PT1966238E - Uso de hsp70 como um regulador de atividade enzimática - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO " USO DE HSP70 COMO UM REGULADOR DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA"

Este pedido é um pedido não provisório do pedido de patente DK PA 2008 00885 registado em 26 de Junho, 2008 Âmbito da invenção A presente invenção relaciona-se com o campo da modulação da atividade de enzima através da exploração da interação entre o acompanhante molecular Hsp70 e o fosfolipido lisossomal Bis(monoacilglicero)fosfato (BMP, também conhecido sob o nome LBPA). A interação Hsp70-BMP modula a atividade de enzimas interativas com BMP do compartimento lisossomal, e a presente invenção proporciona assim um meio para reverter a patologia das doenças de armazenamento lisossomal.

Antecedentes da invenção

Os chaperones moleculares são encontrados em todos os compartimentos de uma célula em que os rearranjos conformacionais de proteinas ocorrem, e embora a sintese proteica seja a maior fonte de péptidos sem dobragem na célula, um desafio para a célula através de alta temperatura ou outro estimulo que pode tornar as proteinas estruturalmente lábeis, e portanto, sujeitas a desdobramento e agregação, é encarada com uma resposta celular especifica envolvendo a produção de proteinas protetoras. Esta resposta é um fenómeno observado em todos os tipos de células variando desde procariotas a eucariotas e é referida como uma resposta a choque térmico ou a stresse. As proteínas induzidas por esta resposta são conhecidas como as proteínas de choque térmico (HSPs), das quais existem várias famílias. 2

Um primeiro exemplo de uma família de chaperones são as proteínas Hsp70. Esta família foi recentemente implicada em outros aspetos de homeostase celular para além de servir como um acompanhante - mais marcadamente através das suas características anti-apoptóticas, as suas funções na imunidade, e a aparente dependência das células cancerígenas na regulação para cima de Hsp70. Mais ainda, a Hsp70 pode desempenhar um papel na salvaguarda da integridade lisossomal. No entanto, o mecanismo molecular portanto manteve-se incerto. As doenças de armazenamento lisossomal são um grupo raro de doenças, caracterizado pela acumulação de substâncias no compartimento lisossomal e resultando na desestabilização deste, com um efeito devastador resultante para os indivíduos afetados. As substâncias acumulam-se no compartimento lisossomal devido a deficiências nas enzimas envolvidas no seu catabolismo.

Até ao presente, não existe qualquer tratamento para a maioria das doenças de armazenamento lisossomal. A causa subjacente deste grupo de doenças é a incapacidade das enzimas lipossomas específicas para catabolizar eficientemente substâncias lisosomais específicas tais como lípidos. Portanto o uso de terapia de substituição de enzima (TSE), fornecendo a um doente a proteína recombinante, tem sido usada para um subconjunto destas doenças, incluindo doença de Gaucher e Fabry. Porém, TSE é uma forma muito dispendiosa de terapia a qual pode limitar o seu uso em algumas áreas, e também é eficiente somente através de tipo específico de doença qual a proteína recombinante foi produzida. A presente invenção tem como objetivo fornecer novos meios para tratar os distúrbios de armazenamento lisosomais.

Sumário da Invenção 3

Na presente invenção, a base molecular para a contribuição do Hsp70 na estabilidade da membrana lisossomal é divulgada fornecendo um entendimento da base molecular para a associação entre Hsp70 e as membranas celulares - em particular membranas plasmática e lisossomal.

Sabe-se da literatura que Hsp70 pode desempenhar um papel na salvaguarda da integridade lisossomal. No entanto, o mecanismo molecular permanece pouco claro. Adicionalmente, a questão quanto ao facto de este atributo ser especifico para a maioria dos Hsp70 indutiveis por stresse (HspAlA/Al B - chamado de Hsp70 ao longo de todo este estudo) ou se outros membros da familia Hsp70 poderiam ter a mesma caracteristica, não tinha sido também abordada.

Estas questões não respondidas levaram a que um dos maiores objetivos desta invenção, que foi investigar a base molecular do efeito protetor do lisossoma do Hsp70. Para este fim, um método para produção de Hsp70 recombinante e mutantes destas foi estabelecido, como sendo um protocolo de fracionamento subcelular baseado em ultracentrifugação de gradiente iodixanol. Um ensaio para a avaliação direta da integridade da membrana lisossomal foi estabelecido com base na permeabilização dos lisossomas induzida por foto oxidação, o qual permitiu uma abordagem microscópica em tempo real para avaliar o efeito de Hsp70 e outros componentes em relação à sua capacidade tanto para sintetizar como para proteger as membranas lisosomais. A interação de Hsp70 recombinante e mutante com vários lipidos foi investigada em sistemas in vitro incluindo medições da dispersão de luz do lipossoma a 90°, deslocação de fluorescência do triptofano e ressonância plasmónica de superfície (BIAcore). A criação de um modelo conceptual para a interação Hsp70-BMP foi auxiliada pela modelação de 4 superfície electrostática in silico do Hsp70. Para verificar a relevância in vivo da interação lipídica testemunhada nos sistemas in vitro, a interação BMP-Hsp70 foi atingida em relação a ambos os componentes. Para mostrar adicionalmente a exequibilidade de exploração deste mecanismo, o modo de morte celular induzida por administração de cisplatina foi caracterizado, e Hsp70 lisossomal foi atingido nestes dois sistemas de morte celular em cancro assim como em linhas de células não transformadas.

Com vista a direcionar a base molecular para a contribuição de Hsp70 para a estabilidade da membrana lisossomal, os investigadores pensaram estabelecer um sistema que possa eliminar a influência de Hsp70 citosólico, i.e. foi necessário apontar o Hsp70 diretamente para os lisossomas. Imagens de microscopia eletrónica de Nylandsted et al. mostraram que Hsp70 pode estar presente dentro dos lisossomas, e foi portanto decidido estabelecer um método para a produção de Hsp70 recombinante humano (rHsp70) e espera-se explorar a maquinaria endocítica como um passo de libertação de rHsp70 diretamente para os lisossomas. Os presentes inventores devem por este meio ultrapassar a necessidade de adicionar sinais de ordenação lisosomais ao Hsp70, potencialmente destruindo a função e evitando complicações que possam surgir devido a sobre expressão. Uma abordagem endocítica deverá adicionalmente permitir a titulação das quantidades de rHsp70 o mecanismo e numa perspetiva mais ampla abrir possibilidades para estudar o mecanismo de captação do Hsp70 extracelular.

Tendo estabelecido um método para a produção de Hsp70, foi então marcado com o fluoróforo Alexa Fluor 488 (Hsp70-AF488) para validar a sua endocitose. Imagem confocal 5 revelou que o rHsp7 0 pode de facto ser dirigido para os lisossomas por esta via. Com vista a avaliar o impacto na estabilidade da membrana lisossomal, os investigadores estabeleceram depois um método para quantificar a permeabilização da membrana lisossomal ao nivel de lisossomas únicos e utilizaram este método para avaliar o efeito do rHsp70 sujeito a endocitose. Estes métodos formaram a base para os Exemplos 1 e 2, nos quais os investigadores mostram que a Hsp70 aumenta a sobrevivência celular por estabilização dos lisossomas através de uma ligação de alta afinidade dependente de pH ao fosfolipido aniónico endolisossomal bis(monoacil-glicero)fosfato (BMP). 0 dominio de ATPase carregado positivamente do Hsp70 é responsável pela ligação mas o dominio de ligação ao substrato é também requerido para estabilização efetiva dos lisossomas. Curiosamente, esta interação, e a proteção que oferece, dependem do triptofano 90, o qual está localizado na cunha carregada positivamente do dominio da ATPase. De modo importante, o efeito citoprotetor pode ser obtido por libertação endocitica do rHsp70 e revertido especialmente por administração extracelular de Anticorpos BMP ou Inibidores de Hsp70.

Adicionalmente a isto, os investigadores pensaram também em acoplar o mecanismo de proteção do Hsp70 das membranas lisosomais dos eventos de tumorogénese e morte celular programada. Os investigadores caracterizaram assim o programa da morte celular iniciado pela administração de um comum agente quimioterapêutico, cisplatina e verificaram ser este independente de caspases, mas caracterizado por libertação lisossomal de proteases. Hsp70T transgénico assim como sujeito a endocitose é capaz de aumentar a sobrevivência celular em face a desafio por cisplatina através da estabilização das membranas lisosomais. Curiosamente, os investigadores mostram que o próprio Hsp70 6 lisossomal visado ou o seu parceiro de interação lisossomal bis(monoacil-glicero)fosfato (BMP), sensibilizam linhas de células de próstata transformadas, mas não transformadas, em cisplatina as quais fornecem evidência experimental para explorar a interação de BMP-Hsp70 com um alvo farmacológico para a terapia do cancro.

Curiosamente o Hsp70-2, embora partilhando 86% de homologia de aminoácido com Hsp70, não foi capaz de proteger as membranas lisosomais diretamente. No entanto, a depleção de Hsp7 0-2 também resulta na permeabilização da membrana lisossomal e subsequente morte celular programada. Este efeito não depende de uma interação direta entre Hsp70-2 e o compartimento lisossomal, mas é antes orquestrado via desregulação para baixo de Fator de crescimento derivado de epitélio do cristalino (LEDGF), em resposta a Depleção do Hsp70-2.

Os métodos e resultados desta investigação são apresentados com mais pormenor na secção dos Exemplos.

Tendo elucidado aqui a base molecular do efeito citoprotetor de Hsp70 através de uma interação com o BMP lisossómico para promover a estabilização lisossómica, estas descobertas fornecem a base para os alvos terapêuticos das doenças de armazenamento lisossomal.

Foi agora demonstrado que surpreendentemente, fornecer Hsp70 recombinante a células reverte eficientemente a patologia das doenças de armazenamento lisossomal, como aqui mostrado para a doença de Niemann-Pick e doença de Farber. A presente invenção fornece portanto um método para tratar doenças de armazenamento lisossomal aumentado a 7 concentração intracelular e/ou a atividade de Hsp70 em individuos com necessidade dela, fornecendo Hsp70, ou um fragmento funcional ou uma variante deste. A presente invenção relaciona-se num aspeto com um agente bioativo capaz de aumentar a concentração intracelular e/ou a atividade de Hsp7 0 para uso como um medicamento ou para uso no tratamento de uma doença de armazenamento lisossómica.

Numa forma de realização, o referido agente bioativo é Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta. É também um aspeto da presente invenção fornecer um método para tratamento de uma doença de armazenamento lisossomal compreendendo administração do agente bioativo de acordo com a presente invenção a um individuo com necessidade disso.

Numa forma de realização, o referido tratamento é profilático, curativo ou melhorador.

Numa forma de realização, a referida doença de armazenamento lisossomal é selecionada a partir do grupo que consiste em Doença de Niemann-Pick, Doença de Farber, Doença de Krabbe, Doença de Fabry, Doença de Gaucher, Sialidose, Leucodistrofia metacrómica e deficiência de saponina.

Numa outra forma de realização, a referida doença de armazenamento lisossomal é caracterizada como tendo atividade enzimática residual da enzima defetiva envolvida na doença patológica. A presente invenção relaciona-se também com o tratamento de uma doença de armazenamento lisossomal compreendendo o agente bioativo de acordo com a presente invenção em combinação com pelo menos uma outra modalidade de tratamento.

Num outro aspeto, a presente invenção relaciona-se com Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, para uso como um medicamento.

Preferencialmente, Hsp70 ou o referido fragmento funcional ou variante desta formam um complexo covalente ou não-covalente com BMP.

Preferencialmente, BMP interage com uma saponina.

Preferencialmente, a referida saponina é selecionada a partir do grupo que consiste em saponina A, saposina B, saposina C, e saposina D.

Preferencialmente, a referida enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em esfingomielinase, esfingomielinase acidica, sialidase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, beta-galactosilceramidase, glucosilceramidase, e ceremidase ácida.

Preferencialmente a referida modulação da atividade enzimática é uma regulação para cima da atividade enzimática da referida enzima.

Num outro aspeto, a presente invenção respeita a Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, para uso como um medicamento. Preferencialmente, o referido Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, pode ser usado no tratamento, alivio, ou profilaxia de um distúrbio de 9 armazenamento lisossomal, tais como os distúrbios de Niemann-Pick, Gaucher, Farber, Krabbe, Fabry, e Sialidose.

Uma forma de realização da invenção respeita a um método para regulação para cima de uma atividade enzimática de uma enzima associada com um distúrbio de armazenamento lisossomal, tal como Niemann-Pick, Gaucher, Farber, Krabbe, Fabry, e Sialidose. Preferencialmente, o referido distúrbio de armazenamento lisossomal é Niamann-Pick.

Uma vez que os distúrbios de armazenamento lisossomal são causados por atividade enzimática insuficiente, é o objetivo da invenção aumentar a atividade enzimática com vista a aliviar ou curar o distúrbio.

Foi demonstrado que o Hsp70 interage com a BMP. Uma vez que a BMP atua como um cofator para várias outras proteinas, a interação entre Hsp70 e BMP pode modular a função dessas várias outras proteinas. Por exemplo, a BMP atua como um cofator para aSMase. Portanto, a interação entre Hsp70 e BMP pode aumentar a atividade de aSMase. Dado que o distúrbio de Niemann-Pick está associado com uma diminuição da atividade aSMase, o Hsp70 pode aliviar ou curar o distúrbio de Niemann-Pick através do aumento da atividade de aSMase. De modo similar, a BMP atua como um cofator para a saponina A, saponina, B, saponina C, e saponina D. Estas proteinas saponinas estão implicadas em outros distúrbios de armazenamento lisossomal, e portanto o Hsp70 pode aliviar ou curar outros distúrbios de armazenamento lisossomal aumentando a atividade da saponina ou de uma enzima associada com a referida saponina.

Numa forma de realização da invenção, o Hsp70 é administrado em conjunto com a terapia de substituição de enzima no tratamento de um distúrbio de armazenamento 10 lisossomal. Deste modo, a quantidade de enzima necessária pode ser significativamente reduzida devido ao efeito de ativação de enzima de Hsp70.

Definições e abreviaturas aSMase/ASM Esfingomielinase acidica ADD70: chamariz derivado de AIF para Hsp70 AIF: Fator de indução de apoptose AO: Laranja de acridina Apaf-1: Fator 1 de ativação de protease apoptótica Bag-1: Bcl-2 associada a atanogene-1 Bcl-2: linfoma célula B/leucemia 2 Bid: BH3 agonista de interação no domínio da morte BMP: Bis(monoacil-glicero)fosfato CARD: Dominio de recrutamento de Caspase Caspase: Protease específica de aspartato de cisteína CHI P : terminal carboxi de proteína de ligação a Hsp70 CytC: Citocromo C DD: Dominio de morte DED: Domínio efetor de morte dsRNA: RNA de cadeia dupla eHsp70: Hsp70 extracelular ER: Retículo endoplásmico TSE Terapia de substituição de enzima FADD: Domínio de morte associado a Fas HIP: Proteína de interação com Hsp70 HRP: Peroxidase de rábano HS: Stresse/choque térmico HSE: Elemento de choque térmico HSF: Fator de choque térmico Hsp: Proteína de choque térmico HspBPl: Proteína 1 de ligação a proteína de choque térmico IAP: Inibidor da proteína de apoptose iMEF Fibroblastos Embrionários de Murino imortalizado 11 JNK: c-jun quinase terminal NH2 LAMP-1/-2: Proteína -1/-2 de membrana associada a lisossoma LBPA: Ácido lisobisfosfatídico LEDGF: fator de crescimento derivado de epitélio do cristalino PML: Permeabilização da membrana lisossomal MIC-1: Citocina 1 inibidora de macrófagos MOMP: Permeabilização de membrana mitocondrial externa MPR Recetor de manose 6 fosfato MTT : brometo de 3-(4,5-Dimetil-2-tiazolil)-2,5- difenil-2H-tetrazólio NPD Doença de Niemann-Pick NPDA Doença de Niemann-Pick, tipo A NPDB Doença de Niemann-Pick, tipo B NPDC Doença de Niemann-Pick, tipo C NPDD Doença de Niemann-Pick, tipo D MCP: Morte celular programada PKC: Proteína quinase C POPC: Palmitoil-oleoil-fosfatidilcolina POPS : Palmitoil-oleoil-fosfatidilserina RNAi : RNA de interferência ROS : Espécies reativas de oxigénio SD: Desvio padrão siRNA: RNA de curta interferência

Smac/Diablo: Segundo ativador de caspases derivado de

mitocôndria tBid: Bid Truncado TNF: Fator de necrose do tumor TNFR: recetor TNF TRADD: Proteína de domínio de morte associada a TNFR TRAF: Fator associado a TNFR TRAF: 12

Distúrbio de armazenamento lisossomal (DAL): Os termos "distúrbio de armazenamento lisossomal" e "doença de armazenamento lisossomal" são usados como sinónimos.

Fragmento funcional de Hsp70: 0 termo "fragmento funcional de Hsp70" é para ser construído para significar qualquer fragmento de Hsp70 com uma desejada função. Em relação à modulação da atividade enzimática, um fragmento funcional é um fragmento capaz de modular a atividade enzimática. Em relação ao aumento da absorção de uma substância, um fragmento funcional de Hsp70 é um fragmento capaz de aumentar a absorção da referida substância. É desejável que o efeito quantitativo exato do fragmento funcional possa ser diferente do efeito do comprimento total da molécula. Em algumas situações, o fragmento funcional pode evidentemente ser mais eficaz que o comprimento total da molécula. Mais ainda, o uso de fragmentos em vez do comprimento total da molécula pode ser vantajoso dado o tamanho mais pequeno dos fragmentos.

Variante funcional de Hsp70: 0 termo "variante funcional de Hsp70" é para ser construído como significando qualquer variante de Hsp70 com a desejada função. Em relação à modulação da atividade enzimática, uma variante funcional é uma variante capaz de modular a atividade enzimática. Em relação a aumentar a absorção de uma substância, a variante funcional de Hsp70 é um fragmento capaz de aumentar a absorção da referida substância. É desejável que o efeito quantitativo exato da variante funcional possa ser diferente do efeito do comprimento total da molécula. Em algumas situações, uma variante funcional pode de facto ser mais eficaz que o comprimento total da molécula.

Um "Agente bioativo" (i. e., substância/agente biologicamente ativo) é qualquer agente, fármaco, composto, 13 composição de matéria ou mistura que fornece algum efeito farmacológico, muitas vezes benéfico, efeito que pode ser demonstrado in vivo ou in vitro. Como aqui usado, este termo inclui ainda qualquer substância fisiologicamente ou farmacologicamente ativa que produz um efeito sistémico localizado ou num indivíduo. Exemplos adicionais de agente bioativos incluem, mas não são limitados a, agentes compreendendo ou consistindo de um oligossacáridos, agentes compreendendo ou consistindo de um polissacárido, agentes compreendendo ou consistindo de um péptido opcionalmente glicosilado, agentes compreendendo ou consistindo de um polipéptido opcionalmente glicosilado, agentes compreendendo ou consistindo de um ácido nucleico, agentes compreendendo ou consistindo de um oligonucleótido, agentes compreendendo ou consistindo de um polinucleótido, agentes compreendendo ou consistindo de um lípido, agentes compreendendo ou consistindo de um ácido gordo, agentes compreendendo ou consistindo de um éster de ácido gordo e agentes compreendendo ou consistindo de metabolitos secundários. Podem ser quer profilaticamente, terapeuticamente, em conexão com tratamento de um indivíduo, tal como um humano ou qualquer outro animal. Como aqui usado, um agente bioativo é uma substância capaz de aumentar a concentração intracelular e/ou a atividade do Hsp7 0 .

Os termos "fármaco" ou "medicamento" como aqui usados incluem substâncias biologicamente, fisiologicamente, ou farmacologicamente ativas que atuam localmente ou sistemicamente no corpo humano ou animal.

Os termos "tratar", "tratamento" e "terapia" como aqui usado referem-se igualmente a terapia curativa, terapia profilática ou preventiva e terapia melhoradora ou paliativa. 0 termo inclui uma abordagem para obter 14 resultados fisiológicos benéficos ou desejados, que podem ser estabelecidos clinicamente. Para fins desta invenção, resultados clinicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, alivio de sintomas, diminuição da extensão da doença, situação estabilizada (i.e., não agravamento), atraso ou abrandamento da progressão ou do agravamento da situação/sintomas, melhoramento ou paliação da situação ou dos sintomas, e remissão (quer parcial quer total), tanto detetável como não detetável. 0 termo "paliação", e variações deste, como aqui usado, significa que a extensão e/ou manifestações indesejáveis de uma situação ou sintoma fisiológico são diminuídas e/ou em comparação com composições de não administração da presente invenção. A "efeito de tratamento" ou "efeito terapêutico" é manifestado se houver uma mudança na situação a ser tratada, como medido pelo critério constituindo a definição dos termos "tratar" e "tratamento." Há uma "mudança" na situação a ser tratada se houver pelo menos 5% de melhoria, preferencialmente 10% de melhoramento, mais preferencialmente pelo menos 25%, ainda mais preferencialmente pelo menos 50%, de modo a pelo menos 75%, e mais preferencialmente pelo menos 100% de melhoria. A mudança pode ser baseada nos melhoramentos na gravidade da situação tratada num indivíduo, ou numa diferença na frequência das situações de melhoria nas populações dos indivíduos com e sem tratamento com o agente bioativo, ou com o agente bioativo em combinação com uma da composição farmacêutica da presente invenção. "Quantidade farmacologicamente ativa", "quantidade farmaceuticamente ativa" ou "quantidade fisiologicamente eficaz de um "agente bioativo" e a quantidade de um agente ativo presente numa composição farmacêutica como aqui 15 descrito que é necessária para fornecer um nivel desejado do agente ativo na corrente sanguínea ou no local da ação (por exemplo os pulmões, o sistema gástrico, o sistema colorretal, próstata, etc.) num indivíduo a tratar para dar uma resposta fisiológica antecipada quando a composição é administrada. A quantidade precisa deve depender de numerosos fatores, por exemplo, do agente ativo, da atividade da composição, do dispositivo de libertação empregue, das características físicas da composição, do uso pretendido pelo doente (i.e. o número de doses administradas por dia), considerações do doente, e afins, e pode ser prontamente determinada por uma pessoa especialista na técnica, com base na informação aqui fornecida. Uma "quantidade eficiente" de um agente bioativo pode ser administrada numa só administração, ou através de administrações múltiplas de uma quantidade dessa quantidade total eficiente, preferencialmente ao longo do período de 24 horas. Pode ser determinada usando procedimentos clínicos padrão para determinar quantidades apropriadas e tempos de administração. É entendido que a "quantidade eficiente" pode ser o resultado de determinação empírica e/ou individualizada (caso-a-caso) por parte do profissional de saúde e/ou indivíduo a tratar.

Os termos "aumentar" e "melhorar" um efeito benéfico, e variações destes, como aqui usado, refere-se ao efeito terapêutico do agente bioativo contra o placebo, ou um aumento no efeito terapêutico de um estado da técnica do tratamento médico acima normalmente obtido quando a composição farmacêutica é administrada sem o agente bioativo desta invenção. "Um aumento nos efeitos terapêuticos" é manifestado quando há uma aceleração e/ou aumento na intensidade e/ou extensão dos efeitos terapêuticos obtidos como resultado da administração do(s) agente(s) bioativo(s). Inclui também a extensão da 16 longevidade dos benefícios terapêuticos. Pode também manifestar-se quando uma quantidade menor da composição farmacêutica é requerida para obter os mesmos benefícios e/ou efeitos quando é co-administrado como o(s) agente(s) bioativo(s) fornecidos pela presente invenção em comparação com a administração numa quantidade maior da composição farmacêutica na ausência do agente bioativo. 0 efeito de melhoramento preferencialmente, mas não necessariamente, resulta no tratamento de sintomas agudos para os quais a composição farmacêutica sozinha não é eficaz ou é menos eficaz terapeuticamente. A melhoria é atingida quando há pelo menos um aumento de 5% nos efeitos terapêuticos, tal como pelo menos 10% de aumento nos efeitos terapêuticos quando um agente bioativo da presente invenção é co-administrado com a composição farmacêutica em comparação com a administração da composição farmacêutica sozinha. Preferencialmente o aumento é pelo menos 25%, mais preferencialmente pelo menos 50%, ainda mais preferencialmente pelo menos 75%, o mais preferencialmente pelo menos 100%. "Co-administrar" ou "co-administração" de agente(s) bioativo(s), ou agente(s) bioativos e medicamentos do estado da arte, como aqui usado, refere-se à administração de um ou mais agente(s) bioativos da presente invenção, ou administração de um ou mais agentes bioativos da presente invenção e a composição farmacêutica do estado da arte dentro de um determinado período de tempo. 0 período de tempo é preferencialmente menos de 72 horas, tal como 48 horas, por exemplo menos de 24 horas, tal como menos de 12 horas, por exemplo menos de 6 horas, tal como menos de 3 horas. No entanto, estes termos significam também que o agente bioativo e a composição farmacêutica podem ser administrados em conjunto. 17 0 termo "Indivíduo" refere-se a vertebrados, em particular um membro de uma espécie de mamífero, preferencialmente primatas incluindo humanos. Numa forma de realização preferida, um indivíduo como aqui usado é um humano sendo, masculino ou feminino, de qualquer idade.

Um "indivíduo em necessidade deste" refere-se a um indivíduo que pode beneficiar com a presente invenção. Numa forma de realização, o referido indivíduo em necessidade disto é um indivíduo doente, em que a referida doença é uma doença de armazenamento lisossomal. 0 termo "nucleótido natural" ou "nucleótido" refere-se a qualquer dos quatro desoxirribonucleótidos, dA, dG, dT, e dC (constituintes de DNA), e os quatro ribonucleótidos, A, G, U, e C (constituintes de RNA) , como encontrados na natureza. Cada nucleótido natural compreende ou essencialmente consiste de uma porção açúcar (ribose ou desoxiribose), uma porção fosfato, e uma porção base natural/padrão. Nucleótidos naturais ligam aos nucleótidos complementares de acordo com regras bem conhecidas de emparelhamento de base (Watson e Crick), onde adenina (A) emparelha com timina (T) ou uracilo (U); e onde guanina (G) emparelha com citosina (C), em que os correspondentes pares de bases fazem parte das cadeias de nucleótidos antiparalelos complementares. 0 emparelhamento de bases resulta numa hibridação específica entre nucleótidos predeterminados e complementares. 0 emparelhamento de bases é a base pela qual as enzimas são capazes de catalisar a síntese de um oligonucleótido complementar ao oligonucleótido modelo. Nesta síntese, blocos de construção (normalmente os trifosfatos derivados ribo ou desoxiribo de A, T, U, C, ou G) são dirigidos para um oligonucleótido modelo para formar um oligonucleótido complementar com a sequência correta, complementar. 0 reconhecimento de uma 18 sequência de oligonucleótido pela sua sequência complementar é mediado pelas bases correspondentes e interatuantes que formam pares de bases. Na natureza, as interações especificas que conduzem ao emparelhamento de bases são governadas pelo tamanho das bases e o padrão das pontes de hidrogénio dadores e aceitadores das bases. Uma base de purina grande (A ou G) emparelha com uma base pirimidina pequena (T, U ou C) . Adicionalmente, o reconhecimento do par de base entre bases é influenciado pelas pontes de hidrogénio formadas entre as bases. Na geometria do par de bases Watson-Crick, um anel de seis membros (uma pirimidina em oligonucleótidos naturais) é justaposto com um sistema de anel composto de um anel com seis membros, fundido, e um anel com cinco membros (uma purina em oligonucleótidos naturais), com uma ponte de hidrogénio ligando dois átomos do anel, e ligações hidrogénio em cada lado juntando grupos funcionais anexados a cada um dos anéis, com grupos dadores emparelhados com grupos aceitadores.

Como aqui usado, "ácido nucleico" ou " molécula de ácido nucleico" referem-se a polinucleótidos, tal como ácido desoxiribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA), oligonucleótidos, fragmentos gerados pela reação de cadeia de polimerase (PCR), e fragmentos gerados por qualquer ligação, cisão, ação endonuclease, e podem ser compostos de monómeros que são nucleótidos que ocorrem naturalmente (tal como DNA e RNA), ou análogos de nucleótidos que ocorrem naturalmente (por exemplo formas alfa-enantioméricas de nucleótidos que ocorrem naturalmente), ou uma combinação de ambos. Nucleótidos modificados podem ter alterações em porções açúcar e/ou nas porções de base pirimidina ou purina. Modificações de açúcar incluem, por exemplo, substituição de um ou mais grupos hidroxilo com halogénios, grupos alquilo, aminas, e grupos azido, ou os açúcares 19 podem ser funcionalizados como éteres ou ésteres. Além disso, a porção de açúcar inteira pode ser substituída por estruturas estericamente e eletronicamente similares, tal como aza-açúcares e análogos carbociclicos de açúcar. Exemplos de modificações numa porção base incluem purinas e pirimidinas alquiladas, purinas ou pirimidinas aciladas, ou outros substitutos heterociclicos bem conhecidos. Monómeros de ácido nucleico podem ser ligados por ligações fosfodiéster ou análogos dessas ligações. Análogos de ligações fosfodiéster incluem fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato, e afins. 0 termo "molécula de ácido nucleico" inclui ainda por exemplo os assim chamados "ácidos nucleicos péptidos," os quais compreendem bases de ácido nucleico que ocorrem naturalmente ou modificados anexados a uma estrutura poliamida. Ácidos nucleicos podem também ser de cadeia simples ou cadeia dupla. 0 termo "complemento de uma molécula de ácido nucleico" refere-se a uma molécula de ácido nucleico com uma sequência de nucleótido complementar e orientação reversa como comparado com uma sequência nucleótido referência. Por exemplo, a sequência 5' ATGCACGGG 3' é complementar à 5' CCCGTGCAT 3'.

Uma "molécula de ácido nucleico isolada" é uma molécula de ácido nucleico que não é integrada no DNA genómico de um organismo. Por exemplo, uma molécula de DNA que codifica um fator de crescimento que foi separado a partir de DNA genómico de uma célula é uma molécula de DNA isolada. Outro exemplo de uma molécula de ácido nucleico isolada é uma molécula de ácido nucleico sintetizada quimicamente que não está integrada no genoma de um organismo. Uma molécula de ácido nucleico que foi isolada a partir de uma espécie 20 particular é mais pequena que a molécula de DNA completa de um cromossoma dessa espécie.

Uma "a construção da molécula de ácido nucleico " é uma molécula de ácido nucleico, tanto de cadeia simples ou dupla, que foi modificada através de intervenção humana para conter segmentos de ácido nucleico combinados e justapostos num arranjo que não existe na natureza. "DNA Linear" designa moléculas de DNA não circulares com terminações livres 5' e 3'. O DNA linear pode ser preparado a partir de moléculas de DNA circulares fechadas, tal como plasmideos, por digestão enzimática ou rutura fisica. "DNA complementar (cDNA)" é uma molécula de DNA de cadeia simples que é formada a partir de um modelo de mRNA através de enzima transcriptase reversa. Tipicamente, um primer complementar a porções de mRNA é empregue para a iniciação da transcrição reversa. Aqueles especialistas na técnica também usam o termo "cDNA" para referir uma molécula de DNA de cadeia dupla consistindo dessa molécula de DNA de cadeia simples e a sua cadeia de DNA complementar. O termo "cDNA" refere-se também a um clone de uma molécula de cDNA sintetizada a partir de um modelo de RNA. "DNA heterólogo" refere-se a uma molécula de DNA, ou uma população de moléculas de DNA, que não existem naturalmente dentro de uma dada célula hospedeira. Moléculas de DNA heterólogo de uma célula hospedeira particular podem conter DNA derivado da espécie de célula hospedeira (i.e., DNA endógeno) enquanto que o DNA hospedeiro é combinado com DNA não hospedeiro (i.e., DNA exógeno). Por exemplo, a molécula de DNA contendo um segmento de DNA não hospedeiro que codifica um polipéptido operacionalmente ligado a um segmento de DNA hospedeiro compreendendo um promotor de 21 transcrição é considerada como uma molécula de DNA heterólogo. Contrariamente, a molécula de DNA heterólogo pode compreender um gene endógeno operacionalmente ligado a um promotor exógeno. Como outra ilustração, uma molécula de DNA compreendendo um gene derivado de uma célula tipo selvagem á considerada como DNA heterólogo se essa molécula de DNA for introduzida numa célula mutante que não tem o gene do tipo selvagem.

Um "polipéptido" é um polimero de residuos de aminoácidos preferencialmente unidos exclusivamente pelas ligações peptidicas, quer produzidos naturalmente ou sinteticamente. Um polipéptido produzido pela expressão de uma molécula de DNA não hospedeira é um péptido ou polipéptido "heterólogo". 0 termo "polipéptido" como aqui usado engloba proteinas, péptidos e polipéptidos, em que os referidos proteínas, péptidos ou polipéptidos podem ou não ter sido pós-translacionalmente modificados. A modificação pós-translacional podem por exemplo ser fosforilação, metilação e glicosilação. 0 termo "expressão" refere-se à biossíntese de um gene ou um produto genético.

Para "hibridar" significa emparelhar cadeias de ácido nucleico a partir de diferentes origens; quer dizer, para formar pares de bases entre regiões complementares de duas cadeias de DNA que originalmente não estavam emparelhadas. 0 termo "hibridação sob condições restritas" é definido de acordo com Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press (1989), 1.101-1.104. Preferencialmente, hibridação sob condições restritas significa que após lavagem durante 1 h com SSC 1 vez e 0,1 % de SDS a 50 graus C, preferencialmente a 55 graus C, mais preferencialmente a 62 graus C e o mais 22 preferencialmente a 68 graus C, particularmente durante 1 h em 0,2 vezes SSC e 0,1% SDS a 50 graus C, preferencialmente a 55 graus C, mais preferencialmente a 62 graus C e o mais preferencialmente a 68 graus C, é observado um sinal de hibridação positiva.

Uma extensão de "Homologia completa" é definida como um jogo de emparelhamento de nucleótidos ao longo de uma sequência dos nucleótidos interatuantes; em RNA que ocorre naturalmente o emparelhamento de A com U e G com C.

Um "promotor" é uma sequência de nucleótido que dirige a transcrição de um gene estrutural. Tipicamente, um promotor está localizado na região de não codificação 5' de um gene, próximo do sitio de inicio transcricional de um gene estrutural. Elementos da sequência dentro dos promotores que funcionam na iniciação da transcrição são muitas vezes caracterizados pelas sequências de nucleótidos consenso. Se um promotor é um promotor indutivel, então a taxa de transcrição aumenta em resposta um agente de indução. Em contraste, a taxa de transcrição não é regulada por um agente de indução se e promotor é um promotor constitutivo. São conhecidos promotores repressiveis.

Um "elemento regulador" é uma sequência de nucleótidos que modula a atividade de um produtor. Por exemplo, um elemento regulador pode conter uma sequência de nucleótidos que se liga com fatores celulares permitindo a transcrição exclusivamente ou preferencialmente em células, tecidos, ou organelos particulares. Estes tipos de elementos reguladores estão normalmente associados com genes que são expressos num modo "célula-específico," "tecidos-específico," ou "organelo-específico". 23

Um "potenciador" é um tipo de elemento regulador que pode aumentar a eficiência de transcrição, independentemente da distância ou orientação do potenciador relativo ao sitio de inicio da transcrição.

Um "vetor de clonagem" é uma molécula de ácido nucleico, tal como um plasmideo, cosmideo, ou bacteriófago que tem a capacidade de se replicar autonomamente numa célula hospedeira. Vetores de clonagem tipicamente contêm um ou um pequeno número de sítios de reconhecimento de endonuclease de restrição que permitem a inserção de uma molécula de ácido nucleico num modo determinável sem perda de uma função biológica essencial do vetor, assim como as sequências de nucleótidos que codificam um gene marcador que são adequados para uso na identificação e seleção de células transformadas com o vetor de clonagem. Genes marcadores tipicamente incluem genes que fornecem resistência a tetraciclina ou ampicilina. sao

Um "vetor de expressão" é uma molécula de ácido nucleico que codifica um gene que é expresso numa célula hospedeira. Tipicamente, uns vetores de expressão compreendem um promotor de transcrição, um gene, e um terminador de transcrição. 0 gene de expressão é usualmente colocado sob o controlo de um promotor, e um tal gene é referido como "operacionalmente ligado a" o promotor. De modo similar, um elemento regulador e um promotor de núcleo são ligados operacionalmente se o elemento regulador modula a atividade do promotor de núcleo, vetores de simplificação chamados "vetores de transcrição" são somente capazes de serem transcritos mas não traduzidos: podem ser replicados numa célula alvo mas não expressos, ao contrário dos vetores de expressão. Vetores de transcrição são usados para amplificar a sua inserção.

Uma "hospedeira recombinante" é uma célula que contém uma molécula de ácido nucleico heteróloga, tal como um vetor de clonagem ou vetor de expressão.

Transfeção descreve a introdução de material estranho nas células eucarióticas. 0 termo 'transfeção' para métodos não virais é muito frequentemente usado em referência a células de mamifero, enquanto que o termo 'transformação' é preferido para descrever transferência de DNA não virai em bactérias e células eucarióticas não animais tais como fungos, algas e plantas. Tanto métodos quimicos como físicos podem ser empregues para transfetar células.

Um "polipéptido" é um polímero de resíduo de aminoácidos preferencialmente juntas exclusivamente pelas ligações peptídicas, quer produzido naturalmente ou sinteticamente. Um polipéptido produzido pela expressão de uma molécula de DNA não hospedeira é um péptido ou polipéptido "heterólogo". 0 termo "polipéptido" como aqui usado engloba proteínas, péptidos e polipéptidos, em que os referidos proteínas, péptidos ou polipéptidos podem ou não ter sido modificados pós-translacionalmente. A modificação pós-translacional pode por exemplo ser fosforilação, metilação e glucosilação.

Um "resíduo de aminoácido" pode ser um resíduo de aminoácido natural ou não natural ligado a ligações peptídicas ou a ligações diferente das ligações peptídicas. Os resíduos de aminoácidos podem ser na configuração D ou configuração L. Um resíduo de aminoácidos compreende uma parte terminal amino (NH2) e uma parte terminal carboxi (COOH) separada por uma parte central compreendendo um átomo do carbono, ou um cadeia de átomos do carbonos, pelo menos um dos quais compreende pelo menos uma cadeia lateral ou grupo funcional. NH2 refere-se ao grupo amina presente 25 na extremidade terminal amino de um aminoácido ou péptido, e COOH refere-se ao grupo carboxi presente na extremidade terminal carboxi de um aminoácido ou péptido. 0 termo genérico aminoácido compreende tanto aminoácidos naturais como não naturais. A nomenclatura padrão de aminácidos naturais conforme listado em J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969) e adotada em 37 C.F.R., secção 1.822(b)(2) pertence ao grupo de aminoácidos listados na Tabela laqui a seguir. Aminoácidos não naturais são aqueles não listados na Tabela 1. Exemplos de aminoácidos não naturais são aqueles listados por exemplo em 37 C.F.R. secção 1.822 (b) (4), todos os quais são aqui incorporados como referência. Também, resíduos de aminoácidos não naturais incluem, mas não são limitados a, resíduos de aminoácidos modificados, resíduo de aminoácidos L, e estereoisómeros ode resíduos de aminoácidos D.

Tabela 1. Aminoácidos naturais e seus respetivos códigos Símbolos Aminoácido Letra 1 Letra 3 Y Tyr tirosina G Gly glicina F Phe fenilalanina M Met metionina A Ala alanina S Ser serina I Ile isoleucina L Leu leucina T Thr treonina V Vai valina P Pro prolina K Lys lisina H His histidina 26 Símbolos Aminoácido Letra 1 Letra 3 Q Gin glutamina E Glu ácido glutâmico W Trp triptofano R Arg arginina D Asp ácido aspártico N Asn asparagina C Cys cisteína

Um "resíduo de aminoácido equivalente" refere-se a um resíduo de aminoácido capaz de substituir outro resíduo de aminoácido num polipéptido sem alterar substancialmente a estrutura e/ou funcionalidade do polipéptido. Aminoácidos equivalentes portanto têm propriedades similares tais como o tamanho da cadeia lateral, polaridade da cadeia lateral (polar ou não polar), hidrofobicidade (hidrofóbica ou hidrofílica) , pH (acídica, neutra ou básica) e organização das moléculas de carbono na cadeia lateral (aromáticas/alifáticas). Tais como, "resíduos de aminoácidos equivalentes" podem ser olhados como "substituições conservativas de aminoácido.

A classificação de aminoácidos equivalentes refere-se numa forma de realização às seguintes classes: 1) HRK, 2) DENQ, 3) C, 4) STPAG, 5) MILV e 6) FYW

Dentro do significado do termo "substituição de aminoácido equivalente" como aqui aplicado, um aminoácido pode ser substituído por outro, numa forma de realização, nos grupos de aminoácidos indicados aqui a seguir: 27 i) Aminoácidos com cadeias laterais polares (Asp, Glu, Lys, Arg, His, Asn, Gin, Ser, Thr, Tyr, e Cys,) ii) Aminoácidos com cadeias laterais não polares (Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro, e Met) iii) Aminoácidos com cadeias laterais alifáticas (Gly, Ala Vai, Leu, Ile) iv) Aminoácidos com cadeias laterais cíclicas (Phe, Tyr, Trp, His, Pro) v) Aminoácidos com cadeias laterais aromáticas (Phe, Tyr, Trp) vi) Aminoácidos com cadeias laterais acídicas (Asp, Glu) vii) Aminoácidos com cadeias laterais básicas (Lys, Arg, His) viii) Aminoácidos com cadeias laterais amida (Asn, Gin) ix) Aminoácidos com cadeias laterais hidróxi (Ser, Thr) x) Aminoácidos com cadeias laterais contendo enxofre (Cys, Met) , xi) Neutras, aminoácidos fracamente hidrofóbica (Pro, Ala, Gly, Ser, Thr) xii) Aminoácidos Hidrofílicos (Gin, Asn, Glu, Asp), e xiii) Aminoácidos Hidrofóbicos (Leu, Ile, Vai) A presente invenção relaciona-se também com variantes do Hsp70, ou fragmentos desta, em que as substituições foram desenhados por análise computacional que usa homologia de sequências para decidir se uma substituição afeta a função da proteína (por exemplo Pauline C. Ng e Steven Henikoff, Genome Research, Vol. 11, Capítulo 5, 863-874, Maio 2001).

