがＧln；７位のＸaaがＧln；２２位のＸaaがＡsn；２７位のＸaaがＴhr；２８位のＸaaがＧlnまたは不在；３４位のＸaaがＧln；５４位のＸaaがＭet；５６位のＸaaがＧln；６２位のＸaaがＧln；６３位のＸaaがＧln；６８位のＸaaがＭet；７２位のＸaaがＡsn；７５位のＸaaがＧln；７８位のＸaaがＡsn；８２位のＸaaがＡsn；１００位のＸaaがＴrp；１０８位のＸaaがＡsp；１３０位のＸaaがＧln；１３４位のＸaaがＧln；１３６位のＸaaがＭet；１３８位のＸaaがＴrp；かつ１３９位のＸaaがＧln である化合物は除く。本発明はさらに、肥満症の処置を必要とする哺乳動物に式（Ｉ）のタンパク質を投与することを含む、肥満症の処置方法を提供する。本発明はさらに、１またはそれ以上の製薬学的に許容し得る希釈剤、担体またはその賦形剤とともに式（Ｉ）のタンパク質を含む、医薬組成物を提供する。詳細な説明本発明の目的のためには、本明細書に開示および特許請求するように、下記術語および略語を以下のように定義する：塩基対（bp）・・ＤＮＡまたはＲＮＡをいう。略語Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは、それらがＤＮＡ分子中に存在する場合にはそれぞれ（デオキシ）アデニン、（デオキシ）シチジン、（デオキシ）グアニンおよび（デオキシ）チミンヌクレオチドの５'−一リン酸の形態に対応する。略語Ｕ、Ｃ、ＧおよびＴは、それらがＲＮＡ分子中に存在する場合にはそれぞれウラシル、シチジン、グアニンおよびチミジンヌクレオシドの５'−一リン酸の形態に対応する。二本鎖ＤＮＡにおいては塩基対はＡとＴ、またはＣとＧとが共同すること（partnership）をいう。ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖においては塩基対はＴもしくはＵとＡ、またはＣとＧとが共同することをいう。キレート形成ペプチド・・多価金属イオンと錯体を形成しうるアミノ酸配列をいう。免疫応答タンパク質・・抗体、親抗体分子と同様の性質の抗原と結合できる抗体の断片、および単鎖ポリペプチド結合分子（ＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ８７／０２２０８号、国際公開第ＷＯ８８／０１６４９号に記載）を記載するのに使用する語句。ＭＷＣＯ・・分子量カットオフの略語。プラスミド・・染色体外自律複製遺伝要素。ＰＭＳＦ・・フェニルメチルスルホニルフルオライドの略語。リーディングフレーム・・翻訳が行われるヌクレオチド配列は、ｔＲＮＡ、リボソームおよび関連因子の翻訳装置によってトリプレットにて「読まれ」、各トリプレットは特定のアミノ酸に対応する。各トリプレットは別個で同じ長さであるため、コーディング配列は３の倍数でなければならない。１塩基対の挿入または欠失は（フレームシフト変異という）、同じＤＮＡセグメントによりコードされる２つの異なるタンパク質となる。これを防ぐには、所望のポリペプチドに対応するトリプレットコドンが開始コドンから３の倍数で並べられなければならない、すなわち正しい「リーディングフレーム」が維持されなければならない。キレート形成ペプチドを含む融合タンパク質を生成するに際しては、構造タンパク質をコードするＤＮＡ配列のリーディングフレームはキレート形成ペプチドをコードするＤＮＡ配列中で維持されなければならない。組換えＤＮＡクローニングベクター・・１つまたはそれ以上のＤＮＡセグメントを加えうるまたは加えたＤＮＡ分子を含む、プラスミドおよびファージ（これらに限られるものではない）などの自律複製因子。組換えＤＮＡ発現ベクター・・プロモーターが組み込まれている組換えＤＮＡクローニングベクター。レプリコン・・プラスミドその他のベクターの自律複製を制御および可能にするＤＮＡ配列。転写・・ＤＮＡのヌクレオチド配列中に含まれる情報が相補的なＲＮＡ配列に移しとられるプロセス。翻訳・・メッセンジャーＲＮＡの遺伝情報を用いてポリペプチド鎖の合成を明記および指令するプロセス。トリス・・トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタンの略語。処置・・疾患、状態または障害と闘うための患者の管理および介護であり、兆候または合併症の発症を防ぎ、兆候または合併症を軽減し、または疾患、状態もしくは障害を排除するために本発明の化合物を投与することを含む。それゆえ、肥満症の処置には食物摂取の抑制、体重増加の抑制およびその必要がある患者において体重の減少を誘導することが含まれる。ベクター・・適当なタンパク質分子に対応するポリヌクレオチド配列を含む、遺伝子操作において細胞の形質転換に使用するレプリコンであって、該配列は適当な制御配列と組み合わされたときに、形質転換されるべき宿主細胞に対して特定の性質を付与するもの。プラスミド、ウイルスおよびバクテリオファージは適当なベクターである。というのはそれらは本来レプリコンであるからである。異なる源からのＤＮＡ分子を制限酵素およびリガーゼを用いて切断および連結することによって人工ベクターが構築される。ベクターは組換えＤＮＡクローニングベクターおよび組換えＤＮＡ発現ベクターを含む。Ｘ−gal・・５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトシドの略語。上記のように、本発明は式（Ｉ）のタンパク質を提供する。本発明の好ましいタンパク質は、式（Ｉ）において２７位のＸaaがＡlaであるものである。本発明の他の好ましいタンパク質は、式（Ｉ）において１０８位のＸaaがＡsp、２２位のＸaaがＡsp、１００位のＸaaがＴrpまたはＧln、または１３８位のＸaaがＴrp であるものである。本発明の他の好ましいタンパク質は、式（Ｉ）において４位のＸaaがＧlnまたはＧlu；７位のＸaaがＧlnまたはＧlu；２２位のＸaaがＧln、ＡsnまたはＡsp；２７位のＸaaがＴhrまたはＡla；２８位のＸaaがＧlnまたはＧlu；３４位のＸaaがＧlnまたはＧlu；５４位のＸaaがＭetまたはメチオニンスルホキシド；５６位のＸaaがＧlnまたはＧlu；６２位のＸaaがＧlnまたはＧlu；６３位のＸaaがＧlnまたはＧlu；６８位のＸaaがＭetまたはメチオニンスルホキシド；７２位のＸaaがＧln、ＡsnまたはＡsp；７５位のＸaaがＧlnまたはＧlu；７８位のＸaaがＧln、ＡsnまたはＡsp；１００位のＸaaがＴrp；８２位のＸaaがＧln、ＡsnまたはＡsp；１０８位のＸaaがＡspまたはＧlu；１３０位のＸaaがＧlnまたはＧlu；１３４位のＸaaがＧlnまたはＧlu；１３６位のＸaaがＭetまたはメチオニンスルホキシド；および１３８位のＸaaがＴrp；１３９位のＸaaがＧlnまたはＧlu であるものである。本発明の最も好ましいタンパク質は、式（Ｉ）において４位のＸaaがＧln；７位のＸaaがＧln；２２位のＸaaがＧln、ＡsnまたはＡsp；２７位のＸaaがＴhrまたはＡla；２８位のＸaaがＧln；３４位のＸaaがＧln；５４位のＸaaがＭet；５６位のＸaaがＧln；６２位のＸaaがＧln；６３位のＸaaがＧln；６８位のＸaaがＭet；７２位のＸaaがＧln、ＡsnまたはＡsp；７５位のＸaaがＧln；７８位のＸaaがＡsn；８２位のＸaaがＧln、ＡsnまたはＡsp；１００位のＸaaがＴrp；１０８位のＸaaがＡsp；１３０位のＸaaがＧln；１３４位のＸaaがＧln；１３６位のＸaaがＭet；および１３８位のＸaaがＴrp；１３９位のＸaaがＧln であるものである。