JP2001192343A - 安定化された有用タンパク質組成物、安定化された有用タンパク質組成物の製造方法、安定化された有用タンパク質組成物の保存方法、イヌ疾病の治療剤およびイヌ疾病の治療方法 - Google Patents
安定化された有用タンパク質組成物、安定化された有用タンパク質組成物の製造方法、安定化された有用タンパク質組成物の保存方法、イヌ疾病の治療剤およびイヌ疾病の治療方法Info
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- JP2001192343A JP2001192343A JP2000292947A JP2000292947A JP2001192343A JP 2001192343 A JP2001192343 A JP 2001192343A JP 2000292947 A JP2000292947 A JP 2000292947A JP 2000292947 A JP2000292947 A JP 2000292947A JP 2001192343 A JP2001192343 A JP 2001192343A
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 有用タンパク質を医薬品として製造する際の
安定化方法の提供。 【解決手段】 有用タンパク質を医薬品とする場合、高
純度で製造する必要がある。しかし、一般に、サイトカ
インなどの有用タンパク質は高純度になると、その安定
性が低下する。そのため安定化剤を添加する方法が知ら
れているが、これは免疫反応等を誘起することがある。
そこで界面活性剤を含み、他の安定化剤を含まない安定
化された有用タンパク質組成物。サイトカインがインタ
ーフェロン−ω、インターロイキン１２及び１８の他、
特にインターフェロン−γの活性を有するタンパク質で
あり、ｐＨが５から９であることを特徴とする。上記安
定化されたイヌインターフェロン−γの活性を有するタ
ンパク質を含んでなる抗ウイルス治療剤、腫瘍治療剤、
感染症治療剤及び皮膚病治療剤等のイヌ疾病の治療剤。
安定化方法の提供。 【解決手段】 有用タンパク質を医薬品とする場合、高
純度で製造する必要がある。しかし、一般に、サイトカ
インなどの有用タンパク質は高純度になると、その安定
性が低下する。そのため安定化剤を添加する方法が知ら
れているが、これは免疫反応等を誘起することがある。
そこで界面活性剤を含み、他の安定化剤を含まない安定
化された有用タンパク質組成物。サイトカインがインタ
ーフェロン−ω、インターロイキン１２及び１８の他、
特にインターフェロン−γの活性を有するタンパク質で
あり、ｐＨが５から９であることを特徴とする。上記安
定化されたイヌインターフェロン−γの活性を有するタ
ンパク質を含んでなる抗ウイルス治療剤、腫瘍治療剤、
感染症治療剤及び皮膚病治療剤等のイヌ疾病の治療剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、有用タンパク質を
医薬品として製造する際の有用タンパク質の安定化に関
する。特に長期間活性を安定に保持する有用タンパク質
およびその製造法を提供する。
医薬品として製造する際の有用タンパク質の安定化に関
する。特に長期間活性を安定に保持する有用タンパク質
およびその製造法を提供する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子操作技術の進歩によりヒトのサイ
トカインのみならず、ウシ、ウマ、ネコなどの動物の各
種サイトカインについてもその遺伝子が次々にクローニ
ングされ、その結果、ウイルス病や腫瘍などの治療薬と
しての各種サイトカインの用途開発研究が行われている
ものもある。イヌについても、インターフェロン（以下
ＩＦＮと略記する）および各種インターロイキン（以下
ＩＬと略記する）のクローニングが報告されている（参
考文献１、２、３、１１）。
トカインのみならず、ウシ、ウマ、ネコなどの動物の各
種サイトカインについてもその遺伝子が次々にクローニ
ングされ、その結果、ウイルス病や腫瘍などの治療薬と
しての各種サイトカインの用途開発研究が行われている
ものもある。イヌについても、インターフェロン（以下
ＩＦＮと略記する）および各種インターロイキン（以下
ＩＬと略記する）のクローニングが報告されている（参
考文献１、２、３、１１）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】イヌには、乳腺腫瘍な
ど多数の腫瘍、パルボウイルス感染症、ジステンバ−感
染症など多数のウイルス病および多数の皮膚病などが知
られている。これらの治療薬としてイヌＩＦＮ-γが特
に有効であると考えられるので、イヌＩＦＮ-γの活性
を有するタンパク質が大量生産され、容易に入手可能と
なれば、これらイヌの治療薬としての用途が開かれると
期待される。
ど多数の腫瘍、パルボウイルス感染症、ジステンバ−感
染症など多数のウイルス病および多数の皮膚病などが知
られている。これらの治療薬としてイヌＩＦＮ-γが特
に有効であると考えられるので、イヌＩＦＮ-γの活性
を有するタンパク質が大量生産され、容易に入手可能と
なれば、これらイヌの治療薬としての用途が開かれると
期待される。
【０００４】有用タンパク質を医薬品とする場合、高純
度で製造する必要がある。しかし、一般に、サイトカイ
ンなどの有用タンパク質は高純度になると、その安定性
が低下することが知られている。そのため、一般には有
用タンパク質の高純度溶液に種々の局方に記載された安
定化剤を添加することによる安定化方法が知られてい
る。一般に使用される安定化剤としては、例えばゼラチ
ン、血清、アルブミン、コラーゲンなどの他のタンパク
質や、例えば単糖類、二糖類およびデキストランやヒド
ロキシエチルデンプンなどの糖類、あるいはサイクロデ
キストリン、多糖類アルコールやアラビアゴムなどであ
る。
度で製造する必要がある。しかし、一般に、サイトカイ
ンなどの有用タンパク質は高純度になると、その安定性
が低下することが知られている。そのため、一般には有
用タンパク質の高純度溶液に種々の局方に記載された安
定化剤を添加することによる安定化方法が知られてい
る。一般に使用される安定化剤としては、例えばゼラチ
ン、血清、アルブミン、コラーゲンなどの他のタンパク
質や、例えば単糖類、二糖類およびデキストランやヒド
ロキシエチルデンプンなどの糖類、あるいはサイクロデ
キストリン、多糖類アルコールやアラビアゴムなどであ
る。
【０００５】これらの安定化剤は、有用タンパク質に対
する安定化効果は高いが、医薬品として有用タンパク質
と混合され、生体に投与された場合、それ自体が生体に
対する作用を示す可能性がある。例えば、生体での異物
認識作用や、免疫細胞へのマイトージェン活性などによ
り、生体に免疫反応を誘起することがある。
する安定化効果は高いが、医薬品として有用タンパク質
と混合され、生体に投与された場合、それ自体が生体に
対する作用を示す可能性がある。例えば、生体での異物
認識作用や、免疫細胞へのマイトージェン活性などによ
り、生体に免疫反応を誘起することがある。
【０００６】これらの生体での反応が、有用タンパク質
の疾病に対する活性を増強するものであれば良いが、有
用タンパク質や疾病の種類によっては、有用タンパク質
の活性を過剰に増強したり、逆に低下させたりし、生体
に対して有害になる可能性がある。
の疾病に対する活性を増強するものであれば良いが、有
用タンパク質や疾病の種類によっては、有用タンパク質
の活性を過剰に増強したり、逆に低下させたりし、生体
に対して有害になる可能性がある。
【０００７】従って、これらの安定化剤を含まず、長期
間、有用タンパク質の活性を安定に保持する方法を見出
すことができれば、種々の有用タンパク質の医薬品とし
ての開発の途が開かれると期待される。
間、有用タンパク質の活性を安定に保持する方法を見出
すことができれば、種々の有用タンパク質の医薬品とし
ての開発の途が開かれると期待される。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者はかかる状況に
鑑み、各種生産系で生産された有用タンパク質を安定化
剤を含まない状態で安定化することを目的とし、創意工
夫を成し、種々の容器への吸着を防止することによっ
て、遺伝子組換え手法を用いて種々の生産系で生産され
た有用タンパク質を、他のタンパク質または糖類から選
ばれる安定化剤を含まない状態で安定化する方法を確立
し、かくして本発明を完成させるに至った。
鑑み、各種生産系で生産された有用タンパク質を安定化
剤を含まない状態で安定化することを目的とし、創意工
夫を成し、種々の容器への吸着を防止することによっ
て、遺伝子組換え手法を用いて種々の生産系で生産され
た有用タンパク質を、他のタンパク質または糖類から選
ばれる安定化剤を含まない状態で安定化する方法を確立
し、かくして本発明を完成させるに至った。
【０００９】すなわち本発明は、 （１） 界面活性剤を含み、他のタンパク質および糖類
から選ばれる安定化剤を含まないことを特徴とする安定
化された有用タンパク質組成物。 （２） 他のタンパク質および糖類から選ばれる安定化
剤を含まない有用タンパク質に界面活性剤を添加するこ
とを特徴とする安定化された有用タンパク質の製造方
法。 （３） （１）の安定化されたイヌインターフェロン−
γの活性を有するタンパク質組成物または（２）の方法
により得られた安定化されたイヌインターフェロン−γ
の活性を有するタンパク質を含んでなるイヌ疾病の治療
剤。 （４） （３）のイヌ疾病の治療剤をイヌに注射投与す
ることを特徴とするイヌ疾病の治療方法。である。
から選ばれる安定化剤を含まないことを特徴とする安定
化された有用タンパク質組成物。 （２） 他のタンパク質および糖類から選ばれる安定化
剤を含まない有用タンパク質に界面活性剤を添加するこ
とを特徴とする安定化された有用タンパク質の製造方
法。 （３） （１）の安定化されたイヌインターフェロン−
γの活性を有するタンパク質組成物または（２）の方法
により得られた安定化されたイヌインターフェロン−γ
の活性を有するタンパク質を含んでなるイヌ疾病の治療
剤。 （４） （３）のイヌ疾病の治療剤をイヌに注射投与す
ることを特徴とするイヌ疾病の治療方法。である。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明に関し詳細に説明す
る。
る。
【００１１】本発明の安定化された有用タンパク質は全
ての動物種を含むものとする。本発明では、特に有用タ
ンパク質がサイトカインである場合が好ましく、サイト
カインとしては、インターフェロン（以下、ＩＦＮ）−
γの活性を有するタンパク質、インターフェロン−ω、
インターロイキン（以下、ＩＬ）１２、インターロイキ
ン１８などが好ましく挙げられる。
ての動物種を含むものとする。本発明では、特に有用タ
ンパク質がサイトカインである場合が好ましく、サイト
カインとしては、インターフェロン（以下、ＩＦＮ）−
γの活性を有するタンパク質、インターフェロン−ω、
インターロイキン（以下、ＩＬ）１２、インターロイキ
ン１８などが好ましく挙げられる。
【００１２】なお、ＩＦＮ-γの活性を有するタンパク
質とは、ＩＦＮ-γの活性を有するものであれば良く、
糖鎖、酸化、アミノ酸配列などの構造に限定されない。
例えば以下の性質のいずれかを示すものである。 （１）単量体または単量体の組合せからなる２量体であ
ることを特徴とする。 （２）単量体が、そのＣ末端構造が欠損したタンパク質
であることを特徴とする。 （３）単量体が、配列番号：１、配列番号：２、配列番
号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番
号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６または配列
番号：３７から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列
もしくは、これらアミノ酸配列において１もしくは数個
のアミノ酸が欠失、付加、置換もしくは修飾されたアミ
ノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする。 （４）単量体が、そのＮ末端側のメチオニン残基が酸化
を受けたタンパク質であることを特徴とする。 （５）２量体が、（２）、（３）または（４）に記載の
単量体の組合せからなるホモ２量体またはヘテロ２量体
であることを特徴とする。好ましくはホモ２量体であ
る。 （６）インターフェロン−γの活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡにより遺伝子組換えされ、生産させ
た組換えタンパク質であることを特徴とする。 （７）上記インターフェロン−γの活性を有するタンパ
ク質をコードするＤＮＡが配列番号：１、配列番号：
２、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３
３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６
または配列番号：３７から選ばれる少なくとも１つの配
列もしくは該配列とハイブリダイズする配列を有するこ
とを特徴とする。 （８）インターフェロン−γの活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡにより遺伝子組換えされた組換えカ
イコ核多角体病ウイルスを、カイコ生体中で増殖させ
て、生産させたタンパク質であることを特徴とする。
質とは、ＩＦＮ-γの活性を有するものであれば良く、
糖鎖、酸化、アミノ酸配列などの構造に限定されない。
例えば以下の性質のいずれかを示すものである。 （１）単量体または単量体の組合せからなる２量体であ
ることを特徴とする。 （２）単量体が、そのＣ末端構造が欠損したタンパク質
であることを特徴とする。 （３）単量体が、配列番号：１、配列番号：２、配列番
号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番
号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６または配列
番号：３７から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列
もしくは、これらアミノ酸配列において１もしくは数個
のアミノ酸が欠失、付加、置換もしくは修飾されたアミ
ノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする。 （４）単量体が、そのＮ末端側のメチオニン残基が酸化
を受けたタンパク質であることを特徴とする。 （５）２量体が、（２）、（３）または（４）に記載の
単量体の組合せからなるホモ２量体またはヘテロ２量体
であることを特徴とする。好ましくはホモ２量体であ
る。 （６）インターフェロン−γの活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡにより遺伝子組換えされ、生産させ
た組換えタンパク質であることを特徴とする。 （７）上記インターフェロン−γの活性を有するタンパ
ク質をコードするＤＮＡが配列番号：１、配列番号：
２、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３
３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６
または配列番号：３７から選ばれる少なくとも１つの配
列もしくは該配列とハイブリダイズする配列を有するこ
とを特徴とする。 （８）インターフェロン−γの活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡにより遺伝子組換えされた組換えカ
イコ核多角体病ウイルスを、カイコ生体中で増殖させ
て、生産させたタンパク質であることを特徴とする。
【００１３】本発明の製造法では、高純度の有用タンパ
ク質を含む溶液に界面活性剤を添加し、容器への吸着を
防止することによって有用タンパク質を安定に製造でき
る。
ク質を含む溶液に界面活性剤を添加し、容器への吸着を
防止することによって有用タンパク質を安定に製造でき
る。
【００１４】使用する界面活性剤としては、特に限定は
ないが、非イオン性のものが好ましく使用できる。具体
例を挙げると、アルキルアリルポリエーテルアルコー
ル、高級アルコール硫酸化物、Ｎ−ココイルーＬーアル
ギニンエチルエステルＤＬーピロリドンカルボン酸塩、
ＮーココイルーＮーメチルアミノエチルスルホン酸ナト
リウム、コレステロール、自己乳化型モノステアリン酸
グリセリン、ショ糖脂肪酸エステル、スクワラン、ステ
アリンアルコール、ステアリン酸ポリオキシル４０、セ
スキオレイン酸ソルビタンセタノール、セトマクロゴー
ル１０００、セバシン酸ジエチル、ソルビタン脂肪酸エ
ステル、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ノニ
ルフェノキシポリオキシエチレンエタン硫酸エステルア
ンモニウム、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエー
テル、ポリオキシエチレンオレインアミン、ポリオキシ
エチレン硬化ヒマシ油２０、ポリオキシエチレン硬化ヒ
マシ油６０、ポリオキシエチレンステアリンエーテル、
ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレ
ンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソル
ビットミツロウ、ポリオキシエチレンノニルフェニルエ
ーテル、ポリオキシエチレン（１０５）ポリオキシプロ
ピレン（５）グリコール、ポリオキシエチレン（１２
０）ポリオキシプロピレン（４０）グリコール、ポリオ
キシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン３０）グ
リコール、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロ
ピレン（２０）グリコール、ポリソルベート６０、ポリ
ソルベート８０、マクロゴール４００、モノオレイン酸
ソルビタン、モノステアリン酸グリセリン、モノステア
リン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、モノラ
ウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ラウリル硫酸
ナトリウム、ラウリン酸ジエタノールアミド、ラウロイ
ルサルコシンナトリウム、ラウロマクロゴール、リン酸
ナトリウムポリオキシエチレンラウリルエーテル、リン
酸ポリオキシエチレンオレイルエーテルなど日本薬局方
に医薬品添加物として記載されているものが好ましく、
その中でもポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０が特に
好ましく用いられる。また、添加する濃度は０．００１
〜１０重量％が好ましい。
ないが、非イオン性のものが好ましく使用できる。具体
例を挙げると、アルキルアリルポリエーテルアルコー
ル、高級アルコール硫酸化物、Ｎ−ココイルーＬーアル
ギニンエチルエステルＤＬーピロリドンカルボン酸塩、
ＮーココイルーＮーメチルアミノエチルスルホン酸ナト
リウム、コレステロール、自己乳化型モノステアリン酸
グリセリン、ショ糖脂肪酸エステル、スクワラン、ステ
アリンアルコール、ステアリン酸ポリオキシル４０、セ
スキオレイン酸ソルビタンセタノール、セトマクロゴー
ル１０００、セバシン酸ジエチル、ソルビタン脂肪酸エ
ステル、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ノニ
ルフェノキシポリオキシエチレンエタン硫酸エステルア
ンモニウム、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエー
テル、ポリオキシエチレンオレインアミン、ポリオキシ
エチレン硬化ヒマシ油２０、ポリオキシエチレン硬化ヒ
マシ油６０、ポリオキシエチレンステアリンエーテル、
ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレ
ンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソル
ビットミツロウ、ポリオキシエチレンノニルフェニルエ
ーテル、ポリオキシエチレン（１０５）ポリオキシプロ
ピレン（５）グリコール、ポリオキシエチレン（１２
０）ポリオキシプロピレン（４０）グリコール、ポリオ
キシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン３０）グ
リコール、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロ
ピレン（２０）グリコール、ポリソルベート６０、ポリ
ソルベート８０、マクロゴール４００、モノオレイン酸
ソルビタン、モノステアリン酸グリセリン、モノステア
リン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、モノラ
ウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ラウリル硫酸
ナトリウム、ラウリン酸ジエタノールアミド、ラウロイ
ルサルコシンナトリウム、ラウロマクロゴール、リン酸
ナトリウムポリオキシエチレンラウリルエーテル、リン
酸ポリオキシエチレンオレイルエーテルなど日本薬局方
に医薬品添加物として記載されているものが好ましく、
その中でもポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０が特に
好ましく用いられる。また、添加する濃度は０．００１
〜１０重量％が好ましい。
【００１５】さらに、界面活性剤を添加した高純度の有
用タンパク質を含む溶液のｐＨや保存温度を各タンパク
質に最も安定な値にすることにより、より高い安定化効
果が期待できる。例えば、高純度に精製されたＩＦＮ-
γの活性を有するタンパク質は、種々の濃度で短時間で
急激に活性が低下する。界面活性剤を添加して保存した
場合、ここで見られた活性低下を著しく回復することが
できる。さらに長期間、安定に保存する場合、ｐＨ値を
５〜９、保存温度を−８０〜１５℃にすることで、３０
日間活性低下は観察されない。さらに好ましくは、ｐＨ
値を５．５±０．３、保存温度を−８０〜−２０℃に調
