JP4632326B2 - イヌのアトピー性皮膚炎の治療薬及び治療方法 - Google Patents
イヌのアトピー性皮膚炎の治療薬及び治療方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛋白質の一次構造がイヌの遺伝情報由来であるイヌインターロイキン１２（以下、ＣａＩＬ１２と略記する）からなるイヌのアトピー性皮膚炎の治療薬およびその薬を用いたイヌのアトピー性皮膚炎の治療方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インターロイキン１２は、分子量約４０ｋＤ蛋白質（以下Ｐ４０と略記する）と約３５ｋＤ蛋白質（以下Ｐ３５と略記する）とのヘテロダイマーよりなり、ナチュラルキラー 細胞および１型ヘルパーＴ細胞を活性化するなどの生理活性作用を有するサイトカインで（文献１、２）、ＩＬ１２と略記される。ＩＬ１２は、特に細胞性免疫の強力な活性化作用により、腫瘍、感染症、アレルギーなどのマウスモデル実験において、驚異的な治癒効果が多くの文献において報告されており（文献３、４、５）、腫瘍および感染症の治療薬として臨床試験も始まっている。
【０００３】
ヒトと同様、イヌにも乳腺腫瘍など多数の腫瘍、アトピー性皮膚炎など多くの皮膚炎、パルボウイルス感染症、ジステンバー感染症など多数の感染症などが知られており、これらはイヌの疾病統計で常に上位にランクされている。しかしながら、これらイヌの疾病に対する有効な治療薬および予防薬は現在のところほとんどない。例えば腫瘍では、腫溜が大きくなってから来院するイヌやがほとんどで、手術により切除してもすでに転移していて、手術後まもなく死亡することが多い。また、イヌに多い皮膚疾病では、ステロイド剤などを用いて長期にわたり繰り返し治療されているにもかかわらず、完治しない例が多く、即効性でかつ持続性のある治療薬が望まれている。そのような現状の中で、イヌのＩＬ１２が入手可能となれば、有効な治療薬および予防薬がないこれらイヌの疾病に対する用途が開かれると期待される。ネコに関しても同様なことが言える。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、かかる状況に鑑みＣａＩＬ１２ｃＤＮＡをクローニングし、それを用いて大量生産すること、およびＣａＩＬ１２からなる製剤を免疫疾患のイヌのアトピー性皮膚炎治療薬として提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的の達成のため、創意工夫を成し、イヌのｃＤＮＡからＣａＩＬ１２のＰ４０とＰ３５をコードするそれぞれの遺伝子をクローニングすることに成功し、更にはこれらを発現ベクターに連結した２つのプラスミドを用いてＣａＩＬ１２を生産する細胞の作製、およびこれら遺伝子を同時に含む組換えバキュロウイルスの作製に成功し、以って簡単に大量にＣａＩＬ１２を製造する方法を確立し、さらにはＣａＩＬ１２からなる製剤を従来の治療法では治療が困難である疾病のイヌに投与すること、または疾病のイヌ末梢血からリンパ球を分離してｉｎ ｖｉｔｒｏでＣａＩＬ１２からなる製剤で刺激後、再び同一イヌに戻すことによってその病状が驚くほど顕著に改善されることを見出し、かくして本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明の骨子は、下記の各発明から成る。
【０００７】
（１）配列番号：１または配列番号：１１と同じアミノ酸配列と配列番号：２または配列番号：１２と同じアミノ酸配列がヘテロダイマーを形成してできるイヌインターロイキン１２を含んでなるイヌのアトピー性皮膚炎治療薬。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のＣａＩＬ１２蛋白質の２つのサブユニットをそれぞれコードするＤＮＡを組込んだプラスミドは例えば次のようにして製造することができる。すなわち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡを合成し、ウシやヒトのＩＬ１２の２つのサブユニットをそれぞれコードする遺伝子配列を元にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことによってＣａＩＬ１２活性を示す２つのサブユニットをそれぞれコードする２つの遺伝子をクローニングすることができる。また、合成したｃＤＮＡ組換え体よりファージライブラリーを作製し、ＰＣＲによって得られた２つの遺伝子断片とプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、ＣａＩＬ１２Ｐ４０ｃＤＮＡとＣａＩＬ１２Ｐ３５ｃＤＮＡの全長をクローニングすることができる。
【００１４】
イヌの臟器や細胞、例えばマイトージェンなどで刺激されたイヌ単核球やリンパ球などよりＲＮＡを得る方法としては、通常の方法、例えば、ポリソームの分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられる。上記イヌ臟器やイヌ細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、グアニジン・チオシアネート処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法（文献３）バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤で処理したのちフェノール抽出を行う方法（文献４），グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行うことができる。
【００１５】
イヌ臟器やマイトージェンなどで刺激されたイヌ単核球やリンパ球より通常の方法、例えば、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート法、オリゴｄＴセルロースカラム法等によりｍＲＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例えば、Ｇｕｂｌｅｒらの方法（文献５），Ｈ．Ｏｋａｙａｍａらの方法（文献６）等によりｃＤＮＡを合成する。得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、基本的にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素などを用いるほか１部プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合成あるいはクローニング用キットを用いるのが便利である。
【００１６】
このｃＤＮＡを鋳型としてヒト、マウスおよびウシの塩基配列を基にしたプライマーを用いてＰＣＲを行うことによってＣａＩＬ１２活性を示すＰ４０サブユニットおよびＰ３５サブユニットをコードする遺伝子をクローニングすることができる。また、合成したｃＤＮＡをλファージベクターに連結した後、インビトロでλファージのコート蛋白質などと混合することによりパッケージングし、その生成されたファージ粒子を宿主となる大腸菌に感染させる。この際、λファージの感染した大腸菌は溶菌し、１個１個のクローンがプラークとして回収される。このプラークをニトロセルロースなどのフィルターに移し、放射標識したＰＣＲで得た遺伝子をプローブとしたハイブリダイゼーションにより、ＣａＩＬ１２Ｐ４０ｃＤＮＡおよびＣａＩＬ１２Ｐ３５ｃＤＮＡの全長をクローニングすることができる。
【００１７】
宿主としては原核生物又は真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ），バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等を用いることができる。真核生物としては酵母、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の真核性微生物、昆虫細胞、例えば、ヨガ細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、キャベツルーパー細胞（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）、カイコ細胞（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、動物細胞、例えばヒト細胞、サル細胞、マウス細胞等を使用することができる。本発明においてはさらに、生物体それ自体、例えば昆虫、例えばカイコ、キャベツルーパー等を用いることもできる。
【００１８】
発現ベクターとしては、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウイルス（バキュロ（昆虫）、ワクチニア（動物細胞））等が使用できる。発現ベクター中のプロモーターは宿主細菌に依存して選択され、例えば細菌用プロモーターとしてはｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えばａｄｈ１プロモーター、ｐｑｋプロモーター等が使用される。
また、昆虫用プロモーターとしてはバキュロウイルスポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター等、動物細胞としてはＳｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ４０のｅａｒｌｙまたはｌａｔｅプロモーター等があげられるが、これらに限定されない。 発現ベクターによる宿主の形質転換は、当業界においてよく知られている常法により行うことができ、これらの方法は例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社、に記載されている。形質転換体の培養も常法に従って行うことができる。
【００１９】
産生されたＣａＩＬ１２は，非還元下、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により決定すると、見かけの分子量が約７０〜８０ｋＤである。
【００２０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、７０〜８０ｋＤのバンドが、還元条件下では分子量約４０ｋＤと約３５ｋＤの２つのサブユニットを生じる。 ＣａＩＬ１２は、以下の実施例２で示すように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、イヌ白血球からのインターフェロンγ（以下ＩＦＮγと略記する）の誘導能およびフィトヘムアグルチニンン（以下ＰＨＡと略記する）で刺激されたイヌリンパ球の増殖促進効果により主に特性化される。その他、ＮＫ細胞や細胞障害性Ｔ細胞を活性化してそれらの標的細胞、例えば腫瘍由来のセルラインまたはウイルス感染した線維芽細胞を融解する活性を有する。
【００２１】
遺伝子組換え技術によって製造されたＣａＩＬ１２を単離、精製するための方法に特に限定はなく、通常の蛋白質の精製方法を用いることができる。例えばイヌＩＦＮγの誘導活性を指標としながら、イオン交換性担体、色素担体、ゲル濾過担体、シリカゲル担体、キレート担体等を用いたクロマトグラフィーや、限外濾過、ゲル濾過、透析、塩析等による脱塩、濃縮を組合せることによって精製し単離することができる。
【００２２】
本発明に係るイヌのアトピー性皮膚炎治療薬は、腫瘍をはじめ皮膚炎、アレルギー疾患、感染症など免疫能が低下した疾病、あるいは特に細胞性免疫反応に比べ、液性免疫反応が中心となったような片寄った免疫反応を示す疾病などさまざまなイヌの免疫疾病に対して、従来のこれらイヌの疾病に対する治療薬・予防薬や治療方法・治療方法に比べ、驚くべき顕著な治療効果および予防効果を示す。
【００２３】
本発明において、イヌの腫瘍としては、乳腺腫瘍、好酸球性肉芽腫、類表皮腫、皮膚腫瘍、脂肪腫、耳血腫、肺水腫、皮膚有茎軟腫または肛門腫瘍が挙げられ、イヌの皮膚炎としては、外耳道炎、皮膚炎、湿疹、皮膚真菌症、膿皮症、アレルギー性皮膚炎、じん麻疹、外傷性皮膚炎、または脱毛症が挙げられ、イヌの感染症としては、イヌパルボウイルス感染症、ジステンバー感染症が挙げられ、そしてアレルギー性疾病としては、イヌの花粉症が挙げられる。
【００２４】
また、このイヌのアトピー性皮膚炎治療薬は、ＣａＩＬ１２に加えて任意に他の成分を含むことができる。本薬に添加される成分は、主として、本薬が投与される方式に依存して決定される。本薬が個体として用いられる場合は、例えばラクトース等の充填剤、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン等の結合剤、着色剤、コーティング剤等を用いることができ、このような剤は経口投与に好適である。また、担体または賦活剤として例えば、白色ワセリン、セルロース誘導体、界面活性剤、ポリエチレングリコール、シリコーン、オリーブ油等を加えてクリーム、乳液、ローション等の形態として外用薬として患部に塗布して用いることもできる。また、本薬が液体として投与される場合は、通常行われている生理学的に許容される溶媒、および乳化剤、安定剤を含むことができる。溶媒としては水、ＰＢＳ、等張性生理食塩水等が挙げられ、乳化剤としては、ポリオキシエチレン系界面活性剤、脂肪酸系界面活性剤、シリコーン等が例示でき、安定剤としては、イヌ血清アルブミン、ゼラチン等のポリオール、またはソルビトール、トレハロースなどの糖類等が挙げられる。本発明のアトピー性皮膚炎治療薬の投与方法に特に限定はないが、注射投与することにより最も治療効果が期待できる。注射投与方法としては静脈内投与、筋肉
