ES2257287T3 - Composiciones de leptina glicosiladas y metodos relacionados. - Google Patents

Abstract

Una proteína leptina glicosilada que comprende SEQ. ID Nº: 1 que tiene una o más alteraciones en la secuencia como un sitio de glicosilación, seleccionada entre (en que ¿T/S¿ significa treonina o serina): (a) 01VN 02PS (en que X es cualquier aminoácido excepto prolina) 03IT/S (b) 02PN 03I 04QT/S (c) 23DN 24I 25ST/S (d) 47PN 48I 49LT/S (e) 48IN 49L 50T/S (f) 69PN 70S 71RT/S (g) 92FN 93S 94KT/S (h) 101AN 102S 103GT/S (i) 102SN 103G 104LT/S (j) 103GN 104L 105ET/S

Description

Composiciones de leptina glicosiladas y métodos relacionados.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones de leptina glicosiladas y a métodos relacionados. Se incluyen proteínas leptina glicosiladas con un radio de Stokes que permite propiedades mejoradas, así como proteínas leptina glicosiladas con sitios seleccionados para la glicosilación, ácidos nucleicos que codifican proteínas de este tipo, células huésped relacionadas, vectores, procedimientos de producción y métodos de uso de composiciones de este tipo. También se proporcionan nuevos métodos para producir proteínas glicosiladas.

Antecedentes

A pesar de que la base molecular de la obesidad es ampliamente desconocida, la identificación del "gen OB" y de la proteína codificada ("proteína OB", a la que también se alude en esta memoria como "leptina") ha vertido algo de luz sobre los mecanismos que el cuerpo utiliza para regular la deposición de grasa corporal. Zhang et al., Nature 372: 425-432 (1994) incorporado en esta memoria como referencia; véase también, la Corrección en Nature 374: 479 (1995), también incorporada en esta memoria como referencia. La proteína OB es activa in vivo tanto en ratones mutantes ob/ob (ratones obesos debido a un defecto en la producción del producto génico OB), así como en ratones normales de tipo salvaje. La actividad biológica se manifiesta por sí misma, entre otras cosas, en una pérdida de peso. Véase, en general, Barinaga, "Obese" Protein Slims Mice, Science 269: 475-476 (1995). Véase la Publicación Internacional PCT número WO96/05309, "Modulators of Body Weight, Corresponding Nucleic Acids and Proteins, and Diagnostic and Therapeutic Uses Thereof", incorporada en esta memoria como referencia en su totalidad. Véanse también las Publicaciones Internacionales PCT números WO96/40912, WO97/06816, WO97/18833, WO97/38014, WO 98/08512 y WO98/28427, todas las cuales describen métodos y composiciones OB con mayor detalle y todas las cuales se incorporan en esta memoria como referencia en su totalidad.

Los otros efectos biológicos de la proteína OB no están bien caracterizados. Véase, en general, Friedman et al., Nature 395: 763-770 (octubre de 1998) para una revisión de leptina y la regulación del peso corporal en mamíferos, incorporada en esta memoria como referencia. Es sabido, por ejemplo, que en ratones mutantes ob/ob, la administración de proteína OB da como resultado una disminución en los niveles de insulina en el suero y en los niveles de glucosa en el suero. También es conocido que la administración de proteína OB resulta en una disminución de la grasa corporal. Esto se observó tanto en ratones mutantes ob/ob como en ratones normales no obesos. Pelleymounter et al., Science 269: 540-543 (1995); Halaas et al., Science 269: 543-546(1995). Véase, también, Campfield et al., Science 269: 546-549 (1995) (la administración periférica y central de dosis de microgramos de proteína OB reducía la ingesta de alimentos y el peso corporal de ratones ob/ob y obesos inducidos por la dieta, pero no en ratones obesos db/db). En ninguno de estos informes se han observado toxicidades, incluso a las dosis más altas.

Leptina recombinante es eficaz en seres humanos para dar como resultado una pérdida de peso. Greenberg AS, Heymsfield SB, Fujioka K, et al., Preliminary safety and efficacy of recombinant methionyl human leptin (rL) administered by SC injection in lean and obese subjects. Poster presentado en: 58ª Reunión Anual y Sesiones Científicas de la Asociación de Diabetes Americana; 14 de junio de 1998; Chicago, IL, incorporada en esta memoria como referencia. Tal como se ha demostrado, la administración de metionil-leptina humana recombinante a seres humanos obesos ha dado como resultado una pérdida de peso sin toxicidades. Además, el peso que se pierde es predominantemente grasa. Heymsfield et al., Weight and body composition changes in lean and obese subjects treated with recombinant methionyl human leptin. Poster presentado en: Congreso Internacional sobre Obesidad; 29 de agosto - 3 de septiembre, 1998; París, Francia, incorporado en esta memoria como referencia.

Se sabe que la leptina humana nativa tiene una semivida relativamente rápida en seres humanos. Lau et al., Pharmacokinetics of recombinant methionyl human leptin and the effect of antibody formation in lean and obese subjects following subcutaneous dosing. Poster presentado en: Congreso Internacional sobre Obesidad; 29 de agosto - 3 de septiembre, 1998; París, Francia, incorporado en esta memoria como referencia. En la circulación sistémica, la acumulación se puede conseguir administrando dosis mayores o dosis más frecuentes de la proteína objeto. Los informes indican que la leptina exógena, así como la endógena, son retiradas de la circulación, al menos en parte, por los riñones. Véase, por ejemplo, Cumin et al., Journal of Endocrinology, 155: 577-585 (1997) y Cumin et al., Internal Journal of Obesity, 21: 495-504 (1997), ambos incorporados en esta memoria como referencia.

En general, el riñón actúa para clarificar el plasma sanguíneo de determinadas sustancias al concentrarlas en la orina. Véase, por ejemplo, Harth, The Function of the Kidneys, en: Human Physiology, Schmidt et al., eds., editorial Springer Nueva York, Heidelberg, Berlín, 1983 en las págs. 610-642, incorporado en esta memoria como referencia. La tasa o el grado al que una proteína del suero puede atravesar el riñón es difícil de estimar, pero, por lo general, la anatomía del riñón permite el paso libre de agua y de solutos pequeños, pero impone una barrera al paso de las proteínas del plasma. Diferentes sustancias tienen "filtrabilidad", tasas de clarificación de los riñones diferentes, véase Anderson et al., Renal and Systemic Manifestations of Glomerular Desease, en: The Kidney, Brener et al., eds., Harcort Brace Joanovich, Inc., Filadelfia, PA 1991, en las páginas 1831-1843, incorporado en esta memoria como referen-
cia.

La leptina se puede acumular en la circulación sistémica mediante administración continua, tal como mediante una bomba osmótica o derivatizando químicamente la proteína, de modo que se aumente el tiempo de circulación. Véase, por ejemplo, el documento PCT WO96/40912, publicado el 19 de diciembre de 1996 e incorporado en esta memoria como referencia en su totalidad. La derivatización química de una proteína producida de modo recombinante requiere generalmente, sin embargo, un proceso de dos (o más) etapas: la etapa uno, preparar la proteína; la etapa dos, añadir un resto químico (tal como un resto polietilenglicol o dextrano), véase, por ejemplo, el documento PCT WO96/40912, supra, en la página 8 y siguientes para una descripción de leptina derivatizante N-terminal (a la que se alude en esta memoria como proteína OB).

Para un procedimiento de "una etapa", en un sistema de ADN recombinante, se puede codificar una proteína de fusión (alternativamente denominada una proteína "quimérica"), en donde un resto polipéptido adicional es codificado junto con la proteína deseada, de modo que ambos se expresan. El alargamiento de la proteína puede también aumentar el tiempo de circulación. Polipéptidos tales como la parte "Fc" de un anticuerpo, o albúmina, han sido utilizados a este respecto. Véase, por ejemplo, el documento PCT WO98/28427, incorporado en esta memoria como referencia, titulado "OB Fusion Protein Compositions and Methods". La desventaja general en la fabricación es que, a veces, productos de expresión mayores son más difíciles de plegar para producir conformaciones adecuadas, y los rendimientos pueden ser menores que aquellos para productos más pequeños. Además, se incrementa la carga global de la proteína por dosis, y disminuye la proporción de proteína terapéutica con el uso de proteínas de fusión con un tamaño crecientemente grande.

La presencia de un hidrato de carbono en una proteína puede afectar a su tasa de clarificación y puede mejorar su potencia in vivo, mientras que, al mismo tiempo, puede afectar a la actividad intrínseca, solubilidad, estabilidad e inmunogenicidad de la proteína. Véase, por ejemplo, la publicación de patente europea 0 640 619, publicada el 1 de marzo de 1995, titulada "Erythropoietin analogs with additional glycosylation sites", incorporada en esta memoria como referencia, y la publicación de patente PCT WO 96/25498, publicada el 22 de agosto de 1996, titulada "MPL Ligand Analogs", ambas incorporadas en esta memoria como referencia.

Además, el hidrato de carbono se puede añadir mediante la producción de células eucarióticas, sin la necesidad de un procedimiento de dos etapas. Por ejemplo, el documento PCT/US96/06609, publicado el 14 de noviembre de 1996, incorporado en esta memoria como referencia, propone diversas secuencias señal de mamíferos para la secreción de una proteína ob a partir de una célula de mamífero (en las páginas 11-12, por ejemplo). Véase, también, el documento PCT WO 97/20933, publicado el 12 de junio de 1997, titulado "Mutational Variants of Mammalian OB Gene Proteins", particularmente en la página 11, que propone alteraciones en la glicosilación de proteínas OB. La glicosilación se produce en lugares específicos a lo largo de la cadena principal del polipéptido. Habitualmente existen dos tipos de glicosilación: oligosacáridos enlazados a O son fijados a residuos serina o treonina, mientras que oligosacáridos enlazados a N son fijados a residuos asparagina cuando son una parte de la secuencia Asn-X-Ser/Thr, en que X puede ser cualquier aminoácido, excepto prolina. Las estructuras de oligosacáridos enlazados a N y enlazados a O y los residuos azúcar encontrados en cada tipo son diferentes. Un tipo de azúcar que se encuentra habitualmente en ambos es ácido N-acetilneuramínico (al que se alude aquí en lo que sigue como ácido siálico). El ácido siálico es habitualmente el residuo terminal de oligosacáridos tanto enlazados a N como enlazados a O en células de mamíferos y, en virtud de su carga negativa, puede conferir propiedades de carácter ácido a la glicoproteína. La forma predominante de leptina humana que se produce en la naturaleza (proporcionada en células humanas) no está glicosilada. Una variante de la proteína que se produce de forma natural, ausente en la posición 28 de la proteína madura (SEQ.. ID Nº 2, infra) contiene dos sitios de glicosilación. Estos sitios son ambos para una glicosilación enlazada a O. Sin embargo, se piensa que la forma se produce solamente en cantidades traza en seres humanos, y no es la forma predominante activa in vivo.

Sería deseable tener un procedimiento que diese como resultado una leptina con un tiempo de circulación sistémica incrementado, que no requiera una segunda etapa de derivatización de este tipo según se describe anteriormente. Adicionalmente, es deseable aumentar la actividad intrínseca y la solubilidad de leptina, sin provocar ni aumentar la inmunogenicidad ni otros efectos perjudiciales. El documento WO-A-9720933 describe variantes mutacionales de proteínas del gen Ob de mamíferos. El documento WO-A-9505465 describe análogos de eritropoyetina. El documento WO-A-9726916 describe compuestos análogos a una proteína de obesidad y formulaciones de los mismos.

Sumario de la invención

La presente invención procede de la observación de que, en comparación con leptina humana recombinante nativa inalterada, la proteína leptina glicosilada es funcional in vivo y, además, determinadas formas de proteína leptina glicosilada tienen tiempos de circulación sistémica más prolongados in vivo, sin toxicidades.

Se ha encontrado, de manera sorprendente e importante, que una leptina humana glicosilada que tiene un único sitio de glicosilación enlazado a N tiene actividad biológica in vitro, así como in vivo. Además, la actividad biológica es igual o es ligeramente más potente que la proteína leptina humana nativa recombinante. Como se ha indicado anteriormente, se piensa que el efecto de la leptina sobre la obesidad se debe, en parte, a la acción en el cerebro. Tal como se ha indicado antes, la leptina no es una molécula glicosilada de forma natural (en la forma Q+28, SEQ. ID Nº 1, infra que se piensa es la forma predominante en el suero humano). Además, las proteínas glicosiladas (glicoproteínas) pueden generalmente no penetrar en el cerebro debido a la incapacidad de atravesar la barrera de sangre-cerebro. La demostración de la actividad biológica igual (o ligeramente mejor) por parte de leptina glicosilada demuestra que
(a) la leptina glicosilada penetra en el cerebro, o (b), si no lo hace, la leptina glicosilada es más biológicamente eficaz en los tejidos periféricos (tales como zonas viscerales del tejido adiposo) que la leptina humana recombinante nativa.

Se ha observado, además, que una leptina humana que está N-glicosilada en tres sitios tiene un tiempo de circulación mucho más prolongado y una mayor potencia que la leptina humana recombinante o la leptina N-glicosilada en un solo sitio. Tal como se recoge en los ejemplos de trabajo que figuran más adelante, diversas leptinas glicosiladas en dos, tres, cuatro y cinco sitios han sido preparadas y sometidas a ensayo en cuanto a la actividad in vitro, y en algunos casos in vivo.

Las presentes leptinas glicosiladas pueden tener una semivida en plasma deseada relativamente larga. Las presentes leptinas glicosiladas que tienen un radio de Stokes mayor que o igual a 30 \ring{A} tienen una tasa reducida de filtrabilidad a través de las membranas y, así, una velocidad reducida de degradación en los riñones.

A pesar de que los radios de Stokes se pueden determinar de una diversidad de maneras, el modo preferido en esta memoria es utilizar la cromatografía por filtración en gel. Véase, en general, Le Maire et al., Analytical Biochemistry 154: 525-535 (1986) incorporado en esta memoria como referencia, para la cromatografía de filtración en gel para determinar los radios de Stokes de diversas proteínas para uso como patrones. Así, las presentes leptinas glicosiladas son aquellas que tienen radios de Stokes de aproximadamente 30 \ring{A} cuando se determinan utilizando la cromatografía por filtración en gel.

Se prefiere que las presentes leptinas glicosiladas eviten también sustancialmente la clarificación en el hígado. Se sabe que el hígado tiene receptores que unen galactosa. La galactosa es un azúcar y puede ser un componente del resto hidrato de carbono en las presentes leptinas glicosiladas. El ácido siálico "cubrirá" típicamente el resto galactosa e impedirá su reactividad con receptores galactosa en el hígado. Adicionalmente, un resto ácido siálico imparte una carga negativa. Cuanto más negativamente cargada se encuentren las presentes leptinas glicosiladas, tanto más "repelerán" las membranas de carga negativa del hígado y de los riñones. Por lo tanto, las presentes proteínas leptinas glicosiladas son preferiblemente aquellas que tienen al menos una mayoría de los restos galactosa no disponibles para la unión a un receptor de galactosa y, más preferiblemente, que tienen un resto ácido siálico situado en al menos una mayoría de los sitios disponibles para la sialación.

Tal como se ha comentado en esta memora, la leptina humana recombinante, modificada con el fin de que contenga sitios para la glicosilación enlazada a N en un sitio o en tres sitios, demostró que la proteína leptina glicosilada pudiera ser funcional y pudiera ser igual de funcional que la humana natural. La glicosilación se consiguió a través de una maquinaria celular del huésped, en cultivos de células y, por lo tanto, no requería una etapa extra del procedimiento (según se requiere para derivatizar la proteína) para conseguir las características deseadas de semivida más prolongada.

Así, en un aspecto, la presente invención se refiere a una proteína leptina glicosilada de acuerdo con las reivindicaciones que se acompañan, que tiene un radio de Stokes mayor que el de una leptina humana glicosilada que se produce de forma natural de SEQ. ID Nº 2 (rHu - leptina 1-145, que figura más abajo). En otro aspecto, la presente invención se refiere a un proteína leptina glicosilada que tiene un radio de Stokes mayor que el de una proteína leptina glicosilada que tiene un resto de glicosilación enlazado a N. Y, todavía en otro aspecto, la presente invención se refiere a una proteína leptina glicosilada que tiene un radio de Stokes igual o mayor que 30 \ring{A}, según se determina mediante filtración en gel.

La presente invención reivindicada pertenece también a proteínas leptina que tienen al menos un sitio de glicosilación adicional. Todavía de otro modo, la presente invención se refiere a una proteína leptina glicosilada que tiene cinco o más de cinco restos ácido siálico. La variante de leptina humana que se produce de forma natural (SEQ. ID Nº: 2, que figura más abajo) contiene 2 sitios para la glicosilación enlazada a O y, por lo tanto, puede contener 4 restos ácido siálico. Los presentes ejemplos de trabajo demuestran que una proteína leptina más fuertemente glicosilada tiene un tiempo de circulación sustancialmente mejorado. Además, la presente invención se refiere a una proteína leptina glicosilada que tiene cinco, seis o siete restos ácido siálico.

En otros aspectos, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica una proteína leptina glicosilada según se recoge en esta memoria, así como un vector que contiene un ácido nucleico que codifica una proteína leptina glicosilada de acuerdo con la descripción de esta memoria.

Así, todavía en otros aspectos, la presente invención se refiere a una célula huésped que contiene un ácido nucleico que codifica una proteína leptina glicosilada de acuerdo con la presente descripción.

La presente descripción también se refiere al uso de los presentes ácidos nucleicos para la terapia génica. Además, la presente invención se refiere a un método para preparar una proteína leptina glicosilada.

La presente invención también se refiere a moléculas de unión selectivas, tales como anticuerpos, que se unen selectivamente a las presentes proteínas leptina glicosiladas.

En otros aspectos descritos con mayor profundidad más abajo, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína leptina glicosilada de la presente invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La presente descripción también se refiere a un método de tratamiento de un ser humano para un estado seleccionado entre obesidad, diabetes y efectos del elevado contenido de lípidos en sangre; comprendiendo dicho método administrar una cantidad eficaz de una leptina humana glicosilada de acuerdo con la presente invención.

La presente invención también se refiere a métodos mejorados para la producción de proteínas leptina glicosiladas, así como a la producción de proteínas glicosiladas en general. Los presentes ejemplos de trabajo demuestran que para las presentes proteínas leptina glicosiladas, el uso de un péptido señal distinto del péptido señal de leptina humana nativa mejora la eficacia de la glicosilación. En este caso, la eficacia de la glicosilación mejorada da como resultado la propiedad deseable tanto del número como del tamaño incrementados de cadenas de hidratos de carbono añadidas. Así, las presentes composiciones y métodos incluyen el uso de péptidos señal distintos del péptido señal de leptina nativa. Aparte de la señal de leptina humana nativa se recogen en lo que sigue péptidos señal particulares, tanto los que se sabe que se encuentran de forma natural (es decir, péptidos señal naturales son aquellos que no han sido genéticamente manipulados por seres humanos, por ningún medio, incluida la recombinación homóloga, técnicas de ADN recombinante u otros medios conocidos o de los que se espera alteren los constituyentes de la secuencia del ácido nucleico, a pesar de que la célula que los contiene puede haber sido cultivada o separada de otro modo de su entorno natural in vivo), así como los que no se encuentran en la naturaleza (es decir, péptidos no naturales son aquellos que han sido genéticamente manipulados por seres humanos tal como se describe antes).

La presente invención se refiere, además, a la observación de que la modificación de los péptidos señal, así como de otros péptidos que son procesados fuera de la proteína madura, mejoran el rendimiento de proteínas glicosiladas. Modificaciones del péptido señal incluyen la alteración del sitio de escisión de la peptidasa para mejorar la precisión de la escisión (y, así, producir un mayor rendimiento de proteínas glicosiladas deseadas que tengan la secuencia de aminoácidos N-terminal pronosticada). Las modificaciones del péptido señal pueden también, o de forma alternativa, mejorar ampliamente la eficacia de la glicosilación, incluso en ausencia de la escisión "correcta" de la proteína madura a partir de las presecuencias. ("Correcta" indica que el primer aminoácido en el extremo N es uno de la proteína madura pronosticada, que no tiene ningún aminoácido que se encuentre en el péptido señal u otras presecuencias). Otras modificaciones incluyen la adición de "prosecuencias", que también se separan por escisión, pero que también generan una eficacia de la glicosilación mejorada. Péptidos señal que se producen de forma natural así como de forma no natural se pueden modificar como tales. En esta memoria se proporcionan ejemplos específicos.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método mejorado para fabricar una proteína glicosilada, que comprende:

(a) cultivar, bajo condiciones adecuadas de expresión y glicosilación, una célula huésped que contiene una secuencia de ADN que codifica, en la dirección 5' a 3', (i) un péptido señal, y (ii) un ADN que codifica una proteína glicosilada; y

(b) obtener dicha proteína glicosilada, en donde dicha mejora comprende el uso de un péptido señal con un sitio de escisión de peptidasa optimizado para maximizar el rendimiento de dicha proteína glicosilada y, opcionalmente, la adición de una prosecuencia.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una gráfica que muestra la pérdida de peso con relación al control tampón para animales dosificados con diversas dosis de una leptina glicosilada en un sitio ("leptina de CHO glicosilada") y rmetHu-leptina 1-146 ("leptina") no glicosilada.

La Figura 2 es un borrón Western, según se describe adicionalmente en los Ejemplos 5 y 6 que figuran más abajo, que muestra que alteraciones en la secuencia de aminoácidos del sitio de glicosilación pueden alterar el tipo o la magnitud de glicosilación.

La Figura 3 es una gráfica de concentraciones de leptina en suero después de la administración subcutánea de 1,0 mg/kg de rmetHu-leptina o una proteína leptina glicosilada en tres sitios en ratones CD-1 machos, según se describe adicionalmente en el Ejemplo 7.

La Figura 4 es una gráfica de concentraciones de leptina en suero después de la administración intravenosa de 1,0 mg/kg de rmetHu-leptina o una proteína leptina glicosilada en tres sitios en ratones CD-1 machos, según se describe adicionalmente en el Ejemplo 7.

La Figura 5 es una gráfica de la pérdida de peso tras la administración de una proteína leptina glicosilada en tres sitios ("GE-leptina"), según se describe adicionalmente en el Ejemplo 8.

La Figura 6 es una gráfica de la ingesta de alimentos tras la administración de una proteína leptina glicosilada en tres sitios ("GE-leptina"), según se describe adicionalmente en el Ejemplo 9.

La Figura 7 es un borrón Western que ilustra los efectos de diversos péptidos señal sobre la expresión y la glicosilación de una proteína leptina glicosilada en tres sitios, según se describe adicionalmente en el Ejemplo 14.

La Figura 8 es un borrón Western que ilustra los efectos de diversos péptidos señal, y de otros péptidos, sobre la glicosilación de una leptina glicosilada en tres sitios, según se describe adicionalmente en el Ejemplo 14.

La Figura 9 es un borrón Western que ilustra los efectos del sitio de escisión de la peptidasa tras la glicosilación de una proteína leptina glicosilada en tres sitios, según se describe adicionalmente en el Ejemplo 14.

La Figura 10 es un borrón Western que ilustra los efectos de diversos péptidos señal, y de otros péptidos, sobre la glicosilación de una leptina glicosilada en tres sitios, según se describe adicionalmente en el Ejemplo 14.

La Figura 11 es un borrón Western, según se describe en el Ejemplo 15 que figura más abajo, y muestra que al aumentar el número de sitios de glicosilación, al menos hasta cinco sitios, se aumenta la magnitud de la glicosilación encontrada en la proteína leptina cuando se expresa en células CHO.

Descripción detallada de la invención

Tal como se ha indicado antes, la presente invención se refiere, en un aspecto, a proteínas leptina glicosiladas que tienen un radio de Stokes mayor que el de leptina humana glicosilada que se produce de forma natural. Preferiblemente, para aumentar la semivida de una composición terapéutica en la circulación sistémica del radio de Stokes basta con reducir la capacidad de filtración en los riñones. El efecto de tener un radio de Stokes de esta magnitud consiste en mantener la proteína leptina glicosilada en la circulación sistémica durante un periodo de tiempo más prolongado que para una proteína leptina glicosilada, u otra proteína leptina que no tenga este tamaño eficaz. Tras la determinación empírica del radio de Stokes para la presente proteína leptina glicosilada, el tamaño debe ser mayor que o igual a aproximadamente 30 \ring{A}, según se determina por métodos descritos con mayor detalle más abajo. Cuando se utiliza con referencia a una molécula de proteína leptina glicosilada individual, el término "aproximadamente" significa el radio de Stokes medio a lo largo de un periodo de tiempo para esa molécula de proteína leptina glicosilada indivi-
dual.

Tal como se proporciona en esta memoria, proteínas leptina glicosiladas con un radio de Stokes mayor que las proteínas leptina que se producen de forma natural tienen propiedades mejoradas. El radio de Stokes preferido para una población de moléculas de proteína leptina glicosilada, tal como se encuentra presente en una dosis terapéuticamente eficaz, es aquel que es mayor que o igual a aproximadamente 30 \ring{A}. El término "aproximadamente" indica en este caso que de cualquier población de moléculas de proteína leptina glicosilada algunas pueden tener un radio de Stokes mayor, algunas pueden tener un radio de Stokes menor, pero el radio de Stokes medio de una población dada de proteínas leptina glicosiladas es mayor que o igual a 30 \ring{A}.

Cuanto más por encima de 30 \ring{A} se encuentre el radio de Stokes, tanto mayor será el tamaño eficaz de la o las moléculas de proteína leptina glicosiladas. Cuanto mayor sea el tamaño eficaz, es decir cuanto mayor sea el volumen hidrodinámico logrado mediante la adición de oligosacáridos, más lento será el movimiento del efecto a través de membranas basales a lo largo del cuerpo. Con el fin de que la leptina alcance los túbulos renales en donde se degrada, primero ha de pasar a través de las membranas basales del glomérulo. Así, al aumentar el tamaño hidrodinámico, se ralentiza la filtración a través de la membrana glomerular y, por lo tanto, se ralentiza la degradación y, así, el aclaramiento final del polipéptido en los túbulos proximales. Por ejemplo, la presente leptina de 3 sitios de glicosilación, rHu-leptina 1-146 con los sitios de glicosilación en las posiciones 47, 69 y 102 (es decir, con un residuo asparagina sustituido en las posiciones 47, 69 y 102, y un residuo treonina sustituido en las posiciones 29, 71 y 104) tiene un radio medio de Stokes de 32,1 \ring{A} (basado en dos mediciones de filtración en gel de 31,9 \ring{A} y 32,3 \ring{A}). El ejemplo de trabajo que figura más abajo demuestra que esta leptina glicosilada exhibía una disminución de 4 a 5 veces en el aclaramiento sistémico y un aumento en la semivida en comparación con rmetHu-leptina.

También, según se ha indicado antes, existen varios modos de determinar el radio de Stokes de una molécula. El presente radio de Stokes, para los fines de las presentes proteínas leptina glicosiladas, se determina utilizando filtración en gel, véase, Le Maire, et al., supra, véase, también, Kyte, Structure in Protein Chemistry, Garland Publishing, Inc., Nueva York y Londres, 1995, en las páginas 293-316, incorporado en esta memoria como referencia. Actualmente, la filtración gel para determinar el radio de Stokes la filtración en gel, utiliza perlas de polímero (agarosa) a las que se une covalentemente dextrano. Preparaciones comerciales incluyen Superdex™ 200 HR 10/30 (Pharmacia) y Sephacryl® S-200 high Resolution (Pharmacia). estas dos preparaciones se utilizaron alternativamente para determinar el radio de Stokes de las presentes proteínas leptina glicosiladas.

Una columna puede tener cualquier tamaño, pero se prefiere un tamaño de aproximadamente 1 x 30 cm para facilitar la manipulación. Los manuales de instrucciones para la preparación de la columna para cada una de las sustancias de filtración en gel anteriores se incorporan en esta memoria como referencia en su totalidad (documentos números 71-7059-00 Edition AB para Superdex™ y 52-2086-00-03 para Sephacryl®).

El tampón a utilizar debería ser bastante parejo a un tampón fisiológico que no altere significativamente la conformación de la solución de la molécula ni interfiera con la separación por tamaños de las moléculas de proteína. Se prefiere solución salina tamponada con fosfato, y ésta se utilizó para determinar el radio de Stokes de las presentes proteínas leptina glicosiladas.

El procedimiento para llevar a cabo la filtración en gel debería seguir generalmente los manuales de instrucciones tal como se incorporan anteriormente. La proteína leptina glicosilada seleccionada para la cual se ha de determinar un radio de Stokes debería ser cargada sobre la columna. Por debajo se utilizó, por ejemplo, una concentración de 0,4 A280/ml, que es aproximadamente 0,45 mg/ml, para una leptina glicosilada en tres sitios (47, 49, 102). Los tampones utilizados en este caso eran PBS, pero también se pueden utilizar otros tampones. El tampón para la carga debería ser compatible con buenas prácticas de filtración en gel y debería contener, en teoría, altos contenidos en sales y otros materiales consistentes que un experto en la técnica considerara apropiados. El tampón de carga o almacenamiento no debería interferir (ya sea precipitando al golpear la columna o ya sea desnaturalizándose y requiriendo un replegamiento a medida que se eluye) en la determinación del radio de Stokes. Se prefiere una columna de sustancias de filtración en gel que no hayan sido previamente utilizadas. El tampón de lavado, tal como solución salina tamponada con fosfato, debería aplicarse a una tasa de 0,25 ml/min o a un caudal lineal de 0,3 cm/min. Este valor se determinará mediante las propiedades del gel y básicamente por las instrucciones de los fabricantes. Las fracciones eluidas contienen las moléculas de proteínas leptina glicosiladas que no están atrapadas en la sustancia de filtración en gel.

Para determinar el radio de Stokes, es necesario comparar la proteína leptina glicosilada de ensayo con proteínas conocidas, utilizadas para calibrar la columna de filtración en gel. En esta memoria se incorporan como referencia los métodos que figuran en el manual de instrucciones del kit de calibración de filtración en gel (Gel Filtration Calibration Kit Instruction Manual) (Pharmacia Biotech documento 11-B-033-07, Rev. 2). En general, proteínas seleccionadas de un radio de Stokes conocido se filtran a través de la columna, y se anota la fracción en la que cada una eluye. La fracción que contiene la proteína leptina glicosilada objeto se compara con la fracción de las proteínas calibradas.

Así, las proteínas leptina glicosiladas son aquellas que tienen un radio de Stokes (del resto proteína leptina glicosilada solo, no incluyendo ninguna derivatización química que pueda ser realizada adicionalmente, tal como se indica más abajo) mayor que o igual a 30 \ring{A}, según se determina mediante filtración en gel. La filtración en gel se puede conseguir utilizando sustancias de filtración en gel de agarosa revestidas con dextrano, tales como Superdex™ o Sephacryl®, según se describe antes. El tampón puede ser solución salina tamponada con fosfato.

