ES2339846T3 - Metodo para aumentar la masa de tejido magro usando composiciones de proteina ob. - Google Patents
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Abstract
Una proteína de fusión que comprende una proteína Fc fusionada al N terminal de una proteína OB.
Description
Método para aumentar la masa de tejido magro
usando composiciones de proteínas OB.
La presente invención se refiere a proteínas de
fusión que comprenden una proteína Fc fusionada al N terminal de
una proteína OB.
Aunque la base molecular de la obesidad es
ampliamente desconocida, la identificación del "gen OB" y la
proteína codificada ("proteína OB") ha arrojado alguna luz
sobre los mecanismos que el cuerpo usa para regular el depósito de
la grasa corporal. Zhang et al., Nature 372:
425-432 (1994); véase también, the Correction en
Nature 374: 479 (1995). La proteína OB es activa in vivo en
ratones ob-mutantes ob (ratones obesos debido a un
defecto en la producción del producto del gen OB) así como en
ratones de tipo salvaje normales. La actividad biológica se
manifiesta por sí misma, entre otras cosas, en la pérdida de peso.
Véase de forma general Barinaga, "Obese" Protein Slims Mice,
Science 269: 475-476 (1995).
Los otros efectos biológicos de la proteína OB
no están bien caracterizados. Es conocido, por ejemplo, que en
ratones ob/mutantes ob, la administración de proteína OB da lugar a
una disminución de los niveles de insulina en suero y los niveles
de glucosa en suero. Es conocido también que la administración de
proteína OB da lugar a una disminución de la grasa corporal. Esto
se observó en ratones ob/mutantes ob, así como en ratones normales
no obesos. Pelleymounter et al., Science 269:
540-543 (1995); Halaas et al., Science 269:
543-546 (1995). Véase también, Campfield et
al., Science 269: 546-549 (1995). (La
administración periférica y central de dosis de microgramos de
proteína OB redujo la ingestión de alimentos y el peso corporal de
ratones obesos ob/ob e inducidos por la dieta, pero no en ratones
obesos db/db. En ninguno de estos informes se observaron
toxicidades, incluso a las dosis más
elevadas.
elevadas.
La dilucidación de otros efectos biológicos de
la proteína OB, particularmente sobre animales que pueden no sacar
provecho o pueden no necesitar una reducción de peso, proporcionará
usos adicionales para la proteína OB.
Uno de estos usos, proporcionado por la presente
invención, es el aumento de la masa de tejido magro.
Naturalmente, la modulación de la dieta y el
ejercicio es una forma de aumentar el tamaño muscular. Hay también
composiciones usadas para aumentar la masa magra. Las composiciones
actuales que se cree que aumentan la masa de tejido magro incluyen
esteroides anabolizantes, como testosterona y sus derivados, y la
hormona del crecimiento humano. Sin embargo, estas se aprecia que
tienen efectos secundarios indeseables. (El resumen siguiente está
completamente explicado en la publicación Remington's Pharmaceutical
Sciences, 18ª Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042)
Capítulo 50, en páginas 948-1001)).
La hormona del crecimiento humano, como
Protropina y Somatropina se aprecia que provocan frecuentemente
hipercalciuria, que habitualmente cede en 2 a 3 meses. Se aprecia
que se producen también hiperglicemia y diabetes mellitus abierta.
Se aprecia que la mialgia y los dolores de cabeza por la mañana
temprano son relativamente frecuentes y, ocasionalmente, se pueden
producir casos de hipertiroidismo y supersaturación de colesterol en
la bilis. Si las epífisis están cerradas, la hormona no debe ser
usada porque la estimulación continuada del crecimiento de las
falanges y las mandíbulas, pero no de otros huesos, puede provocar
proporciones corporales anormales.
Los esteroides anabolizantes aumentan el
rendimiento atlético y la agresividad. Su uso ha sido condenado por
el Colegio Americano de Medicina Deportiva. El rendimiento en
mujeres es aumentado, pero a costa de una virilización y acné
vulgaris. Los andrógenos provocan hirsutismo, gravedad o ronquera de
la voz, pubertad precoz y cierre epifiseal en machos inmaduros,
líbido aumentada (tanto en machos como en hembras), priapismo,
oligospermia y atrofia testicular, engrosamiento del clítoris en
mujeres, sofocos, disminución del volumen de eyaculación y
población de esperma, ginocomastia, hipersensibilidad, acné,
ganancia de peso, edema e hipercalcemia. El uso prolongado aumenta
la agresividad, a veces enormemente, y se ha establecido que muchos
asaltos son atribuibles a un abuso de andrógenos. Se han descrito
también comportamientos de tipo paranoico y otros psicóticos. Se
producen estasis biliar e ictericia. Ha habido unos pocos casos
descritos de hepatoma a continuación de una terapia a largo
plazo.
Por lo tanto, es deseable tener una composición
terapéutica o cosmética que aumente la masa de tejido magro sin los
efectos secundarios observados en los fármacos actualmente
disponibles.
La presente invención según se define en las
reivindicaciones se basa en la observación de que la administración
de proteína OB a animales tanto obesos como no obesos da lugar a un
aumento de la masa de tejido magro. Por tanto, la proteína OB tiene
la capacidad de actuar, además de la actuación como un agente para
reducir peso, como un agente que afecte a la masa de tejido magro.
Como tales, están contempladas numerosas terapias que aumentan la
masa de tejido magro, incluso para pacientes que no necesariamente
se aprovecharían de una reducción de peso. Por tanto, un aspecto de
la presente descripción es el uso de proteína OB (o análogos o
derivados de la misma) para aumentar la masa de tejido magro.
En otro aspecto, la presente descripción se
refiere a métodos para tratar la diabetes y a la reducción de los
niveles de insulina necesarios para el tratamiento de la diabetes.
El aumento de la masa de tejido magro, con la disminución
consecuente de la masa de tejido graso, aumenta la sensibilidad a la
insulina. Por lo tanto, los presentes métodos se refieren al uso de
la proteína OB (o análogos o derivados de la misma) para disminuir
la cantidad de insulina necesaria para el tratamiento de la
diabetes.
Como se estableció anteriormente, los métodos de
la presente descripción son los que aumentan la masa de tejido
magro en un individuo. Este aumento en la masa de tejido magro se ha
observado que está acompañado de una disminución en la masa de
grasa. Por tanto, incluso si la administración de proteína OB (o
análogos o derivados de la misma) no da lugar a una cantidad
deseada de pérdida de peso, la administración de proteína OB puede
ser útil para reconfigurar la masa corporal reduciendo la grasa
corporal, mientras aumenta la masa magra.
Adicionalmente, el aumento en la masa de tejido
magro puede hacer que un individuo sea más sensible a la insulina
y, por tanto, los presentes métodos para usar la proteína OB (o sus
análogos o derivados) están relacionados también con un aumento de
la sensibilidad a la insulina en un paciente diabético. Aunque el
modo preciso de acción es incierto, el tejido magro (por ejemplo,
músculos), en comparación con el tejido graso, puede ser más
sensible a los efectos de la insulina. Por lo tanto, un aumento del
tejido magro puede hacer que haya más células disponibles que sean
sensibles a la insulina. Adicionalmente, la eliminación del tejido
graso (por ejemplo, adiposo) puede tener la ventaja adicional de
proporcionar un tejido magro con una exposición adicional a la
circulación periférica, en la que se encuentra la insulina en
circulación. Por lo tanto, otro aspecto de la presente descripción
es que se proporciona un método para aumentar la sensibilidad a la
insulina. Dicho de otro modo, se proporciona por tanto también un
método para disminuir la dosificación de insulina necesaria para un
diabético.
