JP2001161378A

JP2001161378A - タンパク質の高純度製造法、インターロイキン１２、インターロイキン１２の活性を阻害するタンパク質、哺乳動物の免疫疾病治療剤および免疫疾病治療方法

Info

Publication number: JP2001161378A
Application number: JP2000292946A
Authority: JP
Inventors: Fumiyoshi Okano; 文義岡野
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1999-10-01
Filing date: 2000-09-26
Publication date: 2001-06-19

Abstract

(57)【要約】【課題】イヌインターロイキン１２およびインターロ
イキン１２の活性を阻害するタンパク質を高純度で大量
に製造し、免疫疾患のイヌの治療薬および予防薬として
提供すること。【解決手段】本発明は、各種生産系で生産されたイヌ
インターロイキン１２およびインターロイキン１２の活
性を阻害するタンパク質をイオン交換担体、色素担体を
単独あるいは組み合わせて用い高純度に精製分離する方
法に関する。さらに、本発明は、イヌＰ４０をコードす
る遺伝子をより発現性が高いプロモーター下に接続し、
イヌＰ３５をコードする遺伝子をそれより発現性が低い
プロモーター下に接続し、これらを同時に含む組換え体
を作製し、イヌＩＬ１２とイヌＰ４０ホモダイマーを、
同時に大量に製造する方法に関する

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、インターロイキン
１２およびインターロイキン１２の活性を阻害するタン
パク質を遺伝子操作技術によって量産して、以って医薬
品（抗腫瘍・抗ウイルス・抗アレルギー）とする事を目
的とした、インターロイキン１２およびインターロイキ
ン１２の活性を阻害するタンパク質を高純度で製造する
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】インターロイキン１２は、分子量約４０
ｋＤタンパク質（以下Ｐ４０と略記する）と約３５ｋＤ
タンパク質（以下Ｐ３５と略記する）とのヘテロダイマ
ーよりなり、ナチュラルキラー細胞および１型ヘルパー
Ｔ細胞を活性化するなどの生理活性作用を有するサイト
カインで（文献１、２）、ＩＬ１２と略記される。ＩＬ
１２は、特に細胞性免疫の強力な活性化作用により、腫
瘍、感染症、アレルギーなどのマウスモデル実験におい
て、驚異的な治癒効果が多くの文献において報告されて
おり（文献３、４、５）、腫瘍および感染症の治療薬と
して臨床試験も始まっている。

【０００３】また、ＩＬ１２を構成する２つのタンパク
質の内、Ｐ４０がダイマー構造を形成したタンパク質
（以下Ｐ４０ホモダイマーと略記する）はＩＬ１２の活
性を特異的に阻害する活性を有する。ＩＬ１２は細胞性
免疫を強力に活性化するため、細胞性免疫の過剰反応が
原因である疾患に対しては逆に病態の悪化を引き起こ
す。細胞性免疫の過剰反応が原因である疾患の多くは、
ＩＬ１２が過剰産生されており、Ｐ４０ホモダイマーは
このような疾患に対して特に治療効果が期待される。
（ＩＬ１２の活性を阻害するタンパク質を以下、Ｐ４０
ホモダイマーと略記する。）遺伝子操作技術の進歩によりヒトのＩＬ１２のみなら
ず、イヌ、ウシ、ネコなどの動物のＩＬ１２の遺伝子も
クローニングが報告されている。（文献６、７、８）。

【０００４】ヒトと同様、イヌにも乳腺腫瘍など多数の
腫瘍、アトピー性皮膚炎など多くの皮膚炎、パルボウイ
ルス感染症、ジステンバー感染症など多数の感染症など
が知られており、これらはイヌの疾病統計で常に上位に
ランクされている。しかしながら、これらイヌの疾病に
対する有効な治療薬および予防薬は現在のところほとん
どない。例えば腫瘍では、腫溜が大きくなってから来院
するイヌがほとんどで、手術により切除してもすでに転
移していて、手術後まもなく死亡することが多い。ま
た、イヌに多い皮膚疾病では、ステロイド剤などを用い
て長期にわたり繰り返し治療されているにもかかわら
ず、完治しない例が多く、即効性でかつ持続性のある治
療薬が望まれている。これらの疾病のほとんどは生体内
の免疫バランスが破綻していることが原因であり、免疫
バランスを制御し得る治療薬が有望であると考えられ
る。そのような現状の中で、強く免疫反応を制御し得る
イヌＩＬ１２やイヌＰ４０ホモダイマーが入手可能とな
れば、有効な治療薬および予防薬がないこれらイヌの疾
病に対する用途が開かれると期待される。ネコに関して
も同様なことが言える。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、かかる状況に鑑み、イヌＩＬ１２およびイヌＰ４０
ホモダイマーを大量生産し、高純度に製造して医薬品と
し、免疫疾患のイヌの治療薬および予防薬として提供す
ることにある。

【０００６】ＩＬ１２は２つのタンパク質から構成され
るため、種々の生産系で生産した場合、ほとんどの場
合、Ｐ４０とＰ３５のヘテロダイマー以外に、Ｐ４０ホ
モダイマー、Ｐ４０モノマおよびＰ３５モノマーなどの
組合せができ、従って、多成分で生産される。ＩＬ１２
の製剤中にＰ４０ホモダイマーが存在すれば、ＩＬ１２
の活性が阻害され、また逆にＰ４０ホモダイマーの製剤
中にＩＬ１２が存在すれば、Ｐ４０ホモダイマーの活性
が阻害されるため、それぞれタンパク質の薬効が低下す
る。従って、医薬品とする場合、特にＩＬ１２とＰ４０
ホモダイマーは完全に分離する必要がある。また、多成
分から成る有用蛋白質を医薬品とする場合、各成分をそ
れぞれ単独に精製分離し、各成分ごとに毒性試験、薬効
試験等詳細な解析を行うことが必要であり、また製剤化
の際、それぞれの成分を常に一定含量添加することが義
務づけられている。従って、ＩＬ１２およびＰ４０ホモ
ダイマーを遺伝子組換えの医薬品とする場合、目的の成
分を高純度で精製分画することが重要な課題である。

【０００７】イヌＩＬ１２の場合も、種々の生産系で生
産させた場合、得られた培養液中には、イヌＰ４０とイ
ヌＰ３５のヘテロダイマー以外の組合せが存在し、多成
分で生産されることを見出した。

【０００８】このように多成分のイヌＰ４０とイヌＰ３
５の組合せから、イヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダ
イマーを、カラム精製で活性を維持したまま高純度に大
量に分離精製する方法はこれまで知られていなかった。
従って、イヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーの
高純度での製造法を確立することができれば、イヌＩＬ
１２およびイヌＰ４０ホモダイマーの医薬品としての開
発の途が開かれると期待される。

【０００９】また、イヌＩＬ１２とイヌＰ４０ホモダイ
マーはどちらもイヌ治療薬となる可能性が高いため、同
時に大量に製造する方法を見出すことができれば、より
幅広くイヌの免疫疾病治療薬を提供することが可能にな
る。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者はかかる状況に
鑑み、各種生産系で生産されたイヌＩＬ１２およびイヌ
Ｐ４０ホモダイマーを高純度に精製分離することを目的
とし、創意工夫を成し、遺伝子組換え手法を用いて種々
の生産系でイヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマー
を生産し、それぞれ純度９０％以上に精製分離する方法
を確立し、また、イヌＰ４０をコードする遺伝子をより
発現性が高いプロモーター下に接続し、イヌＰ３５をコ
ードする遺伝子をそれより発現性が低いプロモーター下
に接続し、これらを同時に含む組換え体を作製し、イヌ
ＩＬ１２とイヌＰ４０ホモダイマーを、同時に大量に製
造する方法を見出し、かくして本発明を完成させるに至
った。すなわち本発明は、１．インターロイキン１２および／またはインターロイ
キン１２の活性を阻害するタンパク質をイオン交換担体
および／または色素担体に接触させ、インターロキン１
２および／またはインターロイキン１２の活性を阻害す
るタンパク質を取得することを特徴とするタンパク質の
高純度製造法。２．純度が９０％以上であることを特徴とするインター
ロイキン１２。３．純度が９０％以上であることを特徴とするインター
ロイキン１２の活性を阻害するタンパク質。４．上記１．の方法により得られたタンパク質または上
記２．もしくは上記３．に記載のタンパク質を含むこと
を特徴とする哺乳動物の免疫疾病治療剤。５．上記４．に記載の免疫疾病治療剤をイヌまたはネコ
に投与することを特徴とする免疫疾病治療方法。であ
る。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明のイヌＩＬ１２蛋白質の２
つのサブユニットをそれぞれコードするＤＮＡを組込ん
だプラスミドは例えば次のようにして製造することがで
きる。すなわち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽
出した後、ｃＤＮＡを合成し、ウシやヒトのＩＬ１２の
２つのサブユニットをそれぞれコードする遺伝子配列を
元にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以
下ＰＣＲと略す）を行うことによってイヌＩＬ１２活性
を示す２つのサブユニットをそれぞれコードする２つの
遺伝子をクローニングすることができる。また、合成し
たｃＤＮＡ組換え体よりファージライブラリーを作製
し、ＰＣＲによって得られた２つの遺伝子断片とプラー
クハイブリダイゼーションを行うことにより、イヌＩＬ
１２Ｐ４０ｃＤＮＡとイヌＩＬ１２Ｐ３５ｃＤＮＡの全
長をクローニングすることができる。

【００１２】イヌの臟器や細胞、例えばマイトージェン
などで刺激されたイヌ単核球やリンパ球などよりＲＮＡ
を得る方法としては、通常の方法、例えば、ポリソーム
の分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法
などがあげられる。上記イヌ臟器やイヌ細胞よりＲＮＡ
を抽出する方法としては、グアニジン・チオシアネート
処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシ
アネート−塩化セシウム法（文献９）バナジウム複合体
を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活
性剤で処理したのちフェノール抽出を行う方法（文献１
０），グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノー
ル法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸
法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロ
ホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理したのち
塩化リチウムで処理してＲＮＡを沈殿させる方法などの
中から適当な方法を選んで行うことができる。