Secuencias de aminoácidos de leptina

1. Sitios de glicosilación. En general, para preparar la presente composición de leptina glicosilada se comenzará con una secuencia de aminoácidos seleccionada, y se modificará esa secuencia para que incluya la adición de sitios para la glicosilación enlazada a N o enlazada a O. Se prefiere la siguiente fórmula para añadir sitios para la glicosilación enlazada a N (véase, en general, Creighton, Proteins, W.H. Freeman and Company, N.Y., (1984) pág. 498, más el índice en las páginas 76-78, incorporado en esta memoria como referencia):

N - X - T/S

en donde "N" es asparagina, "X" es cualquier aminoácido, excepto prolina, y "T/S" es treonina o serina. Se prefiere la fórmula "N - X - T"; en donde la alteración con respecto a una secuencia de aminoácidos de leptina de partida es que "X" sigue siendo el mismo que para la secuencia de leptina de partida (preferiblemente SEQ.. ID N^{os} 1 ó 2, infra), y el aminoácido situado inmediatamente más abajo (hacia el extremo C) es treonina. Se prefieren sitios enlazados a N en la superficie exterior de la proteína. Residuos en la superficie adecuados para la glicosilación se pueden identificar mediante el examen de una estructura o modelo tridimensional, o mediante resonancia magnética nuclear o estructura cristalina (tal como se comenta más abajo). También, se ha determinado que una prolina en la posición -1 con respecto al residuo asparagina (es decir, hacia el extremo N) en algunos sitios de glicosilación puede ser perjudicial, y se puede pretender evitar un residuo prolina en un sitio de este tipo. Los Ejemplos de Trabajo 5 y 6 demuestran el efecto de la ocupación del sitio de glicosilación por N - X - S frente a N - X - T y aminoácidos adyacentes.

Los sitios de glicosilación enlazados a O se encuentran en la superficie exterior de las proteínas, generalmente próximos o adyacentes a los residuos prolina. Los sitios enlazados a O se pueden encontrar o introducir al incluir residuos serina o treonina próximos o adyacentes a residuos prolina. En general, se prefieren los residuos treonina. Por ejemplo, la SEQ. ID Nº: 1 (que figura más abajo) tiene una prolina en la posición 99, y se introdujo una treonina en la posición 100. Esta leptina se expresó en células CHO y células COS, y estaba glicosilada enlazada a O.

Además, se puede hacer una selección para combinar sitios enlazados a N y de glicosilación en O en las presentes proteínas leptina glicosiladas. Tal como se ha descrito antes, se pueden añadir uno o más sitios de glicosilación enlazados a O y, además, se pueden añadir uno o más sitios de glicosilación enlazados a N.

2. Sitios para la glicosilación. En general, se modificará la cadena principal de la proteína utilizando las fórmulas anteriores para añadir un sitio de glicosilación enlazado a N o enlazado a O.

Con el fin de seleccionar un sitio a lo largo de la cadena principial de la proteína para la glicosilación en N, la norma general es que el residuo asparagina debe estar situado en una superficie externa de la proteína con el fin de que esté disponible para añadir el resto hidrato de carbono. Por ejemplo, con respecto a la estructura tridimensional de leptina, el residuo asparagina debería estar en un bucle, giro \beta, o en una superficie exterior de una hélice alfa. Este análisis se basa en la actual estructura de leptina y en la relación funcional de la estructura de varias citoquinas.

Cuando se selecciona el sitio para la glicosilación, se puede considerar la conformación tridimensional de la leptina. Los primeros varios aminoácidos de leptina están desordenados, lo que indica un cierto grado de flexibilidad. Topológicamente, la estructura de leptina (véase, Zhang et al., Nature 387: 206-209 (1997) (que informan sobre la estructura cristalina de la proteína leptina de la obesidad E-100, incorporado en esta memoria como referencia) es similar a la estructura de la citoquina, factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF" - siglas en inglés) (véase, por ejemplo, patente de EE.UU. nº 5.581.476, Osslund, que describe la estructura tridimensional de rmetHuG-CSF cristalina).

Dada la aparente flexibilidad y la aparente carencia de importancia biológica de la hélice A, se puede elegir modificar la SEQ. ID Nº: 1 para que incluya sitios de glicosilación en los residuos Val1 o Pro2.

Asp23 (de SEQ. ID Nº: 1) se encuentra en el último giro de la hélice A y se considera una buena elección, ya que la cadena lateral se encuentra, al menos en parte, en la superficie exterior de la proteína.

El residuo prolina en la posición 47 y el residuo isoleucina en la posición 48 (de SEQ. ID Nº: 1) se encuentran en el extremo del bucle AB, sólo un par de residuos desde el comienzo de la hélice B. Se encuentran sobre la superficie de la proteína y pueden ser adecuados para la inserción del sitio para la glicosilación.

El residuo prolina en la posición 69 se encuentra en la superficie de la proteína, que es una buena posición para la glicosilación.

El residuo fenilalanina en la posición 92 se encuentra en el extremo de la hélice C, y su cadena lateral está enfrentada a lo que puede ser la cara de unión al receptor. Probablemente, esto proporciona el mejor resultado debido a que existe la menor interferencia de cualquier resto de glicosilación con la unión al receptor.

La serina en la posición 102 se encuentra en la superficie de la proteína en el centro del bucle CD y debería ser una porción relativamente flexible de la estructura, junto con las posiciones 101 (alanina) y 103 (glicina).

Así, la presente invención se refiere a una proteína leptina glicosilada que comprende la SEQ. ID Nº: 1 (rHu-leptina 1-146, véase más abajo) o la SEQ. ID Nº: 2 (rHu-leptina 1-145, véase más abajo) con una o más alteraciones de la secuencia como un sitio de glicosilación. Dichas alteraciones de la secuencia se pueden seleccionar entre:

01V\rightarrowN 02P\rightarrowA 03I\rightarrowT o S (es decir, alterando el primer aminoácido en la SEQ. ID Nº: 1, que figura más abajo, que es una valina, en asparagina, alterando el segundo aminoácido de prolina en cualquiera de los otros 19 aminoácidos (tal como alanina), y alterando el tercer aminoácido de isoleucina en treonina o serina);

02P\rightarrowN 03I 04Q\rightarrowT o S (es decir, alterando el segundo aminoácido en la SEQ. ID Nº: 1, que figura más abajo, que es una prolina, en asparagina, manteniendo el tercer aminoácido como isoleucina, y alterando el cuarto aminoácido de glutamina en treonina o serina);

23D\rightarrowN 24I 25S\rightarrowT o mantener como S (es decir, alterando el 23^{er} aminoácido en la SEQ. ID Nº: 1, que figura más abajo, que es un ácido aspártico, en asparagina, manteniendo el 24º aminoácido como isoleucina y para el 25º aminoácido, manteniendo como serina o alterando en treonina);

47P\rightarrowN 48I 49L\rightarrowT o S (es decir, alterando el 47º aminoácido de prolina en asparagina, manteniendo el 48º aminoácido como isoleucina y alterando el 49º aminoácido de leucina a serina o treonina);

48I\rightarrowN 49L 50T o T\rightarrowS (es decir, alterando el 48º aminoácido de isoleucina en asparagina, manteniendo el 49º aminoácido como leucina y manteniendo el 50º aminoácido como treonina o alterando en serina);

69P\rightarrow70S 71R\rightarrowT o S (es decir, alterando el 69º aminoácido en SEQ. ID Nº: 1, que figura más abajo, de prolina a asparagina, manteniendo el 70º aminoácido como serina y alterando el 71º aminoácido de arginina en treonina);

92F\rightarrow93S 94 K\rightarrowT o S (es decir, alterando el 92º aminoácido de SEQ. ID Nº: 1, que figura más abajo de fenilalanina en asparagina, manteniendo el 93º aminoácido como serina y alterando el 94º aminoácido de lisina en treonina o serina;

101A\rightarrowN 102S 103G\rightarrowT o S (es decir, alterando el 101º aminoácido en SEQ. ID Nº: 1, que figura más abajo, de alanina en asparagina, manteniendo el 102º aminoácido como serina y alterando el 103^{er} aminoácido de glicina en treonina o serina).

102S\rightarrowN 103G 104L\rightarrowT o S (es decir, alterando el 102º aminoácido en SEQ. ID Nº: 1, que figura más abajo de triptófano en asparagina, manteniendo el 103^{er} aminoácido como glicina y alterando el 104º aminoácido de leucina en treonina o serina).

103G\rightarrowN 104 L 105E\rightarrowT o S (es decir, alterando el 103^{er} aminoácido en SEQ. ID Nº: 1, que figura más abajo, de glicina en asparagina, manteniendo el 104º aminoácido como leucina y alterando el 105º aminoácido de ácido glutámico en treonina o serina).

Así, las anotaciones taquigráficas anteriores indican la localización del aminoácido con respecto a SEQ. ID Nº: 1, y el cambio de un aminoácido \rightarrow en otro aminoácido. Tal como se indica más abajo, se prefiere el cambio en el tercer aminoácido (el aminoácido hacia el extremo C de la proteína) en treonina para facilitar la fabricación comercial, particularmente en la eficacia de la glicosilación, a pesar de que, como se ha indicado antes, también se puede utilizar una serina en este lugar. Se utilizan abreviaturas de aminoácidos de una sola letra convencionales, tal como en Stryer, Biochemistry, Tercera Edición (1988), W. H. Freeman and Company, Nueva York, contratapa, incorporado en esta memoria como referencia.

A la vista de lo anterior, la presente invención también se refiere a una proteína leptina glicosilada que comprende SEQ. ID Nº: 1 (rHu-leptina 1-146, que figura más abajo) con una o más alteraciones en la secuencia como un sitio de glicosilación, seleccionada entre (en que "T/S" significa treonina o serina):

(a) 01V\rightarrowN 02P\rightarrowS (en que X es cualquier aminoácido excepto prolina) 03I\rightarrowT/S

(b) 02P\rightarrowN 03I 04Q\rightarrowT/S

(c) 23D\rightarrowN 24I 25S\rightarrowT/S

(d) 47P\rightarrowN 48I 49L\rightarrowT/S

(e) 48I\rightarrowN 49L 50T/S

(f) 69P\rightarrowN 70S 71R\rightarrowT/S

(g) 92F\rightarrowN 93S 94K\rightarrowT/S

(h) 101A\rightarrowN 102S 103G\rightarrowT/S

(i) 102S\rightarrowN 103G 104L\rightarrowT/S

(j) 103G\rightarrowN 104L 105E\rightarrowT/S

Los ejemplos de trabajo que figuran más abajo demuestran la actividad biológica que al menos se aproxima a la rmetHu-leptina 1-146 no glicosilada (SEQ. ID Nº: 1) para proteínas leptina de un sitio de glicosilación sencillo y doble. Además, proteínas leptina de tres, cuatro y cinco sitios de glicosilación particulares han demostrado una actividad biológica incrementada. Así, la presente invención también incluye proteínas leptina glicosiladas particulares, tales como se recogen en los ejemplos de trabajo:

- una proteína leptina glicosilada que comprende los aminoácidos 1-146 de SEQ. ID Nº: 1, que tiene un sitio de glicosilación situado en una posición seleccionada (con respecto a la numeración de SEQ. ID Nº: 1: 1, 2, 4, 8, 23, 44, 47, 48, 69, 70, 93, 97, 100, 101, 102, 103, 118 y 141.

- una proteína leptina glicosilada que comprende los aminoácidos 1-146 de SEQ. ID Nº: 1, que tiene dos sitios de glicosilación, seleccionándose dichos dos sitios entre (con respecto a la numeración de SEQ. ID Nº:1):

47 + 69;

48 + 69;

69 + 101;

69 + 102;

69 + 103;

69 + 118; y

100 + 102.

- una proteína leptina glicosilada que comprende los aminoácidos 1-46 de SEQ. ID Nº: 1, que tiene tres sitios de glicosilación, seleccionándose dichos tres sitios de entre (con respecto a la numeración de SEQ. ID Nº: 1):

2 + 47 + 69

23 + 47 + 69;

47 + 69 + 100;

47 + 69 + 102;

48 + 69 + 118;

69 + 102 + 118; y

69 + 103 + 118.

- una proteína leptina glicosilada que comprende los aminoácidos 1-146 de SEQ. ID Nº: 1, que tiene cuatro sitios de glicosilación, seleccionándose dichos cuatro sitios de entre (con respecto a la numeración de SEQ. ID Nº: 1):

2 + 47 + 69 + 92;

2 + 47 + 69 + 102;

23 + 47 + 69 + 92;

23+ 47 + 69 + 102; y

47 + 69 + 100 + 102.

- una proteína leptina glicosilada que comprende los aminoácidos 1-146 de SEQ. ID Nº: 1, que tiene cinco sitios de glicosilación, seleccionándose dichos cinco sitios de entre (con respecto a la numeración de SEQ. ID Nº: 1):

2 + 23 + 47 + 69 + 92

2 + 47 + 69 + 92 + 102;

23 + 47 + 69 + 92 + 102.

Más particularmente, la presente invención incluye las siguientes secuencias de aminoácidos de la proteína leptina glicosilada, ADNs que codifican dichas secuencias y ADNs específicos según se recogen más abajo:

Leptina glicosilada 2, 47, 69 (SEQ. ID Nº: 25, ADN):

1

\vskip1.000000\baselineskip

Leptina glicosilada 2, 47, 69 (SEQ. ID Nº: 26, proteína):

2

Leptina glicosilada 2, 47, 69, 92 (SEQ. ID Nº: 27, ADN):

3

Leptina glicosilada 2, 47, 69, 92 (SEQ. ID Nº: 28, proteína):

4

Leptina glicosilada 2, 47, 69, 102 (SEQ. ID Nº: 29, ADN):

5

Leptina glicosilada 2, 47, 69, 102 (SEQ. ID Nº: 30, proteína):

6

Leptina glicosilada 2, 69,102 (SEQ. ID Nº: 31, ADN):

7

Leptina glicosilada 47, 69, 102 (SEQ. ID Nº: 32, proteína):

8

Leptina glicosilada 2, 47, 69, 92, 102 (SEQ. ID Nº: 33, ADN):

9

Leptina glicosilada 2, 47, 69, 92, 102 (SEQ. ID Nº: 34, proteína):

10

Leptina glicosilada 47, 69, 92, 102 (SEQ. ID Nº: 35, ADN):

11

Leptina glicosilada 47, 69, 92, 102 (SEQ. ID Nº: 36, proteína):

12

Éstas eran las secuencias de aminoácidos específicas y los correspondientes ADNs utilizados en los ejemplos de trabajo que figuran más abajo.

Caracterización mediante restos ácido siálico

Además, las presentes proteínas glicosiladas se pueden caracterizar por su número de restos ácido siálico. En general, puede haber de cero a cuatro restos ácido siálico en un sitio de glicosilación enlazado a N, y cero a dos restos ácido siálico en un sitio de glicosilación enlazado a O. Una preparación de proteína glicosilada típica contendrá una mezcla de moléculas de proteínas glicosiladas sialadas por completo (es decir, con un resto ácido siálico que ocupa todos los sitios disponibles) y parcialmente sialadas (es decir, con un resto ácido siálico que ocupa menos de todos los sitios disponibles).

El número de restos ácido siálico puede determinarse por métodos disponibles por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede medir el peso molecular de la proteína o preparación de la misma antes y después del tratamiento con enzimas que separan ácido siálico, y calcular el peso molecular de los constituyentes. Alternativamente, se puede utilizar un enfoque isoeléctrico y otros métodos para determinar el contenido en ácido siálico.

Por ejemplo, leptina humana 1-145 (SEQ. ID Nº: 2, que figura más abajo) contiene dos sitios de glicosilación enlazados a O y, así, cuando está totalmente sialada, cuatro restos ácido siálico. Los presentes ejemplos de trabajo con un solo sitio de glicosilación enlazado a N contienen cuatro restos ácido siálico cuando están totalmente sialados. Las proteínas leptina glicosiladas en dos sitios que figuran más abajo, cuando están totalmente glicosiladas, contienen 8 restos ácido siálico, las de tres sitios, 12 restos ácido siálico, las de cuatro, 16 restos ácido siálico y las leptinas glicosiladas en cinco sitios, 20 restos ácido siálico. Así, la presente invención abarca una preparación de proteína leptina glicosilada en donde cada molécula de proteína leptina glicosilada en dicha preparación tiene cinco o más restos ácido siálico. Más preferiblemente, con el fin de reforzar un efecto de liberación sostenido de una proteína terapéutica, la presente invención también abarca una preparación de proteína leptina glicosilada, en donde cada molécula de proteína leptina glicosilada en dicha preparación tiene de 8 a 20 restos ácido siálico. También se puede elegir añadir sitios de glicosilación adicionales y aumentar el contenido en ácido siálico por encima de 20 de manera correspondiente.

3. Cadena principal de proteína leptina. El tipo de leptina utilizado para las composiciones farmacéuticas de leptina glicosiladas puede seleccionarse de las descritas en la Publicación Internacional PCT número WO96/05309, tal como se cita anteriormente e incorporada en esta memoria como referencia en su totalidad. La figura 3 de esa publicación (tal como se cita en esta memoria SEQ. ID Nº: 4) describe la secuencia de aminoácidos deducida completa para la leptina humana (a la que también se alude como proteína "OB" humana). Los aminoácidos se numeran del 1 al 167. Un sitio de escisión de la secuencia señal está situado después del aminoácido 21 (Ala), de manera que la proteína madura se extiende desde el aminoácido 22 (Val) al aminoácido 167 (Cys). Para la presente descripción, en esta memoria se utiliza una numeración diferente, en donde la posición 1 del aminoácido es el residuo valina que se encuentra al comienzo de la proteína madura.

La secuencia de aminoácidos para leptina humana madura recombinante se presenta en esta memoria como SEQ. ID Nº: 1, en donde el primer aminoácido de la proteína madura es valina (en la posición 1) (denominada en esta memoria rHu-leptina 1-146, SEQ. ID Nº: 1):

13

Alternativamente, se puede utilizar una variante natural de leptina humana que tiene 145 aminoácidos y, en comparación con rHu-leptina 1-146, tiene una glutamina ausente en la posición 28, que se presenta más abajo (denominada en esta memoria rHu-leptina 1-145, SEQ. ID Nº: 2, en donde el espacio en blanco ("-") indica ningún aminoácido):

14

Por ejemplo, para las proteínas leptina glicosiladas específicas citadas en esta memoria, se puede elegir utilizar la versión "Q-" de leptina humana (1-145, SEQ. ID Nº: 2) y modificar los correspondientes sitios numerados para la leptina humana de 1-146 aminoácidos, de modo que incluya sitios de glicosilación.

En general, la proteína leptina para uso en esta memoria será capaz de ser utilizada terapéuticamente en seres humanos (véase, también, leptinas animales que figuran más abajo). Así, uno puede someter a ensayo empírico la actividad para determinar qué formas de proteína leptina se pueden utilizar. Tal como se recoge en el documento WO96/05309, la proteína leptina en su forma nativa o fragmentos (tales como productos de escisión enzimática) u otras formas truncadas y análogos pueden todos ellos conservar una actividad biológica. Cualesquiera de estas formas se puede utilizar para preparar las presentes composiciones de leptina glicosilada, a pesar de que formas alteradas de este tipo deberían ser sometidas a ensayo para determinar características deseadas. Véanse, también, las publicaciones internacionales PCT números WO96/40912, WO97/06816, WO97/18833, WO 97/38014 y WO98/08512, todas ellas incorporadas aquí como referencia.

Se puede preparar un análogo de leptina humana recombinante alterando los residuos aminoácidos en la secuencia humana recombinante, tal como sustituyendo los aminoácidos que divergen de la secuencia murínica. La leptina murínica es esencialmente homóloga a la leptina humana, en particular en calidad de una proteína madura y, además, particularmente en el extremo N. Dado que la proteína humana recombinante tiene actividad biológica en ratones, un análogo de este tipo sería posiblemente activo en seres humanos. Por ejemplo, en la secuencia de aminoácidos de leptina humana nativa según se presenta en la SEQ. ID Nº: 1, se pueden sustituir con otro aminoácido uno o más de los aminoácidos en las posiciones 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145. Se puede seleccionar el aminoácido en la correspondiente posición de proteína murínica (SEQ. ID Nº: 3) u otro aminoácido.

Se pueden preparar adicionalmente moléculas sintéticas basadas en la secuencia de leptina de rata, denominada proteína OB. Murakami et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 209:944-52 (1995) incorporada en esta memoria como referencia. La proteína OB de ratas difiere de la proteína OB humana en las siguientes posiciones (utilizando la numeración de SEQ. ID Nº: 1): 4, 32, 33, 35, 50, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138 y 145. Se puede sustituir otro aminoácido por uno o más de los aminoácidos en estas posiciones divergentes. Las posiciones en negrilla son aquellas en las que la proteína OB murínica, así como la proteína OB de rata son divergentes de la proteína OB humana y, así, son particularmente adecuadas para la alteración. En una o más de las posiciones, se puede sustituir un aminoácido procedente de la correspondiente proteína OB de rata u otro aminoácido.

Las posiciones de proteína OB tanto de rata como murínica que divergen de la proteína OB humana madura son: 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145. Una proteína OB de acuerdo con SEQ. ID Nº: 1 que tiene 1 o más de los aminoácidos anteriores reemplazados por otro aminoácido, tal como el aminoácido que se encuentra en la correspondiente secuencia de rata o murínica, también puede ser eficaz.

Además, los aminoácidos encontrados en la proteína OB de monos rhesus que divergen de la proteína OB humana madura son (con las identidades señaladas entre paréntesis en la abreviatura de aminoácido de una letra): 8 (S), 35 (R), 48 (V), 53 (Q), 60 (I), 66 (I), 67 (N); 68 (L), 89 (L), 100 (L), 108 (E), 112 (D) y 118 (L). Dado que la proteína OB humana recombinante es activa en monos cynomolgus, una proteína OB humana de acuerdo con SEQ. ID Nº: 1 que tenga uno o más de los aminoácidos divergentes de monos rhesus reemplazado por otro aminoácido, tal como los aminoácidos entre paréntesis, puede ser eficaz. Debe señalarse que determinados aminoácidos divergentes de rhesus se encuentran también en las especies murínicas anteriores (posiciones 35, 68, 89, 100 y 112). Así, se puede preparar una molécula consenso murínica/rhesus/humana (utilizando la numeración de SEQ. ID Nº: 1) que tenga uno o más de los aminoácidos en las posiciones reemplazadas por otro aminoácido: 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145.

Se pueden preparar otros análogos suprimiendo una parte de la secuencia de aminoácidos de la proteína. Por ejemplo, la proteína madura carece de una secuencia señal (-22 a -1). Se puede suprimir una parte de la proteína madura, y esta supresión puede incidir en la fabricación, por ejemplo, la escisión del péptido señal u otras presecuencias más allá del primer aminoácido N-terminal de la proteína madura. También, el extremo N puede contener uno o más aminoácidos adicionales, que pueden incidir a utilizar presecuencias de este tipo, tales como, por ejemplo, la escisión en el centro de un sitio de escisión del péptido señal, de modo que se fija una parte de los aminoácidos del sitio de escisión.

Se pueden preparar las siguientes formas truncadas de molécula de proteína leptina humana (utilizando la numeración de SEQ. ID Nº: 1):

(a) aminoácidos 98-146;

(b) aminoácidos 1-99 y (conectados a) 112-146;

(c) aminoácidos 1-99 y (conectados a) 112-146 con uno o más aminoácidos 100-111 colocados secuencialmente entre los aminoácidos 99 y 112.

Además, las formas truncadas también pueden tener alterados uno o más de los aminoácidos que son divergentes (en la proteína OB murínica, de rata o rhesus) de la proteína OB humana. Además, cualesquiera alteraciones pueden estar en forma de aminoácidos alterados tal como peptidomiméticos o D-aminoácidos.

Se incluyen aquellas proteínas tal como se recogen anteriormente con sustituciones de aminoácidos que son "conservativas" de acuerdo con la acidez, carga, carácter hidrófobo, polaridad, tamaño o cualquier otra característica conocida por los expertos en la técnica. Esto se recoge en la Tabla 1 que figura más abajo. Véase, en general, Creighton, Proteins, W.H. Freeman and Company, N.Y., (1984) pág. 498, más índice, passim. Véase, en general, Ford et al., Protein Expression and Purification 2 : 95-107, 1991, que se incorpora en esta memoria como referencia.

TABLA 1 Sustituciones de aminoácidos conservativas

De carácter básico:	arginina
	lisina
	histidina
De carácter ácido:	ácido glutámico
	ácido aspártico
Polar:	glutamina
	asparagina
De carácter hidrófobo:	leucina
	isoleucina
	valina
Aromática:	fenilalanina
	triptófano
	tirosina
Pequeña:	glicina
	alanina
	serina
	treonina
	metionina

Por lo tanto, las presentes proteínas leptina humanas glicosiladas se pueden preparar comenzando primero con una secuencia seleccionada entre (de acuerdo con la secuencia de aminoácidos tal como se presenta en SEQ. ID Nº: 1 en esta memoria):

(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID Nº: 1, que carece opcionalmente de un residuo glutaminilo en la posición 28;

(b) una secuencia de aminoácidos de la subparte (a) con un aminoácido diferente sustituido en una o más de las siguientes posiciones: 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145.

(c) un análogo de proteína leptina truncada seleccionado de: (utilizando la numeración de la subparte (a) anterior):

(i)

aminoácidos 98-146

(ii)

aminoácidos 1-99 y 112-146

(iii)

aminoácidos 1-99 y 112-146 con uno o más de los aminoácidos 100-111 dispuestos secuencialmente entre los aminoácidos 99 y 112; y

(iv)

el análogo de leptina truncada de la subparte (i) con uno o más de los aminoácidos 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145 sustituido con otro aminoácido;

(v)

el análogo de leptina truncada de la subparte (ii) que tiene uno o más de los aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 y 145, reemplazados por otro aminoácido;

(vi)

el análogo de leptina truncada de la subparte (iii) que tiene uno o más de los aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145, reemplazados por otro aminoácido; y

(d) una proteína leptina de cualquiera de las subpartes (a)-(c) con una o más sustituciones de aminoácidos conservadas, y seleccionando luego un sitio, preferiblemente en la superficie externa de una hélice alfa con el fin de insertar, mediante adición o sustitución, un sitio de glicosilación. Sitios de glicosilación particulares se relacionan en lo que antecede.

Proteínas leptina, análogos y moléculas relacionadas también se reseñan en las siguientes publicaciones; sin embargo, no se hace ninguna representación con respecto a la actividad de ninguna composición reseñada:

Patentes de EE.UU. n^{os} 5.521.283; 5.525.705; 5.532.336; 5.552.522; 5.552.523; 5.552.524; 5.554.727; 5.559.208; 5.563.243; 5.563.244; 5.563.245; 5.567.678; 5.567.803; 5.569.743; 5.569.744; 5.574.133; 5.580.954; 5.594.101;
5.594.104; 5.605.886; 5.614.379; 5.691.309; 5.719.266 (todas cedidas a Eli Lilly and Company);

documentos PCT WO96/23513; WO96/23514; WO96/23515; WO96/23516; WO96/23517; WO96/23518; WO96/
23519; WO96/23520; WO96/23815; WO96/24670; WO96/27385; EP 725078; EP 725079 (todos cedidos a Eli Lilly and Company);

PCT WO96/22308 (cedido a Zymogenetics);

PCT WO96/29405 (cedido a Ligand Pharmaceuticals, Inc.);

PCT WO96/31526 (cedido a Amylin Pharmaceuticals, Inc.);

PCT WO96/34885 (cedido a Smithkline Beecham PLC):

PCT WO96/35787 (cedido a Chiron);

EP 736599 (cedido a Takeda);

EP 741187 (cedido a F. Hoffman LaRoche).

En la medida en que estas referencias proporcionan proteínas leptina o análogos útiles, o composiciones o métodos asociados, dichas composiciones y/o métodos pueden utilizarse en unión con las presentes composiciones farmacéuticas de leptina glicosilada, tales como para la co-administración (juntas o por separado, en una lista de dosificación seleccionada). Con las condiciones anteriores, estas publicaciones se incorporan en esta memoria como referencia.

Ácidos nucleicos, vectores, células huésped y otros sistemas de expresión

También comprendidos por la presente invención se encuentran ácidos nucleicos que codifican las presentes proteínas leptina glicosiladas. Ácidos nucleicos de este tipo se pueden preparar mediante mutagénesis dirigida al sitio de una secuencia de ácidos nucleicos existente o por medios sintéticos, o por otros medios tal como están disponibles para los expertos en la técnica. Métodos como los descritos en los Ejemplos de Referencia que figuran más abajo son ilustrativos.

Los vectores incluyen vectores plasmídicos, así como vectores virales según están disponibles para los expertos en la técnica. Los vectores pueden ser para la clonación o expresión, e incluyen plásmidos, cósmidos y virus que infestan a células procarióticas o eucarióticas. Para la expresión de una proteína glicosilada, los vectores serán útiles para la expresión en una célula eucariótica. El sistema de expresión puede ser constitutivo o inducible, tal como sistemas que incluyen un promotor LTR de tumor mamario en ratón inducible. Reforzadores, terminadores de la transcripción, donantes de corte y empalme y sitios de aceptor, y otros elementos pueden estar incluidos en el sistema global, según se conoce por los expertos en la técnica.

Vectores descritos en los Ejemplos de Referencia que figuran más abajo son ilustrativos. Los presentes ejemplos de trabajo utilizaban una forma modificada de pDSR\alpha2 para expresar proteínas leptina glicosiladas.

Las células huésped pueden ser procarióticas, tales como bacterias utilizadas para la clonación de los presentes ácidos nucleicos, por ejemplo. Otras células huésped pueden ser eucarióticas. Células huésped eucarióticas se pueden seleccionar del filo Chordata, tal como aquellas en la clase Mamíferos. Se pueden utilizar células de primates, incluidas células humanas (tales como Namalwa, HeLa, carcinoma hepatocelular humano, tal como células Hep G2, células de riñón embrionario humano, células de hígado humano, células de pulmón humano o células cultivadas a partir de fuentes humanas) y células COS, u otras células de mamíferos, tales como células de riñón de hámster bebé (células "BHK"- siglas en inglés), células de ovario de hamster chino (células "CHO"- siglas en inglés), células sertoli de ratón, células de riñón de perro, células de hígado de rata búfalo, células de tumores mamarios en ratón. También se pueden utilizar células de insectos. También se incluyen organismos inferiores de células huésped, tales como levaduras y hongos. Véase, en general, Margulis, Five Kingdoms, 2ª edición (1988) W.H. Freeman & Co., Nueva York, para las clasificaciones de organismos.

Se puede buscar la co-expresión de más de una proteína deseada. Por ejemplo, la presente proteína leptina glicosilada se puede expresar en una célula huésped eucariótica con una o más de otras proteínas deseadas. Las proteínas se pueden separar utilizando un cierto número de técnicas de separación disponibles, dependiendo de las características de la proteína. Por ejemplo, en una célula huésped sencilla, tal como una célula CHO se puede expresar una proteína leptina glicosilada, así como una proteína diferente, tal como una proteína glicosilada diferente deseada para el uso terapéutico. Se puede utilizar, por ejemplo, el peso molecular para separar las proteínas para la purificación. De esta manera se pueden conseguir ahorros de fabricación y producir dos proteínas diferentes a partir de un único cultivo celular.

