JP2002534962A

JP2002534962A - Ｆｃ融合タンパク質としての抗肥満症タンパク質の発現および輸送

Info

Publication number: JP2002534962A
Application number: JP2000592323A
Authority: JP
Inventors: キン−ミンロー，; ジンヤンジャン，; ステファンディー．ギリス，
Original assignee: レキシジェンファーマシューティカルズコーポレイション
Priority date: 1999-01-07
Filing date: 2000-01-07
Publication date: 2002-10-22
Also published as: HUP0105090A2; BR0007414A; CA2356401A1; AU778939B2; ZA200105352B; CZ20012406A3; EP1141013A2; AU2602500A; NO20013371L; NO20013371D0; ID30327A; WO2000040615A3; MXPA01006922A; SK9432001A3; US20040053366A1; KR20020007287A; WO2000040615A2; CN1341121A

Abstract

(57)【要約】ヌクレオチド配列（例えば、免疫グロブリンＦｃ−レプチン融合タンパク質をコードする、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列）が開示される。ヌクレオチド配列は、適切な発現ベクターに挿入され得、そして哺乳動物細胞において発現され得る。このようなヌクレオチド配列の発現によって産生され得る免疫グロブリンＦｃ−レプチン融合タンパク質のファミリーもまた、開示される。このようなヌクレオチド配列および融合タンパク質を用いて、レプチンの投与によって緩和される状態を処置するための方法もまた、開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願）本出願は、１９９９年１月７日に出願された、米国仮出願番号６０／１１５，
０７９号に対して優先権を主張し、この開示は、本明細書中で参考として援用さ
れる。

【０００２】（発明の分野）本発明は、一般的には、抗肥満症タンパク質を含む融合タンパク質を作製し、
そして使用するための方法および組成物に関する。より特に、本発明は、免疫グ
ロブリンＦｃ領域およびレプチン（ｌｅｐｔｉｎ）（抗肥満症タンパク質）を含
む融合タンパク質を作製し、そして使用するための方法および組成物に関する。

【０００３】（発明の背景）肥満症は、多くの疾患（例えば、糖尿病、高血圧症、心臓病および特定の型の
癌）に関連する、主要な生理学的障害である。米国では、成人人口の３０％を超
える人が肥満（すなわち、少なくとも理想体重を２０％超える）であると推定さ
れる。肥満は、急速に、世界的に深刻な健康問題となっているという、増加した
指摘もまた存在する。多くの場合において、特に、肥満となる素因をつくる遺伝
的特性を受け継ぐ人においては、食餌および運動単独では、体重の減少を達成す
るに不十分であることが認識される。従って、人々の減量を助け得、そして肥満
症関連障害の危険度を低下させ得る薬物の必要性が存在する。より詳細には、適
した用量レベルで、実質的な体重の減少を引き起こすために十分な効能を有する
抗肥満症薬物の必要性が存在する。肥満症は、理想体重を２０％を超えていると
定義されるので、少なくとも２０％の体重減少が望ましい。より重篤な場合にお
いては、３０〜６０％の体重減少が、人の体重を健康な範囲にまで下げるために
、必要であり得る。

【０００４】肥満症は、生理学的因子、心理学的因子、遺伝的因子および環境的因子の組み
合わせから生じ得る、多因子性の表現型である。肥満症に関連する１つの因子は
、現在クローニングされた肥満（ｏｂ）遺伝子である（Ｚｈａｎｇら（１９９４
）ＮＡＴＵＲＥ３７２：４２５）。正常なマウスにおいては、このｏｂ遺伝子
は、レプチンと呼ばれるホルモンをコードする（Ｆｒｉｅｄｍａｎら（１９９８
）ＮＡＴＵＲＥ３９５：７６３）。十分に満たされた状態においては、過剰な
エネルギーが、脂肪細胞中にトリグリセリドとして変換され、そして貯蔵され、
このトリグリセリドは、順に、血流中にレプチンを分泌する。レプチンは、その
レセプターに結合することによって、メッセンジャーとして機能し、このレセプ
ターの長い形態は、シグナル伝達をし得る細胞質ドメインを有し、そして主に、
視床下部において見出される。ホルモンレセプターの結合は、脂肪組織が、エネ
ルギー貯蔵の状態について脳に知らせ得ることを通じた、シグナル伝達メカニズ
ムであることが意図される。レプチンが、血液脳関門を横切り、視床下部に位置
するレプチンレセプターへの接近を獲得することが意図される（Ｓｐｉｅｇｅｌ
ｍａｎら（１９９６）ＣＥＬＬ８７：３７７）。脳が、エネルギー貯蔵が豊富
であるというメッセージを受け取る場合に、食物取り込みの減少および／または
エネルギー消費の増加によって、体に、それに応じて調整するよう告げる。

【０００５】ｏｂ／ｏｂマウスといわれる、病的に肥満のマウスの系統は、２つの変異ｏｂ
対立遺伝子を有するホモ接合体である。変異対立遺伝子は、短縮型レプチンを産
生し、この短縮型レプチンは、非機能的であり、そしておそらく、インビボで急
速に分解する。ｏｂ／ｏｂマウスにおけるレプチンの欠乏の結果としては、嗜眠
、低体温症、高血糖症、高インスリン血症および不妊症が挙げられる。ヒトにお
いては、体重増加、およびレプチンの欠乏に対する肥満症に関連する証拠がまた
存在するが（Ｍｏｎｔａｇｕｅら（１９９７）ＮＡＴＵＲＥ３８７：９０３；
Ｒａｖｕｓｓｉｎら（１９９７）ＮＡＴＵＲＥＭＥＤＩＣＩＮＥ３：２３８
）、肥満の人々の大多数が、高レベルの循環レプチンを有することが報告されて
いる（Ｃｏｎｓｉｄｉｎｅら（１９９５）Ｎ．ＥＮＧＬ．Ｊ．ＭＥＤ．３３４：
２９２）。

【０００６】ｏｂ／ｏｂマウスにおけるレプチンの欠乏に関連する症状は、組換えレプチン
の投与によって改善され得る。レプチンの毎日の腹腔内注射が、食物取り込み、
体重、体脂肪百分率、ならびにグルコースおよびインスリンの血清濃度を減少し
得る。これには、代謝速度、体温および移動活性（ｌｏｃｏｍｏｔｏｒａｃｔ
ｉｖｉｔｙ）における増加が付随し、これらのすべては、エネルギー消費を必要
とする（Ｐｅｌｌｅｙｍｏｕｎｔｅｒら（１９９５）ＳＣＩＥＮＣＥ２６９：
５４０；Ｈａｌａａｓら（１９９５）ＳＣＩＥＮＣＥ２６９：５４３）。同じ
研究において、正常なマウスはまた、レプチン処置から利益を得るが、体重、食
物取り込みおよび体脂肪における減少は、有意により小さかった。組換えレプチ
ンはまた、雌性および雄性ｏｂ／ｏｂマウスの両方における不妊症を治すために
、用いられている（Ｃｈｅｂａｂら（１９９６）ＮＡＴＡＵＲＥＧＥＮＥＴＩ
ＣＳ１２：３１８；Ｍｏｕｎｚｉｂら（１９９７）ＥＮＤＯＣＲＩＮＯＬＯＧ
Ｙ１３８：１１９０）。さらに、トランスジェニックマウスを用いた最近の実
験は、比較的正常なまたは低いレプチンのレベルを有する、約５〜１０％の肥満
のヒトが、レプチン処置に対して応答性であり得ることを示唆した（Ｉｏｆｆｅ
ら（１９９８）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ９５：１１８
５２）。

【０００７】その存在形態におけるレプチンの使用は、数ヶ月間、一日複数回注射されるべ
き高用量のタンパク質を必要とし、所望の臨床成果を達成する。例えば、最近の
臨床試験において、高用量の範囲に対する数人のボランティアは、６ヶ月間、一
日３回注射されるべきレプチンを必要とした（ＷＡＬＬＳＴＲＥＥＴＪＯＵ
ＲＮＡＬ、Ｊｕｎｅ１５、１９９８）。おそらく、頻繁な高用量が、レプチン
の低い効力および短い血清半減期の組み合わせに起因して、必要とされる。この
知見はまた、ｏｂ／ｏｂマウスモデルにおける知見と矛盾せず、一日当たり５〜
２０ｍｇ／ｋｇのレプチンの腹腔内注射が、有意な体重減少を実証するために必
要であった（Ｐｅｌｌｅｙｍｏｕｎｔｅｒら（１９９５）ＳＣＩＥＮＣＥ２６
９：５４０；Ｈａｌｌａｓら（１９９５）ＳＣＩＥＮＣＥ２６９：５４３；Ｃ
ｈｅｂａｂら（１９９６）ＮＡＴＵＲＥＧＥＮＥＴＩＣＳ１２：３１８；Ｍ
ｏｕｎｚｉｈら（１９９７）ＥＮＤＯＣＲＩＮＯＬＯＧＹ１３８：１１９０）
。レプチンの「最適以下の薬物動態」を克服するために、１時間当たり４００ｎ
ｇでのレプチンの皮下長期注入が、マウスにおいて生理学的な血漿レベルのレプ
チンを達成するために必要とされた（Ｈａｌａａｓら（１９９７）ＰＲＯＣ．Ｎ
ＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ９４：８８７８）。

【０００８】頻繁な、高用量についての主要な理由は、１つ以上の内因性の特性（例えば、
レプチンのサイズおよび薬理学的な薬剤が調製される方法）に起因するようであ
る。レプチンは、約１６ｋＤの分子量を有し（Ｈａｌａａｓら（１９９５）ＳＣ
ＩＥＮＣＥ２６９：５４３）、従って、腎臓濾過によって浄化されるに十分な
程小さい。故に、高用量が、インビボでの短い血清半減期を補うために必要とさ
れ得る。

【０００９】さらに、より小さいタンパク質（例えば、レプチン）が、細菌（例えば、Ｅ．
ｃｏｌｉ）において産生され得る。特定の環境下で、組換えレプチンは、Ｅ．ｃ
ｏｌｉにおいて、不溶性の封入体として産生される。使用の前に、この封入体を
、変性剤（例えば、塩酸グアニジン）で可溶化し、変性条件下で精製し、そして
機能性タンパク質を産生するための適切な条件下でフォールドしなければならな
い。さらに、レプチンは、分子内ジスルフィド結合に関与する２つのシステイン
残基を含む。従って、可溶性の生物学的に活性な分子の回収を最大にするために
、フォールディングプロセスは、不溶性タンパク質の凝集体および分子内ジスル
フィド結合の形成を最小化するために、慎重に制御される必要がある。

【００１０】このような複雑な産生プロセスの結果として（すなわち、原核生物において作
製された封入体から精製されたレプチン）、十分な生物学的活性を有する、よく
定義された均質なタンパク質サンプルを提供することが、可能ではないかもしれ
ない。レプチンの溶解度を改善するための試みは、特定のアミノ酸残基を、アス
パラギン酸またはグルタミン酸に変異させることを含み、これによって、レプチ
ンの等電点（ｐＩ）を、５．８４〜５．５未満に低下させる（米国特許第５，７
１９，２６６号）。このような操作は、より容易に処方され、そして保存され得
る産物を生じるが、この産物はまた、意図されたレシピエントにおいて免疫原性
であり得る変異タンパク質である。

【００１１】高用量、低い効力、短い血清半減期、ならびにレプチンの産生および精製に関
与する、非常に複雑なプロセスを仮定すれば、この産生を高め、そしてこの抗肥
満症薬剤の薬理学的特性を改善する方法についての当該分野における必要性が存
在する。

【００１２】（発明の要旨）本発明は、抗肥満症タンパク質（例えば、レプチン）を含む融合タンパク質の
作製および使用に有用な、方法および組成物を特徴とする。この融合タンパク質
は、生物学的に活性な抗肥満症タンパク質の高レベルの発現を容易にし得る。こ
の融合タンパク質は、哺乳動物（例えば、ヒト）への投与の前に、薬学的に受容
可能なキャリアと組み合わせられ得る。特定の環境下で、この抗肥満症タンパク
質は、処方および／または投与の前に、この融合タンパク質から切断され得る。
あるいは、融合タンパク質を含む抗肥満症タンパク質をコードする核酸配列は、
薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせられ得、そして哺乳動物に投与され得
る。

【００１３】レプチンの産生および分泌を容易にする新規の核酸配列（例えば、ＤＮＡおよ
びＲＮＡ）を提供することが、本発明の目的である。特に、本発明の目的は、以
下の通りである：（ｉ）レプチンの効率的な産生および分泌を容易にする新規の
核酸配列を提供すること；（ｉｉ）種々の哺乳動物宿主細胞における、レプチン
の迅速かつ効率的な産生および分泌のための核酸構築物を提供すること；ならび
に（ｉｉｉ）組換えレプチンまたは遺伝子操作されたその改変体（非ネイティブ
なレプチンタンパク質、生合成レプチンタンパク質または別の人工的レプチンタ
ンパク質（例えば、合理的な設計によって作成されたタンパク質）を含む）を産
生し、分泌し、そして収集するための方法を提供すること。

【００１４】本発明の他の目的は、ポリヌクレオチド配列を提供することであり、このポリ
ヌクレオチド配列は、レプチンをコードするポリヌクレオチドに融合される場合
に、通常の試薬および技術を用いて精製され得る融合ポリペプチドを含むレプチ
ンをコードする。なお別の目的は、分泌カセットとコードされたレプチンタンパ
ク質との間にタンパク質分解性切断部位を挿入することであり、その結果、この
分泌カセットは、レプチンドメインから切断され得、そのため、レプチンは、独
立的に精製され得る。

【００１５】本発明の別の目的は、レプチンを含む融合タンパク質を提供することである。
本発明の融合タンパク質は、ネイティブのレプチンを超える、改良された生物学
的特性（例えば、増大した溶解度、長期化した血清半減期およびそのレセプター
への増大した結合）を示す。これらの特性は、レプチンの臨床効力を顕著に改善
し得る。好ましい実施形態においては、この融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末
端方向において、必要に応じて、免疫グロブリンＦｃ領域とレプチンの間に挿入
された他の部分（例えば、タンパク質分解性切断部位）を有する免疫グロブリン
Ｆｃ領域およびレプチンを含む。得られた融合タンパク質は、好ましくは、正常
なグリコシル化部位（すなわち、通常、鋳型抗体中に存在する）で、Ｆｃ領域を
グリコシル化する細胞において、合成される。グリコシル化は、少なくとも部分
的に、融合タンパク質の増強された循環半減期に寄与する。

