ES2217327T3

ES2217327T3 - Proteina ob para aumentar la masa de tejido magro.

Info

Publication number: ES2217327T3
Application number: ES96938773T
Authority: ES
Inventors: Mary Ann Pelleymounter; Christopher Francis Toombs; Michael Benjamin Mann
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1995-11-22
Filing date: 1996-11-04
Publication date: 2004-11-01
Anticipated expiration: 2016-11-04
Also published as: WO1997018833A1; EP0956862A1; NZ527007A; MX9803992A; AU7607496A; JP2000500492A; JP4173914B2; EP0866720B1; ZA969605B; DE69631544T2; DE69638119D1; AU763755B2; IL127926A; EP0866720A1; NZ511617A; JP2002206000A; ES2339846T3; JP4227325B2; EP1285664A3; EP1285664A2

Abstract

SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS PARA UTILIZAR COMPOSICIONES DE PROTEINA OB PARA AUMENTAR LA MASA DE TEJIDO MAGRO. TAMBIEN SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS PARA UTILIZAR COMPOSICIONES DE PROTEINA OB PARA AUMENTAR LA SENSIBILIDAD A LA INSULINA, ASI COMO PARA AUMENTAR LA FUERZA CORPORAL GLOBAL Y DISMINUIR LA REABSORCION OSEA.

Description

Proteína OB para aumentar la masa de tejido magro.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de composiciones de proteínas OB para la elaboración de un medicamento para aumentar la masa de tejido magro y a un método de tratamiento cosmético aumentando la masa de tejido magro con el fin de mejorar la apariencia exterior, que comprende administrar composiciones de proteínas OB.

Antecedentes

Aunque la base molecular de la obesidad es ampliamente desconocida, la identificación del "gen OB" y la proteína codificada ("proteína OB") ha arrojado alguna luz sobre los mecanismos que el cuerpo usa para regular el depósito de la grasa corporal. Zhang et al., Nature 372: 425-432 (1994); véase también, the Correction en Nature 374: 479 (1995). La proteína OB es activa in vivo en ratones ob-mutantes ob (ratones obesos debido a un defecto en la producción del producto del gen OB) así como en ratones de tipo salvaje normales. La actividad biológica se manifiesta por sí misma, entre otras cosas, en la pérdida de peso. Véase de forma general Barinaga, "Obese" Protein Slims Mice, Science 269: 475-476 (1995).

Los otros efectos biológicos de la proteína OB no están bien caracterizados. Es conocido, por ejemplo, que en ratones ob/mutantes ob, la administración de proteína OB da lugar a una disminución de los niveles de insulina en suero y los niveles de glucosa en suero. Es conocido también que la administración de proteína OB da lugar a una disminución de la grasa corporal. Esto se observó en ratones ob/mutantes ob, así como en ratones normales no obesos. Pelleymounter et al., Science 269: 540-543 (1995); Halaas et al., Science 269: 543-546 (1995). Véase también, Campfield et al., Science 269: 546-549 (1995). (La administración periférica y central de dosis de microgramos de proteína OB redujo la ingestión de alimentos y el peso corporal de ratones obesos ob/ob e inducidos por la dieta, pero no en ratones obesos db/db. En ninguno de estos informes se observaron toxicidades, incluso a las dosis más elevadas.

La dilucidación de otros efectos biológicos de la proteína OB, particularmente sobre animales que pueden no sacar provecho o pueden no necesitar una reducción de peso, proporcionará usos adicionales para la proteína OB.

Uno de estos usos, proporcionado por la presente invención, es el aumento de la masa de tejido magro.

Naturalmente, la modulación de la dieta y el ejercicio es una forma de aumentar el tamaño muscular. Hay también composiciones usadas para aumentar la masa magra. Las composiciones actuales que se cree que aumentan la masa de tejido magro incluyen esteroides anabolizantes, como testosterona y sus derivados, y la hormona del crecimiento humano. Sin embargo, estas se aprecia que tienen efectos secundarios indeseables. (El resumen siguiente está completamente explicado en la publicación Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) Capítulo 50, en páginas 948-1001)).

La hormona del crecimiento humano, como Protropina y Somatropina se aprecia que provocan frecuentemente hipercalciuria, que habitualmente cede en 2 a 3 meses. Se aprecia que se producen también hiperglicemia y diabetes mellitus abierta. Se aprecia que la mialgia y los dolores de cabeza por la mañana temprano son relativamente frecuentes y, ocasionalmente, se pueden producir casos de hipertiroidismo y supersaturación de colesterol en la bilis. Si las epífisis están cerradas, la hormona no debe ser usada porque la estimulación continuada del crecimiento de las falanges y las mandíbulas, pero no de otros huesos, puede provocar proporciones corporales anormales.

Los esteroides anabolizantes aumentan el rendimiento atlético y la agresividad. Su uso ha sido condenado por el Colegio Americano de Medicina Deportiva. El rendimiento en mujeres es aumentado, pero a costa de una virilización y acné vulgaris. Los andrógenos provocan hirsutismo, gravedad o ronquera de la voz, pubertad precoz y cierre epifiseal en machos inmaduros, líbido aumentada (tanto en machos como en hembras), priapismo, oligospermia y atrofia testicular, engrosamiento del clítoris en mujeres, sofocos, disminución del volumen de eyaculación y población de esperma, ginocomastia, hipersensibilidad, acné, ganancia de peso, edema e hipercalcemia. El uso prolongado aumenta la agresividad, a veces enormemente, y se ha establecido que muchos asaltos son atribuibles a un abuso de andrógenos. Se han descrito también comportamientos de tipo paranoico y otros psicóticos. Se producen estasis biliar e ictericia. Ha habido unos pocos casos descritos de hepatoma a continuación de una terapia a largo plazo.

Por lo tanto, es deseable tener una composición terapéutica o cosmética que aumente la masa de tejido magro sin los efectos secundarios observados en los fármacos actualmente disponibles.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en la observación de que la administración de proteína OB a animales tanto obesos como no obesos da lugar a un aumento de la masa de tejido magro. Por tanto, la proteína OB tiene la capacidad de actuar, además de la actuación como un agente para reducir peso, como un agente que afecte a la masa de tejido magro. Como tales, están contempladas numerosas terapias que aumentan la masa de tejido magro, incluso para pacientes que no necesariamente se aprovecharían de una reducción de peso. Por tanto, un aspecto de la presente invención es el uso de proteína OB (o análogos o derivados de la misma) para la elaboración de un medicamento para aumentar la masa de tejido magro, o un tratamiento cosmético aumentando la masa de tejido magro con el fin de mejorar la apariencia exterior.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a la reducción de los niveles de insulina necesarios para el tratamiento de la diabetes. El aumento de la masa de tejido magro, con la disminución consecuente de la masa de tejido graso, aumenta la sensibilidad a la insulina. Por lo tanto, la presente invención se refiere al uso de la proteína OB (o análogos o derivados de la misma) para disminuir la cantidad de insulina necesaria para el tratamiento de la diabetes.

Descripción detallada

Como se estableció anteriormente, los usos de la presente invención son los que aumentan la masa de tejido magro en un individuo. Este aumento en la masa de tejido magro se ha observado que está acompañado de una disminución en la masa de grasa. Por tanto, incluso si la administración de proteína OB (o análogos o derivados de la misma) no da lugar a una cantidad deseada de pérdida de peso, la administración de proteína OB puede ser útil para reconfigurar la masa corporal reduciendo la grasa corporal, mientras aumenta la masa magra.

Adicionalmente, el aumento en la masa de tejido magro puede hacer que un individuo sea más sensible a la insulina y, por tanto, el presente uso de la proteína OB (o sus análogos o derivados) está relacionado también con un aumento de la sensibilidad a la insulina en un paciente diabético. Aunque el modo preciso de acción es incierto, el tejido magro (por ejemplo, músculos), en comparación con el tejido graso, puede ser más sensible a los efectos de la insulina. Por lo tanto, un aumento del tejido magro puede hacer que haya más células disponibles que sean sensibles a la insulina. Adicionalmente, la eliminación del tejido graso (por ejemplo, adiposo) puede tener la ventaja adicional de proporcionar un tejido magro con una exposición adicional a la circulación periférica, en la que se encuentra la insulina en circulación. Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención es que se proporciona un método para aumentar la sensibilidad a la insulina. Dicho de otro modo, se proporciona por tanto también un método para disminuir la dosificación de insulina necesaria para un diabético.

