JP2001192396A - インターフェロン−γの活性を有するタンパク質の高純度製造法、イヌインターフェロン−γの活性を有する高純度タンパク質、イヌ疾病の治療剤およびイヌ疾病の治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 インターフェロン−γの活性を有するタンパ
ク質の高純度製造法を提供する。 【解決手段】 金属キレート担体、イオン交換担体およ
び色素担体を用いて、インターフェロン−γの活性を有
するタンパク質を高純度で製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、インタ−フェロン
-γの活性を有するタンパク質を遺伝子操作技術によっ
て量産して、以って医薬品（抗腫瘍・抗ウイルス・抗ア
レルギー）とする事を目的とした、インタ−フェロン-
γの活性を有するタンパク質を高純度で製造する方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】インターフェロンは、抗ウイルス作用を
示すところの蛋白質を主成分とする生理活性物質でＩＦ
Ｎと略記される。

【０００３】遺伝子操作技術の進歩によりヒトのＩＦＮ
のみならず、ウシ、ウマ、ネコなどの動物のＩＦＮも大
量生産が可能となり、その結果、ウイルス病や腫瘍など
の治療薬としてのＩＦＮの用途開発研究が行われている
ものもある。イヌについても、α，β，γ各タイプのＩ
ＦＮが報告されている（文献１、２）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】イヌには、乳腺腫瘍な
ど多数の腫瘍、パルボウイルス感染症、ジステンバ−感
染症など多数のウイルス病および多数の皮膚病などが知
られている。これらの治療薬としてイヌＩＦＮ-γが特
に有効であると考えられるので、イヌＩＦＮ−γが大量
生産され、容易に入手可能となれば、これらイヌ疾病の
治療薬としての用途が開かれると期待される。

【０００５】ＩＦＮ-γは種々の生産系において容易に
分解または修飾されるため、ほとんどの場合、多成分で
生産されることが報告されている（文献３）。

【０００６】多成分から成る有用蛋白質を医薬品とする
場合、各成分をそれぞれ単独に精製分離し、各成分ごと
に毒性試験、薬効試験等詳細な解析を行うことが必要で
あり、また製剤化の際、それぞれの成分を常に一定含量
添加することが義務づけられている。従って、ＩＦＮ-
γを遺伝子組換えの医薬品とする場合、目的の成分を高
純度で精製分画することが重要な課題である。

【０００７】イヌＩＦＮ-γの場合も、種々の生産系で
生産させた場合、得られたイヌＩＦＮ-γは以下の特徴
を示し、多種類のイヌＩＦＮ-γの混合物として生産さ
れる。 （１）イヌＩＦＮ-γは大部分２量体で存在する。 （２）イヌＩＦＮ-γはそのＣ末端構造が様々に分解を
受ける。 （３）イヌＩＦＮ-γは種々の生産系で不均一な糖鎖付
加を受ける。 （４）イヌＩＦＮ-γは種々の生産系でメチオニン残基
が酸化を受ける。 このように多種類のイヌＩＦＮ-γをカラム精製で活性
を維持したまま高純度に大量に分離精製する方法はこれ
まで知られていなかった。従って、イヌＩＦＮ-γの高
純度での製造法を確立することができれば、イヌＩＦＮ
-γの医薬品としての開発の途が開かれると期待され
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者はかかる状況に
鑑み、各種生産系で生産されたＩＦＮ-γを高純度に精
製分離することを目的とし、創意工夫を成し、遺伝子組
換え手法を用いて種々の生産系でＩＦＮ-γの活性を有
するタンパク質を生産し、純度９０％以上に精製分離す
る方法を確立し、かくして本発明を完成させるに至っ
た。

【０００９】すなわち本発明は主として次の（１）〜
（４）の構成を有する。すなわち、 （１）インターフェロン−γの活性を有するタンパク質
を、金属をキレート結合させた担体、イオン交換担体お
よび色素担体から選ばれる少なくとも１種の担体と接触
させることを特徴とするインターフェロン−γの活性を
有するタンパク質の高純度製造法。 （２）インターフェロン−γの活性を有するタンパク質
の純度が９０％以上であることを特徴とするイヌインタ
ーフェロン−γの活性を有する高純度タンパク質。 （３）（１）の方法で製造されたイヌインターフェロン
−γの活性を有するタンパク質または（２）のイヌイン
ターフェロン−γの活性を有する高純度タンパク質を含
んでなるイヌ疾病の治療剤。 （４）（３）のイヌ疾病の治療剤をイヌに注射投与する
ことを特徴とするイヌ疾病の治療方法。 である。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明に関し詳細に説明す
る。

【００１１】本発明の製造法で製造されるＩＦＮ-γの
活性を有するタンパク質は全ての動物種を含むものとす
る。本発明では、特にイヌＩＦＮ-γの活性を有するタ
ンパク質が好ましく用いられる。イヌＩＦＮ-γの活性
を有するタンパク質とは、イヌＩＦＮ-γの活性を有す
るものであれば良く、糖鎖、酸化、アミノ酸配列などの
構造に限定されない。イヌＩＦＮ-γの活性を有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡは例えば次のようにして製
造することができる。すなわち、イヌの細胞からポリ
（Ａ）ＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡに転換し、イヌＩ
ＦＮ-γをコ−ドする遺伝子配列を元にしたプライマ−
を用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を
行うことによってイヌＩＦＮ-γをコ−ドする遺伝子を
得ることができる。イヌの細胞、例えばマイト−ジェン
などで刺激されたイヌリンパ球などよりＲＮＡを得る方
法としては、通常の方法、例えば、ポリソ−ムの分離、
ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあ
げられる。上記イヌ細胞よりＲＮＡを抽出する方法とし
ては、グアニジン・チオシアネ−ト処理後ＣｓＣｌ密度
勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネ−ト−塩化セシ
ウム法（文献４）バナジウム複合体を用いてリボヌクレ
ア−ゼインヒビタ−存在下に界面活性剤で処理したのち
フェノ−ル抽出を行う方法（文献５），グアニジン・チ
オシアネ−ト−ホット・フェノ−ル法、グアニジン・チ
オシアネ−ト−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシ
アネ−ト−フェノ−ル・クロロホルム法、グアニジン・
チオシアネ−トで処理したのち塩化リチウムで処理して
ＲＮＡを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選ん
で行うことができる。

【００１２】イヌリンパ球などより通常の方法、例え
ば、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシア
ネ−ト法、オリゴｄＴセルロ−スカラム法等によりｍＲ
ＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例え
ば、Ｇｕｂｌｅｒらの方法（文献６），Ｈ．Ｏｋａｙａ
ｍａらの方法（文献７）等によりｃＤＮＡを合成する。
得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、基本的
にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素な
どを用いるほか１部プライマ−を用いてＤＮＡポリメラ
−ゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合
成あるいはクロ−ニング用キットを用いるのが便利であ
る。このｃＤＮＡを鋳型としてイヌＩＦＮ-γの塩基配
列を基にしたプライマ−を用いてＰＣＲを行うことによ
ってイヌＩＦＮ-γの蛋白質をコ−ドするＤＮＡを得る
ことができる。さらにこのＤＮＡを鋳型としてイヌＩＦ
Ｎ-γ遺伝子の数ヵ所を改変するようように設計したプ
ライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ増幅断
片を連結することによって、イヌＩＦＮ-γの活性を有
するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることができ
る。

【００１３】イヌＩＦＮ−γの活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡの具体例としては、配列番号：１、
配列番号：２、配列番号：３１、配列番号：３２、配列
番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番
号：３６または配列番号：３７から選ばれる少なくとも
１つの配列もしくはこれらの配列とハイブリダイズする
配列を有するものがあげられる。

【００１４】イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質
は、カイコに感染する組換えカイコ核多角体病ウイルス
を作製することによって、カイコ発現系を用いても生産
することができる。組換えカイコ核多角体病ウイルス
は、イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質をコ−ド
するＤＮＡをカイコのクローニングベクター（文献８）
に連結して作製した組換え体プラスミドとカイコ核多角
体病ウイルスＤＮＡとを、カイコ樹立細胞にコトランス
フェクションして作製することができる。従って、組換
え体ウイルスは、ｉｎ ｖｉｖｏ的な方法で作製するこ
とができる。すなわち、イヌＩＦＮ-γの活性を有する
タンパク質をコードするＤＮＡ部分を、例えばｐＢＭ０
３０（文献８）などのカイコのクローニングベクターの
発現調節部分の下流に連結するという一般的な遺伝子操
作に従って組換え体プラスミドを作製することができ
る。この組換え体プラスミドとカイコ核多角体病ウイル
スＤＮＡ（文献８）とを、文献のような方法でカイコ樹
立細胞、例えばＢＭ−Ｎ株（文献８）にコトランスフェ
クションした後、培養を続け、培養液中に出現した非組
換え体（野性型）と組換え体のウイルスの中から限界希
釈法、もしくはプラーク法などの一般的な方法によって
組換えウイルスをクローニングすることができる。組換
えウイルスは多角体の形成能がないことから、野性型ウ
イルスと容易に区別できる。イヌＩＦＮ-γの活性を有
するタンパク質の生産は、前記の組換えカイコ核多角体
ウイルスをカイコ樹立細胞中、またはカイコ生体中で増
殖させることにより行なう。

【００１５】カイコ樹立細胞を用いる場合は、前記組換
えウイルスを含む培養液により、ＢＭ−Ｎ細胞を感染さ
せ、平面培養または浮遊培養により培養する。ＢＭ−Ｎ
細胞を培養する培地としては、例えば牛血清を添加した
ＴＣ−１０培地（文献９）やＴＣ−１００培地（日本農
産工業（株）製）を使用することができる。培養温度は
２５〜２８℃が適当である。培養後、培養液を遠心分離
しその上清からイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク
質を回収する。

【００１６】カイコ生体を用いる場合は、前記の組換え
体ウイルスを含む培養液をカイコ幼虫に注射して、人工
飼料を与えて飼育する。飼育後、体液を採取しその上清
からイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質を回収す
る。

【００１７】カイコ樹立細胞やカイコ生体を用いてＩＦ
Ｎ-γの活性を有するタンパク質を生産する場合、ＩＦ
Ｎ-γの活性を有するタンパク質が生産された溶液に塩
化ベンザルコニウム、ＥＤＴＡあるいは界面活性剤など
を添加して、組換えウイルスを不活化することができ
る。