Devido à imprecisão dos métodos analíticos padrão, pesos moleculares e comprimento dos polímeros são entendidos para serem valores aproximados. Quando esses valores são expressos como "cerca de" X ou "aproximadamente" X, o valor definido de X deve ser entendido para ser correcto em ± 20%, tal como ± 10%, por exemplo ± 5%. 28

Descrição dos desenhos

Figura 1

Os efeitos de Hsp70 na ligação aSMase a BMP e níveis e ceramida. (A) Ligação de 0,2 μΜ aSMase a lipossomas contendo BMP a pH 4,5 como uma função de Hsp7 0 pré ligado (experiência análoga ao Exemplo 1, ver materiais e métodos aqui para pormenores adicionais). Hsp70 foi deixado dissociar durante 10 min, por este meio atingindo uma menor assintota para dissociação antes da adição de aSMase). (B)

Microscopia confocal e quantificação dos niveis de ceramida ni tipo selvagem (WT) e Hsp70 transgénico (Hsp70-TG) iMEFs. A imunodeteção foi efetuada com um anticorpo monoclonal de rato contra ceramida (clone 15b4). A quantificação foi feita com base em micrografias de varrimento de laser a partir de 6 áreas pré-definidas, após as quais a quantificação foi feita num programa LSM Duo.

Figura 2 0 efeito de rHsp70 na atividade de esfingomielinase acidica em iMEF-WT (fibroblastos embriónicos de murino imortalizado, tipo selvagem). O rHsp70 foi administrado a células a 3nM, 30nM e 300nM, e a atividade de aSMase medida (A500 é uma medida da ceramida produzida que aumenta a turbidez). Células de controlo foram tratadas com BSA (albumina de soro bovino).

Figura 3

Atividade de SMase acidica em diferentes fibroblastos. NPDA: Doença de Niemann-Pick tipo A.

Figura 4

Esquema de hidrólise de esfingolípidos principal. A quebra exohidrolitica de esfingolípidos com pequenos grupos de 29 cabeça hidrofílica requerem cofatores não enzimáticos, ativadores de proteínas de esfingolípidos (SAPs ou saposinas). Tanto, as deficiências herdadas da enzima respetiva como a correspondente proteína ativadora causam armazenamento de lípido lisossomal e resultam na expressão de várias esfingolipidoses. Em Ferlintz et al., Chem. Phys. Lipids, (102) 35-43, 1999.

Figura 5 O Hsp70 lisossómico estabiliza membranas lisosomais. (a) Imagens confocais representativas de células U-2-OS incubadas com 300 nM de rHsp70-AF488 (verde) durante 24 h, fixadas em corante para membrana lisossomal integral de proteína-1 (LIMP-1; vermelho). Para a co-localização com outros organelos marcadores ver Fig. 9. (b) células U-2-OS foram incubadas com 300 nM rHsp70-AF488 durante 24 h antes da quantificação de rHsp70-AF488 em membranas (memb.) e supernadante (sup.) obtidas por ciclos repetidos congelamento/descongelamento e centrifugação da fração membrana leve (LMF). As análises de imunoblot da proteína 2 de membrana associada a lisossoma (LAMP-2) e catepsina B (Cat B) demonstram a validade do procedimento de fracionamento, (c) Imagens ainda representativas de células U-2-OS expostas a foto-oxidação (laranja de acridina e azul claro). A perda de integridade lisossómica é visualizada através da perda da vermelha e aumento da coloração verde. Células U-2-OS (d e e) foram incubadas com proteínas recombinantes indicadas (300 nM) durante 24 h, e analisadas quanto à integridade lisossómica depois da foto-oxidação. Quando indicado, as célula foram tratadas com siRNAs indicado durante 48 h antes da adição de proteínas recombinantes (e). Os valores representam médias ± SD para três (d) ou cinco (e) experiências independentes. Immunoblots representativos das proteínas indicadas das células U-2-OS deixadas por tratar ou tratadas com o 30 controlo ou Hsp70 siRNAs são mostradas à direita. Escala de barras: 20 μιτι (a e c) .

Figura 6

Uma interação dependente de pH entre Hsp70 e BMP estabiliza as membranas lisosomais. (a) Mudanças relativas em dispersão de luz a 90° no lipossoma após adição de rHsp70 (em aliquotas de 0,12 nmol) aos lipossomas contendo os lipidos indicados (x= 0,2) a pH 7,4 (esquerda) e pH 6,0 (direita). (b) as células U-2-OS foram deixadas por tratar

(-) ou incubadas com 50 μ9/ιη]1 anti-BMP ou controlo IgG durante 7 h antes da adição do veiculo (-) ou 300 nM rHsp70 durante 24 h, e analisadas quanto à integridade lisossómica após foto-oxidação, (c) células U-2-OS foram deixadas por tratar ou incubadas com 50 μρ/πΛ anti-BMP ou controlo IgG durante 7 h antes da adição do veiculo (-) ou 25 μΜ de cisplatina durante 24 h e analisadas quanto à morfologia da célula apoptótica seguindo a coloração de Hoechst 33342. (d) Interação de rHsp70 e seus mutantes com lipossomas POPC/BMP (XBMP=0,2) a pH 6,0 como medido pelas mudanças nos picos relativos de intensidade de fluorescência. As concentrações de proteina foram 0,36 μΜ (rHsp70), 0,5 μΜ (ΔΑΤΡ) e 0,35 μΜ (ΔΡΒΌ) (esquerda) ou 0,43 μΜ (direita), e lipossomas foram adicionados em aliquotas de 10 μΜ. (e) análise Lacre das interações entre rHsp70 (WT) do tipo selvagem e a sua deleção (ΔΑΤΡ e ΔΡΒΌ) e mutantes pontuais (W90F e W580F) com LUVs imobilizado a pH 4,5 (diâmetro médio: 100 nm; concentração de lipidos totais: 0,1 mM; composição: esfingomielina (X=0,1), fosfatidilcolina (x=0,5), colesterol (x= 0,2) e BMP (x= 0,2)) . Os lipossomas foram injetados até equilíbrio (100 s), e as concentrações indicadas (esquerda) ou 300 nM (direita) das proteínas recombinantes em tampão de acetato de sódio (50 mM, pH 4,5) 31 foram injetados durante 200 s a uma taxa de fluxo de 2 0 μΐ/min seguido de uma fase de dissociação durante 10 min. ARU é definido como a diferença entre o sinal de resposta medido após equilíbrio do lipossoma e equilíbrio proteina-lipossoma. (f e g) as células U-2-OS foram deixadas por tratar (Controlo) ou incubadas com proteínas recombinantes indicadas para Hsp70 (300 nM) durante 24 h, e analisadas quanto à integridade lisossómica após foto-oxidação (f), ou tratadas com veículo (barras brancas) ou 25 μΜ de cisplatina (Barras pretas) durante 24 h e analisadas quanto à apoptose como morfologia (g) . (h) modelos de superfície

Ribbon e Molecular do domínio ATPase do Hsp70. ATP (representação de superfície van der Waal) pode ser visualizado ligado na bolsa de ligação a ATP. Esferas verdes e púrpura indicam a superfície de van der Waals dos iões de Cálcio e Sódio coordenados, respetivamente. Indicação da parte do domínio carregada positivamente em baixo e a posição de W90. Os valores representam as médias ± SD para um mínimo de cinco experiências independentes (b, c, f e g) .

Figura 7

Hsp70 estimula a atividade ASM que por sua vez estabiliza os lisossomas. (a) Medição biacore da ligação de 200 nM rASM a lipossomas contendo BMP a pH 4,5 como função do rHsp70 pré-ligado. As experiências foram realizadas como descrito na legenda da fig. 6e com rASM adicionado durante 180 seg após 10 min da fase de dissociação de rHsp70 seguida ainda por uma fase de dissociação de 10 min. (b) atividade ASM nos lisados do tipo selvagem (WT) e Hsp70 transgénico (Hsp70) MEFs (painel da esquerda) e em MEFs WT incubadas com 300 nM de rHsp70 durante 24 ou 48h conforme indicado, (c e d) Viabilidade (Redução MTT; c) e atividade de catepsina citosólica (zFRase; d) em WT e Hsp70 iMEFs 32 tratadas com as concentrações indicadas de desipramina durante 3h. (e) Imagem das células isoladas vivas da perda de integridade lisossómica (foto-oxidação em WT e Hsp70 MEFs assim como Hsp70 MEFs incubadas durante 3h com 12,5 e 25 μΜ de Desipramine (painéis à esquerda e direita, respetivamente). Perda de vermelho (painel da esquerda) e aumento da fluorescência verde (painel da direita) foi continuamente medida para dar curvas cinéticas completas foram examinadas pr. Experiência das áreas pré-definidas), p<0,001 para Hsp70 vs. WT e Hsp70 + despramina vs. Hsp70. Todos os valores representam médias ± SD para um minimo de 3 experiências independentes.

Figura 8 rHsp70 estimula a atividade ASM, estabiliza os lisossomas e diminui o volume lisossómico nos fibroblastos NPDA. (a) Imagem da célula isolada viva da estabilidade lisossómica dos fibroblastos primários de um doente com NPDA analisadas como na Fig 3e, p<0,001. (b) a atividade ASM de fibroblastos NPDA deixados por tratar ou tratados com 300 nM de rHsp70 durante 48 h (painel da esquerda), ou com 150 nM rASM sozinho ou em combinação com 300 nM rHsp70 durante 24h (painel da direita) . Os valores de p foram calculados a partir da velocidade enzimática obtida (DA500/mg proteina/min). A imagem à direita demonstra a absorção endocitica de rASM (verde) e a sua localização com o compartimento lisossómico como visualizado pela co-coloração com vermelho Lisotracker. (c) Estabilidade lisossómica de fibroblastos NPDA deixados por tratar ou tratados durante 24 h com 300 nM de rHsp70, 150 nM de aSMase ou uma combinação de rHsp7 0 e aSMase foram analisadas como na Fig 3e. p<0,001 para todos os tratamentos em comparação com células não tratadas. (d)

Quantificação da área lisossomal das secções cruzadas 33 confocais de células nos fibroblastos NPDA deixadas por tratar ou tratadas durante 24 h com 300 nM BSA, 300 nM rHsp70, 150 nM rASM (150 nM) ou uma combinação de rHsp70 e rASM. A imagem à direita demonstra o efeito de rHsp70 (verde) no volume do compartimento lisossomal (vermelho) em fibroblastos NPDA. As setas branca indicam células com rHsp70 sujeitas a endocitose e compartimento lisossomal diminuído. Os valores representam médias ± SD para 3 experiências independentes. Escala de barras = 20 μΜ. UT = não tratadas.

Figura 9

Colocalização de rHspVO sujeito a endocitose-AF488 com lisossomas. Imagens confocais representativas de células U-2-OS incubadas com 300 nM de rHsp70-AF488 (verde) durante 24 h, fixadas e coradas para os seguintes organelos marcadores (vermelho): proteína-1 de membrana associada a lisossoma (LAMP-1; lisossomas), LAMP-2 (lisossomas), LBPA/BMP (6C4; compartimento endolisossomal) , cut c (mitocondria), SERCA (ER) e golgin-97 (Golgi). Escala de barras: 20 μιη (LAMP-1, LAMP-2 e BMP) ou 10 μιη (Cyt c, SERCA e Golgin-97).

Figura 10

Interação de rASM (aSMase recombinante) e BMP na presença de rHsp70. (a) interação de rASM com lipossomas aniónicos imobilizados (diâmetro médio é 100 nm, concentração de lípidos totais é 0,1 mM, e composição; 10mol% de esfingomielina, 50mol% de fosfatidilcolina, 20mol% de colesterol e 20mol% de BMP) a pH 4,5. Sinais de resposta subsequente medidos para a ligação dos lipossomas onde definidos como zero. (b) O efeito de rHsp70 préligado na ligação subsequente de rASM. Quantidades indicadas de rHsp70 foram incubadas com lipossomas aniónicos 34 imobilizados identicamente a (a). Após 10 min uma fase de dissociação de rHsp70de, 200nM de rASM foram adicionados durante 180 s seguido por 10 min de dissociação.

Figura 11

Efeito da pequena molécula indutora de Hsp70; Álcool benzílico em fibroblastos de doente de Niemann-Pick Tipo A (NPDA) . (A) Indução de Hsp7 0 em NPDA Gõtz por álcool benzilico num modo dependente de dose (expressão de proteína). (B)

Estabilidade aumentada de lisossomas NPDA Gõtz após tratamento de células NPDA Gõtz com 40 mM de Álcool benzílico. (C) Diminuição da patologia nas células NPDA Gõtz após tratamento com 40 mM de Álcool benzílico, como medido através da área transversal lisossomal (método mais pormenorizado no Exemplo 2).

Figura 12

Efeito de depleção aSMase na estabilidade lisossómica. RNAs de pequena interferência (siRNAs) visando Esfingomielinase acídica (si938, SÍ1257, sil340) e um controlo siRNA (mm) foram transfetados nas células U20S usando Oligofectamina (Invitrogen) de acordo com as indicações dos fabricante. Concentração de siRNAs: 50 nM. Após 72h horas foi confirmada a queda via RT-PCR (não mostrado) e as células analisadas quanto à estabilidade lisossómica via imagem de uma única célula viva do laranja de acridina mediado por fotooxidação. 0 aumento na fluorescência verde foi medido continuamente para dar curvas cinéticas completas da perda de integridade lisossomal. Como evidente nos gráficos as células tratadas com siRNAs visando aSMase mostram um marcado decréscimo da estabilidade lisossómica. O método é melhor explicado no Exemplo 2. 35

Figura 13

Tratamento de todas as linhas de células NPDA/B com rHsp70 reverte fortemente a patologia lisossomal, i.e. reduz a área transversal dos lisossomas. Quantificação da área lisossomal das secções transversais confocais das células de fibroblastos da Doença de Niemann-Pick Tipo A e B (NPDA/NPDB) e fibroblastos normais (BJ) deixadas por tratar ou tratadas durante 24h com 300 nM BSA ou Dextran como controlo, ou tratadas durante 24h com 300 nM rHsp70, 150nM rhaSMase ou uma combinação destas. Células NPDA tratadas durante 24h com 300nM rHsp70-W90F (W90F) - o Hsp70 mutante o qual não interage com BMP, tem um efeito comparável ao das células controlo. Ver Exemplo 2 para métodos.

Figura 14

Atividade aumentada de aSMase em fibroblastos Hsp70 transgénicos e fibroblastos rHsp70 tratados com NPDA. A análise espectroscópica de espécies de lipidos (esfingomielina e ceramida conforme indicado) em fibroblastos embrionários de rato imortalizados (iMEFs), quer do tipo selvagem (WT) ou Hsp70 transgénico (TG) (A e B) , assim como os fibroblastos de doentes de Doença de Niemann-Pick tipo A (NPDA 83/24) quer deixadas por tratar ou tratadas com rHsp70 (C) . Os menores niveis de esfingomielina e mais altos niveis de ceramida indicam uma aumentada atividade de esfingomielinase acidica.

Figura 15

Reversão da patologia Fibroblastos de Doente da doença de Farber. Quantificação da área lisossomal das secções transversais confocais de células de doentes da Doença de Farber. Fibroblastos doentes da Doença de Farber (Farber 89/73 e Farber 89/78) foram deixadas por tratar ou tratadas 36 durante 24 h com 300 nM BSA ou 300 nM de rHsp70 conforme indicado. Como evidente nas figuras, o tratamento de fibroblastos de doente da Doença de Farber com rHsp70 reverte fortemente a patologia lisossomal, i.e. reduz a área transversal dos lisossomas. Ver Exemplo 2 para a descrição dos métodos.

Figura 16

Hsp70 aumenta a absorção endocítica de outras moléculas. Painel A: fibroblastos embrionários de rato imortalizados (iMEF) , quer do tipo selvagem (WT) ou transgénico para Hsp70 (TG) se incubadas com 20Pg/mL BSA marcado com Alexa Fluor-488 (BSA*) durante 24h. A absorção endocitica foi verificada por microscopia de fluorescência (não mostrado) (ver exemplo 2). As células foram então colhidas e analisadas quando à absorção de BSA*. Como evidente a partir da figura o Hsp70-transgenico iMEFs tem uma absorção significativamente mais elevada de BSA* que o iMEFs do tipo selvagem. Painel B: U20S células de osteosarcoma foram incubadas com 20Pg/mL BSA* durante 24h quer com 3000 nM de rHsp70 ou sem conforme indicado. A absorção endocitica foi verificada por microscopia de fluorescência (não mostrado) (ver exemplo 2) . As células foram então colhidas e analisadas quanto à absorção de BSA*. Como evidente a partir da figura, as células U20S nas quais BSA* e rHsp70 foram adicionadas juntas tem um absorção significativamente maior de BSA* que as células incubadas só com BSA*.

Descrição pormenorizada da invenção

Como é demonstrado pelos presentes inventores, Hsp70 exerce a maior parte do seu efeito citoprotetor através da interação direta com endo-membranas lisosomais; uma interação que é coordenada por um fosfolipido especifico, nomeadamente BMP (bis(monoacil-glicero)fosfato). BMP está presente somente nos últimos endossomas e lisossomas. Os 37 investigadores mostram que a Interação Hsp70-BMP é dependente do dominio ATP-ase N-terminal de Hsp70, especificamente triptofano 90, e também que a interação é dependente de pH. A interação entre Hsp70 e BMP é essencial para o efeito de estabilização de membrana s de Hsp70, fornecendo uma plataforma para modular a estabilidade de um subconjunto especifico de enzimas lisosomais, e prevenindo a desestabilização de membranas lisosomais com subsequente libertação de enzimas lisosomais. Estas descobertas formam a base para uma nova e promissora modalidade de tratamento para o distúrbio de armazenamento lisossomal, como aqui divulgado.

Lisossomas

Desde a descoberta de lisossomas por de Duve em 1955, a visão deste organelo tem sido dominada pelo dogma de que é somente o fim da via endocitica em células animais um compartimento contendo um vasto conjunto de hidrolases, que, se libertado no citosol, causa necrose e inflamação do tecido. Esta visão dos lisossomas como, na melhor das hipóteses, uma unidade de eliminação de lixo, e na pior das hipóteses, um "saco de suicídio" inespecífico, mudou drasticamente devido a recentes descobertas que fornecem evidência para numerosas tarefas mais específicas para os lisossomas e seus conteúdos.

Hidrolases lisosomais

Como principal compartimento para degradação intracelular e subsequente reciclagem dos constituintes celulares, os lisossomas recebem carga tanto hetero- com autofágica, a qual no lúmen deste organelo encontra o seu destino final. A degradação é realizada por várias hidrolases acídicas (fosfatases, nucleases, glicosidases, proteases, peptidases, sulfatases, lipases, etc.) capazes de digerirem as maiores macromoléculas celulares. Entre as proteases 38 lisosomais melhor estudadas está a família das proteases catepsina. As catepsinas podem ser divididas em três subgrupos de acordo com o seu sítio do aminoácido ativo, i.e. as catepsinas cisteína (B, C, H, F, K, L, 0, S, V, W e X/Z), aspartato (D e E) e serina (G). As catepsinas funcionam otimamente ao pH acídico dos lisossomas (pH 4-5) embora possam também funcionar a pH neutro fora dos lisossomas, embora tendo estabilidade decrescida e/ou especificidade alterada.

Até recentemente a função das catepsinas pensava-se estar limitada a turnover da proteína intralisossómica, e a degradação da matriz extracelular uma vez secretada. No entanto, durante os passados poucos anos muitas das catepsinas foram aprovadas com funções mais específicas incluindo papeis na remodelação óssea, apresentação de antigénio, homeostase epidérmica, processamento prohormona, proteção de linfócitos citotóxicos de auto-destruição após desgranulação, manutenção do sistema nervoso central em rato, angiogénese, invasão de células do cancro assim como morte celular programada (MCP).

Para além do colapso das proteínas, os lisossomas e os últimos endossomas são também responsáveis pelo metabolismo dos lípidos celulares, tal como os glipofingolípidos, através de uma série de enzimas endolisómicas e coenzimas, cuja função adequada depende da composição lipídica das membranas intra-lisossómicas. A importância do metabolismo lipídico endolisossómico funcional pode ser facilmente apreciado pelo facto de que a doença clínica é evidente no caso de disfunção em qualquer estádio do esfingolípido, dando origem a doenças tais como Doença de Tay-Sachs, Doença de Sandhoff, Doença de Farber, Doença de Fabry, Doença de Gaucher, Doença de Krabbe e Doença de Niemann-Pick. 39

Transporte de e para os lisossomas 0 transporte de membranas endocíticas desempenha um papel essencial na célula de mamífero devido à sua libertação de componentes da membrana, várias moléculas de soluto e ligandos associados a recetor para os vários compartimentos intracelulares. Enquanto que, até recentemente, as várias vias endocíticas pareciam simples, com os principais passos convergindo nos lisossomas, onde a degradação e possível reciclagem de volta para a membrana plásmica deve ocorrer, evidências recentes mostram que estas vias são mais complexas do que inicialmente imaginado. A via endocitica A endocitose é melhor compreendida em termos de endocitose das moléculas mediada por recetor através da formação de poços revestidos por clatrina, apesar de uma diversidade de vias endocíticas não mediadas por clatrina (por exemplo macropinocitose, fagocitose, absorção via formação de cavéolas e formação de poços revestidos de clatrina) tenham também sido identificadas. A nomenclatura do sistema endocítico não foi totalmente normalizada, e o termo comummente usado "endossoma precoce" na verdade, descreve dois compartimentos endossómicos distintos - o endossoma de separação e o compartimento endocítico de reciclagem (ERC). Num convencional passo endocítico mediado por recetor, os recetores tal como o recetor transferrina, o recetor de lipoproteína de baixa densidade e o recetor de manose-6-fosfato (MPR) concentram-se nos poços revestidos de clatrina na superfície da membrana plasmática devido às interações entre motivos de sequência na sua cauda citoplasmática e elementos no revestimento de clatrina. Depois de derramar o seu revestimento de clatrina, o recém formado endossoma funde-se com outros endossomas e os pré-existentes endossomas separam para se tornarem um endossoma 40 de separação. Tal como o nome indica, a sua primeira tarefa é separar componentes recentemente adquiridos para os seus locais corretos. Os três destinos conhecidos incluem a membrana plásmica, os últimos endossomas e o ERC. À medida que são separados os endossomas maduros, verifica-se uma queda no pH, a qual facilita a libertação dos ligandos ligados a recetor no lúmen do endossoma. Antes da maturação completa do endossoma de separação dentro do endossoma tardio, no entanto, as moléculas destinadas a reciclar devem ser removidas. Acredita-se que este processo ocorre através de poda de tubulos estreitos, um processo, que favorece a saida de proteínas da membrana das moléculas de soluto em que a razão área de superfície para volume dos tubulos é maior que a do endossoma de separação vesicular. Os túbulos podados podem retransmitir as proteínas da membrana diretamente de volta para a membrana plásmica (a via de retorno directo) ou para o ERC. O ERC é principalmente um conjunto de organelos tubulares, cuja localização varia entre os tipos de células. Enquanto que o ERC é capaz de separar moléculas para diferentes destinos, a maioria das moléculas que transitam através do ERC retornam à membrana plásmica. À medida que o endossoma de separação matura, o pH do lúmen cai constantemente, principalmente devido à ação do ATPase de protão tipo vacuolar (V-ATPase), enquanto que também ocorrem mudanças na membrana lipídica e na composição da proteína. O transporte de membrana do endossoma de separação para o endossoma tardio e ainda mais para o lisossoma tem sido palco de alguma controvérsia. A disputa é acerca de se este transporte é melhor explicado através do transporte vesicular ou pela maturação do endossoma de separação. Ambos os modelos fornecem um intermediário entre o separado e o endossoma tardio. Enquanto que o modelo de maturação sustenta que a vesícula, que atinge o endossoma 41 tardio, é o que permanece após a remoção dos componentes do antigo endossoma de separação, o modelo do compartimento pré-existente sustenta que o transporte das moléculas dos endossomas tardios ocorre através de uma vesicula transportadora endocitica (ECV), uma vesicula de transporte especifica entre o de separação pré-existente e os compartimentos endossómicos tardios. Ambos os compartimentos endossómicos de separação e tardios são considerados como estruturalmente mais complexos e tendo funções mais especializadas que os das vesículas transportadoras. Estudos recentes de imagens de células vivas reconciliaram os aspetos mecanicistas de ambos os modelos, no entanto, as vesículas que surgem de uma rede dinâmica de endossoma precoce pode sofrer uma conversão em que perde a pequena GTPase RAB5 e recruta RAB7, um marcador do endossomas tardios. Apesar de a organização da via endocitica estar funcionalmente bem definida, a nomenclatura pode ser confusa. Funcionalmente, a via endocitica é definida por recetores de limpeza (por exemplo o recetor transferrina) e outros lípidos e proteínas sendo reciclados através de endossoma precoce/endossoma de substituição onde o recetor-ligando de desacoplamento ocorre - mas não através de endossoma tardio onde a proteólise pode ocorrer. Por detrás destes critérios funcionais no entanto, a imagem torna-se turva quando se trata da nomenclatura, não, pelo menos como a geração de vesículas intraluminais, partindo dos endossomas precoces e tornando-se mais e mais proeminentes durante a maturação para endossomas tardios, foi originado o termo "corpos multivesiculares" (MVB) . Este termo tem sido usado alternadamente como outro nome para os ECVs e endossomas tardios assim como para todas as vesículas endocíticas contendo regiões multivesiculares ou elementos, incluindo organelos híbridos que se formam quando os lisossomas se fundem com os endossomas tardios (que contêm estruturas 42 multivesiculares). No entanto, os endossomas tardios contêm mais vesículas da membrana do lúmen que os endossomas precoces e são portanto muitas vezes o compartimento descrito pelo termo "corpos multivesiculares".

Finalmente, uma quantidade substancial da confusão neste campo é proveniente da definição, ou na falta desta, dos endossomas tardios versus lisossomas. Ambos os compartimentos são iqualmente acídicos e a maior parte, senão a totalidade, das proteínas presentes nos lisossomas são também encontradas nos endossomas tardios. De acordo com o modelo de maturação, os endossomas tardios devem ser precursores dos lisossomas, mas perante o desenvolvimento qradual, como a teoria sugere, uma classificação rigorosa pode ser muito difícil de atingir. Recentemente, no entanto, foi apresentada evidência de que os lisossomas e endossomas tardios são compartimentos separados, que depois sofrem ambos os eventos "kissing" (fusões transientes) assim como eventos de fusão completos, após o que os lisossomas podem reformar-se a partir do organelo híbrido. A via biossintética

Para além da endocitose, os endossomas tardios recebem também carga através da via MPR da rede trans-golgi (TGN) (a via biossintética) . A MPR dependente de catião e o fator-II tipo MPR/Insulina (IGF-II) recetor independente de catião partilham a tarefa de distribuir as recém sintetizadas hidrolases acídicas a partir de TGN para os lisossomas. 0 reconhecimento das hidrolases acídicas pelos MPRs requer a adição de hidratos de carbono no retículo endoplásmico e a subsequente modificação e fosforilação dos resíduos de hidratos de carbono em porções manose-6-fosfato no cis-Golgi. As hidrolases ligadas a MPR são primeiro distribuídas aos endossomas, onde se dissociam dos recetores devido à queda no pH do lúmen, permitindo aqui 43 aos recetores reciclarem-se de volta para o TGN. A proteína principalmente responsável pela separação dos MPRs nos poços revestidos de clatrina no TGN, é uma proteína-1 adaptadora (AP-1), apesar de as proteínas de ligação ao fator de ribosilação de ADP contendo γ-ear (GGAs) localizadas no aparelho de Golgi também desempenharem um papel. 0 modo como AP-1 e GGAs trabalham em conjunto ou de facto atingirem os dois MPRs em diferentes localizações subcelulares é presentemente desconhecido. AP-1 é parte de uma família de proteínas adaptadoras consistindo de quarto membros, todos os quais são proteínas heterotetraméricas utilizadas extensivamente nas vias secretora e endocítica. Adicionalmente aos papéis acima mencionados das AP-1 nos poços revestidos de clatrina formados em TGN, AP-1 e AP-2 são usadas nos poços revestidos de clatrina durante a endocitose da membrana plásmica, enquanto que AP-3 e AP-4 funcionam no transporte das proteínas de membrana associadas ao lisossoma (LAMPs). A via autofágica A autofagia é uma terceira via bem conhecida através da qual as macromoléculas alcançam o lisossoma. A autofagia é uma via evolucionariamente conservada envolvido na reversão de proteínas e organelos de vida longa. Usualmente opera a níveis basais baixos, embora possa ser induzido, por exemplo sob condições de carência de nutrientes. Sob estas condições a macroautofagia é a principal via responsável pela distribuição do material para os lisossomas. A macroautofagia é caracterizada por uma membrana plana envolvendo o poço em torno dos organelos citoplásmicos e/ou a porção de citosol formando assim um vacúolo ligado a membrana dupla fechada, o autofagosoma. 0 autofagosoma finalmente funde-se com os lisossomas formando autofagolisosomas/autolisosomas, onde ocorre a degradação e 44 reciclagem das macromoléculas envolvida. A origem da membrana do autofagosoma não é ainda clara. 0 retículo endoplásmico, Golgi, um menos bem caracterizado compartimento da membrana chamado o fagoforo assim como a síntese de novo têm todos sido propostos como origem da membrana autofagosoma. Recentes progressos através de genética de leveduras e a subsequente descoberta de homólogos de mamífero rapidamente melhorou o entendimento do processo de autofagia e será útil para elucidar também a origem da membrana autofagosómica num futuro próximo.

Também existem outras vias através das quais os lisossomas recebem carga autofágica. Um processo bastante indiscriminado chamado microautofagia é caracterizado pela incorporação do citosol nos lisossomas por invaginações da membrana lisossomal. Para além das macromoléculas, as quais estão presentes em citosol incorporado, este processo pode também envolver a absorção de organelos tal como peroxisomas. Finalmente, o transporte mediado por acompanhante de proteínas citosólicas no lúmen lisossómico apresenta uma forma mais direta e seletiva de autofagia. Esta via é dependente da presença do membro constitutivamente expresso da família de Proteína 70 de choque térmico, Hsc7 0, nos dois lados da membrana lisossomal. 0 processo está ainda mais dependente do reconhecimento de um motivo da sequência KDEL nas proteínas alvo por LAMP-2a.

Reformação dos lisossomas e secreção lisossómica Após fusão dos lisossomas com endossomas tardios ou autofagosomas, os lisossomas são reformados a partir de organelos híbridos resultantes através da sequestração de proteínas da membrana e condensação do conteúdo do lúmen. Das proteínas da membrana que necessitam de ser removidas ou recicladas a partir do organelo híbrido, os mais óbvios 45 são os MPRs, na medida em que por definição estão ausentes dos lisossomas. Os lisossomas, no entanto, não podem ser vistos como o ponto terminal das vias endociticas dado que são também capazes de formar lisossomas secretores através da fusão com grânulos secretores, um processo que é dependente de Ca2+ e foi primeiro reconhecido nas células secretoras de origem hematopoiética. No entanto, existem também evidências para um compartimento lisossómico da membrana proximal regulada por Ca2+ responsável por exocitose em células não secretoras. 0 processo de exocitose está dependente da proteina Rab27a, um membro da família da proteína Rab, que conta mais de 60 membros. As Rabs são GTPases pequenas que têm papel regulador chave na maioria dos passos de transporte de membrana incluindo formação de vesículas, motilidade, ancoragem e fusão. Pelo menos 13 proteinas Rab são utilizadas nas vias endociticas com vista a determinar o destino de várias moléculas sujeitas a endocitose e suas vesiculas.

Morte celular programada A regulação do número de células em geral assim como a quantidade de células que constituem os diferentes tecidos juntamente com a necessidade de um mecanismo de eliminação das células não desejadas é de importância fundamental em organismos multicelulares. A morte celular programada é o meio para esse fim, dotar o organismo multicelular com a potencial para se livrar de Células indesejadas sem a fuga de constituintes celulares, portanto evitando a inflamação associada com necrose, a contrapartida conceituai para a morte celular programada.

Apoptose A palavra apoptose é usada em grego para descrever "cair" ou "queda" de pétalas de flores, ou folhas de árvores e foi cunhado por Currie e colegas em 1972 para descrever um tipo 46 comum de morte celular programada, que os autores observaram em vários tecidos e tipos de células. Os autores noticiaram que os eventos que podem observar tinham importantes semelhanças morfológicas, que eram distintas das caracteristicas morfológicas caracterizando células com patologia, morte necrótica e sugerindo que estas comuns caracteristicas morfológicas devem ser devidas a um idêntico processo subjacente.

Quando as células morrem por apoptose, sofrem uma série de eventos transformantes. Entre estes eventos, e essencial para a caracteristica fenótipo apoptóticas, é a ativação de caspases - a família das endopeptidases cisteína, que clivam substratos em resíduos aspartato específicos, daí o nome. A ativação das caspases conduz ao processamento proteolítico de outras caspases assim como hospeda outras mudanças em todas as atividades da proteína dentro das células, em última análise produzindo as caracteristicas morfológicas associadas à ativação da caspase e portanto, por definição, à apoptose. As caracteristicas apoptóticas clássicas incluem retração das células e empolamento da membrana citoplásmica, condensação da cromatina dentro do núcleo de forma clara, formas geométricas, fragmentação de DNA em 200bp inteiros, a assim chamada escada nucleosomal, descolamento celular a partir das suas células vizinhas e desintegração da célula em pequenas, vesículas inclusas chamadas corpos apoptóticos. Num ambiente multicelular estes corpos apoptóticos são em última análise fagocitozadas por macrófagos ou células vizinhas completando deste modo a remoção completa das células não desej adas.

Morte celular programada A morte celular programada (MCP) não é sinónimo de apoptose embora se possa estar inclinado a pensar assim com base na 47 quantidade de literatura que usa estes termos indiscriminadamente. O termo MCP é gradualmente assumido, mas o termo apoptose é ainda usado para descrever a morte celular programada orquestrada pela ativação de caspases, em particular caspase 3. No entanto, a capacidade de certas células para sobreviver à ativação de caspases pró-apoptótica assim como a MCP com ausência completa de ativação de caspase e a MCP não apoptótico conduzindo a ativação de caspase, revelou uma marcada plasticidade de programa(s) de morte celular e MCP pode portanto ser mais acuradamente definida como morte celular dependente do sinal ou atividades dentro da célula a morrer. Foi sugerido que essa MCP pode ser subdividida em MCP apoptose, tipo apoptose e tipo necrose, de acordo com a morfologia nuclear das células que morrem, cada definição criada para as distintas caracteristicas morfológicas, a principal caracteristica é a forma de condensação da cromatina ou a ausência dessa, embora seja preferível fazer distinção de distinções de MCP com base nas vias de sinalização participando sob qualquer conjunto de condições que conduzam a MCP. No entanto este modo de distinguir entre diferentes modos de MCP não é ainda aplicável, porque as linhas que conduzem aos vários tipos de morte celular continuam por ser resolvidas.

Necrose A necrose é a contrapartida conceptual para a MCP, uma vez que não pode ser evitada por quaisquer outros meios que não a remoção do estímulo que dá origem à necrose. Este modo de morte celular é usualmente visto durante ofensas patológicas a um organismo. 0 mecanismo molecular da morte celular programada

Apoptose 48

Como mencionado na secção anterior, a apoptose é definida como a ativação dos membros da familia das endopeptidases cisteina conhecidas como caspases e a morfologia associada à sua ativação. A caspases residem nas células como zimogénios inativos, que podem ser rapidamente ativados por processo proteolitico. Este processo procede numa cascata hierárquica em que um estimulo apoptótico ativa uma caspase iniciadora (por exemplo caspase-8 e -9), a qual por sua vez ativa o próximo nivel na hierarquia, a caspases efetora (por exemplo caspase-3, -6 e -7) . Os últimos são considerados os executores da apoptose à medida que clivam uma série de substratos, o processamento dos quais em última análise conduz ao fenotipo associado a apoptose. 0 programa apoptótico pode ser ativado por uma diversidade de estímulos, que podem ser amplamente divididos em estímulos extracelulares e intracelulares, o último sendo a mitocôndria como um interveniente essencial. Os estímulos extracelulares e as respostas seguintes que dão origem à apoptose são também referidos como a via de sinalização extrínseca e são compostos de uma série de eventos começando com a ativação de uma variedades dos recetores de morte tais como Fas/Apo-l/CD95, TNFR ou TRAIL. Após a ligação ao seu ligante apropriado, estes recetores recrutam o domínio de morte (DD) contendo moléculas adaptoras, tais como TRADD (proteína do domínio de morte associada a TNFR1) e FADD (proteína de associação a Fas com domínio de morte), por interação com a DD presente nos recetores. Estas moléculas adaptadoras recrutam então a caspase-8 para o complexo recetor, onde a caspase é ativada, possivelmente por processamento autocatalítico induzido por proximidade. Certas células caspase-8 (as chamadas células tipo I) então clivam diretamente e ativam a procaspase-3, enquanto nas células tipo II, o substrato para a caspase-8 é a proteína citoplásmica Bid. A clivagem de Bid gera um fragmento (Bid 49 truncado (tBid)), que induz a oligomerização, translocação e inserção de dois membros da familia Bcl-2 pró-apoptóticos, Bax e Bak na membrana mitocondrial. Esta inserção medeia a libertação do citocromo c portador de eletrão (CytC) do espaço intermembrana mitocondrial junto com um hospedeiro das outras proteinas, a mais proeminente das quais inclui o Fator de indução de apoptose (AIF), Smac/DIABLO que antagoniza os efeitos das proteinas conhecidas como proteinas inibidoras da apoptose (IAP) e endonuclease G, uma DNAse. Deve notar-se, que embora esta seja o ponto central nas teorias de ativação de caspase através da mitocondria, nenhuma evidência conclusiva foi apresentada em relação a como a inserção de Bax e Bak facilita a libertação de citocromo c. Após libertação a partir da mitocondria, acumula CytC no citoplasma, onde se liga à proteina Apaf-1 (fator-1 de ativação de protease apoptótica) resultando numa alteração conformacional, a qual promove oligomerização de Apaf-1. Este oligómero liga-se então através de interações procaspase-9 homotipicas entre o Dominio de recrutamento de Caspases (CARDs) resultando na formação de um complexo chamado o apoptosoma. A formação deste complexo conduz a uma atividade enzimática de procaspase-9 grandemente aumentada, a atividade da qual conduz à ativação proteolitica da caspase-3.

A apoptose pode também ser desencadeada por fatores intracelulares elicitando a permeabilização mitocondrial da membrana externa (MOMP), um processo conhecido como da via intrinseca. Estes fatores incluem segundos mensageiros associados a stresse celular tal como Ca2+, NO e ácido araquidónico assim como bilirubina, sais biliares e estimulos que podem dar origem à desnaturação de proteina e danificar o DNA nuclear e mitocondrial tais como radiação ionizante, stresse térmico, espécies reativas de oxigénio (ROS) e agentes quimioterapêuticos. No caso de dano do DNA 50 nuclear, este é detectado por várias quinases proteína, as quais dependem da forma do dano do DNA mas também da noxa que a elicia. A atividade destas quinases induz a acumulação de p53, que pode depois atuar como um fator de transcrição, dando origem a uma transcrição aumentada dos genes pró-apoptóticos tais como Bax, Noxa e PUMA, os quais induzem MOMP. A nível mitocondrial, p53 induz a expressão de enzimas mitocondriais que localmente geram ROS assim como uma proteína matriz mitocondrial (p53AIPl), cuja sobreexpressão desencadeia perda do potencial da membrana mitocondrial potencial e apoptose. A indução de MOMP por p53 ou pela ação de estímulos intrínsecos descritos acima é o ponto no qual a via intrínseca e extrínseca convergem, o caminho da via intrínseca seguindo a já descrita para a extrínseca com libertação de citocromo c, formação do apoptosoma e ativação da caspase 3 constituindo o passo final para a morte da célula não desejada.

As Alternativas à Apoptose

Na última década, o papel exclusive das caspases como executoras de MCP foi desafiada e as evidências montadas sugerem que há mais a vida - e especialmente morte - que possa ser atribuída às caspases isoladamente.

Os recentemente desenvolvidos inibidores farmacológicos específicos para caspase assim como a inactivação das vias de caspase por fatores tais como depleção de energia, stresse por nitrato/oxidativo e membros da família de Inibidores apoptose proteica (IAP) nem sempre pára a progressão até à morte, revelaram, ou aumentaram mesmo, um subconjunto de programas de morte básicos independentes da caspase. Estes programas incluem vias iniciadas por recetor de morte assim como vias eliciadas por fármacos para 51 cancro, privação de fatores de crescimento, staurosporina, proteinas relacionadas com Bax e a depleção de Hsp70. As caracteristicas morfológicas destes programas de morte independentes de caspase são muitas vezes reminiscentes das observadas para a apoptose clássica, e o suporte experimental de um papel para outras proteases tais como proteases catepsinas, calpainas e serina como cofatores essencial quer a montante quer a jusante das caspases cresceu rapidamente. 0 argumento é reforçado por constatações de que muitas proteases não caspase são capazes de clivar pelo menos alguns dos substratos da caspase, o que pode explicar algumas das semelhanças observadas entre os programas de morte dependentes ou independentes de caspase.