El aumento en el tejido magro puede ser un
aumento en el tejido muscular. Este aumento se observa que es un
aumento global, en lugar de localizado a áreas particulares (por
ejemplo, Ejemplo 1 y 2 siguientes). Como tal, puede aumentar la
resistencia global. Con un aumento de la resistencia global resultan
otras ventajas, como una disminución en la resorción ósea, con la
capacidad potencial de invertir o mejorar la fragilidad como la
osteoporosis. En pacientes que desean un rendimiento atlético
mejorado, se puede proporcionar también un aumento de la
resistencia global como tal. Puede haber un aumento en la producción
de glóbulos rojos o de la eficacia, y un aumento de la sangre
oxigenada. Como tal, puede ser mejorado también el rendimiento tanto
mental como físico.
La proteína OB puede ser seleccionada entre la
murina recombinante expuesta a continuación (ID. SEC. nº 2) o una
proteína humana recombinante como se expone por Zhang et al.,
Nature, supra, o las que carecen de un residuo de
glutaminilo en la posición 28. (Zhang et al, Nature,
supra, en página 428). Se puede usar también la proteína OB
humana recombinante análoga a la expuesta en la ID. SEC. nº 4, que
contiene 1) una arginina en lugar de lisina en la posición 35 y 2)
una leucina en lugar de isoleucina en la posición 74. (Una
abreviatura corta para este análogo es el humano recombinante
R->K^{35}, L->I^{74}). Las secuencias de aminoácidos para
el análogo humano recombinante y las proteínas de murinas
recombinantes se exponen a continuación con un residuo de metionilo
en la posición -1, sin embargo, como con cualquiera de las proteínas
OB y análogos presentes, el residuo de metionilo puede estar
ausente.
Se puede preparar un análogo de la proteína
humana recombinante alterando (como sustituyendo residuos de
aminoácidos) en la secuencia humana recombinante los aminoácidos
que se apartan de la secuencia de murina. Como la proteína humana
recombinante tiene actividad biológica en ratones, este análogo
probablemente sería activo en seres humanos. Por ejemplo, usando
una proteína humana que tenga una lisina en el residuo 35 y una
isoleucina en el residuo 74 según la numeración de la ID. SEC. nº
4, en la que el primer aminoácido es valina, y el aminoácido en la
posición 146 es cisteina, se puede sustituir con otro aminoácido uno
o más de los aminoácidos en las posiciones 32, 35, 50, 64, 68, 71,
74, 77, 89, 97, 100, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y
145. Se puede seleccionar el aminoácido en la correspondiente
posición de la proteína de murina (SEC. OD. nº 2) u otro
aminoácido.
Se pueden preparar adicionalmente moléculas de
"consenso" basadas en la secuencia de proteínas OB de rata.
Murakami et al., Biochem.Biophys.Res. Comm. 209:
944-952 (1995). La proteína OB de rata difiere de la
proteína OB humana en las siguientes posiciones (usando la
numeración de la ID. SEC. nº 4): 4, 32, 33, 35, 50, 68, 71, 74, 71,
78, 89, 97 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138 y
145. Se puede sustituir con otro aminoácido uno o más de los
aminoácidos en estas posiciones divergentes. Las posiciones en
impresión en negrita son las que en la proteína OB de murina así
como en la proteína OB de rata son divergentes de la proteína OB
humana y, por tanto, son particularmente adecuadas para una
alteración. En una o más de estas posiciones, se puede sustituir un
aminoácido de la correspondiente proteína OB de rata, u otro
aminoácido.
Las posiciones de la proteína OB tanto de rata
como murina que divergen de la proteína OB humana madura son: 4,
32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106,
107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145. Una proteína OB humana
según la ID. SEC. nº 4 (con lisina en la posición 35 e isoleucina en
la posición 74) que tenga uno o más de los aminoácidos anteriores
sustituidos con otro aminoácido, como el aminoácido encontrado en
la correspondiente secuencia de rata o murina, puede ser también
efectiva.
Además, los aminoácidos encontrados en la
proteína OB de mono rhesus que divergen de la proteína OB humana
madura son (con las identidades indicadas entre paréntesis en la
abreviatura de aminoácidos de una letra): 8 (S), 35 (R),
48(V), 53(Q), 60(I), 66(I),
67(N), 68((L), 89(L), 100(L), 108(E),
112 (D) y 118 (L). Debido a que (como se describe en el Ejemplo 2
posterior) la proteína OB humana recombinante es activa en monos
cynomolgus, una proteína OB humana según la ID. SEC. nº 4 (con
lisina en la posición 35 e isoleucina en la posición 74) que tenga
uno o más aminoácidos divergentes de mono rhesus sustituidos con
otro aminoácido, como los aminoácidos entre paréntesis, puede ser
efectiva. Debe apreciarse que ciertos aminoácidos divergentes de
rhesus son los encontrados en las especies murinas anteriores
(posiciones 35, 68, 89, 100 y 112). Por tanto, se puede preparar
una molécula de consenso murina/rhesus/humana que tenga (usando la
numeración de la SEC. OD. nº 4 que tiene una lisina en la posición
35 y una isoleucina en la posición 74) uno o más aminoácidos en las
posiciones sustituidos con otro aminoácido: 4, 8, 32, 33, 35, 48,
50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105,
106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145.
Otros análogos pueden ser preparados suprimiendo
una parte de la secuencia de aminoácidos de la proteína. Por
ejemplo, la proteína madura carece de una secuencia líder (-22 a
-1). Se pueden preparar las siguientes formas truncadas de
moléculas de proteínas OB humanas (usando la numeración de la ID.
SEC. nº 4):
(a) aminoácidos 98-146
(b) aminoácidos 1-32
(c) aminoácidos 40-116
(d) aminoácidos 1-99 y
(conectados a) 112-146
(e) aminoácidos 1-99 y
(conectados a) 112-146 que tienen uno o más de los
aminoácidos 100-111 colocados entre los aminoácidos
99 y 112.
\vskip1.000000\baselineskip
Además, las formas truncadas pueden tener
también alterados uno o más de los aminoácidos que son divergentes
en la proteína OB de rhesus, rata o murina de la proteína OB
humana.
La presente invención se dirige a proteínas de
fusión que comprenden una proteína Fc fusionada al N terminal de
una proteína OB. Las proteínas de fusión pueden ser preparadas
uniendo poliaminoácidos al N terminal del resto de proteína OB. El
poliaminoácido es una región constante de anticuerpo, denominada a
veces "Fc", que se usa en la invención reivindicada) u otros
poliaminoácidos. La colocación de la unión de la proteína Fc está
en el N terminal del resto de la proteína OB según la invención.