【００１６】本発明の他の目的は、レプチン融合タンパク質の多価形態および多量体形態な
らびにその組み合わせを提供することである。

【００１７】本発明の別の目的は、融合タンパク質または切断されたレプチンを用いる処置
の方法を提供することである。本発明の全体的な目的は、効率的および安価の両
方であるプロセスを提供すること、ならびに生物学的に活性な抗肥満症タンパク
質を得ることである。

【００１８】従って、１つの局面において、本発明は、免疫グロブリンＦｃ領域−レプチン
融合タンパク質をコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子）
を提供する。この核酸分子は、シグナル配列、免疫グロブリンＦｃ領域および少
なくとも１つの標的タンパク質（本明細書中で、抗肥満症タンパク質（例えば、
レプチン）としてもいわれる）をコードする。好ましい実施形態において、この
核酸分子は、連続的に、５’から３’方向において、シグナル配列、免疫グロブ
リンＦｃ領域および標的タンパク質配列をコードする。別の実施形態において、
この核酸分子は、連続的に、５’から３’方向において、シグナル配列、標的配
列および免疫グロブリンＦｃ領域をコードする。この核酸は、Ｘ−Ｆｃ構造また
はＦｃ−Ｘ構造をコードし得、ここで、Ｘは、レプチンのような標的タンパク質
である。好ましい実施形態は、Ｆｃ−Ｘ構造であり、これはＦｃ−Ｘ構造の優れ
たレベルの発現のためである。

【００１９】好ましい実施形態において、免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリンヒン
ジ領域を含み、そして好ましくは、少なくとも１つの免疫グロブリン定常重鎖（
ｃｏｎｓｔａｎｔｈｅａｖｙ）領域ドメイン（例えば、免疫グロブリン定常重
鎖２（ＣＨ２）ドメイン、免疫グロブリン定常重鎖３（ＣＨ３）ドメイン、およ
びＦｃ領域を産生するために用いられる免疫グロブリンの型に依存して、必要に
応じて、免疫グロブリン定常重鎖４（ＣＨ４）ドメイン）を含む。より好ましい
実施形態においては、免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも免疫グロブリン定
常重鎖１（ＣＨ１）ドメインを欠如する。免疫グロブリンＦｃ領域は、任意の免
疫グロブリンクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）
に基づき得るが、ＩｇＧに基づく免疫グロブリンＦｃ領域が好ましい。

【００２０】本発明の核酸は、複製可能な発現ベクターに、作動的な結合において組み込ま
れ得、次いでこのベクターは、哺乳動物宿主細胞コンピテントに導入されて、レ
プチンに基づく融合タンパク質を産生し得る。得られたレプチンに基づく融合タ
ンパク質は、哺乳動物宿主細胞から効率的に産生され、そして分泌される。分泌
されたレプチンに基づく融合タンパク質は、哺乳動物宿主細胞を溶解することな
く、培養培地から収集され得る。このタンパク質産物は、活性についてアッセイ
され得、そして／または所望されるように通常の試薬を用いて精製され得、なら
びに／あるいは従来技術をすべて用いて、融合パートナーから切断され得る。

【００２１】別の局面において、本発明は、ポリペプチド結合を直接的に通じてか、または
間接的にポリペプチドリンカーを介してのいずれかで標的タンパク質に連結され
る、免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質を提供する。標的タンパク質
は、この標的タンパク質のＣ末端を介して、免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に
融合され得る。しかし、より好ましい実施形態において、標的タンパク質は、こ
の標的タンパク質のＮ末端を介して、免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端に融合さ
れる。

【００２２】１つの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、少なくとも約５０グラ
ムの初期体重を有するｏｂ／ｏｂマウスに、１日当たり約０．２５ｍｇ／ｋｇの
用量で５日間投与される場合に、約１０％（約５グラム）、より好ましくは、約
１２％（約６グラム）、またはより好ましくは、約１５％（約７．５グラム）の
初期体重減少を誘導する。より好ましい実施形態において、本発明の融合タンパ
ク質は、少なくとも約５０グラムの初期体重を有するｏｂ／ｏｂマウスに、１日
当たり約０．１ｍｇ／ｋｇの用量で５日間投与される場合に、約１０％（約５グ
ラム）、より好ましくは、約１２％（約６グラム）、またはより好ましくは、約
１５％（約７．５グラム）の初期体重減少を誘導する。

【００２３】別の実施形態において、この融合タンパク質は、第二の標的タンパク質（例え
ば、成熟レプチン、全長レプチンまたはその生理活性フラグメント）を含み得る
。この型の構築物においては、第一および第二の標的タンパク質が、同じタンパ
ク質または異なるタンパク質であり得る。この第一および第二の標的タンパク質
は、直接的またはポリペプチドリンカーによってのいずれかによって、互いに連
結され得る。あるいは、両方の標的タンパク質は、直接的またはポリペプチドリ
ンカーを介してのいずれかによって、免疫グロブリンＦｃ領域に連結され得る。
後者の場合においては、第一の標的タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ領域のＮ
末端に結合され得、そして第二の標的タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ領域の
Ｃ末端に結合され得る。

【００２４】別の実施形態において、２つの融合タンパク質は、共有結合的（例えば、ジス
ルフィド結合もしくはポリペプチド結合によって）、または非共有結合的のいず
れかによって結合し、二量体タンパク質を産生し得る。好ましい実施形態におい
て、この２つの融合タンパク質は、システイン残基（好ましくは、各々の鎖の免
疫グロブリンＦｃ領域内に配置される、免疫グロブリンヒンジ領域内に位置した
）を介した、少なくとも１つ、そしてより好ましくは２つの鎖内ジスルフィド結
合によって、共有結合的に結合される。

【００２５】別の局面において、本発明は、免疫グロブリンＦｃ領域および標的タンパク質
を含む融合タンパク質を産生する方法を提供する。この方法は、以下の工程：（
ａ）シグナル配列を用いてか、または用いずにのいずれかで、このような融合タ
ンパク質をコードするＤＮＡ分子を含む、哺乳動物細胞を提供する工程、および
（ｂ）この哺乳動物細胞を培養して、融合タンパク質を産生する工程、を包含す
る。次いで、得られた融合タンパク質を収集し、再フォールドし、必要に応じて
、当該分野で周知であり、そして使用される従来の精製技術を用いて、精製し得
る。この融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ領域と標的タンパク質の間に配
置された、タンパク質分解性切断部位を含むと仮定すると、この標的は、従来の
タンパク質分解酵素を使用して融合タンパク質から切断され得、そして必要に応
じて、使用の前に精製され得る。

【００２６】さらに別の局面において、本発明は、本発明の方法によって産生されたレプチ
ンおよび／または本発明の融合構築物の有効量を哺乳動物に投与することによっ
て、レプチンまたはその活性な改変体によって緩和される状態を処置するための
方法を提供する。本発明はまた、本発明のＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、「裸の
ＤＮＡ」あるいは本発明のＤＮＡまたはＲＮＡを含むベクター）を、レプチンま
たはその活性な改変体によって緩和される状態を有する哺乳動物に投与すること
によって、この状態を処置するための方法を提供する。

【００２７】本発明の前述の目的および他の目的、特徴および利点は、続く詳細な説明、図
面および特許請求の範囲からより明らかとなる。

【００２８】（発明の詳細な説明）本発明は、抗肥満症タンパク質の産生に有用な融合タンパク質を提供する。本
発明の融合タンパク質および／またはこのような融合タンパク質をコードする核
酸は、抗肥満症タンパク質を用いて処置される必要のある哺乳動物に直接的に投
与され得る。しかし、この抗肥満症タンパク質は、使用の前にこの融合タンパク
質から切断され得ることが意図される。

【００２９】従って、本発明は、免疫グロブリンＦｃ領域および少なくとも１つの標的タン
パク質（本明細書中でレプチンといわれる）を含む、融合タンパク質を提供する
。本発明を具体化するタンパク質構築物の５つの例示的な実施形態は、図１Ａ〜
１Ｅとして図面に例示される。二量体構築物が好ましいので、全ては、隣接する
サブユニット中のシステイン間のジスルフィド結合の対によって架橋された二量
体として例示される。この図面において、ジスルフィド結合は、２つの免疫グロ
ブリン重鎖Ｆｃ領域とともに、各重鎖内の免疫グロブリンヒンジ領域を介して結
合するように示され、そして従って、この結合は、これらの分子のネイティブ形
態の特徴である。Ｆｃのヒンジ領域を含む構築物が好ましく、そして治療剤とし
ての見込みを示したが、本発明は、所望されるように他の位置での架橋が選択さ
れ得ることを意図する。さらに、いくつかの状況下で、本発明の実施において有
用な二量体または多量体は、非共有結合的会合（例えば、疎水性相互作用）によ
って生成され得る。

【００３０】ホモ二量体構築物は本発明の重要な実施形態であるので、図面は、このような
構築物を例示する。ヘテロ二量体構造もまた、本発明の実施において有用である
ことが理解されるべきである。しかし、種々の哺乳動物種（ヒトを含む）におい
て肥満症を阻害するために有用な、実行可能な構築物が構築され得る（例えば、
全長レプチンを含む二量体Ｆｃ融合タンパク質の１つの鎖およびレプチン改変体
を含む二量体Ｆｃ融合タンパク質の他の鎖）。

【００３１】図１Ａは、本明細書中に記載される原理に従って生成された二量体構築物を示
す（例えば、実施例１および４を参照のこと）。実施例１は、マウス構築物を表
し、そして実施例４は、ヒト構築物を表す。ホモ二量体の各単量体は、免疫グロ
ブリンＦｃ領域１（ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む）
を含む。Ｆｃ領域のＣ末端に直接的に（すなわち、ポリペプチド結合を介して）
結合されるのは、レプチン２である。Ｆｃ領域は、ポリペプチドリンカーを介し
て標的タンパク質に結合され得ることが理解されるべきである（示していない）
。

【００３２】図１Ｂおよび１Ｃは、タンデムに配置されそしてリンカーによって連結される
、複数の抗肥満症タンパク質を標的タンパク質として含む、本発明のタンパク質
構築物を示す。図１Ｂにおいて、標的タンパク質は、全長レプチン２、グリシン
残基およびセリン残基から作製されるポリペプチドリンカー４、ならびにレプチ
ンの活性改変体３を含む。図１Ｃは、ほとんどのＣ末端タンパク質ドメインがレ
プチン２の第２の全長コピーを含むことにおいて、図１Ｂの構築物と異なる。

【００３３】図１Ａ〜１Ｃは、Ｆｃ−Ｘ構築物を示す（ここで、Ｘは、標的タンパク質であ
る）が、Ｘ−Ｆｃ型構築物はまた、本発明の実施において有用であり得ることが
、意図される。従って、図１Ｄおよび１Ｅは、本明細書中に示される原理に従っ
て作製されるＸ−Ｆｃ型構築物を示す（例えば、実施例５および６を参照のこと
）。図１Ｄにおいて示されるＸ−Ｆｃ型構築物は、そのＮ末端に全長レプチン２
’を含む。レプチンのＣ末端に直接的に連結されるのは、ヒンジ領域を含むＦｃ
領域１’である。図１Ｅにおいて、例示される構築物は、そのＮ末端に全長レプ
チン２’を有する。しかし、図１Ｄの構築物とは対照的に、図１Ｅに示されるレ
プチン２’は、Ｆｃ領域１’に対してポリペプチドリンカー４’によって連結さ
れる。さらに、本発明の有用なタンパク質はまた、式Ｘ−Ｆｃ−Ｘによって示さ
れ得ることが意図される。ここで、Ｘは、同じまたは異なる標的タンパク質を示
し得る。

【００３４】本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチドリンカー」は、天然におい
てはともに天然に結合しない２つのタンパク質を一緒に結合し得るペプチド配列
を意味することが、理解される。ポリペプチドリンカーは、好ましくは、複数の
アミノ酸（例えば、アラニン、グリシンおよびセリンまたはこのようなアミノ酸
の組合せ）を含む。好ましくは、ポリペプチドリンカーは、一連の、約１０〜１
５残基長のグリシンペプチドおよびセリンペプチドを含む。例えば、米国特許第
５，２５８，６９８号を参照のこと（この開示は、本明細書中に参考として援用
される）。しかし、最適なリンカー長およびアミノ酸組成は、慣用的な実験によ
って決定され得ることが、意図される。

【００３５】本明細書中で使用される場合、用語「多価」は、２つ以上の生物学的に活性な
セグメントを組み込む組換え分子をいう。多価分子を形成するタンパク質フラグ
メントは、構成部分を結合しかつ各々独立して機能することを許容するポリペプ
チドリンカーを通じて結合され得る。

【００３６】本明細書中で使用される場合、用語「二価」は、配置Ｆｃ−ＸまたはＸ−Ｆｃ
を有する多価組換え分子をいう。ここで、Ｘは、標的分子である。免疫グロブリ
ンＦｃ領域は、例えば、鎖内ジスルフィド結合を介して会合されて、図１Ａおよ
び１Ｄに示される型の構築物を生成し得る。本発明の融合構築物が配置Ｆｃ−Ｘ
−Ｘを有する場合、得られるＦｃ二量体分子は、図１Ｃに示される。２つの標的
タンパク質は、ペプチドリンカーを通じて結合され得る。図１Ａに示される型の
構築物は、標的分子とそのレセプターとの間のみかけの結合親和性を増大し得る
。例えば、Ｆｃ−レプチン融合タンパク質の１つのレプチン部分が特定の親和性
を有する細胞上のレセプターに結合し得る場合、同じＦｃ−レプチン融合タンパ
ク質の第２のレプチン部分は、非常により高いアビディティー（みかけの親和性
）で同じ細胞上の第２のレセプターに結合し得る。これは、第１のレプチン部分
がすでに結合した後に、第２のレプチン部分のレセプターへの物理的近接のため
に生じ得る。抗原に対する抗体結合の場合、みかけの親和性は、少なくとも数万
倍（すなわち、１０⁴）増大され得る。各タンパク質サブユニット（すなわち、
「Ｘ」）は、それ自体独立した機能を有し、その結果、多価分子において、タン
パク質サブユニットの機能は、相加的または相乗的であり得る。