【００１３】イヌ臟器やマイトージェンなどで刺激され
たイヌ単核球やリンパ球より通常の方法、例えば、塩化
リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート
法、オリゴｄＴセルロースカラム法等によりｍＲＮＡを
単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例えば、Ｇ
ｕｂｌｅｒらの方法（文献１１），Ｈ．Ｏｋａｙａｍａ
らの方法（文献１２）等によりｃＤＮＡを合成する。得
られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、基本的に
はトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素など
を用いるほか１部プライマーを用いてＤＮＡポリメラー
ゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合成
あるいはクローニング用キットを用いるのが便利であ
る。

【００１４】このｃＤＮＡを鋳型としてヒト、マウスお
よびウシの塩基配列を基にしたプライマーを用いてＰＣ
Ｒを行うことによってイヌＩＬ１２活性を示すＰ４０サ
ブユニットおよびＰ３５サブユニットをコードする遺伝
子をクローニングすることができる。また、合成したｃ
ＤＮＡをλファージベクターに連結した後、インビトロ
でλファージのコート蛋白質などと混合することにより
パッケージングし、その生成されたファージ粒子を宿主
となる大腸菌に感染させる。この際、λファージの感染
した大腸菌は溶菌し、１個１個のクローンがプラークと
して回収される。このプラークをニトロセルロースなど
のフィルターに移し、放射標識したＰＣＲで得た遺伝子
をプローブとしたハイブリダイゼーションにより、イヌ
ＩＬ１２Ｐ４０ｃＤＮＡおよびイヌＩＬ１２Ｐ３５ｃＤ
ＮＡの全長をクローニングすることができる。

【００１５】宿主としては原核生物又は真核生物を用い
ることができる。原核生物としては細菌、特に大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ），バチルス属
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌、例えばバチルス・ズブチリ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）等を用いる
ことができる。真核生物としては酵母、例えばサッカロ
ミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、例えば
サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の真核性微生物、昆
虫細胞、例えば、ヨガ細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆ
ｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、キャベツルーパー細胞（Ｔｒｉ
ｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）、カイコ細胞（Ｂｏｍｂｙｘ
ｍｏｒｉ）、動物細胞、例えばヒト細胞、サル細胞、
マウス細胞等を使用することができる。本発明において
はさらに、生物体それ自体、例えば昆虫、例えばカイ
コ、キャベツルーパー等を用いることもできる。

【００１６】発現ベクターとしては、プラスミド、ファ
ージ、ファージミド、ウイルス（バキュロ（昆虫）、ワ
クチニア（動物細胞））等が使用できる。発現ベクター
中のプロモーターは宿主細菌に依存して選択され、例え
ば細菌用プロモーターとしてはｌａｃプロモーター、ｔ
ｒｐプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターと
しては、例えばａｄｈ１プロモーター、ｐｑｋプロモー
ター等が使用される。また、昆虫用プロモーターとして
はバキュロウイルスポリヘドリンプロモーター、ｐ１０
プロモーター等、動物細胞としてはＳｉｍｉａｎＶｉ
ｒｕｓ４０のｅａｒｌｙまたはｌａｔｅプロモーター等
があげられるが、これらに限定されない。発現ベクタ
ーによる宿主の形質転換は、当業界においてよく知られ
ている常法により行うことができ、これらの方法は例え
ば、カレントプロトコールインモレキュラーバイ
オロジー（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ），ジョンウ
イリーアンドサンズ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆
Ｓｏｎｓ）社、に記載されている。形質転換体の培養も
常法に従って行うことができる。

【００１７】産生されたイヌＩＬ１２は，非還元下、ド
デシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により決定すると、見かけの分子
量が約７０〜８０ｋＤである。

【００１８】ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、７０〜８０ｋＤの
バンドが、還元条件下では分子量約４０ｋＤと約３５ｋ
Ｄの２つのサブユニットを生じる。

【００１９】イヌＩＬ１２は、以下の実施例２で示すよ
うに、ｉｎｖｉｔｒｏで、イヌ白血球からのインター
フェロンγ（以下ＩＦＮγと略記する）の誘導能および
フィトヘムアグルチニンン（以下ＰＨＡと略記する）で
刺激されたイヌリンパ球の増殖促進効果により主に特性
化される。その他、ＮＫ細胞や細胞障害性Ｔ細胞を活性
化してそれらの標的細胞、例えば腫瘍由来のセルライン
またはウイルス感染した線維芽細胞を融解する活性を有
する。

【００２０】本発明において高純度精製に使用されるイ
オン交換担体としては、アガロース、セルロース、合成
ポリマーゲルなどに、例えばジエチルアミノエチル（Di
ethylaminoethyl）、クオテナリアミノエチル（Quatern
ary aminoethyl）、クオテナリアンモニウム（Quaterna
ry ammonium）、カルボキシメチル（Carboxymethyl）、
スルホプロピル（Sulphopropyl）、メチルスルホネ−ト
（Methyl sulphonate）などの官能基を導入したものが
挙げられる。好ましくはスルホプロピルが導入された、
ＳＰセファロースハイパフォーマンス（アマシャム・
ファルマシア社製）やＳＰセファロースファーストフ
ロー（アマシャム・ファルマシア社製）など（以下、Ｓ
Ｐセファロース担体と略記する）が用いられる。ＳＰセ
ファロース担体からの溶出は、溶出剤のｐＨ値、イオン
強度などによって決定される。Ｐ４０とＰ３５の組合せ
から成るタンパク質はそれぞれ異なった電荷を有してお
り、それぞれの電荷の差により、本担体を用いて、それ
ぞれを分画することができる。例えば、昆虫細胞中で生
産させたイヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーの
場合、ｐＨ値７下で、それぞれを分画することができ
る。

【００２１】さらに、色素担体としては、ブルー色素を
結合させた担体（以下、ブルー担体と略記する）が好ま
しく用いられる。ブルー担体としては次のものが使用さ
れる。ブルー色素は一般名をＣＩリアクティブブルー２
といい、例えばＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ社からジバクロン
ブルーＦ３ＧＡ、またはジバクロンブルー３ＧＡという
商品名で市販されている青色色素などが挙げられる。実
際のクロマトグラフィーに使用する担体としては、ブル
ーセファロースＣＬ−６Ｂ（アマシャム・ファルマシア
社製）、ブルーセファロース６ファーストフロー（アマ
シャム・ファルマシア社製）、ブルーセファロース６ハ
イパフォーマンス（アマシャム・ファルマシア社製）、
マトレックスゲルブルーＡ（アミコン社製）、アフィゲ
ルブルー（バイオラット社製）などの商品名で市販され
ているブルーアガロースゲル、またはブルートリスアク
リルーＭ（ＬＫＢ社製）ブルーセルロファイン（チッソ
社製）などの商品名で市販されているブルーセファロー
スゲルなどが適当であり、容易に入手することができ
る。ブルー担体からの溶出は、溶出剤のｐＨ値、イオン
強度、疎水度などによって決定される。例えば、イヌＩ
Ｌ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーの場合、中性付近
のｐＨで、それぞれを分離溶出して、高純度で精製する
ことができる。

【００２２】本発明の製造法におけるカラム担体を用い
た精製操作はそれぞれ単独で行ってもイヌＩＬ１２およ
びイヌＰ４０ホモダイマーの高純度化が可能であるが、
好ましくはそれぞれを組合わせて行った方がより効果が
高い。例えば、カイコ生体中で生産したイヌＩＬ１２お
よびイヌＰ４０ホモダイマーを含む溶液中には、非常に
多くのカイコ由来の夾雑物と複数のイヌＰ４０とイヌＰ
３５の組合わせが含まれるので、上記２つのカラム担体
を組合わせることが好ましい。昆虫細胞中およびカイコ
生体中で生産させたイヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモ
ダイマーの製造においては、初段精製にスルホプロピル
担体を、２段目精製にブルー担体を用いることが好まし
い。

【００２３】なお、各カラム担体を用いた精製操作にお
ける、溶出剤の組成、液量などは特に限定されるもので
はなく、最適な分離条件は存在する夾雑タンパク質、イ
ヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーの量、および
カラムの寸法などに応じて適宜決定される。

【００２４】また、本発明の製造法で製造されるイヌＩ
Ｌ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーの純度は、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥによる分析で９８％以上、逆相カラムを用い
たＨＰＬＣによる分析で、９０％以上である。

【００２５】また、ＩＬ１２およびＰ４０ホモダイマー
をそれぞれ同時に大量に製造するために、Ｐ４０をコー
ドする遺伝子をより発現性が高いプロモーター下に接続
し、Ｐ３５をコードする遺伝子をそれより発現性が低い
プロモーター下に接続し、これらを同時に含む組換え体
を作製し、それぞれの遺伝子を発現させることで、ＩＬ
１２とＰ４０ホモダイマーを、同時に生産することがで
きる。例えば、バキュロウイルス発現系において、ポリ
ヘドリンプロモーターとＰ１０プロモーターの両方を含
むベクターのポリヘドリンプロモーター下にイヌＰ４０
をコードする遺伝子を、Ｐ１０プロモーター下にイヌＰ
３５をコードする遺伝子をそれぞれ連結し、組換えウイ
ルスを作製して、昆虫細胞で発現させることによって、
イヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーの両方を同
時に大量に製造することができる。

【００２６】本発明に係るイヌおよびネコの免疫疾病治
療薬・予防薬は、腫瘍をはじめ皮膚炎、アレルギー疾
患、感染症など免疫能が低下した疾病、あるいは特に細
胞性免疫反応に比べ、液性免疫反応が中心となったよう
な片寄った免疫反応を示す疾病などさまざまなイヌおよ
びネコの免疫疾病に対して、従来のこれらイヌおよびネ
コの疾病に対する治療薬・予防薬や治療方法・治療方法
に比べ、驚くべき顕著な治療効果および予防効果を示
す。