También se pueden utilizar animales transgénicos para expresar la presente proteína leptina glicosilada. Por ejemplo, se puede utilizar un animal productor de leche transgénico (una vaca o cabra, por ejemplo) y obtener la presente proteína leptina glicosilada en la leche producida. Se pueden utilizar plantas para producir las presentes proteínas glicosiladas pero, en general, la glicosilación que se produce en plantas es diferente de la que se produce en células de mamíferos, y puede dar como resultado un producto glicosilado que no sea adecuado para el uso terapéutico humano.

Terapia génica

El ADN proporcionado en esta memoria (o ARNs correspondientes) también se puede utilizar para la terapia génica. Un artículo de revisión sobre la terapia génica es Verma, Scientific American, noviembre 1990, páginas 68-84, que se incorpora en esta memoria como referencia.

Así, la presente invención proporciona una población de células que expresan la presente proteína leptina glicosilada. Células de este tipo son adecuadas para el trasplante o la implantación en un individuo para fines terapéuticos. Se pueden entonces implantar células de este tipo en un individuo. Por ejemplo, células de este tipo pueden ser células del hígado, células de la médula ósea o células derivadas del cordón umbilical. Alternativamente, se puede desear utilizar células circulantes tales como células progenitoras de la sangre, células T u otras células de la sangre. Para seres humanos, se pueden utilizar células humanas. Las células pueden estar en forma de tejido. Células de este tipo se pueden cultivar antes del transplante o la implantación.

Las células a transferir al receptor se pueden cultivar utilizando uno o más factores que afectan al crecimiento o la proliferación de células de este tipo, si es apropiado. En el cultivo de células hemotopoyéticas se pueden utilizar factores hematopoyéticos. Factores de este tipo incluyen G-CSF, EPO, MGDF. SCF, ligando Flt-3, interleuquinas (por ejemplo, IL1-IL13), GM-CSF, LIF, y análogos y derivados de los mismos según se encuentran disponibles para un experto en la técnica.

Células nerviosas, tales como neuronas o glia, también se pueden utilizar, y éstas se pueden cultivar con factores neurotróficos tales como BDNF, CNTF, GDNF, NT3, u otros.

Técnicas para la encapsulación de células vivas son familiares para los expertos ordinarios en la técnica, y la preparación de las células encapsuladas y su implantación en pacientes se puede lograr sin una experimentación excesiva. Por ejemplo, Baetge et al. (publicación internacional nº WO 95/05452; solicitud internacional nº PCT US94/09299, cuya descripción se incorpora con ello como referencia) describen cápsulas de membrana que contienen células tratadas por ingeniería genética para el suministro eficaz de moléculas biológicamente activas. Las cápsulas son biocompatibles y son fácilmente reparables. Las cápsulas encapsulan a células transfectadas con moléculas de ADN recombinante que comprenden secuencias de ADN que codifican moléculas biológicamente activas operativamente enlazadas a promotores que no son objeto de una regulación in vivo tras su implantación en un huésped mamífero. Los dispositivos proporcionan el suministro de las moléculas a partir de células vivas a sitios específicos dentro de un receptor. Además, véanse las patentes de EE.UU. números 4.892.538, 5.011.472 y 5.106.627, cada una de las cuales se incorpora específicamente en esta memoria como referencia. Un sistema para encapsular células vivas se describe en la solicitud PCT WO 91/10425 de Aebischer et al. específicamente incorporada en esta memoria como referencia. Véase, también, la solicitud PCT WO 91/10470 de Aebischer et al., Winn et al., Exper. Neurol. 113: 322-329 (1991), Aebischer et al., Exper. Neurol. 111: 269-275, (1991); Tresco et al., ASAIO 38: 17-23 (1992), cada una de las cuales se incorpora específicamente en esta memoria como referencia.

También se prevé un suministro de terapia génica in vivo e in vitro de la presente proteína leptina glicosilada. La terapia génica in vivo se puede conseguir introduciendo el ácido nucleico que codifica una presente proteína leptina glicosilada en células a través de la inyección local de una molécula de polinucleótido u otros vectores de suministro apropiados. (Hefti, J. Neurobiology,. 25: 1418-1435, 1994). Por ejemplo, una molécula de polinucleótido que codifica una proteína leptina glicosilada puede estar contenida en un vector de virus adeno-asociado para el suministro a las células objetivo (por ejemplo Johnson, publicación internacional nº WO 95/34670; solicitud internacional nº PCT/US95/07178, cuya descripción se incorpora con ello como referencia). El genoma del virus adeno-asociado (AAV - siglas en inglés) recombinante contiene repeticiones terminales invertidas de AAV que flanquean una secuencia de ADN que codifica el factor neurotrópico enlazado operativamente al promotor funcional y a secuencias de poliadenilación.

Vectores virales alternativos incluyen, pero no se limitan a retrovirus, adenovirus, virus herpes simplex y vectores de virus de papiloma. La patente de EE.UU. 5.672.344 (expedida el 30 de septiembre de 1997), Kelley et al., Universidad de Michigan), cuya descripción se incorpora con ello como referencia, describe un sistema de transferencia de genes mediado por virus in vivo que implica un vector HSV-1 neurotrópico recombinante. La patente de EE.UU. 5.399.346 (expedida el 21 de marzo de 1995, Anderson et al., Department of Health and Human Services), cuya descripción se incorpora en esta memoria como referencia, proporciona ejemplos de un procedimiento para proveer a un paciente de una proteína terapéutica mediante el suministro de células humanas que han sido tratadas in vitro para insertar un segmento de ADN que codifica una proteína terapéutica. Métodos y materiales adicionales para la práctica de técnicas de terapia génica, cuyas descripciones se incorporan como referencia en esta memoria, se describen en la patente de EE.UU. 5.631.236 (expedida el 20 de mayo de 1997, Woo et al., Baylor College of Medicine) que implica vectores adenovirales; la patente de EE.UU. 5.672.510 (expedida el 30 de septiembre de 1997, Eglitis et al., Genetic Therapy, Inc.) que implica vectores retrovirales; y la patente de EE.UU. 5.635.399 (expedida el 3 de junio de 1997, Kriegler et al., Chiron Corporation) que implica vectores retrovirales que expresan citoquinas.

Métodos de suministro no virales incluyen la transferencia mediada por liposomas, el suministro de ADN desnudo (inyección directa), transferencia mediada por receptor (complejo de ligando y ADN), electroporación, precipitación con fosfato de calcio y bombardeo de micropartículas (por ejemplo cañón de genes). Materiales y métodos de terapia génica también pueden incluir promotores inducibles, reforzadores-promotores específicos de los tejidos, secuencias de ADN diseñadas para la integración específica del sitio, secuencias de ADN capaces de proporcionar una ventaja selectiva frente a la célula parental, marcas para identificar células transformadas, sistemas de selección negativa y sistemas de control de la expresión (medidas de seguridad), agentes de unión específicos de células (para células objetivo), factores de internalización específicos de células, factores de transcripción para reforzar la expresión mediante un vector, así como métodos para la fabricación del vector. Métodos y materiales adicionales de este tipo para la práctica de las técnicas de terapia génica, cuyas descripciones se incorporan en esta memoria como referencia, se describen en la patente de EE.UU. 4.970.154 (expedida el 13 de noviembre de 1990, D.C. Chang, Baylor College of Medicine), técnicas de electroporación; documento WO 9640958 (publicado 961219, Smith et al., Baylor College of Medicine) ligandos nucleares; patente de EE.UU. 5.679.559 (expedida el 21 de octubre de 1997, Kim et al., University of Utah Research Foundation) que concierne a un sistema que contiene lipoproteínas para el suministro de genes; patente de EE.UU. 5.676.954 (expedida el 14 de octubre de 1997, K.L. Brigham, Vanderbilt University que implica soportes de liposomas; patente de EE.UU. 5.593.875 (expedida el 14 de enero de 1997, Wurm et al., Genentech, Inc.) que concierne a métodos para la transfección con fosfato de calcio; y la patente de EE.UU. 4.945.050 (expedida el 31 de julio de 1990, Sanford et al., Cornell Research Foundation), en donde partículas biológicamente activas son impulsadas a células a una velocidad en la que las partículas penetran en la superficie de las células y quedan incorporadas en el interior de las células. Técnicas del control de la expresión incluyen la regulación química inducida (por ejemplo, documentos WO 9641865 y WO 9731899), el uso de un antagonista de progesterona en un sistema de receptor de hormonas esteroides modificado (por ejemplo patente de EE.UU. 5.364.791), sistemas de control de ecdisona (por ejemplo, documento WO 9637609) y transactivadores controlables por tetraciclina positivos (por ejemplo, patentes de EE.UU. 5.589.362; EE.UU. 5.650.298; y EE.UU. 5.654.168).

También se contempla que la presente terapia génica o terapia de células pueda incluir adicionalmente el suministro de una segunda composición terapéutica. Por ejemplo, la célula huésped se puede modificar de modo que exprese y libere tanto una proteína leptina glicosilada como una leptina humana nativa. Alternativamente, éstas se pueden expresar y liberar a partir de células separadas. Células de este tipo pueden ser introducidas por separado en el paciente o las células pueden estar contenidas en un dispositivo sencillo implantable, tal como la membrana encapsulante antes descrita.

Moléculas de unión selectiva

La presente invención también se refiere a restos de unión selectiva de las presentes proteínas leptina humanas glicosiladas. Un "resto de unión selectiva" significa una sustancia que se une selectivamente a las presentes proteínas leptina humanas glicosiladas. en forma glicosilada o no glicosilada. La selectividad se determina viendo si el resto de unión se une a la proteína leptina objeto por encima de niveles de fondo (no selectivos). Las moléculas de unión selectiva son anticuerpos, tales como monoclonales, policlonales, policlonales monoespecíficos, producidos, por ejemplo, por tecnología de hibridoma o utilizando medios de ácidos nucleicos recombinantes. Véase, por ejemplo, Huse et al., Science 246: 1275 (1989). También quedan comprendidos en esta memoria ácidos nucleicos, vectores, células huésped y otros materiales y métodos utilizados en la expresión de ácidos nucleicos recombinantes de un resto de unión selectivo, tal como un anticuerpo recombinante. Se pueden fijar marcas detectables a restos de unión selectivos de este tipo, tales como marcas quimioluminiscentes, fluorescentes, colorimétricas o radiactivas utilizando materiales y métodos disponibles para los expertos en la técnica. Se pueden preparar ensayos, o kits, que contienen una o más de estas moléculas de unión selectiva para la detección o medición de las presentes proteínas leptina. Es ilustrativo un kit que incluye anticuerpos monoclonales selectivos para una proteína leptina glicosilada particular, y medios para detectar la unión selectiva de dichos anticuerpos monoclonales a dicha proteína leptina glicosilada. Otros materiales y métodos para kits de este tipo están disponibles para los expertos en la técnica.

Formulaciones y derivados

Todavía en otro aspecto de la presente invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas de las presentes composiciones de leptina glicosilada, y derivados (véase más abajo). Composiciones farmacéuticas de este tipo pueden ser para administración mediante inyección o por vía oral, intratecal, pulmonar, nasal, transdermal u otras formas de administración. En general, quedan comprendidas por la invención composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades eficaces de proteína o productos derivados de la invención junto con diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o soportes farmacéuticamente aceptables. Composiciones de este tipo incluyen diluyentes de diverso contenido en tampón (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica; aditivos, tales como detergentes y agentes solubilizantes (por ejemplo, Tween 80, Polysorbate 80), anti-oxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), conservantes (por ejemplo, Thimersol, alcohol bencílico) y sustancias conferidoras de consistencia (por ejemplo, lactosa, manitol); la incorporación del material en preparaciones en partículas de compuestos polímeros tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc. o en liposomas. Véase, por ejemplo, el documento PCT WO96/29989, Collins et al., "Stable protein: phospholipid compositions and methods", publicado el 3 de octubre de 1996, incorporada en esta memoria como referencia. También se puede utilizar ácido hialurónico, y éste puede tener el efecto de fomentar una duración sostenida en la circulación. Composiciones de este tipo pueden influir sobre el estado físico, la estabilidad, la tasa de liberación in vivo y la tasa de aclaramiento in vivo de las presentes proteínas y derivados. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712 que se incorporan en esta memoria como referencia. Las composiciones se pueden preparar en forma líquida o pueden estar en un polvo seco, tal como forma liofilizada. También se contemplan formulaciones de liberación retardada implantables, como son formulaciones transdermales.

Específicamente, se contemplan formas de dosificación oral de las proteínas derivatizadas anteriores. La proteína se puede modificar químicamente de modo que el suministro oral del derivado sea eficaz. En general, la modificación química contemplada es la fijación de al menos un resto a la molécula de proteína (o péptido) propiamente dicha, en donde dicho resto permite (a) la inhibición de la proteolisis; y (b) la absorción en el torrente sanguíneo a partir del estómago o intestino. También se desea el incremento en la estabilidad global de la proteína y el incremento en el tiempo de circulación en el cuerpo. Véase el documento PCT WO 95/21629, Habberfield, "Oral Delivery of Chemically Modified Proteins" (publicada el 17 de agosto de 1995), incorporada en esta memoria como referencia y la patente de EE.UU. 5.574.018, Habberfield et al., "Conjugates of Vitamin B12 and Proteins", expedida el 12 de noviembre de 1996, incorporada en esta memoria como referencia. Los materiales y métodos descritos en esta memoria son aplicables a las presentes composiciones de leptina glicosilada y métodos.

También se contempla en esta memoria el suministro pulmonar de la presente proteína o derivado de la misma. La proteína (derivado) se suministra a los pulmones de un mamífero al tiempo que inhala y atraviesa el revestimiento epitelial de los pulmones hacia la corriente sanguínea. Véase, documento PCT WO94/20069, Niven et al., "Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor", publicado el 15 de septiembre de 1994, incorporado en esta memoria como referencia, y el documento PCT WO95/05309, previamente incorporado como referencia en la página 83 y siguientes, por ejemplo. Las presentes proteínas leptina glicosiladas se pueden secar por pulverización en partículas con un tamaño medio de menos de 10 micras o, más preferiblemente, de 0,5 a 5 micras. Dependiendo de la densidad de cada partícula, se pueden utilizar partículas de mayor tamaño.

También se contempla el suministro nasal de la proteína (o análogo o derivado). El suministro nasal permite el paso de la proteína al torrente sanguíneo directamente después de administrar el producto terapéutico a la nariz, sin la necesidad de la deposición del producto en los pulmones. Formulaciones para el suministro nasal incluyen aquellas con agentes reforzadores de la absorción, tal como dextrano o ciclodextrano. También se contempla el suministro vía transporte a través de otras membranas mucosas.

Las presentes proteínas leptina glicosiladas pueden también derivatizarse mediante la fijación de uno o más restos químicos al resto proteína. Se ha encontrado que la modificación química de proteínas biológicamente activas proporciona ventajas adicionales bajo determinadas circunstancias, tal como incrementando la estabilidad y el tiempo de circulación de la proteína terapéutica y disminuyendo la inmunogenicidad. Véase, la patente de EE.UU. nº 4.179.337, Davis et al., expedida el 18 de diciembre de 1979. Para una revisión, véase Abuchowski et al., en Enzymes as Drugs. (J.S. Holcerberg y J. Roberts, eds. págs. 367-383 (1891)). Un artículo de revisión que describe la modificación de la proteína y proteínas de fusión es Francis, Focus on Growth Factors 3: 4-10 (mayo de 1992) (publicado por Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, Londres N20, OLD, GB). Puede desearse modificar adicionalmente las presentes composiciones de leptina glicosiladas, tal como añadiendo, por modificación química, un polímero soluble en agua. La adición de un resto químico requerirá probablemente una etapa adicional de fabricación, pero puede dar como resultado beneficios adicionales en términos de características mejoradas del producto (con la advertencia de que bajo algunas condiciones, la derivatización química puede hacer al producto menos deseable, tal como induciendo la formación de vacuolas en los riñones, véase supra). Los restos químicos deberían fijarse a la proteína, teniendo en consideración los efectos sobre dominios funcionales o antigénicos de la proteína. Existe un cierto número de métodos de fijación disponibles para los expertos en la técnica. Por ejemplo. el documento PCT WO96/11953, "N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods", publicado el 25 de abril de 1996, incorporado en esta memoria como referencia y en su totalidad y el documento EP 0 401 384, incorporado en esta memoria como referencia (acoplamiento de PEG a G-CSF). Los métodos y polímeros descritos en esta memoria en las publicaciones anteriores aplicables a las presentes composiciones de leptina glicosiladas, si la derivatización se desea para mejorar adicionalmente las características de una composición terapéutica, por ejemplo.

Proteínas de fusión se pueden preparar fijando poliaminoácidos a resto proteína leptina glicosilada. Por ejemplo, el poliaminoácido puede ser una proteína soporte que sirve para aumentar adicionalmente la semivida de circulación de la proteína. Para los presentes fines terapéuticos o cosméticos, un poliaminoácido de este tipo debería ser aquel que no creara una respuesta antigénica neutralizante ni otra respuesta adversa. Un poliaminoácido de este tipo se puede seleccionar del grupo que consiste en albúmina de suero (tal como albúmina de suero humano), un anticuerpo o parte del mismo (tal como una región constante de anticuerpo, a veces denominada "Fc"), u otros poliaminoácidos. La localización de la fijación del poliaminoácido puede encontrarse en el extremo N del resto proteína leptina glicosilada, o en otro lugar, y también puede conectarse por un resto "enlazador" químico a la proteína. Véase, por ejemplo, el documento PCT WO 98/28427, publicado el 2 de julio de 1998, titulado "Ob Fusion Protein Compositions and Methods", incorporado en esta memoria como referencia en su totalidad. El poliaminoácido se puede utilizar para ayudar a la detección o purificación, tal como utilizando una marca "FLAG", marca "his", marca "myc" u otra marca de poliaminoácido conocida por los expertos en la técnica.

Marcas detectables relacionadas se pueden fijar a las presentes proteínas leptina glicosiladas. Para un marcaje de este tipo de las presentes proteínas se pueden utilizar radioisótopos, compuestos emisores de luz (por ejemplo, compuestos fluorescentes o quimioluminiscentes), compuestos enzimáticamente escindibles, anticuerpo detectable (o una modificación del mismo) u otras sustancias. La detección de la proteína a través del uso de las marcas puede servir para identificar la presencia o cantidad de las presentes proteínas o un compuesto que contiene este tipo de proteína (tal como un complejo de anticuerpo/proteína).

Dosificaciones

Un experto en la técnica será capaz de averiguar dosificaciones eficaces mediante la administración y observando el efecto terapéutico deseado. Actualmente, se ha demostrado que rmetHu-leptina 1-146 no modificada es eficaz a dosis de 0,3 mg de proteína/kg de peso corporal/día y se ha observado que es menos eficaz a una dosis de 0,1 mg de proteína/kg de peso corporal/día. Greenberg et al., Preliminary safety and efficacy of recombinant methionyl human Leptin adminstered by SC injection in lean and obese subjects. Poster presentado en: Reunión Anual de la Asociación sobre Diabetes Americana; 16 de junio de 1998, Chicago, IL. El intervalo deseado de dosificación, con el fin de que sea ventajoso frente a la rmetHu-leptina 1-146 existente, es el mismo o menor que el anterior. También, un intervalo deseado de dosificación puede ser útil en el que la misma (o inferior) carga de proteínas se administra con menor frecuencia. Las dosificaciones eficaces se pueden determinar utilizando herramientas de diagnóstico a lo largo del tiempo. Por ejemplo, un diagnóstico para medir la cantidad de leptina en la sangre (o plasma o suero) se puede utilizar primero para determinar los niveles endógenos de leptina. Una herramienta diagnóstica de este tipo puede estar en forma de un análisis de anticuerpos, tal como un análisis de sándwich de anticuerpos. La cantidad de leptina endógena se cuantifica inicialmente y se determina una línea de base. Las dosificaciones terapéuticas se determinan dado que la cuantificación de leptinas endógenas y exógenas (es decir, proteína, análogo o derivado encontrado dentro del cuerpo ya sea auto-producido o administrado) se continúa a lo largo del curso de la terapia. Las dosificaciones pueden variar, por lo tanto, a lo largo del curso de la terapia, utilizándose inicialmente una dosificación relativamente elevada, hasta que se observe un beneficio terapéutico cosmético, y se utilizan dosificaciones menores para mantener los beneficios terapéuticos o cosméticos.

Durante un curso inicial de la terapia de una persona obesa, las dosificaciones se pueden administrar, con lo que se alcanza una pérdida de peso y un incremento concomitante de la disminución del tejido graso. Una vez que se ha conseguido una pérdida suficiente de peso, se puede administrar una dosis suficiente para prevenir una recuperación del peso, pero todavía suficiente para mantener el peso o la masa de grasa deseado. Estas dosificaciones se pueden determinar empíricamente, ya que los efectos de la leptina son reversibles. Por ejemplo, Campfield et al., Science 269: 546-549 (1995) en la pág. 547. Así, si se observa una dosificación que resulte en una pérdida de peso cuando no se desea la pérdida de peso, se administraría una dosis menor pero que todavía mantenga el peso deseado.

Métodos de uso

Terapéutico. Usos terapéuticos incluyen la modulación del peso, el tratamiento o la prevención de la diabetes, la reducción de lípidos en la sangre (y el tratamiento de estados relacionados), el incremento de la masa de un cuerpo delgado y el incremento de la sensibilidad a la insulina. Además, las presentes composiciones se pueden utilizar para la fabricación de uno o más medicamentos para el tratamiento o la mejora de los estados anteriores.

Cosmético. Para aquellos que deseen únicamente una mejora del aspecto, las presentes composiciones se pueden utilizar para la pérdida de peso o para mantener el peso que no tenga ningún efecto concomitante sobre un estado médico adverso. Además, las presentes composiciones se pueden utilizar para la fabricación de una o más preparaciones para fines cosméticos.

Modulación del peso. Las presentes composiciones y métodos se pueden utilizar para la reducción del peso. Visto de otra manera, las presentes composiciones se pueden utilizar para mantener un peso o nivel de adiposidad deseado. Como se ha demostrado en modelos murínicos (véase supra), la administración de las presentes proteínas leptina glicosiladas resulta en una pérdida de peso. La masa corporal perdida es principalmente de tejido adiposo, o grasa. Una pérdida de peso de este tipo, o el mantenimiento de un peso particular, se puede asociar con la prevención y el tratamiento de estados concomitantes, tales como los que figuran más abajo y, por lo tanto, constituyen una aplicación terapéutica.

Tratamiento de la diabetes. Las presentes composiciones y métodos se pueden utilizar para la prevención o el tratamiento de diabetes de tipo I o tipo II. Dado que la diabetes de tipo II se puede correlacionar con la obesidad, el uso de la presente invención para reducir el peso (o mantener un peso deseado, o reducir o mantener un nivel de adiposidad) se puede también aliviar o prevenir el desarrollo de la diabetes. Además de ello, incluso en ausencia de dosificaciones suficientes para dar como resultado una pérdida de peso, las presentes composiciones se pueden utilizar para prevenir o mejorar la diabetes.

La administración de las presentes composiciones puede dar como resultado una sensibilidad incrementada a la insulina endógena o exógena, y permitir que un individuo reduzca o elimine la cantidad administrada de insulina exógena requerida para tratar diabetes de tipo II. Se contempla, además, que las presentes composiciones se pueden utilizar en el tratamiento, prevención o mejora de la diabetes de tipo I.

Modulación de lípidos en la sangre. Las presentes composiciones y métodos se pueden utilizar en la modulación de los niveles de lípidos en la sangre. De manera ideal, en situaciones en las que únicamente se desea la reducción en los niveles de lípidos en la sangre, o en los que se desea un mantenimiento de los niveles de lípidos en la sangre, la dosificación será insuficiente para dar como resultado una pérdida de peso. Así, durante un transcurso inicial de la terapia de un paciente obeso, se pueden administrar dosificaciones con lo que se consigue la pérdida de peso y una disminución concomitante del nivel de lípidos en la sangre. Una vez que se alcanza una pérdida suficiente de peso, se puede administrar, por ejemplo, una dosificación suficiente para prevenir una recuperación del peso, pero que todavía sea suficiente para mantener los niveles deseados de lípidos en sangre, u otros estados tal como se recogen en esta memoria. Así, si se observa una dosificación que resulte en una pérdida de peso cuando no se desee una pérdida de peso, se administraría una dosis inferior con el fin de alcanzar los niveles deseados de lípidos en la sangre, pero manteniendo el peso deseado. Véase, por ejemplo, la publicación PCT WO97/06816 incorporada en esta memoria como referencia.

Aumento de la masa de flacura o sensibilidad a la insulina. De manera ideal, en situaciones en las que solamente se desea un incremento en la masa del cuerpo delgado, la dosificación será insuficiente para dar como resultado una pérdida de peso. Así, durante el transcurso inicial de la terapia de una persona obesa, las dosificaciones se pueden administrar con lo que se consigue una pérdida de peso y una disminución del tejido graso/incremento en la masa de flacura concomitante. Una vez que se ha conseguido una pérdida suficiente de peso, se puede administrar una dosificación suficiente para prevenir la recuperación del peso, pero todavía suficiente para mantener el incremento de masa de flacura deseada (o la prevención del agotamiento de la masa de flacura). Para aumentar una sensibilidad del individuo a la insulina, se pueden tener en cuenta consideraciones de dosificación similares. El incremento de la masa de flacura sin una pérdida de peso puede conseguirse de manera suficiente para disminuir la cantidad de insulina (o, potencialmente, amilina, antagonistas o agonistas de amilina, tiazolidindionas, u otros fármacos potenciales para el tratamiento de diabetes) que se administraría a un individuo para el tratamiento de la diabetes. Para aumentar la resistencia global, puede haber consideraciones de dosificación similares. Un incremento de la masa de flacura con un incremento concomitante en la resistencia global puede conseguirse con dosis insuficientes para dar como resultado una pérdida de peso. También pueden conseguirse en ausencia de una pérdida de peso otros beneficios, tales como el incremento en los glóbulos rojos de la sangre (y la oxigenación en la sangre) y una disminución en la resorción de los huesos u osteoporosis. Por ejemplo, documento PCT WO97/18833, publicado del 29 de mayo de 1997, incorporado en esta memoria como referencia en su totalidad.

Terapias de combinación. Las presentes composiciones y métodos se pueden utilizar en unión con otras terapias, tal como una dieta alterada y ejercicio. Se pueden utilizar otros medicamentos tales como aquellos útiles para el tratamiento de la diabetes (por ejemplo, insulina y posiblemente amilina, antagonistas o agonistas de las mismas, tiazolidindionas u otros fármacos potenciales para el tratamiento de la diabetes), medicamentos reductores del colesterol y de la presión sanguínea (tales como aquellos que reducen los niveles de lípidos en la sangre u otros medicamentos cardiovasculares), medicamentos que incrementan la actividad (por ejemplo anfetaminas), diuréticos (para la eliminación de líquidos), y supresores del apetito (tales como agentes que actúan sobre los receptores de neuropéptidos \gamma, inhibidores de la reabsorción de serotonina o inhibidores de la absorción de grasa gástrica). Una administración de este tipo puede ser simultánea o puede ser in seriatim. Además, los presentes métodos se pueden utilizar en unión con procesos quirúrgicos, tales como cirugías cosméticas diseñadas para alterar el aspecto general de un cuerpo (por ejemplo, liposucción o cirugías de láser diseñadas para reducir la masa corporal, o cirugías de implante diseñadas para aumentar el aspecto de la masa corporal). Los beneficios de la salud de cirugías cardíacas, tales como cirugías de derivación (bypass) u otras cirugías diseñadas para aliviar un estado perjudicial provocado por el bloqueo de los vasos sanguíneos por parte de depósitos grasos, tales como la placa arterial, pueden aumentarse con el uso concomitante de las presentes composiciones y métodos. Métodos para eliminar piedras en la vesícula, tales como métodos ultrasónicos o láser, también se pueden utilizar ya sea antes de, durante o después del transcurso de los presentes métodos terapéuticos. Además, los presentes métodos se pueden utilizar como adyuvantes a cirugías o terapias para huesos rotos, músculos
dañados u otras terapias que serían mejoradas mediante un incremento en la masa de tejido magro o libre de grasa.

Métodos de fabricación

Como se ha indicado antes, se ha observado también que construcciones particulares de secuencias señal y secuencias de proteína madura pueden mejorar la eficacia de la glicosilación. A este respecto, la expresión "secuencia señal" (a la que se alude a veces en la técnica como "péptido señal") se utiliza para dar a entender un péptido, encontrado en o próximo al extremo N de la proteína madura, habitualmente con una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos, rico en aminoácidos hidrófobos, que facilita la secreción de la proteína madura en el retículo endoplásmico. Es en el retículo endoplásmico, o región de la membrana de la célula, en donde se produce la glicosilación inicial de la proteína. Las secuencias señal se escinden a partir de la secuencia madura antes de la secreción de la proteína madura. Véase Watson et al., Molecular Biology of the Gene 4ª ed., en la página 731, (The Bejamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, California) incorporado en esta memoria como referencia. En particular, se han utilizado diversas secuencias señal que no se encuentran de forma natural enlazadas de manera operativa a una proteína leptina que se produce en la naturaleza, y se ha encontrado que mejoran la eficacia de la glicosilación de proteínas leptina múltiples veces glicosiladas.

Por ejemplo, se ha encontrado que, en comparación con la secuencia señal de leptina humana nativa, la secuencia señal se encuentra normalmente unida a la secuencia del activador de plasminógeno del tejido, cuando se utiliza en unión con la expresión de diversas proteínas leptina múltiples veces glicosiladas descritas en esta memoria, da como resultado niveles mayores de glicosilación (por ejemplo, restos de glicosilación en todos los sitios adecuados en una proporción mayor de las moléculas expresadas de la proteína madura).

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método para fabricar una proteína leptina glicosilada, que comprende:

(a) cultivar, bajo condiciones adecuadas para la expresión, una célula huésped que contiene una secuencia de ADN que codifica, en la dirección 5' a 3', (i) una secuencia señal, y (ii) un ADN que codifica una proteína leptina glicosilada; y

(b) obtener dicha proteína leptina glicosilada.