【００３７】本明細書中で使用される場合、用語「多量体（の）」は、共有的（例えば、共
有的相互作用（例えば、ジスルフィド結合）による）かまたは非共有的（例えば
、疎水性相互作用による）のいずれかでの、２つ以上のポリペプチド鎖の安定な
会合をいう。用語多量体は、ホモ多量体（サブユニットが同じである）ならびに
ヘテロ多量体（サブユニットが異なる）の両方を含むことが、意図される。

【００３８】本明細書中で使用される場合、用語「二量体（の）」は、２つのポリペプチド
鎖が、共有的または非共有的相互作用によって安定に会合される、特定の多量体
分子をいう。免疫グロブリンＦｃ領域（少なくともヒンジ領域の一部、ＣＨ２ド
メインおよびＣＨ３ドメインを含む）は、代表的に二量体を形成することが理解
されるべきである。多くのタンパク質リガンドＸが、それらのレセプターにリガ
ンドとして結合することが公知である。タンパク質リガンドＸが天然に二量体化
する場合、Ｆｃ−Ｘ分子のＸ部分は、より大きな程度まで二量体化する。なぜな
ら、二量体化プロセスは、濃度依存性であるからである。Ｆｃによって連結され
る２つのＸ部分の物理的近接は、二量体化を分子内プロセスにし、二量体を支持
する平衡を大きく移動させ、そしてレセプターに対するその結合を増強する。

【００３９】本明細書中で使用される場合、用語「レプチン」は、全長成熟レプチンタンパ
ク質（例えば、配列番号２および配列番号４を参照のこと（これらは、それぞれ
、成熟ヒトレプチンおよびマウスレプチンを示す））のみならず、それらの改変
体および生物活性フラグメントもまた意味することが、理解される。用語生物活
性フラグメントは、ｏｂ／ｏｂマウスモデルを使用して決定されるような成熟鋳
型レプチンタンパク質の生物学的活性の、少なくとも３０％、より好ましくは、
少なくとも７０％、そして最も好ましくは、少なくとも９０％を有する、任意の
レプチンタンパク質フラグメントをいう。用語改変体は、種改変体および対立遺
伝子改変体、ならびに他の天然に存在する改変体または天然に存在しない改変体
（例えば、遺伝子操作プロトコルによって生成される）を含み、本明細書中で開
示されるレプチンの天然に存在する配列のいずれかに対して、少なくとも７０％
類似または６０％同一、より好ましくは、少なくとも７５％類似または６５％同
一、そして最も好ましくは、少なくとも８０％類似または７０％同一である。

【００４０】候補ポリペプチドが参照ポリペプチドに対して必須の類似性パーセンテージま
たは同一性パーセンテージを有するか否かを決定するために、候補アミノ酸配列
および参照アミノ酸配列は、最初に、ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ
（１９９２）、「Ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｍａｔｒ
ｉｃｅｓｆｒｏｍｐｒｏｔｅｉｎｂｌｏｃｋｓ」、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．
ＡＣＡＤ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５〜１０９１９の図２に記載される
ＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリクスを組み合わせて、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒ
ｍａｎ（１９８１）Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．１４７：１９５〜１９７に記載され
るダイナミックプログラミングアルゴリズムを使用して整列される。本発明につ
いて、ギャップ挿入ペナルティー（ｇａｐｉｎｓｅｒｔｉｏｎｐｅｎａｌｔ
ｙ）についての適切な値は、−１２であり、そしてギャップ伸長ペナルティー（
ｇａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎｐｅｎａｌｔｙ）についての適切な値は、−４で
ある。Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムおよびＢＬＯＳＵＭ６２マ
トリクスを使用する整列を実施するコンピュータープログラム（例えば、ＧＣＧ
プログラムスート（ＯｘｆｏｒｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｒｏｕｐ，Ｏｘｆｏ
ｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）は、市販されており、そして当業者によって広範に使用
される。

【００４１】一旦、候補配列と参照配列との間の整列が作製されると、パーセント類似性ス
コアが計算され得る。各々の配列の個々のアミノ酸は、互いにこれらの類似性に
従って、連続的に比較される。２つの整列されたアミノ酸に対応するＢＬＯＳＵ
Ｍ６２マトリクスにおける値が０または負の数である場合、対合（ｐａｉｒ−ｗ
ｉｓｅ）類似性スコアは、０であるか；そうでなければ、対合類似性スコアは、
１．０である。生の類似性スコアは、整列されたアミノ酸の対合類似性スコアの
合計である。次いで、生のスコアは、この生のスコアを、候補配列または参照配
列の小さいほうのアミノ酸の数で除算することによって正規化される。正規化さ
れた生のスコアは、パーセント類似性である。あるいは、パーセント同一性を計
算するために、各配列の整列されたアミノ酸は、再び連続的に比較される。アミ
ノ酸が同一でない場合、対合同一性スコアは、０であるか；そうでなければ、対
合同一性スコアは、１．０である。生の同一性スコアは、整列された同一のアミ
ノ酸の合計である。次いで、生のスコアは、この生のスコアを、候補配列または
参照配列の小さいほうのアミノ酸の数で除算することによって正規化される。正
規化された生のスコアは、パーセント同一性である。挿入および欠失は、パーセ
ント類似性およびパーセント同一性を計算する目的のために無視される。従って
、ギャップペナルティーは、この計算において使用されないが、これらは、最初
の整列において使用される。

【００４２】改変体はまた、レプチン様活性を有する他のレプチンムテインを含み得る。例
えば、米国特許第５，７１９，２６６号を参照のこと。この開示は、本明細書中
で参考として援用される。種改変体は、ヒトレプチン配列およびマウスレプチン
配列（例えば、それぞれ、配列番号２および配列番号４を参照のこと）を含むが
、これらに限定されず、そして種改変体は、例えば、登録番号Ｕ７２８７３（Ｐ
ｏｎｇｏｐｙｇｍａｅｕｓ）、登録番号Ｕ９６４５０（Ｐａｎｔｒｏｇｌｏ
ｇｙｔｅｓ）、登録番号Ｕ６６２５４（Ｓｕｓｓｃｒｏｔａ）、登録番号Ｕ５
０３６５（Ｂｏｓｔａｕｒｕｓ）、登録番号Ｄ４９６５３（Ｒａｔｔｕｓｎ
ｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、登録番号Ｕ５８４９２（Ｍａｃａｃａｍｕｌａｔｔａ
）、登録番号Ｕ７２８７２（Ｇｏｒｉｌｌａｇｏｒｉｌｌａ）、登録番号Ｕ６
２１２３（Ｏｖｉｓａｒｉｅｓ）、登録番号ＡＦ０８２５００（Ｇａｌｌｕｓ
ｇａｌｌｕｓ）、登録番号ＡＦ０８２５０１（Ｍｅｌｅａｇｒｉｓｇａｌｌ
ｏｐａｖｏ）、登録番号ＡＢ０２０９８６（Ｃａｎｉｓｆａｍｉｌｉａｒｉｓ
）、登録番号ＡＦ０９７５８２（Ｅｑｕｕｓｃａｂａｌｌｕｓ）、および登録
番号ＡＦ１５９７１３（Ｓｍｉｎｔｈｏｐｓｉｓｃｒａｓｓｉｃａｕｄａｔａ
）に基づく、Ｇｅｎｂａｎｋおよび／またはＥＭＢＬデータベースにおいて開示
されるヌクレオチド配列によってコードされる。これらの開示は、本明細書中で
参考として援用される。

【００４３】さらに、レプチン配列は、配列番号２０に示されるコンセンサス配列の一部ま
たは全てを含み得る。ここで、レプチンは、ｏｂ／ｏｂマウスモデルを使用して
決定されるように、成熟全長ヒトレプチンの生物学的活性の、少なくとも３０％
、より好ましくは、少なくとも７０％、そして最も好ましくは、少なくとも９０
％を有する。配列番号２０のコンセンサス配列は、マウス、ラット、ニワトリ、
ヒト、チンパンジー、雌ウシ、ヒツジ、ローランドゴリラ、アカゲザル、ブタ、
オランウータンおよびイヌ由来のレプチン配列から生成された。例えば、レプチ
ンは、以下：

【００４４】

【化１】（配列番号２０）のコンセンサス配列の一部または全てを含み得る。ここで、必
要に応じて、Ｘａａ３は、ＩｌｅまたはＣｙｓであり得、Ｘａａ４は、Ａｒｇ、
Ｔｒｐ、ＧｌｎまたはＨｉｓであり得、Ｘａａ５は、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＩｌ
ｅであり得、Ｘａａ６は、ＶａｌまたはＰｈｅであり得、Ｘａａ１９は、Ａｌａ
またはＴｈｒであり得、Ｘａａ２８は、Ｇｌｎまたはペプチド結合であり得、Ｘ
ａａ３２は、ＳｅｒまたはＡｌａであり得、Ｘａａ３３は、ＬｙｓまたはＡｒｇ
であり得、Ｘａａ３５は、ＡｒｇまたはＬｙｓであり得、Ｘａａ３７は、Ａｌａ
またはＴｈｒであり得、Ｘａａ４６は、ＧｌｎまたはＨｉｓであり得、Ｘａａ４
８は、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＬｙｓであり得、Ｘａａ５０は、ＳｅｒまたはＴｈ
ｒであり得、Ｘａａ５３は、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＧｌｎであり得、Ｘａａ６０
は、ＩｌｅまたはＶａｌであり得、Ｘａａ６４は、ＩｌｅまたはＶａｌであり得
、Ｘａａ６６は、Ａｎｓ、Ｔｈｒ、ＩｌｅまたはＡｌａであり得、Ｘａａ６７は
、ＬｅｕまたはＭｅｔであり得、Ｘａａ６８は、ＬｅｕまたはＭｅｔであり得、
Ｘａａ６９は、ＨｉｓまたはＰｒｏであり得、Ｘａａ７１は、ＡｒｇまたはＧｌ
ｎであり得、Ｘａａ７３は、ＶａｌまたはＭｅｔであり得、Ｘａａ７４は、Ｖａ
ｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕであり得、Ｘａａ７７は、ＳｅｒまたはＡｌａであり得
、Ｘａａ７８は、ＡｓｎまたはＨｉｓであり得、Ｘａａ８９は、ＬｅｕまたはＶ
ａｌであり得、Ｘａａ９２は、Ｓｅｒ、ＰｈｅまたはＡｌａであり得、Ｘａａ９
７は、Ｐｒｏ、ＨｉｓまたはＳｅｒであり得、Ｘａａ１００は、Ａｒｇ、Ｑｌｎ
、ＴｒｐまたはＬｅｕであり得、Ｘａａ１０１は、Ａｌａ、ＶａｌまたはＴｈｒ
であり得、Ｘａａ１０２は、ＡｒｇまたはＳｅｒであり得、Ｘａａ１０３は、Ｇ
ｌｙまたはＡｌａであり得、Ｘａａ１０５は、ＧｌｕまたはＧｌｎであり得、Ｘ
ａａ１０６は、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＬｙｓであり得、Ｘａａ１０７は、Ｐｈｅ
、ＬｅｕまたはＰｒｏであり得、Ｘａａ１０８は、ＧｌｕまたはＡｓｐであり得
、Ｘａａ１１１は、ＧｌｙまたはＡｓｐであり得、Ｘａａ１１２は、Ｇｌｙ、Ａ
ｓｐまたはＶａｌであり得、Ｘａａ１１８は、ＬｅｕまたはＧｌｙであり得、Ｘ
ａａ１３１は、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＡｒｇであり得、Ｘａａ１３２は、Ａｌａ
またはＳｅｒであり得、Ｘａａ１３６は、ＭｅｔまたはＩｌｅであり得、Ｘａａ
１３８は、Ａｒｇ、ＴｒｐまたはＱｌｎであり得、Ｘａａ１３９は、Ａｒｇまた
はＧｌｎであり得、Ｘａａ１４２は、ＬｅｕまたはＶａｌであり得、あるいはＸ
ａａ１４５は、ＧｌｙまたはＧｌｕであり得る。

【００４５】好ましい実施形態において、標的タンパク質は、全長のレプチンの成熟配列を
含む。ヒトレプチンタンパク質およびマウスレプチンタンパク質をコードするヌ
クレオチド配列およびヒトレプチンタンパク質およびマウスレプチンタンパク質
を定義するアミノ酸配列は、配列番号１〜４に示される。

【００４６】本明細書中に開示される標的タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域を有す
る融合タンパク質として表され得る。公知のように、各免疫グロブリン重鎖定常
領域は、４つまたは５つのドメインを含む。このドメインは、連続的に以下のよ
うに名付けられる：ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（ＣＨ４）。重鎖ドメイン
のＤＮＡ配列は、免疫グロブリンクラスのうちで交差相同性を有する。例えば、
ＩｇＧのＣＨ２ドメインは、ＩｇＡおよびＩｇＤのＣＨ２ドメイン、ならびにＩ
ｇＭおよびＩｇＥのＣＨ３ドメインに相同である。

【００４７】本明細書中で使用される場合、用語「免疫グロブリンＦｃ領域」は、免疫グロ
ブリン鎖定常領域、好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常領域、またはその一部
のカルボキシル末端部分を意味することが、理解される。例えば、免疫グロブリ
ンＦｃ領域は、以下を含み得る：１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣ
Ｈ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン
およびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または５）
２つ以上のドメインおよび免疫グロブリンヒンジ領域の組合せ。好ましい実施形
態において、免疫グロブリンＦｃ領域は、少なくとも免疫グロブリンヒンジ領域
、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、そして好ましくは、ＣＨ１ドメ
インを欠如する。