【００１８】上記の製造法で製造されるＩＦＮ-γの活
性を有するタンパク質の性質としては、以下の点が挙げ
られ、本発明の高純度製造法はこのような性質を有する
タンパク質の製造に特に有用である。 （１）Ｃ末端構造が様々に分解を受けた構造で存在す
る。例えば、カイコで生産したイヌＩＦＮ-γの活性を
有するタンパク質はそのＣ末端構造が２０アミノ酸残基
までさまざまに分解を受けたものが存在する。その内、
１６アミノ酸残基および１７アミノ酸残基欠損したもの
が多く存在する。 （２）２量体で存在する。これはゲルろ過などにより、
分子量を測定することによって検出することができる。
例えば、カイコで生産したイヌＩＦＮ-γの活性を有す
るタンパク質は全て２量体で存在する。 （３）メチオニン残基が酸化を受けた構造のものが存在
する。例えば、カイコで生産したイヌＩＦＮ-γの活性
を有するタンパク質を本発明の製造法で高純度に精製し
たものの中には、そのＮ末端側のメチオニン残基が酸化
を受けたものが存在する。

【００１９】本発明のＩＦＮ−γの活性を有するタンパ
ク質の高純度製造法が特に有用であるタンパク質をまと
めると以下のようなものである。 （１）単量体、または単量体の組み合わせからなる２量
体からなるタンパク質。 （２）単量体のＣ末端構造が欠損したタンパク質。 （３）単量体が、配列番号：１、配列番号：２、配列番
号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番
号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６または配列
番号：３７から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列
もしくは、これらアミノ酸配列において１もしくは数個
のアミノ酸が欠失、付加、置換もしくは修飾されたアミ
ノ酸配列からなるタンパク質。 （４）２量体が（３）の単量体のホモ２量体、またはヘ
テロ２量体であるタンパク質。好ましくはホモ２量体の
タンパク質。 （５）インターフェロン−γの活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡにより遺伝子組換えされた組換えカ
イコ核多角体病ウイルスを、カイコ生体中で増殖させて
生産させたタンパク質。 （６）メチオニン残基が酸化されたタンパク質。

【００２０】本発明は、ＩＦＮの活性を有するタンパク
質を、金属をキレート結合させた担体、イオン交換担
体、および色素担体から選ばれる少なくとも１種の担体
と接触させることが重要である。これらの担体と接触さ
せることで高純度のＩＦＮ−γの活性を有するタンパク
質を製造することができる。このとき、製造方法として
は、ＩＦＮ−γの活性を有するタンパク質を含む溶液を
担体に接触させ、担体への非吸着物を回収する方法が好
ましい。

【００２１】本発明において高純度精製に使用される、
金属をキレート結合させた担体としては、アガロース、
セルロース、ポリアクリルアミドゲルなどに、例えばビ
スカルボキシメチルイミノ基｛Ｎ（ＣＨ₂ＣＯＯＨ）₂｝
などのキレート能を有する交換基が結合した担体を、硫
酸銅や塩化ニッケルなどの金属塩の溶液で処理した担体
が挙げられる。好ましくは、キレーティングセファロー
ス（アマシャム・ファルマシア社製）などの不溶性多糖
類系担体に銅をキレート結合させた担体（以下、銅キレ
ート担体と略記する）が用いられる。インターフェロン
−γの活性を有するタンパク質の大部分は、溶液のｐＨ
値が４〜９の範囲では該担体に吸着せず、一方、多くの
インターフェロン−γの活性を有するタンパク質以外の
夾雑タンパク質は該担体に吸着するので、本操作にてイ
ンターフェロン−γの活性を有するタンパク質を高純度
で回収することができる。また、該担体にインターフェ
ロン−γの活性を有するタンパク質が吸着しても、極め
て弱い吸着であり、塩化アンモニウムや塩化ナトリウム
などの塩の低濃度溶液で容易に溶出させ、高純度で回収
することができる。例えば、カイコ生体中で生産させた
イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質を含む溶液を
ｐＨ値を７にし、該担体に接触させると、イヌＩＦＮ-
γの活性を有するタンパク質は非吸着画分に全て回収さ
れ、カイコ由来物の大部分は該担体に強固に吸着し、除
去することができる。また、本操作をｐＨ値５．５下で
行うと、非吸着画分には、Ｃ末端構造が１２アミノ酸残
基以上欠損したイヌＩＦＮ-γ（以下低分子イヌＩＦＮ-
γと略記する）が回収され、それ以外の高分子のイヌＩ
ＦＮ-γの活性を有するタンパク質は該担体に弱く吸着
する。高分子のイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク
質は０．１〜０．６Ｍの塩化アンモニウム溶液で回収さ
れ、カイコ由来物の大部分は本画分には回収されない。
従って、本操作にて、低分子と高分子のイヌＩＦＮ-γ
の活性を有するタンパク質をそれぞれ分離して高純度で
回収することができる。

【００２２】また、イオン交換担体としては、アニオン
交換担体が好ましく、アガロース、セルロース、合成ポ
リマーゲルなどに、例えばジエチルアミノエチル（Diet
hylaminoethyl）、クアテナリアミノエチル（Quaternar
y aminoethyl）、クアテナリアンモニウム（Quaternary
ammonium）、カルボキシメチル（Carboxymethyl）、ス
ルホプロピル（Sulphopropyl）、メチルスルホネート
（Methyl sulphonate）などの官能基を導入したものが
挙げられる。好ましくはクアテナリアンモニウムが導入
された、Ｑ セファロースハイパフォーマンス（Ｑ Seph
arose High Performance）（アマシャム・ファルマシア
社製）やＱ セファロースファーストフロー（Ｑ Sephar
ose Fast Flow）（アマシャム・ファルマシア社製）な
ど（以下、Ｑセファロース担体と略記する）が用いられ
る。Ｑセファロース担体からの溶出は、溶出剤のｐＨ
値、イオン強度などによって決定される。多種類のＩＦ
Ｎ-γの活性を有するタンパク質はそれぞれ異なった電
荷を有しており、それぞれの電荷の差により、本担体を
用いて、それぞれを分画することができる。例えば、カ
イコ生体中で生産させた糖鎖を欠損させたイヌＩＦＮ-
γの活性を有するタンパク質の場合、ｐＨ値９下で、Ｃ
末端構造が１６アミノ酸残基欠損したイヌＩＦＮ-γ
（以下、イヌＩＦＮ-γ／１６−と略記する）のホモ２
量体とＣ末端構造が１７アミノ酸残基欠損したイヌＩＦ
Ｎ-γ（以下、イヌＩＦＮ-γ／１７−と略記する）のヘ
テロ２量体およびイヌＩＦＮ-γ／１６−とイヌＩＦＮ-
γ／１７−のヘテロ２量体をそれぞれ分画することがで
きる。

【００２３】さらに、色素担体としては、ブルー色素を
結合させた担体（以下、ブルー担体と略記する）が好ま
しく用いられる。ブルー担体としては次のものが使用さ
れる。ブルー色素は一般名をＣＩリアクティブブルー２
といい、例えばＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ社からジバクロン
ブルーＦ３ＧＡ、またはジバクロンブルー３ＧＡという
商品名で市販されている青色色素などが挙げられる。実
際のクロマトグラフィーに使用する担体としては、ブル
ーセファロースＣＬ−６Ｂ（アマシャム・ファルマシア
社製）、ブルーセファロース６ファーストフロー（アマ
シャム・ファルマシア社製）、ブルーセファロース６ハ
イパフォーマンス（アマシャム・ファルマシア社製）、
マトレックスゲルブルーＡ（アミコン社製）、アフィゲ
ルブルー（バイオラット社製）などの商品名で市販され
ているブルーアガロースゲル、またはブルートリスアク
リルーＭ（ＬＫＢ社製）ブルーセルロファイン（チッソ
社製）などの商品名で市販されているブルーセファロー
スゲルなどが適当であり、容易に入手することができ
る。ブルー担体からの溶出は、溶出剤のｐＨ値、イオン
強度、疎水度などによって決定される。例えば、イヌＩ
ＦＮ-γの活性を有するタンパク質の場合、中性付近の
ｐＨで、イヌＩＦＮ-γ／１６−のホモ２量体、イヌＩ
ＦＮ-γ／１７−のホモ２量体あるいは高分子のイヌＩ
ＦＮ-γの活性を有するタンパク質をそれぞれ分離溶出
して、高純度で精製することができる。

【００２４】本発明の製造法におけるカラム担体を用い
た精製操作はそれぞれ単独で行ってもＩＦＮ-γの活性
を有するタンパク質の高純度化が可能であるが、好まし
くはそれぞれを組み合わせて行った方がより効果が高
い。例えば、カイコ生体中で生産したＩＦＮ-γの活性
を有するタンパク質を含む溶液中には、非常に多くのカ
イコ由来の夾雑物と他種類のＩＦＮ-γの活性を有する
タンパク質が含まれるので、上記３つのカラム担体精製
を組み合わせることが好ましい。カイコ生体中で生産さ
せたイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質の製造に
おいては、初段精製に銅キレート担体を、２段目精製に
Ｑセファロース担体を、３段目精製にブルー担体を用い
ることが好ましい。

【００２５】なお、各カラム担体を用いた精製操作にお
ける、溶出剤の組成、液量などは特に限定されるもので
はなく、最適な分離条件は存在する夾雑タンパク質、Ｉ
ＦＮ-γの活性を有するタンパク質の量、およびカラム
の寸法などに応じて適宜決定される。