さらに別の好ましいタンパク質としては、式（Ｉ）において４位のＸaaがＧlnまたはＧlu；７位のＸaaがＧlnまたはＧlu；２２位のＸaaがＡsn；２７位のＸaaがＴhrまたはＡla；２８位のＸaaがＧlnまたはＧlu；３４位のＸaaがＧlnまたはＧlu；５４位のＸaaがＭet；５６位のＸaaがＧlnまたはＧlu；６２位のＸaaがＧlnまたはＧlu；６３位のＸaaがＧlnまたはＧlu；６８位のＸaaがＭet；７２位のＸaaがＡsn；７５位のＸaaがＧlnまたはＧlu；７８位のＸaaがＡsn；８２位のＸaaがＡsn；１００位のＸaaがＴrp；１０８位のＸaaがＡsp；１３０位のＸaaがＧlnまたはＧlu；１３４位のＸaaがＧlnまたはＧlu；１３６位のＸaaがＭet；および１３８位のＸaaがＴrp；１３９位のＸaaがＧlnまたはＧlu であるもの、および式（Ｉ）において４位のＸaaがＧln；７位のＸaaがＧln；２２位のＸaaがＡsn；２７位のＸaaがＴhrまたはＡla；２８位のＸaaがＧln；３４位のＸaaがＧln；５４位のＸaaがＭetまたはメチオニンスルホキシド；５６位のＸaaがＧln；６２位のＸaaがＧln；６３位のＸaaがＧln；６８位のＸaaがＭetまたはメチオニンスルホキシド；７２位のＸaaがＡsn；７５位のＸaaがＧln；７８位のＸaaがＡsn；８２位のＸaaがＡsn；１００位のＸaaがＴrp；１０８位のＸaaがＡsp；１３０位のＸaaがＧln；１３４位のＸaaがＧln；１３６位のＸaaがＭetまたはメチオニンスルホキシド；および１３８位のＸaaがＴrp；１３９位のＸaaがＧln であるものが挙げられる。本発明の好ましい種としては、配列番号：２〜配列番号：５に示されるものが挙げられる。該アミノ酸略語は米国特許商標局によって３７Ｃ.Ｆ.Ｒ.§１.８２２（ｂ）（２）（１９９３）に示されるように受容されている。当業者はあるアミノ酸が転位さＪ.Ｐeptide Ｐrotein Ｒes. １４：４８５−９４（１９７９）およびそこに引用されている参考文献に記載されている通り、例えばＡsnはアスパラギン酸アミド（aspartimide）およびイソアスパラギンに転位されうる。これら転位誘導体は本発明の範囲に含まれる。特に断らない限りアミノ酸はＬ配置である。イイン・ツァンら（Ｎature ３７２：４２５−３２（１９９４年１２月）は、マウス肥満症（ｏｂ）マウス遺伝子のクローニングを報告しており、肥満症タンパク質のマウスＤＮＡ配列並びにマウスおよびヒトの肥満症タンパク質の天然アミノ酸配列を提示している。このタンパク質は、脂肪細胞によって分泌され体重を制御しているホルモンであると推測されている。ツァンらによっては薬理活性は示されていない。本発明は肥満症の有効な処置を提供する生物学的に活性なタンパク質を提供するものである。特許請求されたタンパク質の多くは、安定性、とりわけ酸安定性、および改善された吸収特性などのさらなる利点を付与する。特許請求されたタンパク質の調製は、通常、特許請求されたタンパク質をコードするＤＮＡを修飾し、ついで該ＤＮＡを組換え細胞培養中にて発現させることによる。既知の配列を有するＤＮＡ中の前以て決定した部位で置換変異を形成する技術は、たとえばＭ１３プライマー突然変異誘発のように、よく知られている。本発明の抗肥満症タンパク質をコードするＤＮＡ中に形成する変異は、該配列をリーディングフレーム外に置いてはならず、二次ｍＲＮＡ構造を生成しうる相補的な領域を形成しないのが好ましいであろう。ドゥボア（ＤeＢoer）ら、ＥＰ７５,４４４Ａ（１９８３）。本発明の化合物は、組換えＤＮＡ技術またはよく知られた化学合成法、たとえば、溶液または固相ペプチド合成、または常法の溶液法によりカップリングしたタンパク質断片から開始する溶液中での半合成により調製できる。Ａ．固相特許請求されているタンパク質の合成は固相ペプチド合成または組換え方法によって行う。ポリペプチドの固相化学合成の原理は当該技術分野においてよく知られており、デュガス（Ｄugas,Ｈ.）およびペニー（Ｐenny,Ｃ.）のバイオオーガニック・ケミストリー（Ｂioorganic Ｃhemistry）、スプリンガー−フェアラーク（Ｓpringer-Ｖerlag）、ニューヨーク、５４−９２頁（１９８１）などの当該領域の一般的なテキストに記載されている。たとえば、ペプチドの合成は、ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ（ＰＥ−Ａpplied Ｂiosystems）４３３Ａペプチド合成機（アプライド・バイオシステムズ、フォスター・シティー、カリフォルニアより市販されている）およびアプライド・バイオシステムズにより提供される合成サイクルを用いた固相法により行うことができる。Ｂocアミノ酸その他の試薬はＰＥ−アプライド・バイオシステムズその他の化学会社により市販されている。Ｃ−末端カルボキシアミドを製造するため、ダブルカップルプロトコール（double couple protocol）を用いた連続Ｂoc化学を出発物質のｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂に行う。Ｃ−末端酸の製造のため、対応するＰＡＭ樹脂を使用する。アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジンおよびメチオニンを、前以て形成したヒドロキシベンゾトリアゾールエステルを用いて結合させる。以下の側鎖保護が使用される：Ａrg、トシルＡsp、シクロヘキシルまたはベンジルＣys、４−メチルベンジルＧlu、シクロヘキシルＨis、ベンジルオキシメチルＬys、２−クロロベンジルオキシカルボニルＭet、スルホキシドＳer、ベンジルＴhr、ベンジルＴrp、ホルミルＴyr、４−ブロモカルボベンゾキシＢoc脱保護は、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で行う。Ｔrpからのホルミル脱保護は、ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンでペプチド樹脂を４℃で６０分間処理することにより行う。Ｍet（Ｏ）の還元は、ペプチド樹脂をＴＦＡ／ジメチルスルフィド／濃ＨＣｌ（９５／５／１）で２５℃で６０分間処理することにより行うことができる。上記の前処置に続いて、１０％ｍ−クレゾールまたはｍ−クレゾール／１０％ｐ−チオクレゾールまたはｍ−クレゾール／ｐ−チオクレゾール／ジメチルスルフィドの混合物を含む無水フッ化水素で該ペプチドをさらに脱保護および開裂できる。側鎖保護基およびペプチドの樹脂からの開裂は、０℃またはそれより低い温度、好ましくは−２０℃で３０分間、ついで０℃で３０分間行う。ＨＦを除去した後、ペプチド／樹脂をエーテルで洗浄する。ペプチドを氷酢酸にて抽出し、凍結乾燥させる。精製は、アセトニトリル濃度の上昇勾配を用いた０.１％ＴＦＡ中にて、逆相Ｃ１８クロマトグラフィー（ヴィダック（Ｖydac）カラムにより行う。当業者は、固相合成はまたＦＭＯＣ法およびＴＦＡスカベンジャー開裂混合物を用いても行うことができると認識する。Ｂ．組換え合成特許請求されているタンパク質はまた、組換え法を用いても製造できる。組換え法は高収率が望まれる場合に好ましい。タンパク質の組換え産生における基本的工程は以下が含まれる：（ａ）特許請求されているタンパク質をコードする合成または半合成（または天然資源からの単離）ＤＮＡの構築、（ｂ）コーディング配列を単独または融合タンパク質のいずれかの発現に適したやり方にて発現ベクターに組み込むこと、（ｃ）該発現ベクターで適当な真核生物または原核生物宿主細胞を形質転換すること、および（ｄ）組換えにより産生したタンパク質を回収および精製すること。