内投与、皮下投与、腹腔内投与、胸腔内投与いずれの方法にも限定されない。
【００２５】
投与量は、個体の大きさ、投与方法、疾病の種類、症状などに依存して決定されるであろうが、治療効果および予防効果を示すのに十分な量を投与すればよく、例えば、１用量、１日当たり、０．１ｐｇから１００μｇ／ｋｇのＣａＩＬ１２の投与で十分な効果が得られる。
【００２６】
また、養子免疫療法では１−１００ｍｌのイヌの血液から分離したリンパ球に対し、０．００１ｐｇから１μｇのＣａＩＬ１２で１２時間から６日間刺激した後に再び体内に戻すことによって十分な効果が得られる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２８】
［実施例１］
ＣａＩＬ１２Ｐ４０、Ｐ３５遺伝子のクローニング：
（１）イヌｃＤＮＡの調製
イヌ肝臓、ＬＰＳ（５０μｇ／ｍｌ）で４８時間刺激したイヌ末梢血単核球およびニワトリニューカッスル病ウイルスで７時間処理した（１０7 ｐｆｕ／ｍｌ）イヌ脾臓由来リンパ球よりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で５分間処理した後、１Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加えた。０．５Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥにて洗浄後、０．０１％ ＳＤＳを含む２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１８ｍｅｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベートしたのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．４），５００ｍＭ ＫＣｌ溶液を２μｌ，２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 を２μｌ，１０ｍＭ ｄＮＴＰを１μｌおよび０．１Ｍ ＤＴＴを２μｌそれぞれ加え、４２℃で５分間インキュベートしたのち、２００ユニットのＧｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５分間インキュベートして反応を停止し、氷上に５分間置いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。
【００２９】
（２）イヌｃＤＮＡファージライブラリーの調製
上記（１）で得られたポリ（Ａ）ＲＮＡ１μｇづつを用い、ファルマシア社のタイムセーバーｃＤＮＡ合成キットにて添付のマニュアルに従い、オリゴｄＴプライマーを用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成し、さらにＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプターを連結した。これを用いて、アマシャム社のｃＤＮＡラピットクローニングモジュール−λｇｔ１０にて添付のマニュアルに従い、組換えλｇｔ１０ベクターを作製し、さらにアマシャム社のインビトロパッケージングモジュールにて添付のマニュアルに従い、組換え体ファージ作製した。
【００３０】
（３）ＣａＩＬ１２Ｐ４０遺伝子のクローニング
ヒトＩＬ１２Ｐ４０のＮ末端およびＣ末端の塩基配列（文献１）をもとに、
５´ＡＴＧＴＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＣＡＴＣＴＣＴＴＧＧＴＴＴ３´（配列番号３）
と
５´ＣＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＡ３´（配列番号４）
の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）のイヌ肝臓およびＬＰＳ刺激イヌ末梢血より得られたｃＤＮＡを別々の０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに２μｌづつ取り、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２５ｍＭ ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ ゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位 ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約９９０ｂｐのＤＮＡ断片を常法（文献７）に従って調製した。
【００３１】
このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認し、Ｇｅｎｅｓｉｓ２０００ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（デュポン社）を用いて、ダイデオキシ法（文献９）でＣａＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユニットのうち一方のＰ４０サブユニットＤＮＡの塩基配列を決定した。この配列を配列番号１に示す。
【００３２】
また、この配列を含む、９９０ｂｐのＤＮＡ断片に宝酒造（株）のＲａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔを用いて３２Ｐを標識し、プローブを作製した。上記（２）で得られたイヌ肝臓ｃＤＮＡから作製した組換え体ファージライブラリーを大腸菌ＮＭ５１４上でプラークとして形成させ、アマシャム社のＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋に常法に従って転写した。
【００３３】
Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋は、５×ＳＳＰＥ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4，５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４），５×デンハルト溶液（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン）、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中、６５℃で２時間インキュベートし、ついで同じ溶液中で上述のようにして作製した標識プローブ１×１０6ｃｐｍ／ｍｌとハイブリダイズした。６５℃で１晩インキュベートした後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋を０．２×ＳＳＣ（３０ｍＭ ＮａＣｌ，３ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ中１５分、３回洗浄し、富士写真フィルム（株）の富士イメージングプレートに１２時間露出し、富士写真フィルム（株）のバイオイメージングアナライザーにて解析した。陽性のシグナルを有するプラークは常法に従い、再スクリーニングを行った。３回のスクリーニングの結果、陽性シグナルを有する１個の組換え体ファージを得た。この組換え体ファージより常法に従ってファージＤＮＡを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、１％アガロースゲル電気泳動にて得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調製し、宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２を用いて、宝酒造（株）のｐＵＣ１１８ＢＡＰ処理ＤＮＡ（ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ）と連結した。これを用いてプラスミドＤＮＡを常法により調製し、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。このうち、ＣａＩＬ１２Ｐ４０をコードする配列を配列番号１１に示す。
【００３４】
（４）ＣａＩＬ１２Ｐ３５遺伝子のクローニング
ヒトＩＬ１２Ｐ３５のＮ末端（文献１）およびウシＩＬ１２Ｐ３５のＣ末端の塩基配列をもとに、
５´ＡＧＣＡＴＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＣＧＣＴＡＣＣＣＴＧ３´（配列番号５）
と
５´ＣＴＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＧＡＴＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＴＣＧＡＴＧＧＴ３´（配列番号６）
の２種類のプライマ−をＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）の鶏ニューカッスル病ウイルスで処理したイヌ脾臓由来リンパ球より得られたｃＤＮＡを鋳型として上記（３）と同様にして約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を得、Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ＣａＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユニットのうち一方のＰ３５サブユニットＤＮＡの塩基配列を決定した。この配列を配列番号２に示す。
【００３５】
また、この配列を含む６７０ｂｐのＤＮＡ断片を用いて標識プローブを作製した。上記（２）で得られた鶏ニューカッスル病ウイルスで処理したイヌ脾臓由来リンパ球より得られたｃＤＮＡから作製した組換え体ファージライブラリーを上記（３）と同様にして標識プローブとハイブリダイズし、スクリーニングを行った。その結果得られた陽性シグナルを有する１個の組換え体ファージよりＤＮＡを抽出し、制限酵素ＮｏｔＩで切断した後、１％アガロースゲル電気泳動にて得られた約１．２ｋｂのＤＮＡ断片をＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩのＮｏｔＩサイトに常法に従い連結した。これを用いてプラスミドＤＮＡを調製し、蛍光ＤＮＡシーケンサーを用いて、得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。このうち、ＣａＩＬ１２Ｐ３５をコードする配列を配列番号１２に示す。
【００３６】
［実施例２］
ＣａＩＬ１２の生産：
（１）ＣａＩＬ１２発現ベクターの調製
発現ベクターｐＣＤＬ−ＳＲα２９６（文献９）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、バクテリア由来アルカリホスファターゼで末端を脱リン酸化した。これを１％アガロースゲル電気泳動にて約３．６ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調製した。一方、ＣａＩＬ１２Ｐ４０ ＤＮＡ断片は
５´ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＣＡＴＣＴＣＴＴＧＧ３´（配列番号７）
と
５´ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＡＧＴＣＧＣＴ３´（配列番号８）
の２種類のＥｃｏＲＩ切断部位を付加したプライマーを作製し、実施例１（２）で調製したＴ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入したＣａＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユニットのうち一方のＰ４０サブユニットＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡの変性条件を９４℃、１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃，３分、サイクル数３０でＰＣＲを行い、エタノール沈殿後、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、１％アガロースゲル電気泳動にて約９９０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。また、