製することにより、同条件でＩＦＮ-γの活性を有する
タンパク質は、１年以上活性低下がなく、安定に保存で
きる。
用タンパク質を含む溶液のｐＨや保存温度を各タンパク
質に最も安定な値にすることにより、より高い安定化効
果が期待できる。例えば、高純度に精製されたＩＦＮ-
γの活性を有するタンパク質は、種々の濃度で短時間で
急激に活性が低下する。界面活性剤を添加して保存した
場合、ここで見られた活性低下を著しく回復することが
できる。さらに長期間、安定に保存する場合、ｐＨ値を
５〜９、保存温度を−８０〜１５℃にすることで、３０
日間活性低下は観察されない。さらに好ましくは、ｐＨ
値を５．５±０．３、保存温度を−８０〜−２０℃に調
製することにより、同条件でＩＦＮ-γの活性を有する
タンパク質は、１年以上活性低下がなく、安定に保存で
きる。
【００１６】イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡは例えば次のようにして製造するこ
とができる。すなわち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮ
Ａを抽出した後、ｃＤＮＡに転換し、イヌＩＦＮ-γを
コ−ドする遺伝子配列を元にしたプライマ−を用いてポ
リメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことに
よってイヌＩＦＮ-γをコ−ドする遺伝子を得ることが
できる。イヌの細胞、例えばマイト−ジェンなどで刺激
されたイヌリンパ球などよりＲＮＡを得る方法として
は、通常の方法、例えば、ポリソ−ムの分離、ショ糖密
度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられ
る。上記イヌ細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、
グアニジン・チオシアネ−ト処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠
心を行うグアニジン・チオシアネ−ト−塩化セシウム法
（参考文献４）バナジウム複合体を用いてリボヌクレア
−ゼインヒビタ−存在下に界面活性剤で処理したのちフ
ェノ−ル抽出を行う方法（参考文献５），グアニジン・
チオシアネ−ト−ホット・フェノ−ル法、グアニジン・
チオシアネ−ト−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオ
シアネ−ト−フェノ−ル・クロロホルム法、グアニジン
・チオシアネ−トで処理したのち塩化リチウムで処理し
てＲＮＡを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選
んで行うことができる。
をコードするＤＮＡは例えば次のようにして製造するこ
とができる。すなわち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮ
Ａを抽出した後、ｃＤＮＡに転換し、イヌＩＦＮ-γを
コ−ドする遺伝子配列を元にしたプライマ−を用いてポ
リメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことに
よってイヌＩＦＮ-γをコ−ドする遺伝子を得ることが
できる。イヌの細胞、例えばマイト−ジェンなどで刺激
されたイヌリンパ球などよりＲＮＡを得る方法として
は、通常の方法、例えば、ポリソ−ムの分離、ショ糖密
度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられ
る。上記イヌ細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、
グアニジン・チオシアネ−ト処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠
心を行うグアニジン・チオシアネ−ト−塩化セシウム法
（参考文献４）バナジウム複合体を用いてリボヌクレア
−ゼインヒビタ−存在下に界面活性剤で処理したのちフ
ェノ−ル抽出を行う方法（参考文献５），グアニジン・
チオシアネ−ト−ホット・フェノ−ル法、グアニジン・
チオシアネ−ト−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオ
シアネ−ト−フェノ−ル・クロロホルム法、グアニジン
・チオシアネ−トで処理したのち塩化リチウムで処理し
てＲＮＡを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選
んで行うことができる。
【００１７】イヌリンパ球などより通常の方法、例え
ば、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシア
ネ−ト法、オリゴｄＴセルロ−スカラム法等によりｍＲ
ＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例え
ば、Ｇｕｂｌｅｒらの方法（参考文献６），Ｈ．Ｏｋａ
ｙａｍａらの方法（参考文献７）等によりｃＤＮＡを合
成する。得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するに
は、基本的にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆
転写酵素などを用いるほか１部プライマ−を用いてＤＮ
Ａポリメラ−ゼなどを用いる方法を組み合わせてよい
が、市販の合成あるいはクロ−ニング用キットを用いる
のが便利である。このｃＤＮＡを鋳型としてイヌＩＦＮ
-γの塩基配列を基にしたプライマ−を用いてＰＣＲを
行うことによってイヌＩＦＮ-γの蛋白質をコ−ドする
ＤＮＡを得ることができる。さらにこのＤＮＡを鋳型と
してイヌＩＦＮ-γ遺伝子の数ヵ所を改変するようよう
に設計したプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られた
ＰＣＲ増幅断片を連結することによって、イヌＩＦＮ-
γの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得る
ことができる。
ば、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシア
ネ−ト法、オリゴｄＴセルロ−スカラム法等によりｍＲ
ＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例え
ば、Ｇｕｂｌｅｒらの方法（参考文献６），Ｈ．Ｏｋａ
ｙａｍａらの方法（参考文献７）等によりｃＤＮＡを合
成する。得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するに
は、基本的にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆
転写酵素などを用いるほか１部プライマ−を用いてＤＮ
Ａポリメラ−ゼなどを用いる方法を組み合わせてよい
が、市販の合成あるいはクロ−ニング用キットを用いる
のが便利である。このｃＤＮＡを鋳型としてイヌＩＦＮ
-γの塩基配列を基にしたプライマ−を用いてＰＣＲを
行うことによってイヌＩＦＮ-γの蛋白質をコ−ドする
ＤＮＡを得ることができる。さらにこのＤＮＡを鋳型と
してイヌＩＦＮ-γ遺伝子の数ヵ所を改変するようよう
に設計したプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られた
ＰＣＲ増幅断片を連結することによって、イヌＩＦＮ-
γの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得る
ことができる。
【００１８】イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質
は、カイコに感染する組換えカイコ核多角体病ウイルス
を作製することによって、カイコ発現系を用いても生産
することができる。組換えカイコ核多角体病ウイルス
は、イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質をコ−ド
するＤＮＡをカイコのクローニングベクター（参考文献
８）に連結して作製した組換え体プラスミドとカイコ核
多角体病ウイルスＤＮＡとを、カイコ樹立細胞にコトラ
ンスフェクションして作製することができる。従って、
組換え体ウイルスは、ｉｎ ｖｉｖｏ的な方法で作製す
ることができる。すなわち、イヌＩＦＮ-γの活性を有
するタンパク質をコードするＤＮＡ部分を、例えばｐＢ
Ｍ０３０（参考文献８）などのカイコのクローニングベ
クターの発現調節部分の下流に連結するという一般的な
遺伝子操作に従って組換え体プラスミドを作製すること
ができる。この組換え体プラスミドとカイコ核多角体病
ウイルスＤＮＡ（参考文献８）とを、文献のような方法
でカイコ樹立細胞、例えばＢＭ−Ｎ株（参考文献８）に
コトランスフェクションした後、培養を続け、培養液中
に出現した非組換え体（野性型）と組換え体のウイルス
の中から限界希釈法、もしくはプラーク法などの一般的
な方法によって組換えウイルスをクローニングすること
ができる。組換えウイルスは多角体の形成能がないこと
から、野性型ウイルスと容易に区別できる。イヌＩＦＮ
-γの活性を有するタンパク質の生産は、前記の組換え
カイコ核多角体ウイルスをカイコ樹立細胞中、またはカ
イコ生体中で増殖させることにより行なう。
は、カイコに感染する組換えカイコ核多角体病ウイルス
を作製することによって、カイコ発現系を用いても生産
することができる。組換えカイコ核多角体病ウイルス
は、イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質をコ−ド
するＤＮＡをカイコのクローニングベクター（参考文献
８）に連結して作製した組換え体プラスミドとカイコ核
多角体病ウイルスＤＮＡとを、カイコ樹立細胞にコトラ
ンスフェクションして作製することができる。従って、
組換え体ウイルスは、ｉｎ ｖｉｖｏ的な方法で作製す
ることができる。すなわち、イヌＩＦＮ-γの活性を有
するタンパク質をコードするＤＮＡ部分を、例えばｐＢ
Ｍ０３０（参考文献８）などのカイコのクローニングベ
クターの発現調節部分の下流に連結するという一般的な
遺伝子操作に従って組換え体プラスミドを作製すること
ができる。この組換え体プラスミドとカイコ核多角体病
ウイルスＤＮＡ（参考文献８）とを、文献のような方法
でカイコ樹立細胞、例えばＢＭ−Ｎ株（参考文献８）に
コトランスフェクションした後、培養を続け、培養液中
に出現した非組換え体（野性型）と組換え体のウイルス
の中から限界希釈法、もしくはプラーク法などの一般的
な方法によって組換えウイルスをクローニングすること
ができる。組換えウイルスは多角体の形成能がないこと
から、野性型ウイルスと容易に区別できる。イヌＩＦＮ
-γの活性を有するタンパク質の生産は、前記の組換え
カイコ核多角体ウイルスをカイコ樹立細胞中、またはカ
イコ生体中で増殖させることにより行なう。
【００１９】カイコ樹立細胞を用いる場合は、前記組換
えウイルスを含む培養液により、ＢＭ−Ｎ細胞を感染さ
せ、平面培養または浮遊培養により培養する。ＢＭ−Ｎ
細胞を培養する培地としては、例えば牛血清を添加した
ＴＣ−１０培地（参考文献９）やＴＣ−１００培地（日
本農産工業（株）製）を使用することができる。培養温
度は２５〜２８℃が適当である。培養後、培養液を遠心
分離し、その上清からイヌＩＦＮ-γの活性を有するタ
ンパク質を回収する。
えウイルスを含む培養液により、ＢＭ−Ｎ細胞を感染さ
せ、平面培養または浮遊培養により培養する。ＢＭ−Ｎ
細胞を培養する培地としては、例えば牛血清を添加した
ＴＣ−１０培地（参考文献９）やＴＣ−１００培地（日
本農産工業（株）製）を使用することができる。培養温
度は２５〜２８℃が適当である。培養後、培養液を遠心
分離し、その上清からイヌＩＦＮ-γの活性を有するタ
ンパク質を回収する。
【００２０】カイコ生体を用いる場合は、前記の組換え
体ウイルスを含む培養液をカイコ幼虫に注射して、人工
飼料を与えて飼育する。飼育後、体液を採取しその上清
からイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質を回収す
る。
体ウイルスを含む培養液をカイコ幼虫に注射して、人工
飼料を与えて飼育する。飼育後、体液を採取しその上清
からイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質を回収す
る。
【００２１】カイコ樹立細胞、カイコ生体および夜盗蛾
樹立細胞などを用いて有用タンパク質を生産させた培養
液中には、組換えウイルスが含まれる。この培養液に界
面活性剤を添加して、４℃から５０℃で１０分から１週
間処理することで、組換えウイルスを不活化することが
できる。界面活性剤は、日本薬局方に医薬品添加物とし
て記載されているものが好ましく、その中でも非イオン
性のもの、例えばポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０
が好ましく用いられる。また、添加する濃度は０．００
１〜１０重量％が適当である。
樹立細胞などを用いて有用タンパク質を生産させた培養
液中には、組換えウイルスが含まれる。この培養液に界
面活性剤を添加して、４℃から５０℃で１０分から１週
間処理することで、組換えウイルスを不活化することが
できる。界面活性剤は、日本薬局方に医薬品添加物とし
て記載されているものが好ましく、その中でも非イオン
性のもの、例えばポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０
が好ましく用いられる。また、添加する濃度は０．００
１〜１０重量％が適当である。
【００２２】本発明の製造法で使用されるＩＦＮ-γの
活性を有するタンパク質の高純度精製には、金属をキレ
ート結合させた担体、イオン交換担体および色素担体が
それぞれ単独あるいは組み合わせで好ましく使用され
る。金属をキレート結合させた担体としては、アガロー
ス、セルロース、ポリアクリルアミドゲルなどに、例え
ばビスカルボキシメチルイミノ基｛Ｎ（ＣＨ2ＣＯＯ
Ｈ）2｝などのキレート能を有する交換基が結合した担
体を、硫酸銅や塩化ニッケルなどの金属塩の溶液で処理
した担体が挙げられる。好ましくは、キレーティングセ
ファロース（アマシャム・ファルマシア社製）などの不
溶性多糖類系担体に銅をキレート結合させた担体（以
下、銅キレート担体と略記する）が用いられる。インタ
ーフェロン−γの活性を有するタンパク質の大部分は、
溶液のｐＨ値が４〜９の範囲では該担体に吸着せず、一
方、多くのインターフェロン−γの活性を有するタンパ
ク質以外の夾雑タンパク質は該担体に吸着するので、本
操作にてインターフェロン−γの活性を有するタンパク
質を高純度で回収することができる。また、該担体にイ
ンターフェロン−γの活性を有するタンパク質が吸着し
ても、極めて弱い吸着であり、塩化アンモニウムや塩化
ナトリウムなどの塩の低濃度溶液で容易に溶出させ、高
純度で回収することができる。例えば、カイコ生体中で
生産させたイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質を
含む溶液をｐＨ値を７にし、該担体に接触させると、イ
ヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質は非吸着画分に
全て回収され、カイコ由来物の大部分は該担体に強固に
吸着し、除去することができる。また、本操作をｐＨ値
５．５下で行うと、非吸着画分には、Ｃ末端構造が１２
アミノ酸残基以上欠損したイヌＩＦＮ-γ（以下低分子
イヌＩＦＮ-γと略記する）が回収され、それ以外の高
分子のイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質は該担
体に弱く吸着する。高分子のイヌＩＦＮ-γの活性を有
するタンパク質は０．１〜０．６Ｍの塩化アンモニウム
溶液で回収され、カイコ由来物の大部分は本画分には回
収されない。従って、本操作にて、低分子と高分子のイ
ヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質をそれぞれ分離
して高純度で回収することができる。
活性を有するタンパク質の高純度精製には、金属をキレ
ート結合させた担体、イオン交換担体および色素担体が
それぞれ単独あるいは組み合わせで好ましく使用され
る。金属をキレート結合させた担体としては、アガロー
ス、セルロース、ポリアクリルアミドゲルなどに、例え
ばビスカルボキシメチルイミノ基｛Ｎ（ＣＨ2ＣＯＯ
Ｈ）2｝などのキレート能を有する交換基が結合した担
体を、硫酸銅や塩化ニッケルなどの金属塩の溶液で処理
した担体が挙げられる。好ましくは、キレーティングセ
ファロース（アマシャム・ファルマシア社製）などの不
溶性多糖類系担体に銅をキレート結合させた担体（以
下、銅キレート担体と略記する）が用いられる。インタ
ーフェロン−γの活性を有するタンパク質の大部分は、
溶液のｐＨ値が４〜９の範囲では該担体に吸着せず、一
方、多くのインターフェロン−γの活性を有するタンパ
ク質以外の夾雑タンパク質は該担体に吸着するので、本
操作にてインターフェロン−γの活性を有するタンパク
質を高純度で回収することができる。また、該担体にイ
ンターフェロン−γの活性を有するタンパク質が吸着し
ても、極めて弱い吸着であり、塩化アンモニウムや塩化
ナトリウムなどの塩の低濃度溶液で容易に溶出させ、高
純度で回収することができる。例えば、カイコ生体中で
生産させたイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質を
含む溶液をｐＨ値を７にし、該担体に接触させると、イ
ヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質は非吸着画分に
全て回収され、カイコ由来物の大部分は該担体に強固に
吸着し、除去することができる。また、本操作をｐＨ値
５．５下で行うと、非吸着画分には、Ｃ末端構造が１２
アミノ酸残基以上欠損したイヌＩＦＮ-γ（以下低分子
イヌＩＦＮ-γと略記する）が回収され、それ以外の高
分子のイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質は該担
体に弱く吸着する。高分子のイヌＩＦＮ-γの活性を有
するタンパク質は０．１〜０．６Ｍの塩化アンモニウム
溶液で回収され、カイコ由来物の大部分は本画分には回
収されない。従って、本操作にて、低分子と高分子のイ
ヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質をそれぞれ分離
して高純度で回収することができる。
【００２３】また、イオン交換担体としては、アガロー
ス、セルロース、合成ポリマーゲルなどに、例えばジエ
チルアミノエチル（Diethylaminoethyl）、クアテナリ
アミノエチル（Quaternary aminoethyl）、クアテナリ
アンモニウム（Quaternary ammonium）、カルボキシメ
チル（Carboxymethyl）、スルホプロピル（Sulphopropy
l）、メチルスルホネート（Methyl sulphonate）などの
官能基を導入したものが挙げられる。好ましくはクアテ
ナリアンモニウムが導入された、Ｑ セファロースハイ
パフォーマンス（Ｑ Sepharose High Performance）
（アマシャム・ファルマシア社製）やＱ セファロース
ファーストフロー（Ｑ Sepharose Fast Flow）（アマシ
ャム・ファルマシア社製）など（以下、Ｑセファロース
担体と略記する）が用いられる。Ｑセファロース担体か
らの溶出は、溶出剤のｐＨ値、イオン強度などによって
決定される。多種類のＩＦＮ-γの活性を有するタンパ
ク質はそれぞれ異なった電荷を有しており、それぞれの
電荷の差により、本担体を用いて、それぞれを分画する
ことができる。例えば、カイコ生体中で生産させた糖鎖
を欠損させたイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質
の場合、ｐＨ値９下で、Ｃ末端構造が１６アミノ酸残基
欠損したイヌＩＦＮ-γ（以下、イヌＩＦＮ-γ／１６−
と略記する）のホモ２量体とＣ末端構造が１７アミノ酸
残基欠損したイヌＩＦＮ-γ（以下、イヌＩＦＮ-γ／１
７−と略記する）のヘテロ２量体およびイヌＩＦＮ-γ
／１６−とイヌＩＦＮ-γ／１７−のヘテロ２量体をそ
れぞれ分画することができる。
ス、セルロース、合成ポリマーゲルなどに、例えばジエ
チルアミノエチル（Diethylaminoethyl）、クアテナリ
アミノエチル（Quaternary aminoethyl）、クアテナリ
アンモニウム（Quaternary ammonium）、カルボキシメ
チル（Carboxymethyl）、スルホプロピル（Sulphopropy
l）、メチルスルホネート（Methyl sulphonate）などの
官能基を導入したものが挙げられる。好ましくはクアテ
ナリアンモニウムが導入された、Ｑ セファロースハイ
パフォーマンス（Ｑ Sepharose High Performance）
（アマシャム・ファルマシア社製）やＱ セファロース
ファーストフロー（Ｑ Sepharose Fast Flow）（アマシ
ャム・ファルマシア社製）など（以下、Ｑセファロース
担体と略記する）が用いられる。Ｑセファロース担体か
らの溶出は、溶出剤のｐＨ値、イオン強度などによって
決定される。多種類のＩＦＮ-γの活性を有するタンパ
ク質はそれぞれ異なった電荷を有しており、それぞれの
電荷の差により、本担体を用いて、それぞれを分画する
ことができる。例えば、カイコ生体中で生産させた糖鎖
を欠損させたイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質
の場合、ｐＨ値９下で、Ｃ末端構造が１６アミノ酸残基
欠損したイヌＩＦＮ-γ（以下、イヌＩＦＮ-γ／１６−
と略記する）のホモ２量体とＣ末端構造が１７アミノ酸
残基欠損したイヌＩＦＮ-γ（以下、イヌＩＦＮ-γ／１
７−と略記する）のヘテロ２量体およびイヌＩＦＮ-γ
／１６−とイヌＩＦＮ-γ／１７−のヘテロ２量体をそ
れぞれ分画することができる。
【００２４】さらに、色素担体としては、ブルー色素を
結合させた担体（以下、ブルー担体と略記する）が好ま
しく用いられる。ブルー担体としては次のものが使用さ
れる。ブルー色素は一般名をＣＩリアクティブブルー２
といい、例えばＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ社からジバクロン