El aumento en el tejido magro puede ser un aumento en el tejido muscular. Este aumento se observa que es un aumento global, en lugar de localizado a áreas particulares (por ejemplo, Ejemplo 1 y 2 siguientes). Como tal, puede aumentar la resistencia global. Con un aumento de la resistencia global resultan otras ventajas, como una disminución en la resorción ósea, con la capacidad potencial de invertir o mejorar la fragilidad como la osteoporosis. En pacientes que desean un rendimiento atlético mejorado, se puede proporcionar también un aumento de la resistencia global como tal. Puede haber un aumento en la producción de glóbulos rojos o de la eficacia, y un aumento de la sangre oxigenada. Como tal, puede ser mejorado también el rendimiento tanto mental como físico.

La proteína OB puede ser seleccionada entre la murina recombinante expuesta a continuación (ID. SEC. nº 2) o una proteína humana recombinante como se expone por Zhang et al., Nature, supra, incorporada como referencia a la presente memoria descriptiva, o las que carecen de un residuo de glutaminilo en la posición 28. (Zhang et al, Nature, supra, en página 428). Se puede usar también la proteína OB humana recombinante análoga a la expuesta en la ID. SEC. nº 4, que contiene 1) una arginina en lugar de lisina en la posición 35 y 2) una leucina en lugar de isoleucina en la posición 74. (Una abreviatura corta para este análogo es el humano recombinante R->K^{35}, L->I^{74}). Las secuencias de aminoácidos para el análogo humano recombinante y las proteínas de murinas recombinantes se exponen a continuación con un residuo de metionilo en la posición -1, sin embargo, como con cualquiera de las proteínas OB y análogos presentes, el residuo de metionilo puede estar ausente.

La proteína de murina es habitualmente homóloga respecto a la proteína humana, particularmente en forma de una proteína madura y, adicionalmente, particularmente en el N terminal. Se puede preparar un análogo de la proteína humana recombinante alterando (como sustituyendo residuos de aminoácidos) en la secuencia humana recombinante los aminoácidos que se apartan de la secuencia de murina. Como la proteína humana recombinante tiene actividad biológica en ratones, este análogo probablemente sería activo en seres humanos. Por ejemplo, usando una proteína humana que tenga una lisina en el residuo 35 y una isoleucina en el residuo 74 según la numeración de la ID. SEC. nº 4, en la que el primer aminoácido es valina, y el aminoácido en la posición 146 es cisteina, se puede sustituir con otro aminoácido uno o más de los aminoácidos en las posiciones 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145. Se puede seleccionar el aminoácido en la correspondiente posición de la proteína de murina (SEC. OD. nº 2) u otro aminoácido.

Se pueden preparar adicionalmente moléculas de "consenso" basadas en la secuencia de proteínas OB de rata. Murakami et al., Biochem.Biophys.Res. Comm. 209: 944-952 (1995), incorporada como referencia a la presente memoria descriptiva. La proteína OB de rata difiere de la proteína OB humana en las siguientes posiciones (usando la numeración de la ID. SEC. nº 4): 4, 32, 33, 35, 50, 68, 71, 74, 71, 78, 89, 97 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138 y 145. Se puede sustituir con otro aminoácido uno o más de los aminoácidos en estas posiciones divergentes. Las posiciones en impresión en negrita son las que en la proteína OB de murina así como en la proteína OB de rata son divergentes de la proteína OB humana y, por tanto, son particularmente adecuadas para una alteración. En una o más de estas posiciones, se puede sustituir un aminoácido de la correspondiente proteína OB de rata, u otro aminoácido.

Las posiciones de la proteína OB tanto de rata como murina que divergen de la proteína OB humana madura son: 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145. Una proteína OB humana según la ID. SEC. nº 4 (con lisina en la posición 35 e isoleucina en la posición 74) que tenga uno o más de los aminoácidos anteriores suprimidos o sustituidos con otro aminoácido, como el aminoácido encontrado en la correspondiente secuencia de rata o murina, puede ser también efectiva.

Además, los aminoácidos encontrados en la proteína OB de mono rhesus que divergen de la proteína OB humana madura son (con las identidades indicadas entre paréntesis en la abreviatura de aminoácidos de una letra): 8 (S), 35 (R), 48(V), 53(Q), 60(I), 66(I), 67(N), 68((L), 89(L), 100(L), 108(E), 112 (D) y 118 (L). Debido a que (como se describe en el Ejemplo 2 posterior) la proteína OB humana recombinante es activa en monos cynomolgus, una proteína OB humana según la ID. SEC. nº 4 (con lisina en la posición 35 e isoleucina en la posición 74) que tenga uno o más aminoácidos divergentes de mono rhesus sustituidos con otro aminoácido, como los aminoácidos entre paréntesis, puede ser efectiva. Debe apreciarse que ciertos aminoácidos divergentes de rhesus son los encontrados en las especies murinas anteriores (posiciones 35, 68, 89, 100 y 112). Por tanto, se puede preparar una molécula de consenso murina/rhesus/humana que tenga (usando la numeración de la SEC. OD. nº 4 que tiene una lisina en la posición 35 y una isoleucina en la posición 74) uno o más aminoácidos en las posiciones sustituidos con otro aminoácido: 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145.

Otros análogos pueden ser preparados suprimiendo una parte de la secuencia de aminoácidos de la proteína. Por ejemplo, la proteína madura carece de una secuencia líder (-22 a -1). Se pueden preparar las siguientes formas truncadas de moléculas de proteínas OB humanas (usando la numeración de la ID. SEC. nº 4):

(a) aminoácidos 98-146

(b) aminoácidos 1-32

(c) aminoácidos 40-116

(d) aminoácidos 1-99 y (conectados a) 112-146

(e) aminoácidos 1-99 y (conectados a) 112-146 que tienen uno o más de los aminoácidos 100-111 colocados entre los aminoácidos 99 y 112.

Además, las formas truncadas pueden tener también alterados uno o más de los aminoácidos que son divergentes (en la proteína OB de rhesus, rata o murina) de la proteína OB humana. Además de ello, cualquiera de las alteraciones puede estar en la forma de aminoácidos alterados, como peptidomiméticos o D-aminoácidos.

La presente proteína (en la presente memoria descriptiva el término "proteína" se usa para incluir "péptido" y análogos de OB, como los citados con posterioridad, salvo que se indique otra cosa) puede hacerse derivar también mediante la unión de uno o más restos químicos al resto de la proteína. Los derivados químicamente modificados pueden ser adicionalmente formulados para una administración intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intravenosa, oral, nasal, pulmonar, tópica u otras vías. La modificación química de las proteínas biológicamente activas se ha encontrado que proporciona ventajas adicionales bajo ciertas circunstancias, tal como aumentando la estabilidad y el tiempo de circulación de la proteína terapéutica y disminuyendo la inmunogenicidad. Véase la patente de EE.UU. nº 4.179.337, de Davis et al., publicada el 18 de Diciembre de 1979. Para un examen, véase Abuchowski et al., en Enzymes as Drugs. (J.S. Holcerberg and J. Roberts, eds. pag. 367-383 (1981)). Un artículo de examen que describe la modificación de proteínas y proteínas de fusión es Francis, Focus on Growth Factors 3: 4-10 (mayo de 1992) (publicado por Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20, OLD, Reino Unido).

Los restos químicos adecuados para la derivación pueden ser seleccionados entre diversos polímeros solubles en agua. El polímero seleccionado debe ser soluble en agua con el fin de que la proteína a la que está unido no precipite en un entorno acuoso, como un entorno fisiológico. Preferentemente, para un uso terapéutico de la preparación del producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable. Un experto en la técnica será capaz de seleccionar el polímero deseado basándose en consideraciones como si el conjugado de polímero/proteína será usado terapéuticamente, y si es así, la dosificación deseada, tiempo de circulación, resistencia a la proteolisis y otras consideraciones. Para las presentes proteínas y péptidos, la eficacia de la derivación puede ser determinada administrando el derivado, en la forma deseada (es decir, mediante bomba osmótica o, más preferentemente, por inyección o infusión o adicionalmente formulado para un suministro oral, pulmonar o nasal, por ejemplo) y observando los efectos biológicos como se describe en la presente memoria descriptiva.

El polímero soluble en agua puede ser seleccionado entre el grupo que consiste, por ejemplo, en polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros al azar o no al azar) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona) polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno/óxido de etileno), polioles polioxietilados, poli(maleato de estireno) y poli(alcohol vinílico). El polietilenglicol-propionaldehído puede tener ventajas de fabricación debido a su estabilidad en agua.

Las proteínas de fusión pueden ser preparadas uniendo poliaminoácidos al resto de proteína OB (o análogo). Por ejemplo, el poliaminoácido puede ser una proteína portadora que sirva para aumentar la vida media en circulación de la proteína. Para los presentes fines terapéuticos o cosméticos, este poliaminoácido debe ser de los que no hayan creado una respuesta antígena neutralizante u otra respuesta adversa. Este poliaminoácido puede ser seleccionado entre el grupo que consiste en albúmina de suero (como albúmina de suero humano) o un anticuerpo o parte de la misma (como una región constante de anticuerpo, denominada a veces "Fc") u otros poliaminoácidos. Como se indica con posterioridad, la colocación de la unión del poliaminoácido puede estar en el N terminal del resto de la proteína OB, u otro lugar, y puede estar conectada también mediante un resto "conector" químico a la proteína OB.