５´ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＣＡＴＣＴＣＣＴＧＧ３´（配列番号１３）
と
５´ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＡＧＴＣＧＣＴ３´（配列番号１４）
の２種類のＥｃｏＲＩ切断部位を付加したプライマーを作製し、実施例１（２）で調製したｐＵＣ１１８に挿入したＣａＩＬ１２Ｐ４０ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行い、ＥｃｏＲＩで切断し、約９９０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。得られたそれぞれのＣａＩＬ１２Ｐ４０ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて上述のようにして調製したｐＣＤＬ−ＳＲα２９６に連結した。これを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製し、ＣａＩＬ１２Ｐ４０を発現するＦＯＣａＩＬ１２Ｐ４０およびＦＯＣａＩＬ１２Ｐ４０ＦＬを得た。
【００３７】
また、ｐＣＤＬ−ＳＲα２９６を制限酵素ＰｓｔＩで切断し脱リン酸化後、電気泳動にて約３．６ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。ＣａＩＬ１２Ｐ３５ ＤＮＡ断片は
５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＣ３´（配列番号９）
と
５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＧＡＴＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴ３´（配列番号１０）
の２種類のＰｓｔＩ切断部位を付加したプライマーを作製し、実施例１（３）で調製したＴ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入したＣａＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユニットのうち一方のＰ３５サブユニットＤＮＡを鋳型として、９４℃，１分、５５℃，２分、７２℃，３分、３０サイクルでＰＣＲを行い、エタノール沈殿後、制限酵素ＰｓｔＩで切断した。これを１％アガロースゲル電気泳動にて約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。また、
５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＧ３´（配列番号１５）
と
５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＡＡＣＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴ３´（配列番号１６）
の２種類のＰｓｔＩ切断部位を付加したプライマーを作製し、実施例１（２）で調製したｐＵＣ１１８に挿入したＣａＩＬ１２Ｐ３５ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行い、ＰｓｔＩで切断し、約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。得られたそれぞれのＣａＩＬ１２Ｐ３５ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて上述のように、ＰｓｔＩで切断し調製したｐＣＤＬ−ＳＲα２９６に連結、大腸菌形質転換、プラスミドＤＮＡ調製を行い、ＣａＩＬ１２Ｐ３５を発現するＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５およびＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５ＦＬを得た。
【００３８】
さらに、作製したこれら４つの発現プラスミド中のＣａＩＬ１２Ｐ４０ＤＮＡおよびＣａＩＬ１２Ｐ３５ＤＮＡの塩基配列を確認した。
【００３９】
（２）サルＣＯＳ細胞でのＣａＩＬ１２の生産
上記（１）で得られたそれぞれ５μｇのＦＯＣａＩＬ１２Ｐ４０および
ＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、４００μｇ／ｍｌのＤＥＡＥデキストラン（ファルマシア製）および１００μＭのクロロキン（シグマ社）を含む４ｍｌのＥＲＤＦ培地（極東製薬（株）社製）に加えておく。一方、直径１０ｃｍのディッシュを用いて１０％ウシ胎児血清（ギブコ社、以下ＦＢＳと略記する）で５０％コンフルエントになるまで増殖させたＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）をＰＢＳで一回洗浄した後、上記で得た４ｍｌのＤＮＡ混合液を加え、５％ＣＯ2 、３７℃の条件で培養した。４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、２０ｍｌのＥＲＤＦ培地にて５％ＣＯ2 ，３７℃の条件で４日間培養し、ＣａＩＬ１２が生産された培養上清を得た。
【００４０】
（３）ＣａＩＬ１２産生組換えバキュロウイルスの作製
バキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＡＢ３（ファーミンジェン社製）のプロモーター下流の制限酵素ＸｂａＩおよびＳｍａＩ切断部位にそれぞれＰ４０およびＰ３５サブユニットｃＤＮＡを常法に従って連結し、組換えトランスファーベクターを得た。さらにファーミンジェン社製のバキュロウイルストランスフェクションキットを用いてその添付マニュアルに従って、組換えバキュロウイルスを作製した。
（４）昆虫細胞でのＣａＩＬ１２の生産
上記（３）で得られた組換えバキュロウイルスを、ファーミンジェン社製のバキュロゴールドＰｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍで７５ｃｍ2のフラスコでコンフルエントまで平面培養したＳｆ２１細胞（Ｓｐｏｎｄｏｐｔｅｒａ Ｆｌｕｇｉｐｅｒｄａ由来、ファーミンジェン社より入手）に感染させ、４日間培養した後、ＣａＩＬ１２が生産された培養上清を得た。
【００４１】
（５）ＣａＩＬ１２の活性測定
上記（２）、（４）で生産されたＣａＩＬ１２の活性測定は以下のようにして行った。 イヌリンパ球からのイヌＩＦＮγ誘導活性検定のために、抗ウイルス活性およびイヌ細胞のクラスＩＩＭＨＣ発現増強活性を測定した。
【００４２】
イヌ脾臓よりリンパ球を分離し、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦに１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で懸濁し、このうち２．５ｍｌとヒトＩＬ２（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）２５０Ｕを６ｃｍディッシュに添加した。これに上記（２）で得られた培養上清２．５ｍｌとヒトＩＬ２（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）２５０Ｕを加え、５％ＣＯ2 、３７℃の条件で２日間培養し、ウイルスとしてＶｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ，感受性細胞としてＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）を用い、文献１０のＣＰＥ法に従ってこの培養液の抗ウイルス活性を測定した。その結果、２ｘ１０5 希釈単位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が確認された。また、上記（４）で得られた培養上清の抗ウイルス活性を同様にして測定した結果、１０7希釈単位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が検出された。一方、１０μｇのｐＣＤＬ−ＳＲα２９６を上記（２）と同様にＣＯＳ−１細胞に導入したコントロールの細胞培養液およびＳｆ２１細胞を３日間培養した培養液では抗ウイルス活性は全く認められなかった。
【００４３】
また、クラスＩＩＭＨＣを発現したイヌ乳腺腫瘍組織由来細胞株ＦＣＢＲ１を用いて、上記の各培養液中のクラスＩＩＭＨＣの発現増強活性を測定した。６ｃｍディッシュに、１０5個のＦＣＢＲ１を接着させ、これに上記の各培養液５ｍｌを添加し、５％ＣＯ2、３７℃の各条件で１晩培養した。培養後、トリプシンにて細胞を剥離し、１．５ｍｌのミクロ遠心チューブにて遠心した。これに、１０μｌのラット抗イヌクラスＩＩＭＨＣモノクローナル抗体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を添加し、さらに５０μｌの１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、５μｌのＦＩＴＣ標識ラビット抗ラットモノクローナル抗体（セロテック社製）および５０μｌの１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン（株）のＦＡＣＳｃａｎにて解析した。その結果、ＣＯＳ１およびＳｆ２１で産生させたＣａＩＬ１２は、ＦＣＢＲ１上のクラスＩＩＭＨＣの発現量をそれぞれ約２０％、６０％上昇させた。これらのことから、ＣａＩＬ１２はイヌリンパ球に作用して、イヌＩＦＮγを誘導する活性を有することが判明した。
【００４４】
また、芽球化したイヌリンパ球の増殖促進活性を測定した。イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦに１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で懸濁し、このうち５ｍｌを６ｃｍディッシュに添加した。これにＰＨＡを５μｇ／ｍｌの濃度で添加し、５％ＣＯ2 、３７℃の条件で３日間培養してリンパ球を芽球化させた。この芽球化リンパ球を１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦに１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で懸濁し、９６穴マイクロプレート１穴あたり、５０μｌを添加した。これに上記（２）で得られた培養上清を１穴あたり５０μｌ加えた。また、コントロールとして１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦのみを１穴あたり５０μｌ加えた。これらをさらに５％ＣＯ2 、３７℃の条件で３日間培養後、文献１１のＭＴＴアッセイ法により、ＣａＩＬ１２の芽球化リンパ球の増殖促進活性を測定した。すなわち、５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（シグマ社製）溶液を１穴あたり１０μｌづつ添加し、さらに６時間培養した。１５０μｌの０．０１Ｎ塩酸イソプロパノール溶液を加えた後、超音波にて細胞を破砕し、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製Ｍｏｄｅｌ１３５５０）にて波長５９５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、コントロールの吸光度が平均０．６９であったのに対し、ＣＯＳ−１で産生したＣａＩＬ１２は平均１．５２であり、約２倍以上の芽球化リンパ球の増殖促進活性が認められた。
【００４５】
さらに、ＣａＩＬ１２のイヌ腫瘍に対する抗腫瘍作用を検討した。イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで５x１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に懸濁し、このうち５ｍｌを６ｃｍディッシュに添加した。これにベーリンガーマンハイム社（株）のリコンビナントヒトＩＬ２を５００Ｕ添加し、５％ＣＯ2、３７℃の条件で３日間培養した。一方、イヌ腫瘍細胞ＦＣＢＲ１およびＡ７２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５４２）を１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦでそれぞれ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に懸濁し、９６穴プレート１穴あたり５０μｌづつ添加し、プレートに接着させた。これにヒトＩＬ２で刺激したイヌリンパ球５０μｌを加え、さらにＣａＩＬ１２を発現している上記（２）で得られた培養上清１００μｌもしくはコントロールとして１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ１００μｌを添加し、５％ＣＯ2、３７℃の条件で２日間培養した。培養後、上清を完全に取り除き、ＭＴＴアッセイを行った。％細胞障害性を次の式にて算出した。