Además, tal como se ha comentado antes, la presente invención se refiere a un método para fabricar una proteína leptina glicosilada, en donde dicha señal se selecciona entre:

(a) (SEQ. ID Nº 3) (péptido señal de leptina humana nativa)

MHWGTLCGFLWLWPYLFYVQA

\vskip1.000000\baselineskip

(b) (SEQ. ID Nº 4) (péptido señal de leptina humana nativa)

MHWGTLCGFLWLWPYLFYVSPS

\vskip1.000000\baselineskip

(c) (SEQ. ID Nº 5) (péptido señal de leptina humana modificada)

MHWGTLCGFLWLWPYLFYVSP

\vskip1.000000\baselineskip

(d) (SEQ. ID Nº 6) (péptido señal de leptina humana modificada)

MHWGTLCGFLWLWPYLFYVSPA

\vskip1.000000\baselineskip

(e) (SEQ. ID Nº 7) (péptido señal de leptina humana modificada)

MHWGTLCGFLWLWPYLFYVSNS

\vskip1.000000\baselineskip

(f) (SEQ. ID Nº 8) (péptido señal de tPA humano nativo)

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPS

\vskip1.000000\baselineskip

(g) (SEQ. ID Nº 9) (péptido señal de tPA humano nativo)

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP

\vskip1.000000\baselineskip

(h) (SEQ. ID Nº 10) (péptido señal de tPA modificado)

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSNS

\vskip1.000000\baselineskip

(i) (SEQ. ID Nº 11) (péptido señal de tPA modificado)

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPA

\vskip1.000000\baselineskip

(j) (SEQ. ID Nº 12) (péptido señal de leptina/tPA)

MHWGTLCCVLLLLCGAVFVSPS

\vskip1.000000\baselineskip

(k) (SEQ. ID Nº 13) (péptido señal de leptina/tPA)

MHWGTLCCVLLLCGAVFVSP

De manera relacionada, se pueden utilizar secuencias de ácidos nucleicos que codifican péptidos señal de este tipo. Las secuencias de ADN que figuran más abajo, con la excepción de la secuencia señal de péptido señal de leptina humana modificada (d, SEQ. ID Nº: 6) que no se realizó, se utilizaron según se describe en los ejemplos de trabajo que figuran más abajo para codificar los correspondientes péptidos señal, según se recoge antes.

SEQ. ID Nº: 14 (ADN de péptido señal de leptina humana nativa)

\hskip0,5cmATGCATTGGGGAACCCTGTGCGGATTCTTGTGGCTTTGGCCCTATCTTTTCTATGTCCAAGCT

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID Nº: 15 (ADN de péptido señal de leptina humana modificada)

\hskip0,5cmATGCATTGGGGAACCCTGTGCGGATTCTTGTGGCTTTGGCCCTATCTTTTCTATGTTTCGCCCAGC

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID Nº: 16 (ADN de péptido señal de leptina humana modificada)

\hskip0,5cmATGCATTGGGGAACCCTGTGCGGATTCTTGTGGCTTTGGCCCTATCTTTTCTATGTTTCGCCC

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID Nº: 17 (ADN de péptido señal de leptina humana modificada)

\hskip0,5cmATGCATTGGGGAACCCTGTGCGGATTCTTGTGGCTTTGGCCCTATCTTTTCTATGTTTCGCCCGCT

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID Nº: 18 (ADN de péptido señal de leptina humana modificada)

\hskip0,5cmATGCATTGGGGAACCCTGTGCGGATTCTTGTGGCTTTGGCCCTATCTTTTCTATGTTTCGAACCAGC

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID Nº: 19 (ADN de péptido señal de tPA humano modificado)

\hskip0,5cmATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGC
{}\hskip1cmCCAGC

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID Nº: 20 (ADN de péptido señal de tPA humano modificado)

\hskip0,5cmATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGC
{}\hskip1cmCC

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID Nº: 21 (ADN de péptido señal de tPA humano modificado)

\hskip0,5cmATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGA
{}\hskip1cmACAGC

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID Nº: 22 (ADN de péptido señal de tPA humano modificado)

\hskip0,5cmATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGC
{}\hskip1cmCCGCT

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID Nº: 23 (ADN de péptido señal de leptina/tPA)

\hskip0,5cmATGCATTGGGGAACCCTGTGCTGTGTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGC

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ. ID Nº: 24 (ADN de péptido señal de leptina/tPA)

\hskip0,5cmATGCATTGGGGAACCCTGTGCTGTGTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCC

\vskip1.000000\baselineskip

Se pueden seleccionar secuencias señal que se sabe están asociadas a proteínas muy glicosiladas. Secuencias señal que se pueden utilizar son las nativas a la eritropoyetina, factor VIII, beta-interferón, albúmina de suero, insulina, factor de von Willebrand, CD11\alpha, IgG, folistatina, factor intrínseco, G-CSF, ceruloplasmina, LAMP-1, hormonas secretadas, factores de crecimiento y otras proteínas, humanas o no humanas (tales como otras de primates, ratones, ratas u otros mamíferos) que se secretan en células eucarióticas. Para las células de levadura se puede utilizar el factor \alpha de levaduras, y otros. También, diversos otros genes tienen secuencias conductoras que pueden facilitar la secreción de proteínas en sistemas de células de mamíferos, tales como el virus de la influenza A humano, preproinsulina humana y hormona del crecimiento bovina.

También se pueden optimizar las composiciones de aminoácidos de las secuencias señal sobre una base de ensayo y error para mejorar la eficacia de la glicosilación y preparar secuencias señal que se producen de forma no natural. Por ejemplo, se puede aumentar el número de residuos aminoácidos hidrófobos o alterar el sitio de escisión de la peptidasa señal para aumentar el tiempo que la proteína permanece en la membrana, con el fin de prolongar el periodo de tiempo en el que la proteína queda expuesta a la "maquinaria" celular que logra la glicosilación (siendo "maquinaria" un término abreviado para aquellas enzimas y otros restos que realizan la glicosilación dentro de la región de la membrana de la célula).

Se ha encontrado también que la sustitución de un sitio de escisión existente (el sitio en el extremo carboxi-terminal de un péptido señal en el que el péptido señal se escinde enzimáticamente para generar la proteína madura) con sitios de escisión diferentes puede proporcionar ventajas de fabricación, particularmente en sistemas de células de mamíferos, y aumentar la eficacia de la glicosilación. Previamente, los expertos en la técnica habían alterado sitios de escisión de la enzima de prosecuencias (véase más abajo) relacionadas con los péptidos señal.

Según se demostrará en los ejemplos de trabajo que figuran más abajo, el uso del péptido señal del activador del plasminógeno tisular para expresar una proteína leptina glicosilada en tres sitios dio como resultado una eficacia de glicosilación mayor que el uso del péptido señal de leptina humana nativa. Se encontró, además, que el sitio de escisión del péptido señal del tPA (serina-prolina-serina), cuando se sustituye en el péptido señal de leptina humana nativa, confería una eficacia de glicosilación mejorada a lo largo del uso del péptido señal de leptina humana nativa no modificado.

Para proteínas particulares, el sitio serina-asparagina-serina ("SNS") puede funcionar con el fin de mejorar la eficacia de la glicosilación. Por ejemplo, según se describe en esta memoria, la sustitución del sitio de escisión del péptido señal de tPA humano natural por un sitio "SNS" dio como resultado un alto rendimiento de proteína leptina glicosilada escindida de forma correcta (con sitios de glicosilación en las posiciones 2, 47, 69 y 92). Otros sitios de escisión incluyen serina-prolina-serina ("SPS"), serina-asparagina-serina ("SNS"), serina-prolina ("SP") y serina-prolina-alanina ("SPA"). Un nuevo sitio de escisión puede ser sustituido en cualquier péptido señal por métodos conocidos, incluida la mutagénesis dirigida al sitio de ADN codificante, síntesis de ADN y alteración de ADN genómico dentro de una célula. Se puede elegir la fabricación de un péptido señal, particularmente un péptido señal que no se encuentra asociado con ninguna proteína secretada conocida, tal como péptidos señal naturales, e incluye un sitio de escisión tal como antes para optimizar o maximizar la eficacia de la glicosilación.

Algunos sitios de escisión, tal como el sitio de escisión de serina-prolina-serina de activador del plasminógeno tisular ("tPA") humano natural, son escindidos de forma incompleta a partir de la región N-terminal de la proteína madura. Así, queda allí un residuo serina en el extremo N de la proteína madura, al que se alude en esta memoria como la posición -1. La presente invención incluye también las presentes proteínas leptina glicosiladas que tienen, o que opcionalmente tienen si se elige utilizar un presente sitio de escisión, uno o más residuos aminoácidos en el extremo N de la secuencia de la proteína madura.

La presente invención también incluye, de manera más específica, proteínas leptina glicosiladas con

un residuo serina, arginina, prolina o alanina en la posición -1,

una serina en la posición -1 y una prolina en la posición -2,

una secuencia serina-prolina-serina en las posiciones -1, -2 y -3,

una serina en la posición -1 y una arginina en la posición -2,

una serina en la posición -1, una arginina en la posición-2, y una serina en la posición -3,

una arginina en la posición -1 y una serina en la posición -2; y

una alanina en la posición -1 y una prolina en la posición -2.

Además, pueden existir sitios de escisión del péptido señal que escinden una parte de la proteína madura. Así, tal como se ha indicado antes, la presente invención incluye formas truncadas de proteína leptina glicosilada, tales como las que tienen hasta y que incluyen cinco residuos aminoácidos suprimidos del extremo N de la proteína madura, tal como una proteína leptina de SEQ. ID Nº: 1 ó 2, que tienen los presentes sitios de glicosilación.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método mejorado para fabricar una proteína glicosilada, que comprende:

(a) cultivar, bajo condiciones adecuadas para la expresión y glicosilación, una célula huésped que contiene una secuencia de ADN que codifica, en la dirección 5' a 3' (i) un péptido señal y (ii) un ADN que codifica la proteína glicosilada; y

(b) obtener dicha proteína glicosilada, en donde dicha mejora comprende el uso de un péptido señal que tiene un sitio de escisión de peptidasa optimizado para la eficacia de la glicosilación.

El sitio de escisión que se produce de forma no natural se puede seleccionar entre SPS, SP, SNS y SPA. Los péptidos señal y proteínas leptina glicosiladas según se recoge en la memoria descriptiva, incluidos los ejemplos de trabajo, son ilustrativos, a pesar de que estos métodos y composiciones son ampliamente aplicables a una amplia diversidad de proteínas buscadas para ser secretadas y/o glicosiladas por parte de una célula eucariótica. Proteínas de este tipo incluyen, pero no se limitan a activador del plasminógeno tisular, factor VIII u otros factores de coagulación sanguínea, eritropoyetina y análogos de la misma, y otras proteínas glicosiladas.

También se encontró que, en unión con el uso de la secuencia conductora de leptina nativa, el uso de una "prosecuencia" puede también mejorar la eficacia de glicosilación. Una "prosecuencia" es una secuencia de aminoácidos que contiene de manera óptima el motivo R-X-R/K-R, en que "X" es cualquier aminoácido (y las abreviaturas de una letra son las convencionalmente utilizadas, véase infra). La prosecuencia se puede escindir (después del R final) con proteasas similares a furina, normalmente presentes en células CHO Watanabe et al., FEBS letters, 320: 215-218 (1993) (incorporado en esta memoria como referencia). La capacidad de células CHO de escindir prosecuencias de este tipo ha demostrado ser mejorada cuando plásmidos de expresión furina son transfectados en las células. Yanagita et al., Endocrinology 133: 639-644 (1993) (incorporado en esta memoria como referencia). Por ejemplo, la secuencia de leptina humana madura comienza con una valina, la cual interferiría con la separación de la prosecuencia por parte de furina. Se podría conseguir una separación mejor de la prosecuencia cambiando esta valina por un aminoácido más preferido, tal como serina o alanina, o insertando un aminoácido de este tipo delante de la valina (por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio u otros métodos disponibles para los expertos en la técnica). Por lo tanto, los presentes métodos también incluyen opcionalmente el uso de prosecuencias de este tipo en unión con el péptido señal de leptina natural o con otros péptidos señal.

La presente invención también abarca composiciones, tales como ácidos nucleicos, vectores y células huésped, tales como las reseñadas anteriormente e incorporadas en esta memoria como referencia, que contienen ácidos nucleicos que codifican los presentes péptidos señal alterados y/o prosecuencias.

Ejemplos

Se ofrecen los siguientes ejemplos para ilustrar de manera más completa la invención, pero no se han de considerar limitantes del alcance de la misma.

El Ejemplo 1 demuestra la medición del radio de Stokes de diversas leptinas glicosiladas.

El Ejemplo 2 demuestra la actividad biológica in vivo de una leptina glicosilada en un sitio, denominada "N48T50". Este ejemplo demuestra que esta leptina glicosilada tiene una actividad al menos igual a la leptina humana recombinante nativa que carece de glicosilación.

El Ejemplo 3 demuestra la actividad biológica in vitro de leptinas glicosiladas en un sitio adicionales.

El Ejemplo 4 demuestra la actividad biológica in vitro de proteínas leptinas glicosiladas en dos sitios en términos de ensayos de unión al receptor.

El Ejemplo 5 demuestra el efecto sobre la eficacia de la glicosilación al utilizar un residuo treonina, más que un residuo serina, en la secuencia consenso de glicosilación.

El Ejemplo 6 demuestra que aminoácidos adyacentes a la secuencia consenso afectan a la eficacia de la glicosilación.

El Ejemplo 7 demuestra que una proteína leptina glicosilada en tres sitios tiene un tiempo de circulación sistémica sustancialmente más prolongado que la leptina no glicosilada.

El Ejemplo 8 demuestra en ratones ob/ob que una proteína leptina glicosilada en tres sitios tiene una actividad biológica de la pérdida de peso mejorada en comparación con leptina no glicosilada.

El Ejemplo 9 demuestra en ratones ob/ob que una proteína leptina glicosilada en tres sitios tiene una actividad biológica supresora del apetito mejorada en comparación con leptina no glicosilada.

El Ejemplo 10 demuestra en ratones ob/ob que la administración intermitente de una leptina glicosilada en tres sitios tiene una actividad biológica de pérdida de peso mejorada en comparación con leptina no glicosilada.

\newpage

El Ejemplo 11 proporciona estudios de dosis-respuesta adicionales utilizando una leptina glicosilada en tres sitios en animales de tipo salvaje, demostrando que una dosis mucho más baja de la leptina glicosilada en tres sitios da como resultado una pérdida de peso sustancial en comparación con leptina no glicosilada.

El Ejemplo 12 proporciona estudios de dosis-frecuencia utilizando una leptina glicosilada en tres sitios en ratones de tipo salvaje y demuestra que una leptina glicosilada en tres sitios se puede dosificar con menor frecuencia que una leptina no glicosilada para obtener la misma respuesta de pérdida de peso en los animales.

El Ejemplo 13 recoge proteínas leptina de múltiples sitios de glicosilación adicionales y los datos de actividad biológica in vitro.

El Ejemplo 14 recoge la eficacia de la expresión y glicosilación de una proteína leptina glicosilada en tres sitios utilizando una diversidad de péptidos señal y otras secuencias que afectan a la glicosilación o al rendimiento.

El Ejemplo 15 recoge datos de expresión adicionales en una diversidad de proteínas leptina de múltiples sitios de glicosilación utilizando diversos péptidos señal y otras secuencias que afectan a la glicosilación o al rendimiento.

Siguen Ejemplos de Referencia de métodos utilizados en esta memoria.

Ejemplo 1 Radio de Stokes de diversas leptinas

El presente ejemplo demuestra que diversas leptinas tienen diferentes radios de Stokes según se determina por filtración en gel. El presente ejemplo demuestra también la consistencia del método de filtración en gel para determinar el radio de Stokes de una proteína leptina glicosilada sencilla, que cuando se tomaron mediciones repetidas, las mediciones variaban en menos de 2 \ring{A}.

Métodos: Experimentos de filtración en gel se llevaron a cabo en un sistema FPLC de Pharmacia equipado con un contador Unicorn para el control del sistema, adquisición y análisis de datos, un detector UV-1 y un filtro de 280 nm. Las separaciones se realizaron a 4ºC y a un caudal de 0,25 ml/min en una columna SuperDex 200 (HR10/30) equilibrada en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco. Muestras de proteínas, disueltas en tampón de elución, se aplicaron a la columna en volúmenes de 0,25 ml que contenían 0,1 A 280, según se determina mediante un espectrofotómetro Hewlett Packard Modelo 8435.

Las proteínas patrón encontradas en los kits de calibración de filtración en gel de Pharmacia, tanto de elevado peso molecular como de bajo peso molecular, se utilizaron según se recomendaba por el fabricante para calibrar las columnas. (Según se recomendaba por el fabricante, la catalasa no se utilizó como patrón). Patrones adicionales, incluidas transferrina humana (36 \ring{A}), inhibidor de tripsina de soja (22 \ring{A}) y mioglobina del músculo de caballo (19 \ring{A}) se adquirieron de Sigma Chemicals. Azul Dextrano (kit de calibración de filtración en gel de Pharmacia) se utilizó para definir el volumen hueco. Los valores para el radio de Stokes (Rs) para cualquiera de las diversas formas de leptina se calcularon a partir de una gráfica de \surd-log(Kav) frente a Rs, en que Kav = (Ve-Vo)/Vt-Vo, y Ve es el volumen de elución de la proteína, Vo es el volumen vacío y Vt es el volumen del lecho total de la columna.

Resultados: Al utilizar los métodos anteriores y Super Dex 200® en calidad del material de filtración en gel, se determinaron los siguientes radios de Stokes para rHu-leptina 1-146 (SEQ. ID Nº: 1, que figura más abajo) con los siguientes sitios de glicosilación:

TABLA 1.1 Radio de Stokes de diversas Leptinas

rmetHu-leptina 1-146	18,1 \ring{A}
rHu-leptina 1-146 N48T50	23 \ring{A}
rHu-leptina 1-146 N33T35	24 \ring{A}
rHu-leptina 1-146 N47, 69, 102	31,9 \ring{A}
rHu-leptina N47, 69, 102	2,3 \ring{A}

Como puede observarse, una población de moléculas de proteína leptina glicosilada en tres sitios tiene un radio de Stokes superior a 30 \ring{A}, según se determina mediante filtración en gel. El radio medio de Stokes ((31,9 + 32,3)/2)) es 32,1 \ring{A}. El presente método de filtración en gel demostró, además, una consistencia a un Angstrom. Como comparación, la misma proteína leptina glicosilada tenía un radio de Stokes de 31,2 \ring{A} cuando se determina mediante la velocidad de sedimentación (utilizando métodos estándares no detallados aquí).

La proteína leptina no glicosilada (rmetHu-leptina), así como las dos proteínas leptina glicosiladas en un solo sitio, tenían radios de Stokes menores que 30 \ring{A}. Tal como se demostrará en los ejemplos de trabajo que figuran más abajo, la proteína leptina glicosilada N48T50 tenía una actividad biológica equiparable a rmetHu-leptina. La proteína de glicosilación en tres sitios (47, 69, 102) tenía una actividad biológica esencialmente mejorada en términos de un tiempo de circulación incrementado (y, por lo tanto, incremento en la exposición in vivo al fármaco). Esto demuestra el principio de que ampliando el tamaño eficaz (expresado aquí como el radio de Stokes) se prolonga el tiempo de circulación al disminuir la capacidad de filtración y, en última instancia, la degradación en los riñones.

Ejemplo 2 Actividad Biológica in vivo y Tiempo de Circulación en Suero de una Leptina Glicosilada en Un Sitio, N48T50

Este Ejemplo demuestra que una leptina glicosilada en un sitio tiene una actividad biológica aproximadamente igual o modestamente mejorada con respecto a rmetHu-leptina 1-146 (SEQ. ID Nº: 1). La glicosilación no impedía la actividad ni prevenía la unión al receptor. Además, se demuestra que el tiempo de circulación en el suero de una leptina glicosilada en un sitio es el mismo o modestamente mayor que rmetHu-leptina 1-146 (SEQ. ID Nº: 1):

A los animales se les administró la leptina glicosilada en un sitio o rmetHu-leptina a la misma dosis diariamente durante 7 días. Al término de los 7 días, se sacrificó a los animales y se examinó el contenido en grasa. En comparación con rmetHu-leptina, la administración de la leptina glicosilada en un sitio dio como resultado una pérdida de grasa adicional de aproximadamente el 25%. Esto demuestra que las presentes composiciones de leptina glicosilada tienen un sitio de glicosilación que se produce de forma no natural que conserva la actividad biológica.

Métodos

1. Composiciones de leptina utilizadas. Esta leptina glicosilada, "N48T50", tenía la secuencia de aminoácidos de la leptina humana nativa 1-146 (SEQ. ID Nº: 1) con la isoleucina ("I") en la posición 48 sustituida con asparagina ("N"), quedando los siguientes dos aminoácidos (leucina ("L") y treonina ("T")) sin sustitución. Para grupos de dosificación diaria (100 \mul de volumen de inyección para todos): 0,2 mg/ml para el grupo de dosis de 1 mg/kg, 2,0 mg/ml para el grupo de dosis de 10 mg/kg. Para grupos de dosificación de solamente el día 0: 5 mg/ml de concentración, 400 \mul inyectados, dosis de 100 mg/kg.

2. Animales

Número y tipo. 5 ratones C57BL/6 hembras, de Charles River Laboratories (Wilmington, MA)

Edad y peso: los animales eran de 8-10 semanas de edad y pesaban aproximadamente 20 g cada uno.

3. Administración. Al comienzo de cada estudio, los animales se pesaron y luego se les inyectó la muestra en bolo por vía subcutánea.

Pesaje: Se determinó el peso de línea base en animales a los que se dejó que se aclimataran durante 1 semana antes del estudio. Se tomó el peso de la línea base justo antes de recibir la primera dosis. Los pesos se vigilaron diariamente a lo largo de cada estudio. Después de registrar los pesos finales, se sacrificó a los animales y la cantidad de grasa abdominal se calificó de 0-3, siendo 0 no quedando nada de grasa visible, y reflejando una puntuación de 3 una cantidad de grasa visible en un animal normal.

Resultados. Ratones tratados diariamente con rmetHu-leptina (1-146) expresada en E. coli perdieron peso con relación a controles tampón, tal como se muestra en la Figura 1. Sorprendentemente, también perdieron peso ratones tratados con leptina glicosilada (leptina N48 T50). La magnitud de pérdida de peso aumentaba con el incremento de la dosis (1 mg/kg y 10 mg/kg) para las dos formas de leptina. Cuando se realizaron inyecciones sencillas de 100 \mug/kg, los ratones tratados con leptina glicosilada perdieron más peso que ratones tratados con rmetHu-leptina (1-146). Además, la pérdida de peso persistía durante más tiempo para los ratones tratados con leptina glicosilada que para ratones tratados con rmetHu-leptina. El examen visual de ratones tratados con rmetHu-leptina y con leptina N48 T50 indicó que los ratones tratados con las dos formas de leptina tenían cantidades reducidas de grasa abdominal y que la cantidad de grasa abdominal se reducía con el incremento de la dosis. Esto indica que la leptina glicosilada es eficaz para reducir el contenido de grasa y puede administrarse con menor frecuencia que rmetHu-leptina no glicosilada.

Estudios farmacocinéticos de una leptina glicosilada en un sitio

Este estudio demuestra que para la administración intravenosa, una leptina glicosilada en un único sitio tiene una mayor semivida que la leptina no glicosilada. Para la administración por vía subcutánea, los tiempos de circulación son similares, tanto para la leptina glicosilada como para la no glicosilada.

Materiales

1. Leptina. Se utilizó una leptina glicosilada en un sitio según antes (sitios N48 T50), formulada a razón de 10 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato de Dulbbeco sin cloruro de calcio y sin cloruro de magnesio. Como control se utilizó metionil-leptina humana recombinante 1-146 (SEQ. ID Nº: 1 con un residuo metionilo en la posición -1), expresada en E. coli, formulada a razón de 2,0 mg/ml en tampón.

2. Animales

Número utilizado/tipo: 32 (para la proteína leptina glicosilada) y 81 (para r-metHu-leptina) ratones CD-1 machos (Charles River Laboratories, Hollister, CA)

Edad/peso: los animales tenían una edad de aproximadamente 6-9 semanas y pesaban aproximadamente 30 gramos.

Cuidado/manipulación: A los animales se les alojó individualmente y se les alimentó con una dieta de comida para roedores de laboratorio ad libitum. Todos los animales se manipularon de acuerdo con buenas prácticas de manipulación de animales.

3. Administración. A los animales se les inyectó leptina glicosilada a una dosis de 1,0 mg/kg de peso corporal por vía intravenosa (IV) o subcutánea (SC).

4. Muestreo. Los animales se anestesiaron y se recogieron muestras de sangre en instantes designados utilizando técnicas de punción cardíaca estándares. Las concentraciones en el suero de leptina glicosilada se determinaron utilizando un inmunoensayo (según se describe más abajo).

5. Comparación. Los datos del tiempo de circulación se compararon con datos previamente obtenidos para rmetHu-leptina, a la misma dosis, en animales de un tamaño similar, utilizando las mismas vías de administración.

Resultados

La Tabla 2.1 muestra los parámetros farmacocinéticos de leptina glicosilada y de rmetHu-leptina en ratones. Comparando los datos IV, la leptina glicosilada exihibía un aclaramiento sistémico menor (500 ml/h/kg frente a 676 ml/h/kg) y una semivida terminal más prolongada (1,24 h frente a 0,733 h). Los volúmenes de distribución en el estado preparado (V_{ss}) eran similares entre leptina glicosilada y rmetHu-leptina. Estos datos indican que la proteína glicosilada se aclaraba más lentamente que rmetHu-leptina a partir de la circulación sistémica, aumentando por lo tanto la semivida y la exposición (estimaciones de AUC de 2000 ng\cdoth/ml frente a 1480 ng·h/ml). Después de la dosis SC, se obtuvieron concentraciones pico en el suero (C_{máx}) similares entre leptina glicosilada y rmetHu-leptina (1230 ng/ml frente a 1380 ng/ml), a pesar de que existía una cierta demora en el tiempo pico (T_{máx}) para la leptina glicosilada. Para las dos moléculas se obtuvieron estimaciones de exposición similares (basadas en el AUC). La biodisponibilidad subcutánea era de aproximadamente 60,5% para la leptina glicosilada frente a 79,6% para rmetHu-leptina.

TABLA 2.1

	Leptina Glicosilada	Leptina	Relación (Leptina Glicosilada/Leptina)
Dosis SC
t_{max} (h)	0.5	0.167	- - -
C_{max} (ng/mL)	1230	1380	0.89
AUC (ng\cdoth/mL)	1210	1180	1.03
t_{1/2}, lz (h)	0.552	0.541	0.96
F (%dosis)	60.5	79.6	0.760
Dosis IV
AUC (ng\cdoth/mL)	2000	1480	1.35
t_{1/2}, lz (h)	1.24	0.733	1.69
CL (mL/h/kg)	500	676	0.74
V_{ss} (mL/kg)	149	150	0.99

Ejemplo 3 Actividad biológica in vitro de otras leptinas glicosiladas en un sitio

En la Tabla 3.1 que figura más abajo, la localización de la secuencia de aminoácidos para una alteración que incluya un sitio de glicosilación se basa en la numeración de SEQ. ID Nº: 1, anterior, que es rHu-leptina.

La proteína se expresó como en los Ejemplos de Referencia que figuran más abajo utilizando el péptido señal de leptina humana natural y células COS. Los productos de expresión se sometieron luego a cuatro tipos de análisis (en lo que sigue se describen los métodos utilizados):

1. Expresión con relación al tipo salvaje. El rendimiento de proteína se comparó con relación con rHu-leptina 1-146, según se expresa en células COS. A la cantidad de rHu-leptina 1-146 se asignó el número de "1,00" bajo condiciones según las definidas más abajo.

2. Porcentaje de glicosilación. El rendimiento de proteína totalmente glicosilada se determinó como porcentaje de la proteína leptina total mediante la inspección visual de un borrón Western, según se describe más abajo.

3. Unión de leptina-R con relación al tipo salvaje. En un ensayo de competitividad in vitro utilizando una preparación de receptor de leptina, proteinas leptinas glicosiladas radiomarcadas preparadas se compararon con rHu-leptina 1-
146 radiomarcada en la resistencia a la unión en el receptor de leptina, de acuerdo con los métodos descritos más abajo.

4. Bioactividad in vitro con relación al tipo salvaje. En un ensayo in vitro utilizando el receptor de leptina quimérico, tal como se describe más abajo, proteínas leptina glicosiladas preparadas se compararon con rHu-leptina 1-146, de acuerdo con métodos descritos más abajo. "ND" significa que los datos no están disponibles debido a que no se realizaron experimentos.

TABLA 3.1

Sumario de la expresión de Leptina Glicosilada en un Solo Sitio de COS, unión y resultados de la glicosilación
Posición de	Cambios en la	Expresión	% de	Unión al	Bioactividad
N-glicosilación 1/	secuencia	rel. a WT	glicosilación	receptor rel. a WT	rel. a WT
Ninguna	tipo salvaje	1	0	1	1
4	QKV > NKV	1.7	0	1.7	0.73
5	KVQ > NVT	0.33	65	1.7	0.05
7	QDD > NDT	0.55	5	1.25	0.04
8	DDT > NDT	1.1	15	1.2	1.2
23a	DIS > NIT	7.8	60	ND	0.53
23b	DIS > NIT	ND	ND	ND	ND
25	SHT > NHT	0.13	80	0.4	0.02
26	HTQ > NTT	1.1	70	1.5	0.01
27	TQS > NQT	0.45	30	0.7	0.13
29	SVS > NVT	0.5	70	0.6	0.5
33	KQK > NQT	1.6	95	0.9	0.04
35	KVT > NVT	0.55	95	0.5	0.13
37	TGL > NGT	1.4	95	0.4	0.043
38	GLD > NLT	0.26	45	0.2	0.036
43	PGL > NGT	1.6	85	1.5	0.014
44	GLH > NLT	1.8	10	2	0.78
45	CHP > NHT	0.52	85	0.5	0.08
46	HPI > NPT	1.4	0	0.11	0.27
47	PIL > NIT	1.06	80	0.66	0.84
48	ILT > NLT	0.92	50	0.8	0.53

TABLA 3.1 (continuación)

Posición de	Cambios en la	Expresión	% de	Unión al	Bioactividad
N-glicosilación 1/	secuencia	rel. a WT	glicosilación	receptor rel. a WT	rel. a WT
67	SMP > NMP	1.1	15	0.8	0.52
68	MPS > NAT	0.5	80	0.8	0.036
69	PSR > NST	0.8	75	0.6	1.1
70	SRN > NRT	1.07	10	1	1
71	RNV > NNT	1.84	60	1.9	0.3
72	NVI > NVT	1.4	70	1.7	0.26
73	VIQ > NIT	0.53	45	8	0.01
ESP77*	SND > NNT	0.14	10	2.2	<0.02
92	FSK > NST	4.8	45	ND	0.67
93	SKS > NKT	2.4	5	ND	0.67
97	HLP > NLT	2.6	10	ND	1.1
99	PWA > NWT	0.45	0	0.9	0.5
100a	PWAS > SNAT	0.43	35	0.6	0.9
100b	WAS > NAS	1.2	0	0.7	1.46
100c	WAS > NAT	0.5	20	0.45	0.81
100d	PWAS > ANAT	2.3	35	1.45	0.26
100e	WAS > TAS	1	60 (enlazado a O)	> 1.9	0.83
101	ASG > NST	0.59	50	0.7	0.33
102	SGL > NGT	0.79	60	0.6	0.85
103	GLE > NLT	1.6	55	1	0.73
115	EAS > NAT	1.1	70	0.9	0.006
116	ASG > NST	1.1	0	0.9	0.56
117	SGY > NGT	1.33	50	1.9	0.01
118	GYS > NYT	1.44	15	0.8	3.8
119	YST > NST	0.61	70	0.8	0.02
120	STE > NTT	0.9	100	0.7	0.01
141	SLS > NLT	0.18	0	0.3	1
\begin{minipage}[t]{159mm} * ESP77 indica un sitio de glicosilación en la posición 77 y expresión utilizando el péptido señal de eritropoyetina, según se describe con mayor detalle infra\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{159mm}1/ "Posición" indica la posición del aminoácido de acuerdo con SEQ. ID N^{o}\text{:} 1, que es rHu-leptina 1-146. La secuencia particular listada (por ejemplo \text{"53", "55",} etc.) indica la posición de "N" en la secuencia de glicosilación consenso "N - X - S/T".\end{minipage}

Resultados: Como puede observarse, con las proteínas leptina de glicosilación en un solo sitio preparadas, comparadas con leptina no glicosilada, la mayoría de las proteínas leptina glicosiladas en un solo sitio no mostraban ningún incremento sustancial en la actividad biológica según se determina por el ensayo in vitro utilizado en esta memoria, excepto la proteína con un sitio de glicosilación en la posición 118, que parecía tener una cantidad incrementada de actividad. Algunos de estos análogos se secretaron a niveles normales o mayores y la mayoría tenía una actividad de unión al receptor equiparable a rHu-leptina 1-146 expresada y analizada de la misma manera. Sorprendentemente, algunas de las proteínas leptina glicosiladas tenían una baja actividad biológica in vitro, incluso a pesar de que conservaban una actividad de unión al receptor. Así, las proteínas leptina glicosiladas podían dividirse en 2 clases de acuerdo a que retuvieran la actividad biológica in vitro o no. Las proteínas leptina glicosiladas que tenían una baja actividad biológica in vitro pueden ser antagonistas de leptina.