El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o sin ramificar. Para polietilenglicol, el peso molecular preferido es entre aproximadamente 12 kDa y aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" indica que en las preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más y otras menos que el peso molecular establecido) para mayor facilidad en el manejo y elaboración. Pueden ser usados otros tamaños, dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de la liberación sostenida deseada, los efectos, si los hay sobre la actividad biológica, la facilidad de manejo, el grado o carencia de antigenicidad y otros efectos conocidos del polietilenglicol para una proteína terapéutica o análogo).

El número de moléculas de polímero así unidas puede variar, y un experto en la técnica será capaz de determinar el efecto o función. Se puede mono-derivar o se puede proporcionar una di-, tri- o tetra-derivación o alguna combinación, con el mismo o diferentes restos químicos (por ejemplo, polímeros como diferentes pesos de polietilenglicoles). La proporción de moléculas de polímero a moléculas de proteína (o péptido) variará, como lo harán sus concentraciones en la mezcla de reacción. En general, la relación óptima (en términos de eficacia de la reacción en cuanto a que no haya un exceso de proteína o polímero sin reaccionar) será determinada por factores como el grado deseado de derivación (por ejemplo, mono-, di-, tri-, etc.), el peso molecular el polímero seleccionado, si el polímero es ramificado o sin ramificar y las condiciones de la reacción.

Los restos químicos deben estar unidos a la proteína considerando los efectos sobre los dominios funcionales o antígenos de la proteína. Hay un cierto número de métodos de unión disponible para los expertos en la técnica, por ejemplo, el documento EP 0.401.384, incorporado como referencia a la presente memoria descriptiva (acoplamiento de PEG a G-CSF), véase también Malik et al., Exp. Hematol. 20: 1028-1035 (1992) (que describe la pegilación de GM-CSF usando cloruro de tresilo). Por ejemplo, el polietilenglicol puede ser covalentemente unido a través de residuos de aminoácidos a través de un grupo reactivo, como un grupo amino o carboxilo libre. Los grupos reactivos son aquellos a los que puede estar unida una molécula activada de polietilenglicol. Los residuos de aminoácidos que tienen un grupo amino libre pueden incluir residuos de lisina y el residuo del aminoácido N-terminal. Los que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir residuos de ácido aspártico, residuos de ácido glutámico y el residuo de aminoácido del C- terminal. Se pueden usar también grupos sulfhidrilo como un grupo reactivo para unir el (o las) molécula(s) de polietilenglicol. Es preferido para fines terapéuticos la unión en un grupo amino, como la unión en el grupo N terminal o lisino. El enlace en los residuos importantes para la unión de receptores debe ser evitado si se desea la unión de receptores.

Se puede desear específicamente una proteína químicamente modificada en el N terminal. Usando polietilenglicol como una ilustración de las presentes composiciones, se puede seleccionar diversidad de moléculas de polietilenglicoles (por peso molecular, ramificación, etc.), la proporción de moléculas de polietilenglicol a moléculas de proteína en la mezcla de reacción, el tipo de reacción de pegilación que va a ser realizada y el método para obtener la proteína pegilada en el N terminal seleccionada. El método de obtención de la preparación pegilada en el N terminal (es decir, la separación de este resto de otros restos monopegilados si es necesario) puede ser por purificación del material pegilado en el N terminal a partir de una población de moléculas de proteínas pegiladas. La modificación química en el N terminal selectiva puede ser realizada mediante alquilación reductora que explota la reactividad diferencial de los diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina frente al N terminal) disponibles para la derivación en una proteína particular. Bajo las condiciones de reacción apropiadas, se consigue la derivación sustancialmente selectiva de la proteína en el N terminal con un polímero que contiene un grupo carbonilo. Por ejemplo, se puede pegilar selectivamente en el N terminal la proteína realizando la reacción a un pH que permita aprovechar las diferencias de pKa entre el grupo \varepsilon-amino de los residuos de lisina y la del grupo \alpha-amino del residuo N-terminal de la proteína. Mediante esta derivación selectiva, se controla la unión de un polímero soluble en agua a una proteína: la conjugación con el polímero tiene lugar predominantemente en el N terminal de la proteína y nos e produce ninguna modificación significativa de otros grupos reactivos, como los grupos amino de las cadenas laterales de lisinia. Usando una alquilación reductora, el polímero soluble en agua puede ser del tipo anteriormente descrito, y debe tener un único aldehído reactivo para el acoplamiento a la proteína. Puede ser usado un polietilenglicol-propionaldehído que contenga un único aldehído reactivo.

Un derivado monopegilado en el N terminal es preferido por la facilidad en la producción de un producto terapéutico. La pegilación en el N terminal asegura un producto homogéneo ya que la caracterización del producto es simplificada con relación a productos di-, tri- u otros multi-pegilados. El uso del procedimiento de alquilación reductora anterior para la preparación de un producto N-terminal es preferido por la facilidad de la fabricación comercial.

Todavía, en otro aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos para usar composiciones farmacéuticas de proteínas y derivados. Estas composiciones farmacéuticas pueden ser para una administración por inyección o para una administración oral, pulmonar, nasal, transdermal u otras formas. En general, están abarcadas por la invención las composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades eficaces de proteína o productos derivados de la invención junto con diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Estas composiciones incluyen diluyentes de diverso contenido de tampones (Por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y resistencia iónica; aditivos como detergentes ya gentes solubilizantes (por ejemplo, Tween 80, polisorbato 80), anti-oxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), conservantes (por ejemplo, Thimersol, alcohol bencílico) y sustancias espesantes (por ejemplo, lactosa o manitol); la incorporación del material en preparaciones en forma de partículas de compuestos polímeros como poli(ácido acético), poli(ácido glicólico), etc. o en liposomas. Se puede usar también hilaurónico, y este puede tener el efecto de favorecer una duración sostenida en la circulación. Estas composiciones pueden tener una influencia sobre el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de desaparición in vivo en las presentes proteínas y derivados. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712, que se incorpora como referencia a la presente memoria descriptiva. Las composiciones pueden ser preparadas en forma líquida, o pueden estar en un polvo seco, como en forma liofilizada. Están contempladas también las formulaciones de duración sostenida implantables, como son las formulaciones transdermales.

Están contempladas para ser usadas en la presente invención las formas de dosificación oral sólidas, que se describen de forma general en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton PA 18042), en el capítulo 89, que se incorpora como referencia a la presente memoria descriptiva. Las formas de dosificación sólidas incluyen comprimidos, cápsulas, píldoras, pastillas, sellos o granulados. También, se puede usar una encapsulación liposomal o proteinoide para formular las presentes composiciones (como, por ejemplo, las microesferas proteinoides descritas en la patente de EE.UU. nº 4.925.673). Puede ser usada la encapsulación liposomal y los liposomas pueden hacerse derivar con diversos polímeros (por ejemplo, patente de EE.UU. nº 5.013.556). Una descripción de posibles formas de dosificación sólidas para el producto terapéutico se proporciona por Marshall, K. en: Modern Pharmaceutics editado por G.S. Banker y C.T. Rhodes capítulo 10, 1979, que se incorpora como referencia a la presente memoria descriptiva. En general, la formulación incluirá la proteína (o análogo o derivado), e ingredientes inertes que permitan una protección contra el entorno del estómago, y liberen el material biológicamente activo en el intestino.

También están específicamente contempladas las formas de dosificación oral de las proteínas derivadas anteriores. La proteína puede ser químicamente modificada de forma que el suministro oral del derivado sea eficaz. Generalmente, la modificación química contemplada es la unión de al menos un resto a la propia molécula de proteína (o péptido), en el que dicho resto permite (a) la inhibición de la proteolisis; y (b) la absorción en la corriente sanguínea desde el estómago o el intestino. Es deseado también el aumento de la estabilidad global de la proteína y un aumento en el tiempo de circulación en el cuerpo. Ejemplos de estos restos incluyen: polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, carboximetil-celulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona y poliprolina. Abuchowski and Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts.In: "Enzymes as Drugs", Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, (1981), pp 367-383; Newmark, et al., J. Appl. Biochem. 4: 185-189 (1982). Otros polímeros que pueden ser usados son poli-1,3 -dioxolano y poli-1,3,6-tioxocano.