Embora de possa argumentar quanto à relevância desses programas de morte, como são mascarados pela eficácia das caspases, a evidência é a reunião de um papel evolutivo conservado para as proteases catepsina lisossómico na morte celular programada iniciada como resposta a vários estímulos tais como recetores de morte da familia recetora de fator de necrose tumoral, hipóxia, stresse oxidativo, stresse osmótico, calor e fármacos anticancerigenos.

Envolvimento lisossómico na morte celular programada Enquanto que o papel dos lisossomas e suas hidrolases na fase de limpeza da MCP, i.e. as incorporações das células e corpos apoptóticos pelas células ou fagocitos da vizinhança, está bem estabelecido, tem levado mais tempo a reconhecer a importância dos lisossomas e hidrolases lisosomómicas nos eventos mais imediatos da MCP. Uma das razões para este atraso pode ser o facto de os inibidores da metil cetona péptida comummente usados para avaliar o papel das caspases na MCP (por exemplo zVAD-fmk, Ac-DEVD-fmk, Boc-D-fmk, etc) também inibir outras proteases 52 cisteína, incluindo várias catepsinas cisteina. Mesmo nove anos após o reconhecimento desta reação cruzada, efeitos protetores com estes inibidores a concentrações capazes de inibir protéases não caspase são ainda frequentemente interpretados como uma prova da via da morte mediada por caspase, e o papel de outra proteases cisteina na MCP continua portanto a ser subvalorizada. A descoberta da MCP lisossómica pode ter sido atrasada adicionalmente, devido à ultrastrutura lisossómica aparecer intacta nas células apoptóticas analisadas por microscopia eletrónica. Portanto, a rutura lisossómica foi até recentemente considerada como um permutador de tudo ou nada durante os estados tardios da morte celular necrótica incontrolada e da autólise do tecido. No entanto, novas técnicas permitindo uma avaliação mais precisa da integridade da membrana lisossomal revelaram que os lisossomas com ultraestrutura normal podem ter parte das suas enzimas, e essa parcial permeabilização da membrana lisossomal (PML) não só ocorre precocemente em muitos paradigmas da morte, mas podem de facto desencadear a apoptose e a MCP tipo apoptose.

Permeabilização da membrana lisossomal (PML) e suas consequências

Estudos com vários compostos que atingem diretamente a integridade das membranas lisosomais, tais como H202, L-leucil-L-leucina metil éster, stresse osmótico, esfingosina, os antibióticos lisosomotrópicos norfloxacina e ciprofloxacina e dano lisossómico foto oxidativo (fotolise), provaram convincentemente que a permeabilização lisossómica moderada pode resultar em MCP. Uma relação quantitativa entre a quantidade de rutura lisossómica e o modo de morte celular foi sugerida para explicar os resultados de larga diferença morfológica ligada à PML. De 53 acordo com este modelo, intensidades de baixo stresse desencadeiam uma limitada libertação de conteúdos lisossomais para o citoplasma seguido de morte celular apoptótica ou tipo apoptótica, enquanto que stresse de alta intensidade conduz a uma rutura lisossómica generalizada e rápida necrose celular. Consequentemente, baixas concentrações de esfingosina, um metabolito da ceramida gerado por ceramidase ácida com propriedade como detergente a pH baixo, induz PML parcial e apoptose mediada por caspase, ao passo que concentrações mais altas resultam em PML massiva e morte celular necrótica independente de caspase. Neste modelo, a morte desencadeada pela PML parcial pode ser inibida por inibidores farmacológicos das catepsinas cisteina e aspartato, e o aumento na atividade da catepsina citosólica precede a ativação das caspases e as potenciais alterações mitocondriais da membrana sugerindo um papel direto das catepsinas citosólicas num processo de morte. É importante que o papel da PML e das catepsinas na morte celular não está limitado a modelos experimentais empregando disruptores lisossómicos diretos. A PML também participa na execução da morte celular em resposta a uma vasta diversidade de estimulos apoptóticos clássicos, tais como ativação dos recetores de morte da familia de recetores do Fator de necrose do tumor (TN F) , interleucina-1, ativação p53, mitigação do fator de crescimento, agentes estabilizadores de microtubulo, etoposido, ativação do recetor sigma-2, CD437 retinóide sintético, ativação do recetor de B célula, estaurosporina, stresse osmótico, assim como moléculas pequenas identificadas numa triagem de novos fármacos para cancro que induzem apoptose independente de p53. PML como um desencadeador da via da apoptose mitocondrial 54

Os efeitos citotóxicos da PML muitas vezes assentam, pelo menos parcialmente, na ativação da via da morte mitocondrial. Um estudo de microinjeção cuidado demonstrou que quando localizada no citosol, uma única hidrolase lisossomal, catepsina D, é suficiente para desencadear a permeabilização de membrana mitocondrial externa e a apoptose em fibroblastos humanos em doses celulares correspondentes a metade da atividade celular total da catepsina D. A catepsina D, no entanto, não é suficiente para desencadear MCP em todos os modelos de morte celular envolvendo PML. Outros mediadores bem documentados de MCP desencadeada por PML incluem catepsinas cisterna B e L assim como espécies reativas de oxiqénio. Deve, no entanto, realçar-se que o papel de outras hidrolases lisossómicas, mensageiros secundários derivados de lisossoma e acidificação de citosol induzida por PML não tem sido apropriadamente regulamentada. Uma das ligações entre catepsinas e a permeabilização da membrana mitocondrial podem ser Bid, uma proteina proapoptótica só BH3da familia Bcl-2 que pode ser processada e ativada por várias catepsinas cisteina, mas não pela catepsina D, a pH citosólico. Tem, no entanto, sido sugerido que a catepsina D cliva e ativa Bid no ambiente acidico do compartimento endolisossómico a seguir à internalização do recetor-1 de TNF (TNF-R1) . De acordo com este modelo, a endocitose do TNF-R1 ativada por ligando resulta na formação de ceramida mediada por esfingomielinase ácida, a qual quando se liga à catepsina D inativa ativa-a pela via de processamento autocatalítico. A catepsina D pode também ativar Bax de um modo independente de Bid como demonstrado em células T tratadas com estaurosporina. Também nos fibroblastos tratados com ciprofloxacina, a PML desencadeia a permeabilização da membrana mitocondrial através de ativação independente de Bid de Bax e Bak. Neste sistema de modelo a ativação Bax é independente da catepsina D, mas ao 55 invés assenta em espécies reativas de oxigénio. Deve notar-se que a permeabilização da membrana mitocondrial induzida por ciprofloxacina não é totalmente inibida nas células em que faltam as duas Bax e Bak. Os mecanismos alternativos de conexão PML à permeabilização da membrana mitocondrial podem incluir os efeitos diretos das espécies reativas de oxigénio e/ou dos mediadores de lipidos tal como o ácido araquidónico que pode ser gerado de forma dependente da catepsina B. diferentes

Estudos empregando fibroblastos embrionários de murino imortalizado (MEFs) de ratos deficientes em catepsinas individuais revelaram claramente que diferentes catepsinas estão envolvidas na execução da morte celular dependendo dos estímulos que desencadeiam a PML. MEFs imortalizados a partir de ratos deficientes em catepsina B e L, mas não a partir de ratos deficientes em catepsina D, são altamente resistentes ao TNF, enquanto que a imagem oposta surge quando as células são tratadas com estaurosporina. Estudos extensivos sobre vias de morte celular induzida por TNF têm ainda revelado que o papel de individual catepsinas na MCP depende do tipo de célula estudado. Conforme indicado acima, a morte de MEFs imortalizados induzida por TNF depende das catepsinas cisterna, mas não da catepsina D. Mais ainda, a depleção catepsina D protege efetivamente as células de cancro cervix HeLa contra TNF e citotoxicidade induzida por cinplatina. Esta diferença não parece ser devida a diferenças gerais entre células humanas e de murino, porque a catepsina B sozinha ou em conjunto com outras catepsinas cisterna é também crucial para a morte efetiva induzida por TNF de linhas de células de cancro da mama (MCF-7) e do cervix (ME-180) em humanos. A explicação sobre esta diversidade é ainda desconhecida, mas vários niveis de expressão de catepsinas individuais e seus inibidores em diferentes linhas de células podem 56 desempenhar um papel. Concordantemente, a capacidade variável de diferentes estímulos de morte para regularem os niveis de expressão individual das catepsinas ou seus inibidores pode explicar a diferença em respostas a diferentes estímulos. Por exemplo, adriamicina e etoposido são conhecidos para aumentar a expressão da catepsina D via da ativação de p53. Alternativamente, outras vias de sinalização induzidas por vários estímulos podem cooperar com catepsinas específicas.

Vias de morte independente das mitocondrias induzida por PML É importante, que os efeitos letais das PML e catepsinas citosólicas não sejam limitados à ativação da via da apoptose intrínseca. Na pequena célula de células de cancro do pulmão tratadas com fármacos de estabilização de microtúbulos (paclitaxel, epotilona B e discodermolide), a PML ocorre mais cedo num processo de morte e as catepsinas cisteína medeiam a micronucleação e a morte celular de um modo independente de caspase. Em linhas de células de carcinoma humano tratado com TNF a PML ocorre a jusante da permeabilização da membrana mitocondrial externa. No entanto, a inibição da atividade ou da expressão da catepsina cisteina confere proteção significativa contra a morte celular induzida por TNF sem inibir significativamente a ativação da caspase efetora. Mais ainda, a catepsina B é responsável pelas mudanças tipo apoptose, tais como condensação de cromatina, exposição da fosfatidilserina e empolamento da membrana plásmica, na ausência de atividade de caspase em células de fibrosarcoma WEHI-S de murino tratadas com TNF. Mais ainda, a depleção de proteína 70 (Hsp70) por choque térmico em várias células cancerígenas humanas assim como a ativação supraótima das células T desencadeia PML e MCP tipo apoptose mediada por 57 catepsina sem a ativação da via da apoptose intrínseca. De acordo com estes dados, a catepsina B pode induzir apoptose nuclear em núcleos isolados. Portanto, as catepsinas surgem para transportar ou a capacidade de atuarem como iniciadoras ou como proteases efetoras da morte celular programada dependendo dos estímulos e do contexto celular. Especialmente a sua capacidade para mediar a MCP em células cancerígenas, onde a via de morte mitocondrial está bloqueada por exemplo devido a sobreexpressão de Bcl-2, dá esperança que o tratamento de indução de PML possa provar eficácia no tratamento de cancros que são resistentes a indutores de classes de apoptose Esta ideia é ainda suportada pelos dados que mostram que a imortalização e transformação pode sensibilizar células para a morte celular lisossómica.

Sinalização para PML

Como descrito acima, a PML seguida pela libertação de conteúdos lisossomais, especialmente catepsinas, para o citosol é considerada ser o passo chave de ativação da via da morte lisossómica. No entanto, as vias de sinalização que conduzem a PML estão ainda somente a começar a emergir. Um dos mecanismos melhor estudados é a sinalização a partir do recetor 1 do fator de necrose tumoral embora a clarificação desta via de sinalização para PML ter sido grandemente complicada por respostas diferentes nas diferentes células alvo.

Resumindo, TNF pode induzir tanto PML dependente como independente de caspase dependendo do contexto celular. Adicionalmente, os ligandos FasL relacionados com TNF, TRAIL e TWEAK estão todos também associados com MCP independente de caspase com morfologia tanto apoptótica como necrótica. Estudos farmacológicos e genéticos indicam 58 que a via mediada por caspase que leva do TNF para PML é dependente das caspases 8 e 9, embora a ativação da caspase 9 difira largamente entre células humanas e de murino. A ligação entre caspases e PML é ainda desconhecida, e apesar de a clivagem da Bid mediada por caspase-8 induzida por TNF ter sido sugerida como contributo para a PML, estas constatações não podem ser verificadas em PML induzida por TNF de iMEFs deficientes em Bid. A Bid foi ainda sugerida como alvo para catepsinas nas vias da morte lisossómica implicando Bid a jusante, em vez de a montante, da PML. 0 TNF também estimula a quebra da esfingomielina em fosforilcolina e ceramida por ativação da esfingomielinase neutra (SMase) na membrana plásmica e SMase ácida ou acidica (aSMase) no compartimento lisossómico. Os dois eventos estiveram implicados na vias de morte celular induzida por TNF, mas até agora somente a SMase neutra foi associada com a PML através do fator associado à SMase neutra (FAN). Estudos baseados em iMEFs deficiente em FAN assim como fibroblastos humanos expressando uma forma negativa dominante de FAN mostrou que a FAN não somente medeia a produção de ceramida induzida por TNF, mas também contribui para o processamento de caspase-8 e morte celular. Uma vez que a PML induzida por TNF em hepatócitos de murino depende da caspase-8, o seu processo de redução pode explicar a reduzida PML em hepatócitos tratados com TNF expressando FAN negativa dominante. 0 papel de ceramida e seus metabolitos podem, no entanto, não ser excluído. 0 seu papel na sinalização de morte induzida por TNF é suportado pela reduzida hepatotoxicidade induzida por TNF e Faz em ratos deficientes em aSMase, a qual é ativada a jusante da caspase 8. Especialmente a esfingosina que é gerada a partir da ceramida numa reação catalisada pela enzima lisossómica ceramidase ácida é uma candidata tentadora, uma vez que, contrariamente à ceramida, não pode 59 atuar como detergente, desestabilizando diretamente a membrana lisossomal. Adicionalmente para aumentar a formação do precursor da esfingosina, a ceramida, por ativação das SMases, TNF regula os niveis de esfingosina também por desregulação para baixo mediada pela catepsina B da esfingosina quinase-1, uma enzima que converte a esfingosina pro-apoptótica numa esfingosina-l-fosfato anti-apoptótica. Esta atividade da catepsina B pode resultar na acumulação de esfingosina nos lisossomas e pode portanto, pelo menos parcialmente, explicar a necessidade da catepsina B para uma PML eficiente em hepatócitos tratados com TNF. 0 TNF pode também desencadear PML e morte celular na presença de inibidores da caspase. Esta via é independente da caspase-8, mas requere a proteína-1 interagindo com o recetor contendo o dominio da morte (RIP-1) e envolve a formação de espécies reativas de oxigénio. 0 stresse oxidativo pode, juntamente com ferro intra-lisossómico, gerar radicais oxigénio através da química tipo Fenton e desse modo pode causar oxidação dos lípidos da membrana lisossomal, resultando na desestabilização da membrana e libertação do conteúdo lisossómico. A ligação molecular entre RIP-1, stresse oxidativo e PML, no entanto, ainda falta. A indução da morte celular por vários indutores de apoptose clássica (por exemplo p53, etopósido e estaurosporina) também envolvem PML seguida por permeabilização da membrana mitocondrial dependente de catepsina. No entanto, as vias de sinalização destes estímulos para PML permanecem por revelar.

Mecanismos de defesa celular contra PML 60

Dado o resultado potencialmente fatal da PML, não é surpreendente que as células tenham desenvolvido numerosas estratégias para a neutralizar - quer inibindo a própria PML ou protegendo as células contra as hidrolases acidicas que escorrem para o citosol como consequência da PML.

Entre as suas muitas funções, a fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) foi referida para proteger os lisossomas contra a destabilização. A inibição da PI3K nas células endoteliais vasculares humanas induz a libertação de catepsina B para o citosol argumentando a favor de um papel bastante direto da PI3K na preservação da integridade da membrana lisossomal. Mais ainda, os inibidores da PI3K sensibilizam as células para as vias da morte lisossómica induzida por TNF e interleucina-1. Funções lisossómicas alteradas e niveis de expressão de catepsinas aumentados nas células cancerígenas podem por uma ameaça na forma de estabilidade diminuída dos lisossomas. Portanto, a PI3K, a qual é comummente ativada nas células cancerígenas humanas, pode também contribuir para a estabilidade lisossómica das células tumorais e, assim, aumentar a sua resistência à morte celular. Enquanto que o papel de PI3K na estabilidade de lisossomas de células tumorais é puramente especulativa, dados recentes defensores de um papel para a Hsp70 na proteção dos lisossomas contra estímulos destrutivos da membrana. Este trabalho tem sido feito principalmente nas células tumorais, as quais também demonstram muitas vezes uma localização de Hsp70 na membrana plásmica assim como no compartimento endolilsosómica.

No caso de libertação de proteases lisossómica para o citosol sobre PML, os inibidores da proteases lisossómica apresentam um baluarte contra as suas consequências perniciosas. Enquanto não são conhecidos inibidores endógenos da catepsina D, as catepsinas cisteína podem ser 61 efetivamente inibidas por pelo menos três dos inibidores da proteases citosómica, i.e. cistatina A e B e inibidor da serina protease 2A (Spi2A) as quais foram recentemente verificado possuirem potente atividade inibidora também contra várias catepsinas cisteina (B, Η, K, L e V) e catepsina G. A importância destes inibidores na prevenção de MCP em condições fisiológicas e patológicas é demonstrada por ratos deficientes em cistatina B os quais apresentam apoptose aumentada das células grânulos cerebelares. Além disso, a expressão de Spi2A é induzida na via de NF-κΒ através do tratamento TNF, e efetivamente inibem atividade da catepsina B induzida por TNF citosólico e a morte celular em MEFs. Curiosamente, tem sido descrito que apenas em C. elegans, o inibidor da protease serina citosólica (serpina)-6 pode proteger tanto contra as induções como os efeitos letais de uma lesão lisossómica causados por hipostresse osmótico assim como uma diversidade de stresses lisossomais, demonstrando que essa proteção contra a PML é um mecanismo evolutivamente conservado.

Doenças de armazenamento lisossomal

Doenças de armazenamento lisossomal (DALs) são um grupo de aproximadamente 40 distúrbios metabólicos hereditárias raras que resultam de defeitos da função lisossómica. DALs são causadas por disfunção lisossómica usualmente como uma consequência da deficiência de uma única enzima requerida para o metabolismo dos lipidos, glicoproteínas ou mucopolissacáridos. Embora cada distúrbio resulte de diferentes mutações de genes que se traduzem numa deficiência na atividade de enzima, partilham todos uma caracteristica bioquímica comum - todos os distúrbios lisossómico originam uma anormal acumulação de substâncias dentro dos lisossomas. 62

Individualmente, DALs ocorrem com incidências de menos de 1:100.000, no entanto, como um grupo de incidência é cerca de 1:5000 - 1:10.000. A maioria dos distúrbios são autossómicos herdados recessivamente, no entanto uns poucos são recessivamente herdados ligados a X, tal como Doença de Fabry.

As doenças de armazenamento lisossómica são geralmente classificadas pela natureza do material armazenado primário envolvido, e podem ser amplamente divididas nas seguintes: distúrbios de armazenamento de lípidos (ou lipidoses), principalmente esfingolipidoses (incluindo Doença de Gaucher e de Niemann-Picks) o gangliosidose (incluindo doença de Tay-Sachs) o leucodistrofias mucopolissacaridoses (incluindo síndroma de Hunter e doença de Hurler) distúrbios da armazenamento de glicoproteína (glicoproteinose) mucolipidoses

Conforme a gravidade das doenças os pacientes ou morrem numa idade jovem e imprevisível, muitos com poucos meses ou anos de vida, outros sobrevivem até a idade adulta sucumbindo finalmente a várias patologias do seu distúrbio particular. Os sintomas de várias DAL, dependendo do distúrbio particular podem ser moderados ou graves. Podem incluir atraso no desenvolvimento, distúrbios do movimento, convulsões, demência, surdez e/ou cegueira. Algumas pessoas com DAL têm fígados dilatados (hepatomegalia) e baços 63 aumentados (esplenomegalia), problemas pulmonares e cardíacos, e anormal crescimento ósseo. A maioria dos doentes são inicialmente triados por um ensaio de enzima, o qual é o método mais eficiente para chegar a um diagnóstico definitivo. Em algumas famílias em que as mutação(ões) causadoras de doenças são conhecidas e em certos isolados genéticos, a análise de mutação pode ser realizada. Como pode haver numerosas mutações diferentes, a sequenciação dos genes que codificam a enzima particular afetada é por vezes necessário confirmar o diagnóstico. 0 diagnóstico pré-natal pode ser útil quando existe um fator de risco conhecido. A presente invenção é numa forma de realização relacionada com um método para tratar distúrbios de armazenamento lisossomais.

Hidrólise de esfingolípidos lisossomais

Uma variedade de enzimas estão envolvidas no catabolismo lisossomal de esfingolípidos (ou glicofingolípidos) (ver figura 4). Estas enzimas, ou mais especificamente hidrolases, são cada uma responsáveis pela degradação de um esfingolípido específico.

As hidrolases lisossomais de esfingolípidos interagem com proteínas ativadoras esfingolípidas (SAP ou saposinas) para estimular a atividade das referidas hidrolases. As SAPs são consideradas para facilitar a interação enzima/substrato entre enzimas solúveis em água e substratos ligados a membrana.

Adicionalmente, a composição lipídica dos últimos compartimentos endossomal e lisossomal é caracterizada pela presença de fosfolípidos carregados negativamente tais como BMP e PI (fosfatidilinositol) , que também estimula a atividade de algumas hidrolases. As hidrolases lisossomais 64 dependentes de BMP incluem sialidase, α-galactosidase A, glucosilceramidase, β-galactosilceramidase, arilsulfatase A, ceramidase ácida e Esfingomielinase.

Co-fator de Saposinas

Saposinas são pequenas proteínas lisossomais que servem como ativadores de várias enzimas lisossomais degradador de lipidos. Provavelmente atuam isolando o substrato lípido da imediações da membrana, portanto fazendo-a mais acessível para as enzimas degradativas solúveis. Todas as saposinas de mamífero são sintetizadas como uma única molécula precurssora (prosaposina) a qual contém quatro domínios Saponina-B, produzindo as saposinas ativas após clivagem proteolítica, e dois domínios Saponina-A que são removidos na reação de ativação. Os domínios da Saponina-B também ocorrem noutras proteínas, muitas delas ativas na lise de membranas.

Prosaposina (PSAP) é uma proteína que em humanos é codificada pelo gene PSAP. Este gene codifica uma glicoproteína altamente conservada que é um precursor para 4 produtos de clivagem: saponina A, B, C, e D. Saponina é um acrónimo para Proteína Ativadora de Esfingolípidos ou SAP. Cada domínio da proteína precursora tem aproximadamente 80 resíduos de aminoácidos de comprimento com aproximadamente localização idêntica aos resíduos de cisteína e sítios de glicosilação. As saposinas A-D localizam-se primeiramente no compartimento lisossomal onde facilitam o catabolismo dos glicoesfingolípidos com pequenos grupos de oligossacáridos. A proteína precursora existe ou como uma proteína secretora ou como uma proteína de membrana integral e tem atividades neurotróficas. As saposinas A-D são requeridas para a hidrólise de certos 65 esfingolípidos através de hidrolases lisossomais específicas.

As saposinas são importantes co-ativadores da sialidase (SAP-B), α-galactosidase A(SAP-B), glucosilceramidase (SAP-C), β-galactosilceramidase (SAP-C), arilsulfatase A (SAP-B) e ceramidase ácida (SAP-D). A esfingomielinase acídica (aSMase) não é criticamente dependente de qualquer ativador de proteínas conhecido, no entanto a presença de saposinas aumenta a atividade desta enzima. Uma quinta saponina; ativador GM2 de proteína foi também caracterizada.

BMP

Bis (monoacil-glicero)fosfato (BMP), também conhecido como Ácido lisobisfosfatídico, é uma parte de uma composição lipídica de compartimentos tardios endossomais e lisossomais. É um fosfolípido carregado negativamente, mais especificamente um glicerol-fosfolípido. 0 BMP foi primeiro isolado a partir de pulmão de coelho mas é agora conhecido como um constituinte minoritário comum de todos os tecidos animais. A sua configuração estereoquímica difere da dos outros glicero-fosfolípidos animais nos quais a porção fosfodiéster está ligada nas posições sn-1 e sn-1' do glicerol, em vez de na posição sn-3. Permanece por esclarecer se as posições sn-3 e 3' ou sn-2 e sn-2' nas porções glicerol são esterifiçadas com ácidos gordos. Quaisquer que sejam as posições dos ácidos gordos na molécula de glicerol, as suas composições podem ser distintas com 18:1 (n-9) e 18:2 (n-6) , 20:4 e 22:6 (n-3) sendo abundantes, embora estes sejam altamente dependentes do tecido específico, do tipo de célula ou do organelo. Tais composições distintas sugerem funções relativamente específicas, algumas das quais têm ainda que ser reveladas. 66 BMP é usualmente um componente ainda menor dos tecidos animais. No entanto, é altamente enriquecido nos lisossomas de fígado e outros tecidos, onde pode quantificar até 15% ou mais dos fosfolípidos da membrana, e é reconhecido agora como um marcador para este organelo. São os endossomas tardios e os lisossomas que contêm o único lípido, o BMP. Claro que, parecem existir membranas internas dos endossomas tardios que contêm quase 70% dos fosfolípidos como BMP.

Se a presença referida de BMP em algumas estirpes alcalofílicas de espécies de Bacillus pode ser confirmada, esta será a única exceção conhecida à regra de que este lípido é estritamente de origem em mamíferos e não está presente em procariotas, leveduras e plantas superiores. Há uma boa evidência que o BMP é sintetizado a partir de fosfatidilglicerol, principalmente no sistema endossómico. No que se acredita ser a principal via, a fosfolipase A2 remove o ácido gordo da posição sn-2 do fosfatidilglicerol no primeiro passo. No segundo passo, o lisofosfatidilglicerol é acetilado na posição sn-2' da porção glicerol da cabeça de grupo para produzir ácido lisobisfosfatídico sn-3:sn-l', por meios de uma reação de transacilase com lisofosfatidilglicerol os dois como dadores de acilo e aceitador de acilo. O terceiro passo tem de ser ainda adequadamente descrito mas deve envolver a remoção do ácido gordo da posição sn-1 da unidade primária de glicerol e um rearranjo do éster de fosforilo da sn-3 para a posição sn-1. Finalmente a posição sn-2 da unidade primária de glicerol é esterifiçada, provavelmente através de uma reação de transacilação com outro fosfolípido como 67 dador (portanto as composições distintivas de ácido gordo). Outras vias biossintéticas podem ser possíveis. A função do BMP nos lisossomas está sob ativa investigação. Pode ter um papel estrutural no desenvolvimento do sistema complexo de membrana, ajudado por uma tendência para a não formação de uma bicamada. É uma molécula em forma de cone, e apoia a fusão de membranas ao pH dos endossomas. Mais ainda, a sua estereoquímica única significa que é resistente a fosfolipases, por isso vai dificultar ou prevenir a digestão das membranas lisosomais. Os constituintes ácido gordo podem reverter rapidamente por transacilação, mas a estrutura do glicerofosfato é estável. Uma outra possibilidade é que estes lípidos podem associar-se com proteínas específicas nos domínios da membrana, funcionalmente como jangadas. Tem sido sugerido que aquela rede característica de membranas ricas em BMP contida nos endossomas multivesiculares tardios regula o transporte de colesterol atuando como um ponto de recolha e de redistribuição. Por exemplo, quando as membranas lisosomais são incubadas com anticorpos para BMP, o colesterol tende a acumular-se. 0 processo está sob controlo de Alix/AIPl, a qual é uma proteína que interage especificamente com BMP e está envolvida na captação pelos endossomas multivesiculares. 0 BMP é conhecido por estimular grandemente as enzimas envolvidas na degradação de glicosilceramidas, tais como as esfingolípidos ativadores de proteínas como as saposinas. Neste caso, podem simplesmente funcionar para fornecer um ambiente adequado para uma interação das hidrolases glicosfingolipídicas e o seu ativador. Adicionalmente, tem um papel dinâmico na provisão de araquidonato para a produção de eicosanóides nos macrófagos alveolares. 68

Para enzimas dependentes de BMP, a taxa de hidrólise é aumentada grandemente quando o BMP está presente na membrana, para aSMase mesmo sem a presença de um ativador de proteina tal como saponina. Na figura 4, um circulo ponteado marca as enzimas, ou a doença na qual esta enzima está defeituosa, o que mostra a dependência de BMP. 0 BMP está envolvido na patologia de doenças de armazenamento lisossomal tais como doença de Niemann-Pick C (acumulação de colesterol) e certas lipidoses induzidas por fármacos. Nestas circunstâncias, a sua composição tende a mudar para favorecer espécies moleculares que contêm menos componentes poliinsaturados. É um antigénio reconhecido por soros autoimunes a partir de doentes com doenças raras ou pobremente entendidas conhecidas como sindrome antifosfolipido, assim é provavelmente um fator na base patológica nesta doença. A presente invenção está numa forma de realização relacionada com um método para tratar distúrbios de armazenamento lisossomal, através da exploração da interação entre Hsp70 e BMP.

Os distúrbios de armazenamento de lípidos

Os distúrbios de armazenamento de lípidos (ou lipidoses) são um subgrupo dos distúrbios de armazenamento sistema nervoso lisossomais no qual quantidades prejudiciais de lípidos se acumulam no espaço intracelular devido a expressão ou função reduzida das enzimas necessárias para metabolizar os lípidos. Ao longo do tempo, este armazenamento excessivo dos lípidos pode causar danos celulares permanentes dos tecidos, particularmente no cérebro, periférico, fígado, baço e medula óssea. 69

Os líp idos são um grupo vasto de moléculas que ocorrem naturalmente o qual inclui gorduras, ceras, esteróis, vitaminas lipossolúveis (tais como vitaminas A, D, E e K) , monoglicéridos, diglicéridos, fosfolipidos, e outros. Aa principais funções biológicas dos lípidos incluem armazenamento de energia, como componentes estruturais das membranas celulares, e como importantes moléculas sinalisadoras.

Os lipidos podem ser globalmente definidos como pequenas moléculas hidrofóbicas ou anfilíticas; a natureza anfilítica de alguns lípidos permite-lhes formar estruturas tais como vesículas, lipossomas, ou membranas em ambiente aquoso. Lípidos biológicos originam inteiramente ou em parte a partir de dois tipos distintos de subunidades bioquímicas: cetoacilo e grupos isopreno. Usando esta abordagem, os lípidos podem ser divididos em oito categorias: acilos gordos, glicerolípidos, glicerofosfolípidos, esfingolípidos, sacarolípidos e poliquétidos (derivados da condensação de subunidades cetoacilo); e lípidos esteróis e lípidos prenóis (derivados da condensação das subunidades isopreno).

Embora o termo lípido seja por vezes usado como um sinónimo para as gorduras, as gorduras são um subgrupo de lípidos chamados triglicéridos. Os lípidos englobam também moléculas tais como ácidos gordos e seus derivados (incluindo tri-, di-, e monoglicéridos e fosfolípidos), assim como outros metabolitos contendo esterol tal como colesterol. Vários distúrbios de armazenamento lisossomal caracterizados pela acumulação de lípidos (i.e., distúrbios de armazenamento de lípidos) têm sido caracterizados; estes são realçados aqui a seguir. 70 A presente invenção está numa forma de realização relacionada com um método para tratar distúrbios de armazenamento de lipidos.

Doença de Niemann-Pick A doença de Niemann-Pick (NPD) é causada por um defeito na enzima esfingomielinase acidica (aSMase), com o nome sistemático de esfingomielina fosfodiesterase. A maior parte da esfingomielina da membrana é hidrolisada pela enzima lisossomal aSMase para produzir ceramida (e fosfocolina). A esfingomielina consiste de uma membrana de ceramida ancorada que está ligada a uma curta porção de fosforilcolina hidrofilica.

Esfingomielinase não está criticamente dependente de qualquer ativador de proteínas conhecido, tornando o assumido dominio ativador intramolecular da aSMase e a presença de lipidos carregados negativamente nos lisossomas suficientes para a reversão da esfingomielina. A aSMase portanto não requere a presença de saposinas como co-fator; no entanto a presença de saposinas invariavelmente estimula adicionalmente a atividade desta enzima. (Ferlinz et al., 1999). A atividade da aSMase é estimulada pelo BMP.

Quando a esfingomielina não pode ser metabolizada adequadamente acumula-se dentro da célula, eventualmente causando morte celular e o mau funcionamento do dos sistemas de órgãos principais. Os sintomas podem incluir falta de coordenação muscular, degeneração cerebral, problemas de aprendizagem, perda de tónus muscular, aumento da sensibilidade ao toque, espasticidade, dificuldades de alimentação e deglutição, fala arrastada, e um figado e baço aumentados. Pode haver opacificação da córnea e um 71 característico halo vermelho cereja desenvolve-se em torno do centro da retina. A doença de Niemann-Pick (NPD) tem 4 tipos relacionados; tipos A, B, C e D. Todos os tipos de NPD são hereditários num padrão recessivo autossómico e podem afetar o sexo masculino e o feminino. Nos tipos A e B, uma insuficiente atividade da enzima aSMase causa a acumulação de quantidades tóxicas de esfingomielina. A doença ocorre quando ambas as cópias de um gene aSMase de uma pessoa (os dois alelos) têm uma mutação. A Niemann-Pick Tipo A (NPDA), o tipo mais comum, ocorre em crianças. É caracterizado por icterícia, um fígado dilatado, e danos cerebrais profundos. Não há atualmente nenhum tratamento eficaz para pessoas com o tipo A, e os doentes com o tipo A morrem na infância, usualmente antes dos 18 meses de idade. A Niemann-Pick Tipo B (NPDB) envolve um fígado e baço dilatados, o que ocorre usualmente na pré-adolescência, e são comuns os problemas respiratórios. A dilatação dos órgãos e os problemas respiratórios podem causar stresse cardiovascular e podem conduzir a doença cardíaca mais tarde na vida. Doentes com NPDB geralmente têm pouco ou nenhum envolvimento neurológico. 0 transplante de medula foi tentado em alguns doentes com tipo B, e resultados mistos foram registados. 0 desenvolvimento future da substituição da enzima e terapias genéticas podem também ser úteis para os com tipo B. Crianças com Tipo B podem viver um tempo de vida comparativamente longo, mas podem necessitar de suplemento de oxigénio por causa do comprometimento pulmonar. 72 NPDA e NPDB são ambas causadas pela mesma deficiência enzimática e há evidência crescente de que as duas formas representam estremos opostos de um contínuo. Pessoas com NPDA geralmente têm pouca ou nenhuma produção de aSMase (menos de 1% do normal) enquanto que os com NPDB têm aproximadamente 10% do nível normal de aSMase. Há aproximadamente 1.200 casos de NPA e NPB em todo o mundo com a maioria sendo do Tipo B ou uma forma intermédia. NPDA e NPDB são diagnosticadas medindo o nível da atividade de aSMase nas células brancas do sangue a partir de amostras de sangue. Enquanto este teste vai identificar pessoas com Tipo e B, ele não é muito fiável para detetar pessoas que são portadoras (que têm apenas uma cópia não funcional do gene ASM). Para além disso, o teste irá mostrar diminuição da atividade da aSMase, mas não se pode sempre prever se o indivíduo tem tipo A ou Tipo B ou uma variante intermédia da doença; isto requere avaliação clinica do indivíduo.

Em certas populações, mutações específicas contribuem para a elevada percentagem de casos de deficiência de aSMase. Para NPDA, as mutações R496L, fsP330 e L302P contribuem para mais de 95% das alterações genéticas causadoras de doença na população Ashkenazi judaica. Teste direto dos indivíduos nesta população para três alterações é usado para identificação de portadores. Noutras populações, as mutações devem primeiro ser identificadas nos indivíduos afetados antes do teste de DNA portador ser realizado aos membros da família.

Para NPDB, as mutações H421 Y e K576N de aSMase contam para 85% da população NPDB na Arábia Saudita; as mutações L137P, fsP189 e L549P contam para 75% da população NPDB Turca; as 73 mutações S379P, R441X e R474W contam para 55% da população NPDB Portuguesa; a mutação A196P conta para 42% da população NPDB Inglesa/Escocesa, e as mutações F480L e DeltaR608 têm também sido identificadas como causadoras de doença em doentes de NPDB. A Niemann-Pick Tipo C (NPDC) é muito diferente do Tipo A ou B. Doentes de NPDC não são capazes de metabolizar o colesterol e outros lipidos capazmente dentro da célula, e é caracterizada por um defeito que perturba o transporte do colesterol entre as células cerebrais. Consequentemente, quantidades excessivas de colesterol e outros lipidos acumulam-se no figado, baço e cérebro. A NPDC causa uma redução secundária da atividade da aSMase, o que leva a que os três tipos sejam considerados formas da mesma doença. Há variação considerável sobre quando aparecem os primeiros sintomas do Tipo C e a progressão da doença. Os sintomas podem aparecer mais cedo aos poucos meses de idade ou mais tarde na idade adulta. Paralisia do olhar vertical (a incapacidade de mover os olhos para cima e para baixo) , dilatação do figado, dilatação do baço, ou icterícia em crianças pequenas são fortes indicações de que NPC deve ser considerado. É comum que só apareçam um ou dois sintomas nos estádios precoces da doença. Em muitos casos, sintomas neurológicos começam a aparecer entre os 4 e 10 anos de idade. Geralmente, quanto mais tarde começarem os sintomas neurológicas, mais lenta a progressão da doença. A doença de Niemann-Pick Tipo C tem cerca de 500 casos diagnosticados em todo o mundo. Acredita-se, no entanto, que o número de pessoas afetadas por NPDC é superior, mas as dificuldades de diagnóstico não permitem uma avaliação rigorosa da taxa de ocorrência. A NPDC foi inicialmente diagnosticada como uma dificuldade de aprendizagem, atraso atraso no desenvolvimento da e ligeiro, impericia, capacidade motora fina. A Niemann-Pick Tipo D é agora considerada uma variante do tipo C. 0 Tipo D usualmente ocorre em pessoas com uma origem ancestral na Nova Escócia. Indivíduos com tipos C e D são frequentemente colocados em dieta com baixo colesterol, mas os seus benefícios clínicos não são convincentes. A esperança de vida das pessoas com os tipos C e D varia, no entanto a doença é sempre fatal. A vasta maioria das crianças more antes dos 20 anos. A NPDC é uma condição rara e extremamente variável e por conseguinte, não pode ser reconhecida por alguns prestadores de cuidados de saúde. Para os especialistas que suspeitem deste diagnóstico num doente, pode ser determinada tirando uma biópsia da pele, cultivando os fibroblastos, e estudando a sua capacidade para transportar e armazenar colesterol. O transporte de colesterol nas células é estudada medindo a conversão do colesterol de uma forma para a outra (esterificação) . O armazenamento de colesterol é avaliado por coloração das células com um químico (filipin) que brilha sob luz ultravioleta.

Em 1997, o gene NPC1 foi identificado. Mutações, ou alterações causadoras de doença, neste gene são responsáveis em cerca de 95% de todos os casos de NPDC. Desde então, mais de 250 mutações genéticas diferentes relacionados com NPDC foram identificados neste gene e no segundo gene de NPDC, chamado NPC2. Acima de tudo, em cerca de 95% dos casos, é possível identificar as alterações genéticas que tenham causado a doença se o diagnóstico de NPC foi primeiro confirmado pelo teste indicado acima. No entanto, porque existem tantas mutações únicas nestes genes, e existem doentes com NPC clássico em cujas mutações 75 não foram identificados, não é óptimo usar testes genéticos como uma ferramenta de diagnóstico geral para NPDC. A Doença de Niemann-Pick afeta todos os segmentos da população com casos reportados da América do Norte, América do Sul, Europa, África, Ásia, e Austrália. No entanto uma maior incidência foi encontrada em certas populações: • população Ashkenazi judaica (NPDA e NPDB) • população Canadiana Francesa da Nova Escócia (tipo D -agora considerada uma variante de NPDC) • Região do Maghreb (Tunísia, Morrocos, e Argélia) do Norte de África (NPDB) • População Hispano-Americana do sul do Novo México e Colorado (NPDC) A presente invenção está numa forma de realização relacionada com um método para tratar a Doença de Niemann-Pick, por modulação da atividade da enzima esfingomielinase acídica (aSMase).

Doença de Farber A Doença de Farber é causada por um defeito na enzima ceramidase ácida. A ceramidase ácida é responsável pela conversão de ceramida em esfingosina (e ácido gordo); o defeito portanto conduz a uma acumulação de ceramida. A sua atividade é estimulada por BMP e é dependente das saposinas. A ceramidase ácida é também conhecida como N-acilesfingosina amidohidrolase, e é codificada pelo gene ASAH1. É uma proteína heterodimérica consistindo de uma subunidade alfa não glicosilada e uma subunidade beta 76 glicosilada que é clivada numa enzima madura pós-translacionalmente. A Doença de Farber é também conhecida como lipogranulomatose de Farber, deficiência de ceramidase, Dismucopolisacaridose Fibrocitica, e Lipogranulomatose. É uma doença extremamente rara autossómica recessiva caracterizada por anomalias nas articulações, figado, garganta, tecidos e sistema nervoso central. 0 figado, coração, e rins podem também ser afetados. Os sintomas são tipicamente vistos nas primeiras poucas semanas vida e incluem deficiência motora e da capacidade mental e dificuldade em engolir. Outros sintomas podem incluir artrite, inchaço dos gânglios linfáticos e articulações, rouquidão, nódulos subcutâneos (e por vezes nos pulmões e outras partes do corpo), encurtamento crónico dos músculos ou tendões em torno das articulações, e vómitos. As pessoas afetados podem necessitar da inserção de um tubo traqueal. Em casos graves, o figado e baço estão dilatados.

Atualmente não há tratamento especifico para a Doença de Farber. Os corticosteróides podem ajudar a aliviar a dor. Os nódulos podem ser tratados com transplantes de medula, em certas circunstâncias, ou pode ser reduzido ou removido cirurgicamente. A maioria das crianças com a forma clássica da doenças de Farber morrem pelos 2 anos, usualmente de doença pulmonar. Indivíduos com uma forma mais branda da doença podem viver até à adolescência. A presente invenção está numa forma de realização relacionada com um método para tratar Doença de Farber, por modulação da atividade da enzima ceramidase ácida.