ブルーＦ３ＧＡ、またはジバクロンブルー３ＧＡという
商品名で市販されている青色色素などが挙げられる。実
際のクロマトグラフィーに使用する担体としては、ブル
ーセファロースＣＬ−６Ｂ（アマシャム・ファルマシア
社製）、ブルーセファロース６ファーストフロー（アマ
シャム・ファルマシア社製）、ブルーセファロース６ハ
イパフォーマンス（アマシャム・ファルマシア社製）、
マトレックスゲルブルーＡ（アミコン社製）、アフィゲ
ルブルー（Biorad社製）などの商品名で市販されている
ブルーアガロースゲル、またはブルートリスアクリルー
Ｍ（ＬＫＢ社製）ブルーセルロファイン（チッソ社製）
などの商品名で市販されているブルーセファロースゲル
などが適当であり、容易に入手することができる。ブル
ー担体からの溶出は、溶出剤のｐＨ値、イオン強度、疎
水度などによって決定される。例えば、イヌＩＦＮ-γ
の活性を有するタンパク質の場合、中性付近のｐＨで、
イヌＩＦＮ-γ／１６−のホモ２量体、イヌＩＦＮ-γ／
１７−のホモ２量体あるいは高分子のイヌＩＦＮ-γの
活性を有するタンパク質をそれぞれ分離溶出して、高純
度で精製することができる。
結合させた担体（以下、ブルー担体と略記する）が好ま
しく用いられる。ブルー担体としては次のものが使用さ
れる。ブルー色素は一般名をＣＩリアクティブブルー２
といい、例えばＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ社からジバクロン
ブルーＦ３ＧＡ、またはジバクロンブルー３ＧＡという
商品名で市販されている青色色素などが挙げられる。実
際のクロマトグラフィーに使用する担体としては、ブル
ーセファロースＣＬ−６Ｂ（アマシャム・ファルマシア
社製）、ブルーセファロース６ファーストフロー（アマ
シャム・ファルマシア社製）、ブルーセファロース６ハ
イパフォーマンス（アマシャム・ファルマシア社製）、
マトレックスゲルブルーＡ（アミコン社製）、アフィゲ
ルブルー（Biorad社製）などの商品名で市販されている
ブルーアガロースゲル、またはブルートリスアクリルー
Ｍ（ＬＫＢ社製）ブルーセルロファイン（チッソ社製）
などの商品名で市販されているブルーセファロースゲル
などが適当であり、容易に入手することができる。ブル
ー担体からの溶出は、溶出剤のｐＨ値、イオン強度、疎
水度などによって決定される。例えば、イヌＩＦＮ-γ
の活性を有するタンパク質の場合、中性付近のｐＨで、
イヌＩＦＮ-γ／１６−のホモ２量体、イヌＩＦＮ-γ／
１７−のホモ２量体あるいは高分子のイヌＩＦＮ-γの
活性を有するタンパク質をそれぞれ分離溶出して、高純
度で精製することができる。
【００２５】本発明の製造法で使用されるＩＦＮ-γの
活性を有するタンパク質のカラム担体を用いた精製操作
はそれぞれ単独で行ってもＩＦＮ-γの活性を有するタ
ンパク質の高純度化が可能であるが、好ましくはそれぞ
れを組み合わせて行った方がより効果が高い。例えば、
カイコ生体中で生産したＩＦＮ-γの活性を有するタン
パク質を含む溶液中には、非常に多くのカイコ由来の夾
雑物と他種類のＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質が
含まれるので、上記３つのカラム担体精製を組み合わせ
ることが好ましい。カイコ生体中で生産させたイヌＩＦ
Ｎ-γの活性を有するタンパク質の製造においては、初
段精製に銅キレート担体を、２段目精製にＱセファロー
ス担体を、３段目精製にブルー担体を用いることが好ま
しい。
活性を有するタンパク質のカラム担体を用いた精製操作
はそれぞれ単独で行ってもＩＦＮ-γの活性を有するタ
ンパク質の高純度化が可能であるが、好ましくはそれぞ
れを組み合わせて行った方がより効果が高い。例えば、
カイコ生体中で生産したＩＦＮ-γの活性を有するタン
パク質を含む溶液中には、非常に多くのカイコ由来の夾
雑物と他種類のＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質が
含まれるので、上記３つのカラム担体精製を組み合わせ
ることが好ましい。カイコ生体中で生産させたイヌＩＦ
Ｎ-γの活性を有するタンパク質の製造においては、初
段精製に銅キレート担体を、２段目精製にＱセファロー
ス担体を、３段目精製にブルー担体を用いることが好ま
しい。
【００２６】なお、各カラム担体を用いた精製操作にお
ける、溶出剤の組成、液量などは特に限定されるもので
はなく、最適な分離条件は存在する夾雑タンパク質、Ｉ
ＦＮ-γの活性を有するタンパク質の量、およびカラム
の寸法などに応じて適宜決定される。
ける、溶出剤の組成、液量などは特に限定されるもので
はなく、最適な分離条件は存在する夾雑タンパク質、Ｉ
ＦＮ-γの活性を有するタンパク質の量、およびカラム
の寸法などに応じて適宜決定される。
【００２７】また、本発明の製造法で使用されるＩＦＮ
-γの活性を有するタンパク質の純度は、逆相カラムを
用いたＨＰＬＣによる分析で、９０％以上である。
-γの活性を有するタンパク質の純度は、逆相カラムを
用いたＨＰＬＣによる分析で、９０％以上である。
【００２８】本発明の製造法における、カラム担体を用
いた精製を行う際に、ＩＦＮ-γの活性を有するタンパ
ク質を含む溶液中に界面活性剤が本発明の範囲内での濃
度で添加されても、精製挙動に変化なく高純度に製造す
ることができる。界面活性剤を添加することにより、カ
ラム担体やカラム容器への目的タンパク質の吸着による
ロスを防止でき、高い収率での製造が可能になる。イヌ
ＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質を製造する場合、
界面活性剤としてポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０
が好ましく用いられる。
いた精製を行う際に、ＩＦＮ-γの活性を有するタンパ
ク質を含む溶液中に界面活性剤が本発明の範囲内での濃
度で添加されても、精製挙動に変化なく高純度に製造す
ることができる。界面活性剤を添加することにより、カ
ラム担体やカラム容器への目的タンパク質の吸着による
ロスを防止でき、高い収率での製造が可能になる。イヌ
ＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質を製造する場合、
界面活性剤としてポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０
が好ましく用いられる。
【００２９】本発明の製造法で製造されるＩＦＮ-γの
活性を有するタンパク質を含む組成物は、イヌ疾病の治
療剤として使用できる。本組成物は、皮膚病をはじめ腫
瘍、アレルギー疾患、感染症など免疫能が低下した疾病
などさまざまなイヌの疾病に対して、従来のこれらイヌ
の疾病に対する治療薬や治療方法に比べ、驚くべき顕著
な治療効果および予防効果を示す。
活性を有するタンパク質を含む組成物は、イヌ疾病の治
療剤として使用できる。本組成物は、皮膚病をはじめ腫
瘍、アレルギー疾患、感染症など免疫能が低下した疾病
などさまざまなイヌの疾病に対して、従来のこれらイヌ
の疾病に対する治療薬や治療方法に比べ、驚くべき顕著
な治療効果および予防効果を示す。
【００３０】上記イヌの皮膚病としては、アレルギー性
皮膚炎、免疫介在性皮膚炎、腫瘍性皮膚炎、寄生虫性皮
膚炎、細菌性皮膚炎、真菌性皮膚炎、内分泌疾患、角化
異常などが挙げられる。アレルギー性皮膚炎としては、
例えばアトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、ノミによる皮
膚炎、ダニによる皮膚炎などが挙げられ、免疫介在性皮
膚炎としては、例えば狼瘡、天疱瘡、アカントーシス、
表皮壊死、皮膚血管炎、ブドウ膜炎、悪性脱毛、強皮
症、好酸球性皮膚炎などが挙げられ、寄生虫性皮膚炎と
しては、ノミによる皮膚炎、ダニによる皮膚炎、ウジに
よる皮膚炎、フィラリアによる皮膚炎などが挙げられ、
細菌性皮膚炎としては、例えば膿皮症などが挙げられ、
真菌性皮膚炎としては、例えば表皮性皮膚炎、全身性皮
膚炎などが挙げられ、内分泌疾患としては、例えば甲状
腺皮膚炎、成長ホルモン反応性皮膚炎、エストロゲン性
皮膚炎などが挙げられ、角化異常としては、例えば本態
性脂漏性皮膚炎、脂肪酸欠乏性皮膚炎、亜鉛欠乏性皮膚
炎、ビタミンＡ欠乏性皮膚炎などが挙げられる。イヌの
腫瘍としては、乳腺腫瘍、好酸球性肉芽腫、類表皮腫、
皮膚腫瘍、脂肪腫、耳血腫、肺水腫、皮膚有茎軟腫また
は肛門腫瘍などが挙げられ、イヌの感染症としては、イ
ヌパルボウイルス感染症、ジステンバー感染症などが挙
げられ、そしてアレルギー性疾病としては、イヌの花粉
症などが挙げられる。
皮膚炎、免疫介在性皮膚炎、腫瘍性皮膚炎、寄生虫性皮
膚炎、細菌性皮膚炎、真菌性皮膚炎、内分泌疾患、角化
異常などが挙げられる。アレルギー性皮膚炎としては、
例えばアトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、ノミによる皮
膚炎、ダニによる皮膚炎などが挙げられ、免疫介在性皮
膚炎としては、例えば狼瘡、天疱瘡、アカントーシス、
表皮壊死、皮膚血管炎、ブドウ膜炎、悪性脱毛、強皮
症、好酸球性皮膚炎などが挙げられ、寄生虫性皮膚炎と
しては、ノミによる皮膚炎、ダニによる皮膚炎、ウジに
よる皮膚炎、フィラリアによる皮膚炎などが挙げられ、
細菌性皮膚炎としては、例えば膿皮症などが挙げられ、
真菌性皮膚炎としては、例えば表皮性皮膚炎、全身性皮
膚炎などが挙げられ、内分泌疾患としては、例えば甲状
腺皮膚炎、成長ホルモン反応性皮膚炎、エストロゲン性
皮膚炎などが挙げられ、角化異常としては、例えば本態
性脂漏性皮膚炎、脂肪酸欠乏性皮膚炎、亜鉛欠乏性皮膚
炎、ビタミンＡ欠乏性皮膚炎などが挙げられる。イヌの
腫瘍としては、乳腺腫瘍、好酸球性肉芽腫、類表皮腫、
皮膚腫瘍、脂肪腫、耳血腫、肺水腫、皮膚有茎軟腫また
は肛門腫瘍などが挙げられ、イヌの感染症としては、イ
ヌパルボウイルス感染症、ジステンバー感染症などが挙
げられ、そしてアレルギー性疾病としては、イヌの花粉
症などが挙げられる。
【００３１】本発明の治療剤の投与方法に特に限定はな
いが、注射投与することによってより治療効果が期待で
きる。注射投与方法としては、静脈内投与、筋肉内投
与、皮下投与、腹腔内投与、胸腔内投与いずれの方法で
もよいが、皮下投与が簡便で患犬の負担も軽く好適であ
る。
いが、注射投与することによってより治療効果が期待で
きる。注射投与方法としては、静脈内投与、筋肉内投
与、皮下投与、腹腔内投与、胸腔内投与いずれの方法で
もよいが、皮下投与が簡便で患犬の負担も軽く好適であ
る。
【００３２】また、投与量は、個体の大きさ、投与方
法、症状などに依存して決定されるであろうが、一般に
は、イヌ疾病の症状を改善させるに十分な量を投与すれ
ば良い。例えば、１用量、１日当たり０.００２から１.
０MU／kgのイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質の
投与で十分な効果が得られるが、好ましくは０.００５
から０.５MU／kg の用量が効果および経済的な面から好
ましい。ここにおいて、kg は患畜犬の体重の単位であ
り、Uは、上記イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質
の抗ウイルス活性から決定されるユニット数を表し、ウ
イルスとしてvesicular stomatitis virus （ＶＳ
Ｖ）、感受性細胞としてイヌＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ−３４）細胞を用いて参考文献１０のＣＰＥ法に従っ
て測定した時、ＶＳＶによるイヌＭＤＣＫ細胞の細胞変
性率を５０％防ぐことができるイヌＩＦＮ-γの量が１
ユニットである。
法、症状などに依存して決定されるであろうが、一般に
は、イヌ疾病の症状を改善させるに十分な量を投与すれ
ば良い。例えば、１用量、１日当たり０.００２から１.
０MU／kgのイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質の
投与で十分な効果が得られるが、好ましくは０.００５
から０.５MU／kg の用量が効果および経済的な面から好
ましい。ここにおいて、kg は患畜犬の体重の単位であ
り、Uは、上記イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質
の抗ウイルス活性から決定されるユニット数を表し、ウ
イルスとしてvesicular stomatitis virus （ＶＳ
Ｖ）、感受性細胞としてイヌＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ−３４）細胞を用いて参考文献１０のＣＰＥ法に従っ
て測定した時、ＶＳＶによるイヌＭＤＣＫ細胞の細胞変
性率を５０％防ぐことができるイヌＩＦＮ-γの量が１
ユニットである。
【００３３】また、本発明の治療剤の投与頻度もまた、
個体の大きさ、投与方法、症状などに依存して決定され
るであろうが、通常、週当たり１から２回の投与で、治
療開始から２週目には顕著な症状の改善が認められるで
あろう。また、治療経過を観察しながら投与頻度を増減
することも、投与回数を増減することも可能であるが、
飼い主の負担と治療効果の観点から、１日から７日の間
隔で２から１０回投与することが好ましい。
個体の大きさ、投与方法、症状などに依存して決定され
るであろうが、通常、週当たり１から２回の投与で、治
療開始から２週目には顕著な症状の改善が認められるで
あろう。また、治療経過を観察しながら投与頻度を増減
することも、投与回数を増減することも可能であるが、
飼い主の負担と治療効果の観点から、１日から７日の間
隔で２から１０回投与することが好ましい。
【００３４】また、本治療方法においては、イヌ疾病を
治療するための従来技術による治療剤を組み合わせて補
助的に用いることができる。この場合は、本発明の治療
剤は、抗ヒスタミン剤（ジフェンヒドラミン類）、消炎
剤（塩酸ジブカイン等）、殺虫・殺菌剤（マラチオン、
塩化ベンザルコニウム等）、ステロイド剤（デキサメタ
ゾン等）などから選ばれる他の薬剤と共に投与される。
治療するための従来技術による治療剤を組み合わせて補
助的に用いることができる。この場合は、本発明の治療
剤は、抗ヒスタミン剤（ジフェンヒドラミン類）、消炎
剤（塩酸ジブカイン等）、殺虫・殺菌剤（マラチオン、
塩化ベンザルコニウム等）、ステロイド剤（デキサメタ
ゾン等）などから選ばれる他の薬剤と共に投与される。
【００３５】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。
に説明する。
【００３６】実施例１ イヌＩＦＮ-γの活性を有する
タンパク質を生産する遺伝子組換えカイコ核多角体病ウ
イルスの作製 （１）イヌｃＤＮＡの調製 イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、フィトヘムアグルチ
ニン（ＰＨＡ）を５０μｇ／ｍｌの終濃度で４８時間刺
激した。刺激後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジ−ン（株）
製）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１
ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で
５分間処理した後、１Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加
えた。０．５Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリ
ゴｄＴセルロ−スカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同
緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ ＬｉＣｌを含む
ＴＥにて洗浄後、０．０１％ ＳＤＳを含む２ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶
出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一
本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍ
ｌのミクロ遠心チュ−ブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと
０．５μｇのオリゴｄＴプライマ−（１２−１８ｍｅ
ｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネ−ト処理滅菌水を加
えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベ−トし
たのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ トリス
塩酸（ｐＨ８．４），５００ｍＭ ＫＣｌ溶液を２μ
ｌ，２５ｍＭ ＭｇＣｌ2を２μｌ，１０ｍＭ ｄＮＴ
Ｐを１μｌおよび０．１Ｍ ＤＴＴを２μｌそれぞれ加
え、４２℃で５分間インキュベ−トしたのち、２００ユ
ニットの逆転写酵素（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製、Ｓｕｐｅ
ｒＳｃｒｉｐｔＩＩ）を１μｌ加え、４２℃でさらに５
０分間インキュベ−トしてｃＤＮＡ合成反応を行った。
さらに７０℃で１５分間インキュベ−トして反応を停止
し、氷上に５分間置いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃ
ｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、
３７℃で２０分間インキュベ−トした。 （２）イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質をコー
ドする遺伝子の調製 イヌＩＦＮ-γの塩基配列（参考文献２）をもとに、 ５´ＧＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＡＡＴＴＡＴＡＣＡＡＧＣ
ＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ３´（配列番号：３） と ５´ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧＣＴＣＴ
ＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＡＡ３´（配列番号：４） の２種類のプライマ−を日本バイオサービス（株）に依
頼し合成した。実施例１（１）で得られたｃＤＮＡを
０．５ｍｌのミクロ遠心チュ−ブに２μｌづつ取り、各
プライマ−を２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、２５ｍＭ
ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ ゼラチン、５０μＭ各ｄ
ＮＴＰ、４単位 ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラ−ゼ（宝酒
造（株）製）となるように各試薬を加え、全量１００μ
ｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマ
−のアニ−リング条件を５５℃、２分、プライマ−の伸
長条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍ
ｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサ−マルサイクラ−を用
い、３０サイクル反応させた。これを１％アガロ−スゲ
ルにて電気泳動し、５１７ｂｐのＤＮＡ断片（配列番
号：５）を常法（参考文献９）に従って調製した。この
ＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏ
ｒに宝酒造（株）に常法に従い連結した。これを用いて
常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よ
りプラスミドＤＮＡを常法に従い調製した。次に蛍光Ｄ
ＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケ
ンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従っ
て、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイクル
シーケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片が
イヌＩＦＮ-γをコードするＤＮＡの塩基配列であるこ
とを確認した。
タンパク質を生産する遺伝子組換えカイコ核多角体病ウ
イルスの作製 （１）イヌｃＤＮＡの調製 イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、フィトヘムアグルチ
ニン（ＰＨＡ）を５０μｇ／ｍｌの終濃度で４８時間刺
激した。刺激後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジ−ン（株）
製）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１
ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で
５分間処理した後、１Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加
えた。０．５Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリ
ゴｄＴセルロ−スカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同
緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ ＬｉＣｌを含む
ＴＥにて洗浄後、０．０１％ ＳＤＳを含む２ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶
出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一