Para la proteína (o derivado) la ubicación de la liberación puede ser el estómago, el intestino delgado (el duodeno, yeyuno o íleon) o el intestino grueso. Un experto en la técnica tiene formulaciones disponibles que no se disuelven en el estómago, y sin embargo liberan el material en el duodeno en algún otro lugar en el intestino. Preferentemente, la liberación evitará los efectos perjudiciales del entorno del estómago, ya sea mediante la protección de la proteína (o derivado) o mediante la liberación del material biológicamente activo más allá del entorno del estómago, como en el intestino.

Para asegurar una completa resistencia gástrica, es esencial un revestimiento impermeable hasta al menos un pH de 5,0. Ejemplos de los ingredientes inertes más comunes que son usados como revestimientos entéricos son acetato-trimelitato de celulosa (CAT), ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, poli(acetato-ftalato de vinilo) (PVAP), Eudragit L30D, Aquacteric, acetato-ftalato de celulosa (CAP), Eudragit L, Eudragit S y Shellac. Estos revestimientos pueden ser usados en forma de películas mixtas.

Un revestimiento o mezcla de revestimientos puede ser usado también en comprimidos, que no estén destinados a la protección contra el estómago. Esto puede incluir revestimientos de azúcares o revestimientos que hagan el comprimido más fácil de tragar. Las cápsulas pueden consistir en una envoltura dura (como gelatina) para el suministro del producto terapéutico seco, es decir, el polvo; para formas líquidas, se puede usar una envoltura de gelatina blanda. El material de la envoltura para los sellos puede ser almidón espeso u otro papel comestible. Para píldoras, pastillas, comprimidos moldeados o triturados de comprimidos, se pueden usar técnicas de amasamiento en húmedo.

El producto terapéutico puede ser incluido en la formulación como multipartículas finas en la forma de gránulos o granulaciones con un tamaño de partículas de aproximadamente 1 mm. La formulación del material para una administración en cápsulas puede ser también en forma de un polvo, aglomerados ligeramente comprimidos o incluso como comprimidos. El producto terapéutico puede ser preparado por compresión.

Los agentes colorantes y de sabores pueden ser todos incluidos. Por ejemplo, la proteína (o derivado) puede ser formulada (como mediante encapsulación en liposomas o microesferas) y seguidamente puede ser adicionalmente contenida en un producto comestible, como una bebida refrescante que contenga colorantes y agentes de sabores.

Se puede diluir o aumentar el volumen del producto terapéutico con un material inerte. Estos diluyentes pueden incluir carbohidratos, especialmente manitol, \alpha-lactosa, lactosa anhidra, celulosa, sacarosa, dextranos modificados y almidón. Se pueden usar también ciertas sales inorgánicas como materiales de carga que incluyen trifosfato de calcio, carbonato de magnesio y cloruro de sodio. Algunos diluyentes disponibles en el comercio son Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress y Avicell.

Pueden ser incluidos disgregantes en la formulación del producto terapéutico como una forma de dosificación sólida. Los materiales usados como disgregantes incluyen, pero sin limitación, almidón que incluye el disgregante comercial basado en almidón, Explotab. El almidón-glicolato de sodio, Amberlite, carboximetilcelulosa de sodio, ultramilopectina, alginato de sodio, gelatina, cáscara de naranja, carboximetil-celulosa ácida, esponja natural y bentonita pueden ser todos usados. Otra forma de los disgregantes son las resinas de intercambio catiónico insolubles. Pueden ser usadas gomas en polvo como disgregantes y como aglutinantes y estas pueden incluir gomas en polvo como agar, Karaya o tragacanto. El ácido algínico y su sal de sodio son también útiles como disgregantes.

Pueden ser usados aglutinantes para mantener el agente terapéutico conjuntamente para formar un comprimido duro e incluyen materiales de productos naturales como goma arábiga, tragacanto, almidón y gelatina. Otros incluyen metil-celulosa (MC), etil-celulosa (EC) y carboximetil-celulosa (CMC). La polivinilpirrolidona (PVP) y la hidroxipropilmetil-celulosa (HPMC) pueden ser usadas ambas en soluciones alcohólicas para granular el producto terapéutico.

Puede ser incluido un agente anti-rozamiento en la formulación del producto terapéutico para evitar el apelmazamiento durante el procedimiento de formulación. Pueden ser usados lubricantes en forma de una capa entre el producto terapéutico y la pared de la matriz, y estos pueden incluir, pero sin limitación, ácido esteárico, incluidas sus sales de magnesio y calcio, politetrafluoroetileno (PTFE), parafina líquida, aceites vegetales y ceras. Pueden ser usados también lubricantes solubles como lauril-sulfato de sodio, lauril-sulfato de magnesio, polietilenglicol de diversos pesos moleculares, Carbowax 4000 y 6000.

Los adyuvantes de flujo pueden mejorar las propiedades del flujo del fármaco durante la formulación y pueden ser añadidos para ayudar al reagrupamiento durante la compresión. Los adyuvantes de flujo pueden incluir almidón, talco, sílice pirógena y silicoaluminato hidratado.

Para ayudar a la disolución del producto terapéutico en el entorno acuoso puede ser añadido un tensioactivo como un agente humectante. Los tensioactivos pueden incluir detergentes aniónicos como lauril-sulfato de sodio, dioctil -sulfosuccinato de sodio y dioctil-sulfonato de sodio. Puede ser usados detergentes catiónicos y podrían incluir cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio. La lista de detergentes no iónicos potenciales que podrían ser incluidos en la formulación como tensioactivos son lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, polioxietileno-aceite de ricino hidrogenado 10, 50 y 60, monoestearato-polisorbato de glicerol 40, 60, 65 y 80, éster de ácido graso de sacarosa, metil-celulosa y carboximetil-celulosa. Estos tensioactivos podrían estar presentes en la formulación de la proteína o derivado solos o bien como una mezcla en diferentes relaciones.

Los aditivos que aumentan potencialmente la absorción de la proteína (o derivado) son, por ejemplo, los ácidos grasos ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico.

Puede ser deseable una formulación de liberación controlada. El fármaco podría ser incorporado en una matriz inerte que permita la liberación por mecanismos de difusión o bien de lixiviación, es decir, gomas. Pueden ser incorporadas también matrices de degeneración lenta en la formulación. Otra forma de una liberación controlada de este producto terapéutico es mediante un método basado en el sistema terapéutico de Oros (Alza Corp.), es decir, el fármaco está incluido en una membrana semipermeable que permite que entre agua y expulsa fármaco a través de una única abertura pequeña debido a efectos osmóticos. Algunos revestimientos entéricos pueden tener también un efecto de liberación retardada.

Se pueden usar otros revestimientos para la formulación. Estos incluyen una diversidad de azúcares que podían ser aplicados en una bandeja de revestimiento. El agente terapéutico podría ser proporcionado también en un comprimido revestido con películas y los materiales usados en este caso se dividen en dos grupos. El primero está constituido por materiales no entéricos e incluyen metil-celulosa, etil-celulosa, hidroxietil-celulosa, metilhidroxietil -celulosa, hidroxipropil-celulosa, hidroxipropil-metil-celulosa, carboximetil-celulosa de sodio, povidona y polietilenglicoles. El segundo grupo consiste en los materiales entéricos que son comúnmente ésteres de ácido ftálico.

Puede ser usada una mezcla de materiales para proporcionar el revestimiento de película óptimo. El revestimiento de película se puede llevar a cabo en un dispositivo de revestimiento de bandeja o en un lecho fluidizado o mediante revestimiento por compresión.

También está contemplado en la presente memoria descriptiva un suministro pulmonar de la presente invención, o un derivado del mismo. La proteína (derivado) es suministrada a los pulmones de un mamífero mientras la inhala y atraviesa el recubrimiento epitelial de los pulmones hasta la corriente sanguínea. (Otros informes sobre esto incluyen Adjei et al., Pharmaceutical Research 7: 565-569 (1990); Adjei et al., International Journal of Pharnaceutics 63: 135-144 (1990) (acetato de leuprolida); Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology 13 (suppl. 5): s. 143-146 (1989)(endotelina-1); Hubbard et al., Annals of Internal Medicine 3: 206-212 (1989)(\alpha-1-antitripsina); Smith et al., J. Clin.Invest. 84: 1145-1146 (1989) (\alpha-1-proteinasa); Oswein et al., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, Marzo de 1990 (hormona del crecimiento humano recombinante); Debs et al., The Journal of Immunology 140: 3482-3488 (1988) (interferón-\gamma y factor alfa de necrosis tumoral) y Platz et al., patente de EE.UU. nº 5.284.656 (factor estimulador de colonias de granulocitos).