Doença de Krabbe 77 A Doença de Krabbe é causada por um defeito na enzima β-galactosilceramidase. A β-galactosilceramidase é responsável pela conversão da galactosilceramida em ceramida; o defeito portanto conduz a uma acumulação de galactosilceramida. A sua atividade é estimulada por BMP e é dependente de saposinas. A Doença de Krabbe é também conhecida como Leucodistrofia de Células Globóides ou galactosilceramida lipidose. É um distúrbio degenerativo autossómico recessivo raro, muitas vezes fatal que afeta a bainha de mielina do sistema nervoso. Ocorre em cerca de 1 em 100,000 nascimentos. Uma alta prevalência, cerca de 1 em 6,000 foi referida em algumas comunidades Árabes em Israel. A Doença de Krabbe é causada por mutações no gene GALC, o qual causa uma deficiência da enzima galactosilceramidase. A acumulação de lipidos afeta o crescimento da bainha de mielina protetora dos nervos (o revestimento que isola os muitos nervos) e causa grave degeneração das capacidades motoras.

Crianças com Doença de Krabbe são normais à nascença. Os sintomas começam entre os 3 e 6 meses de idade com irritabilidade, febre, rigidez dos membros, convulsões, dificuldades de alimentação, vómitos, e abrandamento do desenvolvimento mental e motor. Nas primeiras fases da doença, os médicos frequentemente erram os sintomas com os da paralisia cerebral. Outros sintomas incluem fraqueza muscular, espasticidade, surdez, atrofia ótica e cegueira, paralisia, e dificuldade ao engolir. Pode ocorrer perda de peso prolongada. Há também inicio de casos juvenis e de adultos de Doença de Krabbe, as quais são sintomas similares mas progressão mais lenta. Em crianças, a doença 78 é geralmente fatal antes dos 2 anos de idade. Doentes com início tardio da Doença de Krabbe tende a ter uma progressão mais lenta da doença e vivem significativamente mais tempo.

Embora não haja cura para a Doença de Krabbe, o transplante de medula tem mostrado beneficiar casos precoces da evolução da doença. Geralmente, o tratamento para o distúrbio é sintomático e de suporte. A fisioterapia pode ajudar a manter ou aumentar o tónus muscular e a circulação. Um estudo recente refere que transplantes de sangue do cordão tiveram sucesso na paragem da doença desde que tivessem sido feitos antes de sintomas evidentes aparecerem. A presente invenção está numa forma de realização relacionada com um método para tratar Doença de Krabbe, por modulação da atividade da enzima β-galactosilceramidase.

Doença de Fabry

Doença de Fabry é causada por um defeito na enzima ot-galactosidase A. A α-galactosidase A é responsável pela conversão de globotriaosilceramida em lactosilceramida; o defeito portanto conduz a uma acumulação de globotriaosilceramida (também abreviadamente como Gb3, GL-3, ou trihexoside ceramida). A sua atividade é estimulada por BMP e é dependente de saponinas.

[0171] A Doença de Fabry é também conhecida como Doença de Anderson-Fabry, Angioqueratoma corpóreo difuso, síndroma de Ruiter-Pompen-Wyers, trihexosidose Ceramida, e doença de Sweeley-Klionsky. É uma doença recessiva ligada a X (hereditária) que afeta indivíduos do sexo masculino hemizigóticos, 1 assim como indivíduos do sexo feminino 79 heterozigótcos e homozigótcos; indivíduos do sexo masculino tendem a sofrer os sintomas clínicos mas graves, enquanto que indivíduos do sexo feminino os sintomas variam desde os virtualmente sem sintomas até aqueles tão graves como os masculinos. Esta variabilidade pensa-se que é devida a padrões de inactivação de X durante o desenvolvimento embriogénico das indivíduos do sexo feminino.

Os sintomas incluem anidrose (falta de sudorese), fadiga, angioqueratomas (lesão cutânea benigna dos vasos capilares), dor de queimadura nas extremidades e comprometimento ocular. Angioqueratomas são pequenas pápulas indolores que aparecem em qualquer região do corpo, mas são predominantes nas coxas, nádegas, parte inferior do abdómen e virilha. Pode existir um comprometimento ocular cosmético mostrando a córnea verticilada (também conhecida como queratopatia em vórtice). A queratopatia pode ser a característica de apresentação em portadores assintomáticos, e deve ser diferenciada de outras causas de queratopatia em vortex (por exemplo deposição de fármaco na córnea). Outras ocorrências oculares que podem ser vistas incluem aneurisma conjuntival, cataratas posteriores tipo-raiado, papiloedema, edema macular, atrofia óptica e dilatação vascular da retina. As complicações do fígado são um comum e sério efeito da doença; a insuficiência renal e falência renal podem piorar ao longo da vida. Proteinúria é frequentemente o primeiro sinal de comprometimento do rim. Complicações cardíacas podem também ocorrer; os efeitos relacionados com o coração pioram com a idade e podem conduzir ao aumento do risco de doença cardíaca. Efeitos cerebrovasculares conduzem a um aumento do risco de enfarte. Outros sintomas incluem zumbidos, vertigens, náuseas e diarreia. 80

Os sintomas são tipicamente experienciados primeiro no inicio da infância e podem ser muito difíceis de compreender; a raridade da Doença de Fabry para muitos clínicos por vezes conduz a diagnóstico errado ou ignorância. As manifestações da doença usualmente aumentam em número e gravidade com a idade do indivíduo.

Até recentemente, o tratamento da Doença de Fabry incidia nos efeitos sintomáticos. No entanto, atualmente tem sido tratada a nível celular através de terapia de substituição de enzima (TSE) usando a Agalsidase alfa (Replagal) e Agalsidase beta (Fabrazyme) . O custo destes fármacos é problemático (aproximadamente $250,000 US por ano/doente) e permanece uma barreira para muitos doentes em alguns países. A terapia de substituição de enzima (tipicamente infusão a cada duas semanas) pode ser aplicada na casa dos próprios doentes. A terapia de substituição de enzima não é uma cura, e deve ser aplicada recorrentemente para máximo benefício. A presente invenção está numa forma de realização relacionada com um método para tratar a Doença de Fabry, por modulação da atividade da enzima α-galactosidase A.

Doença de Gaucher A Doença de Gaucher é causada por um defeito na enzima glucosilceramidase (também conhecida como glucocerebrosidase e β-glucosidase ácida); uma proteína de 55,6, KD 497 aminoácidos de comprimento. A Glucosilceramidase é responsável pela conversão de glicosilceramida (ou glucocerebrosida) em ceramida; o defeito portanto conduz a uma acumulação de glicosilceramida. A sua atividade é estimulada por BMP e é dependente de saponinas. 81 A doença de Gaucher é a mais comum das doenças de armazenamento lisossomal. 0 material gordo pode ser colhido no baço, figado, rins, pulmões, cérebro e medula óssea.

Os sintomas podem incluir dilatação do baço e figado, mau funcionamento do figado, distúrbios do esqueleto e lesões ósseas que podem ser dolorosas, complicações neurológicas graves, inchaço dos gânglios linfáticos e (ocasionalmente) das articulações adjacentes, abdómen distendido, uma tonalidade acastanhada da pele, anemia, plaquetas sanguíneas baixas e depósitos amarelos de gordura na esclerótica. As pessoas afetados muito gravemente podem também ser mais suscetíveis a infeção. A doença mostra hereditariedade autossómica recessiva e portanto afeta tanto indivíduos masculinos como femininos. Diferentes mutações da glucosilceramidase determinam a manutenção da atividade da enzima, e, em grande medida, o fenotipo. A investigação sugere que heterozigotos para mutações especiais de glucosilceramidase são um risco aumentado para a doença de Parkinson e em particular malignidades (linfoma não Hodgkin, melanoma e cancro do pâncreas). A Glicosilceramida é um constituinte da membrana celular dos glóbulos vermelhos e brancos. Os macrófagos que limpam estas células são incapazes de eliminar os produtos de resíduos, que se acumulam nas fibrilas, e regressam para as células Gaucher, as quais por microscopia ótica parecem assemelhar-se a papel amarrotado. A doença de Gaucher tem três subtipos clínicos comuns. Cada tipo está ligado a mutações particulares. Em todos, há mais de 80 mutações conhecidas. 82 • Tipo I (ou tipo não neuropático) é a forma mais comum da doença, ocorrendo em aproximadamente 1 em 50,000 nascimentos. Ocorre mais frequentemente entre pessoas com ascendência Ashkenazi judaica, 100 vezes a ocorrência na população geral. Os sintomas podem começar cedo na vida ou na idade adulta e incluem dilatação do figado e grande dilatação do baço (juntamente com hepatomegália); o baço pode romper e causar complicações adicionais. Enfraquecimento do esqueleto e doença óssea podem ser extensivos. O aumento do baço e a substituição da medula óssea causam anemia, trombocitopenia e leucopenia. O cérebro não é afetado, mas pode haver insuficiência pulmonar e, raramente, insuficiência renal. Os doentes neste grupo usualmente exibem equimoses facilmente (devido aos baixos niveis de plaquetas) e sentem fadiga devido ao baixo número de glóbulos vermelhos. Dependendo do inicio da doença e da gravidade, os doentes tipo 1 podem viver bem na idade adulta. Muitos doentes têm uma forma moderada da doença ou podem não mostrar quaisquer sintomas. • Tipo II (ou doença de Gaucher neuropática infantil aguda) tipicamente começa dentro dos 6 meses de idade e tem uma taxa de incidência de aproximadamente 1 em 100,000 nascimentos. Os sintomas incluem a dilatação do figado e baço, lesão cerebral extensiva e progressiva, distúrbios do movimento dos olhos, espasticidade, convulsões, rigidez dos membros, e uma capacidade deficiente para sugar e engolir. As crianças afetadas geralmente morrem cerca dos 2 anos de idade. • Tipo III (a forma neuropática crónica) pode começar em qualquer altura na infância ou mesmo na idade adulta, e ocorre em aproximadamente 1 em 100,000 nascimentos. É caracterizada por lenta e progressiva mas mais leves sintomas neurológicos comparados com a versão aguda ou tipo 2. Os principais sintomas incluem dilatação do baço 83 e/ou do fígado, convulsões, fraca coordenação, irregularidades do esqueleto, distúrbios do movimento dos olhos, alterações do sangue incluindo anemia e problemas respiratórios. Os doentes frequentemente vivem os seus de primeiros anos da adolescência e idade adulta. A National Gaucher Foundation estabelece que cerca de 1 em 100 pessoas em geral na população dos U.S. é um transportador do tipo 1 da doença de Gaucher, dando uma prevalência de 1 em 40,000; entre os Judeus Ashkenazi a taxa de portadores é consideravelmente mais elevada, cerca de 1 em 15. A doença de Gaucher Tipo 2 não mostra particular preferência por qualquer grupo étnico. A doença de Gaucher Tipo 3 é especialmente comum na população da região do Norte da Suécia de Norrbotten onde a incidência da doença é 1 em 50,000.

Para os doentes do tipo 1 e sobretudo do tipo 3, o tratamento de substituição de com glucosilceramidase recombinante intravenosa pode diminuir o tamanho do fígado e baço, reduzir as anomalias do esqueleto, e reverter outras manifestações. A raridade da doença significa que os estudos para encontrar a dose têm sido difíceis de conduzir, de modo que permanece a controvérsia sobre a dose e a frequência ótimas. Devido à baixa incidência, este tornou-se o fármaco órfão em muitos países. O tratamento atualmente existente para a doença de Gaucher, a Cerezyme® (imiglucerase para injeção), custa mais de $550,000 anualmente para um só doente e o tratamento é um outro fármaco aprovado para esta doença em 2003. O transplante da medula óssea cura com sucesso as manifestações não neurológicas da doença, dado que introduz uma população de monocitos com glucosilceramidase ativa. No 84 entanto, este procedimento acarreta riscos significativos e é raramente realizada nos doentes de Gaucher. A cirurgia para remover o baço (esplenoctomia) pode ser necessária em raras ocasiões de doentes com anemia ou quando a dilatação do órgão afeta o conforto do doente. A transfusão de sangue pode beneficiar alguns doentes anémicos. Outro doentes podem necessitar de cirurgia de substituição às articulações para melhorarem a mobilidade e qualidade de vida. Outras opções de tratamento incluem antibióticos para as infeções, antiepilépticos para as convulsões, bisfosfonatos para as lesões ósseas, e transplantes de figado. A terapia de redução de substrato pode provar ser eficiente para parar o Tipo 2, pois pode atravessar a barreira sanguínea no cérebro. Não há atualmente qualquer tratamento eficiente para as lesões graves do cérebro que podem ocorrer em doentes com os tipos 2 e 3 da Doença de Gaucher. A presente invenção está numa forma de realização relacionada com um método para tratar a Doença de Gaucher, através da modulação da atividade da enzima glucosilceramidase.

Sialidose A Sialidose, ou Mucolipidose tipo I (MLI), é causada por um defeito na enzima sialidase (ou alfa-neuraminidase). A Sialidase é responsável pela conversão de GM3 em lactosilceramida; o defeito portanto conduz a uma acumulação de GM3. A sua atividade é estimulada por BMP e é dependente de saponinas. A Sialidose é hereditária num modo autossómico recessivo. Os sintomas estão tanto presentes ao nascimento como se 85 desenvolvem dentro do primeiro ano de vida. Em muitas crianças afectadas, o inchaço excessivo em todo o corpo é notado à nascença. Estas crianças nascem muitas vezes com traços faciais grosseiros, tal como uma ponte nasal achatada, pálpebras inchadas, alargamento das gengivas, e tamanho excessivo da língua (macroglossia). Muitas crianças com nascem também com malformações do esqueleto tais como luxação do quadril. As crianças desenvolvem frequentemente contrações súbitas involuntárias dos músculos (a chamada mioclonia) e têm manchas vermelhas nos seus olhos (máculas vermelho cereja). São muitas vezes incapazes de coordenação voluntária dos movimentos (a chamada ataxia). Tremores, deficiência da visão, e convulsões também ocorrem. Testes revelaram um aumento anormal do fígado (heptomegália) e do baço (esplenomegalia) e extremo inchaço abdominal. As crianças geralmente têm falta d tónus muscular (hipotonia) e têm atraso mental que é inicialmente ou progressivamente grave. Muitos doentes sofrem de insuficiência de crescimento e de infeções respiratórias recorrentes. A maioria das crianças com ML I morrem antes da idade de 1 ano. A Sialidose pode ser sub-categorizada de acordo com a idade à qual os sintomas começaram e do tipo de sintomas presentes. Os efeitos da doença podem variar desde suaves a graves. A Sialidose é um distúrbio raro que não tem predileção racial. Muito poucos dados da população estão disponíveis, mas um estudo da Holanda referiu a frequência de aproximadamente 1 caso em 2,175,000 de nascimentos. No entanto, esta proporção pode não se aplicar a todas as populações, algumas das quais podem ter uma maior incidência; além disso, a falta de reconhecimento clínico 86 é um fator importante quando o rastreio dos recém nascidos não é uma opção.

As opções de tratamento para a sialidose permanecem limitadas e são primeiramente dirigidas para o tratamento de suporte e alívio sintomático. A presente invenção está numa forma de realização relacionada com um método para tratar Sialidose, através da modulação da atividade da sialidase.

Leucodistrofia metacrómica A Leucodistrofia metacrómica (MLD) ou deficiência de Arilsulfatase A é causada por um defeito na enzima arilsulfatase A (ou cerebrosido-sulfatase). A arilsulfatase A é responsável pela conversão de sulfatida (ou cerebrosida 3-sulfato) em galactosilceramide; o defeito portanto conduz a uma acumulação de sulfatida. A sua atividade é estimulada por BMP e é dependente de saponinas. É uma doença de armazenamento lisossómico que é comummente listada na família das leucodistrofias. A Leucodistrofia afeta o crescimento e/ou desenvolvimento da mielina, a cobertura de gordura que atua como um isolante em torno das fibras nervosas ao longo dos sistemas nervoso central e periférico.

Tal como muitos outros distúrbios genéticos que afetam o metabolismo dos lípidos, há várias formas de MLD, as quais são infantis tardias, juvenis, e adultas: • Na forma infantil tardia, a qual é a forma mais comum de MLD, as crianças afetados começam por ter dificuldade de andar após o primeiro ano de vida. Os sintomas incluem 87 perda de massa e fraqueza muscular, rigidez muscular, atrasos no desenvolvimento, perda progressiva da visão conduzindo a cegueira, convulsões, disfagia, paralisia, e demência. As crianças podem tornar-se comatosas. Se não tratadas, a maioria das crianças com esta forma de MLD morrem por volta dos 5 anos, muitas vezes mais cedo. • Crianças com a forma juvenil de MLD (aparecimento entre 3-10 anos de idade) usualmente começam com desempenho escolar deficiente, deterioração mental, e demência e depois desenvolvem sintomas similares aos da forma infantil tardia mas com progressão mais lenta. A idade da morte é variável, mas normalmente dentro de 10 a 15 anos do aparecimento dos sintomas. • A forma adulta comummente começa após os 16 anos de idade como um distúrbio psiquiátrico ou demência progressiva. A MLD que aparecem em adulto progride mais lentamente que as formas infantil tardia e juvenil, com um tratamento prolongado de uma década ou mais.

Em casos raros o corpo pode compensar a deficiência e a pessoa pode não exibir sintomas. Não há cura para a MLD, e nem qualquer tratamento padrão, é uma doença terminal. As crianças com aparecimento juvenil avançado ou em adultos, e os doentes infantis tardios que apresentam sintomas têm tratamento limitado para a dor e gestão dos sintomas. Doentes com MLD infantil tardia pré-sintomáticos, assim como aqueles com MLD juvenil ou adulta que são ou pré-sintomáticos ou que apresentam sintomas fracos a moderados, têm a opção de transplante de medula óssea (incluindo transplante de células estaminais), as quais estão sob investigação. A presente invenção está numa forma de realização relacionada com um método para tratar Leucodistrofia metacrómica, através da modulação da atividade da enzima arilsulfatase A.

Deficiência em saponina

Tanto em humanos como em ratos, as deficiências em prosaposina/saponina conduzem a déficites neurológicos graves.

Doentes Humanos com mutações pontuais na saponina A, B e C mostram fenotipos de Doença de Krabbe, leucodistrofia metacromática e Doença de Gaucher, indicando que os seus primeiros substratos in vivo são galactosilceramida, sulfatida e glucosilceramida, respetivamente. A Doença de Krabbe, atipica, devido a deficiência em saponina A: Um distúrbio bioquímico hereditário que resulta em regressão neurológica dentro de poucos meses após o nascimento. A morte ocorre usualmente durante os primeiros anos de vida. 0 distúrbio é similar à Doença de Krabbe mas diferencia-se pela origem genética do defeito bioquímico. A Doença de Krabbe envolve um defeito no gene galactocerebrosidase enquanto que a Doença de Krabbe atípica envolve um defeito no gene prosaposina o qual causa uma deficiência de saponina A. A Saponina B, previamente conhecida como SAP-1 e ativador sulfatida, estimula a hidrólise de uma grande variedade de substratos incluindo sulfato cerebrosido, GM1 gangliosido, e globotriaosilceramida pela arilsulfatase A, betabetagalactosidase ácida, e alfa-galactosidase, respetivamente. A deficiência humana de saponina B, transmitida como uma característica autossómica recessiva, resulta na acumulação de cerebroside sulfato nos tecidos e num quadro clínico que se assemelha à Leucodistrofia 89 metacrómica (Leucodistrofia metacrómica deficiente em ativador) embora com atividade arilsulfatase normal. A deficiência em Saponina B é uma doença heterógena com um espetro similar ao da Leucodistrofia metacrómica. A Saponina (SAP-)C é necessária para a degradação da glucosilceramida, e a sua deficiência resulta numa forma variante da Doença de Gaucher; Doença de Gaucher não neuropática devida à deficiência SAP-C. Niveis muito altos de atividade quitotriosidase, quimiocina CCL18, e concentração aumentada de glucosilceramida no plasma e atividade β-glucosidase normal nos fibroblastos da pele são observados nos doentes. A mutação missense, p.L349P, localizada no dominio SAP-C e outra mutação, p.MIL, localizada no codão de iniciação da proteína precursora de prosaposina foi identificada.

Em alguns doentes de Gaucher não neuropática, a mutação nas duas Saponina C e saponina D foi identificada.

Deficiências combinadas de saponina C e D em rato conduzem a um fenotipo neuronopático com acumulação de glucosilceramida e alfa-hidroxi ceramida.

Em rato, a deficiência em saponina D está associada com a acumulação de ceramida, a perda parcial de células Purkinje e deficiente função do sistema urinário. Este fenotipo não mimetiza a letalidade embrionária exibida pelos ratos com deficiência completa de ceramidase ácida, enzima cognata da saponina D.

Em humanos são conhecidas duas mutações que resultam na inactivação completa de todas as quatro saposinas e prosaposina. A total deficiência de saponina é uma doença devastadora com envolvimento de múltiplos órgãos e 90 múltiplos esfingolípidos. A deficiência de saponina combinada (ou deficiência em prósaposina) foi reportada num caso que se apresenta com uma distrofia neurovisceral grave que causou a morte em recém nascido. Múltiplos esfingolípidos estavam elevados na urina, com globotriaosilceramida mostrando o maior aumento. Uma nova mutação no gene PSAP foi identificada, sendo homozigótico para uma mutação no sítio aceitador de junção duas bases a montante do exão 10. Esta mutação conduziu a um codão de paragem prematuro e produziu baixos níveis do transcrito. A presente invenção está numa forma de realização relacionada com um método para tratar a deficiência de saponina. A referida deficiência de saponina pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em deficiência de saponina A, deficiência de saponina B, deficiência de saponina C, deficiência de saponina C, e deficiência combinada de saponina (ou deficiência de prosaposina).

Atividade enzimática residual

As doenças de armazenamento lisossomal são, tal como aqui descrito acima, causadas por uma enzima defetiva. A referida enzima defetiva pode não ter atividade residual, ou pode ter alguma atividade residual. A atividade enzimática residual como aqui usada significa que embora a enzima é defetiva, por exemplo causada por uma mutação, a atividade da enzima não é completamente abolida, mas sim reduzida a um nível patológico. A presente invenção relaciona-se num aspeto com um agente bioativo para uso no tratamento de uma doença de armazenamento lisossomal, e um método para tratamento de um indivíduo com uma doença de armazenamento lisossomal. 91

Numa forma de realização da presente invenção, a doença de armazenamento lisossomal que é tratada de acordo com a presente invenção é caracterizada como tendo atividade enzimática residual da enzima defetiva envolvida na patologia da doença.

Numa forma de realização, a atividade enzimática residual é num intervalo de desde 0,1% até 50%, tal como no intervalo de 0,1 até 1%, por exemplo 1 até 2%, tal como 2 até 3%, por exemplo 3 até 4%, tal como 4 até 5%, por exemplo 5 até 6%, tal como 6 até 7%, por exemplo 7 até 8%, tal como 8 até 9%, por exemplo 9 até 10%, tal como 10 até 11%, por exemplo 11 até 12%, tal como 12 até 13%, por exemplo 13 até 14%, tal como 14 até 15%, por exemplo 15 até 20%, tal como 20 até 25%, por exemplo 25 até 30%, tal como 30 até 35%, por exemplo 35 até 40%, tal como 40 até 45%, por exemplo no intervalo de 45 até 50% de atividade enzimática residual.

Atuais modalidades de tratamento para DAL Não há curas para as doenças de armazenamento lisossomal e o tratamento é principalmente sintomático, apesar de o transplante de medula óssea e a terapia de substituição de enzima (TSE) estarem a ser tentadas com algum sucesso. Adicionalmente, o transplante de sangue do cordão umbilical está a ser realizado em centros especializados para várias destas doenças. A terapia de transplante é no entanto acompanhada por maiores efeitos secundários e muitas vezes põe complicações aos doentes. Adicionalmente, a terapia de redução de substrato, um método usado para diminuir a acumulação de material de armazenamento, está atualmente a ser avaliada para algumas destas doenças. 92

Para a maioria das doenças de armazenamento lisossomal, a principal necessidade não atendida para proporcionar uma modalidade de tratamento eficaz permanece. A terapia de substituição de enzima foi desenvolvida para um subconjunto das doenças de armazenamento lisossomal, e o Cerezyme® está no mercado por várias anos para o tratamento da Doença de Gaucher. A enzima defetiva, glucocerebrosidase, é feita por técnicas recombinantes, e dada por infusão intravenosa durante algumas horas. 0 tratamento não é uma cura e os doentes requerem tratamento para toda a vida para parar a progressão da doença. Alguns sintomas podem melhorar através de TSE.

No entanto, para a maioria dos DALs, um TSE eficiente não foi desenvolvido. Isto pode ser porque a produção de enzima ativa provou ser uma tarefa dificil, devido à estrutura complexa das sub-unidades das enzimas defetivas. Claro que, as enzimas podem dobrar de forma incorrecta depois de produzidas.

Para estas DALs em que TSE está disponível, existem desvantagens que tornam esta forma de terapia menos desejável. Primeiro e acima de tudo, TSE é uma forma de terapia muito dispendiosa, a qual é um encargo financeiro para a sociedade e torna-a inacessível para alguns doentes. Também, o TSE é direcionado especificamente para uma única doença. Alguns efeitos secundários foram referidos para o Cerezyme®, incluindo o desenvolvimento de uma resposta imune, náusea, vómitos, dor abdominal, diarreia, erupção, fadiga, dor de cabeça, febre, tonturas, calafrios dor nas costas, e ritmo cardiaco acelerado assim como sintomas sugestivos de reacções alérgicas. 93

As divulgações feitas na presente invenção fornecem portanto um novo método inovador para o tratamento das doenças de armazenamento lisossomal. Este é particularmente relevante para estas doenças para as quais nenhuma terapia eficiente foi desenvolvida, aquelas que podem beneficiar de um tratamento menos caro, e aquelas que podem beneficiar de uma combinação de terapia compreendendo o agente bioativo da presente invenção.

Como aqui divulgado, o método de acordo com a presente invenção fornece uma modalidade de tratamento que é mais barata para produzir TSE e tem como alvo mais de um distúrbio de armazenamento lisossomal especifico.

Os chaperones moleculares, ou proteínas de choque térmico, são aqui introduzidos a seguir como os investigadores uma interação entre proteína 70 de choque térmico e o BMP lisossómico, como aqui introduzido acima, constitui a base para modulação atividade enzimática lisossomal, e tratar distúrbios de armazenamento lisossomal, de acordo com a presente invenção.

Os Chaperones Moleculares

Depois de gastar grandes quantidades de energia após a primeira transcrição e depois traduzir o código genético do DNA, a célula produziu finalmente um polipéptido, cuja função presumivelmente é requerida nesta altura da vida da célula. No entanto, alguns obstáculos finais são para serem ultrapassados com vista a atingir uma proteína totalmente funcional - uma destas sendo corretamente dobrada desta cadeia polipéptido nascente. Os imperativos evolutivos de alcançar a correta dobragem são óbvios - não só seria um terrível desperdício de energia ter sintetizado um péptido sem a conformação adequada e portanto a função, mas também a agregação dessas proteínas no lúmen celular poderá ser 94 prejudicial para a célula. Esta agregação é de facto um resultado muito provável, considerando o ambiente intracelular de alta concentração de proteína, por isso, não surpreende que uma complicada e sofisticada maquinaria das proteínas existe para auxiliar a dobragem das proteínas, permitindo um estado funcional das proteínas seja mantido sob essas condições. Estas proteínas são coletivamente chamadas de chaperones moleculares, porque, como as suas homólogas humanas, evitam interações não desejadas entre os seus clientes imaturos.

As chaperones moleculares são encontradas em todos os compartimentos da célula onde ocorrem rearranjos conformacionais das proteínas, e embora a síntese das proteína seja a principal fonte de péptidos sem dobragem na célula, um desafio para a célula por alta temperatura ou outros estímulos que possam tornar as proteínas estruturalmente lábeis, e portanto, sujeitas a não dobragem e agregação, é encarada com uma resposta específica celular envolvendo a produção de proteínas protetoras. Esta resposta é um fenómeno observado em todos os tipos de células desde procariotas até eucariotase é referido como resposta a stress de choque térmico. As proteínas induzidas por esta resposta são conhecidos como choque térmico de proteínas (HSPs), das quais existem várias famílias. Estas famílias são compostas quer de proteínas sequencialmente, estruturalmente e funcionalmente relacionadas, enquanto que as companheiras das diferentes famílias podem diferir marcadamente na estrutura assim como na função celular. Um primeiro exemplo de uma família das chaperones são as proteínas Hsp70, que constitui a parte central de uma sistema acompanhante ubíquo presente na maioria dos compartimentos das células eucarióticas, em eubactérias, e em muitas archae. Esta família foi recentemente implicada noutros aspetos de homeostase celular para além de servirem 95 como um acompanhante o mais marcadamente através da suas características anti-apoptóticas, as suas funções na imunidade, e a aparente dependência de células cancerígenas na regulação para cima de Hsp70.

Família de Proteína 70 de choque térmico

As proteínas Hsp70 estão envolvidas numa vasta gama de processos celulares incluindo dobragem de proteína e degradação de proteínas celulares instáveis assim como servindo outros papeis citoprotetores. A função comum das Hsp70 nestes processos parece ser a ligação a segmentos hidrofóbicos curtos em polipéptidos parcialmente dobrados, facilitando deste modo dobragem correta e prevenindo a agregação. Nas eucariotas, as chaperones Hsp70 interagem in vivo com diferentes classes de proteínas que servem para regular passos criticos do seu ciclo funcional; entre estas a familia proteina Hsp40 do dominio J. Mais ainda, proteínas parceiras adicionais foram identificadas, algumas das quais ligam a Hsp70 a outro sistema acompanhante tal como o sistema Hsp90.

Membros da família Hsp70 Humana

Algumas da funções importantes atribuídas aos chaperones moleculares incluem a importação de proteínas para os compartimentos celulares, dobragem de proteínas no citosol, retículo endoplásmico e mitocôndria, prevenção da agregação da proteína e redobragem das proteínas sem dobragem. Atualmente a família de Hsp70 humana inclui 10 membros codificados por diferentes genes, e esta secção é entendida para fornecer uma visão abrangente destes membros da família em relação à função, padrão de expressão e homologia. Existe alguma confusão acerca da nomenclatura dos diferentes membros da família de Hsp70 humana, apesar de um conjunto geral de orientações terem sido 96 estabelecidas sobre isto por Tavaria et al., o qual fornece uma ligação lógica entre nomes de locais, genes e proteínas. No entanto, como existe alguma confusão, interespécies os genes e proteínas Hsp70 são referidos aqui pelo nome do local. 0 nome Hsp70 pode referir os dois membros da família das Hsp70 inducíveis com os nomes de local HSPA1A e HSPA1B ou cpm toda a família Hsp70 em geral como evidente a partir a partir do consenso do texto. No entanto, como utilizado ao longo da presente invenção, a Hsp70 é para incluir qualquer dos dois membros da família Hsp70 inducíveis com os nomes de locais HSPA1A e HSPA1B.

HspAlA e HspAlB

Os genes transcritos a partir dos locais HSPA1A e HSPA1B são os dois genes Hsp70 indutíveis por stresse de calor e a maioria da literatura relativa a Hsp70 humana refere-se a proteínas codificadas por estes dois genes. Os genes dão origem a proteínas consistindo de 641 aminoácidos, com 99% de homologia uma com a outra e foram os primeiros membros da família Hsp70 de humano a serem clonados e caracterizados. Os genes são ligados a complexo III da classe MHC no 6p21.3, são sem intrão e com regiões promotoras contendo HSEs, viabilizando que eles se liguem a HSFs e induzam transcrição em resposta a uma variedade de agressões celulares. A sequência de proteína para de choque térmico de proteína 1 A de 70kDa de Homo sapiens (HSPA1A) é a (SEQ ID N0:1) (N° registo NM 005345.5): 97 KRiíXí^rsofWOSCiWKawPWx^oeoKPswsíiK^riíAFXFKEissiWfciKiesEiAiÃYiiiexfrr

HàVrrWAXF«DSO^AXKDA<SVÍAGLNVLRIINEFt^ÃA?lI&'/aLDRf<3KG^Rma.rF»lííS^3TF:DW>Xlí II DI^X F E VKAXAG0TM LÍ^SDF&^RL VMF VEEFKSEHKItEtI SO^KR^yBBLRÍÃCSÍUyCSTtSSSXaa S:LBIOSLFFfâí:DFyXSXtMftFFÍU;S0tFRSfLKPVEKÀEADAKI<»í(AOl3íStVt¥âGSIRIF»:vOKÍ>íi O£>FF«GR0LbmSIMFDEAVàXmAVaAAIl^fâÕKSimíQOl.LttD%^ÉS^EÍIASaVj4mtXK»MSTI FTKÇTQIFITfS©NQFGVLIQV’IEGeRAMfKmí5íl*CíGRFS0$§tFI>ÃFRSVFer£VÍTei0A^SILNVTA TOKSTGKAKKI r í «DKGRlSKESI SemíQE?.EK¥KAKDKVQREííVSAKHAl,ES,s'AF?'jf;IKSAVSDEGI.KG KliSEADKKKVLOSíCCEVXSWt.OANTl.AlKDSFSHKAKELgOVefíFI.rSQÍíXOGA^FGFOGFâAOQ^KGS SGSGPTXEEVD A sequência de ácido nucleico (DNA) para choque térmico de proteína IA de 70kDa de Homo sapiens (HSPA1A) é a (SEQ ID NO: 2) (no. Registo NM_005345.5): I &feaaaegccc aggggcaagc ggfcccggafca acggctagec tgaggagetg ctgcgacagt 61 ecsetacefcfe tfctcgagagt gaeteeegtt gfccçcaaggc tteccagagc gaaccfcgtgc 121 ggctgcaggc accggegegt ©gagfctfcccg gcgttcggaa ggaccgaget cttctcgegg 18 i atccagtgtt ecgtttecag eccççaatct cagageggag ctgacagsga gcagggaacc 241 ggcatggeca aagecgegge gatcggCáte gacctgggça ccaccfcacte etgcgtgggig 301 gtftfeeeaae acggeaaggt ggaçateaig geeaaegacc agggcaaecg caeeatceee 3St agctâcgtgg cctteaegga e&oegagisgg ctcategçgg atgcggecsa gaaccaggtg 421 gçgetgaaec cgcageacse cgfcgtrfcgaç gçgaagcçfc tgattgeceg eaagttcgge 4ft g&eeeggtgg tgcagfccgga catgaeçeac tggçctttgg aggtgafccaa cgaeggagac 341 «agcccaagg tggaggtgag cfcaeaagggg gagaecaaggr «afcfccfcaceg egaggagsfcç 601 tcgfcççstgg tgcfcgaccaa gatgaaçgaç «tcgccgagg çgtaçcfeggg çtaççcggtg 661 accaacgcgg tgatcaccffc gccffestac ttcaaegaet cgcagcfcca ggeeaccaag 221 gatgegggtg fcgafcegcggg gcfceaacgtg etgefgafcea teaaegagec eacggctgec 781 fccafccgget aeggecfcgg* cagaacgggc aagggggage gçaacgfcgefc catctttgac 84.X ctgggcgggg gcacctfccga cgfcgtecsfce ctgacgatcg aegaeggcat. ettegaggtg 901 aaggccacgg ccggggaeac ccacetgggt ggfgaggact fcfcgaeaaeag gctggtgaac 961 cacttcgfegg aggagtfcea* gagaaaacac aagaaggaca teagecagaa caagcgagcc 1025, gtgaggcggc tgcgcactge etgcgagagg gccaagagga ecctgtcgfcc cagcacccag ló8i gceegcctggr agatcgactc «ctgtttgag ggeatcgaet tstacacgtc eatcaceagg 1141 gegaggtteg aggagctgtg etecgaccfcg ttccgaagea eeetçgagec cgtggagaaq 1261 getctgcgeg acgecaagcfc ggaeaaggcc cagatfccacg scctggtctfc ggteggçgge 1261 tccaccegca fcccccaaggt geagaagcfcg ctgcaggact tcfctcaaegg gcgc.gac.ctg 1321 aaeaagagca tcasecccga cgaggetgtg geetaegggg cggcggtgca ggeggccate 1381 ctgatggggg acaagtccga gaacgtgcag gseetgctge tgcfcggaégt ggcfecccctg 1.441 tcgcfeggfgc tggagacggt cggaggegtg atgactgtce tgateaagég íusaefcccaec 1501 atccccaeca ageagacgca gatctteacc seetactccg ãeaaccaãce cggggtgctg 1361 afeecaggfcgt scgagggííga gagggccatg acgaaagaes acaetétgtt ggggçgetfcic 1621 gagçtgâgcg gçátçççt.ç<í ggçsccéã.gg ggcgtgcccc ágategaggt gaccttcgaé: 1.681 afeegalgçcá acggeafctíít gaadgteaçg geçâcggaea agagcaeegg çaaggceaae 174.1 *#g«tç»CC« tcaccsacga caagggccgG ctgagçaagg aggagstçga gcgcatggtg 1.S01 caggaggçgg agaagfcacaa ageggaggac gaggtgeage gcgagagggt gteagceaag 1861 aacgecetgg agtcetacgc cttcaacatg aagagcgccg tggaggatga gççgcteaag 1321 ggca&gatea gcgaggcgga eaagaagâag gtgctggaea sgtgteaaga ggtcat^cg 1981 tggctggacg ccaao-acctt ggccgagaag gacgagttfcg agcacaagag gaaggagctg 2041 gagcaggtgt gtaaceecat catcagcgga ctgtaccagg gtgccggfcgg ttccgggcct 2101 gggggctteg gggctcaggg tcceaaggga gggtctgggt caggteccac cattgaggag 2161 gtagattagg ggeettfccca agattgctgt ttttgttttg gagcttcsag actttgeatt 2221 teetagtafct tetgtttgte agttctcaat ttcctgtgtt: tfeaatgttg aaatttfcttg 22S1 gtgaagtaet gaacttgctt tttttseggfe txttacsfcgç agsgatgaat Etatactgcc 2341 attttacg&c tatttcttct ttttaataca ctfcaaetcsg gccatfctttt aagttggtta 2401 cttcaaagta asfcaaacttt aaãattceaa a««ea*a*â* aaaaa 98 A sequência proteína para choque térmico de proteína 1 B de 70kDa de Homo sapiens (HSPA1B) é (SEQ ID NO: 3) (No. Reqisto: NM_005346): A sequência de ácido nucleico (DNA) para choque térmico de proteína 1 B de 70kDa de Homo sapiens (HSPA1B) é (SEQ ID NO: 4) (No. Registo: NM_005346): 1 ggaaaaeggc eagcsfegagg agefcgisfcgcg agggfcccgcfc fccgfccfcfctcg «gagtgactc 61 ccgcfgtccc aàqqetttcú «gagegaAOO fcgfefegggfcg eaggeassegg egtgttg&gt 221 tfcscggeçtt ceçaagçect gagctcttgfc. cgoggatccc gtccgccgtfc tccagcccec 181 agtctcagag cggaçpcccac agagcagggc accggoafcgg ccaaagccgg ggcgatcggc 241 afecgecctgg gcaccaceta cfc»ctg«8fcg gggftgttcc ««çacggcaa ggtggagatc 331 âtcgeesaeg aecaggg&aa ccgcaccace ««cagctaeg tggcefctcas ggacacegag 361 «ggctcatcg -gggafcgeggc eaagsaercsg gfcggegstga accegeagaa çaeegfcgfct-fc 42.1 gaegegaagc ggctfatcgf ccg«.a«.gtfcc ggcgacccgg tggtgeagte ggacatgaag 481 «aetggectfc icc&ggfcgfafc caaegsegga gacaagceca aggcgcaggt gagetacaag 541 ggggag&cca aggcafcfcct* ecceçaggag stctegtcca 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HspA 1 L e HspA2

Dois membros da família Hsp70 foram chamados "genes chauvinistas" porque as células germinativas masculinas favorecem a sua expressão com forte prejuízo. 0 gene hspAlL é um membro da família Hsp 70 sem intrão constitutivamente expresso localizado 4kb telomérico do local HSPA1A no mesmo complexo III classe MHC no cromossoma 6. É expresso em pequenas quantidades tanto antes como depois do choque térmico mas com o padrão de expressão favorecendo os testes em rato, ratazana e humanos com os 641 aminoácidos (aa) de proteína sendo 90% homólogos a HspAlA. O gene hspA2 foi primeiro isolado a partir de uma biblioteca genómica de rato e foi mais tarde mostrado ser constitutivamente expressa embora em baixos níveis em vários tecidos no corpo humano incluindo músculo esquelético, ovário, intestino delgado, cólon, cérebro, placenta e os rins, mas altamente expressos no testículo. A sua expressão, ou antes a falta dela, foi ligado com espermatogénese humana anormal e ratos hspA2(~/~> machos são estéreis. O gene está localizado no cromossoma 14, dando origem a uma proteína 639 aa com 84% de homologia a HspAlA, embora a localização exacta esteja sujeita a discussão como dois papéis têm apresentado diferentes posições de locais -14q24.1 vs. 14q22.

HspA6 e HspA7

Os genes hspA6 e hspA7 são membros indutíveis por calor da família Hsp70 sem homólogos aparentes em ratinhos. Contêm HSEs nos seus sítios promotores e os genes são sem intrão. Estão co-localizados no cromossoma 1 e são 94% homólogos uns dos outros na sequência de nucleótidos. No entanto somente HspA6 é funcional como gene abrigo hspA7 uma única inserção nucleótido gerando um codão de paragem prematura a 100 +1324. A proteína HspA6 tem 643 aa de comprimento e mostra 77% de homologia com HspAlA e HspAlB.

HspA5 e HspA9

Os genes hspAS e hspA9 são os dois membros específicos de compartimentos da família Hsp70. A proteína HspA5 de 655 aa está localizada no retículo endoplásmico (ER) e facilita a dobragem e transporte de proteínas sintetizadas de novo neste compartimento. A proteína é 64% homologa com HspAlA, estando o gene localizado em 9q34. A proteína HspA9 de 679 aa está localizada na mitocondria onde ajuda na dobragem de proteínas após o seu transporte através da membrana mitocondrial. A HspA9 está localizada na 5q31.1, sendo a proteína 52% homologa com HspAlA.