【００２６】また、本発明の製造法で製造されるＩＦＮ
-γの活性を有するタンパク質の純度は、逆相カラムを
用いたＨＰＬＣによる分析で、９０％以上である。

【００２７】本発明の製造法における、カラム担体を用
いた精製を行う際に、ＩＦＮ-γの活性を有するタンパ
ク質を含む溶液中に界面活性剤を０．００１〜１重量％
添加する方法が好ましく採用でき、これにより精製挙動
に変化なく高純度に製造することができる。界面活性剤
を添加することにより、カラム担体やカラム容器への目
的タンパク質の吸着によるロスを防止でき、高い収率で
の製造が可能になる。添加する界面活性剤としては、特
に限定はないが、アルキルアリルポリエーテルアルコー
ル、高級アルコール硫酸化物、Ｎ−ココイルーＬーアル
ギニンエチルエステルＤＬーピロリドンカルボン酸塩、
ＮーココイルーＮーメチルアミノエチルスルホン酸ナト
リウム、コレステロール、自己乳化型モノステアリン酸
グリセリン、ショ糖脂肪酸エステル、スクワラン、ステ
アリンアルコール、ステアリン酸ポリオキシル４０、セ
スキオレイン酸ソルビタンセタノール、セトマクロゴー
ル１０００、セバシン酸ジエチル、ソルビタン脂肪酸エ
ステル、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ノニ
ルフェノキシポリオキシエチレンエタン硫酸エステルア
ンモニウム、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエー
テル、ポリオキシエチレンオレインアミン、ポリオキシ
エチレン硬化ヒマシ油２０、ポリオキシエチレン硬化ヒ
マシ油６０、ポリオキシエチレンステアリンエーテル、
ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレ
ンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソル
ビットミツロウ、ポリオキシエチレンノニルフェニルエ
ーテル、ポリオキシエチレン（１０５）ポリオキシプロ
ピレン（５）グリコール、ポリオキシエチレン（１２
０）ポリオキシプロピレン（４０）グリコール、ポリオ
キシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン３０）グ
リコール、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロ
ピレン（２０）グリコール、ポリソルベート６０、ポリ
ソルベート８０、マクロゴール４００、モノオレイン酸
ソルビタン、モノステアリン酸グリセリン、モノステア
リン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、モノラ
ウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ラウリル硫酸
ナトリウム、ラウリン酸ジエタノールアミド、ラウロイ
ルサルコシンナトリウム、ラウロマクロゴール、リン酸
ナトリウムポリオキシエチレンラウリルエーテル、リン
酸ポリオキシエチレンオレイルエーテルなど日本薬局方
に医薬品添加物として記載されているものが好ましく、
イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質を製造する場
合、その中でもポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０が
特に好ましく用いられる。

【００２８】本発明の製造法により得られるイヌＩＦＮ
−γは９０％以上の純度を有しており、イヌ疾病の治療
剤として有効である。

【００２９】本発明に係るイヌ疾病の治療剤は、皮膚病
をはじめ腫瘍、アレルギー疾患、感染症など免疫能が低
下した疾病などさまざまなイヌの疾病に対して、従来の
これらイヌの疾病に対する治療薬や治療方法に比べ、驚
くべき顕著な治療効果および予防効果を示す。

【００３０】本発明における、イヌの皮膚病としては、
アレルギー性皮膚炎、免疫介在性皮膚炎、腫瘍性皮膚
炎、寄生虫性皮膚炎、細菌性皮膚炎、真菌性皮膚炎、内
分泌疾患、角化異常などが挙げられる。アレルギー性皮
膚炎としては、例えばアトピー性皮膚炎、接触性皮膚
炎、ノミによる皮膚炎、ダニによる皮膚炎などが挙げら
れ、免疫介在性皮膚炎としては、例えば狼瘡、天疱瘡、
アカントーシス、表皮壊死、皮膚血管炎、ブドウ膜炎、
悪性脱毛、強皮症、好酸球性皮膚炎などが挙げられ、寄
生虫性皮膚炎としては、ノミによる皮膚炎、ダニによる
皮膚炎、ウジによる皮膚炎、フィラリアによる皮膚炎な
どが挙げられ、細菌性皮膚炎としては、例えば膿皮症な
どが挙げられ、真菌性皮膚炎としては、例えば表皮性皮
膚炎、全身性皮膚炎などが挙げられ、内分泌疾患として
は、例えば甲状腺皮膚炎、成長ホルモン反応性皮膚炎、
エストロゲン性皮膚炎などが挙げられ、角化異常として
は、例えば本態性脂漏性皮膚炎、脂肪酸欠乏性皮膚炎、
亜鉛欠乏性皮膚炎、ビタミンＡ欠乏性皮膚炎などが挙げ
られる。イヌの腫瘍としては、乳腺腫瘍、好酸球性肉芽
腫、類表皮腫、皮膚腫瘍、脂肪腫、耳血腫、肺水腫、皮
膚有茎軟腫または肛門腫瘍などが挙げられ、イヌの感染
症としては、イヌパルボウイルス感染症、ジステンバー
感染症などが挙げられ、そしてアレルギー性疾病として
は、イヌの花粉症などが挙げられる。

【００３１】また、本発明において用いられるイヌ疾病
の治療剤は、イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質
に加えて任意に他の成分を含むことができる。本剤に添
加される成分は、主として、本剤が投与される方式に依
存して決定される。本剤が固体として用いられる場合
は、例えばラクトース等の充填剤、カルボキシメチルセ
ルロース、ゼラチン等の結合剤、着色剤、コーティング
剤等を用いることができ、このような固体の剤は経口投
与に好適であろう。また、担体または賦形剤として例え
ば、白色ワセリン、セルロース誘導体、界面活性剤、ポ
リエチレングリコール、シリコーン、オリーブ油等を加
えてクリーム、乳液、ローション等の形態として外用剤
として患部に塗布して用いることもできる。また、本剤
が液体として投与される場合は、通常行われている生理
学的に許容される溶媒、および、乳化剤、安定剤を含む
ことができる。溶媒としては、水、ＰＢＳ、等張性生理
食塩水等があげられ、乳化剤としては、ポリオキシエチ
レン系界面活性剤、脂肪酸系界面活性剤、シリコーン等
が例示でき、安定剤としては、イヌ血清アルブミン、ゼ
ラチン等の蛋白質、または、ポリエチレングリコール、
エチレングリコール等のポリオール、または、ソルビト
ール、トレハロースなどの糖類等があげられる。

【００３２】本発明の治療剤の投与方法に特に限定はな
いが、注射投与することによってより治療効果が期待で
きる。注射投与方法としては、静脈内投与、筋肉内投
与、皮下投与、腹腔内投与、胸腔内投与いずれの方法で
もよいが、皮下投与が簡便で患犬の負担も軽く好適であ
る。

【００３３】また、投与量は、個体の大きさ、投与方
法、症状などに依存して決定されるであろうが、一般に
は、イヌ疾病の症状を改善させるに十分な量を投与すれ
ば良い。例えば、１用量、１日当たり０.００２から１.
０MU／kgのイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質の
投与で十分な効果が得られるが、好ましくは０.００５
から０.５MU／kg の用量が効果および経済的な面から好
ましい。ここにおいて、kg は患畜犬の体重の単位であ
り、Uは、上記イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質
の抗ウイルス活性から決定されるユニット数を表し、ウ
イルスとしてvesicular stomatitis virus （ＶＳ
Ｖ）、感受性細胞としてイヌＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ−３４）細胞を用いて文献１０のＣＰＥ法に従って測
定した時、ＶＳＶによるイヌＭＤＣＫ細胞の細胞変性率
を５０％防ぐことができるイヌＩＦＮ-γの量が１ユニ
ットである。

【００３４】また、本発明の治療剤の投与頻度もまた、
個体の大きさ、投与方法、症状などに依存して決定され
るであろうが、通常、週当たり１から２回の投与で、治
療開始から２週目には顕著な症状の改善が認められるで
あろう。また、治療経過を観察しながら投与頻度を増減
することも、投与回数を増減することも可能であるが、
飼い主の負担と治療効果の観点から、１日から７日の間
隔で２から１０回投与することが好ましい。

【００３５】また、本治療方法においては、イヌ疾病を
治療するための従来技術による治療剤を組み合わせて補
助的に用いることができる。この場合は、本発明の治療
剤は、抗ヒスタミン剤（ジフェンヒドラミン類）、消炎
剤（塩酸ジブカイン等）、殺虫・殺菌剤（マラチオン、
塩化ベンザルコニウム等）、ステロイド剤（デキサメタ
ゾン等）などから選ばれる他の薬剤と共に投与される。

【００３６】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。

【００３７】実施例１ イヌＩＦＮ-γの活性を有する
タンパク質を生産する遺伝子組換え カイコ核多角体病ウイルスの作製 （１）イヌｃＤＮＡの調製 イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、フィトヘムアグルチ
ニン（ＰＨＡ）を５０μｇ／ｍｌの終濃度で４８時間刺
激した。刺激後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジ−ン（株）
製）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１
ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で
５分間処理した後、１Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加
えた。０．５Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリ
ゴｄＴセルロ−スカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同
緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ ＬｉＣｌを含む
ＴＥにて洗浄後、０．０１％ ＳＤＳを含む２ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶
出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一
本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍ
ｌのミクロ遠心チュ−ブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと
０．５μｇのオリゴｄＴプライマ−（１２−１８ｍｅ
ｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネ−ト処理滅菌水を加
えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベ−トし
たのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ トリス
塩酸（ｐＨ８．４），５００ｍＭ ＫＣｌ溶液を２μ
ｌ，２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂を２μｌ，１０ｍＭ ｄＮＴ
Ｐを１μｌおよび０．１Ｍ ＤＴＴを２μｌそれぞれ加
え、４２℃で５分間インキュベ−トしたのち、２００ユ
ニットの逆転写酵素（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製、Ｓｕｐｅ
ｒＳｃｒｉｐｔＩＩ）を１μｌ加え、４２℃でさらに５
０分間インキュベ−トしてｃＤＮＡ合成反応を行った。
さらに７０℃で１５分間インキュベ−トして反応を停止
し、氷上に５分間置いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃ
ｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、
３７℃で２０分間インキュベ−トした。 （２）イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質をコー
ドする遺伝子の調製 イヌＩＦＮ-γの塩基配列（文献２）をもとに、 ５´ＧＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＡＡＴＴＡＴＡＣＡＡＧＣ
ＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ３´（配列番号：３） と ５´ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧＣＴＣＴ
ＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＡＡ３´（配列番号：４） の２種類のプライマ−を日本バイオサービス（株）に依
頼し合成した。実施例１（１）で得られたｃＤＮＡを
０．５ｍｌのミクロ遠心チュ−ブに２μｌづつ取り、各
プライマ−を２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、２５ｍＭ
ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ ゼラチン、５０μＭ各ｄ
ＮＴＰ、４単位 ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラ−ゼ（宝酒
造（株）製）となるように各試薬を加え、全量１００μ
ｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマ
−のアニ−リング条件を５５℃、２分、プライマ−の伸
長条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍ
ｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサ−マルサイクラ−を用
い、３０サイクル反応させた。これを１％アガロ−スゲ
ルにて電気泳動し、５１７ｂｐのＤＮＡ断片（配列番
号：５）を常法（文献９）に従って調製した。このＤＮ
Ａ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに
宝酒造（株）に常法に従い連結した。これを用いて常法
に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプ
ラスミドＤＮＡを常法に従い調製した。次に蛍光ＤＮＡ
シーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサ
ー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、
パーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシー
ケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片がイヌ
ＩＦＮ-γをコードするＤＮＡの塩基配列であることを
確認した。