【００４６】
％細胞障害性＝（１ーＯＤ２／ＯＤ１）ｘ１００
ここで、ＯＤ１＝培地のみで培養したイヌ腫瘍細胞の波長５９５ｎｍの吸光度
ＯＤ２＝イヌリンパ球と共に培養したイヌ腫瘍細胞の波長５９５ｎｍの吸光度を表す。
【００４７】
その結果、ＦＣＢＲ１ではコントロールが３４％であったのに対し、ＣＯＳ−１で生産したＣａＩＬ１２は約７５％の細胞障害性を示した。また、Ａ７２ではコントロールが２２％であったのに対し、ＣａＩＬ１２は約８３％の細胞障害性を示した。ＣａＩＬ１２はイヌリンパ球を活性化して、イヌ腫瘍細胞に対して抗腫瘍作用を発揮することが判明した。
【００４８】
［実施例３］
ＣａＩＬ１２の精製：
実施例２（４）で得られた細胞培養上清２５０ｍｌを、スルホプロピル担体を充填したカラムにアプライした後、十分量の２０ｍＭリン酸緩衝液でカラムを洗浄し、０．５〜１ＭのＮａＣｌで溶出して得られた吸着画分をさらにブルーセファロース担体を充填したカラムにアプライし、同様にして洗浄後、１．１〜２ＭのＮａＣｌで溶出した画分を得た。得られた画分を透析によって脱塩して、精製したＣａＩＬ１２画分５ｍｌを得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によると、この画分中のＣａＩＬ１２の純度は９５％以上であった。
【００４９】
［実施例４］
ＣａＩＬ１２製剤の製造：
実施例３で得られた精製ＣａＩＬ１２溶液に、注射用生理食塩水、注射用低分子ゼラチン（新田ゼラチン（株））、ソルビトールを加えて、ゼラチンの終濃度０．５％、ソルビトールの終濃度３０％に調製した。さらに、ポジダイン（ポール（株））で処理してパイロジェンを除去した後、２５０℃で２時間乾熱滅菌したガラスバイアルに１ｍｌづつ分注した。その後、無菌的に凍結乾燥することによって、１バイアル中に１ｐｇから５μｇのＣａＩＬ１２を含むＣａＩＬ１２製剤を得た。このＣａＩＬ１２製剤は、室温条件下で安定であり、また、蒸留水または生理食塩水によって良好に溶解した。
【００５０】
［実施例５］
細胞レベルでのＣａＩＬ１２製剤の薬効評価：
（１）腫瘍
ＣａＩＬ１２製剤の抗腫瘍効果を見るために、担ガンマウスを作製し、ＣａＩＬ１２製剤で刺激されたイヌリンパ球を移入して腫瘍の縮小効果を検討した。６週齢のメスヌードマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕ）１０匹を日本クレア（株）より購入した。それぞれの背部皮下にイヌ乳腺腫瘍細胞株ＦＣＢＲ１を１０8ｃｅｌｌｓ移植し、約１ヶ月後、平均３３ｍｍｘ２５ｍｍの腫瘤を有する担ガンマウスを作製した。一方、ＦＣＢＲ１を樹立する際に、Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅらの方法（文献１４）により分離した腫瘍内浸潤リンパ球（以下ＴＩＬと略記する）１０8ｃｅｌｌｓを２０ｍｌの１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで懸濁し、実施例４で調製したＣａＩＬ１２製剤１０ｎｇを添加して５％ＣＯ2、３７℃の条件で２日間培養し、ＣａＩＬ１２製剤で刺激されたＴＩＬを得た。またコントロールとしてＣａＩＬ１２製剤を添加せずに同様の条件で培養した１０8ｃｅｌｌｓのＴＩＬを準備した。これら２種類のＴＩＬを担ガンヌードマウスの尾静脈より１匹あたり１０7ｃｅｌｌｓ、５匹づつ移入した。移入７日後、ノギスにて腫瘍重量を測定し、ＴＩＬ移入前との腫瘍重量の変化を調べた。なお、腫瘍重量は次の式にて算出した。
【００５１】
腫瘍重量＝（長径ｘ短径2／２）
その結果、ＣａＩＬ１２製剤で刺激されたＴＩＬを移入した担ガンヌードマウスは５匹のうち３匹で完全に腫瘍が退縮し、２匹でＴＩＬ移入前の腫瘍重量を１とした相対腫瘍重量で０．２以下であった。一方、コントロールのＴＩＬを移入した担ガンヌードマウスは５匹とも腫瘍が増大し、相対腫瘍重量ですべて１．２５以上であった。以上のことから担ガンマウスを用いた系において、ＣａＩＬ１２製剤はＴＩＬを活性化して腫瘍縮小効果を発揮することが判明した。
【００５２】
（２）アレルギー
ＣａＩＬ１２製剤の抗アレルギー効果を見るために、アレルギーの患犬由来リンパ球をＣａＩＬ１２製剤で刺激し、ＩｇＥなどアレルギーの原因となる因子の発現調節の有無について検討した。アトピー性皮膚炎と診断された患犬５頭からそれぞれ１０ｍｌの血液を採取した。これらより直ちにリンパ球を分離し、抗ヒトＣＤ３ポリクローナル抗体（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）で固相化した１０ｃｍディッシュにて１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦでＣａＩＬ１２製剤をそれぞれ１０ｎｇづつ加えて３日間培養した。なおコントロールとしてＣａＩＬ１２製剤を添加せずに同様の条件で培養したイヌリンパ球を準備した。培養後、各ディッシュ中の一部のリンパ球を回収し、実施例１に記載の方法によりｃＤＮＡを合成し、
イヌＩｇＥおよびイヌＩｇＥレセプター遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、それら遺伝子の発現を調べた。その結果、ＣａＩＬ１２製剤を添加して培養したイヌリンパ球のそれら遺伝子の発現はＣａＩＬ１２製剤を添加しなかったものと比較していずれも抑制されていた。このことから、ＣａＩＬ１２製剤はイヌリンパ球に作用してアレルギーの原因因子の１つであるＩｇＥおよびＩｇＥレセプターの発現を抑制することが判明した。また、抗ヒトＣＤ４ポリクローナル抗体（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）を用いたパンニング法（文献１５）により各ディッシュ中の残りのリンパ球から主にヘルパーＴ細胞集団からなるＣＤ４陽性細胞を得た。これを用いてｃＤＮＡを合成し、ＣａＩＬ５およびＣａＩＦＮγ遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、それら遺伝子の発現を調べた。その結果、ＣａＩＬ５遺伝子の発現に関してはＣａＩＬ１２製剤の添加によりいずれも発現が抑制されていた。一方、ＣａＩＦＮγ遺伝子の発現に関してはＣａＩＬ１２製剤の添加によりいずれも発現が増強されていた。ＩＬ５はアレルギー反応などの液性免疫反応を引き起こす２型ヘルパーＴ細胞から産生され、一方ＩＦＮγは細胞性免疫を引き起こし液性免疫を抑制する１型ヘルパーＴ細胞から産生される。このことから、ＣａＩＬ１２製剤はイヌリンパ球中の２型ヘルパーＴ細胞を抑制し、１型ヘルパーＴ細胞を活性化する作用を有することが示唆された。以上のことから、ＣａＩＬ１２製剤はイヌのアレルギー性疾患の治療に有望であることが判明した。
【００５３】
［実施例６］
ＣａＩＬ１２製剤のイヌに対する毒性試験：
ＣａＩＬ１２製剤の毒性を試験した。試験動物としてビーグル犬３頭を用いた。試験は以下の要領にて実施した。
【００５４】
(1) 投与方法
２日おきに計５回投与を行った。投与量は順次増やしていった（初回：１ｎｇ／ｋｇ体重、５ｎｇ／ｋｇ体重、２５ｎｇ／ｋｇ体重、２５０ｎｇ／ｋｇ体重、５回目：１μｇ／ｋｇ体重）。また投与ルートは静脈投与により行った。
【００５５】
(2) 観察検査期間、観察検査項目、観察点
観察期間は投与開始前１週から投与開始後３週までとした。観察検査項目は臨床症状（呼吸様式、元気、食欲、活動性、可視粘膜、流延、嘔吐、排便行動、傾眠）
、体温、心拍数、体重、血液学的検査（血球系（白血球数、ヘマトクリット、血小板数、血液像）、電解質（Ｎａ，Ｋ，Ｃｌ）、生化学的検査（ＢＵＮ，Ｃｒｅａ．，ＧＯＴ，ＧＰＴ，ＣＰＫ，Ｇｌｕｃｏｓｅ，ＴＰ，Ａｌｂ，Ｇｌｏｂ，Ａ／Ｇ）、尿所見、循環器および自律神経系所見とした。観察点は体重に関しては投与日から７日目毎に１回測定し、その他の項目に関しては、投与開始１週前、投与日の投与直前、投与１０分後、３０分後、１時間後、１．５時間後、２時間後、４時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、投与開始２週後および投与開始３週後に測定した。
【００５６】
以上の要領にて試験を行った結果、ＣａＩＬ１２製剤の投与によって問題となる変化は認められなかったことから、ＣａＩＬ１２製剤は少なくとも１μｇ／ｋｇ体重の投与量まではイヌに対して毒性がないことが明らかになった。
【００５７】
［実施例７］
ＣａＩＬ１２製剤によるイヌ疾病の治療および予防：
表皮に腫瘤を持つ患犬、計１２頭に対してＣａＩＬ１２製剤を局所注射および静脈内注射投与した。どの患犬にもさまざまな大きさの腫瘤が複数個存在していた。１２頭中８頭に対しては、腫瘤１個につき、１０ｎｇ−１μｇのＣａＩＬ１２を３ー４日間隔で３ー１０回、腫瘍局所に直接、注射投与した。その結果、ＣａＩＬ１２製剤を投与した腫瘤の９割が完全に消失し、残りの腫瘤も全て半分以下に縮小した。４頭は大きさが１００ｃｍ3以上の腫瘤を持っており、全てすでに肺、肝臓、腎臓などの内臓に転移していた。これら３頭については外科的手術により表皮の腫瘤を切除した直後にＣａＩＬ１２製剤を静脈内に１０ｎｇ／ｋｇ投与し、以後５００ｎｇ／ｋｇの投与量で連日７日間にわたって投与を続けた。その結果、内臓に転移していた腫瘍は全て消失し、以後６ヵ月間観察したが、再発は全くみられなかった。
【００５８】
また、アトピー性皮膚炎と診断された患犬７頭に対してＣａＩＬ１２製剤を静脈内注射投与した。これら患犬は皮膚に紅斑、湿疹および脱毛などの臨床症状が観察され、また血液中には多量のＩｇＥが検出され、その白血球画分にはＩＬ４，ＩＬ５，ＩＬ１０，ＩＬ１３の各ｍＲＮＡが高発現していた。ＣａＩＬ１２製剤を１回当り０．１ー１００ｎｇ／ｋｇの投与量で３日間隔で３ー５回、静脈内に投与した結果、１回の投与で臨床症状が速やかに改善され、３ー５回で完治にいたった。
【００５９】
さらに、花粉症と診断された患犬３頭に対してＣａＩＬ１２製剤を静脈内注射投与した。投与量は０．１−１０ｐｇ／ｋｇで１回の投与でクシャミ、鼻水等の臨床症状が速やかに改善された。
【００６０】
［実施例８］
ＣａＩＬ１２製剤を用いた養子免疫療法によるイヌ疾病の治療：
表皮に腫瘤を持つ患犬５頭およびアトピー性皮膚炎と診断された患犬３頭それぞれから２５ｍｌの血液を採取した。これらより直ちにリンパ球を分離し、抗ヒトＣＤ３ポリクローナル抗体（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）で固相化した１０ｃｍディッシュにて１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦでヒトＩＬ２（Ｚｅｎｚｙｍｅ社製）５０ＵとＣａＩＬ１２製剤を１００ｎｇ加えて４日間培養した。培養後、リンパ球を回収し、それぞれのイヌに静脈内注射した。その結果、アトピー性皮膚炎の患犬は３頭ともすべて完治し、また、腫瘍の患犬もすべてに腫瘤の縮小傾向が認められ、同様の操作を１週間おきに３〜５回繰り返したところ、すべての腫瘍が完全に退縮した。
【００６１】
【発明の効果】
本発明によれば、イヌの腫瘍、皮膚病、感染症、アレルギー疾病の優れた治療薬・予防薬および優れた治療方法・予防方法を提供できる。
【００６２】
参考文献：
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１５．Ｓｅｅｄら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，３３６５−３３６９（１９８６）．
【配列表】
【００６３】
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【００６７】
【００６８】
【００６９】
【００７０】
【００７１】
【００７２】
【００７３】
【００７４】
【００７５】
【００７６】
【００７７】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛋白質の一次構造がイヌの遺伝情報由来であるイヌインターロイキン１２（以下、ＣａＩＬ１２と略記する）からなるイヌのアトピー性皮膚炎の治療薬およびその薬を用いたイヌのアトピー性皮膚炎の治療方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インターロイキン１２は、分子量約４０ｋＤ蛋白質（以下Ｐ４０と略記する）と約３５ｋＤ蛋白質（以下Ｐ３５と略記する）とのヘテロダイマーよりなり、ナチュラルキラー 細胞および１型ヘルパーＴ細胞を活性化するなどの生理活性作用を有するサイトカインで（文献１、２）、ＩＬ１２と略記される。ＩＬ１２は、特に細胞性免疫の強力な活性化作用により、腫瘍、感染症、アレルギーなどのマウスモデル実験において、驚異的な治癒効果が多くの文献において報告されており（文献３、４、５）、腫瘍および感染症の治療薬として臨床試験も始まっている。