Está contemplada para ser usada en la práctica de esta invención una amplia gama de dispositivos mecánicos diseñados para el suministro pulmonar de productos terapéuticos que incluyen, pero sin limitación, nebulizadores, inhaladores de dosis medidas e inhaladores de polvos, todos los cuales son familiares para los expertos en la técnica.

Algunos ejemplos específicos de dispositivos disponibles en el comercio adecuados para la práctica de esta invención son el nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri, el nebulizador Acorn II, fabricado por Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; el inhalador de dosis medidas Ventolin, fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina, y el inhalador de polvos Spinhaler, fabricado por Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Todos estos dispositivos requieren el uso de formulaciones adecuadas para el suministro de una proteína (o análogo o derivado). Normalmente, cada formulación es específica para el tipo de dispositivo empleado y puede incluir el uso de un material propelente apropiado, además de diluyentes, adyuvantes y/o vehículos útiles en terapia.

La proteína (o derivado) debe ser preparada lo más ventajosamente en forma de partículas con un tamaño medio de partículas de menos de 10 \mum (o micrómetros), lo más preferentemente 0,5 a 5 \mum, para un suministro lo más eficaz al pulmón distal.

Los vehículos incluyen carbohidratos como trehalosa, manitol, xilitol, sacarosa, lactosa y sorbitol. Otros ingredientes para ser usados en las formulaciones pueden incluir DPPC, DOPE, DSPC y DOPC. Pueden ser usados tensioactivos naturales o sintéticos. Puede ser usado polietilenglicol (incluso aparte de su uso en la derivación de la proteína o análogo). Pueden ser usados dextranos, como ciclodextrano. Pueden ser usadas sales biliares y otros mejoradores relacionados. Pueden ser usados celulosa y derivados de celulosa. Pueden ser usados aminoácidos, como se usan en una formulación tamponante.

También, está contemplado el uso de liposomas, microcápsulas o microesferas, complejos de inclusión u otros tipos de vehículos.

Las formulaciones adecuadas para ser usadas con un nebulizador, ya sea de chorro o ultrasónico, comprenderán normalmente la proteína (o derivado) disuelta en agua a una concentración de aproximadamente 0,1 a 25 mg de proteína biológicamente activa por ml de solución. La formulación puede incluir también un tampón y un azúcar sencillo (por ejemplo, para la estabilización de la proteína y la regulación de la presión osmótica). La formulación del nebulizador puede contener también un tensioactivo, para reducir o evitar la agregación inducida en la superficie de la proteína provocada por la atomización de la solución en la formación del aerosol.

Las formulaciones para ser usadas con un dispositivo inhalador de dosis medidas comprenderán generalmente un polvo finamente dividido que contiene la proteína (o derivado) puesta en suspensión en un propelente con la ayuda de un tensioactivo. El propelente puede ser cualquier material convencional empleado para estos fines, como un clorofluorocarburo, un hidroclorofluorocarburo, un hidrofluorocarburo o un hidrocarburo, que incluyen triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano, o sus combinaciones. Los tensioactivos adecuados incluyen trioleato de sorbitan y lecitina de soja. Puede ser útil también como tensioactivo el ácido oleico.

Las formulaciones para un suministro desde un dispositivo inhalador de polvos comprenderán un polvo seco finamente dividido que contiene proteína (o derivado) y puede incluir también un agente espesante como lactosa, sorbitol, sacarosa, manitol, trealosa o xilitol en cantidades que faciliten la dispersión del polvo desde el dispositivo, por ejemplo, 50 a 90% en peso de la formulación.

Está contemplado también el suministro nasal de la proteína (o análogo o derivado). El suministro nasal permite el paso de la proteína a la corriente sanguínea directamente después de administrar el producto terapéutico a la nariz, sin necesidad de un depósito del producto en el pulmón. Las formulaciones para un suministro nasal incluyen las de dextrano y ciclodextrano. Está contemplado también el suministro mediante el transporte a través de otras membranas mucosas.

Un experto en la técnica será capaz de determinar las dosificaciones eficaces mediante la administración y observación del efecto terapéutico deseado. Preferentemente, la formulación de la molécula será tal que entre aproximadamente 10 \mug/kg/día y 10 mg/kg/día producirán el efecto terapéutico deseado. Las dosificaciones eficaces pueden ser determinadas usando herramientas de diagnóstico a lo largo del tiempo. Por ejemplo, un diagnóstico para medir la cantidad de proteína OB en la sangre (o plasma o suero) puede ser usado en primer lugar para determinar los niveles endógenos de proteína OB. Esta herramienta de diagnóstico puede estar en la forma de un ensayo de anticuerpos, como un ensayo de emparedado de anticuerpos. La cantidad de proteína OB endógena es cuantificada inicialmente, y se determina una línea de base. Las dosificaciones terapéuticas son determinadas a medida que la cuantificación de proteína OB endógena y exógena (es decir, proteína, análogo o derivado encontrados en el cuerpo, ya sean auto-producidos o administrados) se continúa durante el transcurso de la terapia. Por lo tanto, las dosificaciones pueden variar durante el transcurso de la terapia, siendo usada inicialmente una dosificación relativamente elevada, hasta que se observa una ventaja terapéutica, y se usan dosificaciones inferiores para mantener las ventajas terapéuticas.

Idealmente, en situaciones en las que solamente se desea un aumento de la masa corporal magra, la dosificación será insuficiente para da lugar a una pérdida de peso. Por tanto, durante un transcurso inicial de la terapia de una persona obesa, pueden ser administradas dosificaciones mediante las cuales se consiga una pérdida de peso y una disminución de tejidos grasos/aumento de masa magra simultáneos. Una vez que se consigue una pérdida de peso suficiente, puede ser administrada una dosificación suficiente para evitar una nueva ganancia de peso, y sin embargo suficiente para mantener el aumento deseado de la masa magra (o la prevención del agotamiento de la masa magra). Estas dosificaciones pueden ser determinadas empíricamente, y los efectos de la proteína OB son reversibles. Por ejemplo, Campfield et al., Science 269: 546-549 (1995) en 547. Por tanto, si se observa una dosificación que da lugar a una pérdida de peso cuando no es deseada la pérdida de peso, se administraría una dosis inferior con el fin de conseguir el aumento deseado en la masa de tejidos magros, manteniendo sin embargo el peso deseado.

Para aumentar la sensibilidad de un individuo a la insulina, se pueden tener en cuenta consideraciones similares para las dosificaciones. Se puede conseguir un aumento de la masa magra sin pérdida de peso suficiente para disminuir la cantidad de insulina (o, potencialmente, anilina u otros fármacos para tratar la diabetes potencial) que habría que administrar a un individuo para el tratamiento de la diabetes.

Para aumentar la resistencia global, se pueden hacer consideraciones similares para la dosificación. El aumento de la masa magra con un aumento simultáneo de la resistencia global se puede conseguir con dosis insuficientes para dar lugar a una pérdida de peso. Se pueden conseguir también otras ventajas, como un aumento de los glóbulos rojos (y oxigenación de la sangre) y una disminución de la resorción ósea u osteoporosis en ausencia de pérdida de peso.

Los presentes métodos pueden ser usados conjuntamente con otros medicamentos, como los que son útiles para el tratamiento de la diabetes (por ejemplo, insulina y posiblemente anilina), colesterol y medicamentos para rebajar la presión sanguínea (como los que reducen los niveles de lípidos en sangre u otros medicamentos cardiovasculares) y medicamentos para aumentar la actividad (por ejemplo, anfetaminas). Se pueden usar también supresores del apetito. Esta administración puede ser simultánea o puede ser en serie.

Además, los presentes métodos pueden ser usados conjuntamente con procedimientos quirúrgicos, como cirugías estéticas destinadas a alterar la apariencia global de un cuerpo (por ejemplo, liposucción o cirugías con láser diseñadas para reducir la masa corporal o cirugías de implante diseñadas para aumentar la apariencia de la masa corporal). Las ventajas sanitarias de las cirugías cardíacas, como cirugías de bypass u otras cirugías diseñadas a aliviar un estado perjudicial provocado por el bloqueo de los vasos sanguíneos por depósitos grasos, como placa arterial, pueden ser aumentadas con el uso simultáneo de las presentes composiciones y métodos. Los métodos para eliminar los cálculos biliares, como los métodos ultrasónicos o láser, pueden ser usados también antes, durante o después del transcurso de los presentes métodos terapéuticos. Además de ello, los presentes métodos pueden ser usados como un adyuvante para cirugías o terapias de rotura de huesos, músculos dañados u otras terapias que serían mejoradas por un aumento de la masa de tejidos magros.