【００３８】次にこのＤＮＡ断片を鋳型として３種類の
プライマーの組合せ（配列番号：６〜１１）で上記と同
様の条件でＰＣＲを行い、３種類のＰＣＲ増幅断片（配
列番号：１２〜１４）を得た。これらを常法に従い回収
し、配列番号：１２に示す断片を制限酵素ＢａｍＨＩお
よびＥｃｏＲＶ で、配列番号：１３に示す断片を制限
酵素ＨｉｎｃＩＩおよびＳｎａｂＩ で、配列番号：１
４に示す断片を制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＥｃｏＲＩ
で、それぞれ切断後、制限酵素処理した配列番号：１２
に示す断片と制限酵素処理した配列番号：１４に示す断
片を混和してｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ部位
へ常法に従い挿入し、組換えベクターを得た。さらにこ
のベクターを制限酵素ＥｃｏＲ Ｖで切断後、配列番
号：１３に示す断片を常法に従い挿入し組換えベクター
を得、挿入されたＤＮＡの塩基配列（配列番号：１５）
を上記と同様にして確認した。その後、制限酵素Ｂａｍ
ＨＩおよびＥｃｏＲＩ で挿入されたＤＮＡを回収し、
これを制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断した
ｐＢＭ０３０に常法に従い挿入して、カイコ発現用組換
えベクターｐＢＭγＳ２(-)を作製した。また、ｐＢＭ
γＳ２(-)を鋳型として配列番号：１６と配列番号：１
７に示すプライマーの組合せ、配列番号：１６と配列番
号：２１に示すプライマーの組合せ、配列番号１６：と
配列番号：２２に示すプライマーの組合せ、配列番号：
１６と配列番号：２３に示すプライマーの組合せ、配列
番号：１６と配列番号：２４に示すプライマーの組合
せ、配列番号：１６と配列番号：２５に示すプライマー
の組合せ、配列番号：１６と配列番号：３８に示すプラ
イマーの組合せ、配列番号：１６と配列番号：３９に示
すプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行い、それぞれ
配列番号：１８、配列番号：２６、配列番号：２７、配
列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列
番号：４０、配列番号：４１に示すＤＮＡ断片を得、こ
れを同様にして制限酵素処理後、ｐＢＭ０３０のＢｇｌ
ＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位に挿入し、それぞれｐＢＭγ
Ｓ２(-)／-２０、ｐＢＭγＳ２(-)／-１６、ｐＢＭγＳ
２(-)／-１５、ｐＢＭγＳ２(-)／-１７、ｐＢＭγＳ２
(-)／-１８、ｐＢＭγＳ２(-)／-１９、ｐＢＭγＳ２
(-)／-１４、ｐＢＭγＳ２(-)／-１３を作製した。ま
た、上記で得られた配列番号：５に示す、改変前のイヌ
ＩＦＮ-γをコードするＤＮＡ断片を同様にして制限酵
素処理後、ｐＢＭ０３０のＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ
部位に挿入し、ｐＢＭγを作製した。 （３）イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質をコー
ドするＤＮＡで組換えられた組換えカイコ核多角体病ウ
イルスの作製 文献２の方法で組換えウイルスを作製した。すなわち、
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、０．
２８Ｍ ＮａＣｌ、０．７ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、０．７
ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄からなる２．５ｍｌの溶液に、２．
５ｍｌのＤＮＡ混合液（０．２５Ｍ ＣａＣｌ₂、カイ
コ核多角体病ウイルスＢｍＮＰＶ Ｔ３株（文献８）の
ＤＮＡ１０μｇ、カイコ発現用組換えベクター６５μｇ
を含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを５ｍｌの
１０％ＦＢＳを添加したＴＣ−１０培地（文献８）中、
２５ｃｍ²のフラスコで平面培養した約３×１０⁵個のＢ
ｍＮ細胞の培養基に加え、カイコ細胞にＤＮＡを導入し
た。２０時間後、新鮮な培地と交換し、さらに７日間培
養後、培養液を回収した。その培養液を遠心して清澄化
した上清を希釈して平面に培養したＢＭ−Ｎ細胞の培養
基に添加して８日間培養後、顕微鏡観察によりウイルス
感染が見られ、かつ多角体が形成していない培養基を選
択した（限界希釈法）。

【００３９】限界希釈法を７回繰り返し、組換え体ウイ
ルスをクローニングした。ここで作製したイヌＩＦＮ-
γ変異体をコードするＤＮＡ（配列番号：１、配列番
号：２、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：
３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３
６および配列番号：３７）を含む組換えウイルスをそれ
ぞれｒＢＮＶγＳ２(-)、ｒＢＮＶγＳ２(-)／-２０、
ｒＢＮＶγＳ２(-)／-１６、ｒＢＮＶγＳ２(-)／-１
５、ｒＢＮＶγＳ２(-)／-１７、ｒＢＮＶγＳ２(-)／-
１８およびｒＢＮＶγＳ２(-)／-１９、ｒＢＮＶγＳ２
(-)／-１４、、ｒＢＮＶγＳ２(-)／-１３、イヌＩＦＮ
-γをコードするＤＮＡ（配列番号：５）を含む組換え
ウイルスをｒＢＮＶγとした。

【００４０】（４）組換え体ウイルス液の調製 ７５ｃｍ²のフラスコ底面で、１５ｍｌの１０％ＦＢＳ
を含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０⁶個
のＢｍＮ細胞に、前記（３）でクローニングした、それ
ぞれの組換え体ウイルスを含む培養液それぞれ５０μｌ
づつをＢＭ−Ｎ細胞に添加して、２７℃で５日間培養
後、培養液を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、
遠心上清を組換え体ウイルス液として得た。それぞれの
ウイルス液を１０⁷倍希釈し、その１ｍｌをＢＭ−Ｎ細
胞の培養基に添加して２７℃で７日間培養を続けると、
顕微鏡観察によって培養基のＢＭ−Ｎ細胞にそれぞれウ
イルス感染が認められた。

【００４１】実施例２ カイコ生体中でのイヌＩＦＮ-
γの活性を有するタンパク質の生産５令２日目のカイコ
幼虫に、実施例１で得た組換え体ウイルスｒＢＮＶγＳ
２(-)のウイルス液をカイコ１００頭に２μｌ／頭づつ
注射し、２５℃で４日間、市販の人工飼料（カネボウシ
ルクエレガンス社製）を与えて飼育した。飼育後、４５
０ｍｌの抽出液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．０１
％塩化ベンザルコニウム、ｐＨ：５．５）および４５０
ｍｌの抽出液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２．５ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．０１％塩化ベンザルコニウム、ｐＨ：
５．５）にそれぞれ５０頭づつのカイコを腹部を切って
添加し、１晩静置した。カイコの死骸を取り除き、３，
０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、その上清をフ
ィルター（ウルチポア ＧＦ ＰＬＵＳ，ＰＡＬＬ社製）
でろ過し、イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質が
生産されたカイコ体液抽出液およびカイコ体液抽出液
を得た。

【００４２】また、実施例１（３）で得たすべての組換
えウイルスをそれぞれカイコ幼虫にに注射、上記と同様
の操作法にてそれぞれのイヌＩＦＮ-γの活性を有する
タンパク質が生産されたカイコ体液抽出液を得た。

【００４３】実施例３ ウエスタンブロッティングによ
るイヌＩＦＮ-γの検出 （１）抗イヌＩＦＮ-γポリクローナル抗体の作製 実施例１（２）で得られた配列番号：５に示すＤＮＡ断
片を鋳型として、２種類のプライマー（配列番号：１９
および配列番号：２０）を用いて、ＤＮＡの変性条件を
９４℃，１分、プライマ−のアニ−リング条件を５５
℃、２分、プライマ−の伸長条件を７２℃、３分の各条
件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡ
サ−マルサイクラ−を用い、３０サイクルでＰＣＲを行
い、約５００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。これを制限酵素
ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、同様に制限酵素Ｎ
ｃｏＩおよびＢａｍＨＩで処理した大腸菌発現ベクター
ｐＥＴ８ｃに連結した。これを用いて大腸菌ＨＢ１０１
を形質転換しプラスミドを抽出、精製後、これを用いて
さらに大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。この形質転換体
を１ＬのＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００ が約０．７に
なるまで３７℃で培養し、終濃度０．５ｍＭのイソプロ
ピルーβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（アマシャムフ
ァルマシアバイオテク（株）製）を加えて、さらに１．
５時間培養した。培養後、培養液を６０００ｇで１０分
間遠心後、上清を捨て、５０ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７）に懸濁し、氷上にてハンディーソニックを
用いて菌体を破砕した。１００００ｇで３０分間遠心
し、可溶性画分（上清）を得た。この画分をスルホプロ
ピル担体（アマシャムファルマシアバイオテク（株）
製）を充填したカラムにアプライした後、十分量の２０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）でカラムを洗浄し、０．５
〜１ＭのＮａＣｌで溶出して得られた吸着画分をさらに
ブルーセファロース担体（アマシャムファルマシアバイ
オテク（株）製）を充填したカラムにアプライし、同様
にして洗浄後、１〜１．５ＭのＮａＣｌで溶出して得ら
れた吸着画分を得た。得られた画分を透析によって脱塩
して、精製した大腸菌生産イヌＩＦＮ-γを得た。ドデ
シル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）解析によると、この画分中のイヌ
ＩＦＮ-γの純度は９０％以上であった。この精製した
イヌＩＦＮ-γ５ｍｇをウサギ１頭の腹腔に注入し４週
間後、イヌＩＦＮ-γに対するポリクローナル抗体が産
生された血清を得た。