Todavía, en otro aspecto de la presente
descripción, se proporcionan métodos para usar composiciones
farmacéuticas de proteínas y derivados. Estas composiciones
farmacéuticas pueden ser para una administración por inyección o
para una administración oral, pulmonar, nasal, transdermal u otras
formas. En general, están abarcadas por la descripción las
composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades eficaces de
proteína o productos derivados de la descripción junto con
diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes
y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Estas composiciones
incluyen diluyentes de diverso contenido de tampones (Por ejemplo,
Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y resistencia
iónica; aditivos como detergentes ya gentes solubilizantes (por
ejemplo, Tween 80, polisorbato 80), anti-oxidantes
(por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio),
conservantes (por ejemplo, Thimersol, alcohol bencílico) y
sustancias espesantes (por ejemplo, lactosa o manitol); la
incorporación del material en preparaciones en forma de partículas
de compuestos polímeros como poli(ácido acético), poli(ácido
glicólico), etc. o en liposomas. Se puede usar también hilaurónico,
y este puede tener el efecto de favorecer una duración sostenida en
la circulación. Estas composiciones pueden tener una influencia
sobre el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in
vivo y velocidad de desaparición in vivo en las
presentes proteínas y derivados. Véase, por ejemplo, Remington's
Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co.,
Easton, PA 18042) páginas 1435-1712. Las
composiciones pueden ser preparadas en forma líquida, o pueden
estar en un polvo seco, como en forma liofilizada. Están
contempladas también las formulaciones de duración sostenida
implantables, como son las formulaciones transdermales.
Están contempladas para ser usadas en la en
realizaciones de la descripción las formas de dosificación oral
sólidas, que se describen de forma general en Remington's
Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton
PA 18042), en el capítulo 89. Las formas de dosificación sólidas
incluyen comprimidos, cápsulas, píldoras, pastillas, sellos o
granulados. También, se puede usar una encapsulación liposomal o
proteinoide para formular las presentes composiciones (como, por
ejemplo, las microesferas proteinoides descritas en la patente de
EE.UU. nº 4.925.673). Puede ser usada la encapsulación liposomal y
los liposomas pueden hacerse derivar con diversos polímeros (por
ejemplo, patente de EE.UU. nº 5.013.556). Una descripción de
posibles formas de dosificación sólidas para el producto
terapéutico se proporciona por Marshall, K. en: Modern Pharmaceutics
editado por G.S. Banker y C.T. Rhodes capítulo 10, 1979. En
general, la formulación incluirá la proteína (o análogo o
derivado), e ingredientes inertes que permitan una protección contra
el entorno del estómago, y liberen el material biológicamente
activo en el intestino.
También están específicamente contempladas en
las realizaciones de la descripción, las formas de dosificación
oral de las proteínas derivadas anteriores. La proteína puede ser
químicamente modificada de forma que el suministro oral del
derivado sea eficaz. Generalmente, la modificación química
contemplada es la unión de al menos un resto a la propia molécula
de proteína (o péptido), en el que dicho resto permite (a) la
inhibición de la proteolisis; y (b) la absorción en la corriente
sanguínea desde el estómago o el intestino. Es deseado también el
aumento de la estabilidad global de la proteína y un aumento en el
tiempo de circulación en el cuerpo. Ejemplos de estos restos
incluyen: polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol y
propilenglicol, carboximetil-celulosa, dextrano,
poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona y poliprolina.
Abuchowski and Davis, Soluble Polymer-Enzyme
Adducts.In: "Enzymes as Drugs", Hocenberg and Roberts, eds.,
Wiley-Interscience, New York, NY, (1981), pp
367-383; Newmark, et al., J. Appl. Biochem.
4: 185-189 (1982). Otros polímeros que pueden ser
usados son poli-1,3-dioxolano y
poli-1,3,6-
tioxocano.
tioxocano.
Para la proteína (o derivado) la ubicación de la
liberación puede ser el estómago, el intestino delgado (el duodeno,
yeyuno o íleon) o el intestino grueso. Un experto en la técnica
tiene formulaciones disponibles que no se disuelven en el estómago,
y sin embargo liberan el material en el duodeno en algún otro lugar
en el intestino. Preferentemente, la liberación evitará los efectos
perjudiciales del entorno del estómago, ya sea mediante la
protección de la proteína (o derivado) o mediante la liberación del
material biológicamente activo más allá del entorno del estómago,
como en el intestino.
Para asegurar una completa resistencia gástrica,
es esencial un revestimiento impermeable hasta al menos un pH de
5,0. Ejemplos de los ingredientes inertes más comunes que son usados
como revestimientos entéricos son
acetato-trimelitato de celulosa (CAT), ftalato de
hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55,
poli(acetato-ftalato de vinilo) (PVAP),
Eudragit L30D, Aquacteric, acetato-ftalato de
celulosa (CAP), Eudragit L, Eudragit S y Shellac. Estos
revestimientos pueden ser usados en forma de películas mixtas.
Un revestimiento o mezcla de revestimientos
puede ser usado también en comprimidos, que no estén destinados a
la protección contra el estómago. Esto puede incluir revestimientos
de azúcares o revestimientos que hagan el comprimido más fácil de
tragar. Las cápsulas pueden consistir en una envoltura dura (como
gelatina) para el suministro del producto terapéutico seco, es
decir, el polvo; para formas líquidas, se puede usar una envoltura
de gelatina blanda. El material de la envoltura para los sellos
puede ser almidón espeso u otro papel comestible. Para píldoras,
pastillas, comprimidos moldeados o triturados de comprimidos, se
pueden usar técnicas de amasamiento en húmedo.
El producto terapéutico de la descripción puede
ser incluido en la formulación como multipartículas finas en la
forma de gránulos o granulaciones con un tamaño de partículas de
aproximadamente 1 mm. La formulación del material para una
administración en cápsulas puede ser también en forma de un polvo,
aglomerados ligeramente comprimidos o incluso como comprimidos. El
producto terapéutico puede ser preparado por compresión.
Los agentes colorantes y de sabores pueden ser
todos incluidos. Por ejemplo, la proteína (o derivado) puede ser
formulada (como mediante encapsulación en liposomas o microesferas)
y seguidamente puede ser adicionalmente contenida en un producto
comestible, como una bebida refrescante que contenga colorantes y
agentes de sabores.
Se puede diluir o aumentar el volumen del
producto terapéutico con un material inerte. Estos diluyentes pueden
incluir carbohidratos, especialmente manitol,
\alpha-lactosa, lactosa anhidra, celulosa,
sacarosa, dextranos modificados y almidón. Se pueden usar también
ciertas sales inorgánicas como materiales de carga que incluyen
trifosfato de calcio, carbonato de magnesio y cloruro de sodio.
Algunos diluyentes disponibles en el comercio son
Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500,
Emcompress y Avicell.
Pueden ser incluidos disgregantes en la
formulación del producto terapéutico como una forma de dosificación
sólida. Los materiales usados como disgregantes incluyen, pero sin
limitación, almidón que incluye el disgregante comercial basado en
almidón, Explotab. El almidón-glicolato de sodio,
Amberlite, carboximetilcelulosa de sodio, ultramilopectina,
alginato de sodio, gelatina, cáscara de naranja,
carboximetil-celulosa ácida, esponja natural y
bentonita pueden ser todos usados. Otra forma de los disgregantes
son las resinas de intercambio catiónico insolubles. PUeden ser
usadas gomas en polvo como disgregantes y como aglutinantes y estas
pueden incluir gomas en polvo como agar, Karaya o tragacanto. El
ácido algínico y su sal de sodio son también útiles como
disgregantes.