Por lo tanto, la presente invención proporciona el uso para la elaboración de un medicamento para aumentar la masa de tejidos magros y un método de tratamiento estético aumentando la masa de tejidos magros con el fin de mejorar la apariencia exterior, administrando una cantidad eficaz de una proteína OB, análogo o derivado de la misma, seleccionados entre:

(a) la secuencia de aminoácidos 1-146 que se expone en la ID. SEC. nº 2 (posterior) o ID. SEC. nº 4 (posterior),

(b) la secuencia de aminoácidos 1-146 como se expone en la ID. SEC. nº 4 (posterior) que tiene un residuo de lisina en la posición 35 y un residuo de isoleucina en la posición 74;

(c) la secuencia de aminoácidos de la subparte (b) que tiene un aminoácido diferente sustituido en una o más de las siguientes posiciones (usando la numeración según la ID. SEC. nº 4 y que retiene la misma numeración incluso en ausencia de un residuo de glutaminilo en la posición 28): 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145;

(d) la secuencia de aminoácidos de las subpartes (a), (b) o (c) que carecen opcionalmente de un residuo de glutaminilo en la posición 28;

(e) la secuencia de aminoácidos de las subpartes (a), (b), (c) o (d) que tienen un residuo de metionilo en el N terminal;

(f) un análogo de proteína OB truncado seleccionado entre: (usando la numeración de la ID. SEC. nº 4 que tienen un residuo de lisina en la posición 35 y un residuo de isoleucina en la posición 74):

(i): aminoácidos 98-146

(ii): aminoácidos 1-32

(iii): aminoácidos 40-116

(iv): aminoácidos 1-99 y 112-146

(v): aminoácidos 1-99 y 112-146 que tienen uno o más aminoácidos 100-111 secuencialmente colocados entre los aminoácidos 99 y 112; y

(vi): el análogo de OB truncado de la subparte (i) que tiene uno o más aminoácidos 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142, y 145 sustituidos con otro aminoácido;

(vii): el análogo truncado de la subparte (ii) que tiene uno o más aminoácidos 4, 8 y 32 sustituidos con otro aminoácido;

(viii): el análogo truncado de la subparte (iii) que tiene uno o más aminoácidos 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 y 112 sustituidos con otro aminoácido;

(vix): el análogo truncado de la subparte (iv) que tiene uno o más aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 y 145 sustituidos con otro aminoácido;

(x): el análogo truncado de la subparte (v) que tiene uno o más aminoácidos 4, 8,32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145 sustituidos con otro aminoácido;

(xi): el análogo truncado de cualquiera de las subpartes (i)-(x) que tiene un residuo de metionilo N-terminal; y

(g) la proteína OB o derivado de análogo de cualquiera de las subpartes (a) a (f) comprendida por un resto químico conectado al resto de la proteína;

(h) un derivado de la subparte (g) en el que dicho resto químico es un resto de polímero soluble en agua;

(i) un derivado de la subparte (h) en el que dicho resto de polímero soluble en agua es polietilenglicol;

(j) un derivado de la subparte (h) en el que dicho resto de polímero soluble en agua es un resto de poliaminoácido;

(k) un derivado de la subparte (h) en el que dicho resto de polímero soluble en agua está unido solamente al N terminal de dicho resto de proteína;

(l) una proteína OB, análogo o derivado de cualquiera de la subpartes (a) a (k) en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar más en detalle la invención, pero no deben concebirse como una limitación de su alcance. El Ejemplo 1 demuestra que la proteína OB es eficaz para aumentar la masa magra en animales no obesos. El Ejemplo 2 demuestra que la proteína OB es eficaz para aumentar la masa magra en primates obesos. Los Ejemplos 3 a 5 son ejemplos previsorios de uso humano. A continuación se exponen los materiales y métodos.

Ejemplo 1

Estos datos demuestran que la proteína OB, o análogos o derivados de la misma, son eficaces para aumentar la masa magra.

Se administró continuamente proteína OB murina de metionilo recombinante (como se describe con posterioridad) a través de infusión por bomba osmótica durante un período de cuatro semanas. Los datos de la Tabla 1 muestran la composición corporal media (para ratones CD1) a las dosis sindicadas:

TABLA 1

Dosis (mg/kg/día)	Agua (g)	Grasa (g)	Masa magra (g)
BPS	22,13 \pm 0,33	8,39 \pm 0,67	3,2 \pm 0,28
0,03	22,09 \pm 0,55	9,44 \pm 0,61	2,32 \pm 0,54
0,1	21,02 \pm 0,44	6,64 \pm -1	3,85 \pm 0,57
0,3	22,02 \pm 0,31	5,22 \pm 0,91	4,72 \pm 0,48
1,0	21,34 \pm 0,38	1,51 \pm 0,48	6,94 \pm 0,25

En ratones CD1 no obesos, se administró continuamente proteína OB murina de metionilo recombinante a unas dosis de 0,3 ó 1 mg/kg/día que se mostró que efectuaba un aumento de la masa magra con relación a los animales testigos, a los que se administró PBS.

Ejemplo 2

Este ejemplo demuestra que la proteína OB humana de metionilo recombinante provoca un aumento de la masa de tejido magro en primates.

A monos cynomolgus obesos que tenían más de 20% de masa corporal se les administró proteína OB humana de metionilo recombinante por vía subcutánea, a una dosis diaria de 1 mg de proteína/kg de peso corporal/día (véase la sección de Materiales y Métodos, posteriores). A los animales testigos se les administró solución salina tamponada con fosfato. La composición corporal se realizó usando un análisis de absorbimetría de rayos X de energía dual ("DEXA"). Las mediciones de la composición corporal se tomaron en intervalos de 7 días.

Las Tablas 2A y 2B muestran los resultados de los análisis de la composición corporal en términos de masa de grasa o tejido magro. Los datos se presentan en gramos. Los resultados para los dos animales testigos están en la Tabla 2A. Los datos para 4 animales del ensayo se presentan en la Tabla 2B. (Se presentan también los datos para la masa ósea). Como se puede observar, en el día 28, los animales del ensayo perdieron aproximadamente 264 gramos de grasa y ganaron aproximadamente 138 gramos de masa magra. En el día 28, los testigos perdieron 36 gramos de tejido graso y ganaron aproximadamente 25 gramos de masa magra. Esto demuestra que la proteína OB provoca un aumento en la masa de tejido magro.

TABLA 2A

Testigo (n=2)	Línea de Base	Día 7	Día 14	Día 21	Día 28
Masa Magra	5393	5411	5467	5410	5418
\pm Desv. Típ.	\pm894	\pm863	\pm934	\pm983	\pm802
Masa de grasa	2884	2838	2835	2852	2848
\pm Desv. Típ.	\pm1962	\pm1936	\pm2113	+2271	\pm2122
Masa Ósea	325	324	324	325	321
\pm Desv. Típ.	\pm12	\pm4	\pm11	\pm16	\pm7

TABLA 2B

Protenína OB (n=4)	Línea de Base	Día 7	Día 14	Día 21	Día 28
Masa magra	4877	4782	4899	4957	5015 *
\pm Desv. Típ.	\pm960	\pm927	\pm1037	\pm1053	\pm1192
Masa de grasa	2577	2536	2432	2380	2313 *
\pm Desv. Típ.	\pm1927	\pm1982	\pm1874	\pm1924	\pm1903
Masa Ósea	296	296	294	292	291
\pm Desv. Típ.	\pm96	\pm99	\pm97	\pm96	\pm96
* indica valores de p menores que 0,05 para mediciones repetidas ANOVA.

Ejemplo 3

Un paciente humano no obeso desea un aumento en la masa de tejido magro para fines terapéuticos, como la recuperación de una enfermedad que agotó la masa de tejido magro. Al paciente se le administra una cantidad eficaz de proteína OB, análogo o derivado de la misma para dar lugar al aumento deseado de la masa de tejido magro. El aumento de la masa de tejido magro es verificado usando una exploración DEXA. Los niveles de proteína OB o análogo o derivado en circulación pueden ser verificados usando un estuche de diagnóstico, como un ensayo por anticuerpos frente a proteína OB (u otra fuente antígena si es aplicable).

Ejemplo 4

Un sujeto humano desea un aumento de la masa de tejido magro para fines estéticos o atléticos, como un aumento en el tejido magro con el fin de mejorar la apariencia externa. Al paciente se le administra una cantidad eficaz de proteína OB, análogo o derivado de la misma para dar lugar al aumento deseado de la masa de tejido magro. El aumento de la masa de tejido magro es verificado usando una exploración DEXA. Los niveles de oxígeno en la sangre aumentan. Los niveles de proteína OB o análogo o derivado en circulación pueden ser verificados usando un estuche de diagnóstico, como un ensayo por anticuerpos frente a la proteína OB (u otra fuente antígena si es aplicable).