【００４４】（２）ウエスタンブロッティング 実施例２で得られたそれぞれのカイコ体液中のイヌＩＦ
Ｎ-γをウエスタンブロッティング法によって検出し
た。それぞれの体液をアトー（株）製のパジェル中、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、アトー（株）製のク
リアブロットメンブランに常法に従ってブロッティング
後、メンブランを、上記（１）で得られた抗イヌＩＦＮ
-γポリクローナル抗体を含むウサギ血清を含むブロッ
クエース（大日本製薬（株）製）溶液に６時間反応さ
せ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて３回洗
浄し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ
（バイオラット（株）製）を含むブロックエース溶液に
６時間反応させ、同様に洗浄した後、コニカ（株）製の
コニカイムノステインＨＲＰ１０００にて発色を行っ
た。その結果、改変前のイヌＩＦＮ-γが生産されたカ
イコ体液は検出されたイヌＩＦＮ-γのバンドが５本で
あったのに対して、イヌＩＦＮ-γ変異体が生産された
カイコ体液は１ー２本であり、２本のものでは１本がメ
ジャーなバンドであった。

【００４５】実施例４ 活性測定 実施例２で得られたそれぞれのカイコ体液中のイヌＩＦ
Ｎ-γの活性を測定した。活性は抗ウイルス活性測定法
により行った。ウイルスとしてＶｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓ
ｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ，感受性細胞としてイ
ヌＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）を用い、文献１
０のＣＰＥ法に従って抗ウイルス活性を測定した結果、
改変前のイヌＩＦＮ-γが生産されたカイコ体液は約２
×１０⁷希釈単位／ｍｌであったのに対し、イヌＩＦＮ-
γ変異体が生産されたカイコ体液はすべて約４×１０⁷
希釈単位／ｍｌと遺伝子改変前の約２倍の抗ウイルス活
性が得られた。

【００４６】実施例５ 各イヌＩＦＮγの活性を有する
タンパク質の大腸菌での生産 実施例１（２）で得られたｐＢＭγＳ２(-)を鋳型とし
て配列番号：１９と配列番号：２０に示すプライマーの
組合せ、配列番号：１９と配列番号：４２に示すプライ
マーの組合せ、配列番号１９：と配列番号：４３に示す
プライマーの組合せ、配列番号：１９と配列番号：４４
に示すプライマーの組合せ、配列番号：１９と配列番
号：４５に示すプライマーの組合せ、配列番号：１９と
配列番号：４６に示すプライマーの組合せ、配列番号：
１９と配列番号：４７に示すプライマーの組合せ、配列
番号：１９と配列番号：４８に示すプライマーの組合
せ、配列番号：１９と配列番号：４９に示すプライマー
の組合せ、配列番号：１９と配列番号：５０に示すプラ
イマーの組合せを用いてＰＣＲを行い、それぞれ配列番
号：５１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番
号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６、配列番
号：５７、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番
号：６０に示すＤＮＡ断片を得、これらを制限酵素Ｎｃ
ｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、同様に制限酵素Ｎｃｏ
ＩおよびＢａｍＨＩで処理した大腸菌発現ベクターｐＥ
Ｔ８ｃに連結し、それぞれｐＥＴγＳ２(-)、ｐＥＴγ
Ｓ２(-)／-２０、ｐＥＴγＳ２(-)／-１６、ｐＥＴγＳ
２(-)／-１５、ｐＥＴγＳ２(-)／-１７、ｐＥＴγＳ２
(-)／-１８、ｐＥＴγＳ２(-)／-１９、ｐＥＴγＳ２
(-)／-１４、ｐＥＴγＳ２(-)／-１３、ｐＥＴγＳ２
(-)／-２１を作製した。これらの組換えベクターはイヌ
ＩＦＮγ変異体のＣ末端アミノ酸の欠損数がそれぞれ
０、２０、１６、１５、１７、１８、１９、１４、１
３、２１となるようにコードされた遺伝子配列を有す
る。これらを用いて大腸菌ＨＢ１０１を形質転換しプラ
スミドを抽出、精製後、これを用いてさらに大腸菌ＢＬ
２１を形質転換した。この形質転換体をそれぞれ１０ｍ
ＬのＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００ が約０．７になる
まで３７℃で培養し、終濃度０．５ｍＭのイソプロピル
ーβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（アマシャムファル
マシアバイオテク（株）製）を加えて、さらに１．５時
間培養した。培養後、培養液を６０００ｇで１０分間遠
心後、上清を捨て、ベーリンガーマンハイム（株）製の
各プロテアーゼインヒビター（E64(10μg/ml)、Leupept
in(0.5μg/ml)、PMSF(170μg/ml、Aprotinin(50/μg/m
l)、Chymostatin(60/μg/ml)、EDTA-Na₂(0.5μg/ml)）
を含む５０ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸
濁し、氷上にてハンディーソニックを用いて菌体を破砕
した。１００００ｇで３０分間遠心し、Ｃ末端アミノ酸
の欠損数が異なる各イヌＩＦＮ-γ変異体が生産された
可溶性画分（上清）を得た。

【００４７】実施例６ 各イヌＩＦＮ-γの活性を有す
るタンパク質の活性比較 実施例５で作製したＣ末端アミノ酸の欠損数が異なる各
イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質の活性の検証
を行った。抗ウイルス活性は、Ｃ末端アミノ酸の欠損数
が２１のもののみ活性が認められなかった。その他の各
イヌＩＦＮγの活性を有するタンパク質はそれぞれ約１
０⁷Ｕ／ｍｌの活性が認められた。

【００４８】また、免疫増強活性に関しても検証を行っ
た。クラスＩＩＭＨＣを発現したイヌ乳腺腫瘍組織由来
細胞株ＦＣＢＲ１（文献１１）を用いて、上記の各イヌ
ＩＦＮγ変異体のクラスＩＩＭＨＣの発現増強活性を測
定した。６ｃｍディッシュに、１０⁵個のＦＣＢＲ１を
接着させ、これに上記の各培養液１００μｌを添加し、
５％ＣＯ₂、３７℃の各条件で１晩培養した。培養後、
トリプシンにて細胞を剥離し、１．５ｍｌのミクロ遠心
チューブにて遠心した。これに、１０μｌのラット抗イ
ヌクラスＩＩＭＨＣモノクローナル抗体（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ社製）を添加し、さらに５０μｌの１０％ＦＢ
Ｓ−ＥＲＤＦで懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳ
で洗浄した後、５μｌのＦＩＴＣ標識ラビット抗ラット
モノクローナル抗体（セロテック社製）および５０μｌ
の１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで懸濁し、氷上で１時間静置
した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン（株）
のＦＡＣＳｃａｎにて解析した。その結果、Ｃ末端アミ
ノ酸の欠損数が２１のもののみ活性が認められず、それ
以外のイヌＩＦＮγの活性を有するタンパク質はすべて
ＦＣＢＲ１上のクラスＩＩＭＨＣの発現量を約８０％上
昇させた。

【００４９】これらのことから、イヌＩＦＮ-γは、Ｃ
末端アミノ酸の欠損数が２０まではそれぞれ同等の生物
活性を有し、Ｃ末端アミノ酸の欠損数が２１以上になる
と活性が喪失することが明らかになった。従って、ｉｎ
ｖｉｖｏにおいても、Ｃ末端アミノ酸の欠損数が２０
までは各イヌＩＦＮ-γは種々のイヌ疾病に対して、同
等の薬効を示すものと考えられる。

【００５０】実施例７ カイコ生体中で生産したイヌＩ
ＦＮ-γの活性を有するタンパク質の精製 （１）初段にＣｕキレート担体を用いたイヌＩＦＮ-γ
の活性を有するタンパク質の精製 実施例２で得られたイヌＩＦＮ-γの活性を有するタン
パク質が生産されたカイコ体液抽出液およびカイコ体
液抽出液を用いて、Ｃｕキレート担体による精製を行
った。担体は、Chelating Sepharose Fast Flow（Amers
ham-Pharmacia社製）に１％硫酸銅水溶液を用いて銅イ
オンを結合させ、調製した。精製はまず、カイコ体液抽
出液を用いて検討を行った。抽出液はｐＨ値を５．５
に調製し、Ｃｕキレート担体にアプライした。担体の容
量は抽出液と等量とし、アプライ後の洗浄は２０ｍＭ酢
酸緩衝液（ｐＨ：５．５）にてＵＶ吸収がなくなるまで
十分に行った。カラムに吸着したタンパク質の溶出は塩
化アンモニウムの塩濃度を１Ｍまで段階的に上げて行
い、またそれでも溶出されないタンパク質は０．１Ｍの
ＥＤＴＡおよび０．１ＮのＮａＯＨを用いて溶出した。
各フラクションのイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパ
ク質および夾雑タンパクの検出はウエスタンブロッティ
ング、銀染色およびＨＰＬＣにて行った。その結果、低
分子のイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質は非吸
着画分に銀染色にてイヌＩＦＮ-γのバンドがクリアに
検出でき、夾雑タンパク質はほとんど除去されていた。
なお、その他の画分には低分子のイヌＩＦＮ-γは全く
検出されなかった。また、高分子のイヌＩＦＮ-γは非
吸着画分には検出されず、０．１〜０．６Ｍ塩化アンモ
ニウム溶出画分において検出された。なお、この画分に
も夾雑タンパク質はほとんど検出されなかった。さらに
０．１ＭのＥＤＴＡおよび０．１ＮのＮａＯＨを用いて
溶出した画分に夾雑タンパク質が検出され、ここにはイ
ヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質は全く検出され
なかった。

【００５１】次にカイコ体液抽出液を用いて検討を行
った。本体液抽出液中にはＥＤＴＡが含有しており、そ
のままＣｕキレート担体にアプライするとＣｕイオンが
破荷してしまい精製不能となるため、まず限外ろ過によ
り、ＥＤＴＡを除いた。限外ろ過はＡｍｉｃｏｎ社のＨ
ＯＬＬＯＷ ＦＩＢＥＲ ＣＡＲＴＲＩＤＧＥ（TYPE:HOP
10-20）を用い、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ：５．５）に置換した。以降はカイコ体液抽出液と
同様の操作を行って、同様の結果が得られた。