Pueden ser usados aglutinantes para mantener el
agente terapéutico conjuntamente para formar un comprimido duro e
incluyen materiales de productos naturales como goma arábiga,
tragacanto, almidón y gelatina. Otros incluyen
metil-celulosa (MC), etil-celulosa
(EC) y carboximetil-celulosa (CMC). La
polivinilpirrolidona (PVP) y la
hidroxipropilmetil-celulosa (HPMC) pueden ser usadas
ambas en soluciones alcohólicas para granular el producto
terapéutico.
terapéutico.
Puede ser incluido un agente
anti-rozamiento en la formulación del producto
terapéutico para evitar el apelmazamiento durante el procedimiento
de formulación. Pueden ser usados lubricantes en forma de una capa
entre el producto terapéutico y la pared de la matriz, y estos
pueden incluir, pero sin limitación, ácido esteárico, incluidas sus
sales de magnesio y calcio, politetrafluoroetileno (PTFE), parafina
líquida, aceites vegetales y ceras. Pueden ser usados también
lubricantes solubles como lauril-sulfato de sodio,
lauril-sulfato de magnesio, polietilenglicol de
diversos pesos moleculares, Carbowax 4000 y 6000.
Los adyuvantes de flujo pueden mejorar las
propiedades del flujo del fármaco durante la formulación y pueden
ser añadidos para ayudar al reagrupamiento durante la compresión.
Los adyuvantes de flujo pueden incluir almidón, talco, sílice
pirógena y silicoaluminato hidratado.
Para ayudar a la disolución del producto
terapéutico en el entorno acuoso puede ser añadido un tensioactivo
como un agente humectante. Los tensioactivos pueden incluir
detergentes aniónicos como lauril-sulfato de sodio,
dioctil-sulfosuccinato de sodio y
dioctil-sulfonato de sodio. Puede ser usados
detergentes catiónicos y podrían incluir cloruro de benzalconio o
cloruro de bencetonio. La lista de detergentes no iónicos
potenciales que podrían ser incluidos en la formulación como
tensioactivos son lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40,
polioxietileno-aceite de ricino hidrogenado 10, 50 y
60, monoestearato-polisorbato de glicerol 40, 60,
65 y 80, éster de ácido graso de sacarosa,
metil-celulosa y
carboximetil-celulosa. Estos tensioactivos podrían
estar presentes en la formulación de la proteína o derivado solos o
bien como una mezcla en diferentes relaciones.
Los aditivos que aumentan potencialmente la
absorción de la proteína (o derivado) son, por ejemplo, los ácidos
grasos ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico.
Puede ser deseable una formulación de liberación
controlada. El fármaco podría ser incorporado en una matriz inerte
que permita la liberación por mecanismos de difusión o bien de
lixiviación, es decir, gomas. Pueden ser incorporadas también
matrices de degeneración lenta en la formulación. Otra forma de una
liberación controlada de este producto terapéutico es mediante un
método basado en el sistema terapéutico de Oros (Alza Corp.), es
decir, el fármaco está incluido en una membrana semipermeable que
permite que entre agua y expulsa fármaco a través de una única
abertura pequeña debido a efectos osmóticos. Algunos revestimientos
entéricos pueden tener también un efecto de liberación
retardada.
Se pueden usar otros revestimientos para la
formulación. Estos incluyen una diversidad de azúcares que podían
ser aplicados en una bandeja de revestimiento. El agente terapéutico
podría ser proporcionado también en un comprimido revestido con
películas y los materiales usados en este caso se dividen en dos
grupos. El primero está constituido por materiales no entéricos e
incluyen metil-celulosa,
etil-celulosa, hidroxietil-celulosa,
metilhidroxietil-celulosa,
hidroxipropil-celulosa,
hidroxipropil-metil-celulosa,
carboximetil-celulosa de sodio, povidona y
polietilenglicoles. El segundo grupo consiste en los materiales
entéricos que son comúnmente ésteres de ácido ftálico.
Puede ser usada una mezcla de materiales para
proporcionar el revestimiento de película óptimo. El revestimiento
de película se puede llevar a cabo en un dispositivo de
revestimiento de bandeja o en un lecho fluidizado o mediante
revestimiento por compresión.
También está contemplado en la presente en
realizaciones de la descripción un suministro pulmonar de la
presente invención, o un derivado del mismo. La proteína (derivado)
es suministrada a los pulmones de un mamífero mientras la inhala y
atraviesa el recubrimiento epitelial de los pulmones hasta la
corriente sanguínea. (Otros informes sobre esto incluyen Adjei
et al., Pharmaceutical Research 7:
565-569 (1990); Adjei et al., International
Journal of Pharnaceutics 63: 135-144 (1990)
(acetato de leuprolida); Braquet et al., Journal of
Cardiovascular Pharmacology 13 (suppl. 5): s.
143-146 (1989)(endotelina-1);
Hubbard et al., Annals of Internal Medicine 3:
206-212
(1989)(\alpha-1-antitripsina);
Smith et al., J. Clin.Invest. 84:
1145-1146 (1989)
(\alpha-1-proteinasa); Oswein
et al., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of
Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado,
Marzo de 1990 (hormona del crecimiento humano recombinante); Debs
et al., The Journal of Immunology 140:
3482-3488 (1988)
(interferón-\gamma y factor alfa de necrosis
tumoral) y Platz et al., patente de EE.UU. nº 5.284.656
(factor estimulador de colonias de granulocitos).
Está contemplada para ser usada en la práctica
de esta descripción una amplia gama de dispositivos mecánicos
diseñados para el suministro pulmonar de productos terapéuticos que
incluyen, pero sin limitación, nebulizadores, inhaladores de dosis
medidas e inhaladores de polvos, todos los cuales son familiares
para los expertos en la técnica.
Algunos ejemplos específicos de dispositivos
disponibles en el comercio adecuados para la práctica de esta
descripción son el nebulizador Ultravent, fabricado por
Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri, el nebulizador Acorn II,
fabricado por Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; el
inhalador de dosis medidas Ventolin, fabricado por Glaxo Inc.,
Research Triangle Park, North Carolina, y el inhalador de polvos
Spinhaler, fabricado por Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.
Todos estos dispositivos de la descripción
requieren el uso de formulaciones adecuadas para el suministro de
una proteína (o análogo o derivado). Normalmente, cada formulación
es específica para el tipo de dispositivo empleado y puede incluir
el uso de un material propelente apropiado, además de diluyentes,
adyuvantes y/o vehículos útiles en terapia.
La proteína (o derivado) debe ser preparada lo
más ventajosamente en forma de partículas con un tamaño medio de
partículas de menos de 10 \mum (o micrómetros), lo más
preferentemente 0,5 a 5 \mum, para un suministro lo más eficaz al
pulmón distal.