本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍ
ｌのミクロ遠心チュ−ブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと
０．５μｇのオリゴｄＴプライマ−（１２−１８ｍｅ
ｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネ−ト処理滅菌水を加
えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベ−トし
たのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ トリス
塩酸（ｐＨ８．４），５００ｍＭ ＫＣｌ溶液を２μ
ｌ，２５ｍＭ ＭｇＣｌ2を２μｌ，１０ｍＭ ｄＮＴ
Ｐを１μｌおよび０．１Ｍ ＤＴＴを２μｌそれぞれ加
え、４２℃で５分間インキュベ−トしたのち、２００ユ
ニットの逆転写酵素（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製、Ｓｕｐｅ
ｒＳｃｒｉｐｔＩＩ）を１μｌ加え、４２℃でさらに５
０分間インキュベ−トしてｃＤＮＡ合成反応を行った。
さらに７０℃で１５分間インキュベ−トして反応を停止
し、氷上に５分間置いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃ
ｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、
３７℃で２０分間インキュベ−トした。 （２）イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質をコー
ドする遺伝子の調製 イヌＩＦＮ-γの塩基配列（参考文献２）をもとに、 ５´ＧＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＡＡＴＴＡＴＡＣＡＡＧＣ
ＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ３´（配列番号：３） と ５´ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧＣＴＣＴ
ＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＡＡ３´（配列番号：４） の２種類のプライマ−を日本バイオサービス（株）に依
頼し合成した。実施例１（１）で得られたｃＤＮＡを
０．５ｍｌのミクロ遠心チュ−ブに２μｌづつ取り、各
プライマ−を２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、２５ｍＭ
ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ ゼラチン、５０μＭ各ｄ
ＮＴＰ、４単位 ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラ−ゼ（宝酒
造（株）製）となるように各試薬を加え、全量１００μ
ｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマ
−のアニ−リング条件を５５℃、２分、プライマ−の伸
長条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍ
ｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサ−マルサイクラ−を用
い、３０サイクル反応させた。これを１％アガロ−スゲ
ルにて電気泳動し、５１７ｂｐのＤＮＡ断片（配列番
号：５）を常法（参考文献９）に従って調製した。この
ＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏ
ｒに宝酒造（株）に常法に従い連結した。これを用いて
常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よ
りプラスミドＤＮＡを常法に従い調製した。次に蛍光Ｄ
ＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケ
ンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従っ
て、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイクル
シーケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片が
イヌＩＦＮ-γをコードするＤＮＡの塩基配列であるこ
とを確認した。
【００３７】次にこのＤＮＡ断片を鋳型として３種類の
プライマーの組合せ（配列番号：６〜１１）で上記と同
様の条件でＰＣＲを行い、３種類のＰＣＲ増幅断片（配
列番号：１２〜１４）を得た。これらを常法に従い回収
し、配列番号：１２に示す断片を制限酵素ＢａｍＨＩお
よびＥｃｏＲＶ で、配列番号：１３に示す断片を制限
酵素ＨｉｎｃＩＩおよびＳｎａｂＩ で、配列番号：１
４に示す断片を制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＥｃｏＲＩ
で、それぞれ切断後、制限酵素処理した配列番号：１２
に示す断片と制限酵素処理した配列番号：１４に示す断
片を混和してｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ部位
へ常法に従い挿入し、組換えベクターを得た。さらにこ
のベクターを制限酵素ＥｃｏＲ Ｖで切断後、配列番
号：１３に示す断片を常法に従い挿入し組換えベクター
を得、挿入されたＤＮＡの塩基配列（配列番号：１５）
を上記と同様にして確認した。その後、制限酵素Ｂａｍ
ＨＩおよびＥｃｏＲＩ で挿入されたＤＮＡを回収し、
これを制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断した
ｐＢＭ０３０に常法に従い挿入して、カイコ発現用組換
えベクターｐＢＭγＳ２(-)を作製した。また、ｐＢＭ
γＳ２(-)を鋳型として配列番号：１６と配列番号：１
７に示すプライマーの組合せ、配列番号：１６と配列番
号：２１に示すプライマーの組合せ、配列番号１６：と
配列番号：２２に示すプライマーの組合せ、配列番号：
１６と配列番号：２３に示すプライマーの組合せ、配列
番号：１６と配列番号：２４に示すプライマーの組合
せ、配列番号：１６と配列番号：２５に示すプライマー
の組合せ、配列番号：１６と配列番号：３８に示すプラ
イマーの組合せ、配列番号：１６と配列番号：３９に示
すプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行い、それぞれ
配列番号：１８、配列番号：２６、配列番号：２７、配
列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列
番号：４０、配列番号：４１に示すＤＮＡ断片を得、こ
れを同様にして制限酵素処理後、ｐＢＭ０３０のＢｇｌ
ＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位に挿入し、それぞれｐＢＭγ
Ｓ２(-)／-２０、ｐＢＭγＳ２(-)／-１６、ｐＢＭγＳ
２(-)／-１５、ｐＢＭγＳ２(-)／-１７、ｐＢＭγＳ２
(-)／-１８、ｐＢＭγＳ２(-)／-１９、ｐＢＭγＳ２
(-)／-１４、ｐＢＭγＳ２(-)／-１３を作製した。ま
た、上記で得られた配列番号：５に示す、改変前のイヌ
ＩＦＮ-γをコードするＤＮＡ断片を同様にして制限酵
素処理後、ｐＢＭ０３０のＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ
部位に挿入し、ｐＢＭγを作製した。 （３）イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質をコー
ドするＤＮＡで組換えられた組換えカイコ核多角体病ウ
イルスの作製 参考文献２の方法で組換えウイルスを作製した。すなわ
ち、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、
０．２８Ｍ ＮａＣｌ、０．７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、
０．７ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4からなる２．５ｍｌの溶液
に、２．５ｍｌのＤＮＡ混合液（０．２５Ｍ ＣａＣｌ
2、カイコ核多角体病ウイルスＢｍＮＰＶＴ３株（参考
文献８）のＤＮＡ１０μｇ、カイコ発現用組換えベクタ
ー６５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌ
を５ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ−１０培地（参
考文献８）中、２５ｃｍ2のフラスコで平面培養した約
３×１０5個のＢｍＮ細胞の培養基に加え、カイコ細胞
にＤＮＡを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換
し、さらに７日間培養後、培養液を回収した。その培養
液を遠心して清澄化した上清を希釈して平面に培養した
ＢＭ−Ｎ細胞の培養基に添加して８日間培養後、顕微鏡
観察によりウイルス感染が見られ、かつ多角体が形成し
ていない培養基を選択した（限界希釈法）。
プライマーの組合せ（配列番号：６〜１１）で上記と同
様の条件でＰＣＲを行い、３種類のＰＣＲ増幅断片（配
列番号：１２〜１４）を得た。これらを常法に従い回収
し、配列番号：１２に示す断片を制限酵素ＢａｍＨＩお
よびＥｃｏＲＶ で、配列番号：１３に示す断片を制限
酵素ＨｉｎｃＩＩおよびＳｎａｂＩ で、配列番号：１
４に示す断片を制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＥｃｏＲＩ
で、それぞれ切断後、制限酵素処理した配列番号：１２
に示す断片と制限酵素処理した配列番号：１４に示す断
片を混和してｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ部位
へ常法に従い挿入し、組換えベクターを得た。さらにこ
のベクターを制限酵素ＥｃｏＲ Ｖで切断後、配列番
号：１３に示す断片を常法に従い挿入し組換えベクター
を得、挿入されたＤＮＡの塩基配列（配列番号：１５）
を上記と同様にして確認した。その後、制限酵素Ｂａｍ
ＨＩおよびＥｃｏＲＩ で挿入されたＤＮＡを回収し、
これを制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断した
ｐＢＭ０３０に常法に従い挿入して、カイコ発現用組換
えベクターｐＢＭγＳ２(-)を作製した。また、ｐＢＭ
γＳ２(-)を鋳型として配列番号：１６と配列番号：１
７に示すプライマーの組合せ、配列番号：１６と配列番
号：２１に示すプライマーの組合せ、配列番号１６：と
配列番号：２２に示すプライマーの組合せ、配列番号：
１６と配列番号：２３に示すプライマーの組合せ、配列
番号：１６と配列番号：２４に示すプライマーの組合
せ、配列番号：１６と配列番号：２５に示すプライマー
の組合せ、配列番号：１６と配列番号：３８に示すプラ
イマーの組合せ、配列番号：１６と配列番号：３９に示
すプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行い、それぞれ
配列番号：１８、配列番号：２６、配列番号：２７、配
列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列
番号：４０、配列番号：４１に示すＤＮＡ断片を得、こ
れを同様にして制限酵素処理後、ｐＢＭ０３０のＢｇｌ
ＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位に挿入し、それぞれｐＢＭγ
Ｓ２(-)／-２０、ｐＢＭγＳ２(-)／-１６、ｐＢＭγＳ
２(-)／-１５、ｐＢＭγＳ２(-)／-１７、ｐＢＭγＳ２
(-)／-１８、ｐＢＭγＳ２(-)／-１９、ｐＢＭγＳ２
(-)／-１４、ｐＢＭγＳ２(-)／-１３を作製した。ま
た、上記で得られた配列番号：５に示す、改変前のイヌ
ＩＦＮ-γをコードするＤＮＡ断片を同様にして制限酵
素処理後、ｐＢＭ０３０のＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ
部位に挿入し、ｐＢＭγを作製した。 （３）イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質をコー
ドするＤＮＡで組換えられた組換えカイコ核多角体病ウ
イルスの作製 参考文献２の方法で組換えウイルスを作製した。すなわ
ち、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、
０．２８Ｍ ＮａＣｌ、０．７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、
０．７ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4からなる２．５ｍｌの溶液
に、２．５ｍｌのＤＮＡ混合液（０．２５Ｍ ＣａＣｌ
2、カイコ核多角体病ウイルスＢｍＮＰＶＴ３株（参考
文献８）のＤＮＡ１０μｇ、カイコ発現用組換えベクタ
ー６５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌ
を５ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ−１０培地（参
考文献８）中、２５ｃｍ2のフラスコで平面培養した約
３×１０5個のＢｍＮ細胞の培養基に加え、カイコ細胞
にＤＮＡを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換
し、さらに７日間培養後、培養液を回収した。その培養
液を遠心して清澄化した上清を希釈して平面に培養した
ＢＭ−Ｎ細胞の培養基に添加して８日間培養後、顕微鏡
観察によりウイルス感染が見られ、かつ多角体が形成し
ていない培養基を選択した（限界希釈法）。
【００３８】限界希釈法を７回繰り返し、組換え体ウイ
ルスをクローニングした。ここで作製したイヌＩＦＮ-
γ変異体をコードするＤＮＡ（配列番号：１、配列番
号：２、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：
３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３
６および配列番号：３７）を含む組換えウイルスをそれ
ぞれｒＢＮＶγＳ２(-)、ｒＢＮＶγＳ２(-)／-２０、
ｒＢＮＶγＳ２(-)／-１６、ｒＢＮＶγＳ２(-)／-１
５、ｒＢＮＶγＳ２(-)／-１７、ｒＢＮＶγＳ２(-)／-
１８およびｒＢＮＶγＳ２(-)／-１９、ｒＢＮＶγＳ２
(-)／-１４、、ｒＢＮＶγＳ２(-)／-１３、イヌＩＦＮ
-γをコードするＤＮＡ（配列番号：５）を含む組換え
ウイルスをｒＢＮＶγとした。
ルスをクローニングした。ここで作製したイヌＩＦＮ-
γ変異体をコードするＤＮＡ（配列番号：１、配列番
号：２、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：
３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３
６および配列番号：３７）を含む組換えウイルスをそれ
ぞれｒＢＮＶγＳ２(-)、ｒＢＮＶγＳ２(-)／-２０、
ｒＢＮＶγＳ２(-)／-１６、ｒＢＮＶγＳ２(-)／-１
５、ｒＢＮＶγＳ２(-)／-１７、ｒＢＮＶγＳ２(-)／-
１８およびｒＢＮＶγＳ２(-)／-１９、ｒＢＮＶγＳ２
(-)／-１４、、ｒＢＮＶγＳ２(-)／-１３、イヌＩＦＮ
-γをコードするＤＮＡ（配列番号：５）を含む組換え
ウイルスをｒＢＮＶγとした。
【００３９】（４）組換え体ウイルス液の調製 ７５ｃｍ2のフラスコ底面で、１５ｍｌの１０％ＦＢＳ
を含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０6個
のＢｍＮ細胞に、前記（３）でクローニングした、それ
ぞれの組換え体ウイルスを含む培養液それぞれ５０μｌ
づつをＢＭ−Ｎ細胞に添加して、２７℃で５日間培養
後、培養液を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、
遠心上清を組換え体ウイルス液として得た。それぞれの
ウイルス液を１０7倍希釈し、その１ｍｌをＢＭ−Ｎ細
胞の培養基に添加して２７℃で７日間培養を続けると、
顕微鏡観察によって培養基のＢＭ−Ｎ細胞にそれぞれウ
イルス感染が認められた。
を含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０6個
のＢｍＮ細胞に、前記（３）でクローニングした、それ
ぞれの組換え体ウイルスを含む培養液それぞれ５０μｌ
づつをＢＭ−Ｎ細胞に添加して、２７℃で５日間培養
後、培養液を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、
遠心上清を組換え体ウイルス液として得た。それぞれの
ウイルス液を１０7倍希釈し、その１ｍｌをＢＭ−Ｎ細
胞の培養基に添加して２７℃で７日間培養を続けると、
顕微鏡観察によって培養基のＢＭ−Ｎ細胞にそれぞれウ
イルス感染が認められた。
【００４０】実施例２ カイコ生体中でのイヌＩＦＮ-
γの活性を有するタンパク質の生産および界面活性剤を
用いた組換えウイルスの不活化 ５令２日目のカイコ幼虫に、実施例１で得たそれぞれの
組換え体ウイルスのウイルス液をそれぞれカイコ１頭づ
つに５０μｌ注射し、２５℃で４日間、市販の人工飼料
（カネボウシルクエレガンス社製）を与えて飼育後、そ
れぞれのカイコの腹部を切り、体液を氷冷したエッペン
ドルフチューブに採取し、遠心分離後の上清を得、０．
２２μｍのフィルターでろ過滅菌し、イヌＩＦＮ-γの
活性を有するタンパク質が生産されたカイコ体液を得
た。
γの活性を有するタンパク質の生産および界面活性剤を
用いた組換えウイルスの不活化 ５令２日目のカイコ幼虫に、実施例１で得たそれぞれの
組換え体ウイルスのウイルス液をそれぞれカイコ１頭づ
つに５０μｌ注射し、２５℃で４日間、市販の人工飼料
（カネボウシルクエレガンス社製）を与えて飼育後、そ
れぞれのカイコの腹部を切り、体液を氷冷したエッペン
ドルフチューブに採取し、遠心分離後の上清を得、０．
２２μｍのフィルターでろ過滅菌し、イヌＩＦＮ-γの
活性を有するタンパク質が生産されたカイコ体液を得
た。
【００４１】こうして得られたイヌＩＦＮ-γの活性を
有するタンパク質が生産されたカイコ体液抽出液中に含
まれる組換えウイルスの不活化を検討した。ポリオキシ
エチレン硬化ヒマシ油６０（日本サーファクタント工業
（株）製）をそれぞれ３％づつ添加し、３７℃で３０分
インキュベートした。
有するタンパク質が生産されたカイコ体液抽出液中に含
まれる組換えウイルスの不活化を検討した。ポリオキシ
エチレン硬化ヒマシ油６０（日本サーファクタント工業
（株）製）をそれぞれ３％づつ添加し、３７℃で３０分
インキュベートした。
【００４２】インキュベート後のそれぞれの溶液を、２
５ｃｍ2のフラスコ底面で、５ｍｌの１０％ＦＢＳを含
むＴＣ−１０培地中で平面培養した約１×１０6個のＢ
ｍＮ細胞の培養液に、それぞれ２００μｌづつ添加し
て、２７℃で１０日間培養後、顕微鏡観察を行ったとこ
ろ、すべて培養基のＢＭ−Ｎ細胞にウイルス感染は全く
認められなかった。
５ｃｍ2のフラスコ底面で、５ｍｌの１０％ＦＢＳを含
むＴＣ−１０培地中で平面培養した約１×１０6個のＢ
ｍＮ細胞の培養液に、それぞれ２００μｌづつ添加し
て、２７℃で１０日間培養後、顕微鏡観察を行ったとこ
ろ、すべて培養基のＢＭ−Ｎ細胞にウイルス感染は全く
認められなかった。
【００４３】実施例３ ウエスタンブロッティングによ
るイヌＩＦＮ-γの検出 （１）抗イヌＩＦＮ-γポリクローナル抗体の作製 実施例１（２）で得られた配列番号：５に示すＤＮＡ断
片を鋳型として、２種類のプライマー（配列番号：１９
および配列番号：２０）を用いて、ＤＮＡの変性条件を
９４℃，１分、プライマ−のアニ−リング条件を５５
℃、２分、プライマ−の伸長条件を７２℃、３分の各条
件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡ
サ−マルサイクラ−を用い、３０サイクルでＰＣＲを行
い、約５００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。これを制限酵素
ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、同様に制限酵素Ｎ
ｃｏＩおよびＢａｍＨＩで処理した大腸菌発現ベクター
ｐＥＴ８ｃに連結した。これを用いて大腸菌ＨＢ１０１
を形質転換しプラスミドを抽出、精製後、これを用いて
さらに大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。この形質転換体
を１ＬのＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００ が約０．７に
なるまで３７℃で培養し、終濃度０．５ｍＭのイソプロ
ピルーβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（アマシャムフ
ァルマシアバイオテク（株）製）を加えて、さらに１．
５時間培養した。培養後、培養液を６０００ｇで１０分
間遠心後、上清を捨て、５０ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７）に懸濁し、氷上にてハンディーソニックを
用いて菌体を破砕した。１００００ｇで３０分間遠心
し、可溶性画分（上清）を得た。この画分をスルホプロ
ピル担体（アマシャムファルマシアバイオテク（株）
製）を充填したカラムにアプライした後、十分量の２０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）でカラムを洗浄し、０．５
〜１ＭのＮａＣｌで溶出して得られた吸着画分をさらに
ブルーセファロース担体（アマシャムファルマシアバイ
オテク（株）製）を充填したカラムにアプライし、同様
にして洗浄後、１〜１．５ＭのＮａＣｌで溶出して得ら
れた吸着画分を得た。得られた画分を透析によって脱塩