【００５２】このように、初段にＣｕキレート担体を用
いた精製法によって、カイコ由来夾雑タンパクの大部分
を除去し、低分子のイヌＩＦＮ-γと高分子のイヌＩＦ
Ｎ-γも分画できた。 （２）Ｑセファロース担体を用いたイヌＩＦＮ-γの活
性を有するタンパク質の精製 上記（１）の２種類の初段Ｃｕキレート精製液を用いて
２段目Ｑセファロース担体による低分子イヌＩＦＮ-γ
の分画を検討した。精製はｐＨ：９で行った。初段Ｃｕ
キレート精製液をそれぞれ限外ろ過にて２０ｍＭのグリ
シンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ：９）に置換し、担体にアプ
ライした。限外ろ過はＡＤＶＡＮＴＥＣ社のＦＩＬＴＥ
Ｒ ＨＯＬＤＥＲ（MODEL: UHP-43KおよびUHP-76K）（装
置）およびＡｍｉｃｏｎ社のＹＭ１０（膜）をそれぞれ
用いた。窒素ボンベの圧力は1.2〜1.5kg/cm2で行った。
なお、各操作は装置を氷冷しながら行った。溶出はＮａ
Ｃｌの濃度を１Ｍまで５ｍＭ刻みで行った。その結果、
カイコ体液抽出液由来の初段Ｃｕキレート精製液およ
びカイコ体液抽出液由来の初段Ｃｕキレート精製液ど
ちらの精製液を用いた場合も、２０〜２５ｍＭ（画分
），３０〜３５ｍＭ（画分）および４０〜５０ｍＭ
（画分）の各ＮａＣｌ濃度の溶出画分でイヌＩＦＮ-
γが溶出された（ウエスタンブロッティング）。なおそ
の他の溶出画分およびアルカリ洗浄画分ではイヌＩＦＮ
γは検出されなかった。

【００５３】イヌＩＦＮ-γが溶出されたそれぞれの画
分をＨＰＬＣで解析した。ＨＰＬＣ解析は、装置はＨＰ
ＬＣシステム（島津ＬＣ−１０ＡＤ）を、カラムはコス
モシール５Ｃ１８ ＡＲ-３００（ナカライテスク社製）
を用いた。移動相Ａに０．０５％トリフルオロ酢酸水溶
液を用い、移動相Ｂには０．０５％トリフルオロ酢酸を
含む１００％アセトニトリルを用いた。流速は１ml/min
とし、ピークの検出は２１０ｎｍで行った。溶出は移動
相Ｂのリニアグラジェント（０分：４０％移動相Ｂ、３
０分：４６％移動相Ｂ）で行った。その結果、画分に
おけるメインピークはリテンションタイムが約２８分、
画分におけるメインピークはリテンションタイムが約
２８分と約２９分、画分におけるメインピ ークはリ
テンションタイムが約２９分であった。それぞれのメイ
ンピークを分取し、構造解析を行った。分子量はTOF-MA
Sによって測定し、Ｃ末端アミノ酸配列は臭化シアン分
解後、ペプチドマッピングを行い、得られたＣ末端ペプ
チドをエドマン分解法によって決定した。その結果、画
分におけるリテンションタイムが約２８分のメインピ
ークはＣ末端が１６アミノ酸残基欠損したイヌＩＦＮγ
／１６ーであり、画分におけるリテンションタイムが
約２８分のメインピークと約２９分のメインピークはそ
れぞれＣ末端が１６アミノ酸残基欠損したイヌＩＦＮγ
／１６ーとＣ末端が１７アミノ酸残基欠損したイヌＩＦ
Ｎγ／１７ーであった。また、画分におけるリテンシ
ョンタイムが約２９分のメインピークはＣ末端が１７ア
ミノ酸残基欠損したイヌＩＦＮγ／１７ーであった。な
お、ここで検出されたイヌＩＦＮγ／１６ーとイヌＩＦ
Ｎγ／１７ーのそれぞれの分子量は前者が約14850であ
り、後者が約14950であった。さらに、画分〜をゲ
ルろ過により分子量解析した結果、それぞれ溶出された
イヌＩＦＮγの活性を有するタンパク質がダイマー構造
で存在することが判った。従って、Ｑセファロース担体
での３つの溶出画分におけるメインのイヌＩＦＮγの活
性を有するタンパク質は、画分がイヌＩＦＮ-γ／１
６ーのホモ２量体、画分がイヌＩＦＮ-γ／１６ーと
イヌＩＦＮ-γ／１７ーのヘテロ２量体、画分がイヌ
ＩＦＮ-γ／１７ーのホモ２量体から成ることが判明し
た。画分および画分からはそれぞれイヌＩＦＮ-γ
／１６ー、イヌＩＦＮ-γ／１７ーのイヌＩＦＮ-γの活
性を有するタンパク質が高純度で精製できる。しかしな
がら、画分においてはヘテロ２量体からなるイヌＩＦ
Ｎγの活性を有するタンパク質がメイン成分であるた
め、ＨＰＬＣの検定で高純度に精製することは困難であ
る。

【００５４】また、上記（１）で得られたカイコ体液抽
出液由来の初段Ｃｕキレート精製液と、カイコ体液抽
出液由来の初段Ｃｕキレート精製液とでは画分と画
分における、それぞれのイヌＩＦＮγ／１６ーとイヌ
ＩＦＮγ／１７ーの量が異なり、カイコ体液抽出液由
来のものではイヌＩＦＮγ／１７ーの量が非常に多く、
一方、カイコ体液抽出液由来のものではイヌＩＦＮγ
／１６ーの量が非常に多い。カイコ体液抽出液中のＥＤ
ＴＡの有無によって、イヌＩＦＮγの活性を有するタン
パク質のＣ末端構造の分解の受け方が異なることが判明
した。 （３）ブルー担体を用いたイヌＩＦＮ-γの活性を有す
るタンパク質の精製 さらに、（２）で得られた各溶出画分（カイコ体液抽出
液由来のＱセファロース担体による溶出画分および
カイコ体液抽出液由来のＱセファロース担体による溶
出画分）をそれぞれ別々にブルー担体に供し、イヌＩ
ＦＮ-γの活性を有するタンパク質の単一化を検討し
た。担体へのアプライはｐＨ：５．５で行った。各溶出
画分をそれぞれ限外ろ過にて２０ｍＭの酢酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ：５．５）に置換し、担体にアプライし
た。限外ろ過はＡＤＶＡＮＴＥＣ社のＦＩＬＴＥＲ Ｈ
ＯＬＤＥＲ（MODEL: UHP-43KおよびUHP-76K）（装置）
およびＡｍｉｃｏｎ社のＹＭ１０（膜）をそれぞれ用い
た。窒素ボンベの圧力は1.2〜1.5kg/cm2で行った。な
お、各操作は装置を氷冷しながら行った。溶出は２０ｍ
Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ：７．１）中でのＮ
ａＣｌの濃度を０〜１Ｍまで段階的に上げて行った。そ
の結果、カイコ体液抽出液由来のＱセファロース担体
による溶出画分では、ＮａＣｌの濃度が０Ｍで、カイ
コ体液抽出液由来のＱセファロース担体による溶出画
分では、ＮａＣｌの濃度が５０ｍＭ〜１５０ｍＭでそ
れぞれイヌＩＦＮ-γ／１７ーのホモ２量体、イヌＩＦ
Ｎ-γ／１６ーのホモ２量体がＨＰＬＣ解析でそれぞれ
９６％の純度で精製できた。 （４）不純物の同定 （３）で得られた、イヌＩＦＮ-γ／１７ーのホモ２量
体およびイヌＩＦＮ-γ／１６ーのホモ２量体それぞれ
の精製液中に含まれる不純物を解析した。解析は、ＨＰ
ＬＣで検出される不純物のピークをそれぞれ分取し、そ
れぞれを４Ｍ尿素存在下で、Achromobacter Protease I
で３７℃、１６時間消化後、逆相カラム（ＯＤＳ ８０
Ｔｓ．、ＴＯＳＯＨ社製）を用いてＨＰＬＣ解析を行っ
た。移動相Ａに０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液を用
い、移動相Ｂには０．０５％トリフルオロ酢酸を含む６
０％アセトニトリルを用いた。流速は０．８ｍｌ／ｍｉ
ｎとし、ピークの検出は２１４ｎｍで行った。溶出は移
動相Ｂのリニアグラジェント（０〜５分：０％移動相
Ｂ、５〜５５分：９０％移動相Ｂ）で行った。なお、温
度は５０℃で行った。その結果検出されたペプチド断片
をすべて分取し、構造解析を行った。分子量はTOF-MAS
によって測定し、アミノ酸配列はエドマン分解法によっ
て決定した。解析の結果、不純物は全てイヌＩＦＮ-γ
の活性を有するタンパク質であり、Ｃ末端が１５アミノ
酸残基欠損したイヌＩＦＮ-γ／１５ー、イヌＩＦＮ-γ
／１６ーのＮ末端側のメチオニンが酸化されたイヌＩＦ
Ｎ-γ／１６ー（MetSOX）、およびイヌＩＦＮ-γ／１７
ーのＮ末端側のメチオニンが酸化されたイヌＩＦＮ-γ
／１７ー（MetSOX）が含まれることが分かった。 （５）界面活性剤の添加による精製収率向上効果 イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質の精製過程に
おいて、担体を詰めるカラム、チューブ、受ける容器、
限外ろ過装置および膜などへイヌＩＦＮ-γの活性を有
するタンパク質が吸着し、そのため精製収率が低下する
可能性がある。日本薬局方に記載されている界面活性剤
であるポリオキシエチレン硬化ヒマシ油を精製工程に添
加し、精製収率の向上効果を検討した。０．０１％のポ
リオキシエチレン硬化ヒマシ油を精製の全工程に添加
し、上記（１）〜（３）と同様の条件でカイコ生体中で
生産したイヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質を精
製した結果、各精製ステップでの精製挙動に全く変化は
認められず、限外ろ過において、回収率が添加前の約９
０％から約１００％に向上し、さらに各担体での精製収
率がそれぞれ５〜３０％向上した。