２.ａ.遺伝子構築そのイン・ビトロまたはイン・ビボでの転写および翻訳がタンパク質の産生となるであろう合成遺伝子は、当該技術分野においてよく知られた技術によって構築できる。遺伝子コードの天然の縮重により、特許請求されたタンパク質をコードする相当量であるが限られた数のＤＮＡ配列を構築しうることを当業者は認識するであろう。本発明の好ましい実施態様においては、合成は組換えＤＮＡ技術により行う。合成遺伝子構築の方法は当該技術分野においてよく知られている。たとえば、ブラウン（Ｂrown）ら（１９７９）メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍetho ds in Enzymology）、アカデミック・プレス（Ａcademic Ｐress）、ニューヨーク、第６８巻、１０９−１５１頁を参照。特許請求されたタンパク質の合成遺伝子に対応するＤＮＡ配列は、アプライド・バイオシステムズ・モデル３８０Ａまたは３８０ＢＤＮＡ合成機（アプライド・バイオシステムズ、インク、８５０リンカーン・センター・ドライブ、フォスター・シティー、カリフォルニア９４４０４より市販）などの従来のＤＮＡ合成装置を用いて製造できる。幾つかの応用においては、例えば、融合タンパク質構築物からのシグナルペプチドの制御された切り出しを容易にすべくシグナルペプチドと構造タンパク質との間に都合のよいプロテアーゼ感受性開裂部位を組み込むために、特許請求されたタンパク質のコーディング配列を修飾するのが望ましい。特許請求されたタンパク質をコードする遺伝子はまた、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）を用いて製造できる。鋳型はｃＤＮＡライブラリー（クローンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）またはストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）から市販されており入手可能）またはヒト脂肪組織から単離されたｍＲＮＡであってよい。このような方法は、当該技術分野のマニアチス（Ｍaniatis）ら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaboratory Ｍanual）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory）、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９）においてよく知られている。２.ｂ.直接発現または融合タンパク質特許請求されたタンパク質は、直接発現するか、または特許請求されたタンパク質を含む融合タンパク質として発現した後に酵素的または化学的に開裂することによって製造されてよい。特定の部位でポリペプチドを開裂するかまたはペプチド鎖のアミノ末端もしくはカルボキシル末端からペプチドを消化する（たとえば、ジアミノペプチダーゼ）多様なペプチダーゼ（たとえば、トリプシン）が知られている。さらに、特定の化学物質（たとえば、臭化シアン）はポリペプチド鎖を特定の部位にて開裂するであろう。当業者は、部位特異的な内部開裂部位を組み込むためアミノ酸配列（および組換え法を使用する場合には合成または半合成コーディング配列）に修飾が必要であること認めるであろう。たとえば、カーター（Ｃarter Ｐ.）、サイト・スペシフィック・プロテオリシス・オブ・フュージョン・プロテインズ（Ｓite Ｓpecific Ｐroteolysis of Ｆusion Ｐrotein s）、第１３章、プロテイン・ピュアリフィケーション：フロム・モレキュラー・メカニズムズ・トゥー・ラージ・スケール・プロセスィズ（Ｐrotein Ｐurifi cation：Ｆrom Ｍolecular Ｍechanisms to Ｌarge Ｓcale Ｐrocesses）中、アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Ａmerican Ｃhemical Ｓoc.）、ワシントンＤ.Ｃ.、（１９９０）参照。２.ｃ.ベクター構築所望のコーディング配列および調節配列を含む適当なベクターの構築には標準ライゲーション技術を用いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡ断片を開裂し、つなぎ合わせ、ついで必要とするプラスミド形成するための望ましい形態にて再度ライゲーションする。所望のタンパク質の翻訳を行うため、適当な制限エンドヌクレアーゼの使用により適当な過剰の組換えＤＮＡ発現ベクターに遺伝子操作した合成ＤＮＡ配列を挿入する。特許請求されたタンパク質は比較的大きなタンパク質である。合成コーディング配列は、転写物のいずれかの末端に制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を有することによりこれら発現プラスミドおよび増幅発現プラスミドからの単離および該プラスミドへの組み込みを容易にするよう設計されている。該単離したｃＤＮＡコーディング配列は、合成リンカーを使用することにより、当該技術分野においてよく知られた技術により所望のクローニングベクター中に該配列を組み込むことを容易にすべく容易に修飾できる。使用した特定のエンドヌクレアーゼは、使用すべき親発現ベクターの制限エンドヌクレアーゼ開裂パターンによって規定されるであろう。制限部位の選択は、調節配列を有するコーディング配列が、特許請求されたタンパク質の適切なイン・フレームでの読み取りおよび発現を達成できるように適切な方向になるよう選択する。一般に、宿主細胞と調和する種由来のプロモーターおよび調節配列を含むプラスミドベクターをこれらの宿主とともに使用する。該ベクターは通常、複製部位並びに形質転換した細胞中での表現型選択を提供することができるマーカー配列を有する。たとえば、Ｅ.coli（大腸菌）は典型的に大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換する（ボリバー（Ｂolivar）ら、Ｇene ２：９５（１９７７））。プラスミドｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含み、従って形質転換した細胞を容易に同定する手段を提供する。該ｐＢＲ３２２プラスミドまたは他の微生物プラスミドはまた、組換えＤＮＡ技術において通常使用されるプロモーターその他の調節要素を含むかまたは含むように修飾されなければならない。所望のコーディング配列は、プロモーターおよびリボソーム結合部位から転写されるように発現ベクターに適切な方向にて挿入され、プロモーターおよびリボソーム結合部位の両者は、該タンパク質が発現される宿主細胞において機能的でなければならない。そのような発現ベクターの例は、ベラガージュ（Ｂelagaje ）らの米国特許第５,３０４,４９３号（その教示を参照のため本明細書に引用する）に記載されたプラスミドである。米国特許第５，３０４,４９３号に記載されたＡ−Ｃ−Ｂプロインシュリンをコードする遺伝子は、制限酵素ＮdeＩおよびＢam ＨＩによりプラスミドｐＲＢ１８２から除去することができる。本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、ＮdeＩ／ＢamＨＩ制限断片カセット上にて該プラスミド骨格に挿入することができる。