Ejemplo 4 Actividad biológica in vitro de leptinas glicosiladas en dos sitios

Tal como se presenta en la Tabla 4.1, diversas proteínas leptina glicosiladas en dos sitios también se produjeron y sometieron a ensayo como antes para las proteínas de un solo sitio. Las anotaciones y abreviaturas son las mismas que las de la Tabla 3.1 para las proteínas de un sitio.

Las anotaciones de glicosilación indican el porcentaje aproximado de material que tenía una cadena o dos cadenas, según se determina mediante el examen visual de un borrón Western según se describe más abajo. Por ejemplo, para la proteína leptina glicosilada 25 + 29, el 50% del material tenía una cadena y el 5% del material tenía dos cadenas.

TABLA 4.1

Sumario de Expresión en Doble Sitio de Leptina de COS, unión y resultados de glicosilación
Posición de N-glicosilación	Expresión rel. a WT	Glicosilación	Unión al receptor rel. a WT	Bioactividad rel. a WT
None	1	0	1	1
25+29	1	1'-50,2'-5	1	ND
25+33	1.2	1'40,2'-60	1.6	ND
25+35	1.2	1'-70,2'-10	1	ND
26+33	0.46	ND	1.6	ND
26+35	0.59	1'-45,2'-35	1	ND
27+33	0.93	1'-60,2'-30	1	ND
27+35	1.1	1'-50,2'-40	0.7	ND
29+33	1.6	1'-50,2'-45	1.4	ND
29+35	0.33	1'-33,2'-33	0.6	ND
33+48	0.86	1'-35,2'-60	0.6	ND
33+120	0.27	1'-5,2'-95	0.89	<0.003
35+48	0.46	1'-30,2'-40	0.6	ND
47+69	1.3	1'-10,2'-50	1	0.69
47+102	2.7	1'-50,2'-30	0.86	0.42
48+69	1.63	1'-20,2'-50	0.87	0.81
69+101	1.2	1'-45,2'-20	0.42	0.66
69+102	1.7	1'-40,2'-30	0.5	0.63
69+103	2.6	1'-50,2'-15	1.7	0.67
69+118	2.9	1'-50,2'-5	2.2	2.3
102+100e	1.8	2'-60	0.62	0.97

Se pueden preparar muchas proteínas leptina glicosiladas que contienen combinaciones de dos sitios glicosilados que conservan la unión al receptor y exhiben una actividad biológica.

Ejemplo 5 Mejora de la Eficacia de la Glicosilación Utilizando una Treonina en lugar de una Serina en la Secuencia Consenso

Este ejemplo demuestra que la eficacia del sitio de glicosilación se mejora utilizando una treonina más que una serina en la secuencia consenso de glicosilación. En este ejemplo, todas las localizaciones de la secuencia de aminoácidos para las alteraciones que incluyan sitios de gliclosilación se basan en la numeración de SEQ. ID Nº: 1, que es rHu-leptina 1-146.

Proteínas leptina glicosiladas se construyeron, expresaron y analizaron utilizando métodos en los Ejemplos de Referencia que figuran más abajo. Los resultados se muestran en la Figura 2. La introducción de un solo sitio de glicosilación mediante la sustitución doble W100,S102 a N100,T102 dio como resultado la adición de un hidrato de carbono enlazado a N, y la proporción de moléculas que contenían hidratos de carbono (mediante SDS PAGE según se determina mediante transferencia Western) era esencialmente mayor que con una sustitución W100,S102 a N100,S102. Esto indica que se glicosilaron más de las moléculas de proteína con una treonina en la secuencia consenso que aquellas con una serina en la secuencia consenso. Así, la eficacia de glicosilación en este sistema de expresión es mayor utilizando la secuencia consenso Asn-Xxx-Thr que cuando se utiliza Asn-Xxx-Ser. Como tal, se prefiere el uso de un residuo treonina.

Ejemplo 6 La Eficacia de la Glicosilación se efectúa mediante una Secuencia Situada más Arriba

Este ejemplo demuestra que la eficacia de la glicosilación se ve afectada por el aminoácido en la posición -1 (con relación al residuo asparagina sustituido) así como la sustitución de una prolina inmediatamente "situada más arriba" (es decir, hacia el extremo N) a partir del residuo asparagina en la secuencia consenso.

Se encontró que rHu-leptina 1-146 con las alteraciones de: S99, N100, S102 se glicosilaba de manera más eficaz que las mismas alteraciones que carecen de la sustitución serina en la posición 99. Esto indica que las sustituciones en torno al sitio de glicosilación consenso pueden dar como resultado una mejora adicional en la ocupación del sitio de glicosilación.

Además, y de manera sorprendente, una sustitución de W100 en T100 dio como resultado una glicosilación en O de la leptina presumiblemente en la posición 100. Esto indica que el hidrato de carbono enlazado a O o enlazado a N se puede añadir a la misma posición dependiendo de la sustitución particular que se realice. La Figura 2 es un borrón Western que compara el sitio de glicosilación enlazado a N con el sitio de glicosilación enlazado a O, según se indica. Como puede verse, el uso de la secuencia "TAS" tal como se indica (con referencia a SEQ. ID Nº: 1) da como resultado una glicosilación enlazada a O.

Ejemplo 7 Tiempo de circulación sistémica mejorado de una leptina glicosilada en tres sitios

Este ejemplo demuestra que una leptina glicosilada que tiene más de un sitio de glicosilación tiene un tiempo de circulación que es esencialmente más prolongado que la leptina humana recombinante no glicosilada. Como puede verse, la leptina glicosilada exhibía una disminución de 4 a 5 veces en el aclaramiento sistémico y un incremento en la semivida en comparación con rmetHu-leptina. A pesar de que existía una pequeña disminución en la biodisponibilidad subcutánea (^{\sim}10% de disminución en comparación con no glicosilada), la leptina glicosilada dio todavía como resultado una exposición más alta al fármaco después de la dosificación subcutánea.

Materiales

1. Leptina. Se utilizó una leptina glicosilada en tres sitios según se prepara más abajo (sitios 47, 69 y 102, SEQ. ID Nº: 32) formulada a razón de 1,76 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin cloruro de calcio y sin cloruro de magnesio (Gibco). Como control se utilizó metionilo-leptina humana recombinante 1-146 (SEQ. ID Nº: 1 con un residuo metionilo en la posición -1) expresada en E. coli, formulada a razón de 2,0 mg/ml en tampón.

2. Animales

Número utilizado/tipo: 27 (para la proteína leptina glicosilada) y 81 (para r-metHu-leptina) ratones CD-1 machos (Charles River Laboratories, Hollister, CA)

Edad/peso: los animales tenían una edad de aproximadamente 6-9 semanas y pesaban aproximadamente 30 gramos.

Cuidado/manipulación: A los animales se les alojó individualmente y se les alimentó con una dieta de comida para roedores de laboratorio ad libitum. Todos los animales se manipularon de acuerdo con buenas prácticas de manipulación de animales.

3. Administración. A los animales se les inyectó leptina glicosilada a una dosis de 1,0 mg/kg de peso corporal por vía intravenosa (IV) o subcutánea (SC).

4. Muestreo. Los animales se anestesiaron y se recogieron muestras de sangre en instantes designados utilizando técnicas de punción cardíaca estándares. Las concentraciones en el suero de leptina glicosilada se determinaron utilizando un inmunoensayo (según se describe más abajo).

5. Comparación. Los datos del tiempo de circulación se compararon con datos previamente obtenidos para rmetHu-leptina, a la misma dosis, en animales de un tamaño similar, utilizando las mismas vías de administración.

Resultados: Los resultados se ilustran en las Figuras 3 y 4. La Figura 3 es una gráfica que muestra la concentración de leptina en suero después de la administración subcutánea, y la Figura 4 es una gráfica que muestra la concentración de leptina en suero después de la administración intravenosa.

En general, después de la administración tanto IV como SC de leptina glicosilada con un radio de Stokes mayor que aproximadamente 30 \ring{A}, las concentraciones en suero eran mayores que las observadas para rmetHu-leptina, así como para la de una leptina glicosilada en un solo sitio (N48 T50). Para rmetHu-leptina, las concentraciones en suero disminuían por debajo de 1,0 ng/ml en el espacio de 6 horas después de las dos vías de administración; mientras que las concentraciones en suero de leptina glicosilada permanecían por encima de 1,0 ng/ml durante 24 horas después de la administración IV o SC.

La Tabla 7.1 muestra los parámetros farmacocinéticos de leptina glicosilada y rmetHu-leptina en ratones.

TABLA 7.1

	Leptina Glicosilada	Leptina	Relación (Leptina Glicosilada/Leptina)
Dosis SC
t_{max} (h)	1	0.167	- - -
C_{max} (ng/mL)	1430	1380	1.04
AUC (ng\cdoth/mL)	5800	1180	4.93
t_{1/2}. lz (h)	2.21	0.541	4.09
F (% dosis)	69.5	79.6	0.873
Dosis IV
AUC (ng\cdoth/mL)	8350	1480	5.65
t_{1/2}, lz (h)	2.76	0.733	3.77
CL (mL/h/kg)	120	676	0.178
V_{ss} (mL/kg)	157	150	1.05

Comparando los datos IV (véase la Figura 4), la leptina glicosilada exhibía un aclaramiento sistémico menor (120 ml/h/kg frente a 676 ml/h/kg) y una semivida terminal más prolongada (2,76 h frente a 0,733 h). Los volúmenes de distribución en el estado preparado (V_{ss}) eran similares entre leptina glicosilada y rmetHu-leptina. Estos datos indican que la proteína glicosilada se aclaraba más lentamente que rmetHu-leptina a partir de la circulación sistémica, aumentando por lo tanto la semivida y la exposición (estimaciones del AUC de 8350 ng\cdoth/ml frente a 1480 ng\cdoth/ml). Después de la dosis SC (véase la Figura 3), se obtuvieron concentraciones pico (C_{máx}) en el suero similares entre leptina glicosilada y rmetHu-leptina (1430 ng/ml frente a 1380 ng/ml), a pesar de existía una cierta demora en el tiempo pico (T_{máx}) para la leptina glicosilada. De manera similar a los resultados obtenidos a partir de la administración IV, la leptina glicosilada administrada por vía subcutánea exhibía una semivida terminal incrementada (2,21 h frente a 0,541 h) y un área bajo la curva ("AUC"- siglas en inglés) (5800 ng·h/ml frente a 1180 ng·h/ml) probablemente debidas al aclaramiento sistémico disminuido para la leptina glicosilada. La biodisponibilidad subcutánea era de aproximadamente 69,5% para la leptina glicosilada frente a 79,6% para rmetHu-leptina.

Ejemplo 8 Actividad de Pérdida de Peso Mejorada de Leptina Glicosilada en Tres Sitios

Este Ejemplo demuestra que una leptina humana glicosilada con un radio de Stokes mayor que 30 \ring{A} tiene una actividad biológica in vivo mejorada en comparación con leptina humana recombinante no glicosilada. Como puede observarse con la administración diaria después de 7 días, ratones ob/ob perdían ^{\sim}6,8 veces más peso con la leptina glicosilada en tres sitos administrada en este caso que con leptina no glicosilada.

Métodos

1. Leptina. Se utilizó la leptina de tres sitios de glicosilación, preparada según se describe más abajo (sitios 47, 69 y 102, SEQ. ID Nº: 32), formulada a una concentración de 1,9 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, pH 6,8. Como base de comparación se utilizó metionil-leptina humana recombinante 1-146 (SEQ. ID Nº: 1 con un metionilo en la posición -1), formulada a razón de 20 mg/ml en acetato de sodio 10 mM con sorbitol al 5%, pH 4,0. Como control vehículo se utilizó acetato de sodio 10 mM con sorbitol al 5%, pH 4,0.

2. Animales. Los animales se alojaron en condiciones controladas de temperatura, luz y humedad con las luces encendidas a las 0600 horas y las luces apagadas a las 1800 horas. El equipo de investigación con animales Amgen, Inc. ha sido aprobado por la USDA y ha sido acreditado por AAALAC. Por cada grupo de tratamiento se utilizaron seis ratones ob/ob hembras (Jackson Laboratories). Los ratones tenían una edad de 2 meses en el momento del estudio, y pesaban una media de 45,6 gramos. Los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento de modo que los pesos corporales medios de los grupos eran equivalentes antes del inicio del tratamiento. Se alojó a dos animales por jaula y se les alimentó con nódulos de alimentos para roedores de laboratorio estándares ad libitum.

3. Administración. Todos los procesos de tratamiento fueron aprobados por Amgen Institutional Animal Care And Use Committee. Leptina glicosilada, r-metHu-leptina o placebo se administraron diariamente a través de inyección subcutánea en la región escapular media en un volumen de 0,1 ml. La dosis de leptina era de 0,5 mg/kg de peso corporal/día, tanto para leptina glicosilada como para r-metHu-leptina. Las inyecciones se realizaron en 7 días consecutivos comenzando el día de estudio 0 en la tarde avanzada (en el espacio de 2 horas de apagarse la luz en la colonia). Los animales fueron pesados diariamente en el momento de la inyección. Todos los datos se reseñan como la media \pm
ET.

Resultados

Como puede verse en la Figura 5, la leptina glicosilada en tres sitios ("leptina GE") dio como resultado la cantidad mayor de pérdida de peso, con una pérdida media de peso de 10,8 \pm 0,3 gramos (-23,8 \pm 0,5% del peso corporal inicial). La administración de la misma dosis de r-metHu-leptina ("hleptina") produjo una pérdida media de peso de 1,6 \pm 0,4 gramos (-3,5 \pm 1,1% de peso corporal inicial), mientras que la administración de placebo dio como resultado una ganancia media de peso de 2,6 \pm 0,2 gramos (5,7 \pm 0,3% del peso corporal inicial). Este ejemplo demuestra una actividad biológica in vivo esencialmente mejorada de leptina glicosilada en comparación con leptina humana recombinante no glicosilada.

Ejemplo 9 Actividad Supresora del Apetito Mejorada de Leptina Glicosilada en Tres Sitios

Este Ejemplo demuestra que una leptina humana glicosilada con un radio de Stokes mayor que 30 \ring{A} tiene una actividad biológica in vivo mejorada en comparación con leptina humana recombinante no glicosilada. Como se puede observar, con la administración diaria al cabo de 7 días, ratones ob/ob comían \approx 11 veces menos alimento con la leptina glicosilada que con leptina no glicosilada.

Métodos

1. Leptina. Se utilizó la leptina de tres sitios de glicosilación, preparada según se describe más abajo (sitios 47, 69 y 102, SEQ. ID Nº: 32), formulada a una concentración de 1,9 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, pH 6,8. Como base de comparación se utilizó metil-leptina humana recombinante 1-146 (SEQ. ID Nº: 1 con un metionilo en la posición -1), formulada a razón de 20 mg/ml en acetato de sodio 10 mM con sorbitol al 5%, pH 4,0. Como control vehículo se utilizó acetato de sodio 10 mM con sorbitol al 5%, pH 4,0.

2. Animales. Los animales se alojaron en condiciones controladas de temperatura, luz y humedad con las luces encendidas a las 0600 horas y las luces apagadas a las 1800 horas. El equipo de investigación con animales Amgen, Inc. ha sido aprobado por la USDA y ha sido acreditado por AAALAC. Por cada grupo de tratamiento se utilizaron seis ratones ob/ob hembras (Jackson Laboratories). Los ratones tenían una edad de 2 meses en el momento del estudio, y pesaban una media de 45,6 gramos. Los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento de modo que los pesos corporales medios de los grupos eran equivalentes antes del inicio del tratamiento. Se alojó a dos animales por jaula y se les alimentó con nódulos de alimentos para roedores de laboratorio estándares ad libitum.

3. Administración. Todos los procesos de tratamiento fueron aprobados por Amgen Institutional Animal Care And Use Committee. Leptina glicosilada, r-metHu-leptina o placebo se administraron diariamente a través de inyección subcutánea en la región escapular media en un volumen de 0,1 ml. La dosis de leptina era de 0,5 mg/kg de peso corporal/día, tanto para leptina glicosilada como para r-metHu-leptina. Las inyecciones se realizaron en 7 días consecutivos comenzando el día de estudio 0 en la tarde avanzada (en el espacio de 2 horas de apagarse la luz en la colonia).

4. Medición del alimento. La ingesta de alimento se midió diariamente en el momento de inyección pesando la cantidad de alimento en cada jaula de los animales cada día. La ingesta de alimento se reseña como los gramos comidos por ratón por día y se calculó como sigue: (peso del alimento en la jaula el día previo - peso del alimento ese día)/número de ratones por jaula (dos). Todos los datos se reseñan como media \pm ET.

Resultados

Como puede verse en la Figura 6, la administración de la leptina glicosilada en tres sitios dio como resultado la máxima reducción de ingesta de alimentos, con una ingesta media de alimentos de 0,4 \pm 0,04 gramos/ratón/día para el período final de 24 horas después de séptima dosis. La administración de metionil-leptina humana recombinante producía una reducción en la ingesta de alimentos hasta 4,4 \pm 0,4 gramos/ratón/día, en comparación con la ingesta de alimentos de controles tratados con vehículo (7,0 \pm 0,3 gramos/ratón/día) para el mismo período de 24 horas. Este Ejemplo demuestra una actividad biológica in vivo esencialmente mejorada de leptina glicosilada en comparación con leptina humana recombinante no glicosilada.

Ejemplo 10 Mejora en la Actividad de la Pérdida del Peso de Leptina Glicosilada en Tres Sitios Administrada de forma Intermitente

Este ejemplo demuestra que la actividad biológica in vivo de una leptina humana glicosilada en tres sitios con un un radio de Stokes mayor que 30 \ring{A} se conserva cuando el material se administra sobre una base intermitente. Como se puede observar, ratones ob/ob comían perdían significativamente más peso con la administración diaria o cada dos días de leptina glicosilada que cuando eran tratados con una dosis 10 veces mayor de leptina no glicosilada.

Métodos

1. Leptina. Se utilizó la leptina de tres sitios de glicosilación, preparada según se describe más abajo (sitios 47, 69 y 102, SEQ. ID Nº: 32), formulada a una concentración de 1,9 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, pH 6,8. Como base de comparación se utilizó metil-leptina humana recombinante 1-146 (SEQ. ID Nº: 1 con un metionilo en la posición -1), formulada a razón de 20 mg/ml en acetato de sodio 10 mM con sorbitol al 5%, pH 4,0. Como control vehículo se utilizó acetato de sodio 10 mM con sorbitol al 5%, pH 4,0.

2. Animales. Los animales se alojaron en condiciones controladas de temperatura, luz y humedad con las luces encendidas a las 0600 horas y las luces apagadas a las 1800 horas. El equipo de investigación con animales Amgen, Inc. ha sido aprobado por la USDA y ha sido acreditado por AAALAC. Por cada grupo de tratamiento se utilizaron seis ratones ob/ob hembras (Jackson Laboratories). Los ratones tenían una edad de 4,5 meses en el momento del estudio, y pesaban una media de 66,6 gramos. Los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento de modo que los pesos corporales medios de los grupos eran equivalentes antes del inicio del tratamiento. Se alojó a dos animales por jaula y se les alimentó con nódulos de alimentos para roedores de laboratorio estándares ad libitum.

3. Administración. Todos los procesos de tratamiento fueron aprobados por Amgen Institutional Animal Care And Use Committee. Leptina glicosilada, r-metHu-leptina o placebo se administraron diariamente o cada dos días a través de inyección subcutánea en la región escapular media en un volumen de 0,1 ml. La dosis de leptina era de 0,25 ó 2,5 mg/kg de peso corporal/día a ratones a los que se inyectó diariamente leptina glicosilada o r-metHu-leptina. La dosis de leptina era 1 ó 10 mg/kg de peso corporal/día para ratones a a los que se inyectó cada dos días leptina glicosilada o r-metHu-leptina. Las inyecciones se realizaron en 7 días consecutivos comenzando el día de estudio 0 en la tarde avanzada (en el espacio de 2 horas de apagarse la luz en la colonia). A ratones a los que se inyectó cada dos días leptina recibieron inyecciones de vehículo los días alternos. Los animales fueron pesados diariamente en el momento de la inyección. La pérdida de porcentaje en peso se calcula como: ((peso corporal el día 7 - peso corporal el día 0)/peso corporal el día 0) multiplicado por 100. Todos los datos se reseñan como la media \pm ET.

Resultados

Tal como se muestra en la Tabla 10.1, ratones a los que se inyectaron diariamente 0,25 mg/kg de peso corporal/día de leptina glicosilada perdían más peso que los ratones que recibieron la misma dosis o una dosis diez veces mayor de metionil-leptina humana recombinante.

TABLA 10.1 Pérdida de peso (expresada como % del peso corporal inicial) después de 7 días de dosificación diaria de leptina glicosilada o metionil-leptina humana recombinante

	Dosis
Producto inyectado	0,25 mg/kg/d	2,5 mg/kg/d
r-metHu-leptina	-8,2 \pm 1,0%	-15,2 \pm 0,5%
Leptina glicosilada en Tres Sitios	-21,4 \pm 0,6%	no realizada

Tal como se muestra en la Tabla 10.2, ratones a los que se inyectó diariamente 1 mg/kg de peso corporal/día de leptina glicosilada perdían más peso que los ratones que recibieron la misma dosis o una dosis diez veces mayor de metionil-leptina humana recombinante.

TABLA 10.2 Pérdida de peso (expresada como % del peso corporal inicial) después de 7 días de dosificación diaria de leptina glicosilada o metionil-leptina humana recombinante

	Dosis
Producto inyectado	1,0 mg/kg/d	10 mg/kg/d
r-metHu-leptina	-5,7 \pm 0,8%	-10,6 \pm 0,8%
Leptina glicosilada en Tres Sitios	-16,9 \pm 1,0%	no realizada

Este ejemplo demuestra que la actividad biológica reforzada de leptina glicosilada, con relación a la leptina no glicosilada, se conserva cuando la proteína se administra de manera intermitente a ratones obesos.

Ejemplo 11 Estudios de Respuesta a la Dosis de una Leptina Glicosilada en Tres Sitios en Ratones de Tipo Salvaje

Este ejemplo demuestra que la presente leptina glicosilada en tres sitios con un radio de Stokes mayor que 30 \ring{A} tiene actividad biológica en ratones no obesos. Además, el presente ejemplo confirma en ratones de tipo salvaje que una dosis mucho más baja de la leptina glicosilada da como resultado una pérdida sustancial de peso, comparada con leptina no glicosilada.

1. Leptina. Se utilizó la leptina de tres sitios de glicosilación, preparada según se describe más abajo (sitios 47, 69 y 102, SEQ. ID Nº: 32), formulada a una concentración de 5,1 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, pH 6,8. Como base de comparación se utilizó metionil-leptina humana recombinante 1-146 (SEQ. ID Nº: 1 con un metionilo en la posición -1), formulada a razón de 20 mg/ml en acetato de sodio 10 mM con sorbitol al 5%, pH 4,0. Como control vehículo se utilizó acetato de sodio diez mM con sorbitol al 5%, pH 4,0.

2. Animales. Los animales se alojaron en condiciones controladas de temperatura, luz y humedad con las luces encendidas a las 0600 horas y las luces apagadas a las 1800 horas. El equipo de investigación con animales Amgen, Inc. ha sido aprobado por la USDA y ha sido acreditado por AAALAC. Por cada grupo de tratamiento se utilizaron seis ratones C57B1/6J hembras (Jackson Laboratories). Los ratones tenían una edad de 2,5 meses en el momento del estudio, y pesaban una media de 20,0 gramos. Los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento de modo que los pesos corporales medios de los grupos eran equivalentes antes del inicio del tratamiento. Se alojó a dos animales por jaula y se les alimentó con nódulos de alimentos para roedores de laboratorio estándares ad libitum.

3. Administración. Todos los procesos de tratamiento fueron aprobados por el Institutional Animal Care And Use Committee de Amgen. Leptina glicosilada, r-metHu-leptina o placebo se administraron diariamente a través de inyección subcutánea en la región escapular media en un volumen de 0,1 ml. La dosis de leptina era de 1 ó 10 mg/kg de peso corporal/día. Las inyecciones se realizaron en 7 días consecutivos, comenzando el día de estudio 0 en la tarde avanzada (en el espacio de 2 horas de apagarse la luz en la colonia). Los animales fueron pesados diariamente en el momento de la inyección. La pérdida de porcentaje en peso se calcula como: ((peso corporal el día 7 - peso corporal el día 0)/peso corporal el día 0) multiplicado por 100. Todos los datos se reseñan como la media \pm ET.

Resultados

Tal como se muestra en la Tabla 11.1, ratones a los que se inyectó diariamente 1 mg/kg de peso corporal/día de leptina glicosilada perdían más peso que los ratones que recibieron la misma dosis o una dosis diez veces mayor de metionil-leptina humana recombinante.

TABLA 11.1 Pérdida de peso (expresada como % del peso corporal inicial) después de 7 días de dosificación diaria de leptina glicosilada o metionil-leptina humana recombinante

	Dosis
Producto inyectado	1 mg/kg/d	10 mg/kg/d
r-metHu-leptina	-2,2 \pm 1,0%	-3,9 \pm 0,6%
Leptina glicosilada en Tres Sitios	-8,6 \pm 0,6%	no realizada

Este ejemplo demuestra que la actividad biológica reforzada de leptina glicosilada, con relación a la leptina no glicosilada, también está presente en ratones no obesos.

Ejemplo 12 Mejora en la Actividad de Pérdida de Peso de Leptina Glicosilada en Tres Sitios Administrada Intermitentemente a Ratones de Tipo Salvaje

El presente ejemplo demuestra que la presente leptina glicosilada en tres sitios con un radio de Stokes mayor que 30 \ring{A} tiene una actividad biológica mejorada en comparación con r-metHu-leptina 1-146. Además, el ejemplo demuestra que la actividad biológica se mantiene cuando la leptina glicosilada se administra a un programa de dosificación menos frecuente que r-metHu-leptina 1-146, en ratones de tipo salvaje.

1. Leptina. Se utilizó la leptina de tres sitios de glicosilación, preparada según se describe más abajo (sitios 47, 69 y 102, SEQ. ID Nº: 32), formulada a una concentración de 5,1 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, pH 6,8. Como base de comparación se utilizó metionil-leptina humana recombinante 1-146 (SEQ. ID Nº: 1 con un metionilo en la posición -1), formulada a razón de 20 mg/ml en acetato de sodio 10 mM con sorbitol al 5%, pH 4,0. Como control vehículo se utilizó acetato de sodio diez mM con sorbitol al 5%, pH 4,0.

2. Animales. Los animales se alojaron en condiciones controladas de temperatura, luz y humedad con las luces encendidas a las 0600 horas y las luces apagadas a las 1800 horas. El equipo de investigación con animales Amgen, Inc. ha sido aprobado por la USDA y ha sido acreditado por AAALAC. Por cada grupo de tratamiento se utilizaron seis ratones C57B1/6J hembras (Jackson Laboratories). Los ratones tenían una edad de 2,5 meses en el momento del estudio, y pesaban una media de 20,0 gramos. Los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento, de modo que los pesos corporales medios de los grupos eran equivalentes antes del inicio del tratamiento. Se alojó a dos animales por jaula y se les alimentó con nódulos de alimentos para roedores de laboratorio estándares ad libitum.

3. Administración. Todos los procesos de tratamiento fueron aprobados por el Institutional Animal Care And Use Committee de Amgen. Leptina glicosilada, r-metHu-leptina, o placebo se administraron diariamente a través de inyección subcutánea en la región escapular media en un volumen de 0,1 ml. La dosis de leptina era de 1,5 ó 10 mg/kg de peso corporal, inyectada cada dos días. Las leptinas se inyectaron cada dos días durante 7 días consecutivos comenzando el día de estudio 0 en la tarde avanzada (en el espacio de 2 horas de apagarse la luz en la colonia). Los ratones recibieron inyecciones de vehículo en días alternos. Los animales fueron pesados diariamente en el momento de la inyección. La pérdida de porcentaje en peso se calcula como: ((peso corporal el día 7 - peso corporal el día 0)/peso corporal el día 0) multiplicado por 100. Todos los datos se reseñan como la media \pm ET.

Resultados

Tal como se muestra en la Tabla 12.1, ratones a los que se inyectó cada dos días 1, 5 ó 10 mg/kg de peso corporal de leptina glicosilada perdían más peso que los ratones que recibieron la misma dosis de metionil-leptina humana recombinante.

TABLA 12.1 Pérdida de peso (expresada como % del peso corporal inicial) después de 7 días de dosificación cada dos días de leptina glicosilada o metionil-leptina humana recombinante

	Dosis
Producto Inyectado	1 mg/kg	5 mg/kg	10 mg/kg
r-metHu-leptina	0,8 \pm 1,4%	-1,0 \pm 0,8%	-1,5 \pm 0,9%
Leptina Glicosilada en Tres Sitios	-1,2 \pm 2,1%	-6,7 \pm 1,2%	-9,1 \pm 0,5%

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Este ejemplo demuestra que la actividad biológica reforzada de leptina glicosilada, con relación a la leptina no glicosilada, se conserva cuando la proteína se administra intermitentemente a ratones no obesos.