して、精製した大腸菌生産イヌＩＦＮ-γを得た。ドデ
シル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）解析によると、この画分中のイヌ
ＩＦＮ-γの純度は９０％以上であった。この精製した
イヌＩＦＮ-γ５ｍｇをウサギ１頭の腹腔に注入し４週
間後、イヌＩＦＮ-γに対するポリクローナル抗体が産
生された血清を得た。
るイヌＩＦＮ-γの検出 （１）抗イヌＩＦＮ-γポリクローナル抗体の作製 実施例１（２）で得られた配列番号：５に示すＤＮＡ断
片を鋳型として、２種類のプライマー（配列番号：１９
および配列番号：２０）を用いて、ＤＮＡの変性条件を
９４℃，１分、プライマ−のアニ−リング条件を５５
℃、２分、プライマ−の伸長条件を７２℃、３分の各条
件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡ
サ−マルサイクラ−を用い、３０サイクルでＰＣＲを行
い、約５００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。これを制限酵素
ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、同様に制限酵素Ｎ
ｃｏＩおよびＢａｍＨＩで処理した大腸菌発現ベクター
ｐＥＴ８ｃに連結した。これを用いて大腸菌ＨＢ１０１
を形質転換しプラスミドを抽出、精製後、これを用いて
さらに大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。この形質転換体
を１ＬのＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００ が約０．７に
なるまで３７℃で培養し、終濃度０．５ｍＭのイソプロ
ピルーβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（アマシャムフ
ァルマシアバイオテク（株）製）を加えて、さらに１．
５時間培養した。培養後、培養液を６０００ｇで１０分
間遠心後、上清を捨て、５０ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７）に懸濁し、氷上にてハンディーソニックを
用いて菌体を破砕した。１００００ｇで３０分間遠心
し、可溶性画分（上清）を得た。この画分をスルホプロ
ピル担体（アマシャムファルマシアバイオテク（株）
製）を充填したカラムにアプライした後、十分量の２０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）でカラムを洗浄し、０．５
〜１ＭのＮａＣｌで溶出して得られた吸着画分をさらに
ブルーセファロース担体（アマシャムファルマシアバイ
オテク（株）製）を充填したカラムにアプライし、同様
にして洗浄後、１〜１．５ＭのＮａＣｌで溶出して得ら
れた吸着画分を得た。得られた画分を透析によって脱塩
して、精製した大腸菌生産イヌＩＦＮ-γを得た。ドデ
シル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）解析によると、この画分中のイヌ
ＩＦＮ-γの純度は９０％以上であった。この精製した
イヌＩＦＮ-γ５ｍｇをウサギ１頭の腹腔に注入し４週
間後、イヌＩＦＮ-γに対するポリクローナル抗体が産
生された血清を得た。
【００４４】（２）ウエスタンブロッティング 実施例１（３）で得たすべての組換えウイルスをそれぞ
れカイコ幼虫に注射し、、実施例２と同様の操作法にて
それぞれのイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質が
生産されたカイコ体液抽出液を得た。それぞれのカイコ
体液中のイヌＩＦＮ-γをウエスタンブロッティング法
によって検出した。それぞれの体液をアトー（株）製の
パジェル中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、アト
ー（株）製のクリアブロットメンブランに常法に従って
ブロッティング後、メンブランを、上記（１）で得られ
た抗イヌＩＦＮ-γポリクローナル抗体を含むウサギ血
清を含むブロックエース（大日本製薬（株）製）溶液に
６時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢ
Ｓにて３回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
ウサギＩｇＧ（バイオラット（株）製）を含むブロック
エース溶液に６時間反応させ、同様に洗浄した後、コニ
カ（株）製のコニカイムノステインＨＲＰ１０００にて
発色を行った。その結果、改変前のイヌＩＦＮ-γが生
産されたカイコ体液は検出されたイヌＩＦＮ-γのバン
ドが５本であったのに対して、イヌＩＦＮ-γ変異体が
生産されたカイコ体液は１ー２本であり、２本のもので
は１本がメジャーなバンドであった。
れカイコ幼虫に注射し、、実施例２と同様の操作法にて
それぞれのイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質が
生産されたカイコ体液抽出液を得た。それぞれのカイコ
体液中のイヌＩＦＮ-γをウエスタンブロッティング法
によって検出した。それぞれの体液をアトー（株）製の
パジェル中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、アト
ー（株）製のクリアブロットメンブランに常法に従って
ブロッティング後、メンブランを、上記（１）で得られ
た抗イヌＩＦＮ-γポリクローナル抗体を含むウサギ血
清を含むブロックエース（大日本製薬（株）製）溶液に
６時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢ
Ｓにて３回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
ウサギＩｇＧ（バイオラット（株）製）を含むブロック
エース溶液に６時間反応させ、同様に洗浄した後、コニ
カ（株）製のコニカイムノステインＨＲＰ１０００にて
発色を行った。その結果、改変前のイヌＩＦＮ-γが生
産されたカイコ体液は検出されたイヌＩＦＮ-γのバン
ドが５本であったのに対して、イヌＩＦＮ-γ変異体が
生産されたカイコ体液は１ー２本であり、２本のもので
は１本がメジャーなバンドであった。
【００４５】実施例４ 活性測定 実施例３（２）で得られたそれぞれのカイコ体液中のイ
ヌＩＦＮ-γの活性を測定した。活性は抗ウイルス活性
測定法により行った。ウイルスとしてＶｅｓｉｃｕｌａ
ｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ，感受性細胞と
してイヌＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）を用い、
参考文献１０のＣＰＥ法に従って抗ウイルス活性を測定
した。すなわち、９６穴マイクロプレート上にコンフル
ーエントとなるまで３７℃で培養されたイヌＭＤＣＫ
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）細胞にイヌＩＦＮ-γを含
むサンプルの希釈液を加え、さらに、３７℃で２０時間
から２４時間培養し抗ウイルス活性を誘導させた。ＶＳ
Ｖを加え３７℃で２４時間培養した後、生存してマイク
ロプレート上に付着しているイヌＭＤＣＫ細胞を２０％
ホルマリンを含むクリスタルバイオレット染色液で染色
した。マイクロプレート上のクリスタルバイオレットの
量を５７０nm における吸光度を測定することによっ
て、細胞を５０％生存させる時のイヌＩＦＮ-γの量を
求めた。この時のイヌＩＦＮ-γの量を、抗ウイルス活
性１ユニット（１Ｕ）と定義した。活性測定の結果、改
変前のイヌＩＦＮ-γが生産されたカイコ体液は約２×
１０7Ｕ／ｍｌであったのに対し、イヌＩＦＮ-γ変異体
が生産されたカイコ体液はすべて約４×１０7Ｕ／ｍｌ
と遺伝子改変前の約２倍の抗ウイルス活性が得られた。
ヌＩＦＮ-γの活性を測定した。活性は抗ウイルス活性
測定法により行った。ウイルスとしてＶｅｓｉｃｕｌａ
ｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ，感受性細胞と
してイヌＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）を用い、
参考文献１０のＣＰＥ法に従って抗ウイルス活性を測定
した。すなわち、９６穴マイクロプレート上にコンフル
ーエントとなるまで３７℃で培養されたイヌＭＤＣＫ
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）細胞にイヌＩＦＮ-γを含
むサンプルの希釈液を加え、さらに、３７℃で２０時間
から２４時間培養し抗ウイルス活性を誘導させた。ＶＳ
Ｖを加え３７℃で２４時間培養した後、生存してマイク
ロプレート上に付着しているイヌＭＤＣＫ細胞を２０％
ホルマリンを含むクリスタルバイオレット染色液で染色
した。マイクロプレート上のクリスタルバイオレットの
量を５７０nm における吸光度を測定することによっ
て、細胞を５０％生存させる時のイヌＩＦＮ-γの量を
求めた。この時のイヌＩＦＮ-γの量を、抗ウイルス活
性１ユニット（１Ｕ）と定義した。活性測定の結果、改
変前のイヌＩＦＮ-γが生産されたカイコ体液は約２×
１０7Ｕ／ｍｌであったのに対し、イヌＩＦＮ-γ変異体
が生産されたカイコ体液はすべて約４×１０7Ｕ／ｍｌ
と遺伝子改変前の約２倍の抗ウイルス活性が得られた。
【００４６】実施例５ 各イヌＩＦＮγの活性を有する
タンパク質の大腸菌での生産 実施例１（２）で得られたｐＢＭγＳ２(-)を鋳型とし
て配列番号：１９と配列番号：２０に示すプライマーの
組合せ、配列番号：１９と配列番号：４２に示すプライ
マーの組合せ、配列番号１９：と配列番号：４３に示す
プライマーの組合せ、配列番号：１９と配列番号：４４
に示すプライマーの組合せ、配列番号：１９と配列番
号：４５に示すプライマーの組合せ、配列番号：１９と
配列番号：４６に示すプライマーの組合せ、配列番号：
１９と配列番号：４７に示すプライマーの組合せ、配列
番号：１９と配列番号：４８に示すプライマーの組合
せ、配列番号：１９と配列番号：４９に示すプライマー
の組合せ、配列番号：１９と配列番号：５０に示すプラ
イマーの組合せを用いてＰＣＲを行い、それぞれ配列番
号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番
号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６、配列番
号：５７、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番
号：６０に示すＤＮＡ断片を得、これらを制限酵素Ｎｃ
ｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、同様に制限酵素Ｎｃｏ
ＩおよびＢａｍＨＩで処理した大腸菌発現ベクターｐＥ
Ｔ８ｃに連結し、それぞれｐＥＴγＳ２(-)、ｐＥＴγ
Ｓ２(-)／-２０、ｐＥＴγＳ２(-)／-１６、ｐＥＴγＳ
２(-)／-１５、ｐＥＴγＳ２(-)／-１７、ｐＥＴγＳ２
(-)／-１８、ｐＥＴγＳ２(-)／-１９、ｐＥＴγＳ２
(-)／-１４、ｐＥＴγＳ２(-)／-１３、ｐＥＴγＳ２
(-)／-２１を作製した。これらの組換えベクターはイヌ
ＩＦＮγ変異体のＣ末端アミノ酸の欠損数がそれぞれ
０、２０、１６、１５、１７、１８、１９、１４、１
３、２１となるようにコードされた遺伝子配列を有す
る。これらを用いて大腸菌ＨＢ１０１を形質転換しプラ
スミドを抽出、精製後、これを用いてさらに大腸菌ＢＬ
２１を形質転換した。この形質転換体をそれぞれ１０ｍ
ＬのＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００ が約０．７になる
まで３７℃で培養し、終濃度０．５ｍＭのイソプロピル
ーβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（アマシャムファル
マシアバイオテク（株）製）を加えて、さらに１．５時
間培養した。培養後、培養液を６０００ｇで１０分間遠
心後、上清を捨て、ベーリンガーマンハイム（株）製の
各プロテアーゼインヒビター（E64(10μg/ml)、Leupept
in(0.5μg/ml)、PMSF(170μg/ml、Aprotinin(50/μg/m
l)、Chymostatin(60/μg/ml)、EDTA-Na2(0.5μg/ml)）
を含む５０ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸
濁し、氷上にてハンディーソニックを用いて菌体を破砕
した。１００００ｇで３０分間遠心し、Ｃ末端アミノ酸
の欠損数が異なる各イヌＩＦＮ-γ変異体が生産された
可溶性画分（上清）を得た。
タンパク質の大腸菌での生産 実施例１（２）で得られたｐＢＭγＳ２(-)を鋳型とし
て配列番号：１９と配列番号：２０に示すプライマーの
組合せ、配列番号：１９と配列番号：４２に示すプライ
マーの組合せ、配列番号１９：と配列番号：４３に示す
プライマーの組合せ、配列番号：１９と配列番号：４４
に示すプライマーの組合せ、配列番号：１９と配列番
号：４５に示すプライマーの組合せ、配列番号：１９と
配列番号：４６に示すプライマーの組合せ、配列番号：
１９と配列番号：４７に示すプライマーの組合せ、配列
番号：１９と配列番号：４８に示すプライマーの組合
せ、配列番号：１９と配列番号：４９に示すプライマー
の組合せ、配列番号：１９と配列番号：５０に示すプラ
イマーの組合せを用いてＰＣＲを行い、それぞれ配列番
号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番
号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６、配列番
号：５７、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番
号：６０に示すＤＮＡ断片を得、これらを制限酵素Ｎｃ
ｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、同様に制限酵素Ｎｃｏ
ＩおよびＢａｍＨＩで処理した大腸菌発現ベクターｐＥ
Ｔ８ｃに連結し、それぞれｐＥＴγＳ２(-)、ｐＥＴγ
Ｓ２(-)／-２０、ｐＥＴγＳ２(-)／-１６、ｐＥＴγＳ
２(-)／-１５、ｐＥＴγＳ２(-)／-１７、ｐＥＴγＳ２
(-)／-１８、ｐＥＴγＳ２(-)／-１９、ｐＥＴγＳ２
(-)／-１４、ｐＥＴγＳ２(-)／-１３、ｐＥＴγＳ２
(-)／-２１を作製した。これらの組換えベクターはイヌ
ＩＦＮγ変異体のＣ末端アミノ酸の欠損数がそれぞれ
０、２０、１６、１５、１７、１８、１９、１４、１
３、２１となるようにコードされた遺伝子配列を有す
る。これらを用いて大腸菌ＨＢ１０１を形質転換しプラ
スミドを抽出、精製後、これを用いてさらに大腸菌ＢＬ
２１を形質転換した。この形質転換体をそれぞれ１０ｍ
ＬのＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００ が約０．７になる
まで３７℃で培養し、終濃度０．５ｍＭのイソプロピル
ーβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（アマシャムファル
マシアバイオテク（株）製）を加えて、さらに１．５時
間培養した。培養後、培養液を６０００ｇで１０分間遠
心後、上清を捨て、ベーリンガーマンハイム（株）製の
各プロテアーゼインヒビター（E64(10μg/ml)、Leupept
in(0.5μg/ml)、PMSF(170μg/ml、Aprotinin(50/μg/m
l)、Chymostatin(60/μg/ml)、EDTA-Na2(0.5μg/ml)）
を含む５０ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸
濁し、氷上にてハンディーソニックを用いて菌体を破砕
した。１００００ｇで３０分間遠心し、Ｃ末端アミノ酸
の欠損数が異なる各イヌＩＦＮ-γ変異体が生産された
可溶性画分（上清）を得た。
【００４７】実施例６ 各イヌＩＦＮ-γの活性を有す
るタンパク質の活性比較 実施例５で作製したＣ末端アミノ酸の欠損数が異なる各
イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質の活性の検証
を行った。抗ウイルス活性は、Ｃ末端アミノ酸の欠損数
が２１のもののみ活性が認められなかった。その他の各
イヌＩＦＮγの活性を有するタンパク質はそれぞれ約１
０7Ｕ／ｍｌの活性が認められた。
るタンパク質の活性比較 実施例５で作製したＣ末端アミノ酸の欠損数が異なる各
イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質の活性の検証
を行った。抗ウイルス活性は、Ｃ末端アミノ酸の欠損数
が２１のもののみ活性が認められなかった。その他の各
イヌＩＦＮγの活性を有するタンパク質はそれぞれ約１
０7Ｕ／ｍｌの活性が認められた。
【００４８】また、免疫増強活性に関しても検証を行っ
た。クラスＩＩＭＨＣを発現したイヌ乳腺腫瘍組織由来
細胞株ＦＣＢＲ１（参考文献１１）を用いて、上記の各
イヌＩＦＮγ変異体のクラスＩＩＭＨＣの発現増強活性
を測定した。６ｃｍディッシュに、１０5個のＦＣＢＲ
１を接着させ、これに上記の各培養液１００μｌを添加
し、５％ＣＯ2、３７℃の各条件で１晩培養した。培養
後、トリプシンにて細胞を剥離し、１．５ｍｌのミクロ
遠心チューブにて遠心した。これに、１０μｌのラット
抗イヌクラスＩＩＭＨＣモノクローナル抗体（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ社製）を添加し、さらに５０μｌの１０％
ＦＢＳ−ＥＲＤＦで懸濁し、氷上で１時間静置した。Ｐ
ＢＳで洗浄した後、５μｌのＦＩＴＣ標識ラビット抗ラ
ットモノクローナル抗体（セロテック社製）および５０
μｌの１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで懸濁し、氷上で１時間
静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン
（株）のＦＡＣＳｃａｎにて解析した。その結果、Ｃ末
端アミノ酸の欠損数が２１のもののみ活性が認められ
ず、それ以外のイヌＩＦＮγの活性を有するタンパク質
はすべてＦＣＢＲ１上のクラスＩＩＭＨＣの発現量を約
８０％上昇させた。
た。クラスＩＩＭＨＣを発現したイヌ乳腺腫瘍組織由来
細胞株ＦＣＢＲ１（参考文献１１）を用いて、上記の各
イヌＩＦＮγ変異体のクラスＩＩＭＨＣの発現増強活性
を測定した。６ｃｍディッシュに、１０5個のＦＣＢＲ
１を接着させ、これに上記の各培養液１００μｌを添加
し、５％ＣＯ2、３７℃の各条件で１晩培養した。培養
後、トリプシンにて細胞を剥離し、１．５ｍｌのミクロ
遠心チューブにて遠心した。これに、１０μｌのラット
抗イヌクラスＩＩＭＨＣモノクローナル抗体（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ社製）を添加し、さらに５０μｌの１０％
ＦＢＳ−ＥＲＤＦで懸濁し、氷上で１時間静置した。Ｐ
ＢＳで洗浄した後、５μｌのＦＩＴＣ標識ラビット抗ラ
ットモノクローナル抗体（セロテック社製）および５０
μｌの１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで懸濁し、氷上で１時間
静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン
（株）のＦＡＣＳｃａｎにて解析した。その結果、Ｃ末
端アミノ酸の欠損数が２１のもののみ活性が認められ
ず、それ以外のイヌＩＦＮγの活性を有するタンパク質
はすべてＦＣＢＲ１上のクラスＩＩＭＨＣの発現量を約
８０％上昇させた。
【００４９】これらのことから、イヌＩＦＮ-γは、Ｃ
末端アミノ酸の欠損数が２０まではそれぞれ同等の生物
活性を有し、Ｃ末端アミノ酸の欠損数が２１以上になる
と活性が喪失することが明らかになった。従って、ｉｎ
ｖｉｖｏにおいても、Ｃ末端アミノ酸の欠損数が２０
までは各イヌＩＦＮ-γは種々のイヌ疾病に対して、同
等の薬効を示すものと考えられる。
末端アミノ酸の欠損数が２０まではそれぞれ同等の生物
活性を有し、Ｃ末端アミノ酸の欠損数が２１以上になる
と活性が喪失することが明らかになった。従って、ｉｎ
ｖｉｖｏにおいても、Ｃ末端アミノ酸の欠損数が２０
までは各イヌＩＦＮ-γは種々のイヌ疾病に対して、同
等の薬効を示すものと考えられる。
【００５０】実施例７ カイコ生体中で生産したイヌＩ
ＦＮ-γの活性を有するタンパク質の精製 ５令２日目のカイコ幼虫に、実施例１で得た組換え体ウ
イルスｒＢＮＶγＳ２(-)のウイルス液をカイコ１００
頭に２μｌ／頭づつ注射し、２５℃で４日間、市販の人
工飼料（カネボウシルクエレガンス社製）を与えて飼育
した。飼育後、４５０ｍｌの抽出液（２０ｍＭ酢酸ナ
トリウム、０．０１％塩化ベンザルコニウム、ｐＨ：
５．５）および４５０ｍｌの抽出液（２０ｍＭ酢酸ナ
トリウム、２．５ｍＭＥＤＴＡ、０．０１％塩化ベンザ
ルコニウム、ｐＨ：５．５）にそれぞれ５０頭づつのカ
イコを腹部を切って添加し、１晩静置した。カイコの死
骸を取り除き、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し
た後、その上清をフィルター（ウルチポア ＧＦ ＰＬＵ
Ｓ，ＰＡＬＬ社製）でろ過し、イヌＩＦＮ-γの活性を
有するタンパク質が生産されたカイコ体液抽出液およ
びカイコ体液抽出液を得た。これらのカイコ体液抽出
液を用いて、まず精製初段にＣｕキレート担体を用いて
精製を行った。担体は、Chelating Sepharose Fast Flo
w（Amersham-Pharmacia社製）に１％硫酸銅水溶液を用
いて銅イオンを結合させ、調製した。精製はまず、カイ
コ体液抽出液を用いて検討を行った。抽出液はｐＨ値
を５．５に調製し、Ｃｕキレート担体にアプライした。
担体の容量は抽出液と等量とし、アプライ後の洗浄は２
０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ：５．５）にてＵＶ吸収がなく
なるまで十分に行った。カラムに吸着したタンパク質の
溶出は塩化アンモニウムの塩濃度を１Ｍまで段階的に上
げて行い、またそれでも溶出されないタンパク質は０．