HspA8 0 membro cognato Hsp70 conhecido como Hsc70 é codificado por um gene chamado hspA8 a llq24, dando origem a uma proteína de 646 aa com 86% de homologia com HspAlA, e é constitutivamente expresso em todos os tecidos e linhas de células. A proteína é análoga à Hsp70 nas suas funções celulares, garantindo o chaperonamento requerido sob circunstâncias normais, mas tem também sido atribuído um papel no não revestimento de vesículas revestidas com clatrina assim como na autofagia mediada por chaperone.

HspA3 e HspA4

Estes não vão ser aqui discutidos, dado que como não há dúvida quanto ao facto de se HSPA3 existe em tudo e uma vez que HSPA4 é mais provável um membro da família HspllO e 101 nada se sabe até agora, exceto que a sua localização cromossómica em 5q31.1-2.

Tabela 1: Lista da Familla de Gene Hsp70 Humano. Os genes são listados de acordo com o nome de local, nomes aqui usados, localização cromossómica (posição), homologia de aminoácido a HspAlA assim como nomes alternativos muitas vezes vistos na literatura.

Local Nome aqui usado gene/proteína Posição % de homologia para HSPA1A Nomes alternativos HSPA1A hspAlA/HspAlA (Hsp7 0) 6p23.1 100 Hsp70; Hsp72; Hsp70-1 HSPA1B hspAlB/HspAlB (Hsp7 0) 6p23.1 99 Hsp70; Hsp72; Hsp70-2 HSPA1L hspAlL/HspAlL 6p23.1 90 Hsp70-Hom; Hsp70t HSPA2 hspA2/HspA2 14q24.1 84 Hsp70-3 HSPA4 hspA4/HspA4 5q31.1 31 Hsp70RY: APG-2 HSPA5 hspA5/HspA5 9q34 64 BiP; GRP78 HSPA6 hspA6/HspA6 iq 84 Hsp70-6; Hsp70B' HSPA7 hspA7/HspA7 iq Hsp70-7; Hsp70B HSPA8 hspA8/HspA8 (Hsc70) llq24 86 Hsc70;Hsp73 HSPA9 hspA9/HspA9 5q31.1 52 GRP75; PBP74; mtHsp75; mortalina; mot-2

Regulação de Hsp70 Transcricional

As pegadas genómicas do promotor de Hsp70 humano tem revelado que o stresse/choque térmico induz uma rápida ligação dos fatores de transcrição do choque térmico (HSF) à região englobando as sequências nGAAn chamados elementos de choque térmico (HSEs). Sob condições normais Hsp70 está ligada a HSFs, que reside no citosol, mas durante o stresse as HSFs são separadas da Hsp70 e adaptam uma conformação 102 homotrimérica por fosforilação por PKC ou outras quinases serina/treonina. Os trimeros HSF entram nos núcleos, onde se ligam a HSEs localizados numa região promotora dos genes Hsp70 e tornam-se mais fosforiladas pelas quinases HSF.

Três HSFs foram até agora caracterizados em humanos (HSF1, HSF2 e HSF4) . O HSF1 é o principal fator de transcrição ativado sob a maioria das condições de stress e responde a uma vasta gama de estímulos, os quais podem ser divididos nas categorias de fisiológicos (por exemplo divisão celular, estimulação hormonal), patológicos (por exemplo infeções, febre, inflamação, malignidade) e condições ambientais (por exemplo choque térmico, metais pesados, etanol). HSF2 responde somente a hemina, enquanto que HSF4 é preferencialmente expresso no coração, pâncreas, cérebro e músculo esquelético de humanos, falta da repetição hidrofóbica C-terminal que é partilhada entre todos os HSFs vertebrados e parece reprimir a expressão dos HSPs. A regulação do gene Hsp70 responsável pela sintese da Hsp70 constitutivamente expressa (Hsc70) não é claramente entendido, mas o HSFs não parece estar envolvido.

Apesar de o HSFs ser o mais proeminente dos fatores de regulação da expressão de HSP, outros fatores de transcrição foram mostrados possuir a mesma capacidade. Fatores específicos de caixa de ligação CCAAT (CBF) mostraram induzir a transcrição de Hsp70, o supressor de tumor p53 pode reprimir a transcrição ligando a região promotora de Hsp70 e neutralizando CBF, e HSFs pode ser antagonizado pelo fator de choque térmico ligando a proteina 1 (HSBP1), a qual neste modo atenua a transcrição de Hsp70.

Propriedades de Hsp70 Estruturais e Funcionais 103 A estrutura e função do sistema Hsp70 são melhor entendidos para a Hsp70 eubacteriano, DnaK, o seu Hsp40 co-chaperone DnaJ e o fator de troca de nucleótido GrpE. Porém, o mecanismo é geralmente considerado para ser análogo nos eucariotas, apesar de a evidência sugerir um desacoplamento de GrpE. Esta secção incidirá sobre o sistema eucariota de Hsp70, mas deverá incluir comentários sobre o sistema eubacterianao, onde isto é considerado apropriado.

Hsp70 é compreendido por duas entidades funcionais - um dominio ATPase N-terminal e um dominio de ligação péptido C-terminal menor. O dominio ATPase compreende dois subdominios separados por uma fenda contendo o sitio de ligação de nucleótidos, que determina as propriedades de ligação a péptido do dominio C-terminal. Quando o ATP está ligado, substratos de péptido ligam-se e dissociam-se rapidamente, embora com baixa afinidade, enquanto que num estado onde quer nenhum nucleótido ou ADP está ligado ao dominio N-terminal, as taxas de ligação péptido e de dissociação decrescem e a afinidade aumenta. A hidrólise de ATP portanto serve como um interruptor molecular entre dois estados de Hsp70, o ciclo do qual é regulado pela proteína Hsp40 da família do domínio J em eucariotas e DnaJ e GrpE em eubactéria. O domino J N-terminal de Hsp40 liga a Hsp70 acelerando a hidrólise ATP, facilitando por este meio a captura de péptido, enquanto que a parte C-terminal das funções Hsp40 como um chaperone através do reconhecimento de péptidos hidrofóbicos, em que Hsp70 é recrutado às cadeias de polipéptido nascentes. É importante notar que os chaperones moleculares não fornecem informação estérica específica para a dobragem da proteína ligada, mas sim inibir interações improdutivas, portanto permitindo à proteína dobrar-se de forma mais eficiente na sua estrutura original. 104

Em eubactérias, GrpE induz a libertação de ADP a partir de DnaK (Hsp70 bacteriano), enquanto que para proteínas Hsp70 eucarióticas esse fator parece ser dispensável porque o passo limitante da taxa neste ciclo de ATPase não é a dissociação do ADP ligado mas sim a própria hidrólise do ATP. No entanto, proteínas adicionais servem para regular a função Hsp7 0 em eucariotas; a proteina homo-oligomérica Hip (Proteina de interação com Hsp70) servindo como um regulador positivo por estabilização do estado ligado a ADP do Hsp70, enquanto que as proteínas Carboxi-terminais da proteina de ligação a Hsp70 (CHIP) e atanogene-1 associado a Bcl-2-(Bag-1) têm ambos efeitos inibidores - CHIP por inibição de ATPase a atividade de Hsp70 e Bag-1 antagonizando a atividade de redobragem de Hsp70. Outras interações são fornecidas pelas duas proteínas Hdj1 e Hdj2 de Hsp40 humano, as quais, para além das suas funções Hsp40 (descritas acima), têm demonstrado facilitar o acoplamento de Hsp70 e Hsp90 através de Hop (de organizadora Hsp), uma proteína adaptadora que fisicamente liga os chaperones através dos seus dois domínios tetratricopéptidos de repetição (TPR) que ligam a extensão sequências C-terminais de Hsp70 e Hsp90, respetivamente. Foi recentemente mostrado que algumas das proteínas acima mencionadas são reguladoras na transferência de proteínas deformadas não nativas ou irreversível dos chaperones da maquinaria ubiquitina-proteasoma. A proteína CHIP é, para além do seu papel negativo regulador no Hsp70, capaz de associar com Hsp90 através de um domínio TPR N-terminal e substratos Hsp90 alvos para degradação através de um domínio ubiquitina ligase C-terminal, mas é também capaz de cooperar funcionalmente com BAG-1, que se liga a Hsp70 (assim como o proteassoma. Estas verificações fornecem uma ligação possível entre os mecanismos que integram dobragem assistida por chaperone e degradação proteolítica, os dois 105 principais componentes da qualidade de controlo da proteina no citosol.

Citoproteção via Hsp70

Para além das suas capacidades anti-apoptóticos como consequência de ser um chaperone molecular, i.e. facilitando - dobragem da proteina sob outra forma de condições de desnaturação, Hsp70 é também capaz de afetar a sobrevivência de células de vários outros modos, incluindo proteção da função mitocondrial após lesão esquémia-reperfusão, ativação do bloqueio da quinase de stresse c-jun N-terminal quinase (JNK) após estimulação dos fibroblastos primários com TNF, e um complexo Hsp70/Bag-1 foi proposto para regular o crescimento celular e mitogénese durante condições de stresse celular. A capacidade de Hsp70 para proteger células da morte celular induzida por um conjunto de estímulos tal como TNF, TRAIL, stresse oxidativo, radiação UV e os fármacos anti-cancerígenos doxorubicina, etoposido e taxol enfatizam ainda mais as suas caracteristicas anti-apoptóticas.

Finalmente, os relatórios têm também fornecido evidências de mais interação direta entre Hsp70 e a maquinaria apoptótica como Hsp70 foi demonstrado que antagonizam o fator de indução de apoptose como foi mostrado para antagonizar fator de indução de apoptose (AIF),assim como uma função anti-apoptótica a jusante da caspase-3. ratos

Evidências recentes também sugerem que parte do potente efeito citoprotetor do Hsp70 é devido à estabilização das membranas lisosomais. Perante disto, a depleção de Hsp70 desencadeia uma permeabilização precoce das membranas lisosomais e a morte celular mediada por catepsina em células cancerígenas, e Hsp70 exógena efetivamente inibe a destabilização lisossómica induzida por vários stresses. Mais ainda, ratos deficientes em Hsp70 sofrem de 106 pancreatite causada pela ligação das proteases lisossómicas no citosol. Todos estes eventos reforçam o papel da Hsp70 como um importante regulador de MCP e portanto fator de sobrevivência para as células.

Hsp70 em Cancro

Hsp70 é frequentemente sobre expressado nos tumores malignos de humanos, e da sua expressão correlaciona-se com o diagnóstico fraco dos tumores do endométrio e da mama. Nesta mesmo linha, Hsp70 aumenta o potencial tumorogénico de células de roedores implantadas em animais imuno-comprometidos ou singenéticos. O papel de Hsp70 como um fator essencial para a sobrevivência de células cancerígenas é adicionalmente substanciada por um relato de Wei et al., que fizeram o primeiro estudo de depleção da Hsp70 em células cancerígenas. Os resultados indicam que quando a expressão de Hsp70 foi inibida em várias linhas de células cancerígenas através do uso de um oligómero antisentido, a inibição da proliferação das células e a subsequente apoptose foram induzidas. Este trabalho foi substanciado numa série de experiências nas quais a depleção de Hsp70 antisentido mediada por adenovirus desencadeou um programa de morte lisossómica específica de células tumorais.

Estudos in vivo utilizando xenoenxertos ortotrópicos de carcinomas glioblastoma e da mama assim como xenoenxertos subcutâneos de carcinoma do cólon em ratinhos imunodeficientes foi melhor demonstrado o potencial anticancerígeno da depleção de Hsp70, como nos tumores de ratinhos que receberam aplicação locoregional da construção adenoviral acima mencionada mostrando morte celular massiva do tipo apoptose e recrutamento de macrófagos. Estes estudos claramente demonstram a dependência de alguns 107 tumores da presença de Hsp70, embora outros estudos tenham argumentado que a citotoxicidade observada na cultura de células na qual a depleção de Hsp70 mediada por adenovírus é devida a uma combinação de stresse celular mediado por vírus e desregulação para baixo de Hsp70. Fora esta controvérsia, a citotoxicidade em cultura de células induzida por uma depleção de Hsp70 não foi dependente de caspases pois nem a sobre expressão de Bcl-2 nem a inibição farmacológica das caspases poderiam resgatar as células, mais, o desencadear da PML e da libertação de catepsinas para o citosol foram os prováveis indutores dos eventos de morte uma vez que a inibição de catepsinas cisterna conferiu citoproteção significativa. Mais ainda, a depleção de Hsp70 nos anteriormente mencionados xenoenxertos tumorais em ratinhos conduz à libertação de catepsina e morte das células tumorais.

Como mencionado anteriormente, um dos mecanismos citoprotetores de Hsp70, que muitas células cancerígenas parecem ter adaptado, é a translocação de Hsp70 para o compartimento endo-lisossómico onde desempenham um papel de protetor da membrana. Esta translocação pode não só ser dirigida pela necessidade de proteger as membranas lisosomais, como estudos mostraram que mais de 50% dos tumores mostram localização de Hsp70 na superfície da membrana plásmica - uma área que está diretamente conectada com o compartimento endo-lisossómico via de eventos endocitosíticos e secretores, como descrito anteriormente. A superfície exposta da Hsp70 apresenta um único epitopo o qual pode atuar como uma estrutura de reconhecimento para as células assassinas naturais (NK), estimularem a sua proliferação e atividade citolítica. As células NK ativadas por esta sequência peptidica Hsp70 mostraram inibir o crescimento tumoral em ratinhos com imunodeficiência combinada grave (SCID), um mecanismo possível para que esta 108 possa ser a superfície celular ligada a Hsp70 que medeia a apoptose pela ligação específica e absorção de granzima B, independente da perforina.

Com escrito previamente, as endo-membranas lisosomais e membrana plásmicas são constantemente intercambiáveis. Portanto, a presença de Hsp70 na superfície das células cancerígenas pode ser uma consequência "infeliz" de dois eventos que promovem a progressão tumoral; a secreção de catepsinas, a qual promove a invasão e angiogénese, e a localização de Hsp70 nas membranas lisosomais, que evitam que previna libertação acidental de cisteína catepsinas para o citosol e subsequente morte celular.

Hsp70 extracelular

Como evidenciado a partir da parágrafos anteriores, as funções intracelulares de Hsp70 são essenciais para a homeostase celular adequada, não, pelo menos face aos desafios nocivos. No entanto papéis interessantes emergem também para a Hsp70 extracelular (eHsp70) especialmente quando provém de expostas imune e inflamatória, as quais novamente devem ter papeis importantes para a depuração das células cancerígenas. Mais ainda, o envolvimento numa adaptação fisiológica geral ao stress e proteção versus lesão celular são também temas emergentes para eHsp70.

Hsp70 extracelular e Neuroproteção A primeira evidência da presença de eHsp70 vem dos estudos em axónio de lula gigante, nos quais foi demonstrado que a elevação da temperatura induziu um conjunto de proteínas de choque térmico na bainha glial em torno do axónio as quais são transferidas para o axónio. Estas observações foram logo reproduzidas nas culturas células de embrião de rato, e importante foi que, já neste ponto, foram apresentadas 109 provas de uma via não-clássica de exocitose que é responsável pela libertação de Hsp70 como nem monensina e nem colchicina, dois inibidores da via secretora clássica, poderiam bloquear a secreção de Hsp70. A partir destas publicações, outros relatos forneceram exemplos de libertação de Hsps por células gliais e a absorção pelos neurões em vários modelos de sistemas animais tais como sapos, crustáceos e ratos. Apoio para um papel para células gliais como fontes de eHsp70 em humanos foi fornecido por um estudo de células cultivadas de glioblastoma humano. Este estudo mostrou que sob condições controladas as células libertaram ~10 μg de Hsp70 por milhão de células para o meio no período de 24h. Esta libertação foi aumentada 2,5-5 vezes quando um choque térmico de 20 min foi aplicado no início do período de tempo. É importante que este estudo também mostrou que a libertação de eHsp70 foi maior do que podia ser explicado por morte celular. Todos estes dados apoiam a hipótese originalmente sugerida estabelecida por Tytell et ai., segundo a qual a libertação glial de Hsps pode ser um modo de apoio à função neuronal durante o stresse metabólico.

[0251] A evidência in vivo para eHsp70 de um papel neuroprotetor durante stresse agudo provem de vários estudos. Um estudo de Tidwell et ai. mostrou que eHsp70 é capaz de reduzir a quantidade de morte celular do neurónio motor pós-axotomia, quando eHsp70 foi aplicado via um gel de esponja após axotomia. No mesmo estudo, sobrevivência aumentada da sensoriais do gânglio da raiz dorsal de células neuronais foram também observados depois da administração de Hsp70, embora esta dependesse de doses levemente mais altas de Hsp70 que os neurónios motores. Adicionalmente, eHsp70 mostrou proteger neurónios motores de outro modo destinados a morrer durante o desenvolvimento 110 embrionário do pinto, e proteger também os neurónios motores isolados das medulas espinais de pintos sobre privação de fator trófico. Um papel protetor in vivo para eHsp70 foi também descrito quando se trata de danos de luz da retina. Neste estudos, Yu et ai., injetaram intravitrealmente uma solução do Hsp70 recombinante e Hsc70 após exposição a luz de indutora de danos numa dose que tinha sido previamente descrita como causadora de degeneração fotoreceptora extensa. Curiosamente, a presença da mistura eHsp70 na câmara vitrea do olho direito resultou significativamente em mais fotorecetores sobreviventes na retina. Mais ainda, a avaliação da absorção de Hsc/Hsp70 marcado dom fluoresceína demonstrou que esta está presente na retina 6h após administração. Hsp70 extracelular administrada via tratamento intranasal também demonstrou prevenir as consequências de estresse inevitável em ratos e foi recentemente descrito que Hsp70 recombinante humana injetada intraperitonealmente foi eficiente no aumento de lifespan, atrasar o inicio dos sintomas, preservando a função motora e prolongando sobrevivência do neurónio motor num modelo de rato de esclerose lateral amiotrófica Trabalhos adicionais in vitro usando Hsp70 ou a mistura Hsc/Hsp70 em sistemas neuronais mostram mais ainda que eHsp70 pode aumentar a força neuronal tolera o stress e reduz a toxicidade e agregação da poliglutamina.

Hsp70 extracelular e imunidade

Para além do papel na citoproteção, associado tanto à membrana plasmática assim como à eHsp70 livre sistémica foram documentadas para servir o papel de imunidade. Considerando que uma das principais funções da Hsp70 é para proteínas intracelulares chaperones, é talvez não surpreendente que possa estar envolvida na ligação de péptidos imunogénicos e apoiar na presentação destas 111 moléculas classe 1 pelo complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Para além disso, as eHsp70 derivadas de tumor mostraram ser chaperones dos péptidos imunogénicos e ligam-se seletivamente a antigénio apresentando células (APC). A seguia a endocitose mediada por recetor estes complexos Hsp70-péptido estão depois presentes nas moléculas MHC classe 1 conduzindo a uma resposta citotóxica da célula t. Adicionalmente a serem chaperones dos próprios antigénios, as Hsp70 são também capazes de ligar péptidos microbianos e motivos CpG não metilados em DNA bacteriano.

Adicionalmente a este papel como um chaperone apresentador de antigénio, a eHsp70 também tem sido implicado na estimulação da imunidade inata. Embora um certo número de tipos de células terem mostrado libertar Hsp70, eHsp70 foi também demonstrado que se liga a um número de recetores em diferentes sub-populações de leucócitos incluindo células assassinas naturais (NK), macrófagos, monócitos e células dendriticas. Os recetores envolvidos no reconhecimento de eHsp70 incluem principalmente receptores de reconhecimento padrão (PRR's) e consistem numa variedade de recetores a partir das diferentes famílias de recetores tais como recetores de ligação (TLR), recetores limpadores e lectinas tipo c. Após ligação a recetor, eHsp70 é capaz de eliciar uma vasta resposta a citoquina incluindo a libertação de pro-citoquinas inflamatórias tais como TNF-a, IL-lb, IL-12, IL-6 e GM-CSF, um processo desencadeado pela translocação de NF-kB para o núcleo, sugerindo uma ação citoquina de eHsp70, que também conduziu à sugestão de cunhar o termo chaperoquina a eHsp70 com vista a descrever melhor as únicas funções de eHsp70 como chaperone e como citoquina. A maioria do trabalho in vivo sobre o papel de eHsp70 na imunidade tem sido conduzida em modelos de roedores. Por 112 exemplo, aumentos na concentração de eHsp70 em resposta a choque de cauda estavam associados com inflamação reduzida e tempos de recuperação mais rápidos a seguir à injeção sub-cutânea de E. Coli. Adicionalmente, a libertação in vivo de Hsp70 em ratinhos acelerou o fecho de feridas, uma caracteristica que foi provavelmente devida ao aumento da fagocitose macrófaga dos detritos da ferida. Não há evidências dos papeis imunoreguladores da Hsp70 em humanos, mas estudos demonstraram a relação entre eHsp70 aumentada e prognóstico/resultado melhorado para trauma cerebral, embora o contrário não tenha sido mostrado. No entanto, sabe-se também que as concentrações de eHsp70 declinam com o avanço da idade, o que pode ser indicativo de uma redução de capacidade para a quantidade de resposta ao stresse relacionada com a idade, o que, novamente, poderia explicar o aumento da mortalidade e morbidade visto com o envelhecimento, embora isto permaneça puramente especulativo.

Libertação de Hsp70

Para a transferência de dados demonstrando a transferência de eHsp70 entre células vizinhas tal como no modelo glial/axónio, vários relatos documentaram a presença de eHsp70 livre na circulação. Para a Hsp70 estar presente neste compartimento, necessariamente tem de ser libertada num órgão/célula. Duas vias principais para atingir isto são usualmente consideradas. Uma é uma via passiva na qual a observação de eHsp70 na circulação periférica é a consequência da libertação de uma conjunto intracelular de Hsp70 devido à lise ou morte da célula. Alternativamente, ou talvez adicionalmente, Hsp70 é ativamente libertada através de uma via exocitótica não clássica. 113

Tem sido sugerido que a Hsp70 em conjunto com outras proteinas de choque térmico são somente libertadas sob circunstâncias patológicas resultando na morte necrótica e não durante a morte celular programada. Sem dúvida, trauma severo e condições patológicas que resultam em necrose podem conduzir à libertação de Hsp70 para a corrente sanguínea. Isto foi bem documentado e deve também ser logicamente esperado. Estudos recentes no entanto, mostraram que Hsp70 pode ser libertada a partir de células intactas por mecanismo ativo e que o grau dos estímulos determina o modo de libertação. Forte evidência da libertação necrótica de Hsp70 vêm também de estudos sobre libertação de eHsp70 induzida por exercício para a circulação sanguínea periférica. Dependendo do modo de exercício (quanto maior o esforço fisico, maior a libertação) maiores libertações de eHsp70 podem ser detetadas na circulação sanguínea periférica, e o mais importante, nenhuns estudos conhecidos referiram uma correlação direta entre eHsp70 e os marcadores de danos musculares. Que eHsp70 pode ser libertado independentemente do dano celular ou do tecido foi elegantemente demonstrado por Fleshner e co-autores que mostraram stresse fisiológico tal como medo predatório e choque elétrico podem evocar um stresse induzido de libertação de eHsp70, um processo que foi sugerido ser dependente de sinalização de catecolamina. 0 modo pelo qual a hsp70 deixa a célula é ainda pouco claro, não só porque a Hsp70 não contém qualquer sequência lider de péptido clássico, que possa visar esta secreção. Adicionalmente, a secreção clássica foi já anteriormente questionada, isto sugere que devem existir mecanismos alternativos para a libertação de eHsp70. Tem sido demonstrado que eHsp70 pode ser libertada nas vesículas caracterizadas como exosomas, mas foi também apresentado 114 que eHsp70 pode ser revelada como eHsp70 livre, tanto nos sistemas celulares assim como in vivo. Foi sugerido que suportes de lípidos são necessários para a libertação de eHsp70 embora isto tenha sido controverso. Além disso, foi demonstrado que o compartimento lisossómico funcional é necessário para libertação de eHsp70 e que esta libertação é acompanhada pela presença de proteínas marcadoras lisosomais na superfície das células, sugerindo a secreção dependente na fusão da membrana plasma- e lisossomal. Em relação a se a libertação é pelos exosomas ou por libertação direta a partir dos lisossomas, é interessante notar que algum tipo de compartimento secretor MVB/endossómico tardio/lisossómico está claramente envolvido em todos os modelos de libertação. 114 ;omo catecolamina: at ao rec >r al-adrenérqi; podem levar a fluxos de cálcio intracelulares, e uma vez que foi sugerido que os mesmos fluxos de cálcio causam a exocitose dos exosomas, corpos multivesiculares e lisossomas, uma hipótese atual é que em momentos de stresse, aumenta na atuação da noradrenalina sobre recetores αΐ-adrenérgicos resulta num fluxo de cálcio dentro da célula e a subsequente libertação de Hsp70 dentro dos exosomas.

Agente bioativo A presente invenção relaciona-se numa forma de realização com a modulação da atividade enzimática, em que a referida enzima interage com BMP, pelo uso de um agente bioativo capaz de aumentar a concentração intracelular e/ou a atividade de Hsp70. A modulação da atividade enzimática de acordo com a presente invenção pode ser obtida providenciando uma das 115 seguintes classes de compostos e terapias, a qual aumenta a concentração intracelular e/ou a atividade de Hsp70:

Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, opcionalmente em combinação com indutores e co-indutores de Hsp70 tal como Fármacos de moléculas pequenas tais como Bimoclomol e Arimoclomol

Fluidificadores de membrana tal como álcool benzilico terapia sub-letal por calor 42°C) ou hipertermia

Certos fármacos do grupo dos anti-inflamatórios e fármacos anti-neoplásticos

Stresse celular

Espécies reativas de oxigénio (ROS)

Adrenalina, noradrenalina

Luz UV

Terapia de radiação

Um agente bioativo de acordo com a presente invenção inclui portanto a própria HSP70, ou um fragmento funcional ou variante desta, através do qual o referido agente bioativo é capaz de modular a atividade de uma enzima que interage com BMP.

Daqui resulta que um agente bioativo pode aumentar a concentração intracelular e/ou a atividade de Hsp70.

Numa forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta. 116

Numa forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção compreende uma combinação de Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, e um indutor ou co-indutor de Hsp70. É um aspeto da presente invenção fornecer um agente bioativo capaz de aumentar a concentração intracelular e/ou a atividade de Hsp70, para uso como um medicamento. É um aspeto adicional da presente invenção fornecer um agente bioativo capaz de aumentar a concentração intracelular e/ou a atividade de Hsp70, para uso no tratamento de um distúrbio de armazenamento lisossomal. É ainda um aspeto adicional da presente invenção fornecer um agente bioativo capaz de aumentar a concentração intracelular e/ou a atividade de Hsp70, para uso como um medicamento ou para uso no tratamento de um distúrbio de armazenamento lisossomal.

Numa forma de realização, o referido tratamento pode ser profilático, curativo ou melhorador. Numa forma particular de realização, o referido tratamento é profilático. Numa outra forma de realização, o referido tratamento é curativo. Numa forma de realização adicional, o referido tratamento é melhorador.

Numa forma de realização, o referido distúrbio de armazenamento lisossomal é selecionado a partir do grupo que consiste em Doença de Niemann-Pick, Doença de Farber, Doença de Krabbe, Doença de Fabry, Doença de Gaucher, Leucodistrofia metacrómica, Sialidose e deficiência de saponina. 117

Numa forma de realização particular, o referido distúrbio de armazenamento lisossomal é Doença de Niemann-Pick tipo A ou B. Numa outra forma de realização particular, o referido distúrbio de armazenamento lisossomal é Doença de Farber. Numa outra forma de realização particular, o referido distúrbio de armazenamento lisossomal é Doença de Krabbe. Numa outra forma de realização particular, o referido distúrbio de armazenamento lisossomal é Leucodistrofia metacrómica. Numa outra forma de realização particular, o referido distúrbio de armazenamento lisossomal é Sialidose. Numa outra forma de realização particular, o referido distúrbio de armazenamento lisossomal é Doença de Fabry. Ainda numa outra forma de realização particular, o referido distúrbio de armazenamento lisossomal é Doença de Gaucher. Ainda numa outra forma de realização particular, o referido distúrbio de armazenamento lisossomal é deficiente em saponina. É também um aspeto da presente invenção fornecer um agente bioativo capaz de aumentar a concentração intracelular e/ou a atividade de Hsp70, para uso no tratamento de um distúrbio de armazenamento lisossomal, em que o referido distúrbio de armazenamento lisossomal é um, tal como dois, por exemplo três, tal como quatro, por exemplo cinco, tal como seis, por exemplo sete distúrbios selecionados a partir do grupo que consiste nas Doença de Niemann-Pick, Doença de Farber, Doença de Krabbe, Doença de Fabry, Doença de Gaucher, Leucodistrofia metacrómica, Sialidose e deficiência de saponina.

Segue-se que o agente bioativo de acordo com a presente invenção pode ser usado para o tratamento de um subgrupo de distúrbios do grupo que consiste em Doença de Niemann-Pick, Doença de Farber, Doença de Krabbe, Doença de Fabry, Doença 118 de Gaucher, Leucodistrofia metacrómica, Sialidose e deficiência de saponina.

Numa forma particular de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção pode ser usado para o tratamento da Doença de Niemann-Pick tipo A e B e Doença de Farber.

Numa forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção compreende uma combinação de Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, e a substância que aumenta a interação entre Hsp70 e BMP. É ainda um aspeto adicional da presente invenção para fornecer o uso de um agente bioativo capaz de aumentar a concentração intracelular e/ou a atividade de Hsp70, para o fabrico de um medicamento para o tratamento de um distúrbio de armazenamento lisossomal.

Agente bioativo - Hsp70, ou a fragmento funcional ou variante desta A presente invenção relaciona-se com uma forma de realização para a modulação da atividade enzimática, em que a referida enzima interage com BMP, através do uso de Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta. É um aspeto da presente invenção fornecer Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, para uso como um medicamento. É um aspeto adicional da presente invenção fornecer Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, para uso no tratamento de distúrbios de armazenamento lisossomais. 119 É ainda um aspeto adicional da presente invenção fornecer o uso de Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, para o fabrico de um medicamento para tratar distúrbios de armazenamento lisossomais.

Numa forma de realização, o referido distúrbio de armazenamento lisossomal é selecionado a partir do grupo que consiste em Doença de Niemann-Pick, Doença de Farber, Doença de Krabbe, Doença de Fabry, Doença de Gaucher, Leucodistrofia metacrómica, Sialidose e deficiência de saponina. É entendido que Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, de acordo com a presente invenção pode ser qualquer produto natural ou sintético, e pode ser produzido por qualquer técnica convencional conhecida de uma pessoas perita na técnica.

Numa forma de realização, Hsp70, ou a fragmento funcional ou variante desta, é purificada a partir de uma fonte natural. A referida fonte natural pode ser de qualquer planta, animal ou bactéria que expressa, ou pode ser induzida para expressar, Hsp numa forma adequada para administrar a um indivíduo com necessidade disso.

Numa forma de realização preferida no entanto, Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, é feita sinteticamente. Segue-se que Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, pode numa forma de realização preferida ser uma proteína recombinante feita por técnicas convencionais, por conseguinte, e como tal designada rHsp7 0. A Hsp70 de acordo com a presente invenção, sintética ou natural, pode ter uma sequência que é derivada de qualquer 120 espécie adequada de plantas, animais ou bactérias. Numa forma de realização, a referida rHsp70 é derivada de um mamifero. O referido mamifero pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em humano (homo sapiens), rato (mus músculos), vaca, cão, rato, furão, suinos, ovinos, e macaco. Numa outra forma de realização, a referida rHsp70 é derivada de bactéria.

Hsp70 é caracterizada em parte por ter um muito alto grau de conservação de sequência interespécies, portanto permitindo, possivelmente, que a Hsp70 derivada de uma espécie ser usada noutras espécies sem eliciar a resposta imune perigosa.

Numa forma particular de realização, a referida rHsp70 tem uma sequência derivada de Hsp70 humana.

Numa forma particular de realização, a referida rHsp70 tem uma sequência derivada de mais de uma espécie. A referida Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, pode portanto numa forma de realização ser um quimera.

Numa proteína recombinante é uma proteína que é derivada de DNA recombinante. O DNA recombinante é uma forma de DNA que não existe naturalmente, a qual é criada por sequências de DNA recombinante que não devem normalmente ocorrer em conjunto. Em termos de modificação genética, o DNA recombinante é introduzido através da adição de DNA relevante num DNA de um organismo existente, tal como os plasmídeos de bactérias, para codificar diferentes características para um fim específico. Difere da recombinação genética, porque não ocorre através de processos dentro da célula, mas é manipulada pelo homem. 121

Numa forma de realização, a Hsp70 de acordo com a presente invenção tem 100% de homologia com o tipo selvagem da proteina Hsp70. Numa outra forma de realização, a Hsp70 de acordo com a presente invenção tem menos de 100% de homologia com o tipo selvagem da proteina Hsp70, tal como entre 99, 9 até 95% de homologia, por exemplo 95 até 90% de homologia, tal como 90 até 85% de homologia, por exemplo 85 até 80% de homologia, tal como 80 até 75% de homologia, qualquer variante de Hsp70 que retenha a sua capacidade para modular a atividade enzimática de uma enzima que se liga a BMP é abrangida pela presente invenção.

Numa forma de realização, o agente bioativo é Hsp70. Numa forma de realização, a referida Hsp70 é Hsp70 de comprimento completo. É também uma forma de realização fornecer um fragmento funcional ou variante de Hsp70. Como aqui definido, um fragmento funcional ou variante é qualquer fragmento de Hsp70 com a desejada função, a qual em termos da presente invenção tem a capacidade de modular a atividade enzimática de uma enzima, em que a referida enzima interage com BMP.

Numa forma de realização, o agente bioativo é um fragmento funcional ou variante de Hsp70.

Numa forma de realização, o agente bioativo é um fragmento funcional ou variante de Hsp70, no qual Hsp70 é modificado por deleção(ões) , adição(ões) ou substituição(ões) da Hsp70 do tipo selvagem. A proteina Hsp70 tipo selvagem tem um comprimento total de 641 aminoácidos. Um fragmento de Hsp70 é numa forma de realização entendida para compreender qualquer fragmento com um comprimento total menor que a proteina do tipo 122 selvagem de 641 aminoácidos, tal como menos que 625 aminoácidos, por exemplo menos de 600 aminoácidos, tal como menos de 575 aminoácidos, por exemplo menos de 550 aminoácidos, tal como menos de 525 aminoácidos, por exemplo menos de 500 aminoácidos, tal como menos de 475 aminoácidos, por exemplo menos de 450 aminoácidos, tal como menos de 425 aminoácidos, por exemplo menos de 400 aminoácidos, tal como menos de 375 aminoácidos, por exemplo menos de 350 aminoácidos, tal como menos de 325 aminoácidos, por exemplo menos de 300 aminoácidos, tal como menos de 275 aminoácidos, por exemplo menos de 250 aminoácidos, tal como menos de 225 aminoácidos, por exemplo menos de 200 aminoácidos, tal como menos de 175 aminoácidos, por exemplo menos de 150 aminoácidos, tal como menos de 125 aminoácidos, por exemplo menos de 100 aminoácidos, tal como menos de 75 aminoácidos, por exemplo menos de 50 aminoácidos, tal como menos de 25 aminoácidos. A proteina Hsp70 tipo selvagem tem um comprimento total de 641 aminoácidos. Um fragmento de Hsp70 é numa forma de realização é entendido para compreender qualquer fragmento com um comprimento total de mais que 10 aminoácidos, tal como mais que 25 aminoácidos, por exemplo mais que 50 aminoácidos, tal como mais que 75 aminoácidos, por exemplo mais que 100 aminoácidos, tal como mais que 125 aminoácidos, por exemplo mais que 150 aminoácidos, tal como mais que 175 aminoácidos, por exemplo mais que 200 aminoácidos, tal como mais que 225 aminoácidos, por exemplo mais que 250 aminoácidos, tal como mais que 275 aminoácidos, por exemplo mais que 300 aminoácidos, tal como mais que 325 aminoácidos, por exemplo mais que 350 aminoácidos, tal como mais que 375 aminoácidos, por exemplo mais que 400 aminoácidos, tal como mais que 425 aminoácidos, por exemplo mais que 450 aminoácidos, tal como mais que 475 aminoácidos, por exemplo mais que 500 123 aminoácidos, tal como mais que 525 aminoácidos, por exemplo mais que 550 aminoácidos, tal como mais que 575 aminoácidos, por exemplo mais que 600 aminoácidos, tal como mais que 625 aminoácidos.

Segue-se que o comprimento total do fragmento de Hsp70 de acordo com a presente invenção pode numa forma de realização ser no intervalo de 5 até 25 aminoácidos, tal como 25 até 50 aminoácidos, por exemplo 50 até 75 aminoácidos, tal como 75 até 100 aminoácidos, por exemplo 100 até 125 aminoácidos, tal como 125 até 150 aminoácidos, por exemplo 150 até 175 aminoácidos, tais como 175 até 200 aminoácidos, por exemplo 200 até 225 aminoácidos, tal como 225 até 250 aminoácidos, por exemplo 250 até 275 aminoácidos, tal como 275 até 300 aminoácidos, por exemplo 300 até 325 aminoácidos, tal como 325 até 350 aminoácidos, por exemplo 350 até 375 aminoácidos, tal como 375 até 400 aminoácidos, por exemplo 400 até 425 aminoácidos, tal como 425 até 450 aminoácidos, por exemplo 450 até 475 aminoácidos, tal como 475 até 500 aminoácidos, por exemplo 500 até 525 aminoácidos, tal como 525 até 550 aminoácidos, por exemplo 550 até 575 aminoácidos, tal como 575 até 600 aminoácidos, por exemplo 600 até 625 aminoácidos, tal como 625 até 640 aminoácidos.

Numa forma particular de realização, o fragmento ou variante da Hsp70 compreende todo ou parte do domínio ATPase da Hsp70. Segue-se que o fragmento ou variante da Hsp7 0 de acordo com a presente invenção numa forma de realização compreende todos ou parte dos aminoácidos número 30 até 382.

Numa outra forma de realização particular, o fragmento ou variante de Hsp70 compreende triptofano na posição 90 do aminoácido do domínio Hsp70 ATPase. 124

Um fragmento de Hsp7 0 pode ser uma versão truncada da proteína tipo selvagem, significando que uma versão mais curta. Um fragmento pode ser truncado por encurtamento da proteína a partir ou do terminal amina ou do terminal carboxi das extremidades da proteína, ou pode ser truncada por deleção de uma ou mais regiões internas de qualquer tamanho da proteína.

Um fragmento ou variante de Hsp70 pode numa forma de realização ter 100% de homologia com a proteína do tipo selvagem. Numa outra forma de realização, o fragmento ou variante de Hsp70 pode também ser uma variante de Hsp70 que tem menos de 100% de homologia com a proteína do tipo selvagem, tal como entre 99, 9 até 95% de homologia, por exemplo 95 até 90% de homologia, tal como 90 até 85% de homologia, por exemplo 85 até 80% de homologia, tal como 80 até 75% de homologia, por exemplo 75 até 60% de homologia com a proteína do tipo selvagem. É para ser entendido que qualquer fragmento ou variante de Hsp70 que mantém a sua capacidade para modular a atividade lisossomal da enzima é englobada pela presente invenção. É para mentir a sua capacidade para interagir com BMP é incluída na presente invenção. É desejável que o efeito quantitativo exato do fragmento funcional ou variante pode ser diferente do efeito de moléculas de comprimento total. Em algumas situações, o fragmento funcional ou variante pode de facto ser mais eficaz que o comprimento total da molécula. Mais ainda, o uso de fragmentos em vez do comprimento total da molécula pode ser vantajoso dado o tamanho mais pequeno dos fragmentos. 125

Numa forma de realização, um fragmento funcional ou variante de Hsp70 pode ser uma variante de Hsp70 em que um ou mais aminoácidos foi substituído. A referida substituição (ões) pode ser uma substituição (ões) equivalente ou conservativa, ou uma substituição (ões) não equivalente ou não conservativa.

Numa forma de realização, entre 0,1 até 1% do resíduos de aminoácidos de tipo selvagem Hsp70 foi substituída, como entre 1 até 2% resíduos de aminoácidos, por exemplo entre 2 até 3% resíduos de aminoácidos, como entre 3 até 4% resíduos de aminoácidos, por exemplo entre 4 até 5% resíduos de aminoácidos, como entre 5 até 10% resíduos de aminoácidos, por exemplo entre 10 até 15% resíduos de aminoácidos, como entre 15 até 20% resíduos de aminoácidos, por exemplo entre 20 até 30% resíduos de aminoácidos, como entre 30 até 40% resíduos de aminoácidos, por exemplo entre 40 até 50% resíduos de aminoácidos, como entre 50 até 60% resíduos de aminoácidos, por exemplo entre 60 até 70% resíduos de aminoácidos, como entre 70 até 80% resíduos de aminoácidos, por exemplo entre 80 até 90% resíduos de aminoácidos, como entre 90 até 100% resíduos de aminoácidos.

Numa forma de realização, entre 1 até 5 de resíduos de aminoácidos do tipo selvagem Hsp70 foram substituídos, como entre 5 até 10 resíduos de aminoácidos, por exemplo entre 10 até 15 resíduos de aminoácidos, como entre 15 até 20 resíduos de aminoácidos, por exemplo entre 20 até 30 resíduos de aminoácidos, como entre 30 até 40 resíduos de aminoácidos, por exemplo entre 40 até 50 resíduos de aminoácidos, como entre 50 até 75 resíduos de aminoácidos, por exemplo entre 75 até 100 resíduos de aminoácidos, como entre 100 até 150 resíduos de aminoácidos, por exemplo 126 entre 150 até 200 resíduos de aminoácidos, como entre 200 até 300 resíduos de aminoácidos, por exemplo entre 300 até 400 resíduos de aminoácidos, como entre 400 até 500 resíduos de aminoácidos.