【００４８】重鎖定常領域が由来する免疫グロブリンの現在の好ましいクラスは、ＩｇＧ（
Ｉｇγ）（γサブクラス１、２、３または４）である。ヒトＦｃγ−１のヌクレ
オチド配列およびアミノ酸配列は、配列番号５および６に示される。マウスＦｃ
γ−２ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、配列番号７および８に示さ
れる。免疫グロブリンの他のクラス（ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、Ｉ
ｇＥ（Ｉｇε）およびＩｇＭ（Ｉｇμ））が、使用され得る。適切な免疫グロブ
リン重鎖定常領域の選択は、米国特許第５，５４１，０８７号および同第５，７
２６，０４４号において詳細に議論される。特定の結果を達成するための、特定
の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常
領域配列の選択は、当該分野の技術レベル内であるとみなされる。免疫グロブリ
ンＦｃ領域をコードするＤＮＡ構築物の一部は、好ましくは、少なくともヒンジ
ドメインの一部を含み、そして好ましくは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇ
Ｍのいずれかにおける少なくともＦｃγのＣＨ₃ドメインの一部もしくは相同性
ドメインを含む。

【００４９】適用に依存して、ヒト以外の種（例えば、マウスまたはラット）由来の定常領
域遺伝子が、使用され得る。ＤＮＡ構築物における融合パートナーとして使用さ
れる免疫グロブリンＦｃ領域は、一般に、任意の哺乳動物種由来であり得る。Ｆ
ｃ領域に対して宿主細胞または宿主動物における免疫応答を惹起することが望ま
しくない場合、Ｆｃ領域は、宿主細胞または宿主動物と同じ種由来であり得る。
例えば、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域は、宿主動物または宿主細胞がヒトである
場合に使用され得る；同様に、マウス免疫グロブリンＦｃ領域は、宿主動物また
は宿主細胞がマウスである場合に使用され得る。

【００５０】本発明の実施において有用なヒト免疫グロブリンＦｃ領域およびマウス免疫グ
ロブリンＦｃ領域をコードする核酸配列およびこの領域を定義するアミノ酸配列
は、配列番号５〜８に示される。しかし、本発明の実施において有用な他の免疫
グロブリンＦｃ領域配列が見出されることが、意図される（例えば、Ｇｅｎｂａ
ｎｋおよび／またはＥＭＢＬデータベースに開示されるヌクレオチド配列（例え
ば、ＡＦ０４５５３６．１（Ｍａｃａｃａｆｕｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、ＡＦ
０４５５３７．１（Ｍａｃａｃａｍｕｌａｔｔａ）、ＡＢ０１６７１０（Ｆｅ
ｌｉｘｃａｔｕｓ）、Ｋ００７５２（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓｃｕｎｉｃｕ
ｌｕｓ）、Ｕ０３７８０（Ｓｕｓｓｃｒｏｆａ）、Ｚ４８９４７（Ｃａｍｅｌ
ｕｓｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）、Ｘ６２９１６（Ｂｏｓｔａｕｒｕｓ）、Ｌ
０７７８９（Ｍｕｓｔｅｌａｖｉｓｏｎ）、Ｘ６９７９７（Ｏｖｉｓａｒｉ
ｅｓ）、Ｕ１７１６６（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓｍｉｇｒａｔｏｒｉｕｓ）、Ｘ
０７１８９（Ｒａｔｔｕｓｒａｔｔｕｓ）、ＡＦ５７６１９．１（Ｔｒｉｃｈ
ｏｓｕｒｕｓｖｕｌｐｅｃｕｌａ）またはＡＦ０３５１９５（Ｍｏｎｏｄｅｌ
ｐｈｉｓｄｏｍｅｓｔｉｃａ））によってコードされる配列による）。これらの開示は、本明細書中に参考として援用される。

【００５１】さらに、免疫グロブリン重鎖定常領域内のアミノ酸の置換または欠失は、本発
明の実施において有用であり得ることが、意図される。１つの例は、Ｆｃレセプ
ターについての親和性を減少するＦｃ改変体を作製するために、上部ＣＨ２領域
においてアミノ酸置換を導入することである（Ｃｏｌｅら（１９９７）Ｊ．ＩＭ
ＭＵＮＯＬ．１５９：３６１３）。当業者は、周知の分子生物学的技術を使用し
て、このような構築物を調製し得る。

【００５２】Ｆｃ領域配列としてのヒトＦｃγ１の使用は、いくつかの利点を有する。例え
ば、Ｆｃ融合タンパク質が生物薬剤（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）と
して使用される場合、Ｆｃγ１ドメインは、融合タンパク質に対してエフェクタ
ー機能活性を付与し得る。エフェクター機能活性は、生物学的活性（例えば、胎
盤移動、および血清半減期の増加）を含む。免疫グロブリンＦｃ領域はまた、抗
ＦｃＥＬＩＳＡによる検出およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ
プロテインＡ（「プロテインＡ」）に対する結合を介する精製について提供する
。しかし、特定の適用において、免疫グロブリンＦｃ領域からの特定のエフェク
ター機能（例えば、Ｆｃレセプター結合および／または補体固定化）を欠失する
ことが、望ましくあり得る。

【００５３】本発明の融合タンパク質において、免疫グロブリンＦｃ領域は、レプチンタン
パク質の適切なフォールディングを容易にして、活性レプチンタンパク質を生じ
、そしてまた、少なくとも細胞外媒体において活性な部分に対して溶解度を与え
る。免疫グロブリンＦｃ領域は親水性であるので、レプチン含有融合タンパク質
は、細菌宿主において発現されるレプチン対応物とは異なり、可溶性である。Ｄ
ｉＭａｒｃｈｉら（米国特許第５，７１９，２６６号）は、特定のアミノ酸残基
をアスパラギン酸またはグルタミン酸へ変異し、それによりレプチンの等電点（
ｐＩ）が５．８４から５．５未満に低下することによって、レプチンの溶解度を
改善した。融合パートナーとしての免疫グロブリンＦｃ領域の使用は、より低い
ｐＩを有するレプチンムテインの作製のための必要性を減少させる。なぜなら、
Ｆｃは、グリコシル化され、そして生理学的ｐＩで高度に荷電されており、それ
ゆえに、レプチンを可溶化するためのキャリアとして作用するからである。結果
として、レプチン含有融合タンパク質は、水溶液（例えば、薬学的に受容可能な
キャリア）中で完全に可溶性である。

【００５４】本発明は、本発明の実施において有用なＦｃ融合タンパク質を作製するための
従来の組換えＤＮＡ方法論を利用することが理解される。好ましくは、Ｆｃ融合
構築物は、ＤＮＡレベルで作製され、そして得られたＤＮＡは、発現ベクターに
組み込まれ、そして発現し、本発明の融合タンパク質を産生する。本明細書中で
用いられる場合、用語「ベクター」は、宿主細胞に組み込まれ、そして宿主細胞
のゲノムと組替えられ、そして宿主細胞のゲノムと統合されるヌクレオチド配列
形質転換受容体を含む任意の核酸を意味することが理解される。このようなベク
ターは、直線化核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、
ウイルスベクターなどを含む。ウイルスベクターの制限されない例は、レトロウ
イルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスを含む。本明細書中で用いら
れる場合、用語「遺伝子発現」または標的タンパク質の「発現」は、ＤＮＡ配列
の転写、ｍＲＮＡ転写物の翻訳、およびＦｃ融合タンパク質産物の選択を意味す
ることが理解される。

【００５５】有用な発現ベクターは、ｐｄＣｓ（Ｌｏら（１９８８）、ＰｒｏｔｅｉｎＥ
ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１１：４９５、この開示は、本明細書中に参考として援
用される）であり、ここで、Ｆｃ−Ｘ遺伝子の転写は、ヒトサイトメガロウイル
スのエンハンサー／プロモーターおよびＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを利
用する。用いたヒトサイトメガロウイルスのエンハンサー配列およびプロモータ
ー配列は、Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ４１：５２１（この開示は
、本明細書中に参考として援用される）に提供される配列のヌクレオチド−６０
１〜＋７由来である。このベクターはまた、選択マーカーとして変異ジヒドロ葉
酸レダクターゼ遺伝子を含む（ＳｉｍｏｎｓｅｎおよびＬｅｖｉｎｓｏｎ（１９
８３）ＰＲＯＣ．ＮＡＴ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ８０：２４９５（この開
示は、本明細書中に参考として援用される））。

【００５６】適切な宿主細胞は、本発明のＤＮＡ配列で形質転換またはトランスフェクトさ
れ得、そして標的タンパク質の発現および／または選択に利用され得る。現在、
本発明における使用のために好ましい宿主細胞は、不死化ハイブリドーマ細胞、
ＮＳ／Ｏミエローマ細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨＥ
ＬＡ細胞およびＣＯＳ細胞を含む。

【００５７】哺乳動物細胞における融合タンパク質の高レベルな発現を産生するために使用
されてきた発現系の１つは、分泌カセット（シグナル配列および免疫グロブリン
Ｆｃ領域、ならびに標的タンパク質を含む）を５’から３’の方向にコードする
ＤＮＡ構築物である。いくつかの標的タンパク質は、このような系において満足
に発現され、そして、例えば、ＩＬ２、ＣＤ２６、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＯＳＦ−２
、βＩＧ−Ｈ３、ＩｇＥレセプター、ＰＳＭＡおよびｇｐ１２０を含む。これら
の発現構築物は、Ｌｏらの米国特許第５，５４１，０８７号および同５，７２６
，０４４号（これらの開示は、本明細書中に参考として援用される）に開示され
る。

【００５８】本明細書中で用いられる場合、用語「シグナル配列」は、レプチン融合タンパ
ク質の分泌を指向し、その後宿主細胞において翻訳に引き続いて切断されるセグ
メントを意味することが理解される。本発明のシグナル配列は、小胞体の幕を横
切ってタンパク質の移行を開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
である。本発明において有用なシグナル配列は、抗体軽鎖シグナル配列（例えば
、抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９８９）Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．ＭＥＴ
Ｈ．１２５：１９１））、抗体重鎖シグナル配列（例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体
重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏら（１９８０）ＮＡＴＵＲＥ２８６：５５７
４））、および当該分野において公知の他のシグナル配列（例えば、Ｗａｔｓｏ
ｎ（１９８４）ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤＳＲＥＳＥＡＲＣＨ１２：５１４
５を参照のこと）を含む。これらの参考文献のそれぞれが、本明細書中に参考と
して援用される。

【００５９】シグナル配列は、当該分野において十分特徴付けられており、そして代表的に
は、１６〜３０アミノ酸残基を含むことが公知であり、そしてより多いまたはよ
り少ないアミノ酸残基を含み得る。代表的なシグナルペプチドは、３つの領域か
らなる：塩基性Ｎ末端領域、中央の疎水性領域、およびより極性のＣ末端領域。
中央の疎水性領域は、初期のポリペプチド移行の間、シグナルペプチドを膜脂質
二重層を横切って固着させる４〜１２の疎水性残基を含む。開始後、シグナルペ
プチドは通常、シグナルペプチダーゼとして公知の細胞性酵素によって、小胞体
の内腔で切断される。シグナルペプチドの潜在的な切断部位は、一般的に、「（
−３，−１）規則」に従う。従って、代表的なシグナルペプチドは、−１位およ
び−３位で小さい中性のアミノ酸残基を有し、そしてこの領域におけるプロリン
残基を欠く。このシグナルペプチダーゼは、−１のアミノ酸と＋１のアミノ酸と
の間のこのようなシグナルペプチドを切断する。従って、このシグナル配列は、
分泌の間に融合タンパク質のアミノ末端から切断され得る。これは、免疫グロブ
リンのＦｃ領域および標的タンパク質からなるＦｃ融合タンパク質の分泌を生じ
る。シグナルペプチド配列の詳細な説明は、ｖｏｎＨｅｉｊｎｅ（１９８６）
ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤＳＲＥＳ．１４：４６８３によって提供される（こ
の参考文献のそれぞれが、本明細書中に参考として援用される）。

【００６０】当業者に明らかなように、分泌カセットにおける使用のための特定のシグナル
配列の安定性は、いくつかの慣用的実験を要求し得る。このような実験は、Ｆｃ
融合タンパク質の分泌を指向するためのシグナル配列の能力を決定すること、お
よびＦｃ融合タンパク質の効果的な分泌を達成するために使用される配列の最適
な配置（ゲノムまたはｃＤＮＡ）の決定をまた包含する。さらに、当業者は、ｖ
ｏｎＨｅｉｊｎｅ（上記で参照される）によって示される規則に従って、合成
シグナルペプチドを作製し得、慣用的な実験によってこのような合成シグナル配
列の有効性について試験し得る。シグナル配列はまた、「シグナルペプチド」「
リーダー配列」または「リーダーペプチド」として言及され得る。

【００６１】シグナル配列および免疫グロブリンＦｃ領域の融合は、時々本明細書中に分泌
カセットとして言及される。本発明の実施に有用な模範的分泌カセットは、免疫
グロブリン軽鎖遺伝子シグナル配列およびヒト免疫グロブリンγ１遺伝子のＦｃ
γ１領域を、５’から３’の方向にコードするポリヌクレオチドである。免疫グ
ロブリンＦｃγ１遺伝子のＦｃγ１領域は、好ましくは、少なくとも免疫グロブ
リンのヒンジドメインの一部、および少なくともＣＨ３ドメイン、またはより好
ましくは、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの
一部を含む。本明細書中で用いられる場合、免疫グロブリンヒンジドメインの「
一部」は、鎖間ジスフィルド結合を形成し得る少なくとも１つ、好ましくは２つ
のシステイン残基を含む免疫グロブリンヒンジの一部を意味することが理解され
る。分泌カセットをコードするＤＮＡは、そのゲノム配置またはそのｃＤＮＡ配
置に置かれ得る。特定の環境下で、これは、ヒト免疫グロブリンＦｃγ２重鎖配
列からＦｃ領域を産生するために有利であり得る。ヒト免疫グロブリンγ１配列
およびγ２配列に基づくＦｃ融合物は、マウスにおいて同様に振舞うが、γ２配
列に基づくＦｃ融合物は、ヒトにおいてより優れた薬物動態を示し得る。

【００６２】別の実施形態において、ＤＮＡ配列は、選択カセットと標的タンパク質との間
に挿入されたタンパク質分解性切断部位をコードする。切断部位は、コードされ
た融合タンパク質のタンパク質分解性切断を提供し、従って、標的タンパク質か
らＦｃドメインを分離する。本明細書中で用いられる場合、「タンパク質分解性
切断部位」は、タンパク質分解酵素または他のタンパク質分解性因子によって優
先的に切断されるアミノ酸配列を意味することが理解される。有用なタンパク質
分解性切断部位は、トリプシン、プラスミンまたはエンテロキナーゼＫのような
タンパク質分解酵素によって認識されるアミノ酸配列を含む。多くの切断部位／
切断因子対が公知である。例えば、米国特許第５，７２６，０４４号（この開示
は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。