２.ｄ.原核生物発現一般に、原核生物は、本発明において有用なベクターを構築するに際してＤＮＡ配列のクローニングに使用する。たとえば、大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ受託番号第３１４４６号）は特に有用である。使用できる他の微生物株には大腸菌Ｂおよび大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ受託番号第３１５３７号）が含まれる。これらの例は制限するものではなく例示にすぎない。原核生物はまた発現にも使用する。上記株ならびに大腸菌Ｗ３１１０（原栄養株、ＡＴＣＣ受託番号第２７３２５号）、バシラス・サチリス（Ｂacills subti lis）などの桿菌、およびサルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimur ium）またはセラチア・マルセスセンス（Ｓeratia marcescans）などの他の腸内細菌、および種々のシュードモナス種が使用できる。原核生物宿主に使用するのに適したプロモーターには、β−ガラクトシダーゼ（ベクターｐＧＸ２９０７［ＡＴＣＣ受託番号第３９３４４号］はレプリコンおよびβ−ラクタマーゼ遺伝子を含む）およびラクトースプロモーター系（チャン（Ｃhang）ら、Ｎature、２７５：６１５（１９７８）；およびゲッデル（Ｇoeddel）ら、Ｎature ２８１：５４４（１９７９））、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（ベクターｐＡＴＨ１［ＡＴＣＣ受託番号第３７６９５号］はｔｒｐプロモーターの制御下でtrpＥ融合タンパク質としてオープン・リーディング・フレームの発現を容易にすべく設計されている）およびtacプロモーター（プラスミドｐＤＲ５４０ＡＴＣＣ受託番号第３７２８２号から単離）などのハイブリッドプロモーターが含まれる。しかしながら、ヌクレオチド配列が一般に知られている他の機能性の細菌プロモーターは、当業者が必要な制限部位を提供するためにリンカーまたはアダプターを用いてタンパク質をコードするＤＮＡに該プロモーターをライゲーションすることを可能にする。細菌系において使用するプロモーターはまた、タンパク質をコードするＤＮＡに作動可能に連結したシャイン−ダルガノ配列をも含むであろう。２.ｅ.真核生物発現該タンパク質は真核生物発現系において組換えにより産生されてよい。哺乳動物宿主細胞中での転写を制御する好ましいプロモーターは、多様な採取源、たとえば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスのゲノムから、または異種哺乳動物プロモーター、たとえばβ−アクチンプロモーターから得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターはＳＶ４０制限断片として都合よく得られ、該断片はまたＳＶ４０ウイルスの複製起点をも含む。フィアーズ（Ｆiers）ら、Ｎature、２７３：１１３（１９７８）。ＳＶ４０全ゲノムはプラスミドｐＢＲＳＶ、ＡＴＣＣ受託番号第４５０１９号から得られる。ヒトサイトメガロウイルスの即時初期プロモーターはプラスミドｐＣＭＢβ（ＡＴＣＣ受託番号第７７１７７号）から得られる。勿論、宿主細胞または関連種からのプロモーターもまた本発明において有用である。特許請求されているタンパク質をコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加する。エンハンサーはＤＮＡのシス−作用性要素であり、通常約１０−３００ｂｐであり、プロモーターに作用してその転写を増大させる。エンハンサーは方向および位置に対して比較的に独立であり、転写ユニットの５'側（レイミンズ（Ｌaimins，Ｌ.）ら、ＰＮＡＳ７８：９９３（１９８１））および３'側（ラスキー（Ｌusky，Ｍ. Ｌ.）ら、Ｍol.Ｃell Ｂio. ３：１１０８（１９８３））、イントロン内（バネルジ（Ｂanerji，Ｊ.Ｌ.）ら、Ｃell ３３：７２９（１９８３））並びにコーディング配列自体内（オズボーン（Ｏsborne，Ｔ.Ｆ.）ら、Ｍol.Ｃell Ｂio. ４：１２９３（１９８４））において認められている。現在、多くのエンハンサー配列が哺乳動物遺伝子（グロビン、ＲＳＶ）ＳＶ４０、ＥＭＣ、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン）から知られている。しかしながら、典型的には、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーが使用されるであろう。例としては、ＳＶ４０後期エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたはその他の多細胞生物からの有核細胞）中で使用される発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼす転写の終結に必要な配列を含むであろう。これらの領域は、ｍＲＮＡコーディングタンパク質の非翻訳部位におけるポリアデニル化セグメントとして転写される。３'非翻訳領域はまた、転写終結部位をも含む。発現ベクターはまた選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含んでいてよい。哺乳動物細胞の適当な選択マーカーの例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ、ｐＪＯＤ−１０［ＡＴＣＣ受託番号第６８８１５号］のＢglII／ＨindIII 制限断片に由来するものであってよい）、チミジンキナーゼ（単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼはｖＰ−５クローン［ＡＴＣＣ受託番号第２０２８号］のＢamＨＩ断片に含まれる）またはネオマイシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子（ｐＮＮ４１４酵母人工染色体ベクター［ＡＴＣＣ受託番号第３７６８２号］から得ることができる）である。そのような選択マーカーがうまく哺乳動物宿主細胞中に移されると、トランスフェクションされた哺乳動物宿主細胞は選択圧の下に置かれたときに生存可能である。選択法（selective regimes）として広く使用されている２つの異なるカテゴリーが存在する。第一のカテゴリーは細胞の代謝に基づくものであり、補足された培地なしでは増殖することができない突然変異株の使用に基づく。２つの例は：ＣＨＯＤＨＦＲ^-細胞（ＡＴＣＣ受託番号第ＣＲＬ −９０９６号）およびマウスＬＴＫ^-細胞（Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）ＡＴＣＣＣＣＬ− ２.３）である。これらの細胞は、チミジンやヒポキサンチンなどの栄養素の添加なしには増殖することができない。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経路に必要なある種の遺伝子を欠如しているため、該細胞は欠失したヌクレオチドが補足培地中で提供されない限り生存できない。培地を補足することの代替法は、完全なＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子をそれぞれの遺伝子を欠如している細胞に導入し、それによって、該細胞の増殖条件を変えることである。ＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は補足されていない培地中では生存できないであろう。第２のカテゴリーは優性選択であり、これはいずれの細胞タイプにもおいて使用される選択機構をいい、突然変異株の使用を必要としない。これらの機構では典型的に宿主細胞の増殖を阻止する薬剤を使用する。新規な遺伝子を有する細胞は薬剤耐性を伝達するタンパク質を発現し、その選択を生き残るであろう。そのような優性選択の例では、薬剤のネオマイシン、サザン（Ｓouthern Ｐ.）およびバーグ（Ｂerg，Ｐ.）、Ｊ.Ｍolec.Ａppl.Ｇenet. １：３２７（１９８２）、ミコフェノール酸、ミュリガン（Ｍulligan，Ｒ.Ｃ.）およびバーグ、Ｓcience ２０９：１４２２（１９８０）、またはハイグロマイシン、サグデン（Ｓugden, Ｂ.）ら、Ｍol.Ｃell Ｂiol. ５：４１０−４１３（１９８５）を使用する。上記に掲げた３つの例では、それぞれ適当な薬剤、Ｇ４１８またはネオマイシン（ジェネチシン）、xgpt（ミコフェノール酸）またはハイグロマイシンに対する耐性を付与すべく真核生物の制御の下に細菌遺伝子を使用する。真核生物の発現の好ましいベクターはｐＲｃ／ＣＭＶである。ｐＲｃ／ＣＭＶはインビトロジェン・コーポレーション（Ｉnvitrogen Ｃorporation）、３９８５ソレント・バレイ・ブールバード、サンディエゴ、カリフォルニア９２１２１から市販されている。構築したプラスミド中の配列が正確か確認するため、ライゲーション混合物を用いて大腸菌Ｋ１２株ＤＨ５ａ（ＡＴＣＣ受託番号第３１４４６号）を形質転換し、ついで首尾よい形質転換体を抗生物質耐性により適切に選択する。形質転換体からのプラスミドを、メッシング（Ｍessing）らの方法（Ｎucleic Ａcids Ｒes. ９：３０９（１９８１））によって制限および／または配列により調製、分析する。宿主細胞を本発明の発現ベクターで形質転換し、ついでプロモーターの誘導、形質転換体の選択、または遺伝子の増幅のために適切であるように修飾した通常の栄養培地において培養する。その培養条件（温度、ｐＨなど）は、発現について選択した宿主細胞で以前に使用したものであり、当業者には明らかであろう。上記ベクターで細胞を形質転換する技術は当該技術分野においてよく知られており、マニアチスら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９）またはカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃurre nt Ｐrotocols in Ｍolecular Ｂiology ）（１９８９）および補遺などの概説参照文献に記載されている。高等真核生物における特許請求されたタンパク質をコードするベクターを発現するのに適した宿主として好ましいものは以下のものである：ＳＶ４０により形質転換されたアフリカミドリザル腎細胞株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ−１６５１）；形質転換したヒト初代胎児（human primary embryonal）腎細胞株２９３（グラハム（Ｇraham，Ｆ.Ｌ.）ら、Ｊ.Ｇen Ｖirol. ３６：５９−７２（１９７７）、Ｖirology ７７：３１９−３２９、Ｖirology ８６：１０−２１）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）、ＡＴＣＣＣＣＬ−１０、Ｖirology １６：１４７（１９６２））；チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ−ＤＨＦＲ^-（ＡＴＣＣＣＲＬ−９０９６）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、ＡＴＣＣＣＲＬ−１７１５、Ｂiol.Ｒeprod. ２３：２４３−２５０（１９８０））；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト頸部上皮癌腫細胞（ＨeＬa、ＡＴＣＣＣＣＬ−２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫＡＴＣＣＣＣＬ−３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ−１４４２）；ヒト２倍体肺細胞（ＷＩ−３８、ＡＴＣＣＣＣＬ−７５）；ヒト肝細胞癌腫細胞（Ｈep Ｇ２、ＡＴＣＣＨＢ−８０６５）；およびマウス乳腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）。２.ｆ.酵母発現原核生物に加えて、酵母培養体などの真核微生物も使用されてよい。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓaccharomyces serevisie）、すなわち通常のパン酵母が最もよく使用される真核微生物であるが、他の多くの株が一般に利用できる。サッカロミセス中での発現には、たとえば、プラスミドＹＲｐ７（ＡＴＣＣ−４００５３、スティンチコーム（Ｓtinchcomb）ら、Ｎature ２８２：３９（１９７９）；キングスマン（Ｋingsman）ら、Ｇene ７：１４１（１９７９）；チェンパー（Ｔschemper）ら、Ｇene １０：１５７（１９８０））が一般に使用される。このプラスミドは既にｔｒｐ遺伝子を含有しており、トリプトファン中で増殖する能力を欠如した酵母の突然変異体株、たとえば、ＡＴＣＣ受託番号第４４０７６号またはＰＥＰ４−１（ジョーンズ（Ｊones）、Ｇenetics ８５：１２（１９７７））のために選択マーカーを提供する。酵母宿主で使用するのに適したプロモーティング配列には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（プラスミドｐＡＰ１２ＢＤＡＴＣＣ受託番号５３２３１号において見いだされ、１９９０年６月１９日に発行された米国特許第４,９３５,３５０号に記載されている）または他の解糖系酵素、たとえば、エノラーゼ（プラスミドｐＡＣ１ＡＴＣＣ受託番号第３９５３２号において見いだされる）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（プラスミドｐＨｃＧＡＰＣ１ＡＴＣＣ受託番号第５７０９０号、５７０９１号に由来）、ザイモモナス・モビリス（zymomonas mobilis）（１９９１年３月１９日に発行された米国特許第５, ０００,０００号）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのプロモーターが含まれる。他の酵母プロモーターは、増殖条件によって制御される転写のさらに別の利点を有する誘導性プロモーターであるが、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン（プラスミドベクターｐＣＬ２８ＸhoＬＨＢＰＶＡＴＣＣ受託番号第３９４７５号、米国特許第４,８４０,８９６号に含まれる）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース（プラスミドｐＲＹ１２１ＡＴＣＣ受託番号第３７６５８号上に見いだされるＧＡＬ１）の利用に関与する酵素のプロモーター領域である。酵母発現において使用するのに適したベクターおよびプロモーターはさらに、ヒッツェマン（Ｒ.