【０００３】
ヒトと同様、イヌにも乳腺腫瘍など多数の腫瘍、アトピー性皮膚炎など多くの皮膚炎、パルボウイルス感染症、ジステンバー感染症など多数の感染症などが知られており、これらはイヌの疾病統計で常に上位にランクされている。しかしながら、これらイヌの疾病に対する有効な治療薬および予防薬は現在のところほとんどない。例えば腫瘍では、腫溜が大きくなってから来院するイヌやがほとんどで、手術により切除してもすでに転移していて、手術後まもなく死亡することが多い。また、イヌに多い皮膚疾病では、ステロイド剤などを用いて長期にわたり繰り返し治療されているにもかかわらず、完治しない例が多く、即効性でかつ持続性のある治療薬が望まれている。そのような現状の中で、イヌのＩＬ１２が入手可能となれば、有効な治療薬および予防薬がないこれらイヌの疾病に対する用途が開かれると期待される。ネコに関しても同様なことが言える。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、かかる状況に鑑みＣａＩＬ１２ｃＤＮＡをクローニングし、それを用いて大量生産すること、およびＣａＩＬ１２からなる製剤を免疫疾患のイヌのアトピー性皮膚炎治療薬として提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的の達成のため、創意工夫を成し、イヌのｃＤＮＡからＣａＩＬ１２のＰ４０とＰ３５をコードするそれぞれの遺伝子をクローニングすることに成功し、更にはこれらを発現ベクターに連結した２つのプラスミドを用いてＣａＩＬ１２を生産する細胞の作製、およびこれら遺伝子を同時に含む組換えバキュロウイルスの作製に成功し、以って簡単に大量にＣａＩＬ１２を製造する方法を確立し、さらにはＣａＩＬ１２からなる製剤を従来の治療法では治療が困難である疾病のイヌに投与すること、または疾病のイヌ末梢血からリンパ球を分離してｉｎ ｖｉｔｒｏでＣａＩＬ１２からなる製剤で刺激後、再び同一イヌに戻すことによってその病状が驚くほど顕著に改善されることを見出し、かくして本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明の骨子は、下記の各発明から成る。
【０００７】
（１）配列番号：１または配列番号：１１と同じアミノ酸配列と配列番号：２または配列番号：１２と同じアミノ酸配列がヘテロダイマーを形成してできるイヌインターロイキン１２を含んでなるイヌのアトピー性皮膚炎治療薬。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のＣａＩＬ１２蛋白質の２つのサブユニットをそれぞれコードするＤＮＡを組込んだプラスミドは例えば次のようにして製造することができる。すなわち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡを合成し、ウシやヒトのＩＬ１２の２つのサブユニットをそれぞれコードする遺伝子配列を元にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことによってＣａＩＬ１２活性を示す２つのサブユニットをそれぞれコードする２つの遺伝子をクローニングすることができる。また、合成したｃＤＮＡ組換え体よりファージライブラリーを作製し、ＰＣＲによって得られた２つの遺伝子断片とプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、ＣａＩＬ１２Ｐ４０ｃＤＮＡとＣａＩＬ１２Ｐ３５ｃＤＮＡの全長をクローニングすることができる。
【００１４】
イヌの臟器や細胞、例えばマイトージェンなどで刺激されたイヌ単核球やリンパ球などよりＲＮＡを得る方法としては、通常の方法、例えば、ポリソームの分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられる。上記イヌ臟器やイヌ細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、グアニジン・チオシアネート処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法（文献３）バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤で処理したのちフェノール抽出を行う方法（文献４），グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行うことができる。
【００１５】
イヌ臟器やマイトージェンなどで刺激されたイヌ単核球やリンパ球より通常の方法、例えば、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート法、オリゴｄＴセルロースカラム法等によりｍＲＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例えば、Ｇｕｂｌｅｒらの方法（文献５），Ｈ．Ｏｋａｙａｍａらの方法（文献６）等によりｃＤＮＡを合成する。得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、基本的にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素などを用いるほか１部プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合成あるいはクローニング用キットを用いるのが便利である。
【００１６】
このｃＤＮＡを鋳型としてヒト、マウスおよびウシの塩基配列を基にしたプライマーを用いてＰＣＲを行うことによってＣａＩＬ１２活性を示すＰ４０サブユニットおよびＰ３５サブユニットをコードする遺伝子をクローニングすることができる。また、合成したｃＤＮＡをλファージベクターに連結した後、インビトロでλファージのコート蛋白質などと混合することによりパッケージングし、その生成されたファージ粒子を宿主となる大腸菌に感染させる。この際、λファージの感染した大腸菌は溶菌し、１個１個のクローンがプラークとして回収される。このプラークをニトロセルロースなどのフィルターに移し、放射標識したＰＣＲで得た遺伝子をプローブとしたハイブリダイゼーションにより、ＣａＩＬ１２Ｐ４０ｃＤＮＡおよびＣａＩＬ１２Ｐ３５ｃＤＮＡの全長をクローニングすることができる。
【００１７】
宿主としては原核生物又は真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ），バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等を用いることができる。真核生物としては酵母、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の真核性微生物、昆虫細胞、例えば、ヨガ細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、キャベツルーパー細胞（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）、カイコ細胞（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、動物細胞、例えばヒト細胞、サル細胞、マウス細胞等を使用することができる。本発明においてはさらに、生物体それ自体、例えば昆虫、例えばカイコ、キャベツルーパー等を用いることもできる。
【００１８】
発現ベクターとしては、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウイルス（バキュロ（昆虫）、ワクチニア（動物細胞））等が使用できる。発現ベクター中のプロモーターは宿主細菌に依存して選択され、例えば細菌用プロモーターとしてはｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えばａｄｈ１プロモーター、ｐｑｋプロモーター等が使用される。
また、昆虫用プロモーターとしてはバキュロウイルスポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター等、動物細胞としてはＳｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ４０のｅａｒｌｙまたはｌａｔｅプロモーター等があげられるが、これらに限定されない。 発現ベクターによる宿主の形質転換は、当業界においてよく知られている常法により行うことができ、これらの方法は例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社、に記載されている。形質転換体の培養も常法に従って行うことができる。
【００１９】
産生されたＣａＩＬ１２は，非還元下、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により決定すると、見かけの分子量が約７０〜８０ｋＤである。
【００２０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、７０〜８０ｋＤのバンドが、還元条件下では分子量約４０ｋＤと約３５ｋＤの２つのサブユニットを生じる。 ＣａＩＬ１２は、以下の実施例２で示すように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、イヌ白血球からのインターフェロンγ（以下ＩＦＮγと略記する）の誘導能およびフィトヘムアグルチニンン（以下ＰＨＡと略記する）で刺激されたイヌリンパ球の増殖促進効果により主に特性化される。その他、ＮＫ細胞や細胞障害性Ｔ細胞を活性化してそれらの標的細胞、例えば腫瘍由来のセルラインまたはウイルス感染した線維芽細胞を融解する活性を有する。
【００２１】
遺伝子組換え技術によって製造されたＣａＩＬ１２を単離、精製するための方法に特に限定はなく、通常の蛋白質の精製方法を用いることができる。例えばイヌＩＦＮγの誘導活性を指標としながら、イオン交換性担体、色素担体、ゲル濾過担体、シリカゲル担体、キレート担体等を用いたクロマトグラフィーや、限外濾過、ゲル濾過、透析、塩析等による脱塩、濃縮を組合せることによって精製し単離することができる。
【００２２】
本発明に係るイヌのアトピー性皮膚炎治療薬は、腫瘍をはじめ皮膚炎、アレルギー疾患、感染症など免疫能が低下した疾病、あるいは特に細胞性免疫反応に比べ、液性免疫反応が中心となったような片寄った免疫反応を示す疾病などさまざまなイヌの免疫疾病に対して、従来のこれらイヌの疾病に対する治療薬・予防薬や治療方法・治療方法に比べ、驚くべき顕著な治療効果および予防効果を示す。
【００２３】
本発明において、イヌの腫瘍としては、乳腺腫瘍、好酸球性肉芽腫、類表皮腫、皮膚腫瘍、脂肪腫、耳血腫、肺水腫、皮膚有茎軟腫または肛門腫瘍が挙げられ、イヌの皮膚炎としては、外耳道炎、皮膚炎、湿疹、皮膚真菌症、膿皮症、アレルギー性皮膚炎、じん麻疹、外傷性皮膚炎、または脱毛症が挙げられ、イヌの感染症としては、イヌパルボウイルス感染症、ジステンバー感染症が挙げられ、そしてアレルギー性疾病としては、イヌの花粉症が挙げられる。
【００２４】
また、このイヌのアトピー性皮膚炎治療薬は、ＣａＩＬ１２に加えて任意に他の成分を含むことができる。本薬に添加される成分は、主として、本薬が投与される方式に依存して決定される。本薬が個体として用いられる場合は、例えばラクトース等の充填剤、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン等の結合剤、着色剤、コーティング剤等を用いることができ、このような剤は経口投与に好適である。また、担体または賦活剤として例えば、白色ワセリン、セルロース誘導体、界面活性剤、ポリエチレングリコール、シリコーン、オリーブ油等を加えてクリーム、乳液、ローション等の形態として外用薬として患部に塗布して用いることもできる。また、本薬が液体として投与される場合は、通常行われている生理学的に許容される溶媒、および乳化剤、安定剤を含むことができる。溶媒としては水、ＰＢＳ、等張性生理食塩水等が挙げられ、乳化剤としては、ポリオキシエチレン系界面活性剤、脂肪酸系界面活性剤、シリコーン等が例示でき、安定剤としては、イヌ血清アルブミン、ゼラチン等のポリオール、またはソルビトール、トレハロースなどの糖類等が挙げられる。本発明のアトピー性皮膚炎治療薬の投与方法に特に限定はないが、注射投与することにより最も治療効果が期待できる。注射投与方法としては静脈内投与、筋肉
内投与、皮下投与、腹腔内投与、胸腔内投与いずれの方法にも限定されない。
【００２５】
投与量は、個体の大きさ、投与方法、疾病の種類、症状などに依存して決定されるであろうが、治療効果および予防効果を示すのに十分な量を投与すればよく、例えば、１用量、１日当たり、０．１ｐｇから１００μｇ／ｋｇのＣａＩＬ１２の投与で十分な効果が得られる。
【００２６】