Los vehículos incluyen carbohidratos como
trehalosa, manitol, xilitol, sacarosa, lactosa y sorbitol. Otros
ingredientes para ser usados en las formulaciones pueden incluir
DPPC, DOPE, DSPC y DOPC. Pueden ser usados tensioactivos naturales
o sintéticos. Puede ser usado polietilenglicol (incluso aparte de su
uso en la derivación de la proteína o análogo). Pueden ser usados
dextranos, como ciclodextrano. Pueden ser usadas sales biliares y
otros mejoradores relacionados. Pueden ser usados celulosa y
derivados de celulosa. Pueden ser usados aminoácidos, como se usan
en una formulación tamponante.
También, está contemplado por la descripción el
uso de liposomas, microcápsulas o microesferas, complejos de
inclusión u otros tipos de vehículos.
Las formulaciones adecuadas para ser usadas con
un nebulizador, ya sea de chorro o ultrasónico, comprenderán
normalmente la proteína (o derivado) disuelta en agua a una
concentración de aproximadamente 0,1 a 25 mg de proteína
biológicamente activa por ml de solución. La formulación puede
incluir también un tampón y un azúcar sencillo (por ejemplo, para
la estabilización de la proteína y la regulación de la presión
osmótica). La formulación del nebulizador puede contener también un
tensioactivo, para reducir o evitar la agregación inducida en la
superficie de la proteína provocada por la atomización de la
solución en la formación del aerosol.
Las formulaciones para ser usadas con un
dispositivo inhalador de dosis medidas comprenderán generalmente un
polvo finamente dividido que contiene la proteína (o derivado)
puesta en suspensión en un propelente con la ayuda de un
tensioactivo. El propelente puede ser cualquier material
convencional empleado para estos fines, como un clorofluorocarburo,
un hidroclorofluorocarburo, un hidrofluorocarburo o un hidrocarburo,
que incluyen triclorofluorometano, diclorodifluorometano,
diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano,
o sus combinaciones. Los tensioactivos adecuados incluyen trioleato
de sorbitan y lecitina de soja. Puede ser útil también como
tensioactivo el ácido
oleico.
oleico.
Las formulaciones para un suministro desde un
dispositivo inhalador de polvos comprenderán un polco seco finamente
dividido que contiene proteína (o derivado) y puede incluir también
un agente espesante como lactosa, sorbitol, sacarosa, manitol,
trealosa o xilitol en cantidades que faciliten la dispersión del
polvo desde el dispositivo, por ejemplo, 50 a 90% en peso de la
formulación.
Está contemplado por la descripción también el
suministro nasal de la proteína (o análogo o derivado). El
suministro nasal permite el paso de la proteína a la corriente
sanguínea directamente después de administrar el producto
terapéutico a la nariz, sin necesidad de un depósito del producto en
el pulmón. Las formulaciones para un suministro nasal incluyen las
de dextrano y ciclodextrano. Está contemplado por la descripción
también el suministro mediante el transporte a través de otras
membranas mucosas.
Un experto en la técnica será capaz de
determinar las dosificaciones eficaces mediante la administración y
observación del efecto terapéutico deseado. Preferentemente, en
realizaciones de la descripción, la formulación de la molécula será
tal que entre aproximadamente 10 \mug/kg/día y 10 mg/kg/día
producirán el efecto terapéutico deseado. Las dosificaciones
eficaces pueden ser determinadas usando herramientas de diagnóstico
a lo largo del tiempo. Por ejemplo, un diagnóstico para medir la
cantidad de proteína OB en la sangre (o plasma o suero) puede ser
usado en primer lugar para determinar los niveles endógenos de
proteína OB. Esta herramienta de diagnóstico puede estar en la
forma de un ensayo de anticuerpos, como un ensayo de emparedado de
anticuerpos. La cantidad de proteína OB endógena es cuantificada
inicialmente, y se determina una línea de base. Las dosificaciones
terapéuticas son determinadas a medida que la cuantificación de
proteína OB endógena y exógena (es decir, proteína, análogo o
derivado encontrados en el cuerpo, ya sean
auto-producidos o administrados) se continúa
durante el transcurso de la terapia. Por lo tanto, las
dosificaciones pueden variar durante el transcurso de la terapia,
siendo usada inicialmente una dosificación relativamente elevada,
hasta que se observa una ventaja terapéutica, y se usan
dosificaciones inferiores para mantener las ventajas
terapéuticas.
Idealmente, en situaciones en las que solamente
se desea un aumento de la masa corporal magra, la dosificación será
insuficiente para da lugar a una pérdida de peso. Por tanto, durante
un transcurso inicial de la terapia de una persona obesa, pueden
ser administradas dosificaciones mediante las cuales se consiga una
pérdida de peso y una disminución de tejidos grasos/aumento de masa
magra simultáneos. Una vez que se consigue una pérdida de peso
suficiente, puede ser administrada una dosificación suficiente para
evitar una nueva ganancia de peso, y sin embargo suficiente para
mantener el aumento deseado de la masa magra (o la prevención del
agotamiento de la masa magra). Estas dosificaciones pueden ser
determinadas empíricamente, y los efectos de la proteína OB son
reversibles. Por ejemplo, Campfield et al., Science 269:
546-549 (1995) en 547. Por tanto, si se observa una
dosificación que da lugar a una pérdida de peso cuando no es deseada
la pérdida de peso, se administraría una dosis inferior con el fin
de conseguir el aumento deseado en la masa de tejidos magros,
manteniendo sin embargo el peso deseado.
Para aumentar la sensibilidad de un individuo a
la insulina, se pueden tener en cuenta consideraciones similares
para las dosificaciones. Se puede conseguir un aumento de la masa
magra sin pérdida de peso suficiente para disminuir la cantidad de
insulina (o, potencialmente, anilina u otros fármacos para tratar la
diabetes potencial) que habría que administrar a un individuo para
el tratamiento de la diabetes.
Para aumentar la resistencia global, se pueden
hacer consideraciones similares para la dosificación. El aumento de
la masa magra con un aumento simultáneo de la resistencia global se
puede conseguir con dosis insuficientes para dar lugar a una
pérdida de peso. Se pueden conseguir también otras ventajas, como un
aumento de los glóbulos rojos (y oxigenación de la sangre) y una
disminución de la resorción ósea u osteoporosis en ausencia de
pérdida de peso.
Los presentes métodos de la descripción pueden
ser usados conjuntamente con otros medicamentos, como los que son
útiles para el tratamiento de la diabetes (por ejemplo, insulina y
posiblemente anilina), colesterol y medicamentos para rebajar la
presión sanguínea (como los que reducen los niveles de lípidos en
sangre u otros medicamentos cardiovasculares) y medicamentos para
aumentar la actividad (por ejemplo, anfetaminas). Se pueden usar
también supresores del apetito. Esta administración puede ser
simultánea o puede ser en serie.