【００２７】本発明において、イヌおよびネコの腫瘍と
しては、乳腺腫瘍、好酸球性肉芽腫、類表皮腫、皮膚腫
瘍、脂肪腫、耳血腫、肺水腫、皮膚有茎軟腫または肛門
腫瘍が挙げられ、イヌおよびネコの皮膚炎としては、ア
レルギー性皮膚炎、免疫介在性皮膚炎、腫瘍性皮膚炎、
寄生虫性皮膚炎、細菌性皮膚炎、真菌性皮膚炎、内分泌
疾患、角化異常などが挙げられる。アレルギー性皮膚炎
としては、例えばアトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、ノ
ミによる皮膚炎、ダニによる皮膚炎などが挙げられ、免
疫介在性皮膚炎としては、例えば狼瘡、天疱瘡、アカン
トーシス、表皮壊死、皮膚血管炎、ブドウ膜炎、悪性脱
毛、強皮症、好酸球性皮膚炎などが挙げられ、寄生虫性
皮膚炎としては、ノミによる皮膚炎、ダニによる皮膚
炎、ウジによる皮膚炎、フィラリアによる皮膚炎などが
挙げられ、細菌性皮膚炎としては、例えば膿皮症などが
挙げられ、真菌性皮膚炎としては、例えば表皮性皮膚
炎、全身性皮膚炎などが挙げられ、内分泌疾患として
は、例えば甲状腺皮膚炎、成長ホルモン反応性皮膚炎、
エストロゲン性皮膚炎などが挙げられ、角化異常として
は、例えば本態性脂漏性皮膚炎、脂肪酸欠乏性皮膚炎、
亜鉛欠乏性皮膚炎、ビタミンＡ欠乏性皮膚炎などが挙げ
られる。イヌおよびネコの感染症としては、イヌパルボ
ウイルス感染症、ジステンバー感染症、ネコエイズおよ
びネコ白血病などが挙げられ、そしてアレルギー性疾病
としては、イヌおよびネコの花粉症などが挙げられる。

【００２８】また、このイヌおよびネコの免疫疾病治療
薬・予防薬は、イヌＩＬ１２に加えて任意に他の成分を
含むことができる。本薬に添加される成分は、主とし
て、本薬が投与される方式に依存して決定される。本薬
が個体として用いられる場合は、例えばラクトース等の
充填剤、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン等の結
合剤、着色剤、コーティング剤等を用いることができ、
このような剤は経口投与に好適である。また、担体また
は賦活剤として例えば、白色ワセリン、セルロース誘導
体、界面活性剤、ポリエチレングリコール、シリコー
ン、オリーブ油等を加えてクリーム、乳液、ローション
等の形態として外用薬として患部に塗布して用いること
もできる。また、本薬が液体として投与される場合は、
通常行われている生理学的に許容される溶媒、および乳
化剤、安定剤を含むことができる。溶媒としては水、Ｐ
ＢＳ、等張性生理食塩水等が挙げられ、乳化剤として
は、ポリオキシエチレン系界面活性剤、脂肪酸系界面活
性剤、シリコーン等が例示でき、安定剤としては、イヌ
血清アルブミン、ゼラチン等のポリオール、またはソル
ビトール、トレハロースなどの糖類等が挙げられる。本
発明の治療薬および予防薬の投与方法に特に限定はない
が、注射投与することにより最も治療効果が期待でき
る。注射投与方法としては静脈内投与、筋肉内投与、皮
下投与、腹腔内投与、胸腔内投与いずれの方法にも限定
されない。

【００２９】投与量は、個体の大きさ、投与方法、疾病
の種類、症状などに依存して決定されるであろうが、治
療効果および予防効果を示すのに十分な量を投与すれば
よく、例えば、１用量、１日当たり、０．１ｐｇから１
００μｇ／ｋｇのイヌＩＬ１２の投与で十分な効果が得
られる。

【００３０】また、養子免疫療法では１ー１００ｍｌの
イヌまたはネコの血液から分離したリンパ球に対し、
０．００１ｐｇから１μｇのイヌＩＬ１２で１２時間か
ら６日間刺激した後に再び体内に戻すことによって十分
な効果が得られる。

【００３１】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。

【００３２】実施例１イヌＩＬ１２Ｐ４０、Ｐ３５遺
伝子のクローニング（１）イヌｃＤＮＡの調製イヌ肝臓、ＬＰＳ（５０μｇ／ｍｌ）で４８時間刺激し
たイヌ末梢血単核球およびニワトリニューカッスル病ウ
イルスで７時間処理した（１０⁷ ｐｆｕ／ｍｌ）イヌ脾
臓由来リンパ球よりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社
製）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１
ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で
５分間処理した後、１ＭＬｉＣｌを含むＴＥを同量加
えた。０．５ＭＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリ
ゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同
緩衝液にて洗浄した。さらに０．３ＭＬｉＣｌを含む
ＴＥにて洗浄後、０．０１％ＳＤＳを含む２ｍＭＥＤ
ＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出
した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本
鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌ
のミクロ遠心チューブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと
０．５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１８ｍｅ
ｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加
えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベートし
たのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ８．４）、５００ｍＭＫＣｌ溶液を２μ
ｌ、２５ｍＭＭｇＣｌ₂ を２μｌ、１０ｍＭｄＮＴ
Ｐを１μｌおよび０．１ＭＤＴＴを２μｌそれぞれ加
え、４２℃で５分間インキュベートしたのち、２００ユ
ニットのＧｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ
ＩＩＲＴを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間イ
ンキュベートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７
０℃で１５分間インキュベートして反応を停止し、氷上
に５分間置いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃｏｌｉ
ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で
２０分間インキュベートした。

【００３３】（２）イヌｃＤＮＡファージライブラリー
の調製上記（１）で得られたポリ（Ａ）ＲＮＡ１μｇづつを用
い、ファルマシア社のタイムセーバーｃＤＮＡ合成キッ
トにて添付のマニュアルに従い、オリゴｄＴプライマー
を用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成し、さらにＥｃｏＲＩ／
ＮｏｔＩアダプターを連結した。これを用いて、アマシ
ャム社のｃＤＮＡラピットクローニングモジュール−λ
ｇｔ１０にて添付のマニュアルに従い、組換えλｇｔ１
０ベクターを作製し、さらにアマシャム社のインビトロ
パッケージングモジュールにて添付のマニュアルに従
い、組換え体ファージ作製した。

【００３４】（３）イヌＩＬ１２Ｐ４０遺伝子のクロー
ニングヒトＩＬ１２Ｐ４０のＮ末端およびＣ末端の塩基配列
（文献１）をもとに、５´ＡＴＧＴＧＴＣＡＣＣＡＧＣ
ＡＧＴＴＧＧＴＣＡＴＣＴＣＴＴＧＧＴＴＴ３´（配列
番号３）と５´ＣＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＣＡＧＡ
ＴＧＣＣＣＡ３´（配列番号４）の２種類のプライマー
をＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）のイ
ヌ肝臓およびＬＰＳ刺激イヌ末梢血より得られたｃＤＮ
Ａを別々の０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに２μｌづ
つ取り、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂ 、
２５ｍＭＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌゼラチン、５０
μＭ各ｄＮＴＰ、４単位ＴａｑＤＮＡポリメラーゼと
なるように各試薬を加え、全量１００μｌとする。ＤＮ
Ａの変性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリン
グ条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２
℃、３分の各条件でパーキンエルマーセータス（Ｐｅｒ
ｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）社のＤＮＡサーマル
サイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１
％アガロースゲルにて電気泳動し、約９９０ｂｐのＤＮ
Ａ断片を常法（文献１３）に従って調製した。

【００３５】このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社
のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）のＤＮＡＬｉｇａ
ｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．１を用いて連結した。これ
を用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質
転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次
にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを
前述と同じ条件のＰＣＲによって確認し、Ｇｅｎｅｓｉ
ｓ２０００ＤＮＡａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍ
（デュポン社製）を用いて、ダイデオキシ法（文献１
４）でイヌＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユ
ニットのうち一方のＰ４０サブユニットＤＮＡの塩基配
列を決定した。この配列を配列番号１に示す。

【００３６】また、この配列を含む、９９０ｂｐのＤＮ
Ａ断片に宝酒造（株）のＲａｎｄｏｍＰｒｉｍｅｒ
ＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔを用いて³²Ｐを標識
し、プローブを作製した。上記（２）で得られたイヌ肝
臓ｃＤＮＡから作製した組換え体ファージライブラリー
を大腸菌ＮＭ５１４上でプラークとして形成させ、アマ
シャム社のＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋に常法に従って転写し
た。

【００３７】Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋は、５×ＳＳＰＥ
（０．９ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、５ｍ
ＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、５×デンハルト溶液
（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリド
ン、０．１％ウシ血清アルブミン）、０．１％ＳＤＳ、
１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中、６５℃で２時間イ
ンキュベートし、ついで同じ溶液中で上述のようにして
作製した標識プローブ１×１０⁶ｃｐｍ／ｍｌとハイブ
リダイズした。６５℃で１晩インキュベートした後、Ｈ
ｙｂｏｎｄ−Ｎ＋を０．２×ＳＳＣ（３０ｍＭＮａＣ
ｌ、３ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ中１
５分、３回洗浄し、富士写真フィルム（株）の富士イメ
ージングプレートに１２時間露出し、富士写真フィルム
（株）のバイオイメージングアナライザーにて解析し
た。陽性のシグナルを有するプラークは常法に従い、再
スクリーニングを行った。３回のスクリーニングの結
果、陽性シグナルを有する１個の組換え体ファージを得
た。この組換え体ファージより常法に従ってファージＤ
ＮＡを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、１％
アガロースゲル電気泳動にて得られた約１．５ｋｂのＤ
ＮＡ断片を常法に従い調製し、宝酒造（株）のＤＮＡ
ＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２を用いて、宝酒
造（株）のｐＵＣ１１８ＢＡＰ処理ＤＮＡ（ＥｃｏＲＩ
／ＢＡＰ）と連結した。これを用いてプラスミドＤＮＡ
を常法により調製し、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキ
ンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、
その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社の
ダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用
いて、得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。この
うち、イヌＩＬ１２Ｐ４０をコードする配列を配列番号
１１に示す。

【００３８】（４）イヌＩＬ１２Ｐ３５遺伝子のクロー
ニングヒトＩＬ１２Ｐ３５のＮ末端（文献１）およびウシＩＬ
１２Ｐ３５のＣ末端の塩基配列をもとに、５´ＡＧＣＡ
ＴＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴ
ＴＧＴＣＧＣＴＡＣＣＣＴＧ３´（配列番号５）と５´
ＣＴＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＧＡＴＡＧＣＴＣＡＴＣ
ＡＴＴＣＴＧＴＣＧＡＴＧＧＴ３´（配列番号６）の２
種類のプライマ−をＤＮＡシンセサイザーにて合成し
た。上記（１）の鶏ニューカッスル病ウイルスで処理し
たイヌ脾臓由来リンパ球より得られたｃＤＮＡを鋳型と
して上記（３）と同様にして約６７０ｂｐのＤＮＡ断片
を得、Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、イヌＩＬ１２活性を
示すと思われる２つのサブユニットのうち一方のＰ３５
サブユニットＤＮＡの塩基配列を決定した。この配列を
配列番号２に示す。