また、養子免疫療法では１−１００ｍｌのイヌの血液から分離したリンパ球に対し、０．００１ｐｇから１μｇのＣａＩＬ１２で１２時間から６日間刺激した後に再び体内に戻すことによって十分な効果が得られる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２８】
［実施例１］
ＣａＩＬ１２Ｐ４０、Ｐ３５遺伝子のクローニング：
（１）イヌｃＤＮＡの調製
イヌ肝臓、ＬＰＳ（５０μｇ／ｍｌ）で４８時間刺激したイヌ末梢血単核球およびニワトリニューカッスル病ウイルスで７時間処理した（１０7 ｐｆｕ／ｍｌ）イヌ脾臓由来リンパ球よりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で５分間処理した後、１Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加えた。０．５Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥにて洗浄後、０．０１％ ＳＤＳを含む２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１８ｍｅｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベートしたのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．４），５００ｍＭ ＫＣｌ溶液を２μｌ，２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 を２μｌ，１０ｍＭ ｄＮＴＰを１μｌおよび０．１Ｍ ＤＴＴを２μｌそれぞれ加え、４２℃で５分間インキュベートしたのち、２００ユニットのＧｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５分間インキュベートして反応を停止し、氷上に５分間置いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。
【００２９】
（２）イヌｃＤＮＡファージライブラリーの調製
上記（１）で得られたポリ（Ａ）ＲＮＡ１μｇづつを用い、ファルマシア社のタイムセーバーｃＤＮＡ合成キットにて添付のマニュアルに従い、オリゴｄＴプライマーを用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成し、さらにＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプターを連結した。これを用いて、アマシャム社のｃＤＮＡラピットクローニングモジュール−λｇｔ１０にて添付のマニュアルに従い、組換えλｇｔ１０ベクターを作製し、さらにアマシャム社のインビトロパッケージングモジュールにて添付のマニュアルに従い、組換え体ファージ作製した。
【００３０】
（３）ＣａＩＬ１２Ｐ４０遺伝子のクローニング
ヒトＩＬ１２Ｐ４０のＮ末端およびＣ末端の塩基配列（文献１）をもとに、
５´ＡＴＧＴＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＣＡＴＣＴＣＴＴＧＧＴＴＴ３´（配列番号３）
と
５´ＣＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＡ３´（配列番号４）
の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）のイヌ肝臓およびＬＰＳ刺激イヌ末梢血より得られたｃＤＮＡを別々の０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに２μｌづつ取り、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２５ｍＭ ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ ゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位 ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約９９０ｂｐのＤＮＡ断片を常法（文献７）に従って調製した。
【００３１】
このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認し、Ｇｅｎｅｓｉｓ２０００ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（デュポン社）を用いて、ダイデオキシ法（文献９）でＣａＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユニットのうち一方のＰ４０サブユニットＤＮＡの塩基配列を決定した。この配列を配列番号１に示す。
【００３２】
また、この配列を含む、９９０ｂｐのＤＮＡ断片に宝酒造（株）のＲａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔを用いて３２Ｐを標識し、プローブを作製した。上記（２）で得られたイヌ肝臓ｃＤＮＡから作製した組換え体ファージライブラリーを大腸菌ＮＭ５１４上でプラークとして形成させ、アマシャム社のＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋に常法に従って転写した。
【００３３】
Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋は、５×ＳＳＰＥ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4，５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４），５×デンハルト溶液（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン）、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中、６５℃で２時間インキュベートし、ついで同じ溶液中で上述のようにして作製した標識プローブ１×１０6ｃｐｍ／ｍｌとハイブリダイズした。６５℃で１晩インキュベートした後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋を０．２×ＳＳＣ（３０ｍＭ ＮａＣｌ，３ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ中１５分、３回洗浄し、富士写真フィルム（株）の富士イメージングプレートに１２時間露出し、富士写真フィルム（株）のバイオイメージングアナライザーにて解析した。陽性のシグナルを有するプラークは常法に従い、再スクリーニングを行った。３回のスクリーニングの結果、陽性シグナルを有する１個の組換え体ファージを得た。この組換え体ファージより常法に従ってファージＤＮＡを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、１％アガロースゲル電気泳動にて得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調製し、宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２を用いて、宝酒造（株）のｐＵＣ１１８ＢＡＰ処理ＤＮＡ（ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ）と連結した。これを用いてプラスミドＤＮＡを常法により調製し、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。このうち、ＣａＩＬ１２Ｐ４０をコードする配列を配列番号１１に示す。
【００３４】
（４）ＣａＩＬ１２Ｐ３５遺伝子のクローニング
ヒトＩＬ１２Ｐ３５のＮ末端（文献１）およびウシＩＬ１２Ｐ３５のＣ末端の塩基配列をもとに、
５´ＡＧＣＡＴＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＣＧＣＴＡＣＣＣＴＧ３´（配列番号５）
と
５´ＣＴＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＧＡＴＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＴＣＧＡＴＧＧＴ３´（配列番号６）
の２種類のプライマ−をＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）の鶏ニューカッスル病ウイルスで処理したイヌ脾臓由来リンパ球より得られたｃＤＮＡを鋳型として上記（３）と同様にして約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を得、Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ＣａＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユニットのうち一方のＰ３５サブユニットＤＮＡの塩基配列を決定した。この配列を配列番号２に示す。
【００３５】
また、この配列を含む６７０ｂｐのＤＮＡ断片を用いて標識プローブを作製した。上記（２）で得られた鶏ニューカッスル病ウイルスで処理したイヌ脾臓由来リンパ球より得られたｃＤＮＡから作製した組換え体ファージライブラリーを上記（３）と同様にして標識プローブとハイブリダイズし、スクリーニングを行った。その結果得られた陽性シグナルを有する１個の組換え体ファージよりＤＮＡを抽出し、制限酵素ＮｏｔＩで切断した後、１％アガロースゲル電気泳動にて得られた約１．２ｋｂのＤＮＡ断片をＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩのＮｏｔＩサイトに常法に従い連結した。これを用いてプラスミドＤＮＡを調製し、蛍光ＤＮＡシーケンサーを用いて、得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。このうち、ＣａＩＬ１２Ｐ３５をコードする配列を配列番号１２に示す。
【００３６】
［実施例２］
ＣａＩＬ１２の生産：
（１）ＣａＩＬ１２発現ベクターの調製
発現ベクターｐＣＤＬ−ＳＲα２９６（文献９）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、バクテリア由来アルカリホスファターゼで末端を脱リン酸化した。これを１％アガロースゲル電気泳動にて約３．６ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調製した。一方、ＣａＩＬ１２Ｐ４０ ＤＮＡ断片は
５´ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＣＡＴＣＴＣＴＴＧＧ３´（配列番号７）
と
５´ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＡＧＴＣＧＣＴ３´（配列番号８）
の２種類のＥｃｏＲＩ切断部位を付加したプライマーを作製し、実施例１（２）で調製したＴ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入したＣａＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユニットのうち一方のＰ４０サブユニットＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡの変性条件を９４℃、１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃，３分、サイクル数３０でＰＣＲを行い、エタノール沈殿後、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、１％アガロースゲル電気泳動にて約９９０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。また、
５´ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＣＡＴＣＴＣＣＴＧＧ３´（配列番号１３）
と
５´ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＡＧＴＣＧＣＴ３´（配列番号１４）
の２種類のＥｃｏＲＩ切断部位を付加したプライマーを作製し、実施例１（２）で調製したｐＵＣ１１８に挿入したＣａＩＬ１２Ｐ４０ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行い、ＥｃｏＲＩで切断し、約９９０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。得られたそれぞれのＣａＩＬ１２Ｐ４０ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて上述のようにして調製したｐＣＤＬ−ＳＲα２９６に連結した。これを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製し、ＣａＩＬ１２Ｐ４０を発現するＦＯＣａＩＬ１２Ｐ４０およびＦＯＣａＩＬ１２Ｐ４０ＦＬを得た。