Ejemplo 13 Proteínas Leptina de Múltiples Sitios de Glicosilación Adicionales

En la Tabla 13.1 que figura más abajo se presentan proteínas leptina humana glicosiladas adicionales que también se prepararon. Las columnas de la Tabla presentan: (1) la posición de la N-glicosilación (con respecto a la numeración de SEQ. ID Nº: 1, rHu-leptina 1-146) (a menos que se señale de otro modo); (2) el rendimiento de expresión en comparación con "tipo salvaje" ("WT", aquí, rHu-leptina 1-146 como en SEQ. ID Nº: 1); (3) las especies de glicosilación que se detectaron; (4) la unión al receptor con relación a "WT"; (5) la bioactividad con relación a "WT". En lo que sigue se describen los métodos utilizados. El término "ND" significa no determinado. (Las secuencias específicas utilizadas en esta memoria para la expresión se recogen con más detalle en el Ejemplo que figura a continuación perteneciente a la expresión de proteína leptina glicosilada 47 + 69 + 102).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 13.1

Sumario de la expresión de la Glicosilación en Tres Sitios de Leptina de COS, unión y resultados de glicosilación
Posición de	Expresión	Glicosilación	Unión al receptor	Bioactividad rel. a WT
N-glicosilación	rel. a WT		rel. a WT
Ninguna	1	0	1	1
2+69+92	1.07	1'25,2'-45,3'-10	0.7	0.41
2+69+92 RRR*	0.36	1'-10,2'-25,3'-60	ND	ND
26+33+48	0.25	1'-30,2'-30,3'-20	ND	ND
26+35+48	0.88	1'30,2'-30,3'-20	1.3	ND
26+33+115	0.17	1'30,2'-30,3'-20	ND	ND
26+35+115	0.16	1'30,2'-30,3'-20	ND	ND
27+35+115	0.25	1'-30,2'-30,3'-20	0.8	ND
29+33 +115	0.83	1'-30,2'-30,3'-20	1.1	ND
33+48+115	0.27	1'-25,2'-25,3'-40	0.7	ND
35+48+115	0.47	1'30,2'-30,3'-20	1	ND
47+69+100e	2.66	1'-5,2'-80(50/O-link)	0.66	1.3
47+69+102	1.8	1'-30,2'-50,3'-10	0.62	0.86

TABLA 13.1 (continuación)

Posición de	Expresión	Glicosilación	Unión al receptor	Bioactividad rel. a WT
N-glicosilación	rel. a WT		rel. a WT
47+69+103	0.57	1'-20,2'-45,3'-5	0.44	0.11
48+69+101	2.2	1'-10,2'-60,3'-10	0.95	0.15
48+69+102	3.3	1'-20,2'-45,3'-20	1.04	0.46
48+69+103	2.8	1'-15,2'-60,3'-5	0.52	0.36
48+69+118	1.2	1'-20,2'-45,3'-5	0.09	1.6
69+102+118	1.1	1'-50,2'-30,3'-0	0.11	3.5
69+103+118	0.72	1'-50,2'-20,3'-0	0.55	1.5
Las abreviaturas y anotaciones son las mismas que las utilizadas anteriormente, véase, por ejemplo, la Tabla 4.1.
*"RRR" significa el uso de tres residuos arginina C-terminales en la proteína leptina glicosilada.

Adicionalmente, se han preparado las siguientes proteínas leptina glicosiladas en múltiples sitios y se han sometido a ensayo tal como se escribe en el Ejemplo 15 que figura más abajo.

2+23+47+69+92

2+47+69+92+102

23+47+69+92+102

2+47+69+92

2+47+69+102

23+47+69+102

23+47+69+92

Q-47+69+92+102 ("Q-" indica que SEQ. ID Nº: 2, rHu-leptina 1-145, se utilizó como la cadena principal de proteína a la que se añadieron sitios de glicosilación)

47+69+92+100e+102

Además, la presente invención también abarca una proteína leptina glicosilada con sitios de glicosilación en las posiciones 47, 69, 92 y 102.

Ejemplo 14 Expresión de una Proteína Leptina Glicosilada en Tres Sitios Utilizando una Diversidad de Secuencias Señal y Otras Secuencias que Afectan a la Glicosilación

Este ejemplo ilustra las diferencias en la glicosilación de una proteína leptina glicosilada en tres sitios con sitios disponibles para la glicosilación situados en las posiciones 47, 69 y 102 de rHu-leptina 1-146 (SEQ. ID Nº: 1 con los sitios de glicosilación señalados utilizando la fórmula N-X-S/T, preparada según se describe en esta memoria), también según se describe antes. La expresión en dos tipos de células, células COS y células CHO, se realizó generalmente de acuerdo con métodos en los Ejemplos de Referencia que figuran más abajo. La glicosilación se determinó de acuerdo con los métodos recogidos en los Ejemplos de Referencia que figuran más abajo. El grado de glicosilación se anotó en una escala del 1 al 5, teniendo 5 el aspecto de la máxima ocupación de los sitios de glicosilación. El término "ND" significa "no determinado".

Se utilizó una diversidad de secuencias señal. Las secuencias de aminoácidos de estas secuencias señal se presentan más abajo en la Tabla 14.1. Los siguientes términos se utilizaron para señalar qué secuencias señal u otras secuencias de aminoácidos se utilizaron para expresar la presente leptina glicosilada:

\vskip1.000000\baselineskip

\begin{minipage}[t]{157mm}Leptina - la secuencia señal de leptina humana que se produce en la naturaleza\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}Leptina/TLA (L/T) - los primeros cinco aminoácidos N-terminales de leptina humana, seguidos de 15 aminoácidos de señal de tPA humano que terminan con SP\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}TPA/leptina (T/L) - los siete aminoácidos N-terminales del activador del plasminógeno tisular humano, seguidos por 16 aminoácidos de la secuencia señal de leptina humana que comienzan en LCG\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}Leptina (SP) - la secuencia señal de leptina humana que se produce en la naturaleza, excepto con los últimos dos aminoácidos C-terminales reemplazados por serina-prolina\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}Leptina (SPS) - la secuencia señal de leptina humana que se produce en la naturaleza, excepto con los últimos dos aminoácidos C-terminales reemplazados por serina-prolina-serina\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}Leptina (SNS) - la secuencia señal de leptina humana que se produce en la naturaleza, excepto con los últimos dos aminoácidos C-terminales reemplazados por serina-asparagina-serina\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}Leptina-pro - la secuencia señal de leptina humana que se produce en la naturaleza, más una secuencia "pro" adicional en el extremo C\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}Leptina-modificada (LGDVMT) - la secuencia señal de leptina humana que se produce en la naturaleza, excepto con seis aminoácidos C-terminales sustituidos con LGDVMT\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}Leptina + RRR y C-term - la secuencia señal de leptina humana que se produce en la naturaleza y, adicionalmente en el extremo C de la proteína leptina glicosilada, tres residuos arginina\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}Leptina R81, R85 (análogo) - la secuencia señal de leptina humana que se produce en la naturaleza y siendo la proteína leptina glicosilada la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID N^{o}\text{:} 1 con arginina en las posiciones 81 y 85, y sitios de glicosilación en las posiciones 47, 69 y 102\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}Trombopoyetina (TPO) - la secuencia señal de trombopoyetina humana que se produce en la naturaleza\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}Activador del Plasminógeno Tisular (TPA) - la secuencia señal de activador del plasminógeno tisular humano que se produce en la naturaleza,\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}TPA (SNS) - la secuencia señal de activador del plasminógeno tisular humano que se produce en la naturaleza, siendo los tres aminoácidos C-terminales los aminoácidos serina-asparagina-serina\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}TPA (SPA) - la secuencia señal de activador del plasminógeno tisular humano que se produce en la naturaleza, siendo los tres aminoácidos C-terminales los aminoácidos serina-prolina-alanina\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}TPA (SP) - la secuencia señal de activador del plasminógeno tisular humano que se produce en la naturaleza, siendo los tres aminoácidos C-terminales los aminoácidos serina-prolina\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}TPA (SFS) - la secuencia señal de activador del plasminógeno tisular humano que se produce en la naturaleza, siendo los tres aminoácidos C-terminales los aminoácidos serina-fenilalanina-serina\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}TPA (SWS) - la secuencia señal de activador del plasminógeno tisular humano que se produce en la naturaleza, siendo los tres aminoácidos C-terminales los aminoácidos serina-triptófano-serina\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}TPA (INS) - la secuencia señal de activador del plasminógeno tisular humano que se produce en la naturaleza, siendo los tres aminoácidos C-terminales los aminoácidos isoleucina-asparagina-serina\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}TPA (INA) - la secuencia señal de activador del plasminógeno tisular humano que se produce en la naturaleza, siendo los tres aminoácidos C-terminales los aminoácidos isoleucina-asparagina-alanina\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}TPA-A2 - la secuencia señal de activador del plasminógeno tisular humano que se produce en la naturaleza, con aminoácidos C-terminales adicionales de arginina-glicina-arginina-fenilalanina-arginina-arginina\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}TPA (SP)-A2 - la secuencia señal de activador del plasminógeno tisular humano que se produce en la naturaleza, con la última serina de la secuencia que se produce en la naturaleza eliminada y con aminoácidos C-terminales adicionales de arginina-glicina-arginina-fenilalanina-arginina-arginina\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}TPA-A4 - la secuencia señal de activador del plasminógeno tisular humano que se produce en la naturaleza, con aminoácidos C-terminales adicionales de glutamina-ácido glutámico-isoleucina-histidina-alanina-arginina-fenilalanina-arginina-arginina\end{minipage}

(Continuación)

\begin{minipage}[t]{157mm}Factor intrínseco - la secuencia señal del factor intrínseco humano que se produce en la naturaleza\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}Albúmina de suero (pre-pro) - la secuencia y procesecuencia señal de albúmina de suero humano que se producen en la naturaleza\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}G-CSF - la secuencia señal del factor estimulante de la colonia de granulocitos humano que se produce en la naturaleza\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}Factor de von Willebrand (vW) - la secuencia señal del factor de von Willebrand humano que se produce en la naturaleza\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm} MAC -1 (CD11 alfa) - el péptido señal de CD11\alpha humano que se produce en la naturaleza\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}Tie (receptor) - el péptido señal del receptor Tie humano que se produce en la naturaleza\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}Factor VIII - la secuencia señal del factor VIII humano que se produce en la naturaleza\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}IgG-1, murínica - la secuencia señal de IgG-1 murínica que se produce en la naturaleza\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}Folistatina (FS) - la secuencia señal de folistatina humana que se produce en la naturaleza\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}LAMP-1 - el péptido señal de LAMP-1 humano que se produce en la naturaleza\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}Ceruloplasmina (CP) - el péptido señal de ceruloplasmina humano que se produce en la naturaleza\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}EPO (o "ESP" que significa péptido señal de eritropoyetina) - la secuencia señal de eritropoyetina humana que se produce en la naturaleza\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}EPO (ESP) RRR y C-term - la secuencia señal de eritropoyetina humana que se produce en la naturaleza y que tiene también, en el extremo C de la secuencia de aminoácidos para la proteína leptina glicosilada, tres residuos arginina\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}EPO-HSApro - la secuencia señal de eritropoyetina humana que se produce en la naturaleza que tiene en el extremo C la secuencia "pro" de albúmina de suero humana\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}EPO-modificado HSApro - la secuencia señal de eritropoyetina humana que se produce en la naturaleza que tiene en el extremo C una secuencia "pro" modificada de albúmina de suero humana (modificada como se indica en la tabla que figura más abajo)\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}EPO-modificado HSApro + furina - la secuencia señal de eritropoyetina humana que se produce en la naturaleza que tiene en el extremo C una secuencia "pro" modificada de albúmina de suero humana (modificada como se indica en la tabla que figura más abajo) coexpresada con furina\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}EPO-NT3 pro - la secuencia señal de eritropoyetina humana que se produce en la naturaleza que tiene en el extremo C una secuencia "pro" de NT-3\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{157mm}EPO- HSApro (leptina NH2 VtoA) - la secuencia señal de eritropoyetina humana que se produce en la naturaleza que tiene en el extremo C una secuencia "pro"de albúmina de suero humana y con Val1 de la secuencia de leptina cambiada en Ala para mejorar la escisión de la prosecuencia por parte de furina\end{minipage}

TABLA 14.1 Expresión de proteína glicosilada en 47+69+102 leptina

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Los diversos péptidos señal de TPA, particularmente aquellos con extremos C modificados (tal como la adición de una prosecuencia) parecieron tener la mayor eficacia de glicosilación tanto en células CHO como en COS.

Esto se confirmó en un borrón de Western (Figura 7). Como se puede observar, el uso del péptido señal para TPA dio como resultado el mayor peso molecular y, por lo tanto, la muestra más altamente glicosilada.

La Figura 8 es un borrón de Western que muestra los resultados de una comparación de las diversas condiciones de expresión para la proteína leptina glicosilada en tres sitios 47 + 69 + 102 como antes. Comenzando en la parte izquierda del borrón de Western en la Figura, las pistas están cargadas de la siguiente forma:

Pista 1: patrones de peso molecular;

Pista 2: 47+69+102 con una secuencia de aminoácidos C-terminal de tres argininas, expresadas en células COS utilizando el péptido señal de leptina humana nativa;

Pista 3: la misma que la pista 2, expresada en células CHO;

Pista 4: la misma que la pista 2, expresada al utilizar un péptido señal de eritropoyetina humana nativa;

Pista 5: "QTT COS ESP", rHu-leptina 1-145 (SEQ. ID Nº: 2) con el cambio de aminoácido 27T29S\rightarrow27T29T, expresada en células COS utilizando un péptido señal de eritropoyetina humana nativa;

Pista 6: "QTT CHO ESP", la misma que la pista 5, expresada en células CHO utilizando un péptido señal de eritropoyetina humana nativa;

Pista 7: "EA2 47 + 69 + 102 COS", la misma que la pista 2, careciendo de las argininas C-terminales, expresada en células COS utilizando el péptido señal de eritropoyetina y una prosecuencia de albúmina humana modificada según se indica en este Ejemplo;

Pista 8: "EA2 47 + 69 +102 CHO", la misma que la pista 7, expresada en células CHO;

Pista 9: "EA2 47 + 69 + 102 + furina en CHO", la misma que en la pista 8, utilizando la construcción furina tal como se indica en este Ejemplo.

Como se puede observar, al anotar la densidad de bandas de elevado peso molecular (que indican una glicosilación), la proteína leptina triple glicosilada (pistas 2, 3, 4, 7, 8 y 9) tiene una mayor glicosilación que la rHu-leptina 1-145 modificada que tiene un único sitio enlazado a O (pistas 5 y 6). El uso de células CHO dio como resultado una cantidad incrementada de glicosilación en comparación con células COS (pista 2 frente a pista 4, por ejemplo) y el uso del péptido señal de eritropoyetina pareció también mejorar también la glicosilación (pista 3 frente a pista 5, por ejemplo).

La Figura 9 es un borrón Western que compara el uso del péptido señal de leptina o del péptido señal de tPA, o el uso de uno cualquiera con un sitio de escisión de la enzima sustituido del otro. El uso del péptido señal de tPA dio como resultado una mayor glicosilación que el uso del péptido señal de leptina (dos pistas de la izquierda). Cuando se utilizó la porción C-terminal del péptido señal de leptina que contiene su sitio de escisión de petidasa con la porción N-terminal del péptido señal de tPA, disminuyó la eficacia de glicosilación (pistas "Tpa/leptina"). Sin embargo, cuando se utilizó la parte C-terminal del péptido señal de tPA que contenía su sitio de escisión con la parte N-terminal del péptido señal de leptina, aumentó la eficacia de glicosilación (pistas "leptina/Tpa"). Se encontró una buena eficacia de la glicosilación cuando únicamente se introdujo el sitio de escisión tPA en el péptido señal de leptina ("leptina (SPS)"). Tenía una mayor eficacia de glicosilación que la sustitución de una secuencia de sitio de escisión parcial ("leptina(SP)").

La Figura 10 es un borrón Western que compara la eficacia de la glicosilación observando los resultados de la separación del resto hidrato de carbono por N-glicanasa. Como se puede observar, en las pistas que tienen el hidrato de carbono separado (indicado por el "+"), la proteína leptina migra al mismo peso molecular que la leptina no glicosilada. Comparando la cantidad aparente de hidrato de carbono en las pistas sin N-glicanasa ("-"), el uso del péptido señal de eritropoyetina ("ESP" o "E" en combinación con otra anotación, tal como se utiliza antes) parece glicosilar de manera más eficaz a la proteína leptina glicosilada en tres sitios sometida a ensayo.

Ejemplo 15 Estudios de Expresión Adicionales de Proteínas Leptina Glicosiladas en Múltiples Sitios Utilizando una Diversidad de Péptidos Señal y otras Secuencias que afectan a la Glicosilación

Este ejemplo presenta datos adicionales de expresión de proteínas leptina de un solo sitio de glicosilación y de múltiples sitios de glicosilación, utilizando una diversidad de péptidos señal y otra secuencia. A menos que se indique de otro modo, las proteínas leptina glicosiladas que figuran más abajo se refieren a los sitios de glicosilación añadidos a SEQ. ID Nº: 1, utilizando la fórmula preferida de N-X-S/T. La expresión se realizó en células COS.

El porcentaje ("%") de glicosilación significa el porcentaje de las moléculas que contienen cualquier hidrato de carbono. Este procentaje se determinó mediante el examen visual de un borrón Western (tal como se describe adicionalmente más abajo en los Ejemplos de Referencia) y determinando subjetivamente esa proporción de proteína glicosilada de la proteína leptina total visualizada.

Controles

Presentados más abajo en la Tabla 15.1 se encuentran los datos para diversas proteínas leptina. La leptina humana 1-145 (SEQ. ID Nº: 2, señalada en esta memoria como "Q-") se expreso en forma de una proteína glicosilada. Cuando se expresó en células COS utilizando sus sitio de glicosilación nativo, utilizando un péptido señal de eritropoyetina ("ESP" como en los Ejemplos anteriores), existía un 25% de glicosilación (que indica que el 25% de los sitios disponibles para la glicosilación estaban glicosilados en una población de moléculas de proteína expresada). Este valor se encuentra por encima del 10% de glicosilación observada cuando se utilizó el péptido señal de leptina humana nativa (como antes). Cuando uno de los sitios de glicosilación se cambió con el fin de que tuviera una treonina en la posición 29 más que una serina (tal como se muestra en la Tabla), los resultados se duplicaron, indicando que una "T" es mejor que una "S" para la glicosilación en O. Tanto la "T" como la "S" del sitio enlazado a O natural puede estar cada una glicosilada con una mezcla de una o dos cadenas de hidratos de carbono. Cuando el sitio se cambia de modo que tenga una "T" en la posición 29, se incrementa el porcentaje de estos dos sitios con 1 y/o dos cadenas.

TABLA 15.1

Posición de	Cambio de la	Expresión con	% de	Unión al receptor	Bioactividad
glicosilación	secuencia	rel. a WT	glicosilación	rel a WT	rel a WT
WT	ninguno	1	0	1	1
ESP Ob+	EPO sp	2	0	1	0.95
(-Q) Ob+	(-)Q y 28	1,3	10	1,3	0,14
ESP (-Q)Ob+	EPO sp	1,1	25	0,6	0,36
ESP (-Q[TT])Ob+	27T29S\rightarrow27T29T	0,72	60	0,71	0,3
EA Ob+		0,13	0	3,5	1,8
"WT" significa rHu-leptina 1-146 (SEQ.. ID Nº: 1)
"ESP" significa el péptido señal de eritropoyetina humana nativa, tal como se recoge en el Ejemplo 14 anterior
"ESP Ob+" significa el uso de lo anterior con el péptido señal de eritropoyetina humana nativa
"(-Q)Ob+" significa rHu-leptina 1-145 (SEQ.. ID Nº: 2)
"EA" significa el uso del péptido señal de eritropoyetina humana nativa con la prosecuencia de albúmina humana,
tal como en elEjemplo 14 anterior.

Expresión de Proteínas Leptina Glicosiladas en un solo Sitio Comparaciones en el Sitio 2

Tal como se puede observar por la Tabla 15.2 que figura más abajo, la adición de tres argininas terminales dio como resultado una eficacia mejorada de la glicosilación.

TABLA 15.2

Posición de	Expresión con	% de	Unión al receptor	Bioactividad
glicosilación	rel. a WT	glicosilación	rel a WT	rel a WT
ESP2	0,3	60	0,9	0,16
				0,012
EA V>A2	0,45	35	1, 0,7	0,53
				0,73
2RRR	ND	90	ND	ND

En el caso en que se realizaron dos ensayos, se presentan los dos resultados. Las abreviaturas son las mismas que para el Ejemplo 14 anterior. "ND", tal como se utiliza en todas las Tablas, significa no determinada.

Comparaciones en el Sitio 23

Tal como se indica en la Tabla 15.3, los niveles de expresión más elevados y la bioactividad más elevada se produjeron con el uso del péptido señal de leptina nativa (primera fila, 23a). La expresión se realizó en células COS.

TABLA 15.3

Posición de	Cambios de la	Expresión con	% de	Unión al receptor	Bioactividad
glicosilación	secuencia	rel. a WT	glicosilación	rel a WT	rel a WT
23a	DIS > NIT	7,8	50	ND	0,53
ESP+ 23a	EPO sp	0,49	30	0,5	0,79
ESP(-Q) 23	EPO sp	0,78	45	0,87	< 0,03
ESP (-Q[TT]) 23	EPO sp	0,32	60	ND	< 0,004

Las abreviaturas son las mismas que las del Ejemplo 14 anterior. "ND", tal como se utiliza en todas las Tablas, significa no determinado.

Comparaciones en el Sitio 47

Tal como se puede observar en la Tabla 15.4 que figura más abajo, la adición de tres residuos arginina terminales ("RRR") dio como resultado una glicosilación adicional para la proteína leptina glicosilada con un sitio de glicosilación en la posición 47.

TABLA 15.4

Posición de	Expresión con	% de	Unión al receptor	Bioactividad
glicosilación	rel. a WT	glicosilación	rel a WT	rel a WT
47	1,06	80	0,66	0,84
47RRR	0,07	95	ND	0,86

En el caso en que se realizaron dos ensayos, se presentan los dos resultados. Las abreviaturas son las mismas que para el Ejemplo 14 anterior. "ND", tal como se utiliza en todas las Tablas, significa no determinada.

Comparaciones en el Sitio 48

Tal como se presenta en la Tabla 15.5 que figura más abajo, los niveles de expresión más elevados para la proteína leptina glicosilada en un solo sitio en la posición 48 utilizando células COS era con el péptido señal de eritropoyetina combinado con la prosecuencia de albúmina de suero humana. Como puede observarse, esta proteína de un solo sitio tenía una actividad biológica mayor que la leptina no glicosilada.

TABLA 15.5

Posición de	Cambios de la	Expresión con	% de	Unión al receptor	Bioactividad
glicosilación	secuencia	rel. a WT	glicosilación	rel a WT	rel a WT
48	ILT > NLT	0,92	50	0,8	0,53
ESP 48	EPO sp	0,54	75	0,8	< 0,001
EA 48	EPO sp + HSA pro	1,8	80	1	1,2
AA 48	HSA sp + HSA pro	1	90	1	0,78

Las abreviaturas utilizadas son las mismas que las utilizadas para los Ejemplos anteriores. El porcentaje de glicosilación se expresa en los mismos términos que en la Tabla 15.1 anterior.

Comparaciones en el Sitio 69

Tal como se puede observar por la Tabla 15.6 el uso del péptido señal de tPA más tres argininas terminales dio como resultado la más elevada eficacia de glicosilación.

TABLA 15.6

Posición de	Expresión con	% de	Unión al receptor	Bioactividad
glicosilación	rel. a WT	glicosilación	rel a WT	rel a WT
69	0,8	75	0,6	1,1
T69	ND	85	ND	ND
69RRR	0,07	65	ND	ND
T 69RRR	0,04	95	ND	ND

Las abreviaturas utilizadas son las mismas que las utilizadas para los Ejemplos anteriores. El porcentaje de glicosilación se expresa en los mismos términos que en la Tabla 15.1 anterior.

Comparaciones en el Sitio 92

Tal como se puede observar en la Tabla 15.7, la adición de tres argininas terminales mejoró la eficacia de la glicosilación.

TABLA 15.7

Posición de	Expresión con	% de	Unión al receptor	Bioactividad
glicosilación	rel. a WT	glicosilación	rel a WT	rel a WT
92	4,8	45	1,6	0,8
92RRR	0,03	95	ND	ND

Las abreviaturas utilizadas son las mismas que las utilizadas para los Ejemplos anteriores. El porcentaje de glicosilación se expresa en los mismos términos que en la Tabla 15.1 anterior.

Comparaciones en el Sitio 102

Tal como se puede observar en la Tabla 15.8, la adición de tres residuos arginina C-terminales dio como resultado una eficacia mejorada de la glicosilación.

TABLA 15.8

Posición de	Expresión con	% de	Unión al receptor	Bioactividad
glicosilación	rel. a WT	glicosilación	rel a WT	rel a WT
102	1,8	70	0,5	0,66
102RRR	0,07	95	ND	0,33

\vskip1.000000\baselineskip

Las abreviaturas utilizadas son las mismas que las utilizadas para los Ejemplos anteriores. El porcentaje de glicosilación se expresa en los mismos términos que en la Tabla 15.1 anterior.

Expresión de Proteína Leptina Glicosilada en Dos Sitios Comparaciones en los Sitios 47 + 69

Tal como se puede observar en la Tabla 15.9, para la proteína glicosilada leptina en los sitios 47 + 69 (tal como se describe antes) el uso de péptidos señal de leptina nativa dio los niveles de expresión más elevados. El uso del péptido señal de eritropoyetina con la prosecuencia de albúmina de suero humana o el uso del péptido señal de albúmina de suero humana y prosecuencia dieron resultados de bioactividad mayores.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 15.9

Posición de	Cambios de la	Expresión con	% de	Unión al receptor	Bioactividad
glicosilación	secuencia	rel. a WT	glicosilación	rel a WT	rel a WT
47+69	47+69	1,3	1'-10,2'-50	1	0,69
ESP 47+69	EPO sp	0,35	1'-10,2'-60	0,6	< 0,002
EA 47+69	EPO sp + HSA pro	0,3	1'-5,2'-85	0,3	1,8
AA 47+69	HSA sp + HSA pro	0,82	1'-20,2'-50	1	1,7

\vskip1.000000\baselineskip

Las abreviaturas son las mismas que las utilizadas anteriormente. La glicosilación se expresa en los mismos términos que los utilizados antes, véase, por ejemplo, la Tabla 4.1.

Comparaciones en los Sitios 69 + 102

Tal como se puede observar en la Tabla 15.10, el uso del péptido señal de eritropoyetina en células COS tenía aparentemente un efecto perjudicial sobre la expresión de la leptina glicosilada en dos sitios 69 + 102 (tal como se describe antes).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 15.10

Posición de	Cambios de la	Expresión con	% de	Unión al receptor	Bioactividad
glicosilación	secuencia	rel. a WT	glicosilación	rel a WT	rel a WT
69+102	69+102	1,7	1'-40,2'-30	0,5	0,63
ESP 69+102	EPO sp/69+102	0,6	1'-20,2'-50	1	< 0,001
47+102	47+102	2,7	1'-50,2'-25	1,08	0,42

\vskip1.000000\baselineskip

Las abreviaturas son las mismas que las utilizadas anteriormente, véase, por ejemplo, el Ejemplo 14 para mayor detalle. La glicosilación se expresa en los mismos términos que los utilizados antes, véase, por ejemplo, la Tabla 4.1.

Expresión de Proteína Leptina Glicosilada en Tres Sitios

Como se puede observar en la Tabla 15.11, el uso del péptido señal de eritropoyetina tenía efectos variables sobre diversas proteínas leptina glicosiladas expresadas en células COS. De manera interesante, la proteína leptina glicosilada con la más alta bioactividad tenía la más alta unión al receptor (cuanto menor sea el número, más alta es la afinidad por el receptor).

TABLA 15.11

Posición de	Cambios de la	Expresión con	% de	Unión al receptor	Bioactividad
glicosilación	secuencia	rel. a WT	glicosilación	rel a WT	rel a WT
ESP 2+47+69	EPO sp	0,2	1'-5,2'-70,3'-20	0,7	0,24
L/T 2+47+69	(véase Ej.14)	0,21	1'-5,2'-60,3'-30	1,25	ND
L(SNS)2+47+69	(véase Ej.14)	0,31	ND	1,63	ND
T 2+47+69	(véase Ej.14)	0,1	1'-5,2'-50,3'-40	ND	ND
ESP 23+47+69	EPO sp	0,51	1'-5,2'-10,3'-45	0,5	1,4
ESP 47+69+77	EPO sp	0,51	1'-10,2'-75,3'-5	4,2	< 0,006
ESP 47+69+92	EPO sp	0,39	2'-15,2'-50,3'-15	0,71	0,47
ESP (-Q ) 47+69+92	EPO sp	0,76	1'-15,2'-50,3'-15	0,8	0,88

Las abreviaturas son las mismas que las utilizadas anteriormente, véase, por ejemplo, el Ejemplo 14 para mayor detalle. La glicosilación se expresa en los mismos términos que los utilizados antes, véase, por ejemplo, la Tabla 4.1.

Expresión de Proteína Leptina Glicosilada en Cuatro Sitios

Como se puede observar en la Tabla 15.12, para la expresión en células COS de la proteína leptina glicosilada en cuatro sitios, se obtuvieron diversos niveles de expresión, y las proteínas glicosiladas resultantes tenían diversos grados de unión al receptor y bioactividad. Para este grupo de leptinas de cuatro sitios, las leptinas de los sitios 23 + 47 + 69 + 92 y 23 + 47 + 69 + 102 tenían la más alta bioactividad con relación al tipo salvaje (es decir, rmetHu-leptina 1-146, SEQ.ID Nº: 1).