【００３９】また、この配列を含む６７０ｂｐのＤＮＡ
断片を用いて標識プローブを作製した。上記（２）で得
られた鶏ニューカッスル病ウイルスで処理したイヌ脾臓
由来リンパ球より得られたｃＤＮＡから作製した組換え
体ファージライブラリーを上記（３）と同様にして標識
プローブとハイブリダイズし、スクリーニングを行っ
た。その結果得られた陽性シグナルを有する１個の組換
え体ファージよりＤＮＡを抽出し、制限酵素ＮｏｔＩで
切断した後、１％アガロースゲル電気泳動にて得られた
約１．２ｋｂのＤＮＡ断片をストラタジーン（ＳＴＲＡ
ＴＡＧＥＮＥ）社のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩのＮｏ
ｔＩサイトに常法に従い連結した。これを用いてプラス
ミドＤＮＡを調製し、蛍光ＤＮＡシーケンサーを用い
て、得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。このう
ち、イヌＩＬ１２Ｐ３５をコードする配列を配列番号１
２に示す。

【００４０】実施例２イヌＩＬ１２の生産（１）イヌＩＬ１２発現ベクターの調製発現ベクターｐＣＤＬ−ＳＲα２９６（文献１５）を制
限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、バクテリア由来アルカリホ
スファターゼで末端を脱リン酸化した。これを１％アガ
ロースゲル電気泳動にて約３．６ｋｂのＤＮＡ断片を常
法に従い調製した。一方、ＣａＩＬ１２Ｐ４０ＤＮＡ
断片は５´ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＣＡＣＣＡ
ＧＣＡＧＴＴＧＧＴＣＡＴＣＴＣＴＴＧＧ３´（配列番
号７）と５´ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＴＧＣＡＧ
ＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＡＧＴＣＧＣＴ３´（配列
番号８）の２種類のＥｃｏＲＩ切断部位を付加したプラ
イマーを作製し、実施例１（２）で調製したＴ−Ｖｅｃ
ｔｏｒに挿入したイヌＩＬ１２活性を示すと思われる２
つのサブユニットのうち一方のＰ４０サブユニットＤＮ
Ａを鋳型として、ＤＮＡの変性条件を９４℃、１分、プ
ライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマ
ーの伸長条件を７２℃，３分、サイクル数３０でＰＣＲ
を行い、エタノール沈殿後、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断
し、１％アガロースゲル電気泳動にて約９９０ｂｐのＤ
ＮＡ断片を調製した。また、５´ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡ
ＴＧＣＡＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＣＡＴＣＴＣ
ＣＴＧＧ３´（配列番号１３）と５´ＣＣＣＧＡＡＴＴ
ＣＣＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＡ
ＧＴＣＧＣＴ３´（配列番号１４）の２種類のＥｃｏＲ
Ｉ切断部位を付加したプライマーを作製し、実施例１
（２）で調製したｐＵＣ１１８に挿入したイヌＩＬ１２
Ｐ４０ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行い、ＥｃｏＲＩ
で切断し、約９９０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。得ら
れたそれぞれのイヌＩＬ１２Ｐ４０ＤＮＡ断片をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて上述のようにして調製したｐＣＤ
Ｌ−ＳＲα２９６に連結した。これを用いて大腸菌を形
質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを
調製し、イヌＩＬ１２Ｐ４０を発現するＦＯＣａＩＬ１
２Ｐ４０およびＦＯＣａＩＬ１２Ｐ４０ＦＬを得た。

【００４１】また、ｐＣＤＬ−ＳＲα２９６を制限酵素
ＰｓｔＩで切断し脱リン酸化後、電気泳動にて約３．６
ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。イヌＩＬ１２Ｐ３５Ｄ
ＮＡ断片は５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＴＣＣＡ
ＧＣＧＣＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＣ３´（配
列番号９）と５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＧＧＡＡＧ
ＡＡＣＴＣＡＧＡＴＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴ３´
（配列番号１０）の２種類のＰｓｔＩ切断部位を付加し
たプライマーを作製し、実施例１（３）で調製したＴ−
Ｖｅｃｔｏｒに挿入したイヌＩＬ１２活性を示すと思わ
れる２つのサブユニットのうち一方のＰ３５サブユニッ
トＤＮＡを鋳型として、９４℃，１分、５５℃，２分、
７２℃，３分、３０サイクルでＰＣＲを行い、エタノー
ル沈殿後、制限酵素ＰｓｔＩで切断した。これを１％ア
ガロースゲル電気泳動にて約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を
調製した。また、５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＣ
ＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＧ３
´（配列番号１５）と５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧ
ＧＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＡＡＣＴＣＡＴＣＡＴＴＣ
Ｔ３´（配列番号１６）の２種類のＰｓｔＩ切断部位を
付加したプライマーを作製し、実施例１（２）で調製し
たｐＵＣ１１８に挿入したイヌＩＬ１２Ｐ３５ＤＮＡを
鋳型として、ＰＣＲを行い、ＰｓｔＩで切断し、約６７
０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。得られたそれぞれのイ
ヌＩＬ１２Ｐ３５ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用
いて上述のように、ＰｓｔＩで切断し調製したｐＣＤＬ
−ＳＲα２９６に連結、大腸菌形質転換、プラスミドＤ
ＮＡ調製を行い、イヌＩＬ１２Ｐ３５を発現するＦＯＣ
ａＩＬ１２Ｐ３５およびＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５ＦＬを
得た。

【００４２】さらに、作製したこれら４つの発現プラス
ミド中のイヌＩＬ１２Ｐ４０ＤＮＡおよびイヌＩＬ１２
Ｐ３５ＤＮＡの塩基配列を確認した。

【００４３】（２）サルＣＯＳ細胞でのイヌＩＬ１２の
生産上記（１）で得られたそれぞれ５μｇのＦＯＣａＩＬ１
２Ｐ４０およびＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５を５０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、４００μｇ／ｍｌのＤＥ
ＡＥデキストラン（ファルマシア社製）および１００μ
Ｍのクロロキン（シグマ社製）を含む４ｍｌのＥＲＤＦ
培地（極東製薬（株）社製）に加えておく。一方、直径
１０ｃｍのディッシュを用いて１０％ウシ胎児血清（ギ
ブコ社製、以下ＦＢＳと略記する）で５０％コンフルエ
ントになるまで増殖させたＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−１６５０）をＰＢＳで一回洗浄した後、上記で
得た４ｍｌのＤＮＡ混合液を加え、５％ＣＯ₂ 、３７℃
の条件で培養した。４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄した
後、２０ｍｌのＥＲＤＦ培地にて５％ＣＯ₂、３７℃の
条件で４日間培養し、イヌＩＬ１２が生産された培養上
清を得た。

【００４４】（３）イヌＩＬ１２産生組換えバキュロウ
イルスの作製バキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＡＢ３
（ファーミンジェン社製）のプロモーター下流の制限酵
素ＸｂａＩおよびＳｍａＩ切断部位にそれぞれＰ４０お
よびＰ３５サブユニットｃＤＮＡを常法に従って連結
し、組換えトランスファーベクターを得た。さらにファ
ーミンジェン社のバキュロウイルストランスフェクショ
ンキットを用いてその添付マニュアルに従って、組換え
バキュロウイルスを作製した。

【００４５】（４）昆虫細胞でのイヌＩＬ１２の生産上記（３）で得られた組換えバキュロウイルスを、ファ
ーミンジェン社のバキュロゴールドＰｒｏｔｅｉｎ−Ｆ
ｒｅｅＩｎｓｅｃｔＭｅｄｉｕｍで７５ｃｍ²のフ
ラスコでコンフルエントまで平面培養したＳｆ２１細胞
（ＳｐｏｎｄｏｐｔｅｒａＦｌｕｇｉｐｅｒｄａ由
来、ファーミンジェン社より入手）に感染させ、４日間
培養した後、イヌＩＬ１２が生産された培養上清を得
た。

【００４６】実施例３ウエスタンブロッティングによ
るイヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーの検出（１）抗イヌＰ４０および抗イヌＰ３５ポリクローナル
抗体の作製実施例１で得られたイヌＰ４０の遺伝子配列から推定さ
れるアミノ酸配列の内、配列番号：１７〜配列番号：２
０に示すペプチド断片をペプチドシークエンサーにて合
成し、各断片をすべて混合してＢＳＡとのコンジュゲー
トを作製した。同様にして、イヌＰ３５の遺伝子配列か
ら推定されるアミノ酸配列の内、配列番号：２１〜配列
番号：２４に示すペプチド断片をペプチドシークエンサ
ーにて合成し、各断片をすべて混合してＢＳＡとのコン
ジュゲートを作製した。

【００４７】各コンジュゲートそれぞれ５ｍｇをウサギ
１頭づつの腹腔に注入し４週間後、イヌＰ４０に対する
ポリクローナル抗体およびイヌＰ３５に対するポリクロ
ーナル抗体が産生された血清を得た。

【００４８】（２）ウエスタンブロッティング実施例２（４）で得られた昆虫細胞の培養上清中のイヌ
ＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマーをウエスタンブ
ロッティング法によって検出した。培養上清をアトー
（株）のパジェル中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その
後、アトー（株）のクリアブロットメンブランに常法に
従ってブロッティング後、メンブランを、上記（１）で
得られた抗イヌＰ４０ポリクローナル抗体を含むウサギ
血清を含むブロックエース（大日本製薬（株）製）溶液
に６時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰ
ＢＳにて３回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ
抗ウサギＩｇＧ（バイオラット（株）製）を含むブロッ
クエース溶液に６時間反応させ、同様に洗浄した後、コ
ニカ（株）のコニカイムノステインＨＲＰ１０００にて
発色を行った。その結果、約７５ｋＤと約８５ｋＤの２
本のバンドが検出された。さらに、抗イヌＰ３５ポリク
ローナル抗体を含むウサギ血清を用いて、同様にして、
実施例２で得られた昆虫細胞の培養上清を解析した結
果、約７５ｋＤのバンドのみが検出された。このことか
ら、約７５ｋＤのバンドは、イヌＰ４０とＰ３５のヘテ
ロダイマーから成るイヌＩＬ１２であり、約８５ｋＤの
バンドは、イヌＰ４０ホモダイマーであることが判明し
た。従って、実施例２の方法により、昆虫細胞でイヌＩ
Ｌ１２とイヌＰ４０ホモダイマーの両方を同時に生産す
ることに成功した。