Numa forma de realização, o fragmento funcional ou variante de Hsp70 é uma fusão proteína. Numa forma de realização, o referido fragmento funcional ou variante de Hsp70 é fundido com um tag.

Vantagens do uso de Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta

Como discutido aqui acima, não há cura para as doenças de armazenamento lisossomal e o tratamento é maioritariamente sintomático, com a exceção do desenvolvimento das terapias de substituição de enzima (TSE) para a Doença de Gaucher e Doença de Fabry. Como mencionado, o TSE é uma forma muito dispendiosa de terapia que é eficaz somente para uma doença específica.

Para o conhecimento dos investigadores, até ao presente nenhuma tentativa de sucesso foi feita para fornecer um TSE para as restantes doenças de armazenamento lisossomal associadas com a acumulação de lípidos, portanto uma grande necessidade não atendida de uma forma eficaz e especifica de tratamento destas DALs mantem-se até hoje. A administração de Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, a um indivíduo com necessidade disso tem várias vantagens em comparação com as modalidades de tratamento convencional para os distúrbios de armazenamento lisossomais. 127

Primeiro, a produção de proteína recombinante, tal como rHsp70 ou um fragmento funcional ou variante desta, é com tecnologia moderna uma maneira simples e direta de produzir quantidades suficientes de rHsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta. Técnicas convencionais para produzir enzimas recombinantes são bem conhecidas dos especialistas na técnica.

Além disso, a produção de uma proteína recombinante, tal como rHsp70 um fragmento funcional ou variante desta, é um método barato para produzir quantidades suficientes de rHsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta. Comparada com a produção de enzimas para TSE, o custo é drasticamente reduzida.

Também, o uso de Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta pode ser usado para tratamento de mais que um distúrbio de armazenamento lisossomal específico. Isto aplica-se também a indutores e co-indutores de Hsp70 da presente invenção. Claro que, o agente bioativo capaz de aumentar a concentração intracelular e/ou a atividade de Hsp70 pode ser usado para tratamento de qualquer doença para modular a atividade enzimática da enzima defetiva envolvida, em que a referida enzima interage com BMP.

Finalmente, como a Hsp7 0 é uma molécula que ocorre endogenamente, i.e. uma molécula que é originada dentro do organismo, tecido, ou célula, espera-se que nenhuma ou uma muito limitada resposta imune seja desencadeada pela administração de Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta. Esta é a principal vantagem dado que facilita o tratamento e reduz os potenciais efeitos secundários quando administrada a um indivíduo.

Expressão ectopica de Hsp70 128

Numa forma de realização, Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, pode ser expressa a partir de um vetor. A invenção portanto numa forma de realização relaciona-se com um vetor que codifica Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta.

Numa forma de realização da presente invenção pode ser administrada a um individuo com necessidade disso na forma de um vetor. 0 vetor usado para expressar Hsp70, ou a fragmento funcional ou variante desta, pode ser selecinado a partir do grupo que consiste em: vetores virais (retroviral e adenoviral) ou vetores não virais (plasmideo, cosmideos, bacteriófagos).

Numa forma de realização, o referido vetor compreende uma ou mais origem de replicação, um marcador para seleção e um ou mais sítios de reconhecimento para uma endonuclease de restrição. Numa outra forma de realização, o referido vetor está operacionalmente ligado a sequências reguladoras que controlam a transcrição da referida Hsp70, ou a fragmento funcional ou variante desta, numa célula hospedeira adequada. A presente invenção numa forma de realização relaciona-se com um método para produzir Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, como descrito aqui; o referido método compreendendo os passos de fornecer um vetor que codifica a referida Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, e expressando o referido vetor quer in vitro, ou in vivo num organismo hospedeiro adequado, produzindo assim a referida Hsp70, ou a fragmento funcional ou variante desta. 129 A invenção adicionalmente relaciona-se com uma célula hospedeira recombinante isolada ou transgénica compreendendo um vetor que codifique Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, de acordo com a presente invenção. A invenção relaciona-se também com um método para gerar uma célula hospedeira recombinante ou transgénica, o referido método compreendendo os passos de fornecer um vetor que codifica Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, introduzindo o referido vetor na referida célula hospedeira recombinante ou transgénica e opcionalmente também expressando o referido vetor na referida célula hospedeira recombinante ou transgénica, gerando deste modo uma célula hospedeira recombinante ou transgénica produzindo a referida Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta.

Numa outra forma de realização a presente invenção relaciona-se com um organismo de mamífero, transgénico, compreendendo a célula hospedeira descrita acima.

Numa forma de realização adicional, organismo de mamífero, transgénico compreendendo a célula hospedeira recombinante ou transgénica de acordo com a presente invenção é não humana. A célula hospedeira transgénica pode ser selecionada a partir do grupo que consiste numa célula hospedeira de mamífero, planta, bactéria, levedura ou fungo.

Para melhorar a libertação do DNA na célula, o DNA deve ser protegido de danos e a sua entrada na célula deve ser facilitada. Foram criados os lipoplexos e poliplexos que 130 têm a capacidade de proteger o DNA da degradação indesejável durante o processo de transfeção. O DNA de plasmideo pode ser coberto com lipidos numa estrutura organizada como uma micela ou uma lipossoma. Quando a estrutura organizada é complexada com DNA é chamada um lipoplexo. Há três tipos de lipidos que podem ser empregues para formar lipossomas; aniónicos (carregados negativamente), neutros, ou catiónicos (carregados positivamente). Complexos de polímeros com DNA são chamados poliplexos. A maioria dos poliplexos consistem em polímeros catiónicos e sua produção é regulada por interações iónicas.

Numa forma de realização, o vetor compreendendo Hsp70, ou a fragmento funcional ou variante desta, pode ser usado para terapia genética. A terapia genética é a inserção de genes nas células e tecidos de indivíduos para tratar uma doença, tal como uma doença heridetária na qual um alelo mutante prejudicial é substituído por um funcional.

Numa outra forma de realização, Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, pode ser administrada como DNA nú. Esta é a forma mais simples de transfeção não virai. A entrega de DNA nu pode ser realizado através do uso de eletroporação, sonoporação, ou o uso de um "gene gun", o qual dispara partículas de DNA revestidas a ouro numa célula usando gás de alta pressão.

Agente bioativo - Em combinação com indutores e co-indutores de Hsp70 A presente invenção relaciona-se com uma forma de realização para modulação da atividade enzimática, em que a referida enzima interage com BMP, através do uso de 131 indutores ou co-indutores de Hsp70 em combinação com Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta.

Um indutor de Hsp7 0 é um composto que pode ele próprio amplificar a expressão do gene Hsp70 e a expressão de proteína sem um stresse concomitante.

Uma co-indutor de Hsp70 é um composto que não pode amplificar a expressão do gene Hsp70 a expressão da proteína sem um stress concomitante (moderado), mas o aumento induzido por stresse nos niveis de Hsp70 é adicionalmente elevado ou aumentado pela presença dele. Fármacos de molécula pequena - derivados hidroxilamina

Numa forma de realização, o referido co-indutor de Hsp70 é um fármaco de molécula pequena.

Numa forma de realização particular, o co-indutor de Hsp70 de acordo com a presente invenção é um derivado da hidroxilamina. Os referidos derivados hidroxilamina podem numa forma de realização adicional ser selecionados a partir do grupo de Bimoclomol (BRLP-42), Arimoclomol (BRX-220), BRX-345 e BGP-15.

Numa forma de realização particular, o referido derivado de hidroxilamina é Arimoclomol (BRX-220).

Bimoclomol (maleato de cloreto de [2-hidroxi-3-(1- piperidinil) propoxi]-3-piridine-carboximidoilo) é um composto não tóxico que foi originalmente desenvolvido para tratamento de complicações diabéticas tais como neuropatias. O Bimoclomol mostrou melhorar a sobrevivência da célula sob condições de stress experimental parcialmente aumentando as proteínas de choque térmico intracelular 132 (HSPs), incluindo Hsp70, pela ativação de HSF-1. Tem sido mostrado que o bimoclomol possui a capacidade de co-indução de Hsp70 na ausência de proteínas não dobradas, e que o bimoclomol interage com e aumenta a fluidez dos lípidos da membrana carregada negativamente. BRX-345 é um análogo estrutural do bimoclomol com uma capacidade um pouco menor para induzir HSPs.

Arimoclomol (BRX-220) é um análogo do bimoclomol, que também interage com e amplifica a resposta a choque térmico. Arimoclomol está atualmente em ensaios clínicos para o tratamento de esclerose lateral amiotrófica (ELA); um distúrbio neurodegenerativo progressivo. Arimoclomal é propriedade da CytRx Corporation.

Fluidificadores de Membrana

Numa forma de realização, o referido indutor de Hsp70 é um fluidificador de membrana. 0 tratamento com um fluidificador de membrana pode também ser chamada terapia lipídica.

Numa forma de realização particular, o indutor de Hsp70 de acordo com a presente invenção é um fluidificador de membrana selecionado a partir do grupo de álcool benzílico, heptanol, AL721, ácido Docosahexaenóico, álcoois alifáticos, álcool de oleílo, dimetilaminoetanol, A2C, farnesol e anestésicos tais como lidocaína, ropivacaína, bupivacaína e mepivacaína, assim como outros conhecidos dos especialistas na técnica.

Para além da desnaturação de uma proporção de proteínas celulares durante o aquecimento (proteotoxicidade), uma mudança na fluidez das membranas é também proposta como 133 sendo um termosensor celular que inicia a resposta de choque térmico e induz HSPs. Evidententemente, perturbações da membrana induzidas quimicamente - análogos com fluidização da membrana plásmica induzida por calor - são capazes de ativação de HSP, sem causar desnaturação da proteína. A fluidez da membrana refere-se à viscosidade da bicamada lipídica da membrana celular. Os fosfolípidos da membrana incorporam ácidos gordos de comprimento varável e saturação. 0 fluidificador da membrana atua intercalando entre lípidos da membrana induzindo portanto uma efeito de desordenamento pelo enfraquecimento das interações de van der Vaals entre as cadeias acilo lipídicas.

Numa forma de realização o fluidificador de membrana é selecionado a partir do grupo do álcool benzílico, heptanol, AL721, ácido Docosahexaenóico, álcoois alifáticos, álcool oleílico, dimetilaminoetanol, A2C, farnesol e anestésicos tal como lidocaína, ropivacaína, bupivacaína e mepivacaína, assim como outros conhecidos da pessoa especialista na técnica, para uso no tratamento de distúrbios de armazenamento lisossomais.

Outros meios para induzir Hsp70

Quaisquer meios para induzir a expressão de Hsp70 alguns dos quais são descritos aqui abaixo, pode ser usado em combinação com Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta. 134

Aumentar a temperatura de um indivíduo é um potente indutor de HSPs incluindo Hsp70, e como tal a terapia de calor subletal é uma forma de realização da presente invenção. Numa forma de realização, a terapia de calor subletal compreende aumentar a temperatura de um indivíduo a uma temperatura de núcleo de cerca de 38°C, tal como cerca de 39°C, por exemplo cerca de 40°C, tal como cerca de 41°C, por exemplo cerca de 42°C, tal como cerca de 43°C. É portanto uma forma de realização da presente invenção fornecer a terapia de calor subletal para uso no tratamento de distúrbios de armazenamento lisossomais. 0 stresse psicológico tal como medo predatório e choque elétrico pode suscitar uma libertação de eHsp70 induzidos por stresse, um processo que é sugerido ser dependente de sinalização de catecolamina, Mais, adrenalina e noradrenalina pode suscitar a libertação de Hsp70.

Os seguintes compostos mostraram induzir (ou co-induzir) HSPs, incluindo Hsp70: o composto de interação com a membrana de alquillisofosfolípido de Edelfosina (ET-18-OCH3 ou l-octadecil-2-metil-rac-glicero-3-fosfocolina); fármacos anti-inflamatórios incluindo inibidores de ciclo oxigenase 1/2 tal como celecoxib e rofecoxib, assim como NSAIDs tais como ácido acetil salicílico, salicilato de sódio e indometacina; prostaglandinas PGA1, PGj2 e 2-ciclopenteno-1-ona; agonistas de recetor-gama ativado por proliferador peroxidase; agentes anticancro que interagem com tubulina incluindo vincristina e paclitaxel; a pioglitazona sensibilizadora de insulina; agentes anti-neoplásicos tais como carboplatina, doxorubicina, fludarabina, ifosfamida e citarabina; os inibidores de Hsp90 geldanamicina, 17-AAG, 17-DMAG, radicicol, herbimicina-A e ácido araquidónico; inibidores de proteassoma MG132 e lactacistina; inibidores 135 de serina protease DCIC, TLCK e TPCK; os fármacos anti-úlceras geranilgeranilacetona (GGA), rebamipide, carbenoxolona e polaprezinco (L-carnosina de zinco); metais pesados (zinco e estanho); o fármaco anti-inflamatório dexametasona; cocaina; nicotina; álcool; agonistas alfa-adrenérgicos; prostanóides ciclopentenona; assim como medicamentos à base de plantas pasoniflorina, glicirrizina, celastrol, dihidrocelastrol, dihidrocelastrol diacetato e curcumina. É portanto uma forma de realização da presente invenção fornecer um composto selecionado a partir do grupo de Edeifosina ET-18-OCH3 ou l-octadecil-2-metil-rac-glicero-3-fosfocolina), celecoxib, rofecoxib, ácido acetilsalicilico, salicilato de sódio, indometacina, PGA1, PGj2 2- ciclopenteno-l-ona, agonistas do recetor-gama ativados por proliferalor de peroxidase, vincristina, paclitaxel, pioglitazona, carboplatina, doxorubicina, fludarabina, ifosfamida citarabina, geldanamicina, 17-AAG, 17-DMAG, radicicol, herbimicin-A, ácido araquidónico, MG132, lactacistina, DCIC, TLCK, TPCK, geranilgeranilacetona (GGA), rebamipida, carbenoxolona, polaprezinco (zinco L-carnosina), dexametasona, cocaina, nicotina, álcool, agonistas alfa-adrenérgicos, ciclopentenona prostanóides, paeoniflorina, glicyirrhizina, celastrol, dihidrocelastrol, diacetato de dihidrocelastrol e curcumina, assim como outros indutores HSP conhecido da pessoa especialista na técnica, para uso no tratamento de distúrbios de armazenamento lisossomais, em combinação com Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta.

Composição farmacêutica de acordo com a presente invenção A presente invenção relaciona-se com a modulação da atividade enzimática, em que a referida enzima interage com BMP, pelo uso de um agente bioativo capaz de aumentar a 136 concentração e/ou a atividade de Hsp70, beneficiando deste modo doentes que sofrem de doenças de armazenamento lisossomal.

Embora seja possível os agentes bioativos da presente invenção serem administrados como o produto químico em bruto, é preferido apresenta-los na forma de uma formulação farmacêutica. Consequentemente, a presente invenção fornece adicionalmente uma composição farmacêutica, para aplicação medicinal, a qual compreende um agente bioativo da presente invenção ou sais destes farmaceuticamente aceitáveis, como aqui definido, e portanto um transportador farmaceuticamente aceitável. É um aspeto da presente invenção fornecer uma composição, tal como uma composição farmacêutica, compreendendo um agente bioativo aqui identificado que possa ser administrado a um indivíduo com necessidade disso.

Numa forma de realização, a invenção relaciona-se com uma composição compreendendo um agente bioativo de acordo com a presente invenção. A composição como aqui divulgado pode numa forma de realização ser formulada em combinação com um transportador fisiologicamente aceitável. A composição como aqui divulgado pode numa forma de realização ser formulada em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável.

Composições farmacêuticas contendo um agente bioativo da presente invenção pode ser preparado por técnicas convencionais, por exemplo como descrito em Remington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, editado por E. W. Martin, Mack Publishing Company, 19a edição, Easton, Pa. 137

Os agentes bioativos da presente invenção podem ser formulados para administração parentérica e podem ser apresentados na forma de doses unitárias em ampolas, seringas pré-cheias, infusão de pequeno volume ou em caixas multidose com uma adição de conservantes. As composições podem tomar formas tais como suspensões, soluções, ou emulsões em veiculos oleosos ou aquosos, transportadores, diluentes, ou solventes incluindo soluções aquosas de sais minerais ou outras moléculas solúveis em água, propileno gi icol, polietileno glicol, óleos vegetais, óleos animais, óleos sintéticos, ésteres orgânicos injetáveis, e pode conter agentes de formulação tais como agentes conservantes, molhantes, emulsionantes ou de suspensão, agentes estabilizadores e/ou agentes de dispersão, corantes, tampão, espessantes, agentes solubilizantes e afins. Alternativamente, o componente ativo pode ser na forma de pó, obtido por isolamento asséptico de sólido estéril ou por liofilização a partir da solução para constituição antes do uso com um veiculo adequado, por exemplo, estéril, água isenta de pirogénios.

Sais farmaceuticamente aceitáveis de agentes bioativos, onde podem ser preparados, são também entendidos para serem cobertas por esta invenção, como são formas as são formas de hidratos específicos de um sal. Estes sais serão aquelas que são aceitáveis na sua aplicação a um uso farmacêutico. Por isto quer dizer que o sal irá reter a atividade biológica do composto parente e o sal não terá efeitos inconveniente ou perigosos na sua aplicação e uso no tratamento de doenças.

Sais farmaceuticamente aceitáveis são preparados num modo padrão. Se o composto parente é uma base é tratado com um excesso de um ácido orgânico ou ácido inorgânico num solvente adequado. Se o composto parente é um ácido, é 138 tratado com uma base inorgânica ou orgânica num solvente adequado.

Qualquer formulação adequada do agente bioativo de acordo com a presente invenção pode ser empregue, conhecido por uma pessoa especialista na técnica.

Numa forma de realização, a Hsp70, ou num fragmento funcional ou variante desta, é formulada numa microsfera biodegradável, tal como um lipossoma.

Administração

Qualquer via de administração adequada pode ser empregue para fornecer um mamífero, preferencialmente um humano, com uma quantidade eficiente de um agente bioativo de acordo com a presente invenção, em que o referido agente bioativo pode ser Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta. A administração de agente bioativos ou composições farmacêuticas a um indivíduo com necessidade disso pode ocorrer através de três vias principais de administração: 1) Tópica (aplicada na superfície do corpo tal como pele ou membranas mucosas), 2) Entérica (pelo trato gastrointestinal ou digestivo) e 3) Parentérica (outras vias que não o trato gastrointestinal ou digestivo). A administração tópica inclui epicutânea (aplicação sobre a pele), inalatória, enema, gotas oculares (sobre a conjuntiva), gotas para os ouvidos, via intranasal, e administração vaginal. A administração entérica é qualquer forma de administração que envolva qualquer parte do trato gastrointestinal e inclui a administração oral (pela boca por exemplo 139 comprimidos, cápsulas ou gotas) , administração intraretal (por exemplo supositório ou enema) para além de pelo tubo de alimentação gástrico ou duodenal. A libertação parentérica, tal como por injeção ou infusão, é eficaz para aplicar o agente bioativo a um sitio alvo ou para introduzir o fármaco na circulação sanguínea, e inclui intravenosa (numa veia), intra-arterial (numa artéria), intramuscular (num músculo), intracardiaca (no coração), subcutânea (sob a pele), intraóssea (na medula óssea), intradérmica, (na própria pele), intratecal ou intraespinal (dentro do canal vertebral), intraperitoneal, (no peritoneu), transdérmica (difusão através da pele intacta), transmucosa (difusão através de uma membrana mucosa, por exemplo insuflação (sopro), sublingual, bocal e supositórios vaginais), inalação, epidural (no espaço epidural) e intravitrea (no olho). A administração sublingual (sob a lingua) é também uma forma de administração parentérica, pelo que agentes bioativos difundem-se para a corrente sanguínea através do tecido da mucosa sob a lingua. 0 agente bioativo da presente invenção pode ser administrado por qualquer via parentérica de distribuição e preferencialmente qualquer dos acima. A aplicação parentérica tem a vantagem de evitar a degradação do trato gastrointestinal, como associados com a entrega entérica. A entrega parentérica tem a vantagem adicional de uma supressão do metabolismo de primeiro passo, como associado com entrega entérica, porque permite que os compostos sejam absorvidos diretamente na circulação sistémica. 0 metabolismo de primeiro passo é um fenómeno do metabolismo do fármaco pelo qual a concentração de um 140 fármaco é grandemente reduzida antes de alcançar a circulação sistémica. É a fração do fármaco perdido durante o processo de absorção que está geralmente relacionada com o figado e parede intestinal.

Após um fármaco ser engolido, este é absorvido pelo sistema digestivo e entra no sistema porta hepático. É transportado através da veia porta no figado antes de atingir o resto do corpo. 0 figado metaboliza muitos fármacos, algumas vezes numa extensão que somente uma pequena parte do fármaco ativo emerge do figado para o resto do sistema circulatório. Esta primeira passagem através do figado, portanto, reduz grandemente a biodisponibilidade do fármaco.

Os quarto sistemas primários que afetam o efeito da primeira passagem de um fármaco são enzimas do lúmen gastrointestinal, enzimas da parede intestinal, enzimas bacterianas, e enzimas hepáticas.

Forma de dosagem apropriadas para essa administração podem ser preparadas por técnicas convencionais. Formas de dosagem apropriadas para administração por inalação, tal como um formulação de aerossol ou um inalador doseador, podem ser preparados por técnicas convencionais.

Numa forma de realização, um modo de administração particular de um agente bioativo de acordo com a presente invenção é por administração parentérica.

Numa forma de realização, um modo de administração particular de um agente bioativo de acordo com a presente invenção é por injeção intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraarterial, subcutânea ou intraperitoneal. 141

Numa forma de realização, um modo de administração particular de um agente bioativo de acordo com a presente invenção é por inalação.

Numa forma de realização, um modo de administração particular de um agente bioativo de acordo com a presente invenção é por infusão intravenosa.

Infusão intravenosa de acordo com a presente invenção pode numa forma de realização ocorrer durante um período de tempo de desde 10 minutos até 2 0 minutos, tal como 20 até 30 minutos, por exemplo 30 até 40 minutos, tal como 40 até 50 minutos, por exemplo 50 até 60 minutos, tal como 60 até 90 minutos, por exemplo 90 até 120 minutos, tal como 2 horas até 3 horas, por exemplo 3 até 4 horas, tal como 4 até 5 horas, por exemplo 5 até 6 horas, tal como 6 até 7 horas, por exemplo 7 até 8 horas.

Numa forma de realização particular, o modo de administração parentérica de um agente bioativo de acordo com a presente invenção é por administração transmucosal. A referida administração transmucosal é numa forma de realização administração sublingual, numa outra forma de realização a referida administração transmucosal é administração bocal, e ainda numa outra forma de realização a referida administração transmucosal é administração por insuflação ou intranasal.

Formas de dosagem incluem comprimidos, pastilhas, dispersões, suspensões, soluções, cápsulas, cremes, untos, emulsões, géis, loções, pastas, aerossóis, ou outras formas conhecidas na técnica. 142 A dose eficaz do componente ativo empregue pode variar dependendo da especifica composição empregue, do modo de administração, da condição a ser tratada e da gravidade da condição a ser tratada. Essa dosagem deve ser determinada facilmente por uma pessoa especialista na técnica.

Numa forma de realização, o agente bioativo da presente invenção é administrada com uma dose diária de desde cerca de 1 micrograma até cerca de 100 miligramas por quilograma de peso corporal animal, dada como uma única dose diária ou em doses divididas, ou numa forma de libertação sustentada. 0 regime de dosagem pode ser ajustado dentro deste intervalo ou mesmo foram deste intervalo para fornecer uma resposta terapêutica óptima.

Numa forma de realização, o agente bioativo da presente invenção é administrado numa dosagem de desde cerca de 1 μg até cerca de 10 μg por kg de peso corporal, tal como desde cerca de 10 μρ até cerca de 50 μρ por kg de peso corporal, por exemplo desde cerca de 50 μρ até cerca de 100 μρ por kg de peso corporal, tal como desde cerca de 100 μρ até cerca de 250 μρ por kg de peso corporal, por exemplo desde cerca de 250 μg até cerca de 500 μρ por kg de peso corporal, tal como desde cerca de 500 μρ até cerca de 750 μρ por kg de peso corporal, por exemplo desde cerca de 750 μρ até cerca de 1000 μρ por kg de peso corporal, tal como desde cerca de 1 mg até cerca de 10 mg por kg de peso corporal, por exemplo desde cerca de 10 mg até cerca de 50 mg por kg de peso corporal, tal como desde cerca de 50 mg até cerca de 100 mg por kg de peso corporal. A referida dosagem pode ser administrada em certos intervalos de tempo, e pode ser expressa como mg por kg de 143 peso corporal por unidade de tempo. A referida unidade de tempo pode numa forma de realização ser por minuto, tal como por hora, por exemplo por dia, tal como por semana.

Combinação de tratamento É um aspeto da presente invenção fornecer um agente bioativo capaz de aumentar a concentração intracelular e/ou a atividade de Hsp70 para uso no tratamento de distúrbios de armazenamento lisossomais, em combinação com outras modalidades de tratamento. A presente invenção em um aspecto refere-se a um método de tratamento da doença de armazenamento lisossomal compreendendo a administração do agente bioativo de acordo com qualquer da presente invenção em combinação com pelo menos uma outra modalidade de tratamento.

Portanto, numa forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é administrado a um indivíduo com necessidade disso em combinação com pelo menos uma outra modalidade de tratamento, tal como modalidades de tratamento convencionais ou conhecidas para DALs. É entendido, que o agente bioativo de acordo com a presente invenção é Hsp70 ou um fragmento funcional ou variante desta, ou um indutor ou co-indutor de Hsp70. A administração de mais que uma modalidade de tratamento em combinação pode ocorrer tanto simultaneamente, ou sequencialmente. A administração simultânea pode ser de dois compostos compreendidos na mesma composição ou compreendidos em composições separadas, ou pode ser uma composição e uma outra modalidade de tratamento realizadas essencialmente ao mesmo tempo. A administração sequencial 144 significa que mais de uma modalidade de tratamento são administradas em diferentes pontos de tempo, tal como administrar uma primeira modalidade de tratamento, e administrar uma segunda modalidade de tratamento subsequentemente. 0 espaço de tempo para a administração pode ser determinado por uma pessoa especialista na técnica para atingir o efeito ótimo, e pode numa forma de realização ser entre 30 minutos até 72 horas.

As modalidades de tratamento na forma de compostos químicos podem ser administradas conjuntamente ou separadamente, cada na sua dose mais eficiente. Administrar mais que um composto pode ter um efeito sinergistico, portanto reduzindo efetivamente a dosagem requerida por cada fármaco.

Numa forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é administrado a um indivíduo com necessidade dele em combinação com a terapia de substituição de enzima (TSE) . A referida TSE pode numa forma de realização ser selecionada a partir do grupo que consiste em Cerezyme® (imiglucerase para injeção), Miglustat, Fabrazyme® (agalsidase beta), e Replagal (Agalsidase alfa).

Numa forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é administrado a um indivíduo com Doença de Gaucher em combinação com Cerezyme® (imiglucerase para injeção) ou Miglustat.

Numa outra forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é administrado a um indivíduo com Doença de Fabry em combinação com Fabrazyme® (agalsidase beta) ou Replagal (Agalsidase alfa). 145

Numa outra forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é administrado a um indivíduo com necessidade disso em combinação com aliviadores da dor.

Ainda numa outra forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é administrado a um indivíduo com necessidade disso em combinação com corticosteróides. 0 agente bioativo de acordo com a presente invenção pode numa forma de realização ser administrado a um indivíduo com necessidade disso em combinação com um transplante, tal como transplante de medula óssea, transplante sangue do cordão umbilical ou transplante de células estaminais. 0 agente bioativo de acordo com a presente invenção pode numa outra forma de realização ser administrado a um indivíduo com necessidade disso em combinação com terapia de redução de substrato.

Numa outra forma de realização, o agente bioativo de acordo com a presente invenção é administrado a um indivíduo com necessidade dele em combinação com terapia sintomática e de suporte, tal como terapia física.

Hsp70 aumenta a absorção de compostos

Os presentes inventores mostraram também que a Hsp70 aumenta a absorção endocíticas de outras moléculas (figura 16). Este aumento da absorção pode ocorrer independentemente da Hsp70 devido a mecanismo passivo que permitem que um composto seja mais rapidamente absorvido pela célula na presença de Hsp70, ou pode ocorrer dependente de Hsp70 devido a associação direta com Hsp70. 146 A capacidade da Hsp70 para aumentar a absorção celular de compostos é uma vantagem por permitir que a Hsp70, ou a fragmento funcional ou variante desta, administrados a células serem rapidamente absorvidas pela célula.

Mais ainda, a capacidade da Hsp70 para aumentar a absorção celular de compostos é uma vantagem na combinação de regimes de tratamento, dado que a presença de Hsp70 pode aumentar a absorção tanto de Hsp70 como do composto dado em combinação com Hsp70.

Em relação à terapia de combinação em que um composto é uma enzima para TSE, e o outro é Hsp70, ou a fragmento funcional ou variante desta, isto pode efetivamente reduzir a quantidade de enzima para TSE necessária para atingir uma dose intracelular eficaz. Isto é relevante dado que o TSE é muito dispendioso.

Na situação em que o agente bioativo de acordo com a presente invenção compreende uma combinação de Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, e um indutor ou co-indutor de Hsp70, a presença de Hsp70 pode portanto aumentar a absorção do referido indutor ou co-indutor de Hsp7 0 . Método para modular a atividade enzimática de uma enzima A presente invenção relaciona-se num aspeto com a modulação da atividade enzimática. A referida enzima pode ser uma enzima envolvida no catabolismo de substâncias lisossomais. E a referida modulação pode derivar de uma interação entre Hsp70 e BMP.

Os presentes inventores descreveram portanto uma interação entre Hsp70 e BMP, em que Hsp70 interage com ou se liga a BMP como uma certa afinidade. Com uma molécula com uma 147 "afinidade" para a molécula X significa aqui que a molécula com afinidade para a molécula X se liga a uma molécula X com uma certa quantidade detetável sob certas condições mas não se ligará (opcionalmente detetável) a outra, moléculas diferentes (para as quais não têm afinidade para) na mesma extensão sob condições idênticas. Uma medida para descrever uma afinidade de molécula para outra molécula é uma constante de dissociação, Kd. Quanto mais pequena a Kd, mais forte a afinidade. As constantes de dissociação podem ser determinadas usando métodos bem conhecidos na técnica, tal como análise de ressonância plasmónica de superficie. Aqui, é preferido que a molécula com "afinidade" para outra molécula X tem uma Kd para a referida molécula X que é menos de 100 mM, tal como menos de 10 mM, por exemplo menos de 5 mM, tal como menos de 1 mM, por exemplo menos de 0,1 mM, tal como menos de 0,01 mM, por exemplo menos de 1 μΜ, tal como menos de 100 nM, por exemplo menos de 10 nM, tal como menos de 1 nM, por exemplo menos de 100 pm, tal como menos de 10 pm, por exemplo menos de 1 pm. Mais ainda, é aqui preferido que a molécula que "não tem qualquer afinidade" para a molécula X tenha uma constante de dissociação, Kd em relação à ligação à molécula X que é pelo menos 10 vezes mais maior, tal como pelo menos 20 vezes maior, por exemplo pelo menos 30 vezes maior, tal como pelo menos 40 vezes maior, por exemplo pelo menos 50 vezes maior, tal como pelo menos 60 vezes maior, por exemplo pelo menos 70 vezes maior, tal como pelo menos 80 vezes maior, por exemplo pelo menos 90 vezes maior, tal como pelo menos 100 vezes maior, do que a Kd da ligação (à molécula X) da molécula que não tem afinidade para a molécula X. O mais preferencialmente, há pelo menos uma diferença de dez vezes na Kd entre aquelas moléculas consideradas como tendo uma afinidade e aqueles 148 considerados como não tendo uma afinidade para a molécula X. A referida interação pode numa forma de realização ser direta, ou a referida interação pode numa outra forma de realização ser indireta.

Numa forma de realização, a referida Hsp70 forma um complexo covalente ou não-covalente com BMP.

Numa forma de realização, a referida BMP interage com uma saponina. Numa forma de realização adicional, a referida saponina pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em saponina A, saponina B, saponina C, e saponina D.

Numa forma de realização adicional, a referida enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em esfingomielinase, esfingomielinase acidica (aSMase), ceremidase ácida, beta-galactosilceremidase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glucosilceremidase, sialidase e aril sulfatase.

Numa forma particular de realização, a modulação a atividade enzimática é um aumento na atividade enzimática.

Numa forma de realização, o referido aumento na atividade enzimática é um aumento no intervalo de 1 até 5%, tal como no intervalo de 5 até 10%, por exemplo no intervalo de 10 até 15%, tal como no intervalo de 15 até 20%, por exemplo no intervalo de 20 até 25%, tal como no intervalo de 25 até 30%, por exemplo no intervalo de 30 até 35%, tal como no intervalo de até 40%, por exemplo no intervalo de 40 até 45%, tal como no intervalo de 45 até 50%, por exemplo no intervalo de 50 até 60%, tal como no intervalo de 60 até 149 70%, por exemplo no intervalo de 70 até 80%, tal como no intervalo de 80 até 90%, por exemplo no intervalo de 90 até 100%, tal como no intervalo de 100 até 120%, por exemplo no intervalo de 120 até 140%, tal como no intervalo de 140 até 160%, por exemplo no intervalo de 160 até 180%, tal como no intervalo de 180 até 200%, por exemplo no intervalo de 200 até 250%, tal como no intervalo de 250 até 300%, por exemplo no intervalo de 300 até 400%, tal como no intervalo de 400 até 500%, por exemplo no intervalo de 500 até 750%, tal como no intervalo de 750 até 1000%, por exemplo no intervalo de 1000 até 1500%, tal como no intervalo de 1500 até 2000%, por exemplo no intervalo de 2000 até 5000%. A presente invenção num outro aspeto relaciona-se com um complexo Hsp70-BMP, e o seu uso como um medicamento, tal como para o tratamento da doença de armazenamento lisossomal.

Numa forma de realização, a presente invenção relaciona-se com um anticorpo que especificamente reconhece o complexo Hsp7 0-BMP. Método de tratamento A presente invenção divulga um método para tratar um individuo com necessidade dele.

Um método para tratamento da doença de armazenamento lisossomal compreendendo administração do agente bioativo de acordo com a presente invenção a um individuo com necessidade disso é divulgado. O referido tratamento pode ser profilático, curativo ou melhorador. 150 O agente bioativo usado de acordo com a presente invenção pode ser formulado como uma composição farmacêutica. O referido distúrbio de armazenamento lisossomal é selecionado a partir do grupo que consiste em Doença de Niemann-Pick, Doença de Farber, Doença de Krabbe, Doença de Fabry, Doença de Gaucher, Leucodistrofia metacrómica, Sialidose e deficiência de saposina. A referida doença lisossomal pode ser caracterizada por um aumento na acumulação intracelular de um esfingolipido. O referido tratamento pode reduzir a acumulação intracelular de substâncias num indivíduo com necessidade deste. A referida substância pode ser uma substância que é normalmente degradada nos lisossomas. A referida substância pode ser um esfingolipido. O tratamento de acordo com a presente invenção pode reduzir a acumulação intracelular de uma substância degradável lisossomalmente tal como um esfingolipido até menos de 100% da quantidade acumulada, tal como menos de 90% da quantidade acumulada, por exemplo menos de 80% da quantidade acumulada, tal como menos de 70% da quantidade acumulada, por exemplo menos de 60% da quantidade acumulada, tal como menos de 50% da quantidade acumulada, por exemplo menos de 40% da quantidade acumulada, tal como menos de 30% da quantidade acumulada, por exemplo menos de 20% da quantidade acumulada, tal como menos de 10% da quantidade acumulada, por exemplo menos de 5% da quantidade acumulada. O tratamento de acordo com a presente invenção pode reduzir a acumulação intracelular de um esfingolipido em pelo menos 5%, tal como pelo menos 10%, por exemplo pelo menos 15%, 151 tal como pelo menos 20%, por exemplo pelo menos 25%, tal como pelo menos 30%, por exemplo pelo menos 35%, tal como pelo menos 40%, por exemplo pelo menos 45%, tal como pelo menos 50%, por exemplo pelo menos 55%, tal como pelo menos 60%, por exemplo pelo menos 65%, tal como pelo menos 70%, por exemplo pelo menos 75%, tal como pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, por exemplo pelo menos 95%, tal como pelo menos 100%.

Os referidos esfingolípidos acumulados podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em esfingomielina, ceramida, galactosilceramida, globotriaosilceramida, glicosilceramida, GM3 e sulfatide. A taxa de redução da concentração intracelular de uma substância lisossomalmemte degradável tal como um esfingolipido pode depender de fatores tais como forma de administração, regimes de dosagem e afins. O referido tratamento prolonga a esperança de vida do referido indivíduo com necessidade deste.

Daqui resulta, que a esperança de vida pode ser aumentada em entre 6 meses até 1 ano, tal como desde 1 ano até 2 anos, por exemplo desde 2 até 3 anos, tal como desde 3 até 4 anos, por exemplo desde 4 até 5 anos, tal como desde 5 até 6 anos, por exemplo desde 6 até 7 anos, tal como desde 7 até 8 anos, por exemplo desde 8 até 9 anos, tal como desde 9 até 10 anos, por exemplo desde 10 até 12 anos, tal como desde 12 até 14 anos, por exemplo desde 14 até 16 anos, tal como desde 16 até 18 anos, por exemplo desde 18 até 20 anos, tal como desde 20 até 25 anos, por exemplo desde 25 até 30 anos, tal como desde 30 até 40 anos, por exemplo desde 40 até 50 anos, tal como desde 50 até 60 anos, por exemplo desde 60 até 70 anos, tal como desde 70 152 até 80 anos, por exemplo desde 80 até 90 anos, tal como desde 90 até 100 anos. A esperança de vida pode ser aumentada em pelo menos 6 meses, tal como pelo menos 1 ano, tal como pelo menos 2 anos, por exemplo 3 anos, tal como pelo menos 4 anos, por exemplo 5 anos, tal como pelo menos 6 anos, por exemplo 7 anos, tal como pelo menos 8 anos, por exemplo 9 anos, tal como pelo menos 10 anos, por exemplo 12 anos, tal como pelo menos 14 anos, por exemplo 16 anos, tal como pelo menos 18 anos, por exemplo 20 anos, tal como pelo menos 25 anos, por exemplo 30 anos, tal como pelo menos 40 anos, por exemplo 50 anos, tal como pelo menos 60 anos, por exemplo 70 anos, tal como pelo menos 80 anos, por exemplo 90 anos, tal como pelo menos 100 anos. É também divulgado o fornecimento de um método para prolongar a esperança de vida num doente com a doença de armazenamento lisossomal, em que o referido método compreende administração do agente bioativo de acordo com a presente invenção a um indivíduo com necessidade dele.

Divulgado é um método para prolongar a esperança de vida num doente com a doença de armazenamento lisossomal, em que 0 referido método compreende a administração do agente bioativo de acordo com a presente na referida esperança de vida é aumentada em entre 6 meses até 1 ano, tal como desde 1 ano até 2 anos, por exemplo desde 2 até 3 anos, tal como desde 3 até 4 anos, por exemplo desde 4 até 5 anos, tal como desde 5 até 6 anos, por exemplo desde 6 até 7 anos, tal como desde 7 até 8 anos, por exemplo desde 8 até 9 anos, tal como desde 9 até 10 anos, por exemplo desde 10 até 12 anos, tal como desde 12 até 14 anos, por exemplo desde 14 até 16 anos, tal como desde 16 até 18 anos, por exemplo desde 18 até 20 anos, tal como desde 20 até 25 153 anos, por exemplo desde 25 até 30 anos, tal como desde 30 até 40 anos, por exemplo desde 40 até 50 anos, tal como desde 50 até 60 anos, por exemplo desde 60 até 70 anos, tal como desde 70 até 80 anos, por exemplo desde 80 até 90 anos, tal como desde 90 até 100 anos.

Divulgado é um método para prolongar a esperanças de vida num doente com a doença de armazenamento lisossomal, em que o referido método compreende a administração do agente bioativo de acordo com a presente invenção a um indivíduo com necessidade dele, em que a referida esperança de vida aumenta em pelo menos 6 meses, tal como pelo menos 1 ano, tal como pelo menos 2 anos, por exemplo 3 anos, tal como pelo menos 4 anos, por exemplo 5 anos, tal como pelo menos 6 anos, por exemplo 7 anos, tal como pelo menos 8 anos, por exemplo 9 anos, tal como pelo menos 10 anos, por exemplo 12 anos, tal como pelo menos 14 anos, por exemplo 16 anos, tal como pelo menos 18 anos, por exemplo 20 anos, tal como pelo menos 25 anos, por exemplo 30 anos, tal como pelo menos 40 anos, por exemplo 50 anos, tal como pelo menos 60 anos, por exemplo 70 anos, tal como pelo menos 80 anos, por exemplo 90 anos, tal como pelo menos 100 anos.