Ejemplo 5

Un paciente humano diabético desea usar dosificaciones disminuidas de insulina para el tratamiento de la diabetes. Al paciente se le administra una cantidad eficaz de proteína OB, análogo o derivado de la misma para dar lugar a un aumento en la masa de tejido magro. La sensibilidad del paciente a la insulina aumenta, y la dosificación de insulina necesaria para aliviar los síntomas de la diabetes son disminuidos, ya sea en términos de una disminución en las unidades de insulina necesarias, o bien en términos de una disminución en el número de inyecciones de insulina necesarias por día. Los niveles de proteína OB o análogo o derivado de en circulación pueden ser verificados usando un estuche de diagnóstico, como un ensayo por anticuerpos frente a la proteína OB (u otra fuente antígena si es aplicable).

Ejemplo 6

Un paciente humano de edad avanzada no obeso desea un aumento de la resistencia global. Al paciente se le administra una cantidad eficaz de proteína OB, análogo o derivado de la misma para dar lugar a un aumento en la masa de tejido magro, y un aumento de la resistencia global. La resorción ósea es también disminuida y un estado de osteoporosis es mejorado. Los niveles de proteína OB o análogo o derivado en circulación pueden ser verificados usando un estuche de diagnóstico, como un ensayo por anticuerpos frente a la proteína OB (u otra fuente antígena si es aplicable).

Materiales y métodos Animales

Roedores. Se usaron ratones CD1 de tipo salvaje para el Ejemplo 1 (datos de la Tabla 1). Los animales fueron mantenidos bajo condiciones humanas.

Primates: Se usó un total de seis monos cynomolgus. Todos los monos tenían al menos 20% de grasa al comienzo del estudio. Los animales se dispusieron al azar en cuanto al peso, y cuatro animales fueron ensayados con proteína OB, y dos animales fueron testigos.

Administración de proteína o vehículo

Para roedores. Para el Ejemplo 1 (datos de la Tabla 1) se administraron proteína de murina recombinante (como se describe con posterioridad) o vehículo (solución salina tamponada con fosfato "PBS", pH 7,4) por medio de infusión con bomba osmótica. Se colocaron quirúrgicamente minibombas osmóticas Alzet (Alza, Palo Alto, CA, modelo nº 2002) en cada ratón en una bolsa subcutánea en el área subcapsular y se sustituyeron después de dos semanas. Las bombas fueron calibradas para administrar 0,5 \mul de proteína en solución por hora para las dosificaciones indicadas en la Tabla 1.

Para primates. Para el Ejemplo 2, la proteína OB humana de metionilo recombinante (de la ID. SEC. nº 4, que tenía una lisina en la posición 35 y una isoleucina en la posición 74), dosificada a 1 mg/ml de PBS, se administró por vía subcutánea a una dosis de 1 mg de proteína/kg de peso corporal/día. A los animales testigo se les administró PBS de la misma forma.

Análisis de pellejo de roedores. El análisis del pellejo se realizó como en A.I. Leshner, V.A. Litwin y R.L. Squibb, Brain Res. 9: 281 (1972). La composición acuosa se determinó mediante la sustracción del peso del pellejo antes y después de un período de deshidratación de 4 días. Se extrajo grasa de una parte previamente pesada del pellejo seco y triturado con etil-éter y alcohol etílico, de forma que el porcentaje de grasa pudiera ser calculado a partir de la cantidad de material que permanecía después del procedimiento de extracción. La masa magra se definió como la proporción de pellejo triturado que permanecía después de la deshidratación y extracción con éter.

Exploración por absorbimetría de rayos X de energía dual en primates. Se realizó una exploración "DEXA" en los valores del tiempo indicados en la Tabla 2 A y B, en el Ejemplo 2.

Proteína: Las ID de secuencias nº 1 y 2 exponen DNA y proteína OB recombinante de murina y las ID de las secuencias nº 3 y 4 exponen un DNA y proteína OB humanos recombinantes análogos. La proteína recombinante de murina como en la ID. SEC. nº 2 se usó en el Ejemplo 1. La proteína OB humana recombinante como en la ID. SEC. nº 4 que tenía un residuo de lisina en la posición 35 y un residuo de isoleucina en la posición 74 se usó en el Ejemplo 2. Como se indicó anteriormente, las proteínas recombinantes análogas de murina y humanas posteriores son ilustrativas de la proteína OB que puede ser usada en los presentes métodos de tratamiento y elaboración de un medicamento. Pueden ser usadas otras proteínas OB o análogos o derivados de las mismas.

En la presente memoria descriptiva, el primer aminoácido de la secuencia de aminoácidos para la proteína recombinante es citado como +1 y es valida, y el aminoácido en la posición -1 es metionina. El aminoácido en el C terminal es el número 146 (cisteína).

DNA (de cadena doble) de met-OB de murina recombinante y secuencia de aminoácidos (ID. SEC. nº 1 y 2)

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DNA (de cadena doble) análogo de met-OB humano recombinante y secuencia de aminoácidos (ID. SEC. nº 3 y 4)

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Métodos para la producción

Los métodos siguientes para la producción han sido usados para producir proteína OB análoga de murina o humana de metionilo recombinante biológicamente activa. Se pueden usar métodos similares para preparar proteína OB humana de metionilo recombinante biológicamente activa.

Vector de expresión y cepa hospedante

El vector de expresión del plásmido usado es pCFM1656, nº de acceso ATCC 69576. El DNA anterior fue ligado en el vector de expresión pCFM1656 linealizado con XbaI y BamHI y transformado en la cepa hospedante de E. coli, FM5. Las células de E. coli, FM5 fueron derivadas en Amgen Inc., Thousand Oaks, CA a partir de la cepa K-12 de E. coli (Bachmann, et al., Bacteriol. Rev. 40: 116-167 (1976)) y contienen el gen represor de fagos lambda integrado c1857 (Sussman et al. C.R. Acad. Sci. iSA: 1517-1579 (1962)). La producción de vectores, transformación de células y selección de colonias se realizaron por métodos estándar, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^{nd} Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Las células se hicieron crecer en medios LB.

Procedimiento de fermentación. Se usó un protocolo de fermentación de tres fases conocido como procedimiento de tandas alimentadas. Las composiciones de los medios se exponen a continuación.

Tanda: Se esterilizó una fuente de nitrógeno y fosfato (subiendo hasta 122ºC durante 35 minutos, 1,24-1,38 bares) en el recipiente de fermentación (Biolafitte, capacidad de 12 litros). Tras enfriar, se añadieron asépticamente fuentes de carbono, magnesio, vitaminas y trazas metálicas. Se añadió al fermentador un cultivo durante una noche de las bacterias productoras de proteínas de murinas recombinantes anteriores (16 horas o más) de 500 ml (crecidas en un caldo LB).

Alimentación I: Tras alcanzar entre 4,0-6,0 OD_{600}, los cultivos fueron alimentados con la Alimentación I. La glucosa fue alimentada a una velocidad limitativa con el fin de controlar la velocidad de crecimiento (\mu). Un sistema automatizado (denominado el Sistema de Control Distributivo) fue instruido para controlar la velocidad de crecimiento a 0,15 generaciones por hora.

Alimentación II: Cuando la OD_{600} había alcanzado 30, la temperatura del cultivo se aumentó lentamente hasta 42ºC y la alimentación se cambió a la Alimentación II posterior. La fermentación se dejó que continuara durante 10 horas con toma de muestras cada 2 horas. Después de 10 horas, el contenido del fermentador se enfrió por debajo de 20ºC y se recolectó por centrifugación.

Composición media Tanda

10 g/l	Extracto de levadura
5,25 g/l	(NH_{4})_{2}SO_{4}
3,5 g/l	K_{2}HPO_{4}
4,0 g/l	KH_{2}PO_{4}
5,0 g/l	Glucosa
1,0 g/l	MgSO_{4}\cdot7H_{2}O
2,0 ml/l	Solución de vitaminas
2,0 ml/l	Solución de trazas metálicas
1,0 ml/l	Antiespumante P2000

Alimentación I

50 g/l	Bacto-triptona
50 g/l	Extracto de levaduras
450 g/l	Glucosa
8,75 g/l	MgSO_{4}\cdot7H_{2}O
10 ml/l	Solución de vitaminas
10 ml/l	Solución de trazas metálicas

Alimentación II

200 g/l	Bacto-triptona
100 g/l	Extracto de levadura
110 g/l	Glucosa

Solución de vitaminas (Tanda y Alimentación I): 0,5 g de biotina, 0,4 g de ácido fólico y 4,2 g de riboflavina, se disolvió en 450 ml de H_{2}O y 3 ml de NaOH 10 N y se llevó hasta 500 ml en H_{2}O. Se disolvieron 14 g de piridoxina-HCl y 61 g de niacina en 150 ml de H_{2}O y 50 ml de NaOH 10 N, y se llevó hasta 250 ml en H_{2}P. Se disolvieron 54 g de ácido pantotémico en 200 ml de H_{2}O y se llevó hasta 250 ml. Las tres soluciones se combinaron y se llevaron hasta un volumen total de 10 litros.