【００３７】
また、ｐＣＤＬ−ＳＲα２９６を制限酵素ＰｓｔＩで切断し脱リン酸化後、電気泳動にて約３．６ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。ＣａＩＬ１２Ｐ３５ ＤＮＡ断片は
５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＣ３´（配列番号９）
と
５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＧＡＴＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴ３´（配列番号１０）
の２種類のＰｓｔＩ切断部位を付加したプライマーを作製し、実施例１（３）で調製したＴ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入したＣａＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユニットのうち一方のＰ３５サブユニットＤＮＡを鋳型として、９４℃，１分、５５℃，２分、７２℃，３分、３０サイクルでＰＣＲを行い、エタノール沈殿後、制限酵素ＰｓｔＩで切断した。これを１％アガロースゲル電気泳動にて約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。また、
５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＧ３´（配列番号１５）
と
５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＡＡＣＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴ３´（配列番号１６）
の２種類のＰｓｔＩ切断部位を付加したプライマーを作製し、実施例１（２）で調製したｐＵＣ１１８に挿入したＣａＩＬ１２Ｐ３５ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行い、ＰｓｔＩで切断し、約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。得られたそれぞれのＣａＩＬ１２Ｐ３５ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて上述のように、ＰｓｔＩで切断し調製したｐＣＤＬ−ＳＲα２９６に連結、大腸菌形質転換、プラスミドＤＮＡ調製を行い、ＣａＩＬ１２Ｐ３５を発現するＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５およびＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５ＦＬを得た。
【００３８】
さらに、作製したこれら４つの発現プラスミド中のＣａＩＬ１２Ｐ４０ＤＮＡおよびＣａＩＬ１２Ｐ３５ＤＮＡの塩基配列を確認した。
【００３９】
（２）サルＣＯＳ細胞でのＣａＩＬ１２の生産
上記（１）で得られたそれぞれ５μｇのＦＯＣａＩＬ１２Ｐ４０および
ＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、４００μｇ／ｍｌのＤＥＡＥデキストラン（ファルマシア製）および１００μＭのクロロキン（シグマ社）を含む４ｍｌのＥＲＤＦ培地（極東製薬（株）社製）に加えておく。一方、直径１０ｃｍのディッシュを用いて１０％ウシ胎児血清（ギブコ社、以下ＦＢＳと略記する）で５０％コンフルエントになるまで増殖させたＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）をＰＢＳで一回洗浄した後、上記で得た４ｍｌのＤＮＡ混合液を加え、５％ＣＯ2 、３７℃の条件で培養した。４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、２０ｍｌのＥＲＤＦ培地にて５％ＣＯ2 ，３７℃の条件で４日間培養し、ＣａＩＬ１２が生産された培養上清を得た。
【００４０】
（３）ＣａＩＬ１２産生組換えバキュロウイルスの作製
バキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＡＢ３（ファーミンジェン社製）のプロモーター下流の制限酵素ＸｂａＩおよびＳｍａＩ切断部位にそれぞれＰ４０およびＰ３５サブユニットｃＤＮＡを常法に従って連結し、組換えトランスファーベクターを得た。さらにファーミンジェン社製のバキュロウイルストランスフェクションキットを用いてその添付マニュアルに従って、組換えバキュロウイルスを作製した。
（４）昆虫細胞でのＣａＩＬ１２の生産
上記（３）で得られた組換えバキュロウイルスを、ファーミンジェン社製のバキュロゴールドＰｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍで７５ｃｍ2のフラスコでコンフルエントまで平面培養したＳｆ２１細胞（Ｓｐｏｎｄｏｐｔｅｒａ Ｆｌｕｇｉｐｅｒｄａ由来、ファーミンジェン社より入手）に感染させ、４日間培養した後、ＣａＩＬ１２が生産された培養上清を得た。
【００４１】
（５）ＣａＩＬ１２の活性測定
上記（２）、（４）で生産されたＣａＩＬ１２の活性測定は以下のようにして行った。 イヌリンパ球からのイヌＩＦＮγ誘導活性検定のために、抗ウイルス活性およびイヌ細胞のクラスＩＩＭＨＣ発現増強活性を測定した。
【００４２】
イヌ脾臓よりリンパ球を分離し、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦに１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で懸濁し、このうち２．５ｍｌとヒトＩＬ２（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）２５０Ｕを６ｃｍディッシュに添加した。これに上記（２）で得られた培養上清２．５ｍｌとヒトＩＬ２（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）２５０Ｕを加え、５％ＣＯ2 、３７℃の条件で２日間培養し、ウイルスとしてＶｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ，感受性細胞としてＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）を用い、文献１０のＣＰＥ法に従ってこの培養液の抗ウイルス活性を測定した。その結果、２ｘ１０5 希釈単位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が確認された。また、上記（４）で得られた培養上清の抗ウイルス活性を同様にして測定した結果、１０7希釈単位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が検出された。一方、１０μｇのｐＣＤＬ−ＳＲα２９６を上記（２）と同様にＣＯＳ−１細胞に導入したコントロールの細胞培養液およびＳｆ２１細胞を３日間培養した培養液では抗ウイルス活性は全く認められなかった。
【００４３】
また、クラスＩＩＭＨＣを発現したイヌ乳腺腫瘍組織由来細胞株ＦＣＢＲ１を用いて、上記の各培養液中のクラスＩＩＭＨＣの発現増強活性を測定した。６ｃｍディッシュに、１０5個のＦＣＢＲ１を接着させ、これに上記の各培養液５ｍｌを添加し、５％ＣＯ2、３７℃の各条件で１晩培養した。培養後、トリプシンにて細胞を剥離し、１．５ｍｌのミクロ遠心チューブにて遠心した。これに、１０μｌのラット抗イヌクラスＩＩＭＨＣモノクローナル抗体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を添加し、さらに５０μｌの１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、５μｌのＦＩＴＣ標識ラビット抗ラットモノクローナル抗体（セロテック社製）および５０μｌの１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン（株）のＦＡＣＳｃａｎにて解析した。その結果、ＣＯＳ１およびＳｆ２１で産生させたＣａＩＬ１２は、ＦＣＢＲ１上のクラスＩＩＭＨＣの発現量をそれぞれ約２０％、６０％上昇させた。これらのことから、ＣａＩＬ１２はイヌリンパ球に作用して、イヌＩＦＮγを誘導する活性を有することが判明した。
【００４４】
また、芽球化したイヌリンパ球の増殖促進活性を測定した。イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦに１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で懸濁し、このうち５ｍｌを６ｃｍディッシュに添加した。これにＰＨＡを５μｇ／ｍｌの濃度で添加し、５％ＣＯ2 、３７℃の条件で３日間培養してリンパ球を芽球化させた。この芽球化リンパ球を１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦに１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で懸濁し、９６穴マイクロプレート１穴あたり、５０μｌを添加した。これに上記（２）で得られた培養上清を１穴あたり５０μｌ加えた。また、コントロールとして１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦのみを１穴あたり５０μｌ加えた。これらをさらに５％ＣＯ2 、３７℃の条件で３日間培養後、文献１１のＭＴＴアッセイ法により、ＣａＩＬ１２の芽球化リンパ球の増殖促進活性を測定した。すなわち、５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（シグマ社製）溶液を１穴あたり１０μｌづつ添加し、さらに６時間培養した。１５０μｌの０．０１Ｎ塩酸イソプロパノール溶液を加えた後、超音波にて細胞を破砕し、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製Ｍｏｄｅｌ１３５５０）にて波長５９５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、コントロールの吸光度が平均０．６９であったのに対し、ＣＯＳ−１で産生したＣａＩＬ１２は平均１．５２であり、約２倍以上の芽球化リンパ球の増殖促進活性が認められた。
【００４５】
さらに、ＣａＩＬ１２のイヌ腫瘍に対する抗腫瘍作用を検討した。イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで５x１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に懸濁し、このうち５ｍｌを６ｃｍディッシュに添加した。これにベーリンガーマンハイム社（株）のリコンビナントヒトＩＬ２を５００Ｕ添加し、５％ＣＯ2、３７℃の条件で３日間培養した。一方、イヌ腫瘍細胞ＦＣＢＲ１およびＡ７２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５４２）を１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦでそれぞれ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に懸濁し、９６穴プレート１穴あたり５０μｌづつ添加し、プレートに接着させた。これにヒトＩＬ２で刺激したイヌリンパ球５０μｌを加え、さらにＣａＩＬ１２を発現している上記（２）で得られた培養上清１００μｌもしくはコントロールとして１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ１００μｌを添加し、５％ＣＯ2、３７℃の条件で２日間培養した。培養後、上清を完全に取り除き、ＭＴＴアッセイを行った。％細胞障害性を次の式にて算出した。
【００４６】
％細胞障害性＝（１ーＯＤ２／ＯＤ１）ｘ１００
ここで、ＯＤ１＝培地のみで培養したイヌ腫瘍細胞の波長５９５ｎｍの吸光度
ＯＤ２＝イヌリンパ球と共に培養したイヌ腫瘍細胞の波長５９５ｎｍの吸光度を表す。
【００４７】
その結果、ＦＣＢＲ１ではコントロールが３４％であったのに対し、ＣＯＳ−１で生産したＣａＩＬ１２は約７５％の細胞障害性を示した。また、Ａ７２ではコントロールが２２％であったのに対し、ＣａＩＬ１２は約８３％の細胞障害性を示した。ＣａＩＬ１２はイヌリンパ球を活性化して、イヌ腫瘍細胞に対して抗腫瘍作用を発揮することが判明した。