１ＭのＥＤＴＡおよび０．１ＮのＮａＯＨを用いて溶出
した。各フラクションのイヌＩＦＮ-γの活性を有する
タンパク質および夾雑タンパクの検出はウエスタンブロ
ッティング、銀染色およびＨＰＬＣにて行った。その結
果、低分子のイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質
は非吸着画分に銀染色にてイヌＩＦＮ-γのバンドがク
リアに検出でき、夾雑タンパク質はほとんど除去されて
いた。なお、その他の画分には低分子のイヌＩＦＮ-γ
は全く検出されなかった。また、高分子のイヌＩＦＮ-
γは非吸着画分には検出されず、０．１〜０．６Ｍ塩化
アンモニウム溶出画分において検出された。なお、この
画分にも夾雑タンパク質はほとんど検出されなかった。
さらに０．１ＭのＥＤＴＡおよび０．１ＮのＮａＯＨを
用いて溶出した画分に夾雑タンパク質が検出され、ここ
にはイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質は全く検
出されなかった。
ＦＮ-γの活性を有するタンパク質の精製 ５令２日目のカイコ幼虫に、実施例１で得た組換え体ウ
イルスｒＢＮＶγＳ２(-)のウイルス液をカイコ１００
頭に２μｌ／頭づつ注射し、２５℃で４日間、市販の人
工飼料（カネボウシルクエレガンス社製）を与えて飼育
した。飼育後、４５０ｍｌの抽出液（２０ｍＭ酢酸ナ
トリウム、０．０１％塩化ベンザルコニウム、ｐＨ：
５．５）および４５０ｍｌの抽出液（２０ｍＭ酢酸ナ
トリウム、２．５ｍＭＥＤＴＡ、０．０１％塩化ベンザ
ルコニウム、ｐＨ：５．５）にそれぞれ５０頭づつのカ
イコを腹部を切って添加し、１晩静置した。カイコの死
骸を取り除き、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し
た後、その上清をフィルター（ウルチポア ＧＦ ＰＬＵ
Ｓ，ＰＡＬＬ社製）でろ過し、イヌＩＦＮ-γの活性を
有するタンパク質が生産されたカイコ体液抽出液およ
びカイコ体液抽出液を得た。これらのカイコ体液抽出
液を用いて、まず精製初段にＣｕキレート担体を用いて
精製を行った。担体は、Chelating Sepharose Fast Flo
w（Amersham-Pharmacia社製）に１％硫酸銅水溶液を用
いて銅イオンを結合させ、調製した。精製はまず、カイ
コ体液抽出液を用いて検討を行った。抽出液はｐＨ値
を５．５に調製し、Ｃｕキレート担体にアプライした。
担体の容量は抽出液と等量とし、アプライ後の洗浄は２
０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ：５．５）にてＵＶ吸収がなく
なるまで十分に行った。カラムに吸着したタンパク質の
溶出は塩化アンモニウムの塩濃度を１Ｍまで段階的に上
げて行い、またそれでも溶出されないタンパク質は０．
１ＭのＥＤＴＡおよび０．１ＮのＮａＯＨを用いて溶出
した。各フラクションのイヌＩＦＮ-γの活性を有する
タンパク質および夾雑タンパクの検出はウエスタンブロ
ッティング、銀染色およびＨＰＬＣにて行った。その結
果、低分子のイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質
は非吸着画分に銀染色にてイヌＩＦＮ-γのバンドがク
リアに検出でき、夾雑タンパク質はほとんど除去されて
いた。なお、その他の画分には低分子のイヌＩＦＮ-γ
は全く検出されなかった。また、高分子のイヌＩＦＮ-
γは非吸着画分には検出されず、０．１〜０．６Ｍ塩化
アンモニウム溶出画分において検出された。なお、この
画分にも夾雑タンパク質はほとんど検出されなかった。
さらに０．１ＭのＥＤＴＡおよび０．１ＮのＮａＯＨを
用いて溶出した画分に夾雑タンパク質が検出され、ここ
にはイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質は全く検
出されなかった。
【００５１】次にカイコ体液抽出液を用いて検討を行
った。本体液抽出液中にはＥＤＴＡが含有しており、そ
のままＣｕキレート担体にアプライするとＣｕイオンが
破荷してしまい精製不能となるため、まず限外ろ過によ
り、ＥＤＴＡを除いた。限外ろ過はＡｍｉｃｏｎ社のＨ
ＯＬＬＯＷ ＦＩＢＥＲ ＣＡＲＴＲＩＤＧＥ（TYPE:HOP
10-20）を用い、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ：５．５）に置換した。以降はカイコ体液抽出液と
同様の操作を行って、同様の結果が得られた。
った。本体液抽出液中にはＥＤＴＡが含有しており、そ
のままＣｕキレート担体にアプライするとＣｕイオンが
破荷してしまい精製不能となるため、まず限外ろ過によ
り、ＥＤＴＡを除いた。限外ろ過はＡｍｉｃｏｎ社のＨ
ＯＬＬＯＷ ＦＩＢＥＲ ＣＡＲＴＲＩＤＧＥ（TYPE:HOP
10-20）を用い、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ：５．５）に置換した。以降はカイコ体液抽出液と
同様の操作を行って、同様の結果が得られた。
【００５２】このように、初段にＣｕキレート担体を用
いた精製法によって、カイコ由来夾雑タンパクの大部分
を除去し、低分子のイヌＩＦＮ-γと高分子のイヌＩＦ
Ｎ-γも分画できた。
いた精製法によって、カイコ由来夾雑タンパクの大部分
を除去し、低分子のイヌＩＦＮ-γと高分子のイヌＩＦ
Ｎ-γも分画できた。
【００５３】上記の２種類の初段Ｃｕキレート精製液を
用いて２段目精製にＱセファロース担体を用いて、低分
子イヌＩＦＮ-γの分画を検討した。精製はｐＨ：９で
行った。初段Ｃｕキレート精製液をそれぞれ限外ろ過に
て２０ｍＭのグリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ：９）に置
換し、担体にアプライした。限外ろ過はＡＤＶＡＮＴＥ
Ｃ社のＦＩＬＴＥＲ ＨＯＬＤＥＲ（MODEL: UHP-43Kお
よびUHP-76K）（装置）およびＡｍｉｃｏｎ社のＹＭ１
０（膜）をそれぞれ用いた。窒素ボンベの圧力は1.2〜
1.5kg/cm2で行った。なお、各操作は装置を氷冷しなが
ら行った。溶出はＮａＣｌの濃度を１Ｍまで５ｍＭ刻み
で行った。その結果、カイコ体液抽出液由来の初段Ｃ
ｕキレート精製液およびカイコ体液抽出液由来の初段
Ｃｕキレート精製液どちらの精製液を用いた場合も、２
０〜２５ｍＭ（画分），３０〜３５ｍＭ（画分）お
よび４０〜５０ｍＭ（画分）の各ＮａＣｌ濃度の溶出
画分でイヌＩＦＮ-γが溶出された（ウエスタンブロッ
ティング）。なおその他の溶出画分およびアルカリ洗浄
画分ではイヌＩＦＮγは検出されなかった。
用いて２段目精製にＱセファロース担体を用いて、低分
子イヌＩＦＮ-γの分画を検討した。精製はｐＨ：９で
行った。初段Ｃｕキレート精製液をそれぞれ限外ろ過に
て２０ｍＭのグリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ：９）に置
換し、担体にアプライした。限外ろ過はＡＤＶＡＮＴＥ
Ｃ社のＦＩＬＴＥＲ ＨＯＬＤＥＲ（MODEL: UHP-43Kお
よびUHP-76K）（装置）およびＡｍｉｃｏｎ社のＹＭ１
０（膜）をそれぞれ用いた。窒素ボンベの圧力は1.2〜
1.5kg/cm2で行った。なお、各操作は装置を氷冷しなが
ら行った。溶出はＮａＣｌの濃度を１Ｍまで５ｍＭ刻み
で行った。その結果、カイコ体液抽出液由来の初段Ｃ
ｕキレート精製液およびカイコ体液抽出液由来の初段
Ｃｕキレート精製液どちらの精製液を用いた場合も、２
０〜２５ｍＭ（画分），３０〜３５ｍＭ（画分）お
よび４０〜５０ｍＭ（画分）の各ＮａＣｌ濃度の溶出
画分でイヌＩＦＮ-γが溶出された（ウエスタンブロッ
ティング）。なおその他の溶出画分およびアルカリ洗浄
画分ではイヌＩＦＮγは検出されなかった。
【００５４】イヌＩＦＮ-γが溶出されたそれぞれの画
分をＨＰＬＣで解析した。ＨＰＬＣ解析は、装置はＨＰ
ＬＣシステム（島津ＬＣ−１０ＡＤ）を、カラムはコス
モシール５Ｃ１８ ＡＲ-３００（ナカライテスク社製）
を用いた。移動相Ａに０．０５％トリフルオロ酢酸水溶
液を用い、移動相Ｂには０．０５％トリフルオロ酢酸を
含む１００％アセトニトリルを用いた。流速は１ml/min
とし、ピークの検出は２１０ｎｍで行った。溶出は移動
相Ｂのリニアグラジェント（０分：４０％移動相Ｂ、３
０分：４６％移動相Ｂ）で行った。その結果、画分に
おけるメインピークはリテンションタイムが約２８分、
画分におけるメインピークはリテンションタイムが約
２８分と約２９分、画分におけるメインピ ークはリ
テンションタイムが約２９分であった。それぞれのメイ
ンピークを分取し、構造解析を行った。分子量はTOF-MA
Sによって測定し、Ｃ末端アミノ酸配列は臭化シアン分
解後、ペプチドマッピングを行い、得られたＣ末端ペプ
チドをエドマン分解法によって決定した。その結果、画
分におけるリテンションタイムが約２８分のメインピ
ークはＣ末端が１６アミノ酸残基欠損したイヌＩＦＮγ
／１６ーであり、画分におけるリテンションタイムが
約２８分のメインピークと約２９分のメインピークはそ
れぞれＣ末端が１６アミノ酸残基欠損したイヌＩＦＮγ
／１６ーとＣ末端が１７アミノ酸残基欠損したイヌＩＦ
Ｎγ／１７ーであった。また、画分におけるリテンシ
ョンタイムが約２９分のメインピークはＣ末端が１７ア
ミノ酸残基欠損したイヌＩＦＮγ／１７ーであった。な
お、ここで検出されたイヌＩＦＮγ／１６ーとイヌＩＦ
Ｎγ／１７ーのそれぞれの分子量は前者が約14850であ
り、後者が約14950であった。
分をＨＰＬＣで解析した。ＨＰＬＣ解析は、装置はＨＰ
ＬＣシステム（島津ＬＣ−１０ＡＤ）を、カラムはコス
モシール５Ｃ１８ ＡＲ-３００（ナカライテスク社製）
を用いた。移動相Ａに０．０５％トリフルオロ酢酸水溶
液を用い、移動相Ｂには０．０５％トリフルオロ酢酸を
含む１００％アセトニトリルを用いた。流速は１ml/min
とし、ピークの検出は２１０ｎｍで行った。溶出は移動
相Ｂのリニアグラジェント（０分：４０％移動相Ｂ、３
０分：４６％移動相Ｂ）で行った。その結果、画分に
おけるメインピークはリテンションタイムが約２８分、
画分におけるメインピークはリテンションタイムが約
２８分と約２９分、画分におけるメインピ ークはリ
テンションタイムが約２９分であった。それぞれのメイ
ンピークを分取し、構造解析を行った。分子量はTOF-MA
Sによって測定し、Ｃ末端アミノ酸配列は臭化シアン分
解後、ペプチドマッピングを行い、得られたＣ末端ペプ
チドをエドマン分解法によって決定した。その結果、画
分におけるリテンションタイムが約２８分のメインピ
ークはＣ末端が１６アミノ酸残基欠損したイヌＩＦＮγ
／１６ーであり、画分におけるリテンションタイムが
約２８分のメインピークと約２９分のメインピークはそ
れぞれＣ末端が１６アミノ酸残基欠損したイヌＩＦＮγ
／１６ーとＣ末端が１７アミノ酸残基欠損したイヌＩＦ
Ｎγ／１７ーであった。また、画分におけるリテンシ
ョンタイムが約２９分のメインピークはＣ末端が１７ア
ミノ酸残基欠損したイヌＩＦＮγ／１７ーであった。な
お、ここで検出されたイヌＩＦＮγ／１６ーとイヌＩＦ
Ｎγ／１７ーのそれぞれの分子量は前者が約14850であ
り、後者が約14950であった。
【００５５】さらに、画分〜をゲルろ過により分子
量解析した結果、それぞれ溶出されたイヌＩＦＮγの活
性を有するタンパク質がダイマー構造で存在することが
判った。従って、Ｑセファロース担体での３つの溶出画
分におけるメインのイヌＩＦＮγの活性を有するタンパ
ク質は、画分がイヌＩＦＮ-γ／１６ーのホモ２量
体、画分がイヌＩＦＮ-γ／１６ーとイヌＩＦＮ-γ／
１７ーのヘテロ２量体、画分がイヌＩＦＮ-γ／１７
ーのホモ２量体から成ることが判明した。画分および
画分からはそれぞれイヌＩＦＮ-γ／１６ー、イヌＩ
ＦＮ-γ／１７ーのイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパ
ク質が高純度で精製できる。しかしながら、画分にお
いてはヘテロ２量体からなるイヌＩＦＮγの活性を有す
るタンパク質がメイン成分であるため、ＨＰＬＣの検定
で高純度に精製することは困難である。
量解析した結果、それぞれ溶出されたイヌＩＦＮγの活
性を有するタンパク質がダイマー構造で存在することが
判った。従って、Ｑセファロース担体での３つの溶出画
分におけるメインのイヌＩＦＮγの活性を有するタンパ
ク質は、画分がイヌＩＦＮ-γ／１６ーのホモ２量
体、画分がイヌＩＦＮ-γ／１６ーとイヌＩＦＮ-γ／
１７ーのヘテロ２量体、画分がイヌＩＦＮ-γ／１７
ーのホモ２量体から成ることが判明した。画分および
画分からはそれぞれイヌＩＦＮ-γ／１６ー、イヌＩ
ＦＮ-γ／１７ーのイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパ
ク質が高純度で精製できる。しかしながら、画分にお
いてはヘテロ２量体からなるイヌＩＦＮγの活性を有す
るタンパク質がメイン成分であるため、ＨＰＬＣの検定
で高純度に精製することは困難である。
【００５６】また、上記で得られたカイコ体液抽出液
由来の初段Ｃｕキレート精製液と、カイコ体液抽出液
由来の初段Ｃｕキレート精製液とでは画分と画分に
おける、それぞれのイヌＩＦＮγ／１６ーとイヌＩＦＮ
γ／１７ーの量が異なり、カイコ体液抽出液由来のも
のではイヌＩＦＮγ／１７ーの量が非常に多く、一方、
カイコ体液抽出液由来のものではイヌＩＦＮγ／１６
ーの量が非常に多い。カイコ体液抽出液中のＥＤＴＡの
有無によって、イヌＩＦＮγの活性を有するタンパク質
のＣ末端構造の分解の受け方が異なることが判明した。
由来の初段Ｃｕキレート精製液と、カイコ体液抽出液
由来の初段Ｃｕキレート精製液とでは画分と画分に
おける、それぞれのイヌＩＦＮγ／１６ーとイヌＩＦＮ
γ／１７ーの量が異なり、カイコ体液抽出液由来のも
のではイヌＩＦＮγ／１７ーの量が非常に多く、一方、
カイコ体液抽出液由来のものではイヌＩＦＮγ／１６
ーの量が非常に多い。カイコ体液抽出液中のＥＤＴＡの
有無によって、イヌＩＦＮγの活性を有するタンパク質
のＣ末端構造の分解の受け方が異なることが判明した。
【００５７】さらに、上記で得られた各溶出画分（カイ
コ体液抽出液由来のＱセファロース担体による溶出画
分およびカイコ体液抽出液由来のＱセファロース担
体による溶出画分）をそれぞれ別々にブルー担体に供
し、イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質の単一化
を検討した。担体へのアプライはｐＨ：５．５で行っ
た。各溶出画分をそれぞれ限外ろ過にて２０ｍＭの酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ：５．５）に置換し、担体にア
プライした。限外ろ過はＡＤＶＡＮＴＥＣ社のＦＩＬＴ
ＥＲ ＨＯＬＤＥＲ（MODEL: UHP-43KおよびUHP-76K）
（装置）およびＡｍｉｃｏｎ社のＹＭ１０（膜）をそれ
ぞれ用いた。窒素ボンベの圧力は1.2〜1.5kg/cm2で行っ
た。なお、各操作は装置を氷冷しながら行った。溶出は
２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ：７．１）中
でのＮａＣｌの濃度を０〜１Ｍまで段階的に上げて行っ
た。その結果、カイコ体液抽出液由来のＱセファロー
ス担体による溶出画分では、ＮａＣｌの濃度が０Ｍ
で、カイコ体液抽出液由来のＱセファロース担体によ
る溶出画分では、ＮａＣｌの濃度が５０ｍＭ〜１５０
ｍＭでそれぞれイヌＩＦＮ-γ／１７ーのホモ２量体、
イヌＩＦＮ-γ／１６ーのホモ２量体がＨＰＬＣ解析で
それぞれ９６％の純度で精製できた。
コ体液抽出液由来のＱセファロース担体による溶出画
分およびカイコ体液抽出液由来のＱセファロース担
体による溶出画分）をそれぞれ別々にブルー担体に供
し、イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質の単一化
を検討した。担体へのアプライはｐＨ：５．５で行っ
た。各溶出画分をそれぞれ限外ろ過にて２０ｍＭの酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ：５．５）に置換し、担体にア
プライした。限外ろ過はＡＤＶＡＮＴＥＣ社のＦＩＬＴ
ＥＲ ＨＯＬＤＥＲ（MODEL: UHP-43KおよびUHP-76K）
（装置）およびＡｍｉｃｏｎ社のＹＭ１０（膜）をそれ
ぞれ用いた。窒素ボンベの圧力は1.2〜1.5kg/cm2で行っ
た。なお、各操作は装置を氷冷しながら行った。溶出は
２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ：７．１）中
でのＮａＣｌの濃度を０〜１Ｍまで段階的に上げて行っ
た。その結果、カイコ体液抽出液由来のＱセファロー
ス担体による溶出画分では、ＮａＣｌの濃度が０Ｍ
で、カイコ体液抽出液由来のＱセファロース担体によ
る溶出画分では、ＮａＣｌの濃度が５０ｍＭ〜１５０
ｍＭでそれぞれイヌＩＦＮ-γ／１７ーのホモ２量体、
イヌＩＦＮ-γ／１６ーのホモ２量体がＨＰＬＣ解析で
それぞれ９６％の純度で精製できた。
【００５８】また、上記で得られた、イヌＩＦＮ-γ／
１７ーのホモ２量体およびイヌＩＦＮ-γ／１６ーのホ
モ２量体それぞれの精製液中に含まれる不純物を解析し
た。解析は、ＨＰＬＣで検出される不純物のピークをそ
れぞれ分取し、それぞれを４Ｍ尿素存在下で、Achromob
acter Protease Iで３７℃、１６時間消化後、逆相カラ
ム（ＯＤＳ ８０Ｔｓ．、ＴＯＳＯＨ社製）を用いてＨ
ＰＬＣ解析を行った。移動相Ａに０．０５％トリフルオ
ロ酢酸水溶液を用い、移動相Ｂには０．０５％トリフル
オロ酢酸を含む６０％アセトニトリルを用いた。流速は
０．８ｍｌ／ｍｉｎとし、ピークの検出は２１４ｎｍで
行った。溶出は移動相Ｂのリニアグラジェント（０〜５
分：０％移動相Ｂ、５〜５５分：９０％移動相Ｂ）で行
った。なお、温度は５０℃で行った。その結果検出され
たペプチド断片をすべて分取し、構造解析を行った。分
子量はTOF-MASによって測定し、アミノ酸配列はエドマ
ン分解法によって決定した。解析の結果、不純物は全て
イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質であり、Ｃ末
端が１５アミノ酸残基欠損したイヌＩＦＮ-γ／１５
ー、イヌＩＦＮ-γ／１６ーのＮ末端側のメチオニンが
酸化されたイヌＩＦＮ-γ／１６ー（MetSOX）、および
イヌＩＦＮ-γ／１７ーのＮ末端側のメチオニンが酸化
されたイヌＩＦＮ-γ／１７ー（MetSOX）が含まれるこ
とが分かった。
１７ーのホモ２量体およびイヌＩＦＮ-γ／１６ーのホ
モ２量体それぞれの精製液中に含まれる不純物を解析し
た。解析は、ＨＰＬＣで検出される不純物のピークをそ
れぞれ分取し、それぞれを４Ｍ尿素存在下で、Achromob
acter Protease Iで３７℃、１６時間消化後、逆相カラ
ム（ＯＤＳ ８０Ｔｓ．、ＴＯＳＯＨ社製）を用いてＨ
ＰＬＣ解析を行った。移動相Ａに０．０５％トリフルオ
ロ酢酸水溶液を用い、移動相Ｂには０．０５％トリフル
オロ酢酸を含む６０％アセトニトリルを用いた。流速は
０．８ｍｌ／ｍｉｎとし、ピークの検出は２１４ｎｍで
行った。溶出は移動相Ｂのリニアグラジェント（０〜５
分：０％移動相Ｂ、５〜５５分：９０％移動相Ｂ）で行
った。なお、温度は５０℃で行った。その結果検出され
たペプチド断片をすべて分取し、構造解析を行った。分
子量はTOF-MASによって測定し、アミノ酸配列はエドマ
ン分解法によって決定した。解析の結果、不純物は全て
イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質であり、Ｃ末
端が１５アミノ酸残基欠損したイヌＩＦＮ-γ／１５
ー、イヌＩＦＮ-γ／１６ーのＮ末端側のメチオニンが
酸化されたイヌＩＦＮ-γ／１６ー（MetSOX）、および
イヌＩＦＮ-γ／１７ーのＮ末端側のメチオニンが酸化
されたイヌＩＦＮ-γ／１７ー（MetSOX）が含まれるこ
とが分かった。
【００５９】実施例８ 界面活性剤を用いたイヌＩＦＮ
-γの活性を有するタンパク質の安定化 実施例７で得られた高純度のイヌＩＦＮ-γの活性を有
するタンパク質（イヌＩＦＮ-γ／１６ーのホモ２量
体）を用いて、溶液中でのイヌＩＦＮ-γの活性を有す
るタンパク質の安定性を検討した。イヌＩＦＮ-γ／１
６ーのホモ２量体の精製溶液を、不二硝子（株）製のバ
イアル瓶 白 Ｖ−ＴＲ２ ＣＳ、に１×１０5Ｕ仕込み、
４℃で保存し、経時的に活性測定を行った。その結果、
仕込み後１０時間以内に９０％以上の活性が喪失した。
安定化のために、イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパ
ク質の仕込み溶液に、安定化剤として終濃度でアラビア
ゴム（三栄薬品工業（株）製）１％、ポリエチレングリ
コール０．５％、グリシン１０ｍＭをそれぞれ添加した
ものを調製し、活性測定を行ったが、同様に仕込み後１
０時間以内に活性が低下し、この場合、約３５％の活性
が喪失した。
-γの活性を有するタンパク質の安定化 実施例７で得られた高純度のイヌＩＦＮ-γの活性を有
するタンパク質（イヌＩＦＮ-γ／１６ーのホモ２量
体）を用いて、溶液中でのイヌＩＦＮ-γの活性を有す
るタンパク質の安定性を検討した。イヌＩＦＮ-γ／１
６ーのホモ２量体の精製溶液を、不二硝子（株）製のバ
イアル瓶 白 Ｖ−ＴＲ２ ＣＳ、に１×１０5Ｕ仕込み、
４℃で保存し、経時的に活性測定を行った。その結果、
仕込み後１０時間以内に９０％以上の活性が喪失した。
安定化のために、イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパ
ク質の仕込み溶液に、安定化剤として終濃度でアラビア
ゴム（三栄薬品工業（株）製）１％、ポリエチレングリ
コール０．５％、グリシン１０ｍＭをそれぞれ添加した
ものを調製し、活性測定を行ったが、同様に仕込み後１
０時間以内に活性が低下し、この場合、約３５％の活性
が喪失した。
【００６０】この活性の喪失が保存容器への吸着による
ものか、タンパク質の失活によるものかを明らかにする
ために、エンザイムイムノアッセイにより、保存溶液中
のイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質の定量を行
った。
ものか、タンパク質の失活によるものかを明らかにする
ために、エンザイムイムノアッセイにより、保存溶液中
のイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質の定量を行
った。