Además, los presentes métodos descripción pueden
ser usados conjuntamente con procedimientos quirúrgicos, como
cirugías estéticas destinadas a alterar la apariencia global de un
cuerpo (por ejemplo, liposucción o cirugías con láser diseñadas
para reducir la masa corporal o cirugías de implante diseñadas para
aumentar la apariencia de la masa corporal). Las ventajas
sanitarias de las cirugías cardíacas, como cirugías de bypass u
otras cirugías diseñadas a aliviar un estado perjudicial provocado
por el bloqueo de los vasos sanguíneos por depósitos grasos, como
placa arterial, pueden ser aumentadas con el uso simultáneo de las
presentes composiciones y métodos. Los métodos para eliminar los
cálculos biliares, como los métodos ultrasónicos o láser, pueden
ser usados también antes, durante o después del transcurso de los
presentes métodos terapéuticos de la descripción. Además de ello,
los presentes métodos de la descripción pueden ser usados como un
adyuvante para cirugías o terapias de rotura de huesos, músculos
dañados u otras terapias que serían mejoradas por un aumento de la
masa de tejidos magros.
(Solamente para
información)
Estos datos demuestran que la proteína OB, o
análogos o derivados de la misma, son eficaces para aumentar la
masa magra.
Se administró continuamente proteína OB murina
de metionilo recombinante (como se describe con posterioridad) a
través de infusión por bomba osmótica durante un período de cuatro
semanas. Los datos de la Tabla 1 muestran la composición corporal
media (para ratones CD1) a las dosis sindicadas:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En ratones CD1 no obesos, se administró
continuamente proteína OB murina de metionilo recombinante a unas
dosis de 0,3 ó 1 mg/kg/día que se mostró que efectuaba un aumento de
la masa magra con relación a los animales testigos, a los que se
administró PBS.
(Solamente para
información)
Este ejemplo demuestra que la proteína OB humana
de metionilo recombinante provoca un aumento de la masa de tejido
magro en primates.
A monos cynomolgus obesos que tenían más de 20%
de masa corporal se les administró proteína OB humana de metionilo
recombinante por vía subcutánea, a una dosis diaría de 1 mg de
proteína/kg de peso corporal/día (véase la sección de Materiales y
Métodos, posteriores). A los animales testigos se les administró
solución salina tamponada con fosfato. La composición corporal se
realizó usando un análisis de absorbimetría de rayos X de energía
dual ("DEXA"). Las mediciones de la composición corporal se
tomaron en intervalos de 7 días.
\newpage
Las Tablas 2A y 2B muestran los resultados de
los análisis de la composición corporal en términos de masa de
grasa o tejido magro. Los datos se presentan en gramos. Los
resultados para los dos animales testigos están en la Tabla 2A. Los
datos para 4 animales del ensayo se presentan en la Tabla 2B. (Se
presentan también los datos para la masa ósea). Como se puede
observar, en el día 28, los animales del ensayo perdieron
aproximadamente 264 gramos de grasa y ganaron aproximadamente 138
gramos de masa magra. En el día 28, los testigos perdieron 36
gramos de tejido graso y ganaron aproximadamente 25 gramos de masa
magra. Esto demuestra que la proteína OB provoca un aumento en la
masa de tejido magro.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
* indica valores de p menores que 0,05 para
mediciones repetidas ANOVA.
\vskip1.000000\baselineskip
(Solamente para
información)
Un paciente humano no obeso desea un aumento en
la masa de tejido magro para fines terapéuticos, como la
recuperación de una enfermedad que agotó la masa de tejido magro.
Al paciente se le administra una cantidad eficaz de proteína OB,
análogo o derivado de la misma para dar lugar al aumento deseado de
la masa de tejido magro. El aumento de la masa de tejido magro es
verificado usando una exploración DEXA. Los niveles de proteína OB
o análogo o derivado en circulación pueden ser verificados usando
un estuche de diagnóstico, como un ensayo por anticuerpos frente a
proteína OB (u otra fuente antígena si es aplicable).
\newpage
(Solamente para
información)
Un sujeto humano desea un aumento de la masa de
tejido magro para fines estéticos o atléticos, como un aumento en
el tejido magro con el fin de mejorar la apariencia externa. Al
paciente se le administra una cantidad eficaz de proteína OB,
análogo o derivado de la misma para dar lugar al aumento deseado de
la masa de tejido magro. El aumento de la masa de tejido magro es
verificado usando una exploración DEXA. Los niveles de oxígeno en
la sangre aumentan. Los niveles de proteína OB o análogo o derivado
en circulación pueden ser verificados usando un estuche de
diagnóstico, como un ensayo por anticuerpos frente a la proteína OB
(u otra fuente antígena si es
aplicable).
aplicable).
(Solamente para
información)
Un paciente humano diabético desea usar
dosificaciones disminuidas de insulina para el tratamiento de la
diabetes. Al paciente se le administra una cantidad eficaz de
proteína OB, análogo o derivado de la misma para dar lugar a un
aumento en la masa de tejido magro. La sensibilidad del paciente a
la insulina aumenta, y la dosificación de insulina necesaria para
aliviar los síntomas de la diabetes son disminuidos, ya sea en
términos de una disminución en las unidades de insulina necesarias,
o bien en términos de una disminución en el número de inyecciones
de insulina necesarias por día. Los niveles de proteína OB o análogo
o derivado de en circulación pueden ser verificados usando un
estuche de diagnóstico, como un ensayo por anticuerpos frente a la
proteína OB (u otra fuente antígena si es
aplicable).
aplicable).
(Solamente para
información)
Un paciente humano de edad avanzada no obeso
desea un aumento de la resistencia global. Al paciente se le
administra una cantidad eficaz de proteína OB, análogo o derivado de
la misma para dar lugar a un aumento en la masa de tejido magro, y
un aumento de la resistencia global. La resorción ósea es también
disminuida y un estado de osteoporosis es mejorado. Los niveles de
proteína OB o análogo o derivado en circulación pueden ser
verificados usando un estuche de diagnóstico, como un ensayo por
anticuerpos frente a la proteína OB (u otra fuente antígena si es
aplicable).
Roedores. Se usaron ratones CD1 de tipo
salvaje para el Ejemplo 1 (datos de la Tabla 1). Los animales fueron
mantenidos bajo condiciones humanas.
Primates: Se usó un total de seis monos
cynomolgus. Todos los monos tenían al menos 20% de grasa al comienzo
del estudio. Los animales se dispusieron al azar en cuanto al peso,
y cuatro animales fueron ensayados con proteína OB, y dos animales
fueron testigos.
Para roedores. Para el Ejemplo 1 (datos
de la Tabla 1) se administraron proteína de murina recombinante
(como se describe con posterioridad) o vehículo (solución salina
tamponada con fosfato "PBS", pH 7,4) por medio de infusión con
bomba osmótica. Se colocaron quirúrgicamente minibombas osmóticas
Alzet (Alza, Palo Alto, CA, modelo nº 2002) en cada ratón en una
bolsa subcutánea en el área subcapsular y se sustituyeron después
de dos semanas. Las bombas fueron calibradas para administrar 0,5
\mul de proteína en solución por hora para las dosificaciones
indicadas en la Tabla 1.
Para primates. Para el Ejemplo 2, la
proteína OB humana de metionilo recombinante (de la ID. SEC. nº 4,
que tenía una lisina en la posición 35 y una isoleucina en la
posición 74), dosificada a 1 mg/ml de PBS, se administró por vía
subcutánea a una dosis de 1 mg de proteína/kg de peso corporal/día.
A los animales testigo se les administró PBS de la misma forma.