【００４９】実施例４イヌＩＬ１２の活性測定実施例２（２）、（４）で生産されたイヌＩＬ１２の活
性測定は以下のようにして行った。イヌリンパ球からの
イヌＩＦＮγ誘導活性検定のために、抗ウイルス活性お
よびイヌ細胞のクラスＩＩＭＨＣ発現増強活性を測定し
た。イヌ脾臓よりリンパ球を分離し、１０％ＦＢＳ−Ｅ
ＲＤＦに１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で懸濁し、
このうち２．５ｍｌとゼンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）社
のヒトＩＬ２を２５０Ｕ、６ｃｍディッシュに添加し
た。これに上記（２）で得られた培養上清２．５ｍｌと
ヒトＩＬ２（ゼンザイム社製）２５０Ｕを加え、５％Ｃ
Ｏ₂、３７℃の条件で２日間培養し、ウイルスとしてＶ
ｅｓｉｃｕｌａｒＳｔｏｍａｔｉｔｉｓＶｉｒｕ
ｓ，感受性細胞としてＭＤＣＫ（ＡＴＣＣＣＣＬ−３
４）を用い、文献１６のＣＰＥ法に従ってこの培養液の
抗ウイルス活性を測定した。その結果、２ｘ１０⁵ 希釈
単位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が確認された。また、
上記（４）で得られた培養上清の抗ウイルス活性を同様
にして測定した結果、１０⁷希釈単位／ｍｌ以上の抗ウ
イルス活性が検出された。一方、１０μｇのｐＣＤＬ−
ＳＲα２９６を上記（２）と同様にＣＯＳ−１細胞に導
入したコントロールの細胞培養液およびＳｆ２１細胞を
３日間培養した培養液では抗ウイルス活性は全く認めら
れなかった。

【００５０】また、クラスＩＩＭＨＣを発現したイヌ乳
腺腫瘍組織由来細胞株ＦＣＢＲ１を用いて、上記の各培
養液中のクラスＩＩＭＨＣの発現増強活性を測定した。
６ｃｍディッシュに、１０⁵個のＦＣＢＲ１を接着さ
せ、これに上記の各培養液５ｍｌを添加し、５％Ｃ
Ｏ₂、３７℃の各条件で１晩培養した。培養後、トリプ
シンにて細胞を剥離し、１．５ｍｌのミクロ遠心チュー
ブにて遠心した。これに、ストラタジーン社のラット抗
イヌクラスＩＩＭＨＣモノクローナル抗体を１０μｌ添
加し、さらに５０μｌの１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで懸濁
し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、５μ
ｌのＦＩＴＣ標識ラビット抗ラットモノクローナル抗体
（セロテック社製）および５０μｌの１０％ＦＢＳ−Ｅ
ＲＤＦで懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄
後、ベクトンディッキンソン（株）のＦＡＣＳｃａｎに
て解析した。その結果、ＣＯＳ１およびＳｆ２１で産生
させたイヌＩＬ１２は、ＦＣＢＲ１上のクラスＩＩＭＨ
Ｃの発現量をそれぞれ約２０％、６０％上昇させた。こ
れらのことから、イヌＩＬ１２はイヌリンパ球に作用し
て、イヌＩＦＮγを誘導する活性を有することが判明し
た。

【００５１】また、芽球化したイヌリンパ球の増殖促進
活性を測定した。イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、１
０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦに１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞
密度で懸濁し、このうち５ｍｌを６ｃｍディッシュに添
加した。これにＰＨＡを５μｇ／ｍｌの濃度で添加し、
５％ＣＯ₂ 、３７℃の条件で３日間培養してリンパ球を
芽球化させた。この芽球化リンパ球を１０％ＦＢＳ−Ｅ
ＲＤＦに１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で懸濁し、
９６穴マイクロプレート１穴あたり、５０μｌを添加し
た。これに上記（２）で得られた培養上清を１穴あたり
５０μｌ加えた。また、コントロールとして１０％ＦＢ
Ｓ−ＥＲＤＦのみを１穴あたり５０μｌ加えた。これら
をさらに５％ＣＯ₂ 、３７℃の条件で３日間培養後、文
献１１のＭＴＴアッセイ法により、イヌＩＬ１２の芽球
化リンパ球の増殖促進活性を測定した。すなわち、５ｍ
ｇ／ｍｌのＭＴＴ（シグマ社製）溶液を１穴あたり１０
μｌづつ添加し、さらに６時間培養した。１５０μｌの
０．０１Ｎ塩酸イソプロパノール溶液を加えた後、超音
波にて細胞を破砕し、マイクロプレートリーダー（バイ
オラット社製Ｍｏｄｅｌ１３５５０）にて波長５９５ｎ
ｍの吸光度を測定した。その結果、コントロールの吸光
度が平均０．６９であったのに対し、ＣＯＳ−１で産生
したイヌＩＬ１２は平均１．５２であり、約２倍以上の
芽球化リンパ球の増殖促進活性が認められた。

【００５２】さらに、イヌＩＬ１２のイヌ腫瘍に対する
抗腫瘍作用を検討した。イヌ末梢血よりリンパ球を分離
し、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで５x１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍ
ｌの細胞密度に懸濁し、このうち５ｍｌを６ｃｍディッ
シュに添加した。これにベーリンガーマンハイム社
（株）のリコンビナントヒトＩＬ２を５００Ｕ添加し、
５％ＣＯ₂、３７℃の条件で３日間培養した。一方、イ
ヌ腫瘍細胞ＦＣＢＲ１およびＡ７２（ＡＴＣＣＣＲＬ
−１５４２）を１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦでそれぞれ１０
５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に懸濁し、９６穴プレー
ト１穴あたり５０μｌづつ添加し、プレートに接着させ
た。これにヒトＩＬ２で刺激したイヌリンパ球５０μｌ
を加え、さらにイヌＩＬ１２を発現している上記（２）
で得られた培養上清１００μｌもしくはコントロールと
して１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ１００μｌを添加し、５％
ＣＯ₂、３７℃の条件で２日間培養した。培養後、上清
を完全に取り除き、ＭＴＴアッセイを行った。％細胞障
害性を次の式にて算出した。

【００５３】％細胞障害性＝（１ーＯＤ２／ＯＤ１）ｘ１００ここで、ＯＤ１＝培地のみで培養したイヌ腫瘍細胞の波
長５９５ｎｍの吸光度ＯＤ２＝イヌリンパ球と共に培養
したイヌ腫瘍細胞の波長５９５ｎｍの吸光度を表す。

【００５４】その結果、ＦＣＢＲ１ではコントロールが
３４％であったのに対し、ＣＯＳ−１で生産したイヌＩ
Ｌ１２は約７５％の細胞障害性を示した。また、Ａ７２
ではコントロールが２２％であったのに対し、イヌＩＬ
１２は約８３％の細胞障害性を示した。イヌＩＬ１２は
イヌリンパ球を活性化して、イヌ腫瘍細胞に対して抗腫
瘍作用を発揮することが判明した。

【００５５】実施例５イヌＩＬ１２およびイヌＰ４０
ホモダイマーの精製実施例２（４）で得られた細胞培養上清を用いてスルホ
プロピル担体によるイヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモ
ダイマーの分画を検討した。精製はｐＨ：７で行った。
培養上清を、スルホプロピル担体を充填したカラムにア
プライした後、十分量の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ：
７）でカラムを洗浄した。溶出はＮａＣｌの濃度を１Ｍ
まで５ｍＭ刻みで行った。その結果、イヌＩＬ１２は、
３５０〜５５０ｍＭで、イヌＰ４０ホモダイマーは、６
００〜７５０ｍＭの各ＮａＣｌ濃度の溶出画分で検出さ
れた（ウエスタンブロッティング）。なおその他の溶出
画分およびアルカリ洗浄画分にはイヌＩＬ１２およびイ
ヌＰ４０ホモダイマーは検出されなかった。

【００５６】イヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマ
ーが溶出された各画分をさらにブルーセファロース担体
を充填したカラムにそれぞれアプライし、十分量の２０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ：７）でカラムを洗浄後、Ｎａ
Ｃｌの濃度を５００ｍＭから２Ｍまで５ｍＭ刻みで溶出
を行った。その結果、イヌＩＬ１２は１．１〜１．２Ｍ
で、イヌＰ４０ホモダイマーは、１．５〜２Ｍの各Ｎａ
Ｃｌ濃度の溶出画分で検出された（ウエスタンブロッテ
ィング）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によると、イヌＩＬ１
２およびイヌＰ４０ホモダイマーが溶出されたブルーセ
ファロース担体での各画分中のイヌＩＬ１２およびイヌ
Ｐ４０ホモダイマーの純度は、それぞれ９８％以上であ
った。

【００５７】実施例６精製イヌＩＬ１２およびイヌＰ
４０ホモダイマーの活性実施例５で得られた精製イヌＩＬ１２およびイヌＰ４０
ホモダイマーのｉｎｖｉｔｒｏでの活性測定は以下のよ
うにして行った。精製イヌＩＬ１２のイヌリンパ球から
のイヌＩＦＮγ誘導活性検定のために、抗ウイルス活性
を測定した。イヌ末梢血からリンパ球を分離し、９６穴
マイクロプレート中、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦに１０⁶
ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で１穴あたり１００μｌ添
加し、各穴にゼンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）社のリコン
ビナントヒトＩＬ２を２５０μｇ加え、これに精製イヌ
ＩＬ１２（１〜１０³ｐｇ／ｍｌ）を単独、および精製
イヌＩＬ１２（１〜１０³ｐｇ）とイヌＰ４０ホモダイ
マー（１ｎｇ／ｍｌ）を同時に加え、それぞれ５％ＣＯ
₂ 、３７℃の条件で７２時間培養した。培養後の各培養
上清１００μｌ中の抗ウイルス活性を測定した。ウイル
スとしてＶｅｓｉｃｕｌａｒＳｔｏｍａｔｉｔｉｓ
Ｖｉｒｕｓ，感受性細胞としてＦＣＢＲ１を用い、文献
１６のＣＰＥ法に従ってこの培養液の抗ウイルス活性を
測定した。その結果、精製イヌＩＬ１２（１〜１０³ｐ
ｇ／ｍｌ）単独添加した培養上清で、２ｘ１０³〜１０⁵
単位／ｍｌの抗ウイルス活性が確認された。一方、精
製イヌＩＬ１２（１〜１０³ｐｇ）とイヌＰ４０ホモダ
イマー（１ｎｇ／ｍｌ）を同時に添加した培養上清で
は、抗ウイルス活性が１０²〜１０³ 単位／ｍｌであ
り、イヌＰ４０ホモダイマーが、イヌＩＬ１２のイヌＩ
ＦＮγ誘導活性を阻害する活性を有することが明らかに
なった。