【００６３】本明細書中に開示される実施例において、高レベルのＦｃ−レプチン融合タン
パク質が産生された。最初のクローンは、約５０μｇ／ｍＬのＦｃ−レプチンを
産生した。このＦｃ−ｒレプチンを、プロテインＡクロマトグラフィーによって
容易に均質に精製し得る。発現レベルを、しばしばサブクローニングによって数
倍に増加し得る。さらに、Ｆｃ−レプチン融合タンパク質は、切断され得、さら
に精製（例えば、アフィニティ精製によって）され得る。上述のように、レプチ
ンがＦｃ融合分子として発現される場合、高レベルの発現が得られ、おそらくは
Ｆｃ部分はキャリアとして働くので、Ｃ末端においてポリペプチドを正確に維持
しそして有効に分泌するように補助する。さらに、Ｆｃ領域はグリコシル化され
、そして生理的ｐＨで高度に荷電され、従って、Ｆｃ領域は、疎水性タンパク質
を可溶化することを補助し得る。

【００６４】高レベルな発現に加え、レプチン融合タンパク質は、それらのより大きな分子
サイズに一部起因して、レプチン単体に比べて長い血清半減期を示した。例えば
、マウスＦｃ−マウスレプチンは、マウスにおいて、マウスレプチンについての
１８分に比べて、８．８時間の循環半減期を有する（以下の実施例１４を参照の
こと）。約１６ｋＤの分子量を有するレプチンは、腎臓での濾過によって効率よ
く清澄化するに十分小さい。逆に、Ｆｃ−レプチン融合タンパク質は、約９０ｋ
Ｄの分子量を有する。なぜなら、２つのレプチン部分が各々免疫グロブリンＦｃ
領域に結合するからである。ここで、Ｆｃ領域は、互いに共有結合する。このよ
うな二量体構造は、レプチンレセプター（この配列は、２つのリガンド結合ドメ
インを含むことを示唆する）に対して、より高い結合親和性を示すべきである（
Ｔａｒｔａｇｌｉａら（１９９５）ＣＥＬＬ８３：１２６３）。レプチン活性
がレセプター媒介性であるようであるので、レプチン融合タンパク質は、レプチ
ン自体よりも潜在的により有効である。

【００６５】さらに、多くのタンパク質リガンドは、二量体としてそれらのレセプターに結
合することが公知である。レプチンが二量体タンパク質リガンドのクラスに属す
る場合、レプチン上の免疫グロブリンＦｃ領域によって課される物理的制限は、
二量体化を分子内プロセスにし、従って、二量体のために平衡をシフトし、そし
てそのレセプターに対する結合を増強する。システイン残基はまた、標準的な組
換えＤＮＡ技術によって、適切な場所で、この単量体に対して導入されて、共有
結合性ジスフィルド結合形成を通じてこの二量体を安定化し得る。

【００６６】本発明の融合タンパク質は、いくつかの重要な臨床的利点を提供する。ｏｂ／
ｏｂマウスモデルにおいて示されるように、ｍｕＦｃ−ｍｕレプチンの形態での
、０．１ｍｇ／ｋｇ／日のマウスレプチンの腹腔内注射または皮下注射は、５〜
２０ｍｇ／ｋｇ／日の細菌的に産生されたレプチンと比較する場合、体重におい
て匹敵する減少を達成するに十分であった（Ｐｅｌｌｅｙｍｏｕｎｔｅｒら（１
９９５）ＳＣＩＥＮＣＥ２６９：５４０；Ｈａｌｌａｓら（１９９５）ＳＣＩ
ＥＮＣＥ２６９：５４３；Ｃｈｅｂａｂら（１９９６）ＮＡＴＵＲＥＧＥＮ
ＥＴＩＣＳ１２：３１８；Ｍｏｕｎｚｉｈら（１９９７）ＥＮＤＯＣＲＩＮＯ
ＬＯＧＹ１３８：１１９０）。０．２５ｍｇ／ｋｇの用量が使用された場合、
注射頻度は、週に３回まで下げられ得た。さらに、０．２５ｍｇ／ｋｇのｍｕＦ
ｃ−ｍｕレプチンで毎日４ヶ月以上にわたって注射されるｏｂ／ｏｂマウスは、
検出可能な副作用を有さずに、まだ都合よく処置に応答した。確かに、このマウ
スは、食欲の減退ならびに産熱および移動活性の増加を伴って、非常に健康であ
り続けた。これらの結果を考慮して、本発明のＦｃ−レプチンの種々の構造的コ
ンフォメーションを構築する能力は、ネイティブの抗肥満症タンパク質を超える
改善された効力を示し得る分子を提供する。

【００６７】少なくとも約５０グラムの最初の体重を有するｏｂ／ｏｂマウスへ、約０．２
５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で５日間の注射によって投与される場合、本発明の融合
タンパク質は、最初の体重の約１０％（約５グラム）、より好ましくは、約１２
％（約６グラム）またはさらにより好ましくは、約１５％（約７．５グラム）の
喪失を誘導する。より好ましくは、少なくとも約５０グラムの最初の体重を有す
るｏｂ／ｏｂマウスへ、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日の用量で５日間の注射によって
投与される場合、本発明の融合タンパク質は、最初の体重の約１０％（約５グラ
ム）、より好ましくは、約１２％（約６グラム）またはさらにより好ましくは、
約１５％（約７．５グラム）の喪失を誘導する。このような投薬は、好ましくは
、体重の１０〜２０％減少を生じる。

【００６８】本発明の別の実施形態は、種々の構造的コンフォメーションを有する構築物（
例えば、二価構築物または多価構築物、二量体構築物または多量体構築物、およ
びこれらの組み合わせ）を提供する。本発明の分子のこのような機能的コンフォ
メーションは、動物モデルにおいて調査されるべきレプチンおよび他の抗肥満症
タンパク質の相乗効果を可能にする。

【００６９】本発明はまた、Ｆｃ融合タンパク質のような非ヒト種のレプチンの産生のため
の方法を提供する。非ヒトレプチン融合タンパク質は、レプチンの前臨床的研究
のために有用である。なぜなら、タンパク質薬物の有効性の研究および毒性の研
究は、ヒトにおける試験の前に、動物モデル系において実施されなければならな
いからである。特定の状況下で、ヒトタンパク質は、マウスモデルにおいて働か
ないかもしれない。なぜなら、このタンパク質は、免疫応答を誘起し得るか、お
よび／または、異なる薬物動態（それによってこの試験結果を歪める）を示し得
るからである。従って、特定の状況下で、等価のマウスタンパク質は、マウスモ
デルにおける試験のための、ヒトタンパク質についてのよりよい代理であり得る
。

【００７０】本発明は、肥満症および関連する状態およびそれらの原因を、このような状態
を有する哺乳動物への本発明のＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の投与によって
処置する方法を提供する。関連する状態は、糖尿病、高血圧、心疾患、癌および
関連する障害を含み得るが、これらに限定されない。神経内分泌応答の調節にお
けるレプチンによって果たされる広い役割において（ＦｒｅｉｄｍａｎおよびＨ
ａｌａａｓ（１９９８）ＮＡＴＵＲＥ３９５：７６３）、本発明はまた、レプ
チンの投与によって緩和される状態の処置のための方法を提供する。これらの方
法は、肥満症に直接関連してもよいしまたは関連しなくてもよい状態を有する哺
乳動物に、有効量の本発明の組成物を投与する工程を包含する。

【００７１】本発明のタンパク質は、治療剤として有用なだけでなく、当業者は、これらの
タンパク質が診断的使用のための抗体の産生に有用であることを認識する。同様
に、例えば、ベクターまたはこのような使用のための他の送達系におけるＤＮＡ
またはＲＮＡの適切な投与は、本発明の使用方法に包含される。さらに、本発明
の構築物は、哺乳動物における美容目的のために体重を制御するために有用であ
る。美容目的は、哺乳動物の体重を制御して肉体の外観を改善するように努める
。哺乳動物は必ずしも肥満であるとは限らない。このような美容の使用は、本発
明の一部を形成する。さらに、他の哺乳動物（例えば、ウシおよびブタ）由来の
Ｆｃ−レプチンの使用は、やせた動物を食用に飼育するために有用である。

【００７２】Ｆｃ−レプチン融合タンパク質が血液脳関門を越えて視床下部におけるレセプ
ターに到達し得るかどうかは公知ではない。Ｆｃ−レプチン融合タンパク質が血
液脳関門を越えない場合、抗肥満症薬剤としてのこの優れた効力は、作用の新た
な機構を示唆するか、または脳の外にレプチンレセプターが存在することを示唆
する。免疫グロブリンＦｃ領域を有する融合タンパク質として、Ｆｃ−レプチン
融合タンパク質は、非常に好都合な組織分布、および臨床的効力を達成するため
のわずかに異なる作用様式を有し得、そしてさらに、長い血清半減期および投与
され得る高用量の可溶性タンパク質を特に考慮して、レプチン耐性を克服し得る
。マウスにおける皮下注射からのデータは、ヒトにおける筋肉内注射が等しく成
功するべきであることを示唆する。鼻腔スプレー、吸入調製物、皮膚パッチまた
は点眼薬としてＦｃ−レプチン融合タンパク質を投与することもまた、望ましく
あり得る。Ｆｃ−レプチン融合タンパク質が吸入調製物として投与される場合、
この融合タンパク質は、この融合タンパク質を処方するために有用である。その
結果、この融合タンパク質は、肺上皮を越えるトランスサイトーシスを受け得る
小粒子内に凝集される。

【００７３】本発明のＤＮＡ構築物（または遺伝子構築物）はまた、遺伝子治療プロトコー
ルの一部として使用され、レプチンまたはその融合タンパク質構築物をコードす
る核酸を送達し得る。本発明は、レプチンの機能を再構成または補充するために
、特定の細胞型における、レプチンまたはその融合タンパク質構築物のインビボ
でのトランスフェクションおよび発現のための発現ベクターを特徴とする。レプ
チンの構築物またはその融合タンパク質構築物の発現は、任意の生物学的に有効
なキャリア（例えば、レプチン遺伝子またはその融合タンパク質構築物を、イン
ビボで細胞に効果的に送達し得る任意の処方物または組成物）において投与され
得る。アプローチは、ウイルスベクター（組換えレトロウイルス、アデノウイル
ス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルス１型、または組換え細菌
プラスミドまたは真核生物プラスミドを含む）中への被験体の遺伝子の挿入を含
む。

【００７４】本発明の組成物は任意の適切な手段によって、直接的に（例えば、注射による
ような局所的、組織位置への移植または局所投与）あるいは全身的に（例えば、
非経口または経口で）動物に提供され得ることが考慮される。組成物が非経口的
に投与される場合（例えば、静脈内、皮下、眼科的、腹腔内、筋肉内、口腔内、
経直腸、経膣、眼窩内、脳内、頭蓋内、脊髄内、心室内、髄膜内、くも膜内、莢
膜内、鼻腔内またはエアロゾルによる投与）、好ましくは、組成物は、水溶性ま
たは生理的適合性の液体懸濁物または溶液の一部を含む。従って、キャリアまた
はビヒクルは、生理的に受容可能である。その結果、患者への所望の組成物の送
達に加えて、さもなくば、患者の電解質および／または容量バランスに悪影響し
ない。従って、薬剤のための液体媒体は、正常の生理的な生理食塩水を含み得る
。

【００７５】本発明の融合タンパク質の投与あたりの好ましい投薬量は、５０ｎｇ／ｍ²〜
１ｇ／ｍ²の範囲内、より好ましくは、５μｇ／ｍ²〜２００ｍｇ／ｍ²、最も好
ましくは、１００μｇ／ｍ²〜１０ｍｇ／ｍ²である。本発明の融合タンパク質を
コードする核酸の投与あたりの好ましい投薬量は、１μｇ／ｍ²〜１００ｍｇ／
ｍ²の範囲内、より好ましくは、２０μｇ／ｍ²〜１０ｍｇ／ｍ²、最も好ましく
は、４００μｇ／ｍ²〜４ｍｇ／ｍ²である。しかし、投与の最適な様式、および
投与量は、十分当業者のレベル内で慣用的な実験によって決定され得る。

【００７６】本発明はさらに、以下の限定されない実施例によって示される。

【００７７】（実施例）（実施例１．ｍｕＦｃ−ｍｕレプチンの発現）ｍＲＮＡのサンプルを、正常Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脂肪細胞から調製し、ｍ
ＲＮＡを、逆転写酵素を用いて逆転写した。得られたｃＤＮＡをポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）の鋳型に用いて、マウスレプチンｃＤＮＡをクローニングし、
そしてｍｕＦｃ−ｍｕレプチン融合タンパク質としての発現のために適合させた
。順方向プライマーは、

【００７８】

【化２】であり、ここで、ＴＡＡＡが引き続く配列ＣＣＣＧＧＧ（ＸｍａＩ制限部位）は
免疫グロブリン重鎖のカルボキシ末端をコードする。太字の配列は、マウスレプ
チンのＮ末端をコードする。逆方向プライマーは、５’ＣＴＣＧＡＧＴＣＡ
ＧＣＡＴＴＣＡＧＧＧＣＴＡＡＣＡＴＣ（配列番号１０）で、これ
は翻訳ＳＴＯＰコドン（アンチコドン、ＴＣＡ）を有するレプチンのＣ末端配列
をコードし、そしてこれはＸｈｏＩ部位（ＣＴＣＧＡＧ）が後に続く。得られた
４５０塩基対のＰＣＲ産物をクローニングし、そして配列決定した。配列分析は
、産物が発現に適合される（すなわち、その５’末端にＸｍａＩ部位およびその
３’末端にＸｈｏＩ部位）成熟マウスレプチンをコードすることを確認した。