Exemplos

Exemplo 1: Interação entre Hsp70 e bis(monoacil- glicero)fosfato estabiliza lisossomas e promove a sobrevivência da célula

Resumo

Permeabilização da membrana lisossomal é uma marca evolutivamente conservada de morte celular induzida por stress. Aqui os investigadores mostram que a principal proteína de choque térmico 70 (Hsp70) indutível pelo 154 stresse aumenta a sobrevivência da célula através da estabilização de lisossomas através de ligação de alta afinidade dependente de pH a um fosfolípido endo-lisossomal aniónico bis(monoacilglicero) fosfato (BMP; também referido como ácido lisobisfosfatidico). 0 dominio ATPase carregado positivamente de Hsp70 é responsável pela ligação mas o dominio de ligação a substrato é também requerido para a estabilização efetiva dos lisossomas. É importante que o efeito citoprotetor possa ser obtido por libertação endocitica da Hsp70 recombinante e revertida especialmente por administração extracelular de anticorpos BMP ou inibidores de Hsp70. Portanto, esta interação proteína-lípido abre excitantes possibilidades para o desenvolvimento de terapias citoprotetoras e citotóxicos especificas para lisossoma para o tratamento de doenças degenerativa e cancro, respetivamente.

Introdução

Os lisossomas são organelos citosólicos altamente dinâmicos que recebem a membrana de entrada de tráfego das vias biossintéticas (rede trans-Golgi), endociticas, fagocitica e autofágica. Estas contêm mais de 50 hidrolases acídicas que podem processar todas as principais macromoléculas da célula para produtos de degradação disponíveis para reutilização metabólica. Adicionalmente as suas funções de arrumação catabólica, as proteases lisossómicas, catepsinas, foram recentemente identificadas como importantes efetoras nos programas de morte celular evolucionariamente conservada por exemplo induzida por recetores de morte da familia de fatores de recetores de necrose tumoral, hipóxia, stresse oxidativo, stresse osmótico, calor e fármacos anticancerigenos. A morte celular dependente de catepsina é caracterizado por uma permeabilização precoce da membrana lisossomal e a subsequente translocação de catepsinas para o citosol, onde 155 podem iniciar as vias de morte celular dependente de caspase e independente. Portanto, a integridade da membrana lisossomal emerges como um importante regulador da sobrevivência celular durante os várias condições de stress. Enquanto que os inibidores de protease cisteina citosólica foram referidas para conferir proteção contra danos celulares induzidos por catepsina quer em células de mamifero assim como no nemátodo Caenorhabditis elegans, os mecanismos pelos quais as células regulam a estabilidade da membrana lisossomal permaneceram largamente obscuros. Recente evidência indireta sugere, no entanto, que o potente efeito citoprotetor da principal Hsp70 indutível por stress é devido a estabilização da membrana lisossomal. A depleção de Hsp70 desencadeia uma permeabilização precoce das membranas lisosomais e morte celular mediada por catepsina em células cancerígenas, e Hsp70 exógena inibem efetivamente a destabilização lisossomal induzida por vários stresses. Mais ainda, ratos deficientes em Hsp70 sofrem de pancreatite causada pela fuga de proteases lisossómica para o citosol. 0 mecanismo molecular subjacente ao potencial de proteção de lisossoma da Hsp70 permaneceu uma incógnita, mas pistas sobre o seu mecanismo de ação pode residir na translocação associada a cancro e stress, de uma pequena porção de Hsp70 para o compartimento endo-lisosossomal. 0 principal objetivo deste estudo foi definido se a localização lisossomal, evidentemente, é crucial para o efeito citoprotetor da Hsp70. Remarcadamente, os dados apresentados aqui demonstram que a Hsp70 se liga com alta afinidade a lipido BMP especifico de lisossoma e que esta interação proteina-lipido estabiliza os lisossomas. É importante que este novo mecanismo citoprotetor possa ser explorado por administração extracelular quer do citoprotetor da própria Hsp70 ou de compostos que 156 interferem com a ligação a Hsp70-BMP ou Hsp70 funciona especificamente no compartimento lisossomal.

Resultados e discussão

Com vista a testar se a localização lisossomal é crucial para o efeito citoprotetor de Hsp70, os presentes inventores produziram Hsp70 recombinante (rHsp70) e aproveitaram da maquinaria endocitica das células para direcionar rHsp70 para o lúmen lisossomal. A análise imunocitoquimica de células de osteosarcoma U-2-0S incubadas com rHsp70 marcada com Alexa Fluor 488 revelou uma co-localização clara da rHsp70 sujeita a endocitose com proteinas marcadoras tardias endossómicas e lisossomais (proteinas 1 e 2 de membrana associada a lisossoma e proteina-1 de membrana integral lisossomal (LIMP-1)) e um lipido especifico de endo-lisossoma (BMP), enquanto que nenhuma co-localização foi vista com marcadores para o reticulo endoplasmático (reticulo endoplásmatico Ca2+-ATPase (SERCA)), aparelho de golgi (golgin-97) ou mitocôndria (citocromo c (cyt c) ) . A localização lisossomal foi também observada em células vivas, onde a rHsp70 sujeita a endocitose co-localizada com Lisotracker® Red mas não com Mitotracker® Red. Com vista a determinar a quantidade de Hsp70 sujeita a endocitose o sinal fluorescente das células carregadas com rHsp70* foi quantificado, o qual revelou que uma média de 7 0 ng de rHsp70* é para pr. 1*105 células. Para determinar se rHsp70* sujeita a endocitose estava meramente localizada no lúmen ou se pode ter uma ligação direta a membranas endo-lisossomais, as células U-2-OS carregadas com rHsp70* foram sub-fracionadas e a quantidade de rHsp70* presente na fração de membrana leve (LMF) medida (organelos celulares incluindo endossomas e lisossomas precoces e tardios). A fratura por congelamento dos organelos em LMF por via de ciclos de congelamento / descongelamento repetidos em azoto 157 líquido, resultou na libertação total de Catepsina B no sobrenadante, enquanto que a proteína de membrana lisossomal LAMP-2 foi retida na fração de membrana fracturada, peletizadas. A quantificação de rHsp70* sujeita a endocitose revelou que aprox. 1/3 da rHsp70* total permaneceu no peletizado, sugerindo fortemente que estava ligada às membranas endo-lisossomais. Com vista a avaliar se a rHsp70 sujeita a endocitose pode estabilizar as membranas lisosomais, as células foram carregadas com laranja de acridina, uma base fraca metacromática que se acumula no compartimento acídico das células, i.e. endossomas e lisossomas tardios, e sensibilizam-nos por fotoxidação após exposição a azul claro (Brunk et al., 1997; Nylandsted et al., 2004). A foto-oxidação resulta na perda de gradiente de pH lisossomal e fuga de laranja de acridina para o citosol. Isto pode ser rapidamente visualizado e quantificado dado que o laranja de acridina exibe fluorescência vermelha quando concentrada no compartimento acídico da célula e fluorescência verde quando numa concentração menor no citosol. Notavelmente, a rHsp70 sujeita a endocitose protegeu os lisossomas contra foto-oxidação induzida por azul claro, enquanto que nenhuma proteção foi observada nas células carregadas com Hsc70 e Hsp70-2 recombinantes, que partilham 86% e 84% de homologia de sequência de aminoácidos com a Hsp70, respetivamente. Mais ainda, um RNA de interferência curta (siRNA) específico para Hsp70 sensibilizou lisossomas de células U-2-OS à foto-oxidação, e este efeito foi completamente revertido por rHsp70 sujeita a endocitose adequadamente demonstrando que o efeito protetor de Hsp70 endógena é mediado pela pequena fração da proteína localizada no lúmen lisossomal em vez do grupo grande residente no citosol. O acima demonstrou absorção endocítica efetiva de Hsp70 e estabilização lisossomal podem explicar os efeitos neuroprotetores surpreendentes recentemente referidos da 158

Hsp70 extracelular administrada aos sitios de lesão seguindo uma variedade de tratamentos conhecidos para desencadear a via da morte celular lisossomal, i.e. dano ligeiro da retina e axotomia do nervo ciático.

De modo a testar se o efeito protetor da Hsp70 pode ser uma consequência de uma associação direta da Hsp70 com as membranas lisossomais, os investigadores investigaram a sua interação com palmitoil-oleoil-fosfatidilcolina (POPC) vesículas unilamelares grandes (LUVs) contendo vários lípidos aniónicos associados a membrana, i.e. palmitoil-oleoil-f osf atidilserina (POPS; primariamente na camada interior da membrana plásmica), cardiolipina (primariamente mitocondrial) e BMP (primariamente nos endossomas e lisossomas tardios) . Considerando o meio cada vez mais ácido do compartimento endolisossómico após maturação dos lisossomas, as interações proteína-lípido em condições neutras (pH 7,4) e acídicas (pH 6,0) foram comparadas. A pH 7,4, a rHsp70 causou um pequena mudança relativa na dispersão de luz a 90° nos liposomas POPC indicando uma ligação muito fraca à bicamada POPC. Como referido anteriormente para POPS, todos os lípidos negativamente carregados melhoraram a ligação de rHsp70 aos liposomas a pH neutro. Esta melhoria foi aproximadamente de 4-vezes irrespetivo do lípido negativo ou da densidade de carga na superfície do lipossoma (POPS tem uma carga bruta de -1, e cardiolipina e BMP têm uma carga bruta de -2) . Notavelmente, o abaixamento do pH desde 7,4 até 6,0 alterou dramaticamente o perfil de associação a lípido da rHsp70. Enquanto que a ligação a POPS foi aumentada apenas ligeiramente aquando da acidificação, a ligação a BMP foi quase 20 vezes mais forte no pH ácido quando comparado com a pH neutro. A ligação de alta afinidade dependente de pH 159 da Hsp70 a BMP foi confirmada num conjunto independente de experiências BIAcore.

Com vista a testar se a interação de alta afinidade dependente do pH entre Hsp70 e BMP observada in vitro era necessária para a estabilização mediada por Hsp70 de lisossomas em células vivas, os investigadores determinaram BMP celular como alvo carregando o compartimento endo-lisossomal de células U-2-0S com Anticorpos BMP como demonstrado anteriormente (Kobayashi et al., 1998). Notavelmente, Anticorpos BMP efetivamente inibiram a capacidade de rHsp70 de conferir proteção contra fuga lisossomal induzida por foto oxidação. Ainda mais importante, Anticorpos BMP significativamente sensibilizaram células de osteosarcoma U-2-0S à cisplatina, o que induz uma permeabilização precoce da membrana lisossomal nas células U-2-0S assim como outras linhas de células sensíveis à cisplatina usadas neste estudo. Consequentemente, também células de carcinoma da próstata PC-3 e DU-145 foram significativamente sensibilizadas à morte celular induzida por cisplatina após tratamento com anti-Anticorpos BMP.

Tendo confirmado que a interação lisossomal Hsp70 - BMP é essencial para o efeito citoprotetor de Hsp70, os investigadores investigaram a seguir que parte da proteína Hsp70 é responsável pela ligação a lípidos. Para determinar isto, foi medida a alteração de fluorescência dos triptofanos (W90 e W580) após ancoragem da rHsp70 nos liposomas contendo BMPa pH 6,0. Os investigadores produziram proteínas rHsp70 mutantes com deleçóes dos dois principais domínios funcionais da proteína, i.e. o domínio de ATPase amino-terminal (rHsp70-AATP; deleção dos aminoácidos 119-426) e o domínio de ligação a péptido carboxiterminal (rHsp70-APBD; deleção dos aminoácidos 437- 160 617) . A perda de sinal na intensidade da fluorescência de pico relativa para Hsp70-AATP indica que o dominio ATPase é necessário para a ligação de alta afinidade da Hsp70 à bicamada POPC/BMP. A seguir, os dois triptofanos na Hsp70 foram substituidos com fenilalaninas (W90F e W580F) com vista a estudar que triptofano é responsável pela ligação a líp ido e alteração da fluorescência. A redução do sinal com rHsp70-W90F sem o triptofano no dominio ATPase (rHsp70-W90F) e o sinal inalterado com rHsp70-W580F que não tem triptofano no domínio de ligação a péptido indica que o triptofano na posição 90 ancorou na camada de lípidos. Como o método usado acima mediu apenas a alteração relativa na fluorescência após o triptofano se incorporar no ambiente lipofílico, os investigadores também analisaram a associação a lípido da rHsp70 e seus mutantes de um modo mais quantitativo empregando um sistema BIAcore 2000 com LUVs contendo BMP imobilizados na superfície de um chip de sensor LI a pH 4,5. Ambas rHsp70 e rHsp70-APBD mostraram uma forte interação com BMP, enquanto que a ligação de rHsp70-AATP foi marcadamente reduzida confirmando que Hsp70 interage com BMP principalmente através do seu domínio ATPase. Surpreendentemente, os mutantes de triptofano mostraram uma diferença notável na sua capacidade de interagir com BMP. Enquanto que o mutante rHsp70-W580F teve essencialmente o mesmo perfil de interação que rHsp70, a ligação do mutante rHsp70-W90F foi dramaticamente reduzida. Uma vez que rHsp70-W90F foi propriamente dobrado como analisado por dicroísmo circular de UV próximo e distante e capaz de dobrar luciferace e hidrolisar ATP, a mutação W90F aboliu especificamente a interação entre Hsp70 e BMP enquanto reteve os aspetos estruturais e funcionais do chaperone Hsp70. Portanto, o mutante rHsp70-W90F forneceu-nos inesperadamente uma ferramenta de grande valor para tentar ainda mais se a interação direta entre Hsp70 e BMP dota a Hsp70 com os seus atributos protetores de lisossoma. 161

De facto, o mutante rHsp70-W90F perdeu completamente a sua capacidade para proteger as membranas lisosomais contra foto-oxidação e células contra morte celular lisossomal induzida por cisplatina, enquanto que o mutante rHsp70-W580F mostrou a mesma eficácia que a proteina de tipo selvagem. Também, o mutante rHsp70-APBD que mostrou uma capacidade inalterada de ligação a membranas ricas em BMP perdeu a sua capacidade de proteger contra foto oxidação e cisplatina. Estes resultados demonstram que a ligação de Hsp70 a BMP é necessária mas não suficiente para dotar as membranas lisosomais com proteção. Adicionalmente, um dominio de ligação a péptido intacto carboxi-terminal é necessário para a estabilização das membranas lisosomais em células vivas.

Inibidores de Hsp70 são há muito considerados como fármacos anticancerigenos interessantes. Atenção tem-se, no entanto, concentrado na inibição de Hsp70 citosólico, e problemas em relação à administração do fármaco e falta de especificidade entre os membros da familia Hsp70 têm representado barreiras intransponíveis para o desenvolvimento de antagonistas de Hsp70 adequados. Tendo estabelecido que ambos se ligam a BMP e um dominio de ligação a péptido intacto são necessários para o efeito citoprotetor de Hsp70, e tendo verificado o potencial de visar a interação Hsp70 - BMP, os investigadores a seguir testaram se o efeito protetor de Hsp70 endo-lisossomal poderia ser combatido por inibidores da atividade chaperone de Hsp70. Isto foi conseguido incubando as células com um péptido derivado do fator de indução de apoptose (ADD70), que inibe a função de chaperone da Hsp70 ligando-se ao seu dominio de ligação a péptido. Deve notar-se que este péptido grande (388 aminoácidos) não atravessa a membrana plasmática, e fornece-nos portanto outra ferramenta para atingir especificamente a Hsp70 endo-lisossomal. 162

Notavelmente, a incubação de células com péptido ADD70 bloqueou completamente o efeito protetor do lisossoma de rHsp70 sujeito a endocitose em células U-2-0S. Com vista a testar se ADD70 poderia também combater o efeito citoprotetor de células próprias Hsp70, os investigadores investigaram o seu efeito na citotoxicidade induzida por cisplatina em fibroblatos embrionários de murino imortalizado transgénico (iMEFs) Hsp70, em que a Hsp70 transgénica confere resistência quase completa contra morte celular induzida por cisplatina. Notavelmente, o tratamento com ADD70 de iMEFs transgénicos de Hsp70 efetivamente aboliu o efeito protetor mediado por Hsp70 e tornou-as sensíveis à cisplatina como iMEFs do tipo selvagem. iMEFs do tipo selvagem expressam níveis muito baixos de Hsp70, e portanto a incapacidade de ADD70 para as sensibilizar ainda mais à cisplatina suporta a ideia de que a sensibilização mediada por ADD70 é, de facto, devida à inibição de Hsp70. Semelhante ao tratamento anti-BMP, também o tratamento ADD70 sensibilizou células de carcinoma da próstata PC-3 e DU-145 à citotoxicidade induzida por cisplatina.

Os dados aqui apresentados mostram que a Hsp70 interage diretamente com o fosfolípido BMP aniónico endo-lisossomal e que esta interação estabiliza as membranas endo-lisosomais. Porque a concentração de BMP aumenta nas vesículas endocíticas à medida que os endossomas maturam para formar corpos multivesiculares, endossomas tardios e lisossomas, a regulação do pH pode ser a maneira pela qual Hsp70 é direcionada para BMP e lisossomas. Os subdomínios de Hsp70 diferem marcadamente nos seus valores de pi, o domínio ATPase tendo 1,72 unidades mais de pi do que o domínio de ligação a péptido. Esta característica sugere que a pH ácido, o domínio ATPase é preferencialmente carregado positivamente, o que poderia facilitar a sua interação com lípidos aniónicos. À medida que o pH baixa 163 durante a maturação endocítica, a carga positiva acumula-se e qualquer interação aniónica será melhorada ainda mais. Os dados aqui apresentados demonstram a dependência da interação Hsp70 - BMP em pH e o dominio ATPase suporta esta teoria. Mais ainda, modelagem molecular da superfície electrostática do domínio ATPase da Hsp70 revelou que forma uma estrutura quase semelhante a uma cunha com uma carga predominantemente positiva no fundo da cunha mesmo a pH 7,0. Curiosamente, W90 encontra-se dentro deste domínio carregado positivamente, o que pode ser indicação da razão pela qual a mutação Hsp70-W90F tem um impacto profundo na capacidade da Hsp70 interagir com BMP e estabilizar lisossomas. BMP está localizado exclusivamente nas membranas internas do compartimento endolisossómico, onde ajuda na desintegração e extração lipídica de vesículas lipídicas por esfingomielinase ácida e proteínas ativadoras esfingolípidas dando origem a metabolitos tal como ceramida e esfingosina-l-fosfato, que estão implicados na destabilização de membranas e morte celular. Deve notar-se que membranas internas lisossomais podem ser conseguidas por invaginação das membranas de perímetro ao nível de endossomas precoces e tardios, e, portanto, é provável que as respetivas vesículas contenham também Hsp70. Consequentemente, Hsp70 pode interferir com o papel de BMP como cofator para hidrólise de esfingolípidos e portanto alterar a composição lipídica dos lisossomas. Com vista a testar esta hipótese, os investigadores estão presentemente a desenvolver espectroscopia de massa com base em tecnologia para quantificação de metabolitos de esfingolípidos lisossomais.

Dados acumulados sugerem que a expressão aumentada e tráfego alterado das proteases lisossómicas pode formar um "calcanhar de Aquiles" para células tumorais sensibilizando-as para permeabilização da membrana 164 lisossomal. Consequentemente, a interação BMPHsp70 nas membranas endo-lisosomais e a resultante estabilização do compartimento endo-lisossomal fornece células cancerígenas com proteção contra esta via de outro modo direta para morte celular. 0 mecanismo molecular subjacente a este efeito citoprotetor abre agora novas possibilidades existentes para sensibilização de células cancerígenas a agentes que induzem as vias de morte celular lisossomal por via de inibição especifica da função de estabilização do lisossoma da Hsp70. Vice versa, a interação entre Hsp70 e BMP pode fornecer novas estratégias de tratamento dependentes da citoproteção oferecida pela função de estabilização do lisossoma da Hsp70 administrada exogenamente para insultos tão diversos como pancreatite, lesões dos nervos motores e sensoriais e lesões da retina induzidos pela luz.

Materiais e métodos

Cultura de células e reagentes

Linhas de células de osteosarcoma humano U-2-0S foram cultivadas em RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado com soro de vitelo 6% inativado pelo calor e penicilina- estreptomicina. Hsp70 transgénica e iMEFs de controlo apropriados foram gerados e mantidos como descrito anteriormente (Nylandsted et al., 2004). Todas as células foram crescidas a 37 °C numa atmosfera de ar humidificado com 5% de C02 e testadas repetidamente e negativas para micoplasma. A menos que mencionado de outro modo, todos os produtos quimicos foram comprados na Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich Dinamarca A/S).

Proteínas recombinantes 165

Hsp70 recombinante e seus mutantes foram gerados usando o sistema de vetor pET-16b (Novagen) com indução da expressão de proteina e subsequente purificação por afinidade de Ni2+ optimizada de acordo com o protocolo do fabricante. A marcação de rHsp70 com Alexa Fluor 488 foi feita de acordo com o protocolo do fabricante (Sondas Moleculares).

Absorção Celular da proteínas recomblnantes e anticorpos: Células sub-confluentes foram cultivadas em RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado com soro de vitelo 6% inativado pelo calor e penicilina-estreptomicina. Proteínas recombinantes ou lisados de reticulócitos foram adicionados diretamente ao meio para obter a concentração final. As células foram depois crescidas mais 20 h na presença de proteina/lisado.

[0443] O carregamento das células com um anticorpo contra BMP (LBPA) (6C4) foi feito de acordo com técnicas na técnica. A quantificação de rHsp70 sujeita a endocitose* foi feita crescendo as células 20 h na presença de rHsp70* após o que as células foram colhidas, lavadas 3 times em PBS e contadas. Para absorção de célula inteira 1*105 células foram usadas. As células foram lisadas por incubação durante 30 min em gelo em 100 pL de digitonina-PBS (200pg/mL). A fluorescência foi medida num leitor de placas Spectramax Gemini (Aparelhos Moleculares). Para frações de membrana leves (LMF) um total de 10*106 células foram colhidas, lavadas 3 vezes em PBS e homogeneizado num Dounce até o rebentamento da membrana atingir 90% como determinado pela coloração azul de tripano. As células foram então 166 sujeitas a fracionamento de membrana primeiro limpando a membrana plasmática, núcleo e fracções de membrana pesadas após o que as LMF foram recolhidas por centrifugação a 17000*g durante 20 min. As LMF foram depois separadas em duas - a primeiro sendo mantida como LMF "total". A segunda fração foi congelada / descongelada durante 5 ciclos em azoto liquido para rebentar as membranas e subsequentemente centrifugada a 20000*g durante 20 min com vista a separar as membranas do conteúdo luminal. Todo o trabalho nas células após recolhidas foi feito a max. 4°C.

Ensaios quanto à integridade lisossomal e viabilidade celular Células U-2-OS Sub-confluentes incubadas com 2 μg /mL de laranja de acridina durante 15 min a 37° C foram lavadas, irradiadas e analisadas em solução salina equilibrada de Hanks complementada com FCS 3%. As células para visualização de células únicas foram selecionadas a partir de 8 áreas pré-definidas de cada poço em modo de luz transmitida após o que as mesmas células foram imediatamente visualizadas e expostas a luz azul de um queimador de arco de mercúrio USH102 100W (Ushio electric) instalado num alojamento U-ULS100HG (Olympus) durante 20 seg. Microscopia de fluorescência foi realizada num microscópio invertido Olympus IX-70 com uma objetiva LCPlanFlx20 com NA=0,40. A perda do gradiente de pH lisossomal foi quantificada contando a perda da coloração vermelha intensa. A morte celular semelhante a apoptose foi avaliada corando as células com 0,05 μg/mL de Hoechst 33342 (Sondas Moleculares) e contando as células com núcleos condensados num Microscópio fluorescente invertido Olympus IX-70 167 (Filtro U-MWU 330-385 nm). Para cada experiência um minimo de oito áreas escolhidas aleatoriamente foram contadas. A viabilidade das células foi analisada pelo ensaio de redução de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazole-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) como descrito anteriomente67. As células necróticas foram quantificadas por citometria de fluxo corando as células durante 10 min a 37°C com 2,5 μΜ de SYTOX Verde (Sondas Moleculares) e dai em diante medição das células positivamente coradas pela sua intensidade de fluorescência no canal FL1 de um citómetro de fluxo (FACSCalibur™; Becton Dickinson).

As células foram tratadas com cisplatina conforme indicado, as frações citosólicas foram obtidas por tratamento com digitonina e catepsina cisteina citosólica (zFRase) e as atividades semelhantes a caspase-3 (DEVDase) foram determinadas. RNA de interferência siRNAs usados incluiram um direcionado para os dois genes que codificam para Hsp70 (HSPA1A e HSPA1B); 5'-GC CAU GAC GAAAGACAACAAUCUGU -3' (Invitrogen) e um siRNA de Hsp70 de controlo descrito anteriormente. Oligofectamina (Invitrogen) foi usada como agente de transfeção.

Imunodeteção

Os anticorpos primários usados incluiram anticorpos monoclonais de rato contra Hsp70 (2H9; amavelmente fornecido por Boris Margulis, Academia de Ciências da Rússia, St. Petersburgo, Rússia), gliceraldeido-3-fosfato 168 desidrogenase (GAP-DH; Biogenesis), BMP (6C4; (Kobayashi et al., 1998)), LIMP-1 (H5C6; desenvolvido por J. Thomas

August e James E.K. Hildreth e obtido a partir do Banco de Hibridomas de Estudos de Desenvolvimento desenvolvido sob os auspícios de NICHD e mantidos pela Universidade de Iowa, Departamento de Ciências Biológicas, Iowa City, EUA), cit c (clone 6H2.B4, BD PharMingen), SERCA (IID8, Calbiochem), e golgin-97 (CDF4, Sondas Moleculares). Proteínas separadas por SDS-PAGE 10% e transferidas para uma membrana de nitrocelulose foram detetadas usando anticorpos primários indicados, anticorpos secundários conjugados com peroxidase apropriados da Dako, reagentes de Western blotting ECL (Amersham), e Leitor de Imagem Luminescente (LAS-lOOOPlus, Fuj ifilm) .

Espetros de fluorescência do Triptofano e dispersão de luz a 90° do lipossoma

Os espetros de fluorescência do triptofano (RFI) e dispersão de luz a 90° do lipossoma (RSI) foram analisados num tampão HEPES (20 mM HEPES, 0,1 mM EDTA, pH 7,4 ou 6,0 conforme indicado) empregando LUVs que consistem em lípidos indicados essencialmente como descrito anteriormente. Para RFI, LUVs foram adicionados em alíquotas de 10 μΜ e os espetros registados após um período de estabilização de 20 min. Para RSI, as proteínas recombinantes foram adicionadas em alíquotas de 0,12 nmol.

Ressonância plasmónica de superfície (BIAcore)

Para a preparação de LUVs uma mistura de lípidos que consiste em 10mol% esfingomielina, 50mol% fosfatidilcolina, 20mol% colesterol e 20mol% BMP dissolvido em solventes orgânicos, foi seca sob um fluxo de árgon e reidratada em 169 tampão Tris/HCl (pH 7,4) (Kolzer et al., 2004). A mistura foi congelada-descongelada nove vezes em azoto liquido e depois numa incubadora a 37°C. Após banho de ultrasom durante 15 min a mistura foi passada 21 vezes através de uma membrana de policarbonato com um diâmetro de poro de 100 nm. As medições de ressonância plasmónica de superfície foram realizadas usando um sistema BIAcore 2000 a 25°C. LUVs (concentração de lípidos totais 0,1 mM) foram imobilizados na superfície de um chip de sensor LI (BIAcore) em PBS (tampão de carregamento) . O tampão de correr usado foi tampão de acetato de sódio (50 mM, pH 4,5). Como controlo, esfingomielinase ácida (0,2μΜ, 60 pL em tampão de correr) foi injetada diretamente na superfície do lipossoma. Foram obtidas unidades de resposta entre 4100 RU - 5250RU. A proteína de interesse foi injetada em tampão de correr a uma taxa de fluxo de 20 pL/min nas concentrações indicadas. Após injeção a fase de dissociação de 10 min foi anexada.

Modelagem molecular A análise da estrutura primária assim como a modelagem molecular foram feitas com software disponível pelo servidor proteómico Expert Protein Analysis System (EXPaSy) do Instituto de Bioinformática da Suiça (http://expasy.org/). A modelagem molecular foi feita com base na estrutura de cristal do domínio Hsp70-ATPase humano (código pdb: 1S3X) e o domínio de ligação a substrato de Hsc70 humano (código pdb: 7HSC) com DeepView-Swiss PDB Viewer. Os modelos de superfície foram baseados na interação de colombo a pH 7,0 usando uma constante dielétrica de solvente de 80 (H20).

Análise estatística 170 A análise estatística foi realizada usando um teste T de Student emparelhado de duas caudas, com vista a avaliar a hipótese nula. O nível limite para significância estatística foi estabelecido para 5% e todos os grupos de dados testados para a comparabilidade das suas variâncias usando um teste F. Todas as estatísticas foram feitas com um mínimo de n=3 experiências independentes.

Discussão A literatura forneceu evidência de que Hsp70 podia estar presente em membrana plasmáticas das células tumorais, assim como no sistema endolisossomal. Era mais ainda sabido que a Hsp70 pode ser libertada na corrente sanguínea durante eventos indutores de stress diferentes, o mais típico sendo febre, trauma e exercício estrénuo, o mais intrigante sendo provavelmente de stress psicológico, embora este trabalho fosse principalmente feito no campo da imunologia. A presença de espécies Hsp70 dentro do compartimento endolisossómico foi também descrita como outro membro da família da Hsp70; a Hsc70 expressa constitutivamente. A função da Hsc70 nesta localização deu de facto o nome ao processo conhecido como autofagia mediada por chaperone.

No entanto, da literatura nada se sabia acerca da base molecular para a associação de Hsp70 com membranas plasmáticas e endolisossomais, o que levou os investigadores à formulação deste projeto. A informação apresentada no Exemplo 1 mostra que a Hsp70 é capaz de interagir com lípidos de membrana carregados negativamente tal como fosfatidilserina (PS), cardiolipina e bis(monoacil-glicero)fosfato (BMP) a pH neutro. Ao imitar a acidez que pode ser esperada no sistema endolisossomal 171 precoce (pH 6,0), no entanto, o perfil de interação muda dramaticamente, e a afinidade da Hsp70 por BMP torna-se 20 vezes maior do que a pH neutro e quase 9 vezes maior do que para PS. Esta interação Hsp70-BMP foi verificada num sistema BIAcore elaborado, em que o pH foi agora estabelecido para o esperado nos endossomas tardios e lisossomas (pH 4,5), os sitios principais para a maioria do BMP celular. Curiosamente, a conhecida proteína que interage com BMP proteína; esfingomielinase ácida (aSMase), que depende de BMP como um cofator, mostra apenas metade da afinidade por BMP comparado à da Hsp7 0, ilustrando a alta afinidade relativa de Hsp70 até BMP. A interação da Hsp70 com PS foi também referida por outros, como uma interação entre Hsp70 de rato e glicoceramidas acídicas, nas quais a interação depende do domínio ATPase N-terminal e em alguns casos também do domínio de ligação do péptido (PBD) . No entanto, contrariamente aos sistemas aqui empregues, estas observações foram feita em sistemas que consistem em basicamente somente um lípido (90-100 % e 100 % lípido puro, respetivamente) , não se assemelhando provavelmente a qualquer ambiente lipídico marginalmente complexo, que é esperado na célula eucariótica. No entanto, a importância da região N-terminal da Hsp70 para a associação lípido acídico como mostrado por Harada et al. está de acordo com as observações dos investigadores, de que a interação de Hsp7 0 com BMP depende do seu domínio ATPase N-terminal. Os investigadores mostram adicionalmente que o triptofano 90 (W90) da Hsp70 é um aminoácido crítico dado que a sua mutação significativamente reduz a Interação Hsp70-BMP. Um modelo hipotético argumenta que a Hsp70 contém sítios específicos de ligação às partes hidrofílica e -fóbica dos glicolípidos acídicos tanto no domínio da ATPase como no da ligação a péptido (PBD). 172

Apesar de este modelo dever ser aplicável para ligação de Hsp70 aos glicolípidos acídicos, os investigadores preferem sugerir outro modelo para a interação Hsp70-BMP. Com base nos dados aqui apresentados em que; I) o PBD é somente capaz de interações muito fracas com BMP; II) a importância de W90; III) as propriedade de ligação do domínio ATPase; e IV) o modelo molecular da potencial superfície electrostática de Hsp70, os investigadores sugerem que a Hsp70 interage com BMP por uma via carregada electrostaticamente positivamente, em cunha, subdomínio, na parte inferior da fenda da ATPase. Como a mutação conservativa de W90 para fenilalanina reduz significativamente a interação Hsp70-BMP sem afetar as atividades de redobragem ou ATPase da Hsp70, e desde que esta mutação de um único aminoácido não altere o perfil electrostático, é possível, no entanto, que um intermediário dos dois modelos seja mais apropriado para explanara interação da Hsp70 com um mais comum motivo lípido aniónico. Num tal modelo, a carga positive de superfície pode facilitar as interações electrostáticas e resíduos particulares tais como W90 deve estar envolvido na determinação da especificidade dos padrões de ligação de lípido aniónico - neste caso, BMP. Curiosamente, isto pode potencialmente implicar Hsp70 como um mais geral regulador de homeostase lipídica na célula. Como apoio a isto estão os dados que demonstrem que membranas lipídicas das células devem servir como os sensores primários de stresse tal como febre e stresse oxidativo e portanto, como os indutores iniciais da resposta ao estresse.

Face do stresse, pode-se argumentar que a membranas lipídica da célula será um compartimento crucial para manter em homeostase ou evidentemente modificar com vista a desencadear eventos de sinalização específicos como uma resposta ao desafio celular. A ligação de Hsp70 a lípidos 173 tal como BMP e o seguinte aumento de estabilidade das membranas lisosomais e talvez de outros eventos de lípidos celulares podem portanto representar uma parte da resposta geral a stresse celular. No caso de cancro uma tal resposta deve ser elevada para servir o fim do próprio cancro, mas também a partir de uma perspectiva evolutiva mais ampla, uma resposta coordenada proteína-lípido face ao stresse celular faria bom sentido.

Os dados qui apresentados que mostram que somente Hsp70, não Hsc70 e Hsp70-2, são capazes de proteger diretamente as membranas lisossomais sugerem que uma resposta ao estresse potencial de lipidos pode ser especificamente regulada pela principal Hsp70 induzida por stress ele própria e não outra espécie de Hsp70. No entanto, como é também mostrado, a depleção de Hsp70-2 conduz também à permeabilização da membrana lisossomal e morte celular, embora neste caso de a via seja indireta dado que depende de LEDGF. 0 mecanismo para como LEDGF afeta as membranas lisossomais permanece, no entanto, por resolver.

Com vista a validar a relevância in vivo da interação Hsp70-BMP, os investigadores orientaram BMP por anticorpos sujeitos a endocitose e Hsp70 lisossomal por endocitose da célula impermeável de outro modo de polipéptido ADD70 derivado de AIF. Assim verificou-se que a interação entre Hsp70 e BMP serve para estabilizar membranas lisossomais como células subsequentemente quando significativamente sensibilizadas para os efeitos de dirigir estimulos disruptivos da membrana lisossomal assim como agente quimioterapêutico cisplatina indutor de LMP, o perfil de morte celular programada da qual foi caracterizado como parte deste projeto. A expressão de ADD70 foi formalmente mostrado sensibilizar células cancerígenas para um variedade de estimulos de morte e decréscimo de 174 tumorigenicidade de carcinoma de cólon de rato e células de melanoma de ratinho em animais singenéticos. A maior diferença entre esta abordagem e a abordagem aqui apresentada é que os presentes inventores pensam especificamente visar a Hsp70 lisossomal através de endocitose de ADD70, enquanto que estudos anteriores utilizaram expressão de ADD70 citosólica com vista a visar a Hsp70 citoplásmica mais abundante. 0 sucesso em visar a interação Hsp70-BMP endolisossomal também forneceu um certo prova-de-conceito da ideia de visar componentes lisossomais através de endocitose por meios terapêuticos, um conceito que pode ter amplas implicações terapêuticas, como se pode imaginar sintetizando por exemplo células cancerígenas como agentes que induzem vias de morte celular lisossomais por inibição especifica da função de estabilização do lisossoma de Hsp70. De outro modo, a interação entre Hsp70 e BMP deve fornecer novas estratégias de tratamento baseadas na cito protecção oferecida pela função de estabilização de lisossoma da Hsp70 administrada exogenamente para ofensas tão diversas como pancreatite, lesões do nervo motor e sensor dano da retina induzido pela luz. Efetivamente, o conceito de utilizar a maquinaria endocitica para introdução de compostos citotóxicos específicos foi também explorada, dado que as libertações endocíticas da hélice BH3 ligadas a hidrocarbono com base no BH3 pró-apoptótico interagindo com o agonista de morte de domínio, Bid, foi mostrado induzir apoptose nas células de leucemia. Este processo depende da hélice BH3 deixando o compartimento endocítico intacto e ativando Bax e Bak com vista a induzir citocromo c liberta e ativa um programa mitocondrial da apoptose. No entanto, o mecanismo de escape deste sistema endocítico infelizmente não foi conduzido neste trabalho.

Como aqui mostrado, a interação entre Hsp70 e BMP depende do domínio ATPase de Hsp70. Curiosamente, relatos recentes 175 sobre cochaperone Hsp70, proteína 1 ligando Hsp70 (HspBPl), deve enfatizar a importância desta área positivamente carregada de Hsp70. Um estudo da estrutura cristalina de HspBPl complexada com parte do domínio ATPase da Hsp70 tem revelado que uma interação entre estas duas foi mediada por uma α-helicoidal curvada, toda dobrada em HspBPl contendo quatro repetições tipo armadillo. A face côncava desta dobra curvada engloba o lobo II do domínio de ATPase, o mesmo lobo que forma a maior parte do volume Hsp7 0s do dominio ATPase carregado eletrotaticamente positivamente, o qual os investigadores pensam que medeia a interação entre Hsp70 um BMP. Um outra perspectiva sobre isto é fornecida por um outro estudo, no qual 14 linhas de células cancerígenas foram caracterizadas com vista aos seus niveis relativos de Hsp70/HspBPl. Este outro estudo verificou que estas linhas de células com alta razão molar HspBPl/Hsp70 eram mais susceptível a fármacos anticancerígenos que aquelas com baixa razão e que essa sobre expressão de HspBPl promoveu a permeabilização da membrana lisossomal. Com base nestes relatos, e nos dados apresentados neste Exemplo, pode sugerir-se para um modelo em que HspBPl por ligação a área carregada positivamente do dominio ATPase da Hsp70, destrói a sua interação com BMP e assim o seu efeito estabilizador nas endo-membranas lisossomais, resultando num aumento da sensibilidade a estímulos indutores de PML. Deste modo, o domínio de repetição de armadillo de HspBPl pode potencialmente formar a base de um desenho de um fármaco inteligente, sobretudo no caso da ADD70. A eficácia dessas moléculas derivadas de HspBPl serão fáceis de testar no sistema aqui descrito e apresenta uma interessante via para outras aplicações do mecanismo molecular aqui descrito.

Como os investigadores mostram aqui, a Hsp70 liga-se com alta afinidade a BMP a pH 4,5 acídico, até quase 2 vezes 176 mais alta que o que é no caso de a "clássica" parceiro de ligação a BMP esfingomielinase ácida (aSMase). Curiosamente, BMP serve como um cofator estimulador da hidrólise enzimática não só da esfingomielina via aSMase, mas da maioria dos esfingolipidos ligados a membrana que também funcional como um cofator para proteínas ativadoras esfingolípidas (SAPs/Saposins) A-D. Uma questão óbvia deve ser portanto, se Hsp70 pela sua ligação a BMP de algum modo altera as propriedades deligação a aSMase e a saposinas, modificando assim o catabolismo da membrana esfingolípida e glicoesfingolípida e a geração a jusante de moléculas efetoras tais como ceramida e seus metabolitos, ceramida-1-fosfato, esfingosina e esfingosina-l-fosfato, todas as quais estiveram implicadas tanto na sobrevivência como na morte celular. Claro que, os investigadores verificaram que a Hsp70 é capaz de modular a ligação a lipososomas aSMase contendo BMP a pH 4,5, dependendo da concentração de Hsp70. Como pode ser visto, as baixas concentrações (3-150 nM) de Hsp70 facilitam a interação da aSMase com os liposomas BMP-Hsp70, enquanto que concentrações mais altas de Hsp70 (300-1500 nM) têm um efeito oposto. Embora o nosso trabalho se concentre em que o meio em que Hsp7 0 é adicionada para a endocitose é 300 nM, deve ser difícil de estimular uma dada concentração intralisossomal nesta base e quaisquer conclusões que para poderem ter efeito em Hsp70 devem ter atividade in vivo para aSMase vai permanecer especulativo. No entanto, a coloração da Hsp70 transgénica (Hsp70-TG) e tipo selvagem (WT) iMEFs com um anticorpo monoclonal contra ceramida revelou que a Hsp70 transgénica de ratinhos mostrou clara regulação para cima da ceramida, a qual está apresente numa característica padrão esferas-num-fio na periferia das células assim como perto do núcleo. Análise adicional do perfil de ceramida do iMEFs via extração de lípido e subsequente espetroscopia de massa lipídica confirmou estas observações, uma vez que os níveis 177 cumulativos de ceramida aumentaram desde uma média de 10,2 mg de ceramida/mg de proteína para eme-WT até 14,9 mg/mg para iMEFs de Hsp70 transgénica. Os investigadores fundamentaram ainda mais que este efeito pode ser atribuído à ação da Hsp70, dado que os investigadores fizeram também o perfil das nossas células U-2-OS carregadas com rHsp70 (i.e. 300 nM rHsp70 em meios completos para 24h, análogos a todos as outras experiências de endocitose Hsp70 aqui apresentados). A quantificação de ceramida em células U-2-OS carregadas Hsp70 mostraram um aumento nos níveis cumulativos de ceramida desde 2,99 ng ceramida/mg proteína para controlo de células a 5,10 ng/mg de células carregadas com Hsp70 (a experiência foi feita somente uma vez no momento da escrita). No entanto, tomadas em conjunto todas suportam um papel para Hsp70 em níveis de modulação de ceramida nas células, embora a validação adicional evidentemente necessária. Ainda, se estes dados puderem ser verificados, uma série de questões se apresentam, tal como a compartimentação das espécies de ceramida, quantificação de espécies específicas de ceramida (da qual são pelo menos 50 espécies moleculares distintas), fazendo perfil dos níveis de ceramida na superfície face de vários stresses, estado de transformação das células etc.