TABLA 15.12

Sumario de la Expresión en Cuatro Sitios de Glicosilación de Leptina en COS, Unión y Resultados de la
Glicosilación
Posición de	Expresión con	Glicosilación	Unión al receptor	Bioactividad
glicosilación	rel. a WT		rel a WT	rel a WT
Ninguna	1	0	1	1
ESP 2+47+69+92RRR	0,004	1'-5,2'-5,3'-30,4'-70	ND	ND
2+47+69+92RRR	0,13	1'-5,2'-5,3'-60,4'-25	ND	0,2
T 2+47+69+92	0,052	1'-5,2'-5,3'-45,4'-40	ND	ND
T 2+47+69+92RRR	0,01	1'-5,2'-5,3'-35,4'-50	ND	ND
T(SNS) 2+47+69+92	0,15	1'-5,2'-20,3'-45,4'-25	1,1	< 0,1
T(-S) 2+47+69+92	0,14	1'-5.2'-20,3'-45,4'-25	1,1	< 0,01
EA 2+47+69+92	0,24	1'-5,2'-10,3'-50,4'-30	ND	ND
TA4 2+47+69+92	0,24	1'-10,2'-25,3'-15,4'-45	0,6	0,49

TABLA 15.12 (continuación)

Posición de	Expresión con	Glicosilación	Unión al receptor	Bioactividad
glicosilación	rel. a WT		rel a WT	rel a WT
TA5 2+47+69+92	0,13	1'-10,2'-25,3'-15,4'-45	0,8	0,88
L/T 2+47+69+92	0,2	1'-5,2'-25,3'-45,4'-25	1,2	ND
L(SNS) 2+47+69+92	0,28	ND	0,75	ND
T 2+47+69+92	0,16	ND	ND	ND
L(SNS) 2+47+69+102	0,28	ND	1,1	ND
ESP 23+47+69+102	0,48	1'-20,2'-20,3'-20,4'-10	0,5	1,8
ESP 23+47+69+92	0,41	1'-20,2'-20,3'-20,4'-5	0,5	2,3
ESP (-Q) 47+69+92+102	0,32	1'-10,2'-40,3'-40	0,57	0,13
47+69+100e+102	1,5	1'-25,2'-40,3'-20	0,7	0,66

Las abreviaturas son las mismas que las utilizadas anteriormente, véase, por ejemplo, el Ejemplo 14 para mayor detalle. La glicosilación se expresa en los mismos términos que los utilizados antes, véase, por ejemplo, la Tabla 4.1.

Expresión de Proteína Leptina Glicosilada en Cinco Sitios

Tal como se presenta en la Tabla 15.13, los niveles de expresión de diversas proteínas glicosiladas en cinco sitios eran bastante bajos utilizando los péptidos señal indicados. Algunos datos no se determinaron ("ND").

TABLA 15.13

Sumario de la Expresión en Cuatro Sitios de Glicosilación de Leptina en COS, Unión y Resultados de la
Glicosilación
Posición de	Expresión con	Glicosilación	Unión al receptor	Bioactividad
glicosilación	rel. a WT		rel a WT	rel a WT
Ninguna	1	0	1	1
2+23+47+69+92RRR	0,11	1'-5,2'-5,3'-20,4'-40,5'-25	1	ND
T 2+23+47+69+92	0,045	2'-5,3'-20,4'-40,5'-25	ND	ND
T 2+23+47+69 +92RRR	0,01	2'-5,3'-10,4'-45,5'-30	ND	ND
T 2+47+69 +92+102	0,19	2'-20,3'-30,4'-30,5'-15	0,83	ND
ESP 23+47+69+92+102	0,34	1'-20,2'-20,3'-20,4'-20,5'-5	0,3	1,3
L/T 2+47+69+92+102	0,29	2'-20,3'-30,4'-30,5'-5	0,75	ND
L(SPS) 2+47+69+92-102	0,18	1'-5.2'-10,3'-20,4'-30,5'-25	1,42	ND
(TSNS) 2+47+69+92+102	0,16	2'-30,3'-30,4'-30,5'-5	0,5	ND
T(SPA) 2+47+69+92+102	0,19	2'-20,3'-30,4'-30,5'-15	0,58	ND
L(SNS) 2+47+69+92+102	0,21	ND	0,38	ND

Las abreviaturas son las mismas que las utilizadas anteriormente, véase, por ejemplo, el Ejemplo 14 para mayor detalle. La glicosilación se expresa en los mismos términos que los utilizados antes, véase, por ejemplo, la Tabla 4.1.

Además, borrones Western de las presentes proteínas leptina glicosiladas ilustran también que las diferencias en las condiciones de expresión y composiciones resultan en diferentes eficacias de glicosilación. La Figura 11 muestra que al aumentar el número de sitios de glicosilación, al menos hasta cinco sitios, aumenta la magnitud de glicosilación encontrada en la proteína leptina cuando se expresa en células CHO. Las muestras son como sigue:

Pista 0: "MOCK" es sobrenadante del cultivo de células que no contiene leptina;

Pista 1: "ESP(W.T.)", rHu-leptina 1-146 (SEQ.. ID Nº: 1), expresada al utilizar un péptido señal de eritropoyetina;

Pista 2: "ESP (N48)", la misma que la anterior, utilizando la proteína leptina glicosilada en un solo sitio indicada (tal como se describe antes):

Pista 3: "ESP (N47 + N69)", la misma que la anterior, utilizando la proteína leptina glicosilada en un dos sitios indicada (tal como se describe antes):

Pista 4: "ESP (N47 + N69 + N102)", la misma que la anterior, utilizando la proteína leptina glicosilada en un tres sitios indicada (tal como se describe antes):

Pista 5: "Tpa(SNS) N2 + N46 + N69 + N102)" indica la proteína leptina glicosilada en cuatro sitios según se describe antes, expresada al utilizar un péptido señal de tPA humano con un sitio de escisión de la enzima de SNS (véase el Ejemplo 14 para la información de la secuencia);

Pista 6: "Tpa N2 + N23 + N47 + N69 + N92" indica la proteína leptina glicosilada en cinco sitios según se describe antes, expresada al utilizar un péptido señal de tPA humano natural (véase el Ejemplo 14 para la información de la secuencia);

Como se puede observar, el peso molecular aumenta con el incremento en los sitios de glicosilación (compárese la pista 1 con la pista 6). Esto indica que a los sitios están añadidos hidratos de carbono y que a la leptina se pueden añadir simultáneamente hasta cinco cadenas.

Aminoácidos/péptidos N-terminales

La Tabla 15.14 que figura más abajo presenta una comparación de los diferentes aminoácidos N-terminales de la presente proteína leptina glicosilada incidente al uso de diversos sitios de escisión de la enzima sustituidos para diversos péptidos señal.

TABLA 15.14

Péptido señal	Glicosilación	Extremo amino extensión N-terminal
Leptina	+	Correcto (V)
TPA	++++	S+ SPS
TPASP	++	30% SP
TPA(SNS)	+++	96%
Leptina (SPS)	++++	S
Leptina (SP)	+++	No determinado
Leptina/tPA	+++	S

Como se puede observar, las leptinas más altamente glicosiladas con el máximo rendimiento de aminoácido N-terminal correcto se produjeron utilizando el péptido señal de tPA(SNS). Leptina(SNS) también estaba altamente glicosilada, y producía una leptina que tenía un aminoácido N-terminal de serina (por ejemplo, serina en la posición -1 de (SEQ.. ID Nº: 1 en un aleptina glicosilada con una secuencia de aminoácidos modificada de SEQ.. ID Nº: 1).

Ejemplos de referencia

Los siguientes ejemplos de referencia proporcionan métodos que se utilizaron en los Ejemplos de Trabajo anteriores.

Preparación de ADNs, Vectores y Células Huésped

1. Construcción del vector de expresión de la Leptina Humana (1-146). Estos métodos dan como resultado un vector de expresión para rHu-leptina 1-146 (SEQ.. ID Nº: 1) en células de mamíferos. El ADN que codifica rHu-leptina 1-146, incluido su péptido señal, también se utilizó como un molde para preparar proteínas leptina glicosiladas de la presente invención.

Un ADN que codifica los aminoácidos 1-146 de rHu-leptina más una secuencia señal, tal como en Zhang et al., Nature 372: 452-432 (1994) en la pág. 430, Figura 6b, incorporado en esta memoria como referencia en su totalidad, se clonó a partir de ADNc de adiposa humano mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR - siglas en inglés). La secuencia señal clonada codificaba la siguiente secuencia de aminoácidos:

MHWGTLCGFL

\hskip0,3cm

WLWPYLFYVQ

\hskip0,3cm

A

Cebadores. El cebador flanqueante 5' (conductor) codificaba el extremo amino del péptido señal de rHu-leptina, un sitio de enzima de restricción XbaI, y una secuencia Kozak optimizada (TCT ATC TAG ACC ACC ATG CAT TGG GGA ACC CTG T). La secuencia del cebador flanqueante 3' (retardado) (GAG AGT CGA CTA TCA GCA CCC AGG GCT GA) contenía el complemento del extremo carboxilo de rHu-leptina (1-146) y codones de terminación, así como un sitio de restricción SalI.

Preparación del Vector. El producto de amplificación por PCR se digerió con enzimas de restricción XbaI y SalI, se sometió a electroforesis en un gel de agarosa y luego se aisló a partir del gel utilizando el proceso kit Promega® Wizard® (Promega® Corporation; Madison, WI). El producto purificado se ligó al vector de expresión pDSR\alpha2 cortado con XbaI y SalI, modificado ligeramente del descrito en el documento WO 90/14363 1990, por ejemplo en la Figura 12, incorporado en esta memoria como referencia en su totalidad. El pDSR\alpha2 utilizado en esta memoria conservaba los mismo elementos funcionales, pero estaba ligeramente modificado con relación al recogido en el documento WO 90/14363. La secuencia en el sitio Hind III se modificó en AAGCTTCTAGA para generar un sitio XbaI, y la secuencia del sitio NcoI se modificó en GTCGACCTAGG para generar un sitio SalI, con suficiente secuencia de ADN ("ADN de embutidora" - "stuffer DNA") entre los dos sitios para permitir un corte eficaz por parte tanto de XbaI como de SalI para producir el plásmido cortado para la clonación direccional de la presente construcción de expresión de la proteína leptina. El plásmido pDSR\alpha2/leptina resultante se utilizó para la expresión de células de mamífero, tal como figura más abajo, y como un molde para la mutagénesis dirigida al sitio in vitro.

2. Construcción de los Sitios de Glicosilación en Leptina mediante mutagénesis dirigida al sitio. Se introdujeron sitios de glicosilación en la secuencia de rHu-leptina 1-146 (SEQ. ID Nº: 1, antes) mediante mutagénesis dirigida al sitio, utilizando métodos de PCR por extensión por solapamiento similares a los descritos por Ho et al., Gene vol. 77, págs. 51-59 (1989). El plásmido pDSR\alpha2/leptina, preparado como antes, se utilizó como un molde de PCR para las etapas iniciales de la mutagénesis dirigida al sitio.

PCR. Los procesos de PCR se realizaron en dos etapas sucesivas.

Etapa 1: se realizaron dos reacciones (PCR1 y PCR2) en ADN del molde de leptina utilizando un total de cuatro oligonucleótidos: el cebador de rHu-leptina flanqueante 5' (conductor), un cebador mutáneo retardado, un cebador mutágeno conductor (complementario, al menos en parte, al cebador mutágeno retardado) y el cebador de rHu-leptina flanqueante 3' (retardado). Los cebadores mutágenos contenían los cambios de nucleótidos deseados, así como 6-20 nucleótidos que coincidían exactamente con el molde en cada lado de los cambios. PCR1 utilizaba el cebador flanqueante 5' (conductor) y el cebador mutágeno retardado. PCR2 utilizaba el cebador flanqueante 3' (retardado) y el cebador mutágeno conductor. Los productos de ADN de PCR1 y PCR2 contenían secuencias solapantes en y sobre los dos lados de las mutaciones. Los fragmentos de ADN amplificados se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Del gel se escindieron pequeños trozos de fragmentos de ADN del tamaño correcto que contenían agarosa.

Etapa 2: los fragmentos de ADN procedentes de PCR1 y PCR2 se reunieron entre sí y se realizó una tercera reacción PCR utilizando solamente los cebadores flanqueantes 5' (conductor) y 3' (retardado). La reasociación de las regiones complementarias 3'-terminales de las hebras apropiadas de los productos de PCR1 y PCR2 y el subsiguiente alargamiento de las hebras dio como resultado la formación de fragmentos de ADN de leptina de longitud completa. Así, se amplificó un segmento de ADN de longitud completa que contenía las mutaciones deseadas.

PCR para la expresión en células COS y CHO. Para la expresión en la línea de células de riñón embrionario humano 293 (tal como la comercialmente disponible de American Type Culture Collection), el cebador 5' (conductor) contenía secuencias que introducían un codón de parada, un sitio KpnI y una secuencia Kozak (ACCACC) delante de la región codificadora del péptido señal de leptina (5'-TCTGGTACCTAGACCACCATGCATTGGGGAACCCTGT-3'). El cebador 3' (retardado) (5'-GAAGCGGCCGCCTATCAGCACCCAGGGCTGA-3') contenía secuencias que introducían dos codones de parada (TGA TAG) y un sitio de restricción NotI en el extremo de la región codificadora de la proteína leptina glicosilada. Para la expresión en células COS y CHO, el cebador 3' (retardado) contenía secuencias que introducían un codón de parada, seguido de un sitio de restricción SalI (GAGAGTCGACTATCAGCACCCAGGGCT
GA). El cebador de la reacción 5' retardado (TCTATCTAGACCACCATGCATTGGGGAACCCTGT) tenía un sitio de restricción XbaI seguido de una secuencia dispuesta más arriba del codón iniciador de leptina (ATG).

Métodos PCR. Se realizaron reacciones en cadena de la polimerasa utilizando indistintamente uno de dos procesos.

En un método, utilizado en alguna de las construcciones para la expresión de 293, se realizaron reacciones PCR utilizando un protocolo adaptado de Cheng et al., PNAS 91: 5695 (1994) (incorporado en esta memoria como referencia en su totalidad): 4 \mul de cada uno de los cebadores conductor y retardado (5 pm/\mul), 1 \mul de molde (50 ng), 10 \mul de tampón 5X LP (tricina 100 mM, pH 8,7/glicerol al 25%/KOAc 425 mM), 2 \mul de material de dNTP (1 mM de en cada caso dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 0,8 \mul de rtTh-olimerasa (Perkin Elmer® ; 2,5 U/\mul) y 2 ml de Vent-polimerasa (NEB; 0,01 U/\mul después de dilución reciente en la relación 1:100 en tampón 1X LP). Se añadió H_{2}O para completar el volumen final hasta 50 \mul. Todos los componentes se añadieron juntos en el orden mostrado, y la PCR se inició cuando la temperatura durante el primer ciclo se encontraba por encima de 60ºC al añadir 1 \mul de MgOAc 10 mM. Las condiciones de la reacción eran: 2 ciclos de 94ºC, 10 s/45ºC, 1 min/68ºC, 5 min, seguidos de 25 ciclos de 94ºC, 10 s/55ºC, 1 min/68ºC, 5 min. Los fragmentos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y el fragmento de ADN de tamaño correcto se purificó utilizando un kit Geneclean™ y los procesos suministrados por el fabricante (Bio 101, Inc.) incorporados en esta memoria como referencia. El ADN purificado se digerió con NotI y KpnI y luego se purificó de nuevo utilizando el kit Geneclean™. Las condiciones de digestión eran 20 unidades de KpnI en tampón "M" (volumen final de 22 \mul) (Boehringer Mannheim), seguido de la adición de 3 \mul de tampón "H", 20 unidades de NotI en un volumen final de 52 \mul. después, el fragmento se ligó en el plásmido pBCB cortado con KpnI y NotI. El plásmido pBCB se derivó de pRC/CMV (Invitrogen®, Carlsbad, California) mediante supresión de la región de pRC/CMV que comprende el origen f1, el origen SV40, el gen de resistencia a neomicina y el sitio de poliadenilación SV40. El ADN ligado se precipitó con 2 volúmenes de etanol en NaOAc 0,3M, pH 5,2, en presencia de ARNt soporte y se transformó en E. coli. Los ADNs de la proteína leptina glicosilada se rastrearon inicialmente mediante PCR de colonias para identificar clones que contenían el inserto de ADN de tamaño y tipo correctos. Con este proceso, células que contenían plásmidos se dispusieron en tubos para PCR en presencia de cebadores conductor y retardado de leptina. Después, la mezcla se sometió a PCR utilizando las condiciones de reacción descritas anteriormente. Luego se prepararon plásmidos a partir de clones positivos, y el inserto de proteína leptina glicosilada se secuenció para confirmar la presencia de los sitios de glicosilación deseados y para asegurar que no se introdujeran cambios adicionales en los aminoácidos.

Se utilizó una estrategia de PCR ligeramente diferente en el resto de las construcciones. La PCR se realizó utilizando Taq ADN polimerasa (Boehringer Mannheim) o, preferiblemente, la ADN polimerasa de corrección de lectura Pfu polimerasa (Stratagene) que, a diferencia de la Taq polimerasa, no tiende a añadir un nucleótido sin molde extra en el extremo 3' de las cadenas extendidas. En las PCRs con Taq polimerasa, el molde de ADN se combinó con 2,5 \mul de tampón 10X Taq PCR, 2,5 \mul de dNTPs 1 mM, 5 pmol de cada cebador y agua en un volumen final de 25 \mul, después de que la mezcla de PCR alcanzara 94ºC, se añadieron 0,5 unidades de Taq polimerasa. Después, las reacciones PCR se llevaron a cabo durante 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, a 60ºC durante 30 segundos y a 72ºC durante 30 segundos. En las PCRs con Pfu polimerasa, el molde ADN se combinó con 5 \mul de tampón 10XPfu (Stratagene), 5 \mul de dNTPs 1 mM, 10 pmol de cada cebador y agua en un volumen final de 50 \mul y se añadieron 1,2 U de Pfu polimerasa. Se realizaron cuatro ciclos de PCR con una temperatura de reasociación de 48ºC, seguidos de 20 ciclos con una temperatura de reasociación de 66ºC. En cada ciclo se realizó una desnaturalización durante 30 s a 94ºC, la reasociación se realizó durante 30 s y el alargamiento fue a 74ºC durante 30 s. Después de las dos reacciones PCR de la primera etapa descrita anteriormente, bandas de producto de los tamaños correctos se escindieron en un gel de agarosa después de la electroforesis, y las rodajas de gel que contenían los productos de PCR1 y PCR2 se añadieron directamente a un tubo para PCR para la segunda etapa de PCR, o primero se combinaron en un tubo con 300 \mul de agua y se hirvieron para fundir la agarosa antes de añadirla al tubo para PCR. Las PCRs se realizaron con Taq o Pfu polimerasa según se describe anteriormente, utilizando los cebadores flanqueantes conductor y retardado. Después del ciclo final de PCR, se dejó que los tubos se incubaran durante 5 minutos extra a la temperatura de alargamiento. Los productos de PCR resultantes para cada análogo se eliminaron utilizando el kit Promega® Wizard® Cleanup. El ADN purificado se digerió en una digestión por restricción de 50 \mul con enzimas de restruicción XbaI y SalI (Boehringer Mannheim) a 37ºC durante 1 hora. Las digestiones se limpiaron mediante el kit Promega® Wizard® Cleanup. Después, el fragmento digerido se ligó en vector pDSR\alpha2 digerido con XbaI y SalI. Se utilizó una parte alícuota de 1 \mul de la reacción de ligamiento, que contenía el plásmido análogo de leptina pDSR\alpha2, para transformar células DH10B mediante electroporación. Una colonia sencilla para cada análogo se desarrolló durante una noche en cultivo líquido y el plásmido se aisló utilizando el kit de aislamiento de plásmidos Qiagen® Maxi DNA®. El ADN para cada análogo de leptina humana pDSR\alpha2 se resuspendió en agua y se secuenció para asegurar que estuviera presente la secuencia correcta.

Sitios de glicosilación múltiple. Dos o más mutaciones en el sitio de glicosilación se combinaron al introducir una nueva sustitución en el ADN que ya contenía un cambio, utilizando el mismo proceso de PCR. Para construir genes análogos a leptina de doble sitio de glicosilación, se utilizaron plásmidos de leptina glicosilada en un solo sitio (producidos como se describe anteriormente) como moldes de PCR y se introdujo un sitio de glicosilación adicional mediante mutagénesis dirigida al sitio con los cebadores apropiados. De manera similar, se contruyeron plásmidos que codificaban análogos de leptina con tres sitios de glicosilación utilizando ADNs de leptina de dos sitios de N-glicosilación como molde,y el proceso se podría repetir para la introducción de sitios de glicosilación adicionales. Alternativamente, se pueden producir nuevas combinaciones de las mutaciones del sitio de glicosilación utilizando dos moldes de ADN diferentes, que contenía sitios de glicosilación diferentes, en PCR1 y PCR2. Por ejemplo, un ADN que codifica un análogo con sitios de glicosilación en las posiciones 2, 47, 69 y 102 podría producirse mediante el par de cebadores mutágenos para la posición 47 de glicosilación, utilizando un molde de ADN con un sitio de glicosilación en la posición 2 en PCR1 y un ADN con sitios de glicosilación en las posiciones 69 y 102 en PCR2.

Estos procesos generales se utilizaron para construir plásmidos para la expresión de las proteínas leptina glicosiladas mostradas en los Ejemplos anteriores. Se muestran los cambios en la secuencia de ADN para cada una de las formas.

Péptidos señal quiméricos. Construcciones para la expresión de leptina o un análogo de leptina con un péptido señal de no leptina se prepararon mediante métodos de PCR de extensión por solapamiento para el corte y empalme de los genes (Horton et al., Gene 77: 61-68 (1989)), similares a los utilizados para la mutagénesis dirigida al sitio. En una etapa preliminar, un ADN que codifica el péptido señal del gen exógeno, por ejemplo el activador del plasminógeno tisular (tPA) se obtuvo mediante métodos de clonación o mediante una combinación de síntesis de genes química y enzimática. Este ADN se utilizó como molde en una PCR para generar un fragmento de ADN que codifica el péptido señal exógeno, precedido de una secuencia Kozak consenso y seguido inmediatamente por la primera parte de la región codificadora de rHu-leptina (o análogo de leptina) madura. Los cebadores utilizados en esta reacción PCR eran un cebador flanqueante 5' (conductor) para el gen exógeno y un cebador retardado, cuya parte 5' (10-25 nucleótidos) era complementaria a la secuencia que codifica la parte amino-terminal de la leptina (o análogo de leptina) madura. Se realizó una segunda reacción PCR con ADN de leptina o análogo de leptina como molde, utilizando el cebador flanqueante 3' (retardado) de leptina y un cebador primario que codifica la región de la unión del péptido señal exógeno y la secuencia de la leptina ( o análogo de leptina) madura. El cebador conductor en esta reacción se diseñó para que solapara el ADN generado por la primera PCR, habitualmente a lo largo de una longitud de 15-35 nucleótidos. Los productos de las dos reacciones PCR se purificaron en gel según se describe antes, se mezclaron y se reasociaron y amplificaron en una PCR con sólo el cebador flanqueante 5' (conductor) del gen exógeno y el cebador flanqueante 3' (retardado) de leptina.

Células huésped

1. Expresión de Proteínas Leptina Glicosiladas en células 293. El ADN se transfectó en la línea de células de riñón embrionario humana, "293", (tal como la comercialmente disponible de American Type Culture Collection) utilizando el método de lipofectamina. Células 293 se desarrollaron hasta una confluencia del 40-70% en placas de cultivo de tejidos (P100) en medio 293 (DMEM (Difco®)/HEPES 20 mM/1X Pen-Strep-Glutamine/FBS al 20%). 20 \mug de ADN del plásmido que codifica la proteína leptina glicosilada en 1 ml de DMEM se esterilizaron en un filtro con una membrana Acrodisc® de 0,45 \mum (Gelman Sciences). Se añadieron 100 \mul de lipofectamina (Gibco®/BRL®), y la mezcla de ADN-lipofectamina se incubó durante 20 minutos a TA. Se separó el medio de las placas que contenían células 293 y se añadieron 4 ml de DMEM y la solución de ADN/lipofectamina. Al cabo de 4-6 horas a 37ºC, se añadieron 5 ml de DMEM con suero de bovino fetal al 20%, y los cultivos se incubaron durante una noche. Al día siguiente, las células se aclararon con medio 293 y se añadieron 5 ml de medio 293 reciente. El medio acondicionado se recogió al cabo de 3 días, se repartió en partes alícuotas y se almacenó a -70ºC.

2. Expresión de proteínas leptina glicosiladas en células COS. Clones de ADNc de proteínas leptina glicosiladas se transfirieron a células COS-1 (ATCC Nº CRL-1650) mediante electroporación. Las células COS-1 se recolectaron a partir de placas semi-confluentes, se lavaron con medio (DMEM que contenía suero de bovino fetal al 10% y L-glutamina/penicilina/estreptomicina al 1% (Irvine Scientific)) y se resuspendieron a razón de 6 x 10^{6} células/ml. Medio ml de células se transfirió a una cubeta de electroporación de 0,2 cm (Bio-Rad®) y se electroporizó con un Electroporation System Electrocell Manipulator 600® de BTX a 650 uF y 130 voltios en la regulación a bajo voltaje con 25 \mug de ADN de plásmido que codifica la proteína leptina glicosilada. Las células electroporizadas se dispusieron en placas de cultivo tisular de 100 mm en 7 ml de medio. El medio acondicionado se recogió 3 días después de la elec-
troporación, se filtró utilizando una membrana Acrodisc® de 0,45 \mum (Gelman Sciences) y se almacenó a menos 80ºC.

3. Expresión de proteína leptina glicosilada en células CHO. La expresión estable de rHu-leptina 1-146 o proteína leptina glicosilada se realizó mediante transformación de células de ovario de hámster chino (CHO - siglas en inglés) deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR^{-}) con pDSR\alpha2 con el ADN de la proteína leptina glicosilada seleccionado como antes, seguido del aislamiento y del ensayo de clones individuales. Una placa de cultivo tisular de 60 mm se sembró con 1 x 10 ^{6} células CHO DHFR^{-} desarrolladas en medio CHO D^{-} (DMEM - alto contenido en glucosa, suero de bovino fetal al 10%, penicilina/estreptomicina/glutamina al 1%, aminoácidos no esenciales al 1% (Gibco® y suplemento HT al 1% (Gibco®)) el día antes de la transfección. Después se formó un precipatado de 10 \mug de ADN y se añadió a las placas gota a gota de acuerdo con las instrucciones del Mammalian Cell Transfection Kit (kit de transfección de células de mamífero) (Specialty Media, incorporado en esta memoria como referencia). Después de 24 horas en una incubadora de cultivo tisular, el medio se reemplazó por medio CHO D^{-} reciente. Veinticuatro horas más tarde, las células se separaron en seis placas de cultivo de 100 mm con medio seleccionado de CHO (D-MEM con alto contenido en glucosa, suero de bovino fetal dializado al 10%, penicilina/estreptomicina/glutamina al 1%, aminoácidos no esenciales al 1% (Gibco®)). El medio se cambió semanalmente hasta que aparecieron las colonias. Al cabo de 10-14 días, las colonias se recogieron utilizando discos de clonación de 5 mm (Labcore®) empapados en 1X tripina-EDTA (Life Technologies®) y se cultivaron en placas de cultivo de tejido de 24 pocillos con medio seleccionado de CHO. Después de 1-2 semanas, se determinó la expresión de proteína leptina glicosilada utilizando un ensayo EIA de leptina descrito más abajo). Los clones que mejor se expresaban (es decir, aquellos que demostraban la respuesta más intensa utilizando el EIA) se expandieron y congelaron en almacenamiento criógeno.

En algunas circunstancias, se utilizó un protocolo más rápido para expresar análogos en células CHO. En este caso, se utilizó la electroporación para transfectar células y no se aislaron clones individuales. Los experimentos de electroporación utilizaban 200 \mug de pDSR\alpha2 con el inserto de proteína leptina glicosilada según se describe antes, y 200 \mug de ADN portador de esperma de arenque. Los ADNs se extrajeron con fenol-cloroformo y se precipitaron en etanol, luego se resuspendieron en 800 \mul de 1 x HEBS junto con 2 x 10^{7} células de ovario de hámster chino (CHO) DHFR^{-} desarrolladas en medio CHO D^{-}. Las células y el ADN se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. La electroporación se llevó a cabo a 290 voltios y 960 ufaradios utilizando un BIO RAD Gene Pulser™ en cubetas de electroporación de 0,4 cm. Después, las células se incubaron durante 10 minutos a la temperatura ambiente, se lavaron con 10 ml de medio CHO D^{-}, se centrifugaron durante 10 minutos a 1000 rpm en una centrífuga Damon®/IEC Division IEC HN-SII, luego se resuspendieron en 20 ml de medio CHO D^{-} y se añadieron a dos placas de 10 centímetros. Las células se desarrollaron durante 2 días a 37ºC, luego se separaron en la relación 1:4 en medios de selección de CHO y se desarrollaron hasta una confluencia de \approx 70%. Después, las células se separaron en la relación 1:2 en medios de selección más 6 nM de metotrexato y se desarrollaron a 37ºC hasta que los clones eran visibles (aproximadamente 2 semanas). Se generaron agrupaciones a partir de placas que contenían al menos 4 colonias y se desarrollaron en medios de selección con 6 nM de metotrexato hasta la confluencia (aproximadamente 1 semana). A continuación, las agrupaciones se congelaron en almacenamiento criógeno.

Expresión y purificación de leptina N48 T50 (proteína leptina de un solo sitio de glicosilación)

Células CHO se transformaron con ADN que expresa leptina N48 T50 según se describe antes. Las células se expandieron en cultivo celular con agitación centrífuga en medio de crecimiento (DMEM/F12 (1:1), 365 mg/l de L-glutamina, 1X MEM aminoácidos no esenciales, FBS al 5%). Frascos cilíndricos con tapones transpirables se inocularon luego con 2e7 células/frasco en 400 ml de medio de desarrollo y se gasificaron durante 10 segundos con CO_{2} al 10% en aire. Al cabo de 5 días, los frascos se cambiaron a medio de producción exento de suero (400 ml/frasco, DMEM/F12 (1:1) 365 mg/l (1X) L-glutamina, 1X MEM aminoácidos no esenciales, 10 \muM de CuSO_{4}, 1,5 g/l de glucosa adicional). Se recogió medio acondicionado exento de suero a partir de tres recolecciones sucesivas (180 litros) y se filtró a través de un filtro de 0,45 \mum, se concentró aproximadamente 30 veces y se diafiltró en CHAPS 1 mM, Tris 10 mM, pH 7,5 utilizando un sistema de ultrafiltración de flujo tangencial (Amicon®) con una membrana de corte de peso molecular 10.000. Los medios diafiltrados se almacenaron a -20ºC.

Se realizaron las siguientes etapas a 2 hasta 8ºC. DFM se aplicó a una columna Q-Sepharose Fast Flow (Pharma-
cia®, 8 cm x 14 cm) equilibrada en Tris 10 mM, pH 7,9 y se lavó con aproximadamente 2 volúmenes de columna de Tris 10 mM para eluir todas las especies de no unión. Leptina N48 T50, que permanece unida a la columna, se eluyó luego mediante un gradiente de volumen de columna doce desde Tris 10 mM, pH 7,9 hasta NaCl 200 mM, Tris 10 mM, pH 7,9, recogida en fracciones. Las fracciones que contenían leptina N48 T50 totalmente glicosilada, según se determina mediante el análisis del borrón Western, se reunieron, y luego se diluyeron con un volumen de agua para reducir la concentración de cloruro de sodio. Después, la muestra se aplicó a una columna Bio-Gel® HT (Bio-Rad®, 10 cm x 7 cm) equilibrada en Tris 10 mM, pH 7,9, luego se lavó con aproximadamente cuatro volúmenes de columna de Tris 10 mM, pH 7,9. Las fracciones de las especies de no unión se recogieron y las que contenían leptina N48 T50, según se determina mediante el análisis de transferencia Western, se combinaron.