【００７９】発現ベクターｐｄＣｓ−ｍｕＦｃ−ｍｕレプチンを、以下のように構築した。
次いで、マウスレプチンｃＤＮＡを含むＸｍａＩ−ＸｈｏＩ制限フラグメントを
、Ｌｏら（ＰＲＯＴＥＩＮＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（１９９８）１１：４９５
）に従って、ｐｄＣｓ−ｍｕＦｃベクターのＸｍａＩ−ＸｈｏＩフラグメントに
連結した。ｍｕＦｃは、マウス免疫グロブリンγ２ａのマウスＦｃフラグメント
である。得られたベクター、ｐｄＣｓ−ｍｕＦｃ−ｍｕレプチンを使用して、ｍ
ｕＦｃ−ｍｕレプチンの発現のために哺乳動物細胞にトランスフェクトした。

【００８０】（実施例２．トランスフェクトおよびタンパク質の発現）一過性のトランスフェクトのために、リン酸カルシウムを用いるプラスミドＤ
ＮＡの同時沈澱（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」，ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ）によって、または製造業者の手引きに従ってＬｉｐ
ｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いるリポフェクションによって、プラスミド
をヒト腎臓２９３細胞に導入した。

【００８１】安定にトランスフェクトしたクローンを得るために、プラスミドＤＮＡをマウ
スミエローマＮＳ／０細胞に、エレクトロポーレーションによって導入した。Ｎ
Ｓ／０細胞を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよびペニシリン／
ストレプトマイシンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地中で増殖
させた。約５×１０⁶の細胞をＰＢＳで一度洗浄し、そして０．５ｍｌのＰＢＳ
中に再懸濁した。次いで、１０μｇの直線化プラスミドＤＮＡを、ＧｅｎｅＰ
ｕｌｓｅｒＣｕｖｅｔｔｅ（０．４ｃｍの電極ギャップ、ＢｉｏＲａｄ）中で
、氷上にて１０分間細胞と共にインキュベートした。０．２５Ｖおよび５００μ
Ｆの設定でＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）
を使用して、エレクトロポーレーションを実施した。細胞を１０分間氷上で回復
させ、その後、細胞を増殖培地中に再懸濁し、次いで、２つの９６ウェルプレー
ト上にプレートした。安定にトランスフェクトされたクローンを、トランスフェ
クト２日後に導入された１００ｎＭメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下にお
ける増殖によって選択した。細胞に３日ごと、２〜３回以上培地を与え、そして
ＭＴＸ耐性クローンは２〜３週間で現れた。クローンからの上清を、抗Ｆｃ−Ｅ
ＬＩＳＡによってアッセイして、高いプロデューサーを同定した。高いプロデュ
ーサークローンを単離して、１００ｎＭＭＴＸを含む増殖培地中に増殖させた
。

【００８２】ゲル電気泳動による慣用的特徴付けについて、馴化培地中のＦｃ融合タンパク
質を、ＰｒｏｔｅｉｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、Ｃａｍｂ
ｒｉｄｇｅ、ＭＡ）上に捕獲して、次いで、２−メルカプトエタノールを含むか
または含まないタンパク質サンプル緩衝液中での煮沸によって溶出した。ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分画の後、タンパ
ク質バンドをＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色によって可視化した。ｍｕＦｃ−ｍｕレプ
チンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して約５０ｋＤの見かけの分子量を有した。

【００８３】精製について、融合タンパク質をＰｒｏｔｅｉｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｅに
結合し、続いてリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄（ｐＨ３
）および１５０ｍＭＮａＣｌ）中に溶出した。次いで、０．１容量の２ＭＴ
ｒｉｓ塩酸（ｐＨ８）で溶出物を直ちに中和した。

【００８４】（実施例３．ＥＬＩＳＡ手順）ＥＬＩＳＡを使用して、ＭＴＸ耐性クローンの上清および他の試験サンプルに
おけるタンパク質産物の濃度を決定した。ヒトＦｃ含有タンパク質およびマウス
Ｆｃ含有タンパク質の量を、それぞれ抗ｈｕＦｃＥＬＩＳＡおよび抗ｍｕＦｃ
ＥＬＩＳＡによって決定した。

【００８５】抗ｈｕＦｃＥＬＩＳＡを、以下に詳細に記載する：（Ａ．プレートのコーティング）ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中に５μｇ／ｍＬで、９６ウェルプレート（Ｎ
ｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏｐｌａｔｅＭａｘｉｓｏｒｐ）に１００μＬ／ウェル
で、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＧｏａｔａｎｔｉ−ＨｕｍａｎＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ
）（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ、ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ、ＰＡ）でコートした。コートしたプレートを覆い
、そして４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ中に０．０
５％Ｔｗｅｅｎ（Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄し、そしてＰＢＳ中に１％
ＢＳＡ／１％ヤギ血清（ウェル当たり２００μＬ）でブロッキングした。３７
℃で２時間のブロッキング緩衝液でのインキュベートの後、プレートをＰＢＳ中
に０．０５％Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、紙タオル上で軽くたたいて乾燥した。

【００８６】（Ｂ．試験サンプルおよび二次抗体とのインキュベート）試験サンプルを、ＰＢＳ中に１％ＢＳＡ／１％ヤギ血清／０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎを含むサンプル緩衝液で適切な濃度に希釈した。既知の濃度のキメラ抗
体（ヒトＦｃを有する）を用いて、標準曲線を調製した。標準曲線を調製するた
めに、連続希釈をサンプル緩衝液で行い、１２５ｎｇ／ｍＬ〜３．９ｎｇ／ｍＬ
の範囲の標準曲線を得る。希釈サンプルおよび標準をプレートに添加し（１００
μＬ／ウェル）そしてプレートを３７℃で２時間インキュベートした。インキュ
ベート後、ＰＢＳ中に０．０５％Ｔｗｅｅｎで８回、プレートを洗浄した。次
いで、各ウェルに１００μＬの二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ヒ
トＩｇＧ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、サンプル緩衝
液で約１：１２０，０００に希釈した）を添加した。二次抗体の正確な希釈を、
ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧの各ロットに対して決定しなければならない。３７℃で
２時間のインキュベート後、ＰＢＳ中に０．０５％Ｔｗｅｅｎで８回、プレー
トを洗浄した。

【００８７】（Ｃ．発色）基質溶液を１００μＬ／ウェルでプレートに添加した。この基質溶液を、３０
ｍｇのＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド、１錠）を１５ｍＬの
（新たに添加した０．０３％Ｈ₂Ｏ₂を含んでいた）０．０２５Ｍクエン酸／
０．０５ＭＮａ₂ＨＰＯ₄緩衝液（ｐＨ５）に溶解することにより調製した。色
素を、遮光して室温で３０分間発色させた。発色時間は、コーティングしたプレ
ート、二次抗体などのロット間の可変性に依存して、変化しやすい。標準曲線で
の発色を観察して、反応を停止する時間を決定する。反応を、１ウェルあたり１
００μＬの４ＮＨ₂ＳＯ₄を添加することにより停止した。このプレートを、プ
レートリーダーで読みとり、このプレートリーダーを、４９０ｎｍおよび６５０
ｎｍの両方で設定し、そして４９０ｎｍのＯＤから６５０ｎｍのバックグラウン
ドＯＤを差し引くようにプログラムする。

【００８８】抗ｍｕＦｃＥＬＩＳＡについての手順は、ＥＬＩＳＡプレートが、ＰＢＳ中
５μｇ／ｍＬおよび１００μＬ／ウェルのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩ
ｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）でコーテ
ィングされており；そして二次抗体が西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ヤギ
抗ｍｕＩｇＧ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｓｓｏｃ．
，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）であり、１：５０００希釈で使用している以外
は、同様であった。

【００８９】（実施例４．ｈｕＦｃ−ｈｕレプチンの発現）ヒト脂肪細胞Ｑｕｉｃｋ−ＣｌｏｎｅｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌ
ｏＡｌｔｏ，ＣＡ）をＰＣＲの鋳型として用いて、ｈｕＦｃ−ｈｕレプチン融
合タンパク質として発現するためのヒトレプチンｃＤＮＡをクローニングし、そ
して適合させた。正方向プライマーは、

【００９０】

【化３】（配列番号１１）であった。ここで、配列

【００９１】

【化４】（配列番号１２）は、免疫グロブリン重鎖のカルボキシ末端をコードし、続いて
配列（太字）はレプチンの成熟Ｎ末端をコードする。ＣＣＣＧＧＧ配列は、
サイレント変異により導入されたＸｍａＩ制限部位である（Ｌｏら（１９９８）
ＰＲＯＴＥＩＮＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ１１：４９５）。逆方向プライマー
は、

【００９２】

【化５】（配列番号１３）であった。この配列は、翻訳停止コドン（アンチコドンＴＣＡ
）を有するレプチンのカルボキシ末端のアンチセンス配列をコードする。そして
このコドンは、ＸｈｏＩ部位（ＣＴＣＧＡＧ）の前にある。得られた４５０塩基
対ＰＣＲ産物をクローニングし、そして配列決定した。配列分析により、成熟ヒ
トレプチンをコードする産物が、発現のために適合された（すなわち、その５’
末端でＸｍａＩ部位およびその３’末端でＸｈｏＩを有する）ことを確認した。

【００９３】発現ベクターｐｄＣｓ−ｈｕＦｃ−ｈｕレプチンを、以下のとおりに構築した
。ヒトレプチンｃＤＮＡを含むＸｍａＩ−ＸｈｏＩ制限フラグメントを、Ｌｏら
（ＰＲＯＴＥＩＮＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（１９９８）１１：４９５）に従っ
てｐｄＣｓ−ｈｕＦｃベクターのＸｍａＩ−ＸｈｏＩフラグメントに連結した。
ｈｕＦｃは、ヒト免疫グロブリンγ１のヒトＦｃフラグメントである。得られた
ベクターｐｄＣｓ−ｈｕＦｃ−ｈｕレプチンを用いて、ｈｕＦｃ−ｈｕレプチン
を発現するために哺乳動物細胞にトランスフェクトした。

【００９４】（実施例５．ｍｕレプチン−ｍｕＦｃおよびｍｕレプチン−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−
リンカー−ｍｕＦｃについての発現ベクターの構築）マウスレプチンｃＤＮＡを、ＰＣＲによりｍｕレプチン−ｍｕＦｃ融合タンパ
ク質として発現するために適合させた。正方向プライマー

【００９５】

【化６】（配列番号１４）には、マウスレプチン（太字の配列）の成熟Ｎ末端をコードす
るｃＤＮＡ配列をシグナルペプチドをコードするＤＮＡに連結するためのＡｆｌ
ＩＩ（ＣＴＴＡＡＧ）部位を導入した。逆方向プライマー

【００９６】

【化７】（配列番号１５）には、停止コドンなしのマウスレプチンのカルボキシ末端をコ
ードする配列（太字のアンチセンス配列）の直ぐ下流にＥｃｏＲＶ部位を導入し
た。ＥｃｏＲＶ部位は、以下で議論するように、マウスレプチンをマウスＦｃへ
インフレームで融合するためのリンカーアダプターとして働いた。得られた４５
０塩基対ＰＣＲ産物をクローニングし、そして完全に配列決定した。次いで、成
熟マウスレプチンをコードするＡｆｌＩＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを、ｐｄＣ
ｓ−ｍｕレプチン−ｍｕＦｃ発現ベクターの構築のために使用した。

【００９７】成熟マウスレプチンをコードするＡｆｌＩＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントと、免
疫グロブリン軽鎖のシグナルペプチドをコードするＸｂａＩ−ＡｆｌＩＩフラグ
メントとの連結産物（Ｌｏら（１９９８）ＰＲＯＴＥＩＮＥＮＧＩＮＥＥＲＩ
ＮＧ１１：４９５）を、サブクローニングした。得られたＸｂａＩ−ＥｃｏＲ
Ｖフラグメントは、シグナルペプチド、次いで、停止コドンなしの成熟マウスレ
プチンをコードする。

【００９８】ＥｃｏＲＶ部位をｍｕＦｃＤＮＡの５’末端に適合させるために、マウスＦ
ｃをコードするＡｆｌＩＩ−ＸｈｏＩフラグメント（Ｌｏら（１９９８）ＰＲＯ
ＴＥＩＮＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ１１：４９５）と、以下のリンカー−アダ
プターとの連結産物を、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩクローニングベクターにサブクロ
ーニングした。

【００９９】

【化８】前述のリンカー−アダプターは、ＥｃｏＲＩおよびＡｆｌＩＩ付着末端を含み、
そしてＥｃｏＲＶ部位（ＧＡＴＡＴＣ）もまた含む。サブクローニング後、停止
コドンありのｍｕＦｃフラグメントをコードするＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩを単離し
た。次いで、このフラグメントを、シグナルペプチドおよび成熟マウスレプチン
（上記）およびＸｂａＩ−ＸｈｏＩ消化したｐｄＣｓベクターフラグメントをコ
ードするＸｂａＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを用いて連結した。得られた発現プ
ラスミドは、ｐｄＣｓ−ｍｕレプチン−ｍｕＦｃと指定され、哺乳動物細胞のト
ランスフェクションのために用いた。

【０１００】ｐｄＣｓ−ｍｕレプチン−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−リンカー−ｍｕＦｃの構築のため
に、ｐｄＣｓ−ｍｕレプチン−ｍｕＦｃＤＮＡを独特のＥｃｏＲＶ部位で直鎖
化し、そして以下の非リン酸化リンカー：

【０１０１】

【化９】を連結によって挿入した。

【０１０２】正確な構築を、正確なリンカー配列が正確な配向で確実に挿入されるように、
ＤＮＡ配列決定によって確認した。得られたベクターｐｄＣｓ−ｍｕレプチン−
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−リンカー−ｍｕＦｃを、哺乳動物細胞のトランスフェクション
のために使用した。