【００６１】エンザイムイムノアッセイは、イヌＩＦＮ
-γの活性を有するタンパク質に対する２種類の抗体
（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体）を用
いて行った。ポリクローナル抗体は、実施例３（１）で
作製した抗イヌＩＦＮ-γポリクローナル抗体を含むウ
サギ抗血清に硫酸アンモニウムを７０重量％添加して、
抗イヌＩＦＮ-γポリクローナル抗体を沈殿させ精製し
たものを用いた。また、モノクローナル抗体は、実施例
７で作製した高純度のイヌＩＦＮ-γ／１６ーのホモ２
量体とイヌＩＦＮ-γ／１７ーのホモ２量体をマウスに
免疫し、その脾細胞を定法に従ってマウスミエローマ細
胞と融合して、その中からイヌＩＦＮ-γの活性を有す
るタンパク質に対する抗体を産生するクローン細胞を分
離し、その細胞を定法に従って、ヌードマウスの腹腔内
に移植し得られた腹水に硫酸アンモニウムを７０重量％
添加して、抗イヌＩＦＮ-γモノクローナル抗体を沈殿
させ精製したものを用いた。エンザイムイムノアッセイ
に使用するプレート、ブロッキング剤、標識３次抗体お
よび反応基質はそれぞれ、Nunc（株）のImmuno PlateF9
6.Maxisorp (Cat.No.439454)、大日本製薬（株）のBloc
k Ace、Cappel（株）製のPOD標識抗マウス抗体(Cat.No.
55566)、およびDAKO（株）製のTMB One-stepSubstrate
System (Code No. S1600)を用いた。各反応後、プレー
トを0.05% Tween 20を含むPBSで３回以上洗浄した。測
定手順は以下のように行った。
-γの活性を有するタンパク質に対する２種類の抗体
（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体）を用
いて行った。ポリクローナル抗体は、実施例３（１）で
作製した抗イヌＩＦＮ-γポリクローナル抗体を含むウ
サギ抗血清に硫酸アンモニウムを７０重量％添加して、
抗イヌＩＦＮ-γポリクローナル抗体を沈殿させ精製し
たものを用いた。また、モノクローナル抗体は、実施例
７で作製した高純度のイヌＩＦＮ-γ／１６ーのホモ２
量体とイヌＩＦＮ-γ／１７ーのホモ２量体をマウスに
免疫し、その脾細胞を定法に従ってマウスミエローマ細
胞と融合して、その中からイヌＩＦＮ-γの活性を有す
るタンパク質に対する抗体を産生するクローン細胞を分
離し、その細胞を定法に従って、ヌードマウスの腹腔内
に移植し得られた腹水に硫酸アンモニウムを７０重量％
添加して、抗イヌＩＦＮ-γモノクローナル抗体を沈殿
させ精製したものを用いた。エンザイムイムノアッセイ
に使用するプレート、ブロッキング剤、標識３次抗体お
よび反応基質はそれぞれ、Nunc（株）のImmuno PlateF9
6.Maxisorp (Cat.No.439454)、大日本製薬（株）のBloc
k Ace、Cappel（株）製のPOD標識抗マウス抗体(Cat.No.
55566)、およびDAKO（株）製のTMB One-stepSubstrate
System (Code No. S1600)を用いた。各反応後、プレー
トを0.05% Tween 20を含むPBSで３回以上洗浄した。測
定手順は以下のように行った。
【００６２】１）抗イヌＩＦＮ-γポリクローナル抗体
（１次抗体）を５０ｎｇ／穴プレートに添加し、４℃で
１晩固相化した。
（１次抗体）を５０ｎｇ／穴プレートに添加し、４℃で
１晩固相化した。
【００６３】２）ブロッキング剤を２００μｇ／穴プレ
ートに添加し、２時間静置した。
ートに添加し、２時間静置した。
【００６４】３）抗イヌＩＦＮ-γモノクローナル抗体
（２次抗体）を２５０ｎｇ／穴プレートに添加し、１時
間静置した。
（２次抗体）を２５０ｎｇ／穴プレートに添加し、１時
間静置した。
【００６５】４）POD標識抗マウス抗体をプレートに添
加（５０００倍希釈）し、１時間静置した。
加（５０００倍希釈）し、１時間静置した。
【００６６】５）反応基質を100μl/穴プレートに添加
し, ２０分間静置した。
し, ２０分間静置した。
【００６７】６）５）の反応液に３Ｎ Ｈ2ＳＯ4／１Ｎ
ＨＣｌ溶液を１００μl/穴づつプレートに添加して反応
を停止し、490-595nmの波長で吸光度を測定し、イヌＩ
ＦＮ-γを定量した。
ＨＣｌ溶液を１００μl/穴づつプレートに添加して反応
を停止し、490-595nmの波長で吸光度を測定し、イヌＩ
ＦＮ-γを定量した。
【００６８】保存溶液中のイヌＩＦＮ-γの活性を有す
るタンパク質のエンザイムイムノアッセイによる定量の
結果、イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質は、安
定化剤を添加しない溶液中で８５％以上が保存容器に吸
着しており、また安定化剤を添加した溶液中では３０％
以上が保存容器に吸着していることが判明した。従って
イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質が溶液中で活
性が喪失する主要因は保存容器への吸着であることが判
明した。
るタンパク質のエンザイムイムノアッセイによる定量の
結果、イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質は、安
定化剤を添加しない溶液中で８５％以上が保存容器に吸
着しており、また安定化剤を添加した溶液中では３０％
以上が保存容器に吸着していることが判明した。従って
イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質が溶液中で活
性が喪失する主要因は保存容器への吸着であることが判
明した。
【００６９】イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質
の溶液中での活性の喪失を防止するため、界面活性剤で
ある、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０（日本サー
ファクタント工業（株）製）を０．０１重量％濃度でイ
ヌＩＦＮ-γ／１６ーのホモ２量体の精製溶液を上記と
同様に１×１０5Ｕ仕込んだ溶液中に添加し、４℃で保
存し、経時的に活性測定を行った。その結果、安定化剤
無添加溶液で、仕込み後７日間、活性は１００％保持さ
れた。従って、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０が
イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質の溶液中での
活性の喪失を大幅に防止できることを見出した。また、
ｐＨ値を５、６、７、８または９にすることで、仕込み
後、３０日間、活性が１００％保持された。特に、ｐＨ
値を５．５±０．３に保持すると、１００日間以上活性
が保持され、さらに同条件でー２０℃で保存すると、１
年以上活性低下がなく、安定に保存できることを見出し
た。
の溶液中での活性の喪失を防止するため、界面活性剤で
ある、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０（日本サー
ファクタント工業（株）製）を０．０１重量％濃度でイ
ヌＩＦＮ-γ／１６ーのホモ２量体の精製溶液を上記と
同様に１×１０5Ｕ仕込んだ溶液中に添加し、４℃で保
存し、経時的に活性測定を行った。その結果、安定化剤
無添加溶液で、仕込み後７日間、活性は１００％保持さ
れた。従って、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０が
イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質の溶液中での
活性の喪失を大幅に防止できることを見出した。また、
ｐＨ値を５、６、７、８または９にすることで、仕込み
後、３０日間、活性が１００％保持された。特に、ｐＨ
値を５．５±０．３に保持すると、１００日間以上活性
が保持され、さらに同条件でー２０℃で保存すると、１
年以上活性低下がなく、安定に保存できることを見出し
た。
【００７０】実施例９ 界面活性剤の添加による精製収
率向上効果 イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質の精製過程に
おいて、担体を詰めるカラム、チューブ、受ける容器、
限外ろ過装置および膜などへイヌＩＦＮ-γの活性を有
するタンパク質が吸着し、そのため精製収率が低下する
可能性がある。日本薬局方に記載されている界面活性剤
であるポリオキシエチレン硬化ヒマシ油を精製工程に添
加し、精製収率の向上効果を検討した。０．０１％のポ
リオキシエチレン硬化ヒマシ油６０を精製の全工程に添
加し、実施例７と同様の条件でカイコ生体中で生産した
イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質を精製した結
果、各精製ステップでの精製挙動に全く変化は認められ
ず、限外ろ過において、回収率が添加前の約９０％から
約１００％に向上し、さらに各担体での精製収率がそれ
ぞれ５〜３０％向上した。
率向上効果 イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質の精製過程に
おいて、担体を詰めるカラム、チューブ、受ける容器、
限外ろ過装置および膜などへイヌＩＦＮ-γの活性を有
するタンパク質が吸着し、そのため精製収率が低下する
可能性がある。日本薬局方に記載されている界面活性剤
であるポリオキシエチレン硬化ヒマシ油を精製工程に添
加し、精製収率の向上効果を検討した。０．０１％のポ
リオキシエチレン硬化ヒマシ油６０を精製の全工程に添
加し、実施例７と同様の条件でカイコ生体中で生産した
イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質を精製した結
果、各精製ステップでの精製挙動に全く変化は認められ
ず、限外ろ過において、回収率が添加前の約９０％から
約１００％に向上し、さらに各担体での精製収率がそれ
ぞれ５〜３０％向上した。
【００７１】実施例１０ イヌＩＦＮ-γの活性を有す
るタンパク質製剤の調製 実施例７で得られたイヌＩＦＮ-γ／１７ーのホモ２量
体およびイヌＩＦＮ-γ／１６ーのホモ２量体それぞれ
の精製溶液に、注射用生理食塩水を加え、ポジダイン
（ポール（株））で処理してパイロジェンを除去した
後、２５０℃で２時間乾熱滅菌したガラスバイアルに１
ｍｌずつ分注し、１バイアル中に０.１ＭＵから２.５Ｍ
ＵのイヌＩＦＮ-γを含むイヌＩＦＮ-γ製剤を得た。こ
のイヌＩＦＮ-γ製剤は、４℃、暗条件下で安定であっ
た。
るタンパク質製剤の調製 実施例７で得られたイヌＩＦＮ-γ／１７ーのホモ２量
体およびイヌＩＦＮ-γ／１６ーのホモ２量体それぞれ
の精製溶液に、注射用生理食塩水を加え、ポジダイン
（ポール（株））で処理してパイロジェンを除去した
後、２５０℃で２時間乾熱滅菌したガラスバイアルに１
ｍｌずつ分注し、１バイアル中に０.１ＭＵから２.５Ｍ
ＵのイヌＩＦＮ-γを含むイヌＩＦＮ-γ製剤を得た。こ
のイヌＩＦＮ-γ製剤は、４℃、暗条件下で安定であっ
た。
【００７２】実施例１１ イヌＩＦＮ-γの活性を有す
るタンパク質によるイヌ皮膚病の治療 実施例８で得られたイヌＩＦＮ-γの活性を有するタン
パク質の製剤を用いて、イヌ皮膚病に対する治療効果を
試験した。イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質の
製剤を１ｍｌの注射用生理的食塩水で溶解後、皮下注射
により投与し、皮膚疾患および副作用について臨床症状
を観察することによって治療効果を判定した。各投与量
の製剤溶液を３〜７回、皮下注射にて投与した臨床結果
を表１に示す。また、０．０１ＭＵ／ｋｇの投与量で連
日５回皮下注射にて投与し、２週間後の臨床結果を表２
に示す。投与の結果、脂漏性皮膚炎、膿皮症、アカント
ーシス、真菌性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、天疱瘡、ウ
ジ寄生性皮膚炎、エストロゲン反応性皮膚炎、アレルギ
ー性皮膚炎、マラセチア皮膚炎、慢性湿疹、膿疱疹、表
皮異形成に対して驚くべき治療効果が認められた。な
お、すべての症例において臨床上問題となる副作用は認
められなかった。
るタンパク質によるイヌ皮膚病の治療 実施例８で得られたイヌＩＦＮ-γの活性を有するタン
パク質の製剤を用いて、イヌ皮膚病に対する治療効果を
試験した。イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質の
製剤を１ｍｌの注射用生理的食塩水で溶解後、皮下注射
により投与し、皮膚疾患および副作用について臨床症状
を観察することによって治療効果を判定した。各投与量
の製剤溶液を３〜７回、皮下注射にて投与した臨床結果
を表１に示す。また、０．０１ＭＵ／ｋｇの投与量で連
日５回皮下注射にて投与し、２週間後の臨床結果を表２
に示す。投与の結果、脂漏性皮膚炎、膿皮症、アカント
ーシス、真菌性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、天疱瘡、ウ
ジ寄生性皮膚炎、エストロゲン反応性皮膚炎、アレルギ
ー性皮膚炎、マラセチア皮膚炎、慢性湿疹、膿疱疹、表
皮異形成に対して驚くべき治療効果が認められた。な
お、すべての症例において臨床上問題となる副作用は認
められなかった。
【００７３】
【表１】
【００７４】
【表２】
【００７５】
【表３】
【００７６】
【発明の効果】本発明によれば、高純度の有用タンパク
質を長期間安定に保存できる。
質を長期間安定に保存できる。
【００７７】参考文献 １．Ａｄｏｌｆら：Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅ
ｓ．７，１７３−１８３（１９８７）． ２．Ｄｅｖｏｓら：Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅ
ｓ．１２，９５−１０２（１９９２）． ３．Ｏｋａｎｏら：Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ＆ Ｃｙ
ｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．１７， ７１３−７１８（１９９
７）． ４．Ｃｈｉｒｇｗｉｎら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
１８、５２９４（１９７９）． ５．Ｂｅｒｇｅｒら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１
８，５１４３（１９７９）． ６．Ｇｕｂｌｅｒら：Ｇｅｎｅ．２５，２３６−２６９
（１９８３）． ７．Ｏｋａｙａｍａら：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２，１６１，（１９８２） ＆ ３，２８０，
（１９８３）． ８．Ｔ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉら：Ａｇｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，５１，１５７３−１５８０，（１９８７）． ９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ．
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１９８２． １０．日本生化学会編：続生化学実験講座第５巻、（１
９８６）．Ｐ２５０−２５６、東京化学同人． １１．Ｏｋａｎｏら：Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ＆ Ｃ
ｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．１９， ２７−３２（１９９
９）．
ｓ．７，１７３−１８３（１９８７）． ２．Ｄｅｖｏｓら：Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅ
ｓ．１２，９５−１０２（１９９２）． ３．Ｏｋａｎｏら：Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ＆ Ｃｙ
ｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．１７， ７１３−７１８（１９９
７）． ４．Ｃｈｉｒｇｗｉｎら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
１８、５２９４（１９７９）． ５．Ｂｅｒｇｅｒら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１
８，５１４３（１９７９）． ６．Ｇｕｂｌｅｒら：Ｇｅｎｅ．２５，２３６−２６９
（１９８３）． ７．Ｏｋａｙａｍａら：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２，１６１，（１９８２） ＆ ３，２８０，
（１９８３）． ８．Ｔ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉら：Ａｇｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，５１，１５７３−１５８０，（１９８７）． ９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ．
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１９８２． １０．日本生化学会編：続生化学実験講座第５巻、（１
９８６）．Ｐ２５０−２５６、東京化学同人． １１．Ｏｋａｎｏら：Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ＆ Ｃ
ｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．１９， ２７−３２（１９９
９）．
【００７８】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 東レ株式会社 <120> 安定化された有用タンパク質組成物、安定化された有用タンパク質の製 造方法、イヌ疾病の治療剤およびイヌ疾病の治療方法 <130> ５１Ｅ１５０００ <160> 60 <210> 1 <211> 501 <212> DNA PRT <213> dog <220> <221> CDS <222> (1)...(498) <220> <221> mat#peptide <222> (70)...(498) <400> 1 atg aat tat aca agc tat atc tta gct ttt cag ctt tgc gtg att ttg 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu tgt tct tct ggc tgt aac tgt cag gcc atg ttt ttt aaa gaa ata gaa 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu aac cta aag gaa tat ttt cag gca agt aat cca gat gta tcg gac ggt 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly ggg tct ctt ttc gta gat att ttg aag aaa tgg aga gag gag agt gac 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys trp Arg Glu Glu Ser Asp aaa aca atc att cag agc caa att gtc tct ttc tac ttg aaa ctg ttt 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe gac aac ttt aaa gat aac cag atc att caa agg agc atg gat acc atc 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile aag gaa gac atg ctt ggc aag ttc tta cag tca tcc acc agt aag agg 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg gag gac ttc ctt aag ctg att caa att cct gtg aac gat ctg cag gtc 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val cag cgc aag gcg ata aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gat ctc tca 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser cca aga tcc aac cta agg aag cgg aaa agg agt cag aat ctg ttt cga 480 Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe Arg ggc cgc aga gca tcg aaa taa 501 Gly Arg Arg Ala Ser Lys *** <210> 2 <211> 441 <212> DNA PRT <213> dog <220> <221> CDS <222> (1)...(438) <220> <221> mat#peptide <222> (70)...