【００５８】実施例７イヌＩＬ１２製剤の製造実施例５で得られた精製イヌＩＬ１２およびイヌＰ４０
ホモダイマーの各溶液を透析によって脱塩した溶液に、
注射用生理食塩水、注射用低分子ゼラチン（新田ゼラチ
ン（株）製）、ソルビトールを加えて、ゼラチンの終濃
度０．５％、ソルビトールの終濃度３０％に調製した。
さらに、ポジダイン（ポール（株）製）で処理してパイ
ロジェンを除去した後、２５０℃で２時間乾熱滅菌した
ガラスバイアルに１ｍｌづつ分注した。その後、無菌的
に凍結乾燥することによって、１バイアル中に１ｐｇか
ら５μｇのイヌＩＬ１２およびイヌＰ４０ホモダイマー
を含むイヌＩＬ１２製剤およびイヌＰ４０ホモダイマー
製剤を得た。これら各製剤は、室温条件下で安定であ
り、また、蒸留水または生理食塩水によって良好に溶解
した。

【００５９】実施例８細胞レベルでのイヌＩＬ１２製
剤の薬効評価（１）腫瘍イヌＩＬ１２製剤の抗腫瘍効果を見るために、担ガンマ
ウスを作製し、イヌＩＬ１２製剤で刺激されたイヌリン
パ球を移入して腫瘍の縮小効果を検討した。６週齢のメ
スヌードマウス（ＢＡＬＢ／Ｃｎｕ／ｎｕ）１０匹を
日本クレア（株）より購入した。それぞれの背部皮下に
イヌ乳腺腫瘍細胞株ＦＣＢＲ１を１０⁸ｃｅｌｌｓ移植
し、約１ヶ月後、平均３３ｍｍｘ２５ｍｍの腫瘤を有す
る担ガンマウスを作製した。一方、ＦＣＢＲ１を樹立す
る際に、Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅらの方法（文献１７）によ
り分離した腫瘍内浸潤リンパ球（以下ＴＩＬと略記す
る）１０⁸ｃｅｌｌｓを２０ｍｌの１０％ＦＢＳ−ＥＲ
ＤＦで懸濁し、実施例４で調製したイヌＩＬ１２製剤１
０ｎｇを添加して５％ＣＯ₂、３７℃の条件で２日間培
養し、イヌＩＬ１２製剤で刺激されたＴＩＬを得た。ま
たコントロールとしてイヌＩＬ１２製剤を添加せずに同
様の条件で培養した１０⁸ｃｅｌｌｓのＴＩＬを準備し
た。これら２種類のＴＩＬを担ガンヌードマウスの尾静
脈より１匹あたり１０⁷ｃｅｌｌｓ、５匹づつ移入し
た。移入７日後、ノギスにて腫瘍重量を測定し、ＴＩＬ
移入前との腫瘍重量の変化を調べた。なお、腫瘍重量は
次の式にて算出した。

【００６０】腫瘍重量＝（長径ｘ短径²／２）その結果、イヌＩＬ１２製剤で刺激されたＴＩＬを移入
した担ガンヌードマウスは５匹のうち３匹で完全に腫瘍
が退縮し、２匹でＴＩＬ移入前の腫瘍重量を１とした相
対腫瘍重量で０．２以下であった。一方、コントロール
のＴＩＬを移入した担ガンヌードマウスは５匹とも腫瘍
が増大し、相対腫瘍重量ですべて１．２５以上であっ
た。以上のことから担ガンマウスを用いた系において、
イヌＩＬ１２製剤はＴＩＬを活性化して腫瘍縮小効果を
発揮することが判明した。

【００６１】（２）アレルギーイヌＩＬ１２製剤の抗アレルギー効果を見るために、ア
レルギーの患犬由来リンパ球をイヌＩＬ１２製剤で刺激
し、ＩｇＥなどアレルギーの原因となる因子の発現調節
の有無について検討した。アトピー性皮膚炎と診断され
た患犬５頭からそれぞれ１０ｍｌの血液を採取した。こ
れらより直ちにリンパ球を分離し、抗ヒトＣＤ３ポリク
ローナル抗体（ゼンザイム社製）で固相化した１０ｃｍ
ディッシュにて１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦでイヌＩＬ１２
製剤をそれぞれ１０ｎｇづつ加えて３日間培養した。な
おコントロールとしてＣａＩＬ１２製剤を添加せずに同
様の条件で培養したイヌリンパ球を準備した。培養後、
各ディッシュ中の一部のリンパ球を回収し、実施例１に
記載の方法によりｃＤＮＡを合成し、イヌＩｇＥおよび
イヌＩｇＥレセプター遺伝子に特異的なプライマーを用
いてＰＣＲを行い、それら遺伝子の発現を調べた。その
結果、イヌＩＬ１２製剤を添加して培養したイヌリンパ
球のそれら遺伝子の発現はイヌＩＬ１２製剤を添加しな
かったものと比較していずれも抑制されていた。このこ
とから、イヌＩＬ１２製剤はイヌリンパ球に作用してア
レルギーの原因因子の１つであるＩｇＥおよびＩｇＥレ
セプターの発現を抑制することが判明した。また、抗ヒ
トＣＤ４ポリクローナル抗体（ゼンザイム社製）を用い
たパンニング法（文献１８）により各ディッシュ中の残
りのリンパ球から主にヘルパーＴ細胞集団からなるＣＤ
４陽性細胞を得た。これを用いてｃＤＮＡを合成し、イ
ヌＩＬ５およびイヌＩＦＮγ遺伝子に特異的なプライマ
ーを用いてＰＣＲを行い、それら遺伝子の発現を調べ
た。その結果、イヌＩＬ５遺伝子の発現に関してはイヌ
ＩＬ１２製剤の添加によりいずれも発現が抑制されてい
た。一方、イヌＩＦＮγ遺伝子の発現に関してはイヌＩ
Ｌ１２製剤の添加によりいずれも発現が増強されてい
た。ＩＬ５はアレルギー反応などの液性免疫反応を引き
起こす２型ヘルパーＴ細胞から産生され、一方ＩＦＮγ
は細胞性免疫を引き起こし液性免疫を抑制する１型ヘル
パーＴ細胞から産生される。このことから、イヌＩＬ１
２製剤はイヌリンパ球中の２型ヘルパーＴ細胞を抑制
し、１型ヘルパーＴ細胞を活性化する作用を有すること
が示唆された。以上のことから、イヌＩＬ１２製剤はイ
ヌのアレルギー性疾患の治療に有望であることが判明し
た。

【００６２】実施例９イヌＩＬ１２製剤およびイヌＰ４０ホモダイマー製剤の
イヌに対する毒性試験イヌＩＬ１２製剤の毒性を試験し
た。試験動物としてビーグル犬３頭を用いた。試験は以
下の要領にて実施した。

【００６３】(1) 投与方法２日おきに計５回投与を行った。投与量は順次増やして
いった（初回：１ｎｇ／ｋｇ体重、５ｎｇ／ｋｇ体重、
２５ｎｇ／ｋｇ体重、２５０ｎｇ／ｋｇ体重、５回目：
１μｇ／ｋｇ体重）。また投与ルートは静脈投与により
行った。

【００６４】(2) 観察検査期間、観察検査項目、観察点観察期間は投与開始前１週から投与開始後３週までとし
た。観察検査項目は臨床症状（呼吸様式、元気、食欲、
活動性、可視粘膜、流延、嘔吐、排便行動、傾眠）、体
温、心拍数、体重、血液学的検査（血球系（白血球数、
ヘマトクリット、血小板数、血液像）、電解質（Ｎａ，
Ｋ，Ｃｌ）、生化学的検査（ＢＵＮ，Ｃｒｅａ．，ＧＯ
Ｔ，ＧＰＴ，ＣＰＫ，Ｇｌｕｃｏｓｅ，ＴＰ，Ａｌｂ，
Ｇｌｏｂ，Ａ／Ｇ）、尿所見、循環器および自律神経系
所見とした。観察点は体重に関しては投与日から７日目
毎に１回測定し、その他の項目に関しては、投与開始１
週前、投与日の投与直前、投与１０分後、３０分後、１
時間後、１．５時間後、２時間後、４時間後、６時間
後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、投与開始２
週後および投与開始３週後に測定した。

【００６５】以上の要領にて試験を行った結果、イヌＩ
Ｌ１２製剤の投与によって問題となる変化は認められな
かったことから、イヌＩＬ１２製剤は少なくとも１μｇ
／ｋｇ体重の投与量まではイヌに対して毒性がないこと
が明らかになった。

【００６６】また、イヌＰ４０ホモダイマー製剤につい
ても同様の投与を行った結果、１μｇ／ｋｇ体重の投与
量まではイヌに対して毒性がないことが明らかになっ
た。

【００６７】実施例１０イヌＩＬ１２製剤およびイヌ
Ｐ４０ホモダイマー製剤によるイヌ疾病の治療および予
防表皮に腫瘤を持つ患犬、計１２頭に対してイヌＩＬ１２
製剤を局所注射および静脈内注射投与した。どの患犬に
もさまざまな大きさの腫瘤が複数個存在していた。１２
頭中８頭に対しては、腫瘤１個につき、１０ｎｇ−１μ
ｇのイヌＩＬ１２を３ー４日間隔で３ー１０回、腫瘍局
所に直接、注射投与した。その結果、イヌＩＬ１２製剤
を投与した腫瘤の９割が完全に消失し、残りの腫瘤も全
て半分以下に縮小した。４頭は大きさが１００ｃｍ³以
上の腫瘤を持っており、全てすでに肺、肝臓、腎臓など
の内臓に転移していた。これら３頭については外科的手
術により表皮の腫瘤を切除した直後にイヌＩＬ１２製剤
を静脈内に１０ｎｇ／ｋｇ投与し、以後５００ｎｇ／ｋ
ｇの投与量で連日７日間にわたって投与を続けた。その
結果、内臓に転移していた腫瘍は全て消失し、以後６ヵ
月間観察したが、再発は全くみられなかった。