【０１０３】（実施例６．ｍｕレプチン−ｍｕＦｃおよびｍｕレプチン−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−
リンカー−ｍｕＦｃの発現レベルの減少）レプチンのＣ末端システイン残基がシステイン−１１７との分子内ジスルフィ
ド結合に関与するので、これを、レプチンが、レプチン−Ｆｃ融合タンパク質と
して作製される場合に、タンパク質フォールディングおよびその後の分泌に問題
を提起し得る。これが実際にそのような場合であるか否かを試験するために、ｍ
ｕレプチン−ｍｕＦｃおよびｍｕレプチン−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー−ｍｕＦｃ
についての発現ベクターを、実施例５に記載のように構築した。後者の構築物は
、レプチンについてのより多くの自由度によりジスルフィド結合が形成され、そ
して正しくフォールディングされるように、レプチンとＦｃとの間に置かれたグ
リシン残基およびセリン残基が豊富な可撓性リンカーをコードする。２９３細胞
における一時的な発現を抗ｍｕＦｃＥＬＩＳＡおよび抗ｍｕＦｃ抗体（西洋ワ
サビペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗ｍｕＩｇＧ、Ｆｃγ、ＪａｃｋｓｏｎＩ
ｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから）および抗ｍｕレプチン抗体（ビオチン化抗マ
ウスレプチンポリクローナル抗体、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏ
ｌｉｓ，ＭＮから）の両方を用いたウェスタンブロット分析により分析した。非
常に低い発現レベルは、各構築物の上清中で検出された。総細胞溶解物の分析は
、ｍｕレプチン−ｍｕＦｃおよびｍｕレプチン−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー−ｍｕ
Ｆｃの大部分が、細胞内に存在することを示した。安定なＮＳ／０クローンもま
た、単離した。ｍｕレプチン−ｍｕＦｃ（リンカーありまたはなしで）の発現レ
ベルは、ｍｕＦｃ−ｍｕレプチンの多くて約１０％の発現レベルであった。

【０１０４】さらに、その後の研究により、レプチン−Ｆｃ融合タンパク質が、Ｆｃ−レプ
チン融合タンパク質（図６を参照のこと）ほどインビボで活性ではないことが示
唆される。ｏｂ／ｏｂマウスに、レプチン−Ｆｃを０．２５ｍｇ／ｋｇ／日で腹
腔内注射した場合、有意な体重減損は観察されなかった。Ｆｃ−レプチンおよび
レプチン−Ｆｃが、同じ部分を含み、各ポリペプチド鎖中でその部分の順番のみ
が異なるので、Ｆｃ−レプチンが、レプチン−Ｆｃよりも有効であることは驚く
べきことである。

【０１０５】（実施例７．ｍｕＦｃ−ｍｕレプチンの腹腔内（ＩＰ）注射によるｏｂ／ｏｂ
マウスの処置）５〜６週齡のＣ５７ＢＬ／６Ｊｏｂ／ｏｂ^IJマウス（このマウスは、肥満遺
伝子変異についてのホモ接合体である（ｏｂ／ｏｂマウス））を、Ｊａｃｋｓｏ
ｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＢａｒｒＨａｒｂｏｒ，ＭＥから購入した。
１群につき２匹のマウスに、ｍｕＦｃ−ｍｕレプチンまたはＰＢＳのみのいずれ
かを与えた。ｍｕＦｃ−ｍｕレプチンをＰＢＳに溶解し、そして毎日（最初の１
２日間は毎日；そしてその後は、月曜日から金曜日のみ）腹腔内注射により投与
した。注射したレプチンの量は、マウスの体重１ｋｇあたり０．２５ｍｇのレプ
チンに標準化した。コントロール群には、ＰＢＳのみを与えた。全てのマウスは
自由給餌であり、そして体重を注射の前に毎日測定した。

【０１０６】４ヶ月間にわたり、コントロール群（図３中、四角）は、体重の４０％という
一定の増加（５０ｇから７０ｇへ）を有した。毎日ｍｕＦｃ−ｍｕレプチンの腹
腔内注射を受けた群は、最初の１ヶ月間にわたり、体重の４５％が減少し（５０
．５ｇから２８ｇまで）、その後は、約２７〜３１ｇで体重が安定した（図３中
、菱形）。マウスは、週末にわたっては処置を受けなかったので、体重は、月曜
日までに３０ｇを超えて増加したが、毎日の処置のために、金曜日までには約２
７〜２８ｇへの体重の一定の減少が引き起こされた。図３に示したように、ｍｕ
Ｆｃ−ｍｕレプチンは、４ヶ月間にわたり有効であることが示された。

【０１０７】処置の最初の２週間の間、飼料摂取は、検出限界未満であったことに注意のこ
と。３〜４週間後に、約３０ｇまで体重が減少し、そして脂肪組織が明らかに激
減したとき、マウスは、マウス１匹あたり平均約３ｇ／日の飼料を消費した。こ
のことは、Ｍｏｕｎｚｉｈら（Ｍｏｕｎｚｉｈら（１９９７）ＥＮＤＯＣＲＩＮ
ＯＬＯＧＹ１３８：１１９０）の結果と一致した。このことは、２０ｍｇ／ｋ
ｇのレプチン処理を受けたｏｂ／ｏｂマウスの飼料消費が、４５日目に約２．６
〜３．２ｇに回復したことを示した。

【０１０８】（実施例８．ｍｕＦｃ−ｍｕレプチンの皮下（ＳＣ）注射によるｏｂ／ｏｂマ
ウスの処置）ｍｕＦｃ−ｍｕレプチンの皮下注射は、ｏｂ／ｏｂマウスの体重減少において
腹腔内注射と同じくらい有効であることを見いだした。５〜６週齡のｏｂ／ｏｂ
マウス（１群につき３匹のマウス）に、毎日（月曜日から金曜日のみ）ＳＣ注射
によりｍｕＦｃ−ｍｕレプチンを処置した。注射したレプチンの量は、マウスの
体重１ｋｇあたり０．２５ｍｇまたは０．１ｍｇのレプチンに標準化した。全て
のマウスは自由給餌であり、そして体重を注射の前に毎日測定した。１７日後に
、０．１ｍｇおよび０．２５ｍｇレプチン／ｋｇを受けたマウスは、それぞれ、
１４％および２２％の体重減少を有したが、一方ＰＢＳを受けたコントロール群
は、１５％の体重増加を有した。ＳＣ注射を受けたマウスにおける飼料摂取の減
少は、等用量のＩＰ注射を受けたマウスのものと類似していた。

【０１０９】（実施例９．ｍｕＦｃ−ｍｕレプチンの静脈内（ＩＶ）注射によるｏｂ／ｏｂ
マウスの処置）ｍｕＦｃ−ｍｕレプチンの静脈内（ＩＶ）注射は、ｏｂ／ｏｂマウスの体重減
少において等しく有効であることを見いだした。ｏｂ／ｏｂマウス（１群あたり
２匹のマウス）に、１ｋｇあたり０．２５ｍｇもしくは１ｍｇのレプチンでｍｕ
Ｆｃ−ｍｕレプチン、またはＰＢＳのＩＶ注射を毎日処置した。全てのマウスは
自由給餌であり、そして体重を注射の前に毎日測定した。処置を５日後に中止し
たが、体重は毎日記録し続けた。図４に示すように、ｍｕＦｃ−ｍｕレプチンと
しての０．２５ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇのレプチンでの処置（それぞれ、
三角および丸）は、それぞれ、次の４８時間および７２時間に体重減少を生じた
。これらの結果は、ｍｕＦｃ−ｍｕレプチンが、体重減少に必要な、高く、頻繁な
レプチン用量に基づくと、マウスレプチンよりはるかに長い循環半減期を有する
ことを示唆する。

【０１１０】（実施例１０．週に３回または４日に１回のｍｕＦｃ−ｍｕレプチンを用いた
ｏｂ／ｏｂマウスの処置）図５は、ｏｂ／ｏｂマウスの体重に対する異なる投薬スケジュールの効果を示
す。具体的には、３匹のｏｂ／ｏｂマウスの群（黒菱形）に、０．２５ｍｇ／ｋ
ｇのマウスレプチンを、ｍｕＦｃ−ｍｕレプチンの形態でＳＣ注射によりＡ点ま
で月曜日から金曜日まで毎日与えた；Ａ点からＢ点までは、注射の頻度を月曜日
と金曜日のみに減少させた；その後、注射の頻度を週３回（月曜日、水曜日およ
び金曜日）に増加させた。別の群（これもまた、３匹のｏｂ／ｏｂマウスからな
る）（四角）に、０．１ｍｇ／ｋｇのマウスレプチンを、ｍｕＦｃ−ｍｕレプチ
ンの形態でＳＣ注射によりＣ点まで月曜日から金曜日まで毎日与えた；Ｃ点から
Ｄ点までは、注射の頻度を週３回（月曜日、水曜日および金曜日）に減少させた
；しかし、Ｄ点の後、投薬を４日に１回、１ｍｇ／ｋｇに増加した。３匹のｏｂ
／ｏｂマウスのコントロール群（三角）に、月曜日から金曜日までＰＢＳを毎日
与えた。全てのマウスは自由給餌であり、そして体重を、毎日注射の前に測定し
た。

【０１１１】図５に示すように、１週間に３回（月曜日、水曜日および金曜日）、０．２５
ｍｇ／ｋｇのｍｕＦｃ−ｍｕレプチンのＳＣ注射は、９週間にわたり約３６〜３
９ｇで体重を安定させることに有効であった。そして４日に１回、１ｍｇ／ｋｇ
のＳＣ注射は、４週間で５１ｇから３４ｇへの減少を生じた。その後、体重は、
３０〜３３ｇの間で安定した。１週間に３回、０．１ｍｇ／ｋｇの投薬スケジュ
ールは、体重の減少において有効ではなかった。これらの結果は、ｍｕＦｃ−ｍ
ｕレプチンの毎日の注射が、適切な用量で注射した場合の長期間の持続効果を考
えれば、不必要であることを示唆する。

【０１１２】（実施例１１．ｍｕＦｃ−ｍｕレプチンを用いた、痩せたマウスおよびｄｂ／
ｄｂマウスの処置）ｏｂ／ｏｂマウスと比較するために、正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、Ｃ５７Ｂ
Ｌ／ＫＳマウスおよびＢａｌｂ／Ｃマウス、ならびに糖尿病Ｃ５７ＢＬ／ＫＳ
ｄｂ／ｄｂマウス（全てＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒｒ
Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥから購入した）に全て、ＰＢＳ中のｍｕＦｃ−ｍｕレプチ
ンの腹腔内注射または皮下注射を毎日（月曜日から金曜日）与えた。注射したレ
プチンの量は、マウスの体重１ｋｇあたり０．２５ｍｇまたは１ｍｇのレプチン
に標準化した。表１に示すように、両方の投薬レベルにおけるｍｕＦｃ−ｍｕレ
プチンは、レプチンに対するレセプターを欠如するｄｂ／ｄｂマウスに対して効
果を有さなかった。正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、Ｃ５７ＢＬ／ＫＳマウスおよ
びＢａｌｂ／Ｃマウスに対しては、低用量が非常に適度な効果を有した。しかし
、高用量は、マウスの年齢とは独立して、１９日間にわたり、顕著な体重減少を
生じた（表１）。

【０１１３】

【表１】（実施例１２．ｈｕＦｃ−ｈｕレプチンの腹腔内（ＩＰ）注射によるｏｂ／ｏ
ｂマウスの処置）ｈｕＦｃ−ｈｕレプチンを、ＳＣの代わりにＩＰにより投与して、マウスの免
疫原性を減少させた。１匹のｏｂ／ｏｂマウスに、０．１ｍｇ／ｋｇのヒトレプ
チンをｈｕＦｃ−ｈｕレプチンの形態でＩＰ注射により毎日（最初の１７日間は
毎日、その後、月曜日から金曜日のみ）与えた。もう１匹のｏｂ／ｏｂマウスに
、より高用量の０．５ｍｇ／ｋｇを３３日目まで毎日（最初の１７日間は毎日、
その後、月曜日から金曜日のみ）与え、その後、注射の頻度を、週に３回（月曜
日、水曜日および金曜日）まで減少させた。コントロールｏｂ／ｏｂマウスには
、ＰＢＳを毎日（最初の１７日間は毎日、その後、月曜日から金曜日のみ）与え
た。全てのマウスは自由給餌であり、そして体重を注射の前に毎日測定した。

【０１１４】図６は、ｈｕＦｃ−ｈｕレプチンが、ｏｂ／ｏｂマウスの体重の減少において
ｍｕＦｃ−ｍｕレプチンと同程度に有効であったことを示す。２匹のより老齢の
ｏｂ／ｏｂマウスの別の群に、毎日（最初の１０日間は毎日、その後月曜日から
金曜日のみ）、０．２５ｍｇ／ｋｇの中間用量を与えた。それらの体重は、２３
日間で６５ｇから３１ｇへ減少し（−５１．４％）、その後、体重は、月曜日で
約３１ｇと金曜日で約２６ｇの間で変動した（データは示さず）。処置のほぼ２
ヶ月後、ｈｕＦｃ−ｈｕレプチンは、その効果を維持し、そしてヒトタンパク質
に対して発生し得る免疫学的応答により有害な影響を受けないようであったこと
が注目に値する。

【０１１５】この実験をより大きなマウス群（ｎ＝８）を用いて反復された。さらに、ｏｂ
／ｏｂマウスを、Ｆｃ−レプチンを用いて１５ヶ月間にわたり処置した。その結
果、マウスの体重は、２０〜３０ｇの範囲で維持された。この期間にわたり、マ
ウスは、明らかな有害な副作用を受けなかった。

【０１１６】さらなる実験によってもまた、Ｆｃ−レプチンの腹腔内注射、皮下注射、およ
び静脈内注射による毎日の投与は全て、同様の結果を生じたことが示された。従
って、注射経路は、ｏｂ／ｏｂマウスにおいてＦｃ−レプチンのインビボ活性を
定量する場合は、重要ではないようである。

【０１１７】（実施例１３．ｍｕＦｃ−ｍｕレプチンの腹腔内（ＩＰ）注射によるｏｂ／ｏ
ｂマウスにおける不妊症の処置）ｏｂ／ｏｂの雄およびｏｂ／ｏｂの雌を、毎日、０．２５ｍｇ／ｋｇのＩＰ注
射によりｍｕＦｃ−ｍｕレプチンで処置した。各ｏｂ／ｏｂ雄を、最初に、１匹
のｏｂ／ｏｂ雌および１匹の正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌とともに飼育した。妊娠を
示す体重の急激な増加があった場合には、妊娠したマウスを隔離した。処置の約
２〜４週間後、６匹のｏｂ／ｏｂ雄は全て、その不妊欠損が較正され、そして正
常雌および／またはｏｂ／ｏｂ雌を妊娠させた。全ての正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ母
は出産し、そしてそれらの仔を正常に授乳した。６匹の妊娠ｏｂ／ｏｂ雌のうち
、４匹のみが正常に出産し、ホモ接合性のｏｂ／ｏｂ仔を導いた。しかし、いず
れの仔も、ｏｂ／ｏｂ母が正常に泌乳しなかったので、初日を超えては生存しな
かった。