Análisis de pellejo de roedores. El
análisis del pellejo se realizó como en A.I. Leshner, V.A. Litwin y
R.L. Squibb, Brain Res. 9: 281 (1972). La composición acuosa se
determinó mediante la sustracción del peso del pellejo antes y
después de un período de deshidratación de 4 días. Se extrajo grasa
de una parte previamente pesada del pellejo seco y triturado con
etil-éter y alcohol etílico, de forma que el porcentaje de grasa
pudiera ser calculado a partir de la cantidad de material que
permanecía después del procedimiento de extracción. La masa magra
se definió como la proporción de pellejo triturado que permanecía
después de la deshidratación y extracción con éter.
Exploración por absorbimetría de rayos X de
energía dual en primates. Se realizó una exploración "DEXA"
en los valores del tiempo indicados en la Tabla 2 A y B, en el
Ejemplo 2.
Proteína: Las ID de secuencias nº 1 y 2
exponen DNA y proteína OB recombinante de murina y las ID de las
secuencias nº 3 y 4 exponen un DNA y proteína OB humanos
recombinantes análogos. La proteína recombinante de murina como en
la ID. SEC. nº 2 se usó en el EJEMPLO 1. La proteína OB humana
recombinante como en la ID. SEC. nº 4 que tenía un residuo de
lisina en la posición 35 y un residuo de isoleucina en la posición
74 se usó en el EJEMPLO 2. Como se indicó anteriormente, las
proteínas recombinantes análogas de murina y humanas posteriores son
ilustrativas de la proteína OB que puede ser usada en los presentes
métodos de tratamiento y elaboración de un medicamento. Pueden ser
usadas otras proteínas OB o análogos o derivados de las mismas.
En la presente memoria descriptiva, el primer
aminoácido de la secuencia de aminoácidos para la proteína
recombinante es citado como +1 y es valida, y el aminoácido en la
posición -1 es metionina. El aminoácido en el C terminal es el
número 146 (cisteína).
DNA (de cadena doble) de
met-OB de murina recombinante y secuencia de
aminoácidos (ID. SEC. nº 1 y 2):
\newpage
DNA (de cadena doble) análogo de
met-OB humano recombinante y secuencia de
aminoácidos (ID. SEC. nº 3 y 4)
Los métodos siguientes para la producción han
sido usados para producir proteína OB análoga de murina o humana de
metionilo recombinante biológicamente activa. Se pueden usar métodos
similares para preparar proteína OB humana de metionilo
recombinante biológicamente activa.
El vector de expresión del plásmido usado es
pCFM1656, nº de acceso ATCC 69576. El DNA anterior fue ligado en el
vector de expresión pCFM1656 linealizado con XbaI y BamHI y
transformado en la cepa hospedante de E. coli, FM5. Las
células de E. coli, FM5 fueron derivadas en Amgen Inc.,
Thousand Oaks, CA a partir de la cepa K-12 de E.
coli (Bachmann, et al., Bacteriol. Rev. 40:
116-167 (1976)) y contienen el gen represor de fagos
lambda integrado c1857 (Sussman et al. C.R. Acad. Sci. USA:
1517-1579 (1962)). La producción de vectores,
transformación de células y selección de colonias se realizaron por
métodos estándar, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2^{nd} Edition, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Las células se hicieron
crecer en medios LB.
Procedimiento de fermentación. Se usó un
protocolo de fermentación de tres fases conocido como procedimiento
de tandas alimentadas. Las composiciones de los medios se exponen a
continuación.
Tanda: Se esterilizó una fuente de
nitrógeno y fosfato (subiendo hasta 122ºC durante 35 minutos,
1,24-1,38 bares) en el recipiente de fermentación
(Biolafitte, capacidad de 12 litros). Tras enfriar, se añadieron
asépticamente fuentes de carbono, magnesio, vitaminas y trazas
metálicas. Se añadió al fermentador un cultivo durante una noche de
las bacterias productoras de proteínas de murinas recombinantes
anteriores (16 horas o más) de 500 ml (crecidas en un caldo
LB).
Alimentación I: Tras alcanzar entre
4,0-6,0 OD_{600}, los cultivos fueron alimentados
con la Alimentación I. La glucosa fue alimentada a una velocidad
limitativa con el fin de controlar la velocidad de crecimiento
(\mu). Un sistema automatizado (denominado el Sistema de Control
Distributivo) fue instruido para controlar la velocidad de
crecimiento a 0,15 generaciones por hora.
Alimentación II: Cuando la OD_{600}
había alcanzado 30, la temperatura del cultivo se aumentó lentamente
hasta 42ºC y la alimentación se cambió a la Alimentación II
posterior. La fermentación se dejó que continuara durante 10 horas
con toma de muestras cada 2 horas. Después de 10 horas, el contenido
del fermentador se enfrió por debajo de 20ºC y se recolectó por
centrifugación.
Tanda:
Alimentación I:
Alimentación II:
Solución de vitaminas (Tanda y Alimentación I):
0,5 g de biotina, 0,4 g de ácido fólico y 4,2 g de riboflavina, se
disolvió en 450 ml de H_{2}O y 3 ml de NaOH 10 N y se llevó hasta
500 ml en H_{2}O. Se disolvieron 14 g de
piridoxina-HCl y 61 g de niacina en 150 ml de
H_{2}O y 50 ml de NaOH 10 N, y se llevó hasta 250 ml en H_{2}P.
Se disolvieron 54 g de ácido pantotémico en 200 ml de H_{2}O y se
llevó hasta 250 ml. Las tres soluciones se combinaron y se llevaron
hasta un volumen total de 10 litros.
Solución de trazas metálicas (Tanda y
Alimentación I):
Cloruro férrico (FeCl_{3}\cdot6H_{2}O): 27
g/l
Cloruro de zinc (ZnCl_{2}\cdot4H_{2}O): 2
g/l
Cloruro de cobalto (CoCl_{2}\cdot6H_{2}O):
2 g/l
Molibdato de sodio
(NaMoO_{4}\cdot2H_{2}O): 2 g/l
Cloruro de calcio (CaCl_{2}\cdot2H_{2}O):
1 g/l
Sulfato cúprico (CuSO_{4}\cdot5 H_{2}O):
1,9 g/l
Ácido bórico (H_{3}BO_{3}): 0,5 g/l
Cloruro de manganeso
(MnCl_{2}\cdot4H_{2}O): 1,6 g/l
Dihidrato de citrato de sodio: 73,5 g/l
La purificación se realizó mediante las
siguientes etapas (salvo que se indique otra cosa, las siguientes
etapas se realizaron a 4ºC):
1. Pasta celular. Una pasta celular de E.
coli se puso en suspensión en un volumen de 5 veces de EDTA 7
mM, pH 7,0. Las células en el EDTA fueron adicionalmente
disgregadas mediante dos pasos a través de un microfluidizador. Las
células disgregadas fueron centrifugadas a 4,2 K-rpm
durante 1 hora en una centrifugadora Beckman J6-B
con un rotor JS-4.2.
2. Inclusión de lavado corporal nº 1. La materia
sobrenadante de la etapa anterior se separó, y el sedimento se
volvió a poner en suspensión en un volumen de 5 veces de EDTA 7 mM,
pH 7,0 y se homogeneizó. Esta mezcla se centrifugó como en la etapa
1.