【００６８】また、アトピー性皮膚炎と診断された患犬
７頭に対してイヌＩＬ１２製剤を静脈内注射投与した。
これら患犬は皮膚に紅斑、湿疹および脱毛などの臨床症
状が観察され、また血液中には多量のＩｇＥが検出さ
れ、その白血球画分にはＩＬ４，ＩＬ５，ＩＬ１０，Ｉ
Ｌ１３の各ｍＲＮＡが高発現していた。イヌＩＬ１２製
剤を１回当り０．１ー１００ｎｇ／ｋｇの投与量で３日
間隔で３ー５回、静脈内に投与した結果、１回の投与で
臨床症状が速やかに改善され、３ー５回で完治にいたっ
た。

【００６９】さらに、花粉症と診断された患犬３頭に対
してイヌＩＬ１２製剤を静脈内注射投与した。投与量は
０．１−１０ｐｇ／ｋｇで１回の投与でクシャミ、鼻水
等の臨床症状が速やかに改善された。

【００７０】イヌＰ４０ホモダイマー製剤については、
イヌＩＬ１２製剤の投与によって、症状が悪化した原因
不明の難治性皮膚炎に対して、１回当り０．１ー１００
ｎｇ／ｋｇの投与量で連日３ー５回、静脈内および皮下
に注射投与した結果、１回の投与で臨床症状が速やかに
改善され、３ー５回で完治にいたった。

【００７１】実施例１１イヌＩＬ１２製剤を用いた養子免疫療法によるイヌ疾病
の治療表皮に腫瘤を持つ患犬５頭、患猫２頭およびアトピー性
皮膚炎と診断された患犬３頭それぞれから２５ｍｌの血
液を採取した。これらより直ちにリンパ球を分離し、抗
ヒトＣＤ３ポリクローナル抗体（ゼンザイム社製）で固
相化した１０ｃｍディッシュにて１０％ＦＢＳ−ＥＲＤ
ＦでヒトＩＬ２（ゼンザイム社製）５０ＵとイヌＩＬ１
２製剤を１００ｎｇ加えて４日間培養した。培養後、リ
ンパ球を回収し、それぞれのイヌおよびネコに静脈内注
射した。その結果、アトピー性皮膚炎の患犬は３頭とも
すべて完治し、また、腫瘍の患犬および患猫もすべてに
腫瘤の縮小傾向が認められ、同様の操作を１週間おきに
３〜５回繰り返したところ、すべての腫瘍が完全に退縮
した。

【００７２】

【発明の効果】本発明によれば、イヌＩＬ１２およびイ
ヌＰ４０ホモダイマーを高純度で大量に製造できる。ま
た、イヌおよびネコの腫瘍、皮膚病、感染症、アレルギ
ー疾病の優れた治療薬・予防薬および優れた治療方法・
予防方法を提供できる。

【００７３】参考文献：１．Ｗｏｌｆら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６，３０７
４−３０８１（１９９１）．２．Ｓｈｏｅｎｈａｕｔら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４
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ｔｏｋｉｎｅＲｅｓ．，１７，７１３−７１８（１９
９７）．７．Ｖｉｒｇｉｌら：Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ
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Ａｃｔａ１２７０，２１５−２１７（１９９５）．９．Ｃｈｉｒｇｗｉｎら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
１８，５２９４（１９７９）．１０．Ｂｅｒｇｅｒら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１
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９（１９８３）．１２．Ｏｋａｙａｍａら：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
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（１９８３）．１３．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬｏｂｏｒａｔｏｒ
ｙ．ＮｅｗＹｏｒｋ．１９８２．１４．Ｐｒｏｂｅｒら：Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８，３３
６−３４１（１９８７）．１５．Ｔａｋｅｂｅら：Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，４４６−４７２（１９
８８）．１６．Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｂａｍら：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５
４，５３６（１９７３）．１７．Ｗｈｅｔｅｓｉｄｅら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ９０，２２１−２２３（１９８６）．１８．Ｓｅｅｄら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ８４，３３６５−３３６９（１９８
６）．

【００７４】

【配列表】 <110> 東レ株式会社 <120> タンパク質の高純度製造法、インターロイキン１２、インターロイキン１２の活性を阻害するタンパク質、哺乳動物の免疫疾病治療剤および免疫疾病治療方法 <130> 51E14990 <160> 24 <210> 1 <211> 990 <212> DNA PRT <213> dog <220> <221> CDS <222> (1)...(987) <220> <221> mat#peptide <222> (67)...(987) <400> atg tgt cac cag cag ttg gtc atc tct tgg ttt tcc ctc gtt ttg ctg 48 Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Leu Leu gcg tct ccc ctc atg gcc ata tgg gaa ctg gag aaa gat gtt tat gtt 96 Ala Ser Pro Leu Met Ala Ile Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val gta gag ttg gac tgg cac cct gat gcc ccc gga gaa atg gtg gtc ctc 144 Val Glu Leu Asp Trp His Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu acc tgc cat acc cct gaa gaa gat gac atc act tgg acc tca gcg cag 192 Thr Cys His Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Ala Gln agc agt gaa gtc cta ggt tct ggt aaa act ctg acc atc caa gtc aaa 240 Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys gaa ttt gga gat gct ggc cag tat acc tgc cat aaa gga ggc aag gtt 288 Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Lys Val ctg agc cgc tca ctc ctg ttg att cac aaa aaa gaa gat gga att tgg 336 Leu Ser Arg Ser Leu Leu Leu Ile His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp tcc act gat atc tta aag gaa cag aaa gaa tcc aaa aat aag atc ttt 384 Ser Thr Asp Ile Leu Lys Glu Gln Lys Glu Ser Lys Asn Lys Ile Phe ctg aaa tgt gag gca aag aat tat tct gga cgt ttc aca tgc tgg tgg 432 Leu Lys Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp ctg acg gca atc agt act gat ttg aaa ttc agt gtc aaa agt agc aga 480 Leu Thr Ala Ile Ser Thr Asp Leu Lys Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg ggc ttc tct gac ccc caa ggg gtg aca tgt gga gca gtg aca ctt tca 528 Gly Phe Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Val Thr Leu Ser gca gag agg gtc aga gtg gac aac agg gat tat aag aag tac aca gtg 576 Ala Glu Arg Val Arg Val Asp Asn Arg Asp Tyr Lys Lys Tyr Thr Val gag tgt cag gag ggc agt gcc tgc ccc tct gcc gag gag agc cta ccc 624 Glu Cys Gln Glu Gly Ser Ala Cys Pro Ser Ala Glu Glu Ser Leu Pro atc gag gtc gtg gtg gat gct att cac aag ctc aag tat gaa aac tac 672 Ile Glu Val Val Val Asp Ala Ile His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr acc agc agc ttc ttc atc aga gac atc atc aaa cca gac cca ccc aca 720 Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Thr aac ctg cag ctg aag cca ttg gaa aat tct cgg cac gtg gag gtc agc 768 Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Glu Asn Ser Arg His Val Glu Val Ser tgg gaa tac ccc gac acc tgg agc acc cca cat tcc tac ttc tcc ctg 816 Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu aca ttt tgc ata cag gcc cag ggc aag aac aat aga gaa aag aaa gat 864 Thr Phe Cys Ile Gln Ala Gln Gly Lys Asn Asn Arg Glu Lys Lys Asp aga ctc tgc gtg gac aag acc tca gcc aag gtc gtg tgc cac aag gat 912 Arg Leu Cys Val Asp Lys Thr Ser Ala Lys Val Val Cys His Lys Asp gcc aag atc cgc gtg caa gcc cga gac cgc tac tat agt tca tcc tgg 960 Ala Lys Ile Arg Val Gln Ala Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp agc gac tgg gca tct gtg ccc tgc agt tag 990 Ser Asp Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser *** <210> 2 <211> 669 <212> DNA PRT <213> dog <220> <221> CDS <222> (1)...(666) <220> <221> peptide <222> (1)...(666) <220> <221> mat#peptide <222> (76)...(666) <400> atg tgt cca gcg cgc agc ctc ctc ctt gtc gct acc ctg gtc ctg cta 48 Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu agc cac ctg gac cac ctt act tgg gcc agg agc ctc ccc aca gcc tca 96 Ser His Leu Asp His Leu Thr Trp Ala Arg Ser Leu Pro Thr Ala Ser cca agc cca gga ata ttc cag tgc ctc aac cac tcc caa aac ctg ctg 144 Pro Ser Pro Gly Ile Phe Gln Cys Leu Asn His Ser Gln Asn Leu Leu aga gcc gtc agc aac acg ctt cag aag gcc aga caa act cta gaa tta 192 Arg Ala Val Ser Asn Thr Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Leu tat tcc tgc act tcc gaa gag att gat cat gaa gat atc aca aag gat 240 Tyr Ser Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp aaa acc agc aca gtg gag gcc tgc tta cca ctg gaa tta acc atg aat 288 Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Met Asn gag agt tgc ctg gct tcc aga gag atc tct ttg ata act aac ggg agt 336 Glu Ser Cys 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Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Leu Leu gcg tct ccc ctc atg gcc ata tgg gaa ctg gag aaa gat gtt tat gtt 96 Ala Ser Pro Leu Met Ala Ile Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val gta gag ttg gac tgg cac cct gat gcc ccc gga gaa atg gtg gtc ctc 144 Val Glu Leu Asp Trp His Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu acc tgc cat acc cct gaa gaa gat gac atc act tgg acc tca gcg cag 192 Thr Cys His Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Ala Gln agc agt gaa gtc cta ggt tct ggt aaa act ctg acc atc caa gtc aaa 240 Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys gaa ttt gga gat gct ggc cag tat acc tgc cat aaa gga ggc aag gtt 288 Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Lys Val ctg agc cgc tca ctc ctg ttg att cac aaa aaa gaa gat gga att tgg 336 Leu Ser Arg Ser Leu Leu Leu Ile His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp tcc act gat atc tta aag gaa cag aaa gaa tcc aaa aat aag atc ttt 384 Ser Thr Asp Ile Leu Lys Glu Gln Lys Glu Ser Lys Asn Lys Ile Phe ctg aaa tgt gag gca aag aat 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Ser Arg His Val Glu Val Ser tgg gaa tac ccc gac acc tgg agc acc cca cat tcc tac ttc tcc ctg 816 Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu aca ttt tgc ata cag gcc cag ggc aag aac aat aga gaa aag aaa gat 864 Thr Phe Cys Ile Gln Ala Gln Gly Lys Asn Asn Arg Glu Lys Lys Asp aga ctc tgc gtg gac aag acc tca gcc aag gtc gtg tgc cac aag gat 912 Arg Leu Cys Val Asp Lys Thr Ser Ala Lys Val Val Cys His Lys Asp gcc aag atc cgc gtg caa gcc cga gac cgc tac tat agt tca tcc tgg 960 Ala Lys Ile Arg Val Gln Ala Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp agc gac tgg gca tct gtg tcc tgc agt tag 990 Ser Asp Trp Ala Ser Val Ser Cys Ser *** <210> 12 <211> 669 <212> DNA PRT <213> dog <220> <221> CDS <222> (1)...(666) <220> <221> peptide <222> (1)...(666) <220> <221> mat#peptide <222> (76)...(666) <400> atg tgc ccg ccg cgc ggc ctc ctc ctt gtg acc atc ctg gtc ctg cta 48 Met Cys Pro Pro Arg Gly Leu Leu Leu Val Thr Ile Leu Val Leu Leu agc cac ctg gac cac ctt act tgg gcc agg agc ctc ccc aca gcc tca 96 Ser His Leu Asp His Leu Thr Trp Ala Arg Ser Leu Pro Thr Ala Ser ccg agc cca gga ata ttc cag tgc ctc aac cac tcc caa aac ctg ctg 144 Pro Ser Pro Gly Ile Phe Gln Cys Leu Asn His Ser Gln Asn Leu Leu aga gcc gtc agc aac acg ctt cag aag gcc aga caa act cta gaa tta 192 Arg Ala Val Ser Asn Thr Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Leu tat tcc tgc act tcc gaa gag att gat cat gaa gat atc aca aag gat 240 Tyr Ser Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp aaa acc agc aca gtg gag gcc tgc tta cca ctg gaa tta acc atg aat 288 Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Met Asn gag agt tgc ctg gct tcc aga gag atc tct ttg ata act aac ggg agt 336 Glu Ser Cys Leu Ala Ser Arg Glu Ile Ser Leu Ile Thr Asn Gly Ser tgc ctg gcc tct gga aag gcc tct ttt atg acg gtc ctg tgc ctt agc 384 Cys Leu Ala Ser Gly Lys Ala Ser Phe Met Thr Val Leu Cys Leu Ser agc atc tat gag gac ttg aag atg tac cag atg gaa ttc aag gcc atg 432 Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Met Glu Phe Lys Ala Met aac gca aag ctt tta atg gat ccc aag agg cag atc ttt ctg gat caa 480 Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln aac atg ctg aca gct atc gat gag ctg tta cag gcc ctg aat ttc aac 528 Asn Met Leu Thr Ala Ile Asp Glu Leu Leu Gln Ala Leu Asn Phe Asn agt gtg act gtg cca cag aaa tcc tcc ctt gaa gag ccg gat ttt tat 576 Ser Val Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr aaa act aaa atc aag ctc tgc ata ctt ctt cat gct ttc aga att cgt 624 Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg gcg gtg acc atc gat aga atg atg agt tat ctg aat tct tcc taa 669 Ala Val Thr Ile Asp Arg Met Met Ser Tyr Leu Asn Ser Ser *** <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> ggggaattca tgcatcctca gcagttggtc atctcctgg 39 <210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> cccgaattcc taactgcagg acacagatgc ccagtcgct 39 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> gggctgcaga tgtgcccgcc gcgcggcctc ctccttgtg 39 <210> 16 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> gggctgcagt taggaagaat tcagataact catcattct 39 <210> 17 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> Ile Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp His 5 10 15 Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys His Thr Pro Glu 20 25 30 Glu Asp Asp Ile 35 <210> 18 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Thr Asn 5 10 15 Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg His 20 25 <210> 19 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser 5 10 15 Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Ile Gln Ala Gln Gly Lys Asn 20 25 30 <210> 20 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> Lys Asp Ala Lys Ile Arg Val Gln Ala Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser 5 10 15 Ser Trp Ser Asp Trp Ala Ser Val Ser Cys Ser 20 25 <210> 21 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> Arg Ser Leu Pro Thr Ala Ser Pro Ser Pro Gly Ile Phe Gln Cys Leu 5 10 15 Asn His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Thr Leu 20 25 30 <210> 22 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser 5 10 15 Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Met Asn Glu 20 25 30 <210> 23 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> Glu Leu Leu Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Val Thr Val Pro Gln Lys 5 10 15 Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr 20 25 <210> 24 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg 5 10 15 Ala Val Thr Ile Asp Arg Met Met Ser Tyr Leu Asn Ser Ser 20 25 30