【００５５】実施例８ イヌＩＦＮ-γの活性を有する
タンパク質製剤の調製 実施例７で得られたイヌＩＦＮ-γ／１７ーのホモ２量
体およびイヌＩＦＮ-γ／１６ーのホモ２量体それぞれ
の精製溶液に、注射用生理食塩水、アラビアゴム（三栄
薬品貿易（株））、ポリエチレングリコール、グリシン
を加えて、アラビアゴム終濃度１％、ポリエチレングリ
コール終濃度０．５％、グリシン１０ｍＭに調製した。
さらに、ポジダイン（ポール（株））で処理してパイロ
ジェンを除去した後、２５０℃で２時間乾熱滅菌したガ
ラスバイアルに１ｍｌずつ分注した。その後、無菌的に
凍結乾燥することによって、１バイアル中に０.１ＭＵ
から２.５ＭＵのイヌＩＦＮ-γを含むイヌＩＦＮ-γ製
剤を得た。このイヌＩＦＮ-γ製剤は、室温暗条件下で
安定であり、また、蒸留水または生理的食塩水によって
良好に溶解した。

【００５６】実施例９ イヌＩＦＮ-γの活性を有する
タンパク質によるイヌ皮膚病の治療 実施例８で得られたイヌＩＦＮ-γの活性を有するタン
パク質の製剤を用いて、イヌ皮膚病に対する治療効果を
試験した。イヌＩＦＮ-γの活性を有するタンパク質の
製剤を１ｍｌの注射用生理的食塩水で溶解後、皮下注射
により投与し、皮膚疾患および副作用について臨床症状
を観察することによって治療効果を判定した。各投与量
の製剤溶液を３〜７回、皮下注射にて投与した臨床結果
を表１に示す。また、０．０１ＭＵ／ｋｇの投与量で連
日５回皮下注射にて投与し、２週間後の臨床結果を表２
に示す。投与の結果、脂漏性皮膚炎、膿皮症、アカント
ーシス、真菌性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、天疱瘡、ウ
ジ寄生性皮膚炎、エストロゲン反応性皮膚炎、アレルギ
ー性皮膚炎、マラセチア皮膚炎、慢性湿疹、膿疱疹、表
皮異形成に対して驚くべき治療効果が認められた。な
お、すべての症例において臨床上問題となる副作用は認
められなかった。

【００５７】

【表１】

【００５８】

【表２】

【００５９】

【表３】

【００６０】

【発明の効果】本発明によれば、インターフェロンーγ
の活性を有するタンパク質を高純度化でき、以ってイン
ターフェロンーγを医薬品として製造することが期待で
きる。

【００６１】参考文献 １．Ａｄｏｌｆら：Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅ
ｓ．７，１７３−１８３（１９８７）． ２．Ｄｅｖｏｓら：Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅ
ｓ．１２，９５−１０２（１９９２）． ３．Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２５９，６７９０−６７９７（１９８４）． ４．Ｃｈｉｒｇｗｉｎら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
１８、５２９４（１９７９）． ５．Ｂｅｒｇｅｒら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１
８，５１４３（１９７９）． ６．Ｇｕｂｌｅｒら：Ｇｅｎｅ．２５，２３６−２６９
（１９８３）． ７．Ｏｋａｙａｍａら：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２，１６１，（１９８２） ＆ ３，２８０，
（１９８３）． ８．Ｔ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉら：Ａｇｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，５１，１５７３−１５８０，（１９８７）． ９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ．
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１９８２． １０．日本生化学会編：続生化学実験講座第５巻、（１
９８６）．Ｐ２５０−２５６、東京化学同人． １１．Ｏｋａｎｏら：Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎ
ｄ ＣｙｔｏｋｉｎｅＲｅｓ．１７，７１３−７１８
（１９９７）．