[0464] Curiosamente, um estudo anterior foi dirigido a uma destas questões, que mostra que o choque térmico (42,5 °C durante 2 h) causa a acumulação de ceramida em Molt-4 linfócitos de leucemia aguda. Esta acumulação pode ser bloqueada pelos inibidores farmacológicos de Fumonisina BI e miriocina, o último dos quais é considerado como um inibidor específico de novo via de síntese de ceramida dado que bloqueia a ação da serina palmitoiltransferase, a enzima que inicia a síntese de novo de novos esfingolípidos da serina e palmitoil-CoA. Um mecanismo parcial para este aumento na síntese de novo de ceramida foi descrita em 178 levedura, em que o stress de calor induz um influxo agudo de serina no ER que deriva a síntese de novo. Será interessante testar se o aumento nos níveis de ceramida observados após endocitose de rHsp70 pode ser modulado por estes inibidores farmacológicos ou se os aumentos observados derivam de vias catabólicas da degradação de esfingolípidos e a estimulação destes pela ligação a Hsp70 ao BMP. Claro que, um modelo de composto pode também ser hipótese. Neste modelo, um tresse térmico poderia conduzir a fluidização da membrana, o influxo de serina e a rápida iniciação da síntese de novo de esfingolípidos. Subsequentemente, a indução de Hsp70, como uma consequência do stress pelo calor, deve conduzir ao aumento dos níveis de Hsp70 na célula, interação Hsp70 com BMP, aumento na atividade aSMase - e possivelmente também a atividade SAP -resultando há geração de ceramida pelas vias catabólicas. Esta resposta secundária pode quer complementar a indução inicial de novo ou pode ser tomada talvez assumir em seu lugar como uma resposta de novo contínua se basearia num fornecimento contínuo de serina e palmitioil-CoA. Permanece no entanto, ser testado se a proteção celular é uma consequência do aumento na própria ceramida ou talvez deve ter contribuído para níveis alterados ou os seus metabolitos a montante e jusante.

Neste ponto, algumas das principais questões permanecem sem ser respondidas - Como deve a Hsp70 acabar no meio extracelular e dentro do compartimento endolilsossómico? É segregada Hsp70 e em seguida, retomada por endocitose? - ou está presente dentro dos lisossomas ou mais especializadamente nos lisossomas secretores, esperando por uma libertação de sinal na forma de stress? E talvez mais o mais importante - o que é a significância biológica da presença de Hsp70 no ambiente extracelular? 179

Embora o trabalho apresentado neste trabalho não seja capaz de responder a estas questões complexas, algumas deduções podem no entanto ser feitas. Primeiro, Hsp70 pode ser sujeita a endocitose em todas as linhas de células testadas neste projeto, sugerindo uma via comum de reconhecimento de Hsp70 extracelular (eHsp70) . Isto está de acordo com os dados mostrando que eHsp70 pode ligar a vários recetores em diferentes sub-populações de leucócitos. Os recetores envolvidos na Hsp7Oextracelular (eHsp70) o reconhecimento inclui principalmente recetores de reconhecimento de padrão (PRRs) e consiste de vários recetores de diferentes familias de recetores tais como o número de recetores (TLR), recetores limpadores e lectinas tipo c. Como o trabalho neste projeto não abordou como o mecanismo pelo qual Hsp70 inicial é sujeita a endocitose (mediada por recetor, dependente de suporte, dependente de clatrina etc.) não se pode dizer se as PRRs são responsáveis pela endocitose de eHsp70 vista nos nossos sistemas. No entanto, o excesso 10 vezes de Hsp70 não marcada não pode competir com a absorção de Hsp70 marcada com Hsp70AF488 nem nas células U-2-OS nem em iMEFs - pelo contrário, a endocitose foi significativamente aumentada na presença de excesso de Hsp70 não marcada, a qual em alguma extensão argumenta contra uma mecanismo de absorção saturável. O foco do campo imunológica tem principalmente sido na resposta a citoquina e ativação da defesa imune inata induzida pela eHsp70 ligando os PRRs e se, portanto não muita consideração tem sido dada ao efeito de eHsp7 0 após ligar o recetor e a iniciação da sinalização.

Os mecanismos de libertação de Hsp70 em meio extracelular e os efeitos de Hsp70 uma vez aqui, em certa medida, sido dirigida, embora uma visão molecular satisfatória sobre 180 estes existindo ainda mecanismos de excitação está ainda em falta. No entanto, a abundância de evidências para a presença de Hsp70 no sistema circulatório após stresse e acumulando dados de suporte de um papel para eHsp70, se induzida por stresse ou aplicada exogenamente, na neuroproteção bem como para o condicionamento do sistema de defesa imunológica primária. Em relação à libertação de Hsp70, a primeira evidência para a transferência de Hsp70 de uma célula para outra veio de estudos no axônio de lula gigante, e durante a reprodução destes resultados em células de embrião de rato cultivadas, foi apresentada evidência foi apresentada que uma via não clássica de exocitose pode ser responsável para a libertação de Hsp70.

[0469] Foi sugerido que Hsp70 juntamente com outro as proteínas de choque térmico são somente libertada sob circunstâncias patológicas resultantes em morte necrótica e não durante a morte celular programada. Recente estudos no entanto, mostraram que Hsp70 pode ser libertada a partir de células intactas por mecanismos ativos e que os graus de estímulos determina o modo de libertação. É importante, os estudos conhecidos reportarem uma correlação direta entre eHsp70 e marcadores no dano de músculo embora aumentos principais de eHsp70 pode ser detetada na corrente sanguínea periférica devido a exercício físico. Mais convincente, e talvez também mais intrigantes, são as verificações mostrando que o stresse fisiológico tal como medo predatório ou choque elétrico pode invocar um stresse induzido liberta eHsp70, um processo que foi sugerido ser dependente em sinalização de catecolamina. Isto é particularmente interessante como catecolaminas via do recetor αι-adrenérgico pode conduzir a fluxos de cálcio intracelular, e os fluxos de cálcio pode causar exocitose de exosomas, corpos multivesiculares e lisossomas. Como tal, durante os tempos de stresse, aumento na noradrenalina 181 atuando sobre recetores oíi-adrenérgicos pode resultar num fluxo de cálcio dentro da célula com a subsequente libertação de Hsp70 dentro dos exosomas. Evidência para esta hipótese vem das demonstrações que eHsp70 pode ser libertada em vesículas caracterizadas como exosomas, mas evidência foi também apresentada que a eHsp70 pode ser libertada como eHsp701ivre, tanto nos sistemas celulares assim como in vivo. Foi também sugerido que os suportes lipidicos são necessários para libertar eHsp70 embora este também tenha sido contestado. Além disso, foi mostrado que o compartimento lisossomal funcional é necessário para libertação de eHsp70 e que esta libertação é acompanhada pela presença de proteínas marcadoras lisossomais na superfície das células, sugerindo uma secreção dependente no plasma- e fusão de membrana lisossómica.

Independentemente da Hsp70 libertada estar presente nos exosomas ou como eHsp70 livre, é interessante notar que algum tipo de secreção MVB/tardio compartimento endossomal/ lisossomal está aparentemente envolvido em todos os modos de libertação. Com base nestes dados, e nos resultados aqui obtidos, pode ser formulada uma hipótese mais complexa para como Hsp70 escapa do citosol para o ambiente extracelular. A libertação de Hsp70 vai depender do aumento do cálcio intracelular, na medida em que este serve como sinal para a endo- exocitose dos lisossomas. A presença de Hsp70 dentro deste compartimento pode no entanto estar dependente de uma interação de Hsp70 e BMP como aqui descrito, dado que a Hsp70 pode efetivamente ser agregada nas membranas internas contendo BMP em endossomas tardios/MVBs/lisossomas. A Hsp70 pode tanto chegar aos endossomas tardios e lisossomas a partir da absorção extracelular tal como endocitose conforme aqui descrito, ou por invaginações do perímetro das membranas dos endossomas precoces e tardios assim como lisossomas, os quais vão trazer Hsp70 intracelular e BMP na 182 proximidade. A acidez do compartimento deve manter uma forte preferência para localização de Hsp70s para membranas contendo BMP. Após a exocitose, algumas Hsp70 devem ainda ser ligadas a exosomas contendo BMP, mas o pH neutro encontrado no ambiente extracelular passaria a favorecer um equilíbrio Hsp70-BMP deslocado significativamente para Hsp70 não ligado, resultando tanto na Hsp70 livre e ligada a exosoma, que poderia, então, exercer as suas funções extracelulares. resumindo, os dados aqui apresentados mostram que a Hsp70 interage diretamente e dependendo do pH com o BMP fosfolípido aniónico endolisossomal. Os investigadores demonstram que a ligação de Hsp7 0 a BMP é mediada via domínio ATPase Hsp70s, envolvendo triptofano 90, e que esta interação resulta na estabilização das membranas endo-lisossomais, possivelmente influenciando a atividade de outras proteínas ligadas a BMP. Os investigadores mostram também que a elucidação deste mecanismo molecular abre novas possibilidades para sensibilização das células cancerígenas a agentes que induzem vias lisossomais de morte celular via inibição especifica da função de estabilização de lisossoma de Hsp70. Ao contrário, a interação entre Hsp70 e BMP pode fornecer novas estratégias de tratamento baseadas na citoproteção oferecida pela função de estabilização de lisossoma da Hsp70 administrada exogenamente.

Exemplo 2: A Interação entre Hsp70 e Bis (monoacil-glicero)fosfato Ativa Esfingomielinase Ácida, Estabiliza Membranas lisosomais e Promove a Sobrevivência da Célula

Proteína de choque térmico 70(Hsp70) é uma chaperone molecular altamente conservada evolucionariamente que 183 promove a sobrevivência de células stressadas inibindo a permeabilização da membrana lisossomal, a marca da morte celular induzida por stresse. Chaves para este mecanismo molecular de ação pode fixar no relatado recentemente stress e translocação associadas ao cancro de uma pequena porção de Hsp70 do compartimento lisossomal. Aqui, nós mostramos que a Hsp70 estabiliza lisossomas por melhoramento da atividade de esfingomielinase ácida (ASM), uma lipase lisossomal que hidrolisa esfingomielina em ceramida e fosforilcolina. Em ambiente acidico Hsp70 liga-se com alta afinidade e especificidade a um fosfolípido aniónico endo-lisossomal para ASM, facilitando deste modo a ligação de ASM a BMP e estimulando a atividade ASM. A inibição da interação Hsp70 - BMP por Anticorpos BMP ou um ponto de mutação (W90A) em Hsp70 assim como a inibição da atividade ASM por desipramina reverte efetivamente a estabilização de lisossomas mediada por Hsp70. Notavelmente, a atividade ASM reduzida em células de doentes com Doença de Niemann-Pick A (NPDA), um grave distúrbio de armazenamento lisossomal causado por mutações no gene ASM, está também associada com uma diminuição dramática da estabilidade lisossómica, e este fenotipo pode ser efetivamente corrigido por restaurar a atividade ASM lisossomal por tratamento com Hsp70 recombinante ou ASM. Tomados em conjunto, estes dados abrem possibilidades de excitar para tratamento de doença de armazenamento lisossomal e cancro com compostos de células não permeáveis que entram no lúmen lisossomal pela via de libertação endocitica.

Proteases lisossómica, catepsinas, são efetoras importantes na morte celular programada evolutivamente conservada induzidas por uma larga variedade de stresses. A morte celular dependente de catepsina é caracterizada por uma permeabilização precoce da membrana lisossomal e 184 subsequente translocação da catepsinas para o citosol, onde podem iniciar vias de morte celular dependentes e independentes de caspase. Com vista a testar se a localização lisossomal é crucial para a capacidade referida da Hsp70 para estabilizar membranas lisosomais e proteger células contra a morte celular induzida por stresse, nós aproveitamos a maquinaria endocitica das células para dirigir a Hsp70 recombinante (rHsp70) para os lisossomas. Análise imunocitoquimica e bioquímica de células U-2-0S de osteosarcoma incubadas com rHsp70 marcadas com fluorocromo revelaram a efetiva absorção de rHsp70, a sua co-localização específica com marcadores tardios endossomais e lisossomais e ligação às membranas lisossomais (Fig. 5a, b e Fig. 9). Usando uma imagem em tempo real para monitorizar a integridade da membrana lisossomal (Fig. 5c), nós mostramos que a rHsp70 sujeita a endocitose protegeu os lisossomas da foto-oxidação (Fig. 5d) . Mais ainda, um RNA de curta interferência (siRNA) específico para Hsp70 sensibilizou para os lisossomas foto-oxidação, e este efeito foi totalmente revertido pela rHsp70 sujeita a endocitose demonstrando que apropriadamente o efeito protetor da Hsp70 endógena é mediado pela pequena fração da proteína no lúmen lisossomal (Fig. 5e). Apesar da absorção similar (dados não mostrados), nenhuma estabilização lisossomal foi observada com Hsc70 e Hsp70-2 recombinantes, as quais partilham 86% e 84% de homologia de sequência de aminoácido com a Hsp70, respetivamente (Fig. 5d) . A presença de Hsp70 nas membranas lisosomais e a sua capacidade para sobreviver a ambiente lisossomal hidrolítico sugere que ela se liga aos lípidos da membrana lisossomal. Portanto, nós investigamos a interação de Hsp70 com grandes vesículas unilamelares (LUVs) palmitoil-oleoil-fosfatidilcolina (POPC) contendo vários lípidos aniónicos 185 associados a membrana, i.e. Palmitoil-oleoil-fosfatidilserina (POPS; primariamente na membrana plásmica), cardiolipina (primariamente mitocondrial) e BMP (primariamente nos endossomas/lisossomas tardios). Tendo em conta o meio cada vez mais ácido do compartimento endo-lisossomal de maturação dos lisossomas, nós comparamos a interação proteina-lipido em condições neutras (pH 7,4) e acidicas (pH 6,0) (Fig. 6a). A pH 7,4, a rHsp70 causou uma pequena mudança relativa na dispersão de luz a 90° em liposomas POPC indicando uma ligação muito fraca. Como referido anteriormente para POPS, todos os lipidos carregados negativamente aumentou a ligação de rHsp70 aos liposomas a pH neutro em aproximadamente 4 vezes independentemente da densidade de carga sobre a superficie dos lipossoma (variando desde -1 até -2) (Fig. 6a). Remarcadamente, a ligação a BMP foi quase 20 vezes mais forte a pH acidico como comparado a pH neutro, se a ligação a POPS foi somente levemente aumentada após acidificação (Fig. 6a) . A alta afinidade de ligação a Hsp70 a BMP a pH acidico foi confirmada num conjunto independente de experiências BIAcore (Fig. 6e e 7a). É importante, anticorpos BMP libertados para o compartimento endo-lisossomal por endocitose efetivamente inibiu a capacidade de rHsp70 para estabilizar os lisossomas nas células vivas (Fig. 6b), e sensibilizaram as células para cisplatina (Fig. 6c), um fármaco anticancerigeno que induz vazamento lisossomal.

Com vista a investigar qual das partes da proteína Hsp70 é responsável pela ligação a BMP, nós medimos o desvio da fluorescência dos triptofanos sobre a ancoragem de rHsp70 e seus mutantes nos lipossomas contendo BMP. As perdas de sinal do pico de intensidade de fluorescência relativa para a Hsp70 mutante sem os aminoácidos 119-426 no domínio ATPase amino-terminal (rHsp70-AATP), mas não para aqueles 186 sem os aminoácidos 437-617 no carboxi-terminal do domínio de ligação a péptido (rHsp70-APBD), indicou que o domínio ATPase foi necessário para alta afinidade de ligação de Hsp70 a BMP (Fig. 6d) . Mais, nós substituímos os dois triptofanos na Hsp70 com fenilalaninas (W90F e W580F) e estudamos qual triptofano é responsável pelo desvio de fluorescência induzido pela ligação lipídica. A redução do sinal somente com rHsp70-W90F indicou que o NH2 terminal da proteína ancorou na camada lipídica (Fig. 6d) . Uma análise BIAcore mais quantitativa da interação BMP - rHsp70 confirmou que a Hsp70 interage com BMP principalmente através do seu domínio ATPase (Fig. 6e) . Surpreendentemente, a mutação W90F especificamente aboliu a interação entre rHsp70 e BMP mantendo o aspeto estrutural (dobragem como analisado por dicroísmo circular de UV longínquo e próximo) e funcional (dobragem luciferace e hidrólise de ATP) do chaperone Hsp70 (Fig. 6e e dados não mostrados). Portanto, a rHsp70-W90F mutante forneceu-nos uma valiosa ferramenta para teste sobre se a interação direta entre Hsp70 e BMP dota Hsp70 com os seus atributos protectores de lisossoma. Efetivamente, rHsp70-W90F mutante tinha perdido completamente a sua capacidade de proteger as membranas lisossomais contra a foto-oxidação e células contra morte celular lisossomal induzida por cisplatina, enquanto que o rHsp70-W580F mutante mostrou o mesmo efeito protetor que a proteína tipo selvagem (Fig. 6f e g) . Importante, as proteínas Hsp70mutantes foram sujeitas a endocitose essencialmente como efetivamente as Hsp70 de tipo selvagem (dados não mostrados). Portanto, nós concluímos que a ligação de Hsp70 a BMP é essencial para a efeito de estabilização de lisossoma da Hsp70.

Porque a concentração de BMP aumenta nas vesículas endocíticas como endossomas maturos para formar lisossomas, a regulação de pH deve ser a via pela qual Hsp7 0 é 187 dirigida aos lisossomas. Cálculos (PROTPARAM, EXPaSy servidor proteómica, Swiss Institute of Bioinformatics) revelaram que o domínio ATPase de Hsp70 tem 1,72 unidades maior pl teórico do que o domínio péptido de ligação (6.62 vs. 4.9). Esta característica sugere que pH acídico, o domínio ATPase é preferencialmente carregado positivamente, o que poderia facilitar a sua interação com lípidos aniónicos. Os nossos dados demonstram a dependência da interação Hsp70 - BMP a pH acídico e o domínio ATPase suporta esta teoria. Mais ainda, modelação molecular da superfície eletrostática do domínio ATPase da Hsp70 revelou que forma uma estrutura quase tipo cunha com uma carga positiva predominante na base da cunha contendo W90 possivelmente explicando o impacto profundo da mutação W90F na capacidade da Hsp70 para interagir com BMP e estabilizar lisossomas (Fig. 6h). BMP liga-se a ASM com alta afinidade e estimula a sua capacidade para hidrolisar esfingomielina para ceramida e fosforilcolina. A análise BIAcore revelou que o pré-tratamento de LUVs contendo BMP com rHsp70 a concentrações sub-equimolares facilitam a ligação subsequente de ASM, se concentrações mais altas de rHsp70 mostrarem um efeito inibidor (Fig. 7a e 10). Remarcadamente, a Hsp70 de fibroblatos embrionários de murino transgénico (Hsp70-MEFs), que são protegidos contra danos lisossomais induzidos por stresse (Fig. 7e) , exibiram significativamente maior atividade ASM que MEFs do tipo selvagem (WT-MEFs), e o tratamento de WT-MEFs com rHsp70 a uma concentração citoprotetora (300 nM) aumentou a atividade ASM a um nível comparável ao de Hsp70-MEFs (Fig. 7b). Com vista a testar se ASM é responsável pelo efeito de estabilização de lisossoma de células com desipramina, um bem caracterizado farmacológico inibitor de ASM. A desipramina reduz a viabilidade de MEFs num modo dependente 188 de dose e a morte celular foi associada com uma permeabilização massiva de lisossomas como demonstrado pelo vazamento de catepsinas lisossomal para o citosol (Fig. 7c e d) . Notavelmente, a morte celular induzida por desipramina e vazamento lisossomal foram significativamente reduzidos em Hsp70-MEFs em comparação com WT-MEFs. Mais ainda, a inibição de ASM com concentração subtóxica de desipraminea reverteu a resistência ao stresse de Hsp70-MEFs ao nivel de WT-MEFs como evidenciado por perda acelerado da integridade da membrana lisossomal por foto-oxidação (Fig. 7e) . 0 papel protetor de lisossoma de ASM foi adicionalmente suportada por dados mostrando que os lisossomas nos fibroblatos dos doentes com NPDA, um distúrbio de armazenamento lisossomal fatal causado por mutações no gene ASM, exibiu uma extrema sensibilidade a danos induzidos por foto-oxidação (Fig. 8a). Remarcadamente, rHsp70 foi também capaz de melhorar a atividade enzimática de ASM endógeno mutado assim como a rASM simultaneamente carregado nas células doentes (Fig. 8b) . 0 aumento da atividade de ASM obtida carregando os lisossomas com rHsp70, rASM ou a combinação de dois correlacionados com a sua capacidade para estabilizar os lisossomas e para normalizar o volume de compartimento lisossomal dramaticamente alargado nas células NPDA (Fig. 8b-d) . Deve notar-se que tal como rHsp7 0, também rASM se localiza nos lisossomas (Fig. 8b).

Tomados em conjunto os nossos dados indicam que a interação Hsp70-BMP estabiliza os lisossomas via de um mecanismo envolvendo a regulação do metabolismo da esfingomielina ao invés da estabilização fisica direta da membrana. Um tal efeito indireto é apoiado pelo facto de BMP estar localizado exclusivamente nas membranas internas do compartimento endo-lisossomal, onde a sua função principal é apoiar a desintegração e extração lipidica das vesículas 189 lipídicas por ASM e proteínas ativadoras esfingolípidas. Curiosamente, o aumento mediado por ASM na concentração de ceramida lisossomal modifica a conformação estérica das membranas lisosomais e assim facilita a sua fusão com outras vesículas intracelular e membrana plásmica. Portanto, as mudanças na composição da membrana lisossomal e volume como resultado da capacidade de aumento de fusão induzida por ceramida pode contribuir para o aumento mediado por Hsp70 na estabilidade lisossómica. Por outro lado, vários estímulos apoptóticos induzem a translocação de ASM para o exterior da lâmina externa da membrana plásmica, onde a ceramida pode formar microdomínios lipídicos que funciona como sítio para ativação de moléculas de sinal associadas a membrana envolvidas na sinalização apoptótica. Portanto, a ceramida pode ter efeitos opostos na sobrevivência da célula dependendo de se é produzida dentro do lisossoma ou na membrana plásmica. 0 acima descrito mecanismo molecular subjacente ao efeito citoprotetor da Hsp70 abre novas possibilidades para sensibilização de células cancerígenas a agentes que induzem vias de morte celular lisossomal por inibição especifica da função de estabilização de lisossoma da Hsp70. Reciprocamente, a capacidade de administrar exogenamente rHsp70 sozinha ou em combinação com rASM pode ser diretamente desafiado como um novo tratamento para doentes de NPD, cujas opções terapêuticas são correntemente limitadas a terapias para o gene e célula estaminal.

Sumário dos Métodos WT- e Hsp70-MEFs foram gerados, imortalizados e mantidos como descrito na técnica. Fibroblatos NPDA Humano (83/24) originado a partir de biopsia da pele de um doente de 5 meses com hepatosplenomegalia. Proteínas recombinantes foram geradas usando o sistema vetor pET-16b e Ni2+-afinidade-purificação (Novagen), e marcado com Alexa Fluor 190 488 de acordo com o protocolo dos fabricantes (Molecular Probes). Para a análise da integridade lisossomal, nos desenvolvemos um método de imagem a tempo real de células coradas com laranja de acridina, uma base fraca metacromática que acumula no compartimento acidico das células que as cora de vermelho e sensibiliza-as para foto-oxidação. A perda induzida por foto-oxidação de gradiente pH lisossomal e vazamento do laranja de acridina para o citosol dos lisossomas individuais foi quantificada visualmente como "perda de pontos vermelhos" em células U2-O-S e à medida que a fluorescência decresce no vermelho aumenta no verde por Software Zeiss LSM DUO em fibroblatos. As atividades total e citoplásmica da catepsina (extraida de digitonina) foram medidas em amostras tratadas com digitonina usando sonda zFR-AFC (Enzime System Products) como descrito na técnica. Os espetros de fluorescência de triptofano a e dispersão de luz a 90° de lipossoma foram analisadas num tampão HEPES (20 mM HEPES, 0,1 mM EDTA, pH conforme indicado) essencialmente como descrito na técnica. Medidas de ressonância plasmónica de superfície foram realizadas com LUVs imobilizados usando um sistema BIAcore 2000 como descrito na técnica. Hsp70 siRNA (5'-GCCAUGACGAAAGACAACAAUCUGU-3') e um controlo Hsp70 siRNA foram transfetadas com Oligofectamina (Invitrogen) . A imunodeteção foi realizada com protocolos padrão. A morte celular tipo apoptose e permeabilização da membrana lisossomal foram analisadas essencialmente como descrito na técnica. A atividade ASM foi analisada por um kit de ensaio Amplex Red Esfingomielinase (A12220) para Sondas Moleculares com modificações descritas na técnica. A análise estatística foi realizada usando um teste T de Student emparelhado de duas caudas e todos os grupos de dados foram testados quanto à compatibilidade das suas variâncias usando um teste F. 191 Métodos [Cultura de células e reagentes. Células U-2-0S de osteosarcoma humano foram cultivadas em RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado com 6% de soro de vitela inativado pelo calor e penicilina-estreptomicina. A Hsp70 transgénica e controlo de MEFs imobilizados foram gerados e mantidos como descrito na técnica. Fibroblatos NPDA primários Humanos onde cresceram em meio MEF suplementado adicionalmente com 1% de Na-Piruvato, 1% de HEPES, 1% L-Glutamina. Todas as células foram crescidas a 37°C numa atmosfera de ar húmido com 5% de CO2 e testadas repetidamente e encontradas negativas para micoplasma. A menos que estabelecido de outro modo, todos os químicos foram comprados à Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich Denmark A/S) .

Ensaios quanto à integridade lisossomal. Células sub-confluentes incubadas com 2 μρ/ηϋΐ de laranja de acridina durante 15 min a 37°C foram lavadas, irradiadas e analisadas em solução salina de Hanks balanceada complementada com 3% de soro de vitela fetal. Imagem de células para célula única foram seleccionados a partir de 8 áreas pré-definidas de cada poço em modo de luz transmitida após o que as mesmas células foram imediatamente visualizadas e expostas a azul claro a partir de arco queimador mercúrio USH102 100W (Ushio electric) instalado num alojamento U-ULS100HG (Olympus) durante 20 sec. A microscopia de fluorescência foi realizada num microscópio invertido Olympus IX-70 com uma objetiva LCPlanFl x20 com NA=0,40. A perda de gradientes de pH lisossomal foi quantificada por contagem da perda de coloração intensa do vermelho. Um método mais elaborado para ensaiar a integridade lisossomal foi desenvolvido para manipular o compartimento lisossomal maior dos vários fibroblatos 192 usados neste estudo. Imagem para células para célula única foram selecionadas a partir de 8 áreas pré-definidas de cada poço em modo de luz transmitida após o que as mesmas células foram imediatamente e continuamente expostas a luz a 489 nm a partir de 100 mW laser de diodo enquanto que as micrografias de varredura a laser foram capturadas a cada 330 ms num sistema confocal Zeiss LSM LIVE DUO em dois canais definidos por os filtros passa-banda para luz 495-555 nm (verde) e LP650 nm (Vermelho). Os movimentos resultante do lapso de tempo foram subsequentemente analisado por software Zeiss LSM DUO. As atividades de catepsina total e citoplásmica (extraída de digitonina) foram medidas em amostras tratadas com digitonina usando sonda zFR-AFC (Enzime System Products) como descrito na técnica.

Ensaios para viabilidade celular. A densidade celular foi avaliada por ensaio redução de 3-(4,5-dimetiltiazole-2-i)-2,5-difeniltetrasodiobrometo (MTT, SIGMA-Aldrich) essencialmente como descrito na técnica. Morte celular tipo apoptose foi medida por coloração das células com 0,05μρ/ιηΒ Hoechst 33342 (Molecular Probes) e contagem de células com núcleos condensados num Microscópio fluorescente Olympus IX-70 invertido (Filter U-MWU 330-385 nm). Para cada experiência um mínimo de oito áreas escolhidas aleatoriamente foram contadas.

Imunodeteção e microscopia. Anticorpos primários usados incluem anticorpos monoclonais de rato contra Hsp70 (2H9; gentilmente fornecidos por Boris Margulis, Russian Academy of Sciences, St. Petersburg, Rússia), gliceraldehide-3-fosfato desidrogenase (GAPDH; Biogenesis), BMP (6C4), proteína-1 integral de membrana lisossomal (H5C6; desenvolvida por J. Thomas August e James E.K. Hildreth e 193 obtida a partir de Developmental Studies Hybridoma Bank desenvolvidas sob os auspícios de NICHD e mantida por The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, USA) . As proteínas separadas por SDS-PAGE 10% e transferidas para uma membrana de nitrocelulose foram detetadas usando anticorpos primários indicados, anticorpos secundários apropriados conjugados com peroxidase da Dako, ECL Western blotting reagents (Amersham), e Luminescent Image Reader (LAS-lOOOPlus, Fujifilm). For imunocitoquímica foram usados anticorpos secundários Alexa Fluor®-576- ou Alexa Fluor®-488-conjugados. Liso rastreador Vermelho® foi usado para visualização ao vivo do compartimento lisossomal. Imagens de fluorescência foram tomadas usando um microscópio de varrimento de laser Zeiss Axiovert 100M. A quantificação de Liso rastreador e movimento de lapso de tempo quanto à integridade lisossomal foram feitos num sistema Zeiss LSM LIVE DUO.

Espetros de fluorescência de triptofano e dispersão de luz de lipossoma a 90°. Os espetros de fluorescência de triptofano (RFI) e dispersão de luz de lipossoma a 90° (RSI) foram analisados num tampão HEPES (20 mM HEPES, 0,1 mM EDTA, pH 7,4 ou 6,0 conforme indicado) empregando LUVs que consiste em lípidos indicados essencialmente como descrito na técnica. Para RFI, foram adicionados LUVs em aliquotas de 10 μΜ e os espetros registados após um período de estabilização de 20 min. Para RSI, foram adicionadas proteínas recombinantes em aliquotas de 0,12 nmol.

Ressonância plasmónica de superfície (BIAcore). Para preparação de LUVs uma mistura lipídica que consiste em 10mol% esfingomielina, 50mol% fosfatidilcolina, 20mol% colesterol e 20mol% BMP dissolvido em solventes orgânicos, 194 foi seco sob uma corrente de árgon e reidratado em tampão Tris/HCl (pH 7,4). A mistura foi congelada-descongelada nove vezes em azoto líquido e depois numa incubadora a 37 °C. Após banho de ultrasom durante 15 min a mistura foi passada 21 vezes através de membrana de policarbonato com um diâmetro de 100 nm. As medidas de ressonância plasmónica de superfície foram realizadas usando um sistema BIAcore 2000 a 25°C. LUVs (concentração de lípidos totais 0,1 mM) foram imobilizados na superfície de um chip sensor LI (BIAcore) em PBS (tampão de carga). O tampão de corrida utilizado foi tampão de acetato de sódio (50 mM, pH 4,5). Como um controlo, esfingomielinase ácida (0,2 μΜ, 60 PI em tampão de corrida) foi injetada diretamente na superfície do lipossoma. Foram obtidas unidades de resposta entre 4100 RU - 5250RU. A proteína de interesse foi injetada em tampão de corrida a uma taxa de fluxo de 20 μΐ/min nas concentrações indicadas. Após injeção a fase de dissociação de 10 min foi acrescentada. No caso em que rASM seguiu rHsp70, rASM foi adicionado durante 180 sec após 10 min de fase de dissociação de rHsp70 seguida por mais uma fase de 10 min de dissociação.

Modelação molecular. A análise da estrutura primária assim como modelação molecular foram feitos com software disponível do Expert Protein Analysis System (EXPaSy) servidor de proteómica do Swiss Institute of Bioinformatics (http: //expasy.org/). A modelação molecular foi feita com base na estrutura cristalina do domínio de Hsp70-ATPase de humano (código pdb: 1S3X) e o domínio de ligação a substrato de Hsc70 humano (código pdb: 7HSC) com DeepView-Swiss PDB Viewer. Modelos de superfície foram baseados na interacção de Coulomb a pH 7,0 usando uma contante dieléctrica de solvente de 80 (H20) . 195

Análise estatística. A análise estatística foi realizada usando o teste de T de Student pareado d duas caudas com vista a avaliar a hipótese nula. 0 nivel de corte para significância estatística foi estabelecido a 5% e todos os grupos de dados testados para a comparação das suas variâncias usando um teste F. Todas as estatísticas foram feitas com um minimo de n=3 experiências independentes.

Exemplo 3: Efeito de Álcool benzilico na Doença de armazenamento lisossomal É mostrado nos Exemplos 2 e 3 que Hsp7 0 tem um efeito

estabilizador de lisossoma via uma interação com BMP. Com vista a avaliar se este efeito é também observado quando expondo as células a um indutor químico de Hsp70, fibroblatos de doente de Niemann-Pick Tipo A (NPDA) foram tratados com o indutor de pequena molécula Hsp70; Álcool benzilico (BA). Os resultados são mostrados na figura 11. Primeiro, células NPDA foram tratadas com doses aumentadas de BA (0, 20, 30, 35, 40, 45 mM), lisadas, e analisadas por western blotting. A mesma quantidade de proteína foi carregada em cada poço. A expressão de proteína Hsp70 foi avaliada para cada condição, e mostra que BA induz a expressão de Hsp70 de um modo dependente de dose (anticorpo primário: Stressgen SPA-810, especifico para Hsp70). A seguir, a estabilidade de lisossomas NPDA Gõtz após tratamento com 40mM BA foi avaliada, usando os mesmos métodos como descrito no Exemplo 2. Uma estabilidade lisossómica aumentada foi observada em resposta a BA. Finalmente, a área transversal lisossomal em células NPDA Gõtz após tratamento com 40mM BA foi avaliada, usando os mesmos métodos como descrito no Exemplo 2. É observado um decréscimo na patologia.

LISTA DE SEQUÊNCIAS LISTING 196 <110> Jensen, Thomas Kirkegaard Jaattela, Marja Helena <120> Usode Hsp70 como um regulador da atividade enzimática

<130> P2146 PCOO <150> PA 2008 00885 <151 > 2008-06-26 <160>4 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 641

<212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Met Aia Lys Ala Ala Ala Xis Giy Ilè Aép Leu Giy Thr Thr Tyr Ser 1 5 10 15 Gys· V*1 siy Vai Pise Sln Ni a Giy Lys Vai Giu lie lie Alá Aáh Asp 20 25 30 Gin Giy Asa Arg Thr Thr Pr© Ser Tyr Vai Ala Phe Thr Asp Thr Giu 35 40 45 .Arg Leu lie Giy Âsp &JI& Ala Lys Asa Giu Vai Alá Leu Aan Pr© Gl« 50 55 60 Thr vai Phe Asp Ala Lya Arg Leu Ile Giy Arg hys Phe Giy Asp m 70 75 SO Pr© Vai vai Gin Ser Asp «et Lys Mis Trp au Pr© Phe Gin vai ii* ílK. As« Âsp· Giy Aãp Lys vS-wl· Pr© Lys Vai Gin Vai +?V Ser Tyr Lys Giy GXU Thr Lys 10Ô 105 110 Ala Phe Pr© Giu Gltt Xla Ser Ser Ket Vai Leu Thr Lys Ket Lys 115 120 1· -Λ· s? Glu lie Ala Giu Ala Tyr Leu Giy Tyr Fr© Vai Thr Asft Ma Vai ile 130 135 140 Thr Vai Pr© Ala fyr Phe Asrs Aap Ser Glft Arg Gin Ala Thr Lyá Asp 145 ISO 155 160 Ala Giy Vai Ilè Ala Giy Leu Asn Vai Leu Arg ile lie Asn Giu Pr© .165 170 175 Thr Ai a Alá Ala Ile Ala Ty3C Giy Leu Asp Arg Thr Giy Lys Giy GlU ISO 185 ISO AiXj As© Vai Leu lie Phe Asp Leu Giy Giy Giy Thr Fh® A$p vai Ser i5S 200 205 lie Leu Th* ile Asp Âap Giy xie Phe Glu Vai Lyâ AJL& Thr AÍ3t í5.1y 210 215 220 Aáp The Ni* Giy Giy Giu Asp Phe Ãsp Asn Arg Leu vai Asn His 225 230 235 240: Phe Vai Gl.u Giu Phe 245 Lys &rg Lys Mia Lys 250 Lys Mp ile Ser Giu 255 Ase Lys Arg Ala Vai Arg Arg Leu Asg Thr Ala Cys Glu Ãrg A1& Lys Arg 260 265 270 Thr Lee Ser Ser Ser Thr Glu Alá Ser Leu Giu ilè Aap Ser Leu Phe 197 197 Met Ala Lys Ala Ma Ala Ile Gly 11« Asp Leu Gly 1 5 10 Cys Vai Gly Vai Fhe Gin lís Gly Lys Vai Glu Ile 20 25 Gin Gly Asn Arg fhr Thr Fr© Ser Tyr Vai Ala Fhe 35 40 Arg Um Ile Gly Asp Ala Ala Lys Asn Gin vai Ala 50 55 60 Asn 85 Thr Vai Fhe Asp Aiâ 70 Lye Arg Leu Ile Gly 75 Arg Fro Vai Vai Gin Ser Asp Met Lys his Trp Fro Fhe 85 00 Asp Giy Asp Lys Fro Lys Vai Gin Vai Ser Tyr Lys 100 105 Ala Fhe lyr Fro Glu Glu ile Ser Ser Met Vai Leu 115 120 Glu lie Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Tyr Pr© Vai Thr 130 135 140 Thr Vai tr© Ala Tyr Fhe Asn Asp Ser Gin Arg Gin 145 150 155 Ala. Gly Vai Ile Ala Gly Leu Asn Vai Leu Arg Ile 165 170 Thr Ala Alá Ala Ile Ala. Tyr Gly Leu Asp Arg Thr 180 185 Arg Asn Vai Leu Ile Fhe Asp Leu Gly Gly Gly Thr 135 200 Ile Leu fhr Ile Asp Asp Gly Ile Fhe Glu Vai Lys 210 215 220 Asp 22 S Thr Sis Leu Gly Gly 230 Glu Asp Fhe Asp Asn 235 Arg Fhe Vai Glu Glu Fhe Lys Arg Lys Hia Lys Lys Asp 245 250 Lys Arg Ala Vai Arg Arg Leu Arg Thr Ala Cys Glu 260 265 Thr Leu Ser Ser Ser The Gin Ala Ser Leu Glu Ile <210> 2 <211 >2445 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400>2

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Lisboa, 24 de Julho de 2012

Claims (14)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, em que a referida Hsp70 ou fragmento funcional ou variante desta é capaz de interagir com BMP (Bis(monoacilglicero)fosfato) , para uso no tratamento de um distúrbio de armazenamento lisossomal.

2. Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, para uso de acordo com a reivindicação 1, em que a referida Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, tem 100% homologia com a proteína Hsp70 de tipo selvagem.

3. Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, para uso de acordo com a reivindicação 1, em que a referida Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, tem entre 99,9 até 95% de homologia, por exemplo 95 até 90% de homologia, tal como 90 até 85% de homologia, por exemplo 85 até 80% de homologia, tal como 80 até 75% de homologia, por exemplo 75 até 60% de homologia com a proteína de tipo selvagem.

4. Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, para uso de acordo com a reivindicação 1, em que a referida Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, é Hsp70.

5. Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, para uso de acordo com a reivindicação 4, em que a referida Hsp70 é Hsp70 de comprimento total.

6. Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, para uso de acordo com a reivindicação 1, em que a referida HSP70 ou fragmento funcional ou variante da 2 Hsp70 compreende todo ou parte do domínio ATPase da Hsp7 0.

7. Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, para uso de acordo com a reivindicação 1, em que a referida HSP70 ou fragmento funcional ou variante da Hsp70 compreende triptofano na posição de aminoácido 90 do domínio ATPase da Hsp70.

8. Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, para uso de acordo com a reivindicação 1, em que o referido distúrbio de armazenamento lisossomal é selecionado a partir do grupo que consiste nos distúrbios de Niemann-Pick, Farber, Krabbe, Fabry, Gaucher, Sialidose, leucodistrofia Metacromática e deficiência em saposina.

9. Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, para uso de acordo com a reivindicação 1, em que o referido distúrbio de armazenamento lisossomal é a doença de Niemann-Pick tipo A ou tipo B.

10. Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, para uso de acordo com a reivindicação 1, em que a referida doença de armazenamento lisossomal é caracterizada por ter atividade enzimática residual da enzima deficiente envolvida na patologia da doença.

11. Hsp70, ou um fragmento funcional ou variante desta, para uso de acordo com a reivindicação 10, em que a referida atividade enzimática residual é na gama de desde 0,1% até 50%, tal como na gama de 0,1 até 1%, por exemplo 1 até 2%, tal como 2 até 3%, por exemplo 3 até 4%, tal com 4 até 5%, por exemplo 5 até 6%, tal com 6 até 7%, por exemplo 7 até 8%, tal como 8 até 9%, 3 por exemplo 9 até 10%, tal como 10 até 11 %, por exemplo 11 até 12%, tal com 12 até 13%, por exemplo 13 até 14%, tal com 14 até 15%, por exemplo 15 até 20%, tal como 20 até 25%, por exemplo 25 até 30%, tal como 30 até 35%, por exemplo 35 até 40%, tal com 40 até 45%, por exemplo na gama de 45 até 50% de atividade enzimática residual.

12. Hsp7 0 ou um fragmento funcional desta para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11.

13. Fragmento funcional de Hsp70 para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, e 6-11.

14. Variante funcional de Hsp70 para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, e 6-11. Lisboa, 24 de Julho de 2012