Ｈitzeman）らのヨーロッパ特許公開第７３,６５７Ａ号にさらに記載されている。サッカロミセス・セレビシエ由来のＵＡＳＧalなどの酵母のエンハンサー（プラスミドＹＥpsec--hI1β ＡＴＣＣ受託番号第６７０２４号上のＣＹＣ１プロモーターとともに見い出される）もまた、酵母プロモーターと共に都合よく使用される。下記実施例を、特許請求されるタンパク質の調製をさらに説明するために提供する。本発明の範囲は、下記実施例からのみなるものと解釈されるべきではない。実施例１下記タンパク質配列：Ｍet Ａrg−配列番号：１をコードするＤＮＡ配列を、標準ＰＣＲ法を用いて得る。フォアウォードプライマーを用い、ヒト脂肪細胞ライブラリー（クローンテックから市販）から配列を増幅させる。このＰＣＲ産物をＰＣＲ−Ｓcript（ストラタジーンから入手可能）中にクローニングし、配列決定する。実施例２ベクターの構築特許請求された所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドを、ＮdeＩおよびＢamＨＩ制限部位を含むように構築する。このクローニングしたＰＣＲ産物を含むプラスミドをＮdeＩおよびＢamＨＩ制限酵素で消化する。小さな〜４５０ｂｐ断片をゲル精製し、Ａ−Ｃ−Ｂプロインシュリンのコーディング配列を欠失させたベクターｐＲＢ１８２中にライゲートする。このライゲート産物を大腸菌ＤＨ１０Ｂ（ギブコ−ＢＲＬから市販）中に形質転換し、１０μ ｇ／ｍＬのテトラサイクリンを添加したトリプトン−酵母（ジフコ（ＤＩＦＣＯ））プレート上で増殖するコロニーを分析する。プラスミドＤＮＡを単離し、Ｎ de ＩおよびＢamＨＩで消化し、得られた断片をアガロースゲル電気泳動により分離する。期待される〜４５０ｂｐのＮdeＩ−ＢamＨＩ断片を含むプラスミドを保持する。タンパク質産生のための培養に適したこの第二のプラスミド発現で大腸菌ＢＢＬ２１（ＤＥ３）（ノボジェン（ＮＯＶＯＧＥＮ）から市販）を形質転換する。上記ベクターで細胞を形質転換する技術は当該技術分野でよく知られており、マニアチスら（１９８８）モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨークまたはカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（１９８９）および補遺などの概説参照文献に記載されている。本明細書中に例示するような本発明の好ましい実施態様において使用する大腸菌細胞の形質転換に関与する技術は、当該技術分野においてよく知られている。形質転換した大腸菌細胞を培養する正確な条件は、使用した大腸菌細胞株および発現ベクターまたはクローニングベクターの性質に依存する。たとえば、ｃ１８５７の熱誘導性λ−ファージプロモーター−オペレーター領域などの熱誘導性プロモーター−オペレーター領域を組み込んだベクターは、タンパク質合成を誘導するのに培養条件において約３０℃から約４０℃への温度シフトが必要である。実施例３式：のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、化学的に合成した一本鎖のオリゴヌクレオチドから組み立て、二本鎖ＤＮＡ配列を生成した。このＤＮＡ配列を組み立てるのに使用したオリゴヌクレオチドは、下記の通りである。オリゴヌクレオチド９〜１３は、ＮdeＩ部位からコーディング配列内の２２０位にあるＸbaＩ部位にまたがる約２２０塩基対のセグメントを生成するのに用いた。オリゴヌクレオチド１４〜２２は、ＸbaＩ部位からＢamＨＩ部位にまたがる約２４０塩基対のセグメントを生成するのに用いた。これら２２０塩基対断片および２４０塩基対断片を組み立てるため、各オリゴヌクレオチドを等モル量、通常は１μｌ当たり約１〜２ピコモルの濃度にて混合した。組み立て前にセグメントの５”末端のオリゴヌクレオチド以外はすべて、試薬の供給者によって特定された条件を用い、Ｔ４ＤＮＡキナーゼを用いた標準キナーゼ緩衝液中でリン酸化した。これら混合物を９５℃に加熱し、１〜２時間かけてゆっくりと室温に冷却してオリゴヌクレオチドの適切なアニーリングを確実にした。ついで、オリゴヌクレオチドを互いにライゲートし、クローニングベクター中にライゲートした。ＰＵＣ１９を用いたが、他のベクターもＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて行うことができる。ＰＵＣ１９緩衝液および条件は、該酵素の供給者によって推奨されたものである。使用前に、２２０塩基対断片のベクターはＮdeＩおよびＸbaＩで消化し、一方、２４０塩基対断片のベクターはＸbaＩおよびＢamＨＩで消化した。これらライゲーション混合物を用いて大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞（ギブコ／ＢＲＬから市販）を形質転換し、形質転換した細胞を１００μ ｇ／ｍｌのアンピシリン、ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含むトリプトン−酵母（ＴＹ）プレート上にプレーティングした。一夜増殖したコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体ＴＹ培地中で増殖させ、プラスミド単離およびＤＮＡ配列分析に用いる。完全な遺伝子を組み立てるため、正しい配列を有するプラスミドを保持した。このことは、２２０塩基対断片および２４０塩基対断片のゲル精製、およびＮdeＩおよびＢamＨＩで線状にしたＰＵＣ１９中へのこれら２つの断片のライゲーションにより行った。ライゲーション混合物を大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞中に形質転換し、上記と同様にしてプレーティングした。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、ＮdeＩおよびＢamＨＩで消化した。大きいベクター断片をゲル精製し、下記６つの化学的に合成したオリゴヌクレオチドから上記のようにして前以て組み立てた約１９５塩基対のセグメントとライゲートした。ライゲーション物を上記と同様にして大腸菌に形質転換した。得られた形質転換体からＤＮＡを単離し、ＤＮＡ配列分析機により配列を確認した。正しい配列を有するプラスミドをＮdeＩおよびＢamＨＩで消化し、約４５０塩基対の挿入物を発現ベクター中に再クローニングした。タンパク質を大腸菌中で発現させ、単離し、ＰＢＳ中に希釈するかまたは８Ｍ尿素（ともに５ｍＭシステインを含有する）中に希釈することにより折り畳ませ、ＰＢＳに対して充分に透析した。サイズ排除クロマトグラフィーによりタンパク質を最後に精製した後、タンパク質をＰＢＳ中に３〜３.５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。アミノ酸組成を確認した。実施例４ＭetＡrgリーダー配列を有する配列番号：２のタンパク質を大腸菌中で発現させた。５ｍＭシステインを含有する８Ｍ尿素中に顆粒を可溶化した。タンパク質を陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、８Ｍ尿素（５ｍＭシステインを含有）中に希釈することにより折り畳ませ、上記実施例と同様の技術によりＰＢＳに対して充分に透析した。タンパク質１ｍｇ当たり６〜１０ミリ単位のｄＤＡＰを加えることによりＭetＡrgリーダー配列を開裂した。変換反応を室温で２〜８時間進行させた。反応の進行を高性能逆相クロマトグラフィーによりモニターした。ＮａＯＨでｐＨを８に調節することにより反応を停止させた。