(438) <400> 2 atg aat tat aca agc tat atc tta gct ttt cag ctt tgc gtg att ttg 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu tgt tct tct ggc tgt aac tgt cag gcc atg ttt ttt aaa gaa ata gaa 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu aac cta aag gaa tat ttt cag gca agt aat cca gat gta tcg gac ggt 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly ggg tct ctt ttc gta gat att ttg aag aaa tgg aga gag gag agt gac 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp aaa aca atc att cag agc caa att gtc tct ttc tac ttg aaa ctg ttt 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe gac aac ttt aaa gat aac cag atc att caa agg agc atg gat acc atc 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile aag gaa gac atg ctt ggc aag ttc tta cag tca tcc acc agt aag agg 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg gag gac ttc ctt aag ctg att caa att cct gtg aac gat ctg cag gtc 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val cag cgc aag gcg ata aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gat ctc tca 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser cca aga taa 441 Pro Arg *** <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 gcagatctat gaattataca agctatatct tagct 35 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 gcgaattctt atttcgatgc tctgcggcct cgaaa 35 <210> 5 <211> 517 <212> DNA <213> dog <400> 5 gcagatctat gaattataca agctatatct tagcttttca gctttgcgtg attttgtgtt 60 cttctggctg taactgtcag gccatgtttt ttaaagaaat agaaaaccta aaggaatatt 120 ttcaggcaag taatccagat gtatcggacg gtgggtctct tttcgtagat attttgaaga 180 aatggagaga ggagagtgac aaaacaatca ttcagagcca aattgtctct ttctacttga 240 aactgtttga caactttaaa gataaccaga tcattcaaag gagcatggat accatcaagg 300 aagacatgct tggcaagttc ttacagtcat ccaccagtaa gagggaggac ttccttaagc 360 tgattcaaat tcctgtgaac gatctgcagg tccagcgcaa ggcgataaat gaactcatca 420 aagtgatgaa tgatctctca ccaagatcca acctaaggaa gcggaaaagg agtcagaatc 480 tgtttcgagg ccgcagagca tcgaaataag aattcgc 517 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 ataggatcca tgaattatac aagctatatc 30 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 ctggatatct ggattacttg cctgaaaata ttc 33 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 ccatacgtat cggacggtgg gtctctt 27 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 ggtggtcgac tgtaagaact tgccaagcat gtcttc 36 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 ccgatatcca ccagtaagag ggaggacttc cttaag 36 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 ctcgaattct tatttcgatg ctctgcggcc tcg 33 <210> 12 <211> 147 <212> DNA <213> dog <400> 12 ataggatcca tgaattatac aagctatatc ttagcttttc agctttgcgt gattttgtgt 60 tcttctggct gtaactgtca ggccatgttt tttaaagaaa tagaaaacct aaaggaatat 120 tttcaggcaa gtaatccaga tatccag 147 <210> 13 <211> 201 <212> DNA <213> dog <400> 13 ccatacgtat cggacggtgg gtctcttttc gtagatattt tgaagaaatg gagagaggag 60 agtgacaaaa caatcattca gagccaaatt gtctctttct acttgaaact gtttgacaac 120 tttaaagata accagatcat tcaaaggagc atggatacca tcaaggaaga catgcttggc 180 aagttcttac agtcgaccac c 201 <210> 14 <211> 195 <212> DNA <213> dog <400> 14 ccgatatcca ccagtaagag ggaggacttc cttaagctga ttcaaattcc tgtgaacgat 60 ctgcaggtcc agcgcaaggc gataaatgaa ctcatcaaag tgatgaatga tctctcacca 120 agatccaacc taaggaagcg gaaaaggagt cagaatctgt ttcgaggccg cagagcatcg 180 aaataagaat tcgag 195 <210> 15 <211> 517 <212> DNA <213> dog <400> 15 gcagatctat gaattataca agctatatct tagcttttca gctttgcgtg attttgtgtt 60 cttctggctg taactgtcag gccatgtttt ttaaagaaat agaaaaccta aaggaatatt 120 ttaatgcaag taatccagat gtatcggacg gtgggtctct tttcgtagat attttgaaga 180 aatggagaga ggagagtgac aaaacaatca ttcagagcca aattgtctct ttctacttga 240 aactgtttga caactttaaa gataaccaga tcattcaaag gagcatggat accatcaagg 300 aagacatgct tggcaagttc ttaaatagca gcaccagtaa gagggaggac ttccttaagc 360 tgattcaaat tcctgtgaac gatctgcagg tccagcgcaa ggcgataaat gaactcatca 420 aagtgatgaa tgatctctca ccaagatcca acctaaggaa gcggaaaagg agtcagaatc 480 tgtttcgagg ccgcagagca tcgaaataag aattcgc 517 <210> 16 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 gcggaattct tatcttggtg agagatcatt catcactttg at 42 <210> 17 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 gcgggatcct tatcttggtg agagatcatt catcactttg at 42 <210> 18 <211> 457 <212> DNA <213> dog <400> 18 gcagatctat gaattataca agctatatct tagcttttca gctttgcgtg attttgtgtt 60 cttctggctg taactgtcag gccatgtttt ttaaagaaat agaaaaccta aaggaatatt 120 ttcaggcaag taatccagat gtatcggacg gtgggtctct tttcgtagat attttgaaga 180 aatggagaga ggagagtgac aaaacaatca ttcagagcca aattgtctct ttctacttga 240 aactgtttga caactttaaa gataaccaga tcattcaaag gagcatggat accatcaagg 300 aagacatgct tggcaagttc ttacagtcat ccaccagtaa gagggaggac ttccttaagc 360 tgattcaaat tcctgtgaac gatctgcagg tccagcgcaa ggcgataaat gaactcatca 420 aagtgatgaa tgatctctca ccaagataag aattcgc 457 <210> 19 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 19 ccgaccatgg ctcaggccat gttttttaaa gaaatagaaa ac 42 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 20 ggcggatcct tatttcgatg ctctgcggcc tcgaaacag 39 <210> 21 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 21 gcgggatcct taccttaggt tggatcttgg 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aactgtttga caactttaaa gataaccaga tcattcaaag gagcatggat accatcaagg 300 aagacatgct tggcaagttc ttaaatagca gcaccagtaa gagggaggac ttccttaagc 360 tgattcaaat tcctgtgaac gatctgcagg tccagcgcaa ggcgataaat gaactcatca 420 aagtgatgaa tgatctctca ccaagatcca acctataaga attcgc 466 <210> 29 <211> 463 <212> DNA <213> dog <400> 29 gcagatctat gaattataca agctatatct tagcttttca gctttgcgtg attttgtgtt 60 cttctggctg taactgtcag gccatgtttt ttaaagaaat agaaaaccta aaggaatatt 120 ttaatgcaag taatccagat gtatcggacg gtgggtctct tttcgtagat attttgaaga 180 aatggagaga ggagagtgac aaaacaatca ttcagagcca aattgtctct ttctacttga 240 aactgtttga caactttaaa gataaccaga tcattcaaag gagcatggat accatcaagg 300 aagacatgct tggcaagttc ttaaatagca gcaccagtaa gagggaggac ttccttaagc 360 tgattcaaat tcctgtgaac gatctgcagg tccagcgcaa ggcgataaat gaactcatca 420 aagtgatgaa tgatctctca ccaagatcca actaagaatt cgc 463 <210> 30 <211> 460 <212> DNA <213> dog <400> 30 gcagatctat gaattataca agctatatct tagcttttca gctttgcgtg attttgtgtt 60 cttctggctg taactgtcag 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ttaaagataa ccagatcatt caaaggagca tggataccat caaggaagac 240 atgcttggca agttcttaaa tagcagcacc agtaagaggg aggacttcct taagctgatt 300 caaattcctg tgaacgatct gcaggtccag cgcaaggcga taaatgaact catcaaagtg 360 atgaatgatc tctcaccaag atccaaccta aggaagcgga aataaggatc gcc 413 <210> 60 <211> 390 <212> DNA <213> dog <400> 60 ccgaccatgg ctcaggccat gttttttaaa gaaatagaaa acctaaagga atattttaat 60 gcaagtaatc cagatgtatc ggacggtggg tctcttttcg tagatatttt gaagaaatgg 120 agagaggaga gtgacaaaac aatcattcag agccaaattg tctctttcta cttgaaactg 180 tttgacaact ttaaagataa ccagatcatt caaaggagca tggataccat caaggaagac 240 atgcttggca agttcttaaa tagcagcacc agtaagaggg aggacttcct taagctgatt 300 caaattcctg tgaacgatct gcaggtccag cgcaaggcga taaatgaact catcaaagtg 360 atgaatgatc tctcaccata aggatccgcc 390
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/12 １７１ Ｃ０７Ｋ 14/54 ４Ｈ０４５ 35/00 14/555 Ｃ０７Ｋ 14/54 14/57 14/555 16/18 // Ｃ０７Ｋ 14/57 Ｃ１２Ｎ 1/21 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｆ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/66 15/09 ＺＮＡ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA10 BA25 DA02 DA06 GA11 GA18 HA06 4B064 AG12 BD02 CA02 CA10 CC24 DA04 4B065 AA26X AA90Y AA95X AB01 BA01 BB23 BD25 CA24 CA25 CA43 4C076 AA11 BB11 CC18 CC27 CC31 CC35 DD51Q EE23Q EE58Q FF63 4C084 AA02 BA01 BA08 BA22 BA23 DA24 MA05 MA66 NA03 ZC612 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA18 EA20 FA72 FA74 GA45
Claims (12)
- 【請求項１】 界面活性剤を含み、他のタンパク質およ
び糖類から選ばれる安定化剤を含まないことを特徴とす
る安定化された有用タンパク質組成物。 - 【請求項２】 界面活性剤が非イオン性であることを特
徴とする請求項１記載の安定化された有用タンパク質組
成物。 - 【請求項３】 有用タンパク質がサイトカインであるこ
とを特徴とする請求項１または２記載の安定化された有
用タンパク質組成物。 - 【請求項４】 サイトカインがインターフェロン−γの
活性を有するタンパク質、インターフェロン−ω、イン
ターロイキン１２およびインターロイキン１８から選ば
れるいずれかであることを特徴とする請求項３記載の安
定化された有用タンパク質組成物。 - 【請求項５】 サイトカインがインターフェロン−γの
活性を有するタンパク質であり、ｐＨが５から９である
ことを特徴とする請求項４記載の安定化された有用タン
パク質組成物。 - 【請求項６】 他のタンパク質および糖類から選ばれる
安定化剤を含まない有用タンパク質に界面活性剤を添加
することを特徴とする安定化された有用タンパク質組成
物の製造方法。 - 【請求項７】 界面活性剤の添加濃度が０．００１から
１０重量％であることを特徴とする請求項６記載の安定
化された有用タンパク質組成物の製造方法。 - 【請求項８】 有用タンパク質がインターフェロン−γ
の活性を有するタンパク質である場合に、ｐＨ５〜９の
範囲で界面活性剤を添加することを特徴とする請求項６
または７記載の安定化された有用タンパク質組成物の製
造方法。 - 【請求項９】 請求項１から５のいずれかに記載の安定
化された有用タンパク質組成物または請求項６から８の
いずれかに記載の製造方法により得られた安定化された
有用タンパク質組成物を、−８０℃〜１５℃で保存する
ことを特徴とする安定化された有用タンパク質組成物の
保存方法。 - 【請求項１０】 請求項１から５のいずれかに記載の安
定化されたイヌインターフェロン−γの活性を有するタ
ンパク質組成物または請求項６から８のいずれかに記載
の方法により得られた安定化されたイヌインターフェロ
ン−γの活性を有するタンパク質を含んでなるイヌ疾病
の治療剤。 - 【請求項１１】イヌ疾病の治療剤が抗ウイルス治療剤、
腫瘍治療剤、感染症治療剤および皮膚病治療剤から選ば
れる少なくとも１つの治療剤であることを特徴とする請
求項１０に記載のイヌ疾病の治療剤。 - 【請求項１２】請求項１０または１１に記載のイヌ疾病
の治療剤をイヌに注射投与することを特徴とするイヌ疾
病の治療方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000292947A JP2001192343A (ja) | 1999-11-02 | 2000-09-26 | 安定化された有用タンパク質組成物、安定化された有用タンパク質組成物の製造方法、安定化された有用タンパク質組成物の保存方法、イヌ疾病の治療剤およびイヌ疾病の治療方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31289299 | 1999-11-02 | ||
| JP11-312892 | 1999-11-02 | ||
| JP2000292947A JP2001192343A (ja) | 1999-11-02 | 2000-09-26 | 安定化された有用タンパク質組成物、安定化された有用タンパク質組成物の製造方法、安定化された有用タンパク質組成物の保存方法、イヌ疾病の治療剤およびイヌ疾病の治療方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001192343A true JP2001192343A (ja) | 2001-07-17 |
Family
ID=26567367
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000292947A Pending JP2001192343A (ja) | 1999-11-02 | 2000-09-26 | 安定化された有用タンパク質組成物、安定化された有用タンパク質組成物の製造方法、安定化された有用タンパク質組成物の保存方法、イヌ疾病の治療剤およびイヌ疾病の治療方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001192343A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006001240A1 (ja) * | 2004-06-29 | 2006-01-05 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | 安定化改変ダニ主要アレルゲン含有医薬組成物 |
| JP2011136911A (ja) * | 2009-12-25 | 2011-07-14 | Tosoh Corp | 甲状腺刺激ホルモンレセプターの安定化方法 |
-
2000
- 2000-09-26 JP JP2000292947A patent/JP2001192343A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006001240A1 (ja) * | 2004-06-29 | 2006-01-05 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | 安定化改変ダニ主要アレルゲン含有医薬組成物 |
| JP2011136911A (ja) * | 2009-12-25 | 2011-07-14 | Tosoh Corp | 甲状腺刺激ホルモンレセプターの安定化方法 |
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|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20061107 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20070403 |