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 31/04 １７１Ａ６１Ｐ 37/00 35/00 Ｃ０７Ｋ 1/18 37/00 1/22 Ｃ０７Ｋ 1/18 14/54 1/22 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｋ 14/54 (Ｃ１２Ｐ 21/02 ＫＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） //(Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 ＫＣ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｒ 1:93） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:93）Ａ６１Ｋ 37/02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】インターロイキン１２および／またはイン
ターロイキン１２の活性を阻害するタンパク質をイオン
交換担体および／または色素担体に接触させ、インター
ロキン１２および／またはインターロイキン１２の活性
を阻害するタンパク質を取得することを特徴とするタン
パク質の高純度製造法。
【請求項２】インターロイキン１２および／またはイン
ターロイキン１２の活性を阻害するタンパク質を含む溶
液をイオン交換担体および／または色素担体に接触さ
せ、担体への吸着物を溶出剤で溶出することを特徴とす
る請求項１記載のタンパク質の高純度製造法。
【請求項３】イオン交換担体がカチオン交換担体である
ことを特徴とする請求項１または２記載のタンパク質の
高純度製造法。
【請求項４】カチオン交換担体がスルホプロピル担体で
あることを特徴とする請求項３記載のタンパク質の高純
度製造法。
【請求項５】色素担体がブルーセファロース担体である
ことを特徴とする請求項１または２記載のタンパク質の
高純度製造法。
【請求項６】インターロイキン１２が、以下の（１）と
（２）がヘテロダイマーを形成したものであることを特
徴とする請求項１から５のいずれか１項記載のタンパク
質の高純度製造法。（１）配列番号：１もしくは配列番号：１１のアミノ酸
配列、または配列番号：１もしくは配列番号：１１のア
ミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、
置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク
質。（２）配列番号：２もしくは配列番号：１２のアミノ酸
配列、または配列番号：２もしくは配列番号：１２のア
ミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、
置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク
質。
【請求項７】インターロイキン１２が、以下の（１）
と（２）を同時に導入した動物細胞または、（１）と
（２）を同時に含むバキュロウイルスを感染させた昆虫
細胞または幼虫を用いて製造されたものであることを特
徴とする請求項１から５のいずれか１項記載のタンパク
質の高純度製造法。（１）配列番号：１もしくは配列番号：１１の塩基配
列、または配列番号：１もしくは配列番号：１１の塩基
配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしく
は付加された塩基配列からなるＤＮＡ。（２）配列番号：２もしくは配列番号：１２の塩基配
列、または配列番号：２もしくは配列番号：１２の塩基
配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしく
は付加された塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項８】インターロイキン１２の活性を阻害するタ
ンパク質が、以下のタンパク質がホモダイマーを形成し
たものであることを特徴とする請求項１から５のいずれ
か１項記載のタンパク質の高純度製造法。配列番号：１
もしくは配列番号：１１のアミノ酸配列、または配列番
号：１もしくは配列番号：１１のアミノ酸配列において
１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加さ
れたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項９】インターロイキン１２の活性を阻害する
タンパク質が、以下の（１）と（２）を同時に導入した
動物細胞または、（１）と（２）を同時に含むバキュロ
ウイルスを感染させた昆虫細胞もしくは幼虫を用いて製
造されたものであることを特徴とする請求項１から５の
いずれか１項記載のタンパク質の高純度製造法。（１）配列番号：１もしくは配列番号：１１の塩基配
列、または配列番号：１もしくは配列番号：１１の塩基
配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしく
は付加された塩基配列からなるＤＮＡ。（２）配列番号：２もしくは配列番号：１２の塩基配
列、または配列番号：２もしくは配列番号：１２の塩基
配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしく
は付加された塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項１０】インターロイキン１２およびインターロ
イキン１２の活性を阻害するタンパク質を同時に生産す
ることを特徴とする請求項１から９のいずれか１２項記
載のタンパク質の高純度製造法。
【請求項１１】インターロイキン１２を構成する２つの
タンパク質の内、高分子のタンパク質をコードする遺伝
子をより発現性が高いプロモーター下に接続し、低分子
のタンパク質をコードする遺伝子をそれより発現性が低
いプロモーター下に接続し、これらを同時に含む組換え
体を用いることを特徴とする請求項１０記載のタンパク
質の高純度製造法。
【請求項１２】純度が９０％以上であることを特徴とす
るインターロイキン１２。
【請求項１３】純度が９０％以上であることを特徴とす
るインターロイキン１２の活性を阻害するタンパク質。
【請求項１４】請求項１〜１１のいずれかの方法により
得られたタンパク質または請求項１２もしくは１３に記
載のタンパク質を含むことを特徴とする哺乳動物の免疫
疾病治療剤。
【請求項１５】哺乳動物がイヌまたはネコであることを
特徴とする免疫疾病治療剤。
【請求項１６】免疫疾病が腫瘍、皮膚炎、感染症または
アレルギー疾病である請求項１４または１５に記載の免
疫疾病治療剤。
【請求項１７】請求項１４〜１６のいずれかに記載の免
疫疾病治療剤をイヌまたはネコに投与することを特徴と
する免疫疾病治療方法。