ｄｅｓ（ＭetＡrg）タンパク質を７〜８Ｍ尿素の存在下、陽イオン交換によりさらに精製し、ＰＢＳ中に透析した。サイズ排除クロマトグラフィーによりタンパク質を最後に精製した後、タンパク質をＰＢＳ中に３〜３.５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。本発明の好ましい態様においては大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８細胞を宿主細胞として用いるが、他の多くの細胞株も利用でき、たとえば、これらに限られるものではないが、大腸菌Ｋ１２Ｌ２０１、Ｌ６８７、Ｌ６９３、Ｌ５０７、Ｌ６４０、Ｌ６４１、Ｌ６９５、Ｌ８１４（大腸菌Ｂ）が挙げられる。ついで、形質転換した宿主細胞を、発現プラスミド上に存在する耐性遺伝子に応じて抗生物質の選択圧の下、適当な培地上にプレーティングする。ついで、使用した宿主細胞株に適した時間および温度にて培養物をインキュベートする。高レベル細菌発現系で発現されたタンパク質は、高レベルの発現タンパク質を含有する顆粒または封入体として特徴的に凝集する。クロイガー（Ｋreuger）ら、プロテイン・フォールディング（Ｐrotein Ｆolding）、ギーラッシュ（Ｇier asch）およびキング（Ｋing）編、１３６〜１４２頁（１９９０）、アメリカン・アソシエーション・フォア・ザ・アドバンスメント・オブ・サイエンス・パブリケーションＮo.８９−１８Ｓ、ワシントン、Ｄ.Ｃ.。かかるタンパク質凝集物は、所望のタンパク質産物をさらに精製および単離するために可溶化しなければならない。上掲文献。タンパク質を可溶化するため、グアニジウム−ＨＣｌなどの強変性溶液および／またはジチオトレイトール（ＤＴＴ）などの弱変性溶液を用いた種々の技術が用いられている。溶液中の変性剤を徐々に（しばしば透析により）除去することにより、変性タンパク質が天然のコンホメーションを回復することが可能になる。変性および折り畳みの特定の条件は、特定のタンパク質発現系および／または当該タンパク質により決定される。好ましくは本発明のタンパク質は、カテプシンＣにより特許請求されたタンパク質に容易に変換されるようにＭet−Ａrg−配列番号：１として発現させる。タンパク質の精製は当該技術分野で知られた技術により行い、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびサイズ排除が含まれる。重要なことに、リーダー配列が結合したタンパク質は活性であることがわかった。従って、本発明は、Ｍet−Ｒ₁リーダー配列（ここで、Ｒ₁はＰro以外の天然アミノ酸であり、好ましくはＲ₁はＡrg、Ａsp、またはＴyrであり、最も好ましくはアルギニンである）を有する式Ｉのタンパク質を提供する。特許請求されたタンパク質は２つのシステイン残基を含む。それゆえ、タンパク質を安定化するためにジスルフィド結合が形成されるかもしれない。本発明は、配列番号：１の９６位のＣysが配列番号：１の１４６位のＣysに架橋したタンパク質、並びにかかるジスルフィド結合を形成していないタンパク質を包含する。さらに本発明のタンパク質は、とりわけ製剤化したときに、二量体、三量体、四量体その他の多量体として存在する。かかる多量体も本発明の範囲に包含される。本発明は肥満症の処置方法を提供する。該方法は、抗肥満症タンパク質の有効量を約１〜１０００μｇ／ｋｇの投与量にて生物体に投与することを含む。好ましい投与量は約１０〜１００μｇ／ｋｇの活性化合物である。ヒト成人に対する典型的な１日当たりの投与量は、約０.５〜１００ｍｇである。該方法を実施するに際しては、式（Ｉ）の化合物を単一の１日投与量または１日当たり複数の投与量にて投与することができる。処置計画は長期にわたる投与を必要とするかもしれない。１回の投与当たりの投与量または総投与量は担当医によって決定され、疾患の性質および重篤度、患者の年齢および一般的健康状態および該化合物に対する患者の耐性などの因子に依存するであろう。本発明はさらに式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物を提供する。好ましくは製薬学的に許容しうる塩の形態のタンパク質を、肥満症の処置もしくは予防処置のための非経口投与用に調合することができる。たとえば、式（Ｉ）の化合物を通常の製薬学的担体および賦形剤と混合することができる。特許請求される化合物を含む組成物は、好ましくは可溶性の形態にて、約０.１〜９０重量％、さらに一般的には約１０〜３０重量％の活性タンパク質を含有する。さらに、本発明のタンパク質は、単独で、または他の抗肥満症剤または糖尿病を処置するのに有用な薬剤と組み合わせて投与することができる。静脈内（ＩＶ）で使用するには、該タンパク質を通常使用される静脈液中にて投与し、注入により投与する。かかる液としては、たとえば、生理食塩水、リンゲル液または５％デキストロース溶液を用いることができる。筋肉内注射製剤のためには、滅菌組成物、好ましくは式（Ｉ）のタンパク質の適当な可溶性の塩の形態、たとえば塩酸塩を、発熱物質不含の水（蒸留）、生理食塩水または５％グルコース溶液などの製薬学的担体中にて溶解および投与することができる。適当な不溶性の形態の該化合物は、水性基剤または製薬学的に許容しうる油基剤、たとえばオレイン酸エチルなどの長鎖脂肪酸のエステル中の懸濁液として調製および投与することができる。本発明の化合物が肥満症を処置する能力は、下記のようにイン・ビボで示される。抗肥満症タンパク質の生物学的試験パラビオーゼ実験は、タンパク質が末梢脂肪組織から放出されること、および該タンパク質が正常並びに肥満症マウスにおいて体重増加を制御しうることを示唆している。それゆえ、最も密接に関連した生物学的試験は、被験物質を幾つかの投与経路（たとえば、静脈内、皮下、腹腔内、またはミニポンプもしくはカニューレにより）にて注射し、ついで食物および飲料の摂取、体重増加、血漿の化学またはホルモン（グルコース、インシュリン、ＡＣＴＨ、コルチコステロン、ＧＨ、Ｔ４）を種々の時間経過でモニターすることである。適当な被験動物には、正常マウス（ＩＣＲ、など）および肥満症マウス（ｏｂ／ｏｂ、Ａｖｙ／ａ、ＫＫ−Ａｙ、ｔｕｂｂｙ、ｆａｔ）が含まれる。肥満症および糖尿病のｏｂ／ｏｂマウスモデルは肥満症状態を示すものとして当該技術分野において一般に受け入れられている。これら注射の非特異的な作用のための対照は、同じパラメータをモニターする同じ動物において活性成分を含有するかまたは含有しない同様の組成中のビヒクルを用い、または受容体を欠くと思われる動物（ｄｂ／ｄｂマウス、ｆａ／ｆａまたはｃｐ／ｃｐラット）において活性剤自体を用いて行う。これらモデルにおいて活性を示すタンパク質は、他の哺乳動物、とりわけヒトにおいても同様の活性を示すであろう。標的組織は食物摂取および脂質生成状態を制御する視床下部にあると思われるので、被験物質を脳内へ直接（たとえば、側脳室または第三脳室を介したｉ.ｃ. ｖ.注射）、または特定の視床下部核（たとえば、弓状核、室傍核、円蓋周囲核（perifornical nuclei））中へ直接注射することも同様のモデルである。上記と同じパラメータを測定するか、または食物摂取または代謝を制御することが知られている神経伝達物質の放出（たとえば、ＮＰＹ、ガラニン、ノルエピネフリン、ドーパミン、β−エンドルフィン放出）をモニターすることができる。同様の研究をイン・ビトロで灌流または組織浴系（tissue bath system）中の単離視床下部組織を用いて行う。この場合は神経伝達物質の放出または電気生理学的変化をモニターする。