Un tercio de volumen de (NH_{4})_{2}SO_{4} 3M, Tris 10 mM, pH 7,9 se añadió a la agrupación de leptina N48 T50 de la columna Bio-Gel® HT. La agrupación, ahora en (NH_{4})_{2}SO_{4} 1 M, se aplicó a una columna Source 15 PHE (Pharmacia®, 10 cm x 1,6 cm) equilibrada en (NH_{4})_{2}SO_{4} 1 M, Tris 10 mM, pH 7,9 y luego se lavó con aproximadamente dos volúmenes de columna de (NH_{4})_{2}SO_{4} 1 M, Tris 10 mM, pH 7,9. F3 que permanece unida a la columna, se eluyó luego mediante un gradiente de volumen de columna 40 de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1M, Tris 10 mM, pH 7,9 a Tris 10 mM, pH 7,9, recogida en fracciones. Las fracciones que contenían F3, según se determina mediante análisis SDS-PAGE se combinaron.

Sulfato de amonio sólido se añadió a la agrupación de leptina N48 T50 procedente de la columna Source 15PHE hasta una concentración final de aproximadamente 2,5 M y se incubó durante una noche. El precipitado de la noche se recogió mediante centrifugación.

El precipitado de sulfato de amonio recolectado se resolubilizó en agua, se tituló hasta pH 4,5 con ácido acético, se aplicó a una columna Source 15S (Pharmacia®, 5,5 cm x 1,6 cm) equilibrada en NaCH_{2}COOH 10 mM, pH 4,5, y luego se lavó con aproximadamente dos volúmenes de columna de NaCH_{2}COOH, pH 4,5. Leptina N48 T50, que permanece unida a la columna se eluyó luego mediante un gradiente de volumen de columna 72 de NaCl 150 mM, NaCH_{2}COOH 10 mM, pH 4,5 a NaCl 150 mM, NaCH_{2}COOH 10 mM, pH 4,5 recogido en fracciones. Las fracciones que contenían leptina N48 T50, según se determina mediante análisis SDS-PAGE, se combinaron y titularon hasta pH 7,5.

La agrupación de leptina N48 T50 procedente de la columna Source 15S se concentró hasta aproximadamente 1 mg/ml, se diafiltró en PBS de Dulbecco (Gibco®), y luego se concentró hasta aproximadamente 5 mg/ml utilizando un sistema de ultrafiltración de células agitado (Amicon®) con una membrana de corte de peso molecular de 10.000 (Filtron®). La leptina N48 T50 se concentró adicionalmente hasta 10 mg/ml utilizando ultrafiltración centrífuga (Centricon 10, Amicon®). La leptina N48 T50 concentrada se filtró (0,22 \mum) y se almacenó a 2 hasta 8ºC.

II. Métodos analíticos

Se utilizaron los siguientes métodos analíticos descritos en esta memoria para caracterizar las presentes proteínas leptina glicosiladas.

A. Ensayos in vitro

1. Ensayo de unión al receptor. En este ensayo, se utilizó un receptor de leptina unido a membrana como diana para medir la cantidad de unión mediante leptinas glicosiladas de ensayo marcadas radiactivamente.

Células de ovario de hámster chino ("CHO") se trataron para expresar establemente un receptor de leptina humana, transfectándolas con ADN del receptor de leptina humana (forma corta; Tartaglia et al., Cell 83: 1271 y siguientes (1995), incorporado en esta memoria como referencia en su totalidad; el artículo completo se incorpora en esta memoria como referencia). Las células que expresan el receptor de leptina se desarrollaron y recogieron mediante centrifugación a baja velocidad. Las células sedimentadas (aproximadamente 50 mg de peso húmedo) se resuspendieron en sacarosa 0,32 M/HEPES 25 mM y se homogeneizaron en tubos homogeneizadores de vidrio utilizando un motor Glas-col®. Las membranas de las células se lavaron dos veces mediante centrifugación (48.000 x g), dispersión utilizando un homogeneizador politron (Tissue Tearor®) y resuspensión en tampón de unión frío (MEM, Gibco, BRL®/HEPES 25 mM, Gibco BRL®/BSA al 0,1%/0,5 mg/ml de Bacitracin® (Sigma®/0,1 mg/ml de STI, Boehringer Mannheim/0,1 mg/ml de AEBSF, Boehringer Mannheim). Después del segundo lavado, la preparación de membranas se resuspendió a una concentración final de 2-3 mg de peso húmedo/ml en tampón de unión frío.

La unión competitiva se realizó incubando 400 \mul de solución de membrana, 50 \mul de ^{125}I-leptina 2 nM (Amersham) y 50 \mul de muestra o patrón de leptina rHu-leptina 1-146 10^{-6} M) durante 2-3 horas a temperatura ambiente en tubos de 12 mm x 75 mm. La ^{125}I-leptina unida se separó de ^{125}I-leptina no unida mediante filtración a través de filtros de fibra de vidrio y 3 lavados con PBS frío utilizando un recolector de células Brandel. La radioactividad ligada se determinó con un contador gamma. La afinidad de cada análogo por el receptor de leptina se determinó mediante el cálculo del punto medio de la curva de desplazamiento en frío (CI50) para cada análogo.

2. Actividad biológica in vitro . En este ensayo se determinó la actividad biológica in vitro utilizando un receptor de leptina quimérico, con un dominio extracelular de un receptor de leptina, dominios de transmembrana e intracelular de un receptor de eritropoyetina. Tras la activación del dominio del receptor de eritropoyetina intracelular mediante la unión al dominio de leptina extracelular, las células exhibían una actividad biológica de proliferación, medida por la absorción de H^{3}-timidina.

Células progenitoras de mieloide murínico 32D (clon 3), interleucina-3 (IL-3) dependientes (Greenberger et al., PNAS-USA 80: 2931 (1983) incorporados en esta memoria como referencia) se desarrollaron en RPMI 1640 (Gibco®) suplementado con suero de bovino fetal al 10% y 10 ng/ml de IL-3 (Biosource®). Se construyó un receptor de leptina quimérico-receptor EPO (OBR-EPOR) mediante técnicas convencionales y se subclonó en un vector de expresión que contenía el promotor de la transcripción del virus de sarcoma murínico Moloney, resultando en el vector OBR-EPOR/pLJ. El receptor quimérico contenía las regiones codificantes para el dominio extracelular de un receptor de leptina humana (aminoácidos 1-839; Tartaglia et al., Cell: 83: 1271 (1996) (incorporado en esta memoria como referencia en su totalidad) y dominios de transmembrana e intracelular de receptor de eritropoyetina murínica (aminoácidos 250-507; D'Andrea et al., 57: 277 (1989) incorporado en esta memoria como referencia en su totalidad. Después, el receptor quimérico se transfectó a células 32D mediante electroporación. Las células transfectadas se seleccionaron inicialmente sobre G418 (750 \mug/ml). Después, las células que responden a leptina se seleccionaron en RPMI 1640 (Gibco®) suplementado con suero de bovino fetal al 10% y 25 ng/ml de Hu-leptina, dando como resultado células 32D-OBECA. Las células 32D que no se transfectaron con el receptor quimérico permanecieron sin respuesta a la leptina.

Las células 32D-OBECA se desarrollaron en medio 1640 RPMI (1x líquido, sin L-glutamina, Gibco®) que contenía suero de bovino fetal al 10% (Hyclone Laboratories®) y 1,0 ng/ml de IL-3 murínica recombinante (Biosource®) hasta una densidad de aproximadamente 5,0U+05 células/ml. Las células se recogieron mediante centrifugación (aproximadamente 270 X G), se lavaron dos veces en 1X PBS estéril (Gibco®) y luego se resuspendieron hasta 1,0U+05 células/ml en un medio que consistía en medio DMEM al 20% (DMEM+FBS al 10%) más medio de ensayo al 80% (RPMI + FBS al 2%) más 10 ng/ml de anticuerpo anti-TGF\beta neutralizante pan-específico. Se preparó una curva patrón de rmetHu-leptina 1-146 de doce puntos extendida utilizando un medio de ensayo en un intervalo de aproximadamente 0,1 a 200 ng/ml. Las muestras de ensayo se diluyeron en medio de ensayo y se operaron típicamente como curvas de múltiples puntos extendidas o a intervalos que caen dentro del intervalo lineal de una curva patrón. Un volumen de 100 \mul de una muestra se añadió a pocillos apropiados de placas de cultivo tisular de microtitulación de 96 pocillos. Las células con muestra o patrón se desarrollaron a razón de 10.000 células por pocillo (en 100 \mul) durante aproximadamente 48 horas a 5\pm1% de CO_{2} y 37\pm2ºC con una incubadora de alta humedad. Después se añadió ^{3}H-timidina (0,5 \muCi por pocillo Dupont®), y las placas se incubaron durante 18 horas adicionales y su ADN se recolectó sobre esterillas de filtro de fibra de vidrio pre-impresas (Pharmacia®) utilizando un recolector de células (Tomtek 96 Mach II®). Los filtros se secaron en un horno microondas, se guardaron en bolsas de muestra LBK® más 10 ml de fluido de centelleo (LKB®) y luego se recontaron en un contador de centelleo Betaplate® (LKB®). La respuesta de las células (en forma de fondo de CPMs medio) se representó frente a la masa (ng/pocillo) de un patrón de rHu-leptina 1-146. La bioactividad de la muestra de rmetHu-leptina o leptina glicosilada se determinó a partir del análisis de regresión de la curva patrón. La actividad específica se calculó dividiendo la actividad biológica ensayada (ng/ml) por la concentración según se determina mediante ELISA de leptina.

B. Caracterización de proteínas leptina glicosiladas 1. Inmunoensayo enzimático ("EIA")

Anticuerpos policlonales. Anticuerpos policlonales anti-rmetHu-leptina 1-146 (SEQ. ID Nº:1 con un residuo metionilo en la posición -1) se desarrollaron en conejos blancos de Nueva Zelanda mediante inyecciones subcutáneas repetidas de rmetHu-leptina 1-146 conjugada a hemocianina de lampa bocallave (KLH - siglas en inglés) y se mezclaron con el adyuvante Titermax™ o con adyuvante completo de Freund (inyección primaria) y adyuvante incompleto de Freund (inyecciones subsiguientes). Los sueros de conejo resultantes se sometieron a ensayo en cuanto a la reactividad con rmetHu-leptina 1-146, y los sueros procedentes de conejos con el título más elevado se agruparon y se purificaron por afinidad sobre Actigel ALD Superflow® (Sterogene nº 2701-S-01) acoplado a rmetHu-leptina. Una parte alícuota del anticuerpo policlonal purificado se acopló a peroxidasa de rábano picante (HRP, Sigma® P-8415) a utilizar como anticuerpo detector en el inmunoensayo enzimático de sándwich (EIA) o Western.

Anticuerpos monoclonales. Anticuerpos monoclonales anti-rmetHu-leptina 1-146 se desarrollaron a partir de ratas Lou a las que se inyectó múltiples veces rmetHu-leptina 1-146 conjugada con KLH, se mezcló con adyuvante completo de Freund (inyección primaria) o con adyuvante incompleto de Freund (inyecciones subsiguientes). Los sueros de las ratas se sometieron a ensayo en cuanto a la reactividad con rmetHu-leptina 1-146, y células del bazo procedentes de éstas con los títulos más elevados se fusionaron a la línea de mieloma de rata Y3Ag 1.2.3 por técnicas de hibridoma convencionales. Las células híbridas se extendieron en placas de 96 pocillos, se las dejó que formaran colonias, se analizaron en cuanto a la actividad anti-rmetHu-leptina 1-146 y se clonaron en células sencillas. El anticuerpo monoclonal a partir de un hibridoma de rata se utilizó como un componente del EIA de sándwich de leptina.

Ensayo de Sándwich. Placas de microtitulación (de 96 pocillos convencionales [Immulon®] o de semipocillos [Costar®]) se revistieron con 75 \mul ó 30 \mul, respectivamente, de anticuerpo policlonal (1,5 \mug/ml) o monoclonal (2,0 \mug/ml) en tampón carbonato/bicarbonato (NaHCO_{3} 0,029 M, Na_{2}CO_{3} 0,015 M, pH 9,6). Las placas se bloquearon (albúmina de suero bovino [BSA- siglas en inglés] al 1%, sacarosa al 5%) y las muestras, diluidas apropiadamente en BSA al 2% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) se añadieron, por duplicado, a los pocillos. A cada placa de microtitulación también se añadió, por triplicado, un conjunto de patrones de r-metHu-leptina, o patrones de leptina glicosilada, que cubren el intervalo de 90 a 4580 pg/ml. Las placas se incubaron a 4ºC durante 18 horas, se aspiraron y se lavaron tres veces con tampón de lavado (Tris 50 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 10 mM, Tween® 20 al 0,05%, pH 7,35 [TEN]) y se añadió anti-rmetHu-leptina 1-146 policlonal conjugada con RHP, \approx 70 ng/ml en BSA al 2% en PBS con Tween® 20 al 0,05%. Las placas se incubaron a la temperatura ambiente durante 3 horas, se lavaron cinco veces con TEN y se desarrollaron en color con sustrato TMB (tetrametil-bencidina) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Kirkegaard y Perry nº 50-76-00, Gaithersburg, MD 20879). La absorbancia se midió a 450 nm en un lector de microplacas. Las concentraciones de leptina se calcularon a partir de una curva patrón construida para cada placa, después de sustraer el color de fondo. La sensibilidad del ensayo era de aproximadamente 90 pg/ml; las variaciones inter- e intra-ensayo, calculadas a partir de los controles incluidos en cada microplaca, eran 7,5% y 5,4%, respectivamente.

2. Análisis de hidratos de carbono mediante transferencia Western

Generalmente, cuanto mayor sea el peso molecular de una proteína leptina glicosilada de la presente invención, tanto más intensamente estará glicosilada. Así, el presente análisis del tipo de borrón de Western se utilizó para determinar la cantidad de hidrato de carbono presente en las proteínas leptina glicosiladas expresadas.

Un volumen de sobrenadante que contenía aproximadamente 400-600 pg de proteína leptina glicosilada procedente de células COS o CHO, transfectadas con ADNc de proteína leptina glicosilada, según se describe antes, se mezcló con tampón de muestra SDS-PAGE 3X (Tris-HCl 0,1875 M pH 6,8, SDS al 6%, glicerol al 30%, 2-mercaptoetanol al 15%). Las muestras se analizaron mediante electroforesis en gel de Tris-glicina SDS- poliacrilamida con acrilamida al 14% (Novex ®) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa de 0,45 \mum (Novex®). La membrana de nitrocelulosa se lavó, se bloqueó con TBST (Tris 20 mM, NaCl 137 mM, Tween® 20 al 0,08%) que contenía FBS al 10% y BSA al 2% y se incubó con anti-rmetHu-leptina 1-146 policlonal HRP conjugada, según se preparó antes (140 ng/ml en TBST que contenía FBS al 5% y BSA al 1%) durante 3-5 horas. Después del lavado con TBST, cinco veces, cinco minutos cada vez, la membrana se desarrolló con reactivo ECL (Amersham®), de acuerdo con las directrices del fabricante. La membrana se expuso a una película X-Omat® AR (Kodak®) durante diez a sesenta segundos y se reveló como para una película de rayos X convencional. Las bandas de proteína específicas se visualizaron y los tamaños se estimaron a partir de sus posiciones con relación a los marcadores del peso molecular. Cuanto mayor era el tamaño, más resto hidrato de carbono estaba conectado a la proteína.

Tratamiento con N-glicanasa. El tratamiento con N-glicanasa separa el hidrato de carbono enlazado a N, lo que resulta en un aumento de la movilidad que es igual a la de leptina no glicosilada. El tratamiento de proteínas leptina glicosiladas con N-glicanasa dio como resultado un peso molecular similar a la leptina no glicosilada. Esto confirma que el tamaño incrementado de proteína leptina glicosilada se debe al hidrato de carbono enlazado a N.

Métodos. Medio acondicionado con células COS que contenía 400 pg de proteína leptina glicosilada (1-3 \mul) se mezcló con 10 \mul de SDS al 0,5%, y cada muestra se hirvió durante 3 minutos. Después, se añadieron 10,5 \mul de NaPO_{4} 0,5 M pH 8,6 + nonidet P40 al 7,5% con 3 \mul de 250 unidades/ml de N-glicanasa (Genzyme®). Cada muestra se incubó durante una noche a 37ºC y la reacción se detuvo mediante la adición de tampón de muestra SDS-PAGE y se sometió a análisis Western con SDS-PAGE según se describe antes. Estos resultados indican que la movilidad reducida sobre SDS-PAGE observada se debe a la adición de hidrato de carbono enlazado a N. El hecho de que se identificaran numerosas proteínas leptina glicosiladas indica que existen múltiples posiciones en la leptina que pueden soportar la adición de hidrato de carbono enlazado a N. Resultados similares se obtuvieron cuando los análogos se expresaron en células 293. De manera similar, cuando se trataron proteínas leptina con múltiples sitios de glicosilación con N-glicanasa, su movilidad también cambió a la de leptina no glicosilada, indicando que las diferencias de movilidad se deben a la presencia de hidrato de carbono enlazado a N.

Mientras que la invención se ha descrito en lo que se considera son sus realizaciones preferidas, no se ha de limitar a las realizaciones descritas, sino que, por el contrario, pretende cubrir diversas modificaciones y equivalentes incluidos dentro de las reivindicaciones anejas, alcance que ha de estar de acuerdo con la interpretación más amplia con el fin de que abarque todas las modificaciones y equivalentes de este tipo.

<110> AMGEN INC.

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<120> COMPOSICIONES DE LEPTINA GLICOSILADA Y MÉTODOS RELACIONADOS

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<130> A-549

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<140> 09/249.675

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<141> 12-02-1999

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<160> 36

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 146

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: rHu leptina 1 hasta 146

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<400> 1

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31

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<210> 2

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<211> 145

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: rHu leptina 1 hasta 145

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<400> 2

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<210> 3

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<211> 21

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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\sa{Met His Trp Gly Thr Leu Gys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu}

\sac{Phe Tyr Val Gln Ala}

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<210> 4

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<211> 22

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido señal de leptina humana modificada

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<400> 4

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\sa{Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu}

\sac{Phe Tyr Val Ser Pro Ser}

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<210> 5

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<211> 21

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido señal de leptina humana modificada

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<400> 5

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\sa{Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu}

\sac{Phe Tyr Val Ser Pro}

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<210> 6

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<211> 22

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido señal de leptina humana modificada

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<400> 6

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\sa{Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu}

\sac{Phe Tyr Val Ser Pro Ala}

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<210> 7

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<211> 22

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido señal de leptina humana modificada

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<400> 7

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\sa{Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu}

\sac{Phe Tyr Val Ser Asn Ser}

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<210> 8

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<211> 23

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400>8

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\sa{Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly}

\sac{Ala Val Phe Val Ser Pro Ser}

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<210> 9

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<211> 22

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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\sa{Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly}

\sac{Ala Val Phe Val Ser Pro}

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<210> 10

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<211> 23

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido señal de tPA modificada

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\sa{Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly}

\sac{Ala Val Phe Val Ser Asn Ser}

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<210> 11

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<211> 23

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido señal de tPA modificada

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<400> 11

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\sa{Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly}

\sac{Ala Val Phe Val Ser Pro Ala}

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<210> 12

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<211> 21

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido señal de leptina/tPA

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<400> 12

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\sa{Met His Trp Gly Thr Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly Ala Val}

\sac{Phe Val Ser Pro Ser}

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<210> 13

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptido señal de leptina/tPA

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<400> 13

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\sa{Met His Trp Gly Thr Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly Ala Val}

\sac{Phe Val Ser Pro}

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<210> 14

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<211> 63

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400>14

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33

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<210> 15

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<211> 66

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<212> ADN

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN de péptido señal de leptina humana modificada

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<210> 16

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35

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<210> 17

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<211> 66

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN de péptido señal de leptina humana modificada

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<400> 18

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<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN de péptido señal de tPA humano modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN de péptido señal de tPA humano modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN de péptido señal de leptina/tPA

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN de péptido señal de leptina/tPA

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgcattggg gaaccctgtg ctgtgtgctg ctgctgtgtg gagcagtctt cgtttcgccc

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 438

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN de leptina 2, 47, 69

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN de leptina 2, 47, 69

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 438

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN de leptina 2, 47, 69, 92

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN de leptina 2, 47, 69, 92

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 438

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN de leptina 2, 47, 69, 102

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN de leptina 2, 47, 69, 102

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

46

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 438

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN de leptina 47, 69, 102

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN de leptina 47, 69, 102

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 438

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN de leptina 2, 47, 69, 92, 102

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: proteína leptina 2, 47, 69, 92, 102

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 438

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ADN de leptina 47, 69, 92, 102

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: proteína leptina 47, 69, 92, 102

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

53

54

Claims (35)

1. Una proteína leptina glicosilada que comprende SEQ. ID Nº: 1 que tiene una o más alteraciones en la secuencia como un sitio de glicosilación, seleccionada entre (en que "T/S" significa treonina o serina):

(a) 01V\rightarrowN 02P\rightarrowS (en que X es cualquier aminoácido excepto prolina) 03I\rightarrowT/S

(b) 02P\rightarrowN 03I 04Q\rightarrowT/S

(c) 23D\rightarrowN 24I 25S\rightarrowT/S

(d) 47P\rightarrowN 48I 49L\rightarrowT/S

(e) 48I\rightarrowN 49L 50T/S

(f) 69P\rightarrowN 70S 71R\rightarrowT/S

(g) 92F\rightarrowN 93S 94K\rightarrowT/S

(h) 101A\rightarrowN 102S 103G\rightarrowT/S

(i) 102S\rightarrowN 103G 104L\rightarrowT/S

(j) 103G\rightarrowN 104L 105E\rightarrowT/S.

2. Una proteína leptina glicosilada que comprende los aminoácidos 1-146 de SEQ. ID Nº: 1, que tiene dos sitios de glicosilación, seleccionándose dichos dos sitios entre (con respecto a la numeración de SEQ. ID Nº:1):

47 + 69;

48 + 69;

69 + 101;

69 + 102;

69 + 103;

69 + 118; y

100 + 102.

3. Una proteína leptina glicosilada que comprende los aminoácidos 1-46 de SEQ. ID Nº: 1, que tiene tres sitios de glicosilación, seleccionándose dichos tres sitios de entre (con respecto a la numeración de SEQ. ID Nº: 1):

2 + 47 + 69

23 + 47 + 69;

47 + 69 + 100;

47 + 69 + 102;

48 + 69 + 118;

69 + 102 + 118; y

69 + 103 + 118.

4. Una proteína leptina glicosilada que comprende los aminoácidos 1-146 de SEQ. ID Nº: 1, que tiene cuatro sitios de glicosilación, seleccionándose dichos cuatro sitios de entre (con respecto a la numeración de SEQ. ID Nº: 1):

2 + 47 + 69 + 92;

2 + 47 + 69 + 102;

23 + 47 + 69 + 92;

23+ 47 + 69 + 102; y

47 + 69 + 100 + 102.

5. Una proteína leptina glicosilada que comprende los aminoácidos 1-146 de SEQ. ID Nº: 1, que tiene cinco sitios de glicosilación, seleccionándose dichos cinco sitios de entre (con respecto a la numeración de SEQ. ID Nº: 1):

2 + 23 + 47 + 69 + 92

2 + 47 + 69 + 92 + 102;

23 + 47 + 69 + 92 + 102.

6. Leptina glicosilda 2, 47, 69 de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende la secuencia de aminoácidos (SEQ. ID Nº: 26):

19

7. Leptina glicosilda 2, 47, 69, 92 de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende la secuencia de aminoácidos (SEQ. ID Nº: 28):

20

8. Leptina glicosilda 2, 47, 69, 102 de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende la secuencia de aminoácidos (SEQ. ID Nº: 30):

21

9. Leptina glicosilda 47, 69, 102 de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende la secuencia de aminoácidos (SEQ. ID Nº: 32):

22

10. Leptina glicosilda 2, 47, 69, 92, 102 de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende la secuencia de aminoácidos (SEQ. ID Nº: 34):

23

\vskip1.000000\baselineskip

11. Leptina glicosilda 47, 69, 92, 102 de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende la secuencia de aminoácidos (SEQ. ID Nº: 36):

24

12. Una proteína leptina glicosilada de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una secuencia del residuo N-terminal seleccionada entre:

un residuo serina, arginina, prolina o alanina en la posición -1,

una serina en la posición -1 y una prolina en la posición -2,

una secuencia serina-prolina-serina en las posiciones -1, -2 y -3,

una serina en la posición -1 y una arginina en la posición -2,

una serina en la posición -1, una arginina en la posición -2 y una serina en la posición -3,

una arginina en la posición -1 y una serina en la posición -2; y

una alanina en la posición -1 y una prolina en la posición -2.

13. Un ácido nucleico que codifica una proteína leptina glicosilada de acuerdo con la reivindicación 1.

14. Un ácido nucleico que codifica una leptina glicosilada 2, 47, 69 que comprende la secuencia de ácidos nucleicos (SEQ. ID Nº: 25):

\vskip1.000000\baselineskip

25

\newpage

15. Un ácido nucleico que codifica una leptina glicosilada 2, 47, 69, 92 que comprende la secuencia de ácidos nucleicos (SEQ. ID Nº: 27):

26

16. Un ácido nucleico que codifica una leptina glicosilada 2, 47, 69, 102 que comprende la secuencia de ácidos nucleicos (SEQ. ID Nº: 29):

27

17. Un ácido nucleico que codifica una leptina glicosilada 47, 69, 102 que comprende la secuencia de ácidos nucleicos (SEQ. ID Nº: 31):

28

18. Un ácido nucleico que codifica una leptina glicosilada 2, 47, 69, 92, 102 que comprende la secuencia de ácidos nucleicos (SEQ. ID Nº: 33):

29

19. Un ácido nucleico que codifica una leptina glicosilada 47, 69, 92, 102 que comprende la secuencia de ácidos nucleicos (SEQ. ID Nº: 35):

30

20. Un vector que contiene un ácido nucleico que codifica una proteína leptina glicosilada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13-19.

21. Un vector de acuerdo con la reivindicación 20 que es un vector de expresión.

22. Una célula huésped que contiene un ácido nucleico que codifica una proteína leptina glicosilada de acuerdo con la reivindicación 1.

23. Una célula huésped según la reivindicación 22, seleccionada entre células procarióticas y eucarióticas.

24. Una célula huésped procariótica según la reivindicación 23, que es una célula bacteriana.

25. Una célula huésped eucariótica según la reivindicación 23, que se selecciona entre células de mamíferos, células de levaduras y células de insectos.

26. Una célula huésped de mamífero según la reivindicación 25, seleccionada entre células humanas, células de mono, células BHK y células CHO.

27. Un método para preparar una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, constituido por:

(a) cultivar una célula que contiene un ácido nucleico que codifica dicha proteína leptina glicosilada bajo condiciones adecuadas para la expresión; y

(b) obtener dicha proteína.

28. Una composición farmacéutica para la inyección por vía parenteral, inyección intravenosa, inyección subcutánea, administración intratecal, administración nasal, administración pulmonar y administración por bomba osmótica, que comprende una proteína leptina glicosilada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12 en un soporte farmacéuticamente aceptable.

29. Una leptina humana glicosilada de acuerdo con la reivindicación 1, para uso en un método de tratamiento de un ser humano para un estado seleccionado entre obesidad, diabetes y efectos del alto contenido en lípidos de la sangre;

comprendiendo dicho método administrar una cantidad eficaz de dicha leptina.

30. Una leptina de acuerdo con la reivindicación 29, en donde dicha cantidad eficaz de dicha leptina humana glicosilada se administra mediante terapia génica.

31. Una molécula de unión selectiva, que es selectiva para una proteína leptina glicosilada de acuerdo con la reivindicación 1, molécula que se selecciona entre un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo recombinante.

32. Una molécula de unión selectiva de acuerdo con la reivindicación 31, en donde la molécula es un anticuerpo monoclonal.

33. Un método para fabricar una proteína leptina glicosilada de acuerdo con la reivindicación 27, que comprende:

(a) cultivar, bajo condiciones adecuadas para la expresión, una célula huésped que contiene una secuencia de ADN que codifica, en la dirección 5' a 3' (i) un péptido señal y (ii) un ADN que codifica una proteína leptina glicosilada de acuerdo con la reivindicación 1; y

(b) obtener dicha proteína leptina glicosilada.

34. Un método según la reivindicación 33, en el que dicho péptido señal se selecciona entre:

\vskip1.000000\baselineskip

(a) (SEQ. ID Nº 3) (péptido señal de leptina humana nativa)

MHWGTLCGFLWLWPYLFYVQA

\vskip1.000000\baselineskip

(b) (SEQ. ID Nº 4) (péptido señal de leptina humana nativa)

MHWGTLCGFLWLWPYLFYVSPS

\vskip1.000000\baselineskip

(c) (SEQ. ID Nº 5) (péptido señal de leptina humana modificada)

MHWGTLCGFLWLWPYLFYVSP

\vskip1.000000\baselineskip

(d) (SEQ. ID Nº 6) (péptido señal de leptina humana modificada)

MHWGTLCGFLWLWPYLFYVSPA

\vskip1.000000\baselineskip

(e) (SEQ. ID Nº 7) (péptido señal de leptina humana modificada)

MHWGTLCGFLWLWPYLFYVSNS

\vskip1.000000\baselineskip

(f) (SEQ. ID Nº 8) (péptido señal de tPA humano nativo)

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPS

\vskip1.000000\baselineskip

(g) (SEQ. ID Nº 9) (péptido señal de tPA humano nativo)

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP

\vskip1.000000\baselineskip

(h) (SEQ. ID Nº 10) (péptido señal de tPA modificado)

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSNS

\vskip1.000000\baselineskip

(i) (SEQ. ID Nº 11) (péptido señal de tPA modificado)

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPA

\vskip1.000000\baselineskip

(j) (SEQ. ID Nº 12) (péptido señal de leptina/tPA)

MHWGTLCCVLLLLCGAVFVSPS

\vskip1.000000\baselineskip

(k) (SEQ. ID Nº 13) (péptido señal de leptina/tPA)

MHWGTLCCVLLLCGAVFVSP

35. Un método según la reivindicación 33, en el que dicho péptido señal se selecciona entre el péptido señal para: eritropoyetina, factor VIII, beta-interferón, albúmina de suero, insulina, factor de von Willebrand, CD11\alpha, IgG, folistatina, factor intrínseco, G-CSF, ceruloplasmina y LAMP-1.