3. Inclusión del lavado corporal nº 3. La
materia sobrenadante de la etapa anterior se separó, y el sedimento
se volvió a poner en suspensión en un volumen de diez veces de Tris
20 mM, pH 8,5, DTT 10 mM y 1% de desoxicolato, y se homogeneizó.
Esta mezcla se centrifugó como en la Etapa 1.
4. Inclusión de lavado corporal nº 3. La materia
sobrenadante de la etapa anterior se separó y el sedimento se
volvió a poner en suspensión en un volumen de diez veces de agua
destilada y se homogeneizó. Esta mezcla se centrifugó como en la
Etapa 1.
5. Replegamiento. El sedimento fue replegado con
15 volúmenes de HEPES 10 mM, pH 8,5, 1% de sarcosina de sodio
(N-lauroil-sarcosina), a temperatura
ambiente. Después de 60 minutos, la solución se hizo que fuera 60
\muM de sulfato de cobre, y seguidamente se agitó durante una
noche.
6. Separación de sarcosina. La mezcla del
replegamiento se diluyó con 5 volúmenes de tampón de Tris 10 mM, pH
7,5, y se centrifugó como en la Etapa 1. La materia sobrenadante se
recogió y se mezcló con agitación durante una hora con resina
Dowex® 1-X4 (Dow Chemical Co., Midland MI), malla
20-50, forma de cloruro, a un volumen total de
0,066% de mezcla de replegamiento diluida. Véase el documento WO
89/10932 en la página 26 para más información sobre Dowex®. Esta
mezcla se vertió en una columna y se recogió el eluyente. La
separación de sarcosina se determinó mediante HPLC de fase
inversa.
7. Precipitación ácida. El eluyente de la etapa
previa se recogió y el pH se ajustó a pH 5,5 y se incubó durante 30
minutos a temperatura ambiente. Esta mezcla se centrifugó como en la
Etapa 1.
8. Cromatografía de intercambio catiónico. El pH
de la materia sobrenadante de la etapa previa se ajustó a pH 4,2 y
se introdujo en una columna CM Sepharose Fast Flow (a un volumen de
7%). Se hicieron volúmenes de 20 columnas de gradiente de sales a
NaOAc 20 mM, pH 4,2, NaCl 0 M a 1,0 M.
9. Cromatografía de interacción hidrófoba. La
reunión en CM Sepharose de las fracciones pico (determinadas a
partir de absorbancia ultravioleta) de la etapa anterior se hizo que
estuviera en sulfato de amonio 0,2 M. Se hizo un gradiente de sales
inversas de 20 volúmenes de la columna a NaOAc 5 mM, pH 4,2, con
sulfato de amonio 0,4 M a 0 M. Este material se concentró y se
diafiltró en PBS.
Fermentación de análogo de proteína OB humana
recombinante: La fermentación de las células hospedantes
anteriores para producir un análogo de proteína OB humana
recombinante (ID. SEC. nº 4) se puede realizar usando las
condiciones y las composiciones anteriormente descritas para el
material de murina recombinante.
Purificación del análogo de proteína OB
humana recombinante: El análogo de proteína humana recombinante
puede ser purificado usando métodos similares a los usados para la
purificación de la proteína de murina recombinante, como en el
Ejemplo 1 anterior. Para la precipitación del análogo de proteína OB
humana recombinante, la Etapa 8 se podría realizar ajustando el pH
de la materia sobrenadante de la Etapa 7 a pH 5,0, e introduciéndolo
en una columna de flujo rápido CM Sepharose. El gradiente de sales
de 20 volúmenes de la columna se podría realizar en NaOAc 20 mM, pH
5,5, NaCl 0 M a 0,5 M. La Etapa 9 se podría realizar diluyendo la
reunión en la columna CM Sepharose cuatro veces con agua y
ajustando el pH a 7,5. Esta mezcla podría hacerse hasta sulfato de
amonio 0,7 M. El gradiente de sales inversas de 20 volúmenes de la
columna podría hacerse en NaOAc 5 mM, pH 5,5, sulfato de amonio 0,2
M a 0 M. Por lo demás, las etapas anteriores son iguales. Para el
material del Ejemplo 2, la proteína OB humana recombinante de la
ID. SEC. nº 4 que tiene lisina 35 e isoleucina 34 se formuló en un
tampón que contenía histidina 10 mM, 4,3% de arginina, a pH 6,0.
Aunque la presente invención ha sido descrita en
términos de las realizaciones preferidas, debe entenderse que se
pueden producir variaciones y modificaciones para los expertos en la
técnica. Por lo tanto, está previsto que las reivindicaciones
anejas abarquen todas estas variaciones equivalentes que entran
dentro del alcance de la invención como es reivindicada.
Claims (2)
1. Una proteína de fusión que comprende una
proteína Fc fusionada al N terminal de una proteína OB.
2. Una proteína de fusión según la
reivindicación 1, en la que la proteína OB se selecciona entre:
(a) la secuencia de aminoácidos
1-146 que se expone en la ID. SEC. nº 2 o ID. SEC.
nº 4,
(b) la secuencia de aminoácidos
1-146 como se expone en la ID. SEC. nº 4 que tiene
un residuo de lisina en la posición 35 y un residuo de isoleucina
en la posición 74;
(c) la secuencia de aminoácidos de la subparte
(b) que tiene un aminoácido diferente sustituido en una o más de
las siguientes posiciones (usando la numeración según la ID. SEC. nº
4): 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77,
78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138,
142 y 145;
(d) la secuencia de aminoácidos de las subpartes
(a), (b) o (c) que carecen opcionalmente de un residuo de
glutaminilo en la posición 28;
(e) la secuencia de aminoácidos de las subpartes
(a), (b), (c) o (d) que tienen un residuo de metionilo en el N
terminal;
(f) una proteína de leptina truncada
seleccionada entre: (usando la numeración de la ID. SEC. nº 4 que
tienen un residuo de lisina en la posición 35 y un residuo de
isoleucina en la posición 74):
- (i)
- aminoácidos 98-146
- (ii)
- aminoácidos 1-32
- (iii)
- aminoácidos 40-116
- (iv)
- aminoácidos 1-99 y 112-146
- (v)
- aminoácidos 1-99 y 112-146 que tienen uno o más aminoácidos 100-111 secuencialmente colocados entre los aminoácidos 99 y 112;
- (vi)
- la leptina truncada de la subparte (f) (i) que tiene uno o más aminoácidos 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142, y 145 sustituidos con otro aminoácido;
- (vii)
- la leptina truncada de la subparte (f)(ii) que tiene uno o más aminoácidos 4, 8 y 32 sustituidos con otro aminoácido;
- (viii)
- la leptina truncada de la subparte (f)(iii) que tiene uno o más aminoácidos 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 y 112 sustituidos con otro aminoácido;
- (ix)
- la leptina truncada de la subparte (f)(iv) que tiene uno o más aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 y 145 sustituidos con otro aminoácido;
- (x)
- la leptina truncada de la subparte (f)(v) que tiene uno o más aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145 sustituidos con otro aminoácido;
- (xi)
- la leptina truncada de cualquiera de las subpartes (f)(i)-(x) que tiene un residuo de metionilo N-terminal.
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