本発明の化合物は上記生物学的試験の少なくとも一つにおいて活性であり、抗肥満症剤である。かかるものとして、本発明の化合物は肥満症および肥満症に関連する障害を処置するのに有用である。表１に掲げた代表的タンパク質を本明細書に示した教示および実施例に従って調製した。表１に示したタンパク質の記載は、配列番号：２９において記載中のアミノ酸を式（Ｉ）におけるように置換したタンパク質を示す。たとえば、Ａsp２２は配列番号：２９において２２位のＡ snがＡspで置換されたタンパク質を示す。ＭetＡrg−の記載は、ＭetＡrgリーダー配列を結合させてタンパク質を調製および試験したことを示す。表１のタンパク質のアミノ酸配列は、質量分析および／またはアミノ酸分析により確認した。本発明のタンパク質は処置剤として有用なだけではない。当業者であれば、本発明のタンパク質が診断に使用するための抗体の産生においても有用であり、タンパク質としては動物の食物添加物として有用であることが認識されるであろう。さらに、本発明の化合物は哺乳動物において美容目的のために体重を制御するのにも有用である。美容目的は、体の外観をよくするために哺乳動物の体重を制御することを追求するものである。哺乳動物は必ずしも肥満症である必要はない。かかる美容目的の使用も本発明の一部を構成する。本発明の原理、好ましい態様および実施態様を上記明細書において記載した。しかしながら、本明細書において保護しようとする発明は開示した特定の態様に限られるものではない。なぜなら、これら開示は限定ではなく例示とみなされるからである。本発明の範囲から逸脱することなく、当業者は変更および改変をなすことができるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ヒース，ウィリアム・エフ・ジュニアアメリカ合衆国46038インディアナ州フィッシャーズ、タフトン・ストリート 11214番 (72)発明者ショーナー，ブリジット・イーアメリカ合衆国46157インディアナ州モンロビア、ボックス30エフ、ルーラル・ルート２番

Claims

【特許請求の範囲】１．式（Ｉ）：ここで、４位のＸaaはＧlnまたはＧlu；７位のＸaaはＧlnまたはＧlu；２２位のＸaaはＧln、ＡsnまたはＡsp；２７位のＸaaはＴhrまたはＡla；２８位のＸaaはＧln、Ｇluまたは不在；３４位のＸaaはＧlnまたはＧlu；５４位のＸaaはＭet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖal、ＡlaまたはＧly；５６位のＸaaはＧlnまたはＧlu；６２位のＸaaはＧlnまたはＧlu；６３位のＸaaはＧlnまたはＧlu；６８位のＸaaはＭet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖal、ＡlaまたはＧly；７２位のＸaaはＧln、ＡsnまたはＡsp；７５位のＸaaはＧlnまたはＧlu；７８位のＸaaはＧln、ＡsnまたはＡsp；８２位のＸaaはＧln、ＡsnまたはＡsp；１００位のＸaaはＧlu、Ｔrp、Ｐhe、Ｉle、ＶalまたはＬeu；１０８位のＸaaはＡspまたはＧlu；１３０位のＸaaはＧlnまたはＧlu；１３４位のＸaaはＧlnまたはＧlu；１３６位のＸaaはＭet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖal、ＡlaまたはＧly；１３８位のＸaaはＧln、Ｔrp、Ｔyr、Ｐhe、Ｉle、ＶalまたはＬeu；１３９位のＸaaはＧlnまたはＧlu で示されるタンパク質、または製薬学的に許容しうるその塩；ただし、４位のＸaaがＧln；７位のＸaaがＧln；２２位のＸaaがＡsn；２７位のＸaaがＴhr；２８位のＸaaがＧlnまたは不在；３４位のＸaaがＧln；５４位のＸaaがＭet；５６位のＸaaがＧln；６２位のＸaaがＧln；６３位のＸaaがＧln；６８位のＸaaがＭet；７２位のＸaaがＡsn；７５位のＸaaがＧln；７８位のＸaaがＡsn；８２位のＸaaがＡsn；１００位のＸaaがＴrp；１０８位のＸaaがＡsp；１３０位のＸaaがＧln；１３４位のＸaaがＧln；１３６位のＸaaがＭet；１３８位のＸaaがＴrp；かつ１３９位のＸaaがＧln である化合物は除く。２．式（Ｉａ）：ここで、４位のＸaaはＧlnまたはＧlu；７位のＸaaはＧlnまたはＧlu；２２位のＸaaはＧln、ＡsnまたはＡsp；２７位のＸaaはＴhrまたはＡla；２８位のＸaaはＧln、Ｇluまたは不在；３４位のＸaaはＧlnまたはＧlu；５４位のＸaaはＭet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖal、ＡlaまたはＧly；５６位のＸaaはＧlnまたはＧlu；６２位のＸaaはＧlnまたはＧlu；６３位のＸaaはＧlnまたはＧlu；６８位のＸaaはＭet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖal、ＡlaまたはＧly；７２位のＸaaはＧln、ＡsnまたはＡsp；７５位のＸaaはＧlnまたはＧlu；７８位のＸaaはＧln、ＡsnまたはＡsp；８２位のＸaaはＧln、ＡsnまたはＡsp；１０８位のＸaaはＡspまたはＧlu；１３０位のＸaaはＧlnまたはＧlu；１３４位のＸaaはＧlnまたはＧlu；１３６位のＸaaはＭet、メチオニンスルホキシド、Ｌeu、Ｉle、Ｖal、ＡlaまたはＧly；１３９位のＸaaはＧlnまたはＧlu で示されるタンパク質、または製薬学的に許容しうるその塩；ただし、４位のＸaaがＧln；７位のＸaaがＧln；２２位のＸaaがＡsn；２７位のＸaaがＴhr；２８位のＸaaがＧln；３４位のＸaaがＧln；５４位のＸaaがＭet；５６位のＸaaがＧln；６２位のＸaaがＧln；６３位のＸaaがＧln；６８位のＸaaがＭet；７２位のＸaaがＡsn；７５位のＸaaがＧln；７８位のＸaaがＡsn；８２位のＸaaがＡsn；１０８位のＸaaがＡsp；１３０位のＸaaがＧln；１３４位のＸaaがＧln；１３６位のＸaaがＭet；かつ１３９位のＸaaがＧln である化合物は除く。３．式：ここで、９６位のＣysは１４６位のＣysとジスルフィド結合しているで示される、請求項２に記載のタンパク質または製薬学的に許容しうるその塩。４．式：Ｍet−Ｒ₁−（ここで、Ｒ₁はＰro以外の天然アミノ酸である）で示されるリーダー配列をさらに含む、請求項１、２または３に記載のタンパク質。５．Ｒ₁がＡrgである請求項４に記載のタンパク質。６．１またはそれ以上の製薬学的に許容しうる希釈剤、担体または賦形剤とともに請求項１、２または３に記載のタンパク質を含む医薬組成物。７．（ａ）請求項１、２または３に記載のタンパク質をコードするＤＮＡで宿主細胞を形質転換し、その際、該タンパク質はリーダー配列を任意に有し、（ｂ）該宿主細胞を培養し、工程（ａ）においてコードされたタンパク質を単離し、ついで任意に（ｃ）該リーダー配列を酵素的に開裂して請求項１、２または３に記載のタンパク質を生成することを含む、請求項１、２または３に記載のタンパク質の製造方法。８．該リーダー配列がＭet−Ｒ₁−（ここで、Ｒ₁はＰro以外の天然アミノ酸である）である、請求項７に記載の方法。９．該リーダー配列がＭet−Ａrg−である、請求項８に記載の方法。１０．肥満症の処置に使用するための請求項１、２または３に記載のタンパク質。１１．請求項１または２に記載のタンパク質を肥満症の処置を必要とする哺乳動物に投与することを含む、肥満症の処置方法。