【０１１８】（実施例１４．薬物動態学）ｍｕＦｃ−ｍｕレプチンおよびマウスレプチン（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍ
ｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の薬物動態を比較した。ｏｂ／ｏｂマウス（１群
につき６匹のマウス）に、尾静脈に注射した。注射したレプチンの量は、マウス
の体重１ｋｇにつき１ｍｇのレプチンに標準化した。血液を、注射後すぐ（０分
）に、そして注射の０．１時間後、０．５時間後、１時間後、２時間後、４時間
後、８時間後、２４時間後および４８時間後に眼窩採血により得た。血液サンプ
ルを、凝固を防ぐためにヘパリンを含有するチューブ中に採取した。細胞をＥｐ
ｐｅｎｄｏｒｆ高速微量遠心分離中で４分間遠心分離することにより除去した。
血漿中のマウスレプチンの濃度を、マウスレプチンイムノアッセイキット（Ｒ＆
ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて測定した。ｍｕ
Ｆｃ−ｍｕレプチンおよびマウスレプチンの循環半減期は、それぞれ８．８時間
および１８分であると決定された。

【０１１９】同様に、ｈｕＦｃ−ｈｕレプチンが、マウスにおいて１０時間を超える循環半
減期を有することを見いだした。

【０１２０】（実施例１５．ｈｕＦｃ（Ｎ→Ｑ変異）−ｈｕレプチンの構築）免疫グロブリンＦｃ領域のＮ結合型グリコシル化がｈｕＦｃ−ｈｕレプチンの
血清半減期に影響を及ぼすか否かを試験するために、組換えｈｕＦｃ−ｈｕレプ
チン変異体を生成し、この変異体では、Ｆｃ領域のグリコシル化部位におけるア
スパラギン残基がグルタミンに変異した。簡潔には、ｈｕＦｃ−ｈｕレプチン
ＤＮＡにおいてコードされるＮグリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ）の
みが、正方向プライマー５’ＧＡＧＣＡＧＴＡＣＣＡＡＡＧＴＡＣＧ
ＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣ（配列番号１６）および逆方向プラ
イマー５’ＡＣＧＧＴＡＣＧＴＡＣＴＴＴＧＧＴＡＣＴＧＣＴＣ
ＣＴＣＣＣＧＣＧ（配列番号１７）を用いてＰＣＲにより変異した。この
プライマーは、Ａｓｎ−Ｓｅｒ−ＴｈｒからＧｌｎ（ＣＡＡ）−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ
への変化をコードし、これは、もはやＮグリコシル化部位ではない。た。さらに
、プライマーには、ＡｓｎからＧｌｎ（ＮからＱ）への変異についてのスクリー
ニングを容易にするために、サイレント変異によりＳｎａＢＩ部位（ＴＡＣＧＴ
Ａ）を導入した。ＰＣＲによる変異誘発の後に、ＮからＱへの置換を含むＳａｃ
ＩＩ−ＳｍａＩフラグメントを、ＤＮＡ配列決定により確認し、次いで、これを
用いて、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃ−ｈｕレプチンにおける、対応するフラグメントを
置換し、ｐｄＣｓ−ｈｕＦｃ（Ｎ→Ｑ）−ｈｕレプチンを生じた。

【０１２１】発現プラスミドｐｄＣｓ−ｈｕＦｃ（Ｎ→Ｑ）−ｈｕレプチンを、実施例２に
記載のように、哺乳動物細胞にトランスフェクトした。次いで、精製ｈｕＦｃ（
Ｎ→Ｑ）−ｈｕレプチンタンパク質を、実施例１４に記載のように薬物動態学研
究のために使用した。直接比較するために、等量のｈｕＦｃ−ｈｕレプチン（１
ｋｇあたり１ｍｇのレプチン）またはｈｕＦｃ（Ｎ→Ｑ）−ｈｕレプチン（１ｋ
ｇあたり１ｍｇのレプチン）を並行してマウスに注射した。マウス血清中のｈｕ
Ｆｃ（Ｎ→Ｑ）−ｈｕレプチンおよびｈｕＦｃ−ｈｕレプチンの濃度を、実施例
３に記載のように、抗ｈｕＦｃＥＬＩＳＡにより測定した。図７に示した結果
は、ｈｕＦｃ−ｈｕレプチン（菱形）が、ｈｕＦｃ（Ｎ→Ｑ）−ｈｕレプチン（
四角）よりも長い循環半減期を有したことを示す。

【０１２２】（均等物）本発明は、本発明の趣旨または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定
の形態で具現化され得る。従って、前述の実施形態は、本明細書中に記載される
発明に限定されるのではなく、全て例示と見なされるべきである。従って、本発
明の範囲は、前述の説明ではなく添付の特許請求の範囲により示され、そして特
許請求の範囲の均等の意味および範囲内にある全ての変更は、それゆえに、均等
の範囲内に含まれると意図される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａ〜Ｅは、本発明に従って構築された例示的な抗肥満症融合タンパク質の
模式図である。この図は、それぞれ、図１Ａ、二量体Ｆｃ−レプチン；図１Ｂ、
二量体Ｆｃ−レプチン−ＧｌｙＳｅｒリンカーレプチンフラグメント；図１Ｃ、
二量体Ｆｃ−レプチン−ＧｌｙＳｅｒリンカー−レプチン；図１Ｄ、二量体レプ
チン−Ｆｃ；および図１Ｅ、二量体レプチン−ＧｌｙＳｅｒリンカー−Ｆｃを示
す。垂線は、各免疫グロブリン領域のヒンジ領域内に配置されたシステイン残基
（Ｃ）を連結する、任意のジスルフィド結合を示す。

【図２】図２は、０．２５ｍｇ／ｋｇのｍｕレプチン−リンカー−ｍｕＦｃ（菱形）、
０．２５ｍｇ／ｋｇのｍｕレプチン−ｍｕＦｃ（四角）、０．２５ｍｇ／ｋｇの
ｍｕＦｃ−Ｍｕレプチン（三角）、またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（
十字）のＩＰ注射を用いて処置されたｏｂ／ｏｂマウスの体重（グラム）を示す
グラフである。

【図３】図３は、０．２５ｍｇ／ｋｇのｍｕＦｃ−ｍｕレプチン（菱形）またはリン酸
緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（四角）のいずれかの、毎日（最初の１２日間毎日
、その後、月曜日〜金曜日のみ）の腹腔内（ＩＰ）注射を用いて処置されたｏｂ
／ｏｂマウスの体重を示すグラフである。

【図４】図４は、５日間、０．２５ｍｇ／ｋｇのｍｕＦｃ−ｍｕレプチン（三角）、１
．０ｍｇ／ｋｇのｍｕＦｃ−ｍｕレプチン（丸）またはＰＢＳ（四角）の毎日の
静脈内（ＩＶ）注射を用いて処置され、続いて処置されなかったｏｂ／ｏｂマウ
スの体重（グラム）を示すグラフである。

【図５】図５は、ｍｕＦｃ−ｍｕレプチン（０．２５ｍｇ／ｋｇ（菱形）；および０．
１ｍｇ／ｋｇ続いて１．０ｍｇ／ｋｇ（四角））またはＰＢＳ（三角）の皮下（
ＳＣ）注射を用いて処置されたｏｂ／ｏｂマウスの体重に対する異なる用量スケ
ジュールの効果を示すグラフである。

【図６】図６は、０．１ｍｇ／ｋｇのｈｕＦｃ−ｈｕレプチン（菱形）、０．５ｍｇ／
ｋｇのｈｕＦｃ−ｈｕレプチン（四角）、またはＰＢＳ（三角）の腹腔内（ＩＰ
）注射を用いて処置されたｏｂ／ｏｂマウスの体重（グラム）を示すグラフであ
る。

【図７】図７は、投与後の時間（時間）の関数として、グリコシル化ｈｕＦｃ−ｈｕレ
プチン（菱形）およびグリコシル化されていないｈｕＦｃ（Ｎ→Ｑ変異）−ｈｕ
レプチン（四角）の血清における循環レベルを示すグラフである。循環レベルは
、初期用量の割合として示される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 19/00 ４Ｈ０４５ 16/46 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 19/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｎ 5/10 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/00 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ジャン，ジンヤンアメリカ合衆国マサチューセッツ 02474，アーリントン，アパートメント９，ブラトルドライブ８ (72)発明者ギリス，ステファンディー．アメリカ合衆国マサチューセッツ 01741，カーライル，サンセットロード 159 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA01 CA04 CA12 DA02 GA11 HA03 HA17 4B064 AG01 AG26 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90 AB04 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA13 BA41 BA44 CA01 CA53 CA62 DB01 MA65 NA05 ZA702 ZC032 ZC612 4C087 AA02 BC83 NA05 ZA70 ZC03 ZC61 4H045 AA10 AA20 AA30 BA42 CA40 EA27 EA30 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】融合タンパク質をコードする核酸であって、該融合タンパク
質が、以下：（ａ）シグナル配列；（ｂ）免疫グロブリンＦｃ領域；および（ｃ）レプチンを含む標的タンパク質配列、を含む、核酸。
【請求項２】前記シグナル配列、前記免疫グロブリンＦｃ領域および前記
標的タンパク質配列が、５’から３’方向において、連続的にコードされる、請
求項１に記載の核酸。
【請求項３】前記シグナル配列、前記標的配列および前記免疫グロブリン
Ｆｃ領域が、５’から３’方向において、連続的にコードされる、請求項１に記
載の核酸。
【請求項４】前記免疫グロブリンＦｃ領域が、免疫グロブリンヒンジ領域
を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項５】前記免疫グロブリンＦｃ領域が、免疫グロブリンヒンジ領域
および免疫グロブリン定常重鎖ドメインを含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項６】前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ヒンジ領域およびＣＨ３ド
メインを含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項７】前記免疫グロブリンＦｃ領域が、少なくともＣＨ１ドメイン
を欠如する、請求項１に記載の核酸。
【請求項８】前記免疫グロブリンＦｃ領域が、少なくとも免疫グロブリン
γの一部をコードする、請求項１に記載の核酸。
【請求項９】哺乳動物細胞をトランスフェクトするための、複製可能な発
現ベクターであって、該ベクターが、請求項１に記載の核酸を含む、複製可能な
発現ベクター。
【請求項１０】請求項１に記載の核酸を収容する、哺乳動物細胞。
【請求項１１】融合タンパク質であって、該融合タンパク質が、免疫グロ
ブリンＦｃ領域、およびレプチンを含む標的タンパク質を含み、ここで、該融合
タンパク質が、少なくとも約５０グラムの初期体重を有するｏｂ／ｏｂマウスに
、１日当たり約０．２５ｍｇ／ｋｇの用量で５日間投与される場合に、１０％ま
たは５グラムの体重減少を誘導する、融合タンパク質。
【請求項１２】前記融合タンパク質が、１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇの
用量で投与される場合に、１０％または５グラムの体重減少を誘導する、請求項
１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】前記標的タンパク質が、配列番号２または配列番号４にお
いて示されるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】請求項１１に記載の融合タンパク質であって、ここで、レ
プチン前記標的タンパク質が、少なくとも２つのレプチン分子を含み、ここで、
該２つのレプチン分子が、ペプチドリンカーによって連結される、融合タンパク
質。
【請求項１５】前記標的タンパク質が、前記免疫グロブリンＦｃ領域のＮ
末端に連結される、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】前記標的タンパク質が、前記免疫グロブリンＦｃ領域のＣ
末端に連結される、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】請求項１１に記載の融合タンパク質であって、該融合タン
パク質が、前記免疫グロブリンＦｃ領域を、前記標的タンパク質に連結する、ペ
プチドリンカーをさらに含む、融合タンパク質。
【請求項１８】多量体タンパク質であって、該多量体タンパク質が、共有
結合を介して連結した、請求項１１に記載の少なくとも２つの融合タンパク質を
含む、多量体タンパク質。
【請求項１９】前記共有結合が、ジスルフィド結合である、請求項１８に
記載のタンパク質。
【請求項２０】多量体タンパク質であって、該多量体タンパク質が、共有
結合を介して連結した、請求項１１に記載の少なくとも２つの融合タンパク質を
含む、多量体タンパク質。
【請求項２１】前記共有結合が、ジスルフィド結合である、請求項２０に
記載のタンパク質。
【請求項２２】前記免疫グロブリンＦｃ領域が、少なくとも１つのグリコ
シル化部位をグリコシル化される、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】融合タンパク質を産生する方法であって、該方法が、以下
の工程：（ａ）請求項１０に記載の哺乳動物細胞を提供する工程；および（ｂ）該哺乳動物細胞を培養して、該融合タンパク質を産生する工程、を包含する、方法。
【請求項２４】請求項２３に記載の方法であって、該方法が、前記融合タ
ンパク質を収集する、さらなる工程を包含する、方法。
【請求項２５】請求項２３に記載の方法であって、該方法が、前記融合タ
ンパク質を精製する、さらなる工程を包含する、方法。
【請求項２６】請求項２３に記載の方法であって、該方法が、前記免疫グ
ロブリンＦｃ領域を、前記標的タンパク質から切断する、さらなる工程を包含す
る、方法。
【請求項２７】請求項２６に記載の方法であって、該方法が、前記標的タ
ンパク質を、内部切断部位で、哺乳動物細胞に対して内因性のタンパク質分解酵
素を用いて切断する、さらなる工程を包含する、方法。
【請求項２８】レプチンの投与によって緩和される状態を処置する方法で
あって、該方法が、請求項１に記載の核酸を、該状態を有する哺乳動物に投与す
る工程を包含する、方法。
【請求項２９】レプチンの投与によって緩和される状態を処置する方法で
あって、該方法が、請求項９に記載のベクターを、該状態を有する哺乳動物に投
与する工程を包含する、方法。
【請求項３０】レプチンの投与によって緩和される状態を処置する方法で
あって、該方法が、請求項１１に記載の融合タンパク質を、該状態を有する哺乳
動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３１】レプチンの投与によって緩和される状態を処置する方法で
あって、該方法が、請求項１８に記載の多量体タンパク質を、該状態を有する哺
乳動物に投与する工程を包含する、方法。