【００４８】
［実施例３］
ＣａＩＬ１２の精製：
実施例２（４）で得られた細胞培養上清２５０ｍｌを、スルホプロピル担体を充填したカラムにアプライした後、十分量の２０ｍＭリン酸緩衝液でカラムを洗浄し、０．５〜１ＭのＮａＣｌで溶出して得られた吸着画分をさらにブルーセファロース担体を充填したカラムにアプライし、同様にして洗浄後、１．１〜２ＭのＮａＣｌで溶出した画分を得た。得られた画分を透析によって脱塩して、精製したＣａＩＬ１２画分５ｍｌを得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によると、この画分中のＣａＩＬ１２の純度は９５％以上であった。
【００４９】
［実施例４］
ＣａＩＬ１２製剤の製造：
実施例３で得られた精製ＣａＩＬ１２溶液に、注射用生理食塩水、注射用低分子ゼラチン（新田ゼラチン（株））、ソルビトールを加えて、ゼラチンの終濃度０．５％、ソルビトールの終濃度３０％に調製した。さらに、ポジダイン（ポール（株））で処理してパイロジェンを除去した後、２５０℃で２時間乾熱滅菌したガラスバイアルに１ｍｌづつ分注した。その後、無菌的に凍結乾燥することによって、１バイアル中に１ｐｇから５μｇのＣａＩＬ１２を含むＣａＩＬ１２製剤を得た。このＣａＩＬ１２製剤は、室温条件下で安定であり、また、蒸留水または生理食塩水によって良好に溶解した。
【００５０】
［実施例５］
細胞レベルでのＣａＩＬ１２製剤の薬効評価：
（１）腫瘍
ＣａＩＬ１２製剤の抗腫瘍効果を見るために、担ガンマウスを作製し、ＣａＩＬ１２製剤で刺激されたイヌリンパ球を移入して腫瘍の縮小効果を検討した。６週齢のメスヌードマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕ）１０匹を日本クレア（株）より購入した。それぞれの背部皮下にイヌ乳腺腫瘍細胞株ＦＣＢＲ１を１０8ｃｅｌｌｓ移植し、約１ヶ月後、平均３３ｍｍｘ２５ｍｍの腫瘤を有する担ガンマウスを作製した。一方、ＦＣＢＲ１を樹立する際に、Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅらの方法（文献１４）により分離した腫瘍内浸潤リンパ球（以下ＴＩＬと略記する）１０8ｃｅｌｌｓを２０ｍｌの１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで懸濁し、実施例４で調製したＣａＩＬ１２製剤１０ｎｇを添加して５％ＣＯ2、３７℃の条件で２日間培養し、ＣａＩＬ１２製剤で刺激されたＴＩＬを得た。またコントロールとしてＣａＩＬ１２製剤を添加せずに同様の条件で培養した１０8ｃｅｌｌｓのＴＩＬを準備した。これら２種類のＴＩＬを担ガンヌードマウスの尾静脈より１匹あたり１０7ｃｅｌｌｓ、５匹づつ移入した。移入７日後、ノギスにて腫瘍重量を測定し、ＴＩＬ移入前との腫瘍重量の変化を調べた。なお、腫瘍重量は次の式にて算出した。
【００５１】
腫瘍重量＝（長径ｘ短径2／２）
その結果、ＣａＩＬ１２製剤で刺激されたＴＩＬを移入した担ガンヌードマウスは５匹のうち３匹で完全に腫瘍が退縮し、２匹でＴＩＬ移入前の腫瘍重量を１とした相対腫瘍重量で０．２以下であった。一方、コントロールのＴＩＬを移入した担ガンヌードマウスは５匹とも腫瘍が増大し、相対腫瘍重量ですべて１．２５以上であった。以上のことから担ガンマウスを用いた系において、ＣａＩＬ１２製剤はＴＩＬを活性化して腫瘍縮小効果を発揮することが判明した。
【００５２】
（２）アレルギー
ＣａＩＬ１２製剤の抗アレルギー効果を見るために、アレルギーの患犬由来リンパ球をＣａＩＬ１２製剤で刺激し、ＩｇＥなどアレルギーの原因となる因子の発現調節の有無について検討した。アトピー性皮膚炎と診断された患犬５頭からそれぞれ１０ｍｌの血液を採取した。これらより直ちにリンパ球を分離し、抗ヒトＣＤ３ポリクローナル抗体（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）で固相化した１０ｃｍディッシュにて１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦでＣａＩＬ１２製剤をそれぞれ１０ｎｇづつ加えて３日間培養した。なおコントロールとしてＣａＩＬ１２製剤を添加せずに同様の条件で培養したイヌリンパ球を準備した。培養後、各ディッシュ中の一部のリンパ球を回収し、実施例１に記載の方法によりｃＤＮＡを合成し、
イヌＩｇＥおよびイヌＩｇＥレセプター遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、それら遺伝子の発現を調べた。その結果、ＣａＩＬ１２製剤を添加して培養したイヌリンパ球のそれら遺伝子の発現はＣａＩＬ１２製剤を添加しなかったものと比較していずれも抑制されていた。このことから、ＣａＩＬ１２製剤はイヌリンパ球に作用してアレルギーの原因因子の１つであるＩｇＥおよびＩｇＥレセプターの発現を抑制することが判明した。また、抗ヒトＣＤ４ポリクローナル抗体（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）を用いたパンニング法（文献１５）により各ディッシュ中の残りのリンパ球から主にヘルパーＴ細胞集団からなるＣＤ４陽性細胞を得た。これを用いてｃＤＮＡを合成し、ＣａＩＬ５およびＣａＩＦＮγ遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、それら遺伝子の発現を調べた。その結果、ＣａＩＬ５遺伝子の発現に関してはＣａＩＬ１２製剤の添加によりいずれも発現が抑制されていた。一方、ＣａＩＦＮγ遺伝子の発現に関してはＣａＩＬ１２製剤の添加によりいずれも発現が増強されていた。ＩＬ５はアレルギー反応などの液性免疫反応を引き起こす２型ヘルパーＴ細胞から産生され、一方ＩＦＮγは細胞性免疫を引き起こし液性免疫を抑制する１型ヘルパーＴ細胞から産生される。このことから、ＣａＩＬ１２製剤はイヌリンパ球中の２型ヘルパーＴ細胞を抑制し、１型ヘルパーＴ細胞を活性化する作用を有することが示唆された。以上のことから、ＣａＩＬ１２製剤はイヌのアレルギー性疾患の治療に有望であることが判明した。
【００５３】
［実施例６］
ＣａＩＬ１２製剤のイヌに対する毒性試験：
ＣａＩＬ１２製剤の毒性を試験した。試験動物としてビーグル犬３頭を用いた。試験は以下の要領にて実施した。
【００５４】
(1) 投与方法
２日おきに計５回投与を行った。投与量は順次増やしていった（初回：１ｎｇ／ｋｇ体重、５ｎｇ／ｋｇ体重、２５ｎｇ／ｋｇ体重、２５０ｎｇ／ｋｇ体重、５回目：１μｇ／ｋｇ体重）。また投与ルートは静脈投与により行った。
【００５５】
(2) 観察検査期間、観察検査項目、観察点
観察期間は投与開始前１週から投与開始後３週までとした。観察検査項目は臨床症状（呼吸様式、元気、食欲、活動性、可視粘膜、流延、嘔吐、排便行動、傾眠）
、体温、心拍数、体重、血液学的検査（血球系（白血球数、ヘマトクリット、血小板数、血液像）、電解質（Ｎａ，Ｋ，Ｃｌ）、生化学的検査（ＢＵＮ，Ｃｒｅａ．，ＧＯＴ，ＧＰＴ，ＣＰＫ，Ｇｌｕｃｏｓｅ，ＴＰ，Ａｌｂ，Ｇｌｏｂ，Ａ／Ｇ）、尿所見、循環器および自律神経系所見とした。観察点は体重に関しては投与日から７日目毎に１回測定し、その他の項目に関しては、投与開始１週前、投与日の投与直前、投与１０分後、３０分後、１時間後、１．５時間後、２時間後、４時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、投与開始２週後および投与開始３週後に測定した。
【００５６】
以上の要領にて試験を行った結果、ＣａＩＬ１２製剤の投与によって問題となる変化は認められなかったことから、ＣａＩＬ１２製剤は少なくとも１μｇ／ｋｇ体重の投与量まではイヌに対して毒性がないことが明らかになった。
【００５７】
［実施例７］
ＣａＩＬ１２製剤によるイヌ疾病の治療および予防：
表皮に腫瘤を持つ患犬、計１２頭に対してＣａＩＬ１２製剤を局所注射および静脈内注射投与した。どの患犬にもさまざまな大きさの腫瘤が複数個存在していた。１２頭中８頭に対しては、腫瘤１個につき、１０ｎｇ−１μｇのＣａＩＬ１２を３ー４日間隔で３ー１０回、腫瘍局所に直接、注射投与した。その結果、ＣａＩＬ１２製剤を投与した腫瘤の９割が完全に消失し、残りの腫瘤も全て半分以下に縮小した。４頭は大きさが１００ｃｍ3以上の腫瘤を持っており、全てすでに肺、肝臓、腎臓などの内臓に転移していた。これら３頭については外科的手術により表皮の腫瘤を切除した直後にＣａＩＬ１２製剤を静脈内に１０ｎｇ／ｋｇ投与し、以後５００ｎｇ／ｋｇの投与量で連日７日間にわたって投与を続けた。その結果、内臓に転移していた腫瘍は全て消失し、以後６ヵ月間観察したが、再発は全くみられなかった。
【００５８】
また、アトピー性皮膚炎と診断された患犬７頭に対してＣａＩＬ１２製剤を静脈内注射投与した。これら患犬は皮膚に紅斑、湿疹および脱毛などの臨床症状が観察され、また血液中には多量のＩｇＥが検出され、その白血球画分にはＩＬ４，ＩＬ５，ＩＬ１０，ＩＬ１３の各ｍＲＮＡが高発現していた。ＣａＩＬ１２製剤を１回当り０．１ー１００ｎｇ／ｋｇの投与量で３日間隔で３ー５回、静脈内に投与した結果、１回の投与で臨床症状が速やかに改善され、３ー５回で完治にいたった。
【００５９】
さらに、花粉症と診断された患犬３頭に対してＣａＩＬ１２製剤を静脈内注射投与した。投与量は０．１−１０ｐｇ／ｋｇで１回の投与でクシャミ、鼻水等の臨床症状が速やかに改善された。
【００６０】
［実施例８］
ＣａＩＬ１２製剤を用いた養子免疫療法によるイヌ疾病の治療：
表皮に腫瘤を持つ患犬５頭およびアトピー性皮膚炎と診断された患犬３頭それぞれから２５ｍｌの血液を採取した。これらより直ちにリンパ球を分離し、抗ヒトＣＤ３ポリクローナル抗体（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）で固相化した１０ｃｍディッシュにて１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦでヒトＩＬ２（Ｚｅｎｚｙｍｅ社製）５０ＵとＣａＩＬ１２製剤を１００ｎｇ加えて４日間培養した。培養後、リンパ球を回収し、それぞれのイヌに静脈内注射した。その結果、アトピー性皮膚炎の患犬は３頭ともすべて完治し、また、腫瘍の患犬もすべてに腫瘤の縮小傾向が認められ、同様の操作を１週間おきに３〜５回繰り返したところ、すべての腫瘍が完全に退縮した。
【００６１】
【発明の効果】
本発明によれば、イヌの腫瘍、皮膚病、感染症、アレルギー疾病の優れた治療薬・予防薬および優れた治療方法・予防方法を提供できる。
【００６２】
参考文献：
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１３．Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｂａｍら：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５４，５３６（１９７３）．
１４．Ｗｈｅｔｅｓｉｄｅら ：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ９０，２２１−２２３（１９８６）．
１５．Ｓｅｅｄら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，３３６５−３３６９（１９８６）．
【配列表】
Claims (4)
- 配列番号：１または配列番号：１１と同じアミノ酸配列と配列番号：２または配列番号：１２と同じアミノ酸配列がヘテロダイマーを形成してできるイヌインターロイキン１２を含んでなるイヌのアトピー性皮膚炎治療薬。
- 配列番号：１または配列番号：１１と同じアミノ酸配列と配列番号：２または配列番号：１２と同じアミノ酸配列がヘテロダイマーを形成してできるイヌインターロイキン１２が遺伝子組換え手法を用いて製造されたイヌインターロイキン１２であることを特徴とする請求項１に記載のイヌのアトピー性皮膚炎治療薬。
- 配列番号：１または配列番号：１１と同じアミノ酸配列と配列番号：２または配列番号：１２と同じアミノ酸配列がヘテロダイマーを形成してできるイヌインターロイキン１２が配列番号：１または配列番号：１１と同じＤＮＡ配列と配列番号：２または配列番号：１２と同じＤＮＡ配列を同時に導入された動物細胞または配列番号：１または配列番号：１１と同じＤＮＡ配列と配列番号：２または配列番号：１２と同じＤＮＡ配列を同時に含む組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞または幼虫を用いて製造されたイヌインターロイキン１２であることを特徴とする請求項１又は２に記載のイヌのアトピー性皮膚炎治療薬。
- 請求項１から３のいずれか１項に記載されたイヌのアトピー性皮膚炎治療薬をイヌの末梢血から分離したリンパ球に作用させた後、再びイヌの体内に戻すことを特徴とするイヌのアトピー性皮膚炎治療方法。
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