Solución de trazas metálicas (Tanda y Alimentación I)

Cloruro férrico (FeCl_{3}\cdot6H_{2}O): 27 g/l

Cloruro de zinc (ZnCl_{2}\cdot4H_{2}O): 2 g/l

Cloruro de cobalto (CoCl_{2}\cdot6H_{2}O): 2 g/l

Molibdato de sodio (NaMoO_{4}\cdot2H_{2}O): 2 g/l

Cloruro de calcio (CaCl_{2}\cdot2H_{2}O): 1 g/l

Sulfato cúprico (CuSO_{4}\cdot5 H_{2}O): 1,9 g/l

Ácido bórico (H_{3}BO_{3}): 0,5 g/l

Cloruro de manganeso (MnCl_{2}\cdot4H_{2}O): 1,6 g/l

Dihidrato de citrato de sodio: 73,5 g/l

Procedimiento de purificación para proteína OB de murina

La purificación se realizó mediante las siguientes etapas (salvo que se indique otra cosa, las siguientes etapas se realizaron a 4ºC):

1. Pasta celular. Una pasta celular de E. coli se puso en suspensión en un volumen de 5 veces de EDTA 7 mM, pH 7,0. Las células en el EDTA fueron adicionalmente disgregadas mediante dos pasos a través de un microfluidizador. Las células disgregadas fueron centrifugadas a 4,2 K- rpm durante 1 hora en una centrifugadora Beckman J6-B con un rotor JS-4.2.

2. Inclusión de lavado corporal nº 1. La materia sobrenadante de la etapa anterior se separó, y el sedimento se volvió a poner en suspensión en un volumen de 5 veces de EDTA 7 mM, pH 7,0 y se homogeneizó. Esta mezcla se centrifugó como en la etapa 1.

3. Inclusión del lavado corporal nº 3. La materia sobrenadante de la etapa anterior se separó, y el sedimento se volvió a poner en suspensión en un volumen de diez veces de Tris 20 mM, pH 8,5, DTT 10 mM y 1% de desoxicolato, y se homogeneizó. Esta mezcla se centrifugó como en la Etapa 1.

4. Inclusión de lavado corporal nº 3. La materia sobrenadante de la etapa anterior se separó y el sedimento se volvió a poner en suspensión en un volumen de diez veces de agua destilada y se homogeneizó. Esta mezcla se centrifugó como en la Etapa 1.

5. Replegamiento. El sedimento fue replegado con 15 volúmenes de HEPES 10 mM, pH 8,5, 1% de sarcosina de sodio (N-lauroil-sarcosina), a temperatura ambiente. Después de 60 minutos, la solución se hizo que fuera 60 \muM de sulfato de cobre, y seguidamente se agitó durante una noche.

6. Separación de sarcosina. La mezcla del replegamiento se diluyó con 5 volúmenes de tampón de Tris 10 mM, pH 7,5, y se centrifugó como en la Etapa 1. La materia sobrenadante se recogió y se mezcló con agitación durante una hora con resina Dowex® 1-X4 (Dow Chemical Co., Midland MI), malla 20-50, forma de cloruro, a un volumen total de 0,066% de mezcla de replegamiento diluida. Véase el documento WO 89/10932 en la página 26 para más información sobre Dowex®. Esta mezcla se vertió en una columna y se recogió el eluyente. La separación de sarcosina se determinó mediante HPLC de fase inversa.

7. Precipitación ácida. El eluyente de la etapa previa se recogió y el pH se ajustó a pH 5,5 y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Esta mezcla se centrifugó como en la Etapa 1.

8. Cromatografía de intercambio catiónico. El pH de la materia sobrenadante de la etapa previa se ajustó a pH 4,2 y se introdujo en una columna CM Sepharose Fast Flow (a un volumen de 7%). Se hicieron volúmenes de 20 columnas de gradiente de sales a NaOAc 20 mM, pH 4,2, NaCl 0 M a 1,0 M.

9. Cromatografía de interacción hidrófoba. La reunión en CM Sepharose de las fracciones pico (determinadas a partir de absorbancia ultravioleta) de la etapa anterior se hizo que estuviera en sulfato de amonio 0,2 M. Se hizo un gradiente de sales inversas de 20 volúmenes de la columna a NaOAc 5 mM, pH 4,2, con sulfato de amonio 0,4 M a 0 M. Este material se concentró y se diafiltró en PBS.

Fermentación de análogo de proteína OB humana recombinante: La fermentación de las células hospedantes anteriores para producir un análogo de proteína OB humana recombinante (ID. SEC. nº 4) se puede realizar usando las condiciones y las composiciones anteriormente descritas para el material de murina recombinante.

Purificación del análogo de proteína OB humana recombinante: El análogo de proteína humana recombinante puede ser purificado usando métodos similares a los usados para la purificación de la proteína de murina recombinante, como en el Ejemplo 1 anterior. Para la precipitación del análogo de proteína OB humana recombinante, la Etapa 8 se podría realizar ajustando el pH de la materia sobrenadante de la Etapa 7 a pH 5,0, e introduciéndolo en una columna de flujo rápido CM Sepharose. El gradiente de sales de 20 volúmenes de la columna se podría realizar en NaOAc 20 mM, pH 5,5, NaCl 0 M a 0,5 M. La Etapa 9 se podría realizar diluyendo la reunión en la columna CM Sepharose cuatro veces con agua y ajustando el pH a 7,5. Esta mezcla podría hacerse hasta sulfato de amonio 0,7 M. El gradiente de sales inversas de 20 volúmenes de la columna podría hacerse en NaOAc 5 mM, pH 5,5, sulfato de amonio 0,2 M a 0 M. Por lo demás, las etapas anteriores son iguales. Para el material del Ejemplo 2, la proteína OB humana recombinante de la ID. SEC. nº 4 que tiene lisina 35 e isoleucina 34 se formuló en un tampón que contenía histidina 10 mM, 4,3% de arginina, a pH 6,0.

Aunque la presente invención ha sido descrita en términos de las realizaciones preferidas, debe entenderse que se pueden producir variaciones y modificaciones para los expertos en la técnica. Por lo tanto, está previsto que las reivindicaciones anejas abarquen todas estas variaciones equivalentes que entran dentro del alcance de la invención como es reivindicada.

Claims

1. Uso de una proteína OB, análogo o derivado de la misma, seleccionados entre:

(a) la secuencia de aminoácidos 1-146 que se expone en la ID. SEC. nº 2 o ID. SEC. nº 4,

(b) la secuencia de aminoácidos 1-146 como se expone en la ID. SEC. nº 4 que tiene un residuo de lisina en la posición 35 y un residuo de isoleucina en la posición 74;

(c) la secuencia de aminoácidos de la subparte (b) que tiene un aminoácido diferente sustituido en una o más de las siguientes posiciones (usando la numeración según la ID. SEC. nº 4): 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145;

(i): aminoácidos 98-146

(ii): aminoácidos 1-32

(iii): aminoácidos 40-116

(iv): aminoácidos 1-99 y 112-146

(vi): el análogo de OB truncado de la subparte (f) (i) que tiene uno o más aminoácidos 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142, y 145 sustituidos con otro aminoácido;

(vii): el análogo truncado de la subparte (f)(ii) que tiene uno o más aminoácidos 4, 8 y 32 sustituidos con otro aminoácido;

(viii): el análogo truncado de la subparte (f)(iii) que tiene uno o más aminoácidos 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 y 112 sustituidos con otro aminoácido;

(vix): el análogo truncado de la subparte (f)(iv) que tiene uno o más aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 y 145 sustituidos con otro aminoácido;

(x): el análogo truncado de la subparte (f)(v) que tiene uno o más aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145 sustituidos con otro aminoácido;

(xi): el análogo truncado de cualquiera de las subpartes (f)(i)-(x) que tiene un residuo de metionilo N-terminal; y

para la elaboración de un medicamento para aumentar la masa de tejido magro.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho uso proporciona también una sensibilidad aumentada a la insulina.

3. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho uso proporciona también un aumento en la resistencia corporal global.

4. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho uso proporciona también una resorción ósea disminuida.

5. Un método de tratamiento estético aumentando la masa de tejido magro, con el fin de mejorar la apariencia exterior, que comprende administrar una cantidad eficaz de una proteína OB, análogo o derivado de la misma seleccionados entre:

(i): aminoácidos 98-146

(ii): aminoácidos 1-32

(iii): aminoácidos 40-116

(iv): aminoácidos 1-99 y 112-146