【００６２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 東レ株式会社 <120> イヌインターフェロン−γの活性を有するタンパク質の高純度製造法、 イヌインターフェロン−γの活性を有する高純度タンパク質、イヌ疾病の治療剤 およびイヌ疾病の治療方法 <130> 51E15601 <160> 60 <210> 1 <211> 501 <212> DNA PRT <213> dog <220> <221> CDS <222> (1)...(498) <220> <221> mat#peptide <222> (70)...(498) <400> 1 atg aat tat aca agc tat atc tta gct ttt cag ctt tgc gtg att ttg 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu tgt tct tct ggc tgt aac tgt cag gcc atg ttt ttt aaa gaa ata gaa 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu aac cta aag gaa tat ttt cag gca agt aat cca gat gta tcg gac ggt 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly ggg tct ctt ttc gta gat att ttg aag aaa tgg aga gag gag agt gac 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys trp Arg Glu Glu Ser Asp aaa aca atc att cag agc caa att gtc tct ttc tac ttg aaa ctg ttt 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe gac aac ttt aaa gat aac cag atc att caa agg agc atg gat acc atc 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile aag gaa gac atg ctt ggc aag ttc tta cag tca tcc acc agt aag agg 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg gag gac ttc ctt aag ctg att caa att cct gtg aac gat ctg cag gtc 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val cag cgc aag gcg ata aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gat ctc tca 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser cca aga tcc aac cta agg aag cgg aaa agg agt cag aat ctg ttt cga 480 Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe Arg ggc cgc aga gca tcg aaa taa 501 Gly Arg Arg Ala Ser Lys *** <210> 2 <211> 441 <212> DNA PRT <213> dog <220> <221> CDS <222> (1)...(438) <220> <221> mat#peptide <222> (70)...(438) <400> 2 atg aat tat aca agc tat atc tta gct ttt cag ctt tgc gtg att ttg 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu tgt tct tct ggc tgt aac tgt cag gcc atg ttt ttt aaa gaa ata gaa 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu aac cta aag gaa tat ttt cag gca agt aat cca gat gta tcg gac ggt 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly ggg tct ctt ttc gta gat att ttg aag aaa tgg aga gag gag agt gac 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp aaa aca atc att cag agc caa att gtc tct ttc tac ttg aaa ctg ttt 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe gac aac ttt aaa gat aac cag atc att caa agg agc atg gat acc atc 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile aag gaa gac atg ctt ggc aag ttc tta cag tca tcc acc agt aag agg 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg gag gac ttc ctt aag ctg att caa att cct gtg aac gat ctg cag gtc 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val cag cgc aag gcg ata aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gat ctc tca 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser cca aga taa 441 Pro Arg *** <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 gcagatctat gaattataca agctatatct tagct 35 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 gcgaattctt atttcgatgc tctgcggcct cgaaa 35 <210> 5 <211> 517 <212> DNA <213> dog <400> 5 gcagatctat gaattataca agctatatct tagcttttca gctttgcgtg attttgtgtt 60 cttctggctg taactgtcag gccatgtttt ttaaagaaat agaaaaccta aaggaatatt 120 ttcaggcaag taatccagat gtatcggacg gtgggtctct tttcgtagat attttgaaga 180 aatggagaga ggagagtgac aaaacaatca ttcagagcca aattgtctct ttctacttga 240 aactgtttga caactttaaa gataaccaga tcattcaaag gagcatggat accatcaagg 300 aagacatgct tggcaagttc ttacagtcat ccaccagtaa gagggaggac ttccttaagc 360 tgattcaaat tcctgtgaac gatctgcagg tccagcgcaa ggcgataaat gaactcatca 420 aagtgatgaa tgatctctca ccaagatcca acctaaggaa gcggaaaagg agtcagaatc 480 tgtttcgagg ccgcagagca tcgaaataag aattcgc 517 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 ataggatcca tgaattatac aagctatatc 30 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 ctggatatct ggattacttg cctgaaaata ttc 33 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 ccatacgtat cggacggtgg gtctctt 27 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 ggtggtcgac tgtaagaact tgccaagcat gtcttc 36 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 ccgatatcca ccagtaagag ggaggacttc cttaag 36 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 ctcgaattct tatttcgatg ctctgcggcc tcg 33 <210> 12 <211> 147 <212> DNA <213> dog <400> 12 ataggatcca tgaattatac aagctatatc ttagcttttc agctttgcgt gattttgtgt 60 tcttctggct gtaactgtca ggccatgttt tttaaagaaa tagaaaacct aaaggaatat 120 tttcaggcaa gtaatccaga tatccag 147 <210> 13 <211> 201 <212> DNA <213> dog <400> 13 ccatacgtat cggacggtgg gtctcttttc gtagatattt tgaagaaatg gagagaggag 60 agtgacaaaa caatcattca gagccaaatt gtctctttct acttgaaact gtttgacaac 120 tttaaagata accagatcat tcaaaggagc atggatacca tcaaggaaga catgcttggc 180 aagttcttac agtcgaccac c 201 <210> 14 <211> 195 <212> DNA <213> dog <400> 14 ccgatatcca ccagtaagag ggaggacttc cttaagctga ttcaaattcc tgtgaacgat 60 ctgcaggtcc agcgcaaggc gataaatgaa ctcatcaaag tgatgaatga tctctcacca 120 agatccaacc taaggaagcg gaaaaggagt cagaatctgt ttcgaggccg cagagcatcg 180 aaataagaat tcgag 195 <210> 15 <211> 517 <212> DNA <213> dog <400> 15 gcagatctat gaattataca agctatatct tagcttttca gctttgcgtg attttgtgtt 60 cttctggctg taactgtcag gccatgtttt ttaaagaaat agaaaaccta aaggaatatt 120 ttaatgcaag taatccagat gtatcggacg gtgggtctct tttcgtagat attttgaaga 180 aatggagaga ggagagtgac aaaacaatca ttcagagcca aattgtctct ttctacttga 240 aactgtttga caactttaaa gataaccaga tcattcaaag gagcatggat accatcaagg 300 aagacatgct tggcaagttc ttaaatagca gcaccagtaa gagggaggac ttccttaagc 360 tgattcaaat tcctgtgaac gatctgcagg tccagcgcaa ggcgataaat gaactcatca 420 aagtgatgaa tgatctctca ccaagatcca acctaaggaa gcggaaaagg agtcagaatc 480 tgtttcgagg ccgcagagca tcgaaataag aattcgc 517 <210> 16 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 gcggaattct tatcttggtg agagatcatt catcactttg at 42 <210> 17 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 gcgggatcct tatcttggtg agagatcatt catcactttg at 42 <210> 18 <211> 457 <212> DNA <213> dog <400> 18 gcagatctat gaattataca agctatatct tagcttttca gctttgcgtg attttgtgtt 60 cttctggctg taactgtcag gccatgtttt ttaaagaaat agaaaaccta aaggaatatt 120 ttcaggcaag taatccagat gtatcggacg gtgggtctct tttcgtagat attttgaaga 180 aatggagaga ggagagtgac aaaacaatca ttcagagcca aattgtctct ttctacttga 240 aactgtttga caactttaaa gataaccaga tcattcaaag gagcatggat accatcaagg 300 aagacatgct tggcaagttc ttacagtcat ccaccagtaa gagggaggac ttccttaagc 360 tgattcaaat tcctgtgaac gatctgcagg tccagcgcaa ggcgataaat gaactcatca 420 aagtgatgaa tgatctctca ccaagataag aattcgc 457 <210> 19 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 19 ccgaccatgg ctcaggccat gttttttaaa gaaatagaaa ac 42 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 20 ggcggatcct tatttcgatg ctctgcggcc tcgaaacag 39 <210> 21 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 21 gcgggatcct taccttaggt tggatcttgg tgagagatca tt 42 <210> 22 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 22 gcgggatcct tacttcctta ggttggatct tggtgagaga tc 42 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 23 gcgggatcct tataggttgg atcttggtga gagatcattc at 42 <210> 24 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 24 gcgggatcct tagttggatc ttggtgagag atcattcatc ac 42 <210> 25 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 25 gcgggatcct taggatcttg gtgagagatc attcatcact tt 42 <210> 26 <211> 469 <212> DNA <213> dog <400> 26 gcagatctat gaattataca agctatatct tagcttttca gctttgcgtg attttgtgtt 60 cttctggctg taactgtcag gccatgtttt ttaaagaaat agaaaaccta aaggaatatt 120 ttaatgcaag taatccagat gtatcggacg gtgggtctct tttcgtagat attttgaaga 180 aatggagaga ggagagtgac aaaacaatca ttcagagcca aattgtctct ttctacttga 240 aactgtttga caactttaaa gataaccaga tcattcaaag gagcatggat accatcaagg 300 aagacatgct tggcaagttc ttaaatagca gcaccagtaa gagggaggac ttccttaagc 360 tgattcaaat tcctgtgaac gatctgcagg tccagcgcaa ggcgataaat gaactcatca 420 aagtgatgaa tgatctctca ccaagatcca acctaaggta agaattcgc 469 <210> 27 <211> 472 <212> DNA <213> dog <400> 27 gcagatctat gaattataca agctatatct tagcttttca gctttgcgtg attttgtgtt 60 cttctggctg taactgtcag gccatgtttt ttaaagaaat agaaaaccta aaggaatatt 120 ttaatgcaag taatccagat gtatcggacg gtgggtctct tttcgtagat attttgaaga 180 aatggagaga ggagagtgac aaaacaatca ttcagagcca aattgtctct ttctacttga 240 aactgtttga caactttaaa gataaccaga tcattcaaag gagcatggat accatcaagg 300 aagacatgct tggcaagttc ttaaatagca gcaccagtaa gagggaggac ttccttaagc 360 tgattcaaat tcctgtgaac gatctgcagg tccagcgcaa ggcgataaat gaactcatca 420 aagtgatgaa tgatctctca ccaagatcca acctaaggaa gtaagaattc gc 472 <210> 28 <211> 466 <212> DNA <213> dog <400> 28 gcagatctat gaattataca agctatatct tagcttttca gctttgcgtg attttgtgtt 60 cttctggctg taactgtcag gccatgtttt ttaaagaaat agaaaaccta aaggaatatt 120 ttaatgcaag taatccagat gtatcggacg gtgggtctct tttcgtagat attttgaaga 180 aatggagaga ggagagtgac aaaacaatca ttcagagcca aattgtctct ttctacttga 240 aactgtttga caactttaaa gataaccaga tcattcaaag gagcatggat accatcaagg 300 aagacatgct tggcaagttc ttaaatagca gcaccagtaa gagggaggac ttccttaagc 360 tgattcaaat tcctgtgaac gatctgcagg tccagcgcaa ggcgataaat gaactcatca 420 aagtgatgaa tgatctctca ccaagatcca acctataaga attcgc 466 <210> 29 <211> 463 <212> DNA <213> dog <400> 29 gcagatctat gaattataca agctatatct tagcttttca gctttgcgtg attttgtgtt 60 cttctggctg taactgtcag gccatgtttt ttaaagaaat agaaaaccta aaggaatatt 120 ttaatgcaag taatccagat gtatcggacg gtgggtctct tttcgtagat attttgaaga 180 aatggagaga ggagagtgac aaaacaatca ttcagagcca aattgtctct ttctacttga 240 aactgtttga caactttaaa gataaccaga tcattcaaag gagcatggat accatcaagg 300 aagacatgct tggcaagttc ttaaatagca gcaccagtaa gagggaggac ttccttaagc 360 tgattcaaat tcctgtgaac gatctgcagg tccagcgcaa ggcgataaat gaactcatca 420 aagtgatgaa tgatctctca ccaagatcca actaagaatt cgc 463 <210> 30 <211> 460 <212> DNA <213> dog <400> 30 gcagatctat gaattataca agctatatct tagcttttca gctttgcgtg attttgtgtt 60 cttctggctg taactgtcag gccatgtttt ttaaagaaat agaaaaccta aaggaatatt 120 ttaatgcaag taatccagat gtatcggacg gtgggtctct tttcgtagat attttgaaga 180 aatggagaga ggagagtgac aaaacaatca ttcagagcca aattgtctct ttctacttga 240 aactgtttga caactttaaa gataaccaga tcattcaaag gagcatggat accatcaagg 300 aagacatgct tggcaagttc ttaaatagca gcaccagtaa gagggaggac ttccttaagc 360 tgattcaaat tcctgtgaac gatctgcagg tccagcgcaa ggcgataaat gaactcatca 420 aagtgatgaa tgatctctca ccaagatcct aagaattcgc 460 <210> 31 <211> 453 <212> DNA PRT <213> dog <220> <221> CDS <222> (1)...(450) <220> <221> mat#peptide <222> (70)...(450) <400> 31 atg aat tat aca agc tat atc tta gct ttt cag ctt tgc gtg att ttg 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu tgt tct tct ggc tgt aac tgt cag gcc atg ttt ttt aaa gaa ata gaa 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu aac cta aag gaa tat ttt cag gca agt aat cca gat gta tcg gac ggt 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly ggg tct ctt ttc gta gat att ttg aag aaa tgg aga gag gag agt gac 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp aaa aca atc att cag agc caa att gtc tct ttc tac ttg aaa ctg ttt 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe gac aac ttt aaa gat aac cag atc att caa agg agc atg gat acc atc 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile aag gaa gac atg ctt ggc aag ttc tta cag tca tcc acc agt aag agg 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg gag gac ttc ctt aag ctg att caa att cct gtg aac gat ctg cag gtc 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val cag cgc aag gcg ata aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gat ctc tca 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser cca aga tcc aac cta agg aag cgg taa 453 Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys Arg *** <210> 32 <211> 456 <212> DNA PRT <213> dog <220> <221> CDS <222> (1)...(453) <220> <221> mat#peptide <222> (70)...(453) <400> 32 atg aat tat aca agc tat atc tta gct ttt cag ctt tgc gtg att ttg 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu tgt tct tct ggc tgt aac tgt cag gcc atg ttt ttt aaa gaa ata gaa 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu aac cta aag gaa tat ttt cag gca agt aat cca gat gta tcg gac ggt 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly ggg Tct ctt ttc gta gat att ttg aag aaa tgg aga gag gag agt gac 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp aaa aca atc att cag agc caa att gtc tct ttc tac ttg aaa ctg ttt 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe gac aac ttt aaa gat aac cag atc att caa agg agc atg gat acc atc 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile aag gaa gac atg ctt ggc aag ttc tta cag tca tcc acc agt aag agg 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg gag gac ttc ctt aag ctg att caa att cct gtg aac gat ctg cag gtc 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val cag cgc aag gcg ata aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gat ctc tca 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser cca aga tcc aac cta agg aag taa 456 Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys *** <210> 33 <211> 450 <212> DNA PRT <213> dog <220> <221> CDS <222> (1)...(447) <220> <221> mat#peptide <222> (70)...(447) <400> 33 atg aat tat aca agc tat atc tta gct ttt cag ctt tgc gtg att ttg 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu tgt tct tct ggc tgt aac tgt cag gcc atg ttt ttt aaa gaa ata gaa 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu aac cta aag gaa tat ttt cag gca agt aat cca gat gta tcg gac ggt 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly ggg tct ctt ttc gta gat att ttg aag aaa tgg aga gag gag agt gac 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp aaa aca atc att caG agc caa att gtc tct ttc tac ttg aaa ctg ttt 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe gAc aac ttt aaa gat aac cag atc att caa agg agc atg gat acc atc 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile aag gaa gac atg ctt ggc aag ttc tta cag tca tcc acc agt aag agg 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg gag gac ttc ctt aag ctg att caa att cct gtg aac gat ctg cag gtc 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val cag cgc aag gcg ata aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gat ctc tca 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser cca aga tcc aac cta taa 450 Pro Arg Ser Asn Leu *** <210> 34 <211> 447 <212> DNA PRT <213> dog <220> <221> CDS <222> (1)...(444) <220> <221> mat#peptide <222> (70)...(444) <400> 34 atg aat tat aca agc tat atc tta gct ttt cag ctt tgc gtg att ttg 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu tgt tct tct ggc tgt aac tgt cag gcc atg ttt ttt aaa gaa ata gaa 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu aac cta aag gaa tat ttt cag gca agt aat cca gat gta tcg gac ggt 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly ggg tct ctt ttc gta gat att ttg aag aaa tgg aga gag gag agt gac 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp aaa aca atc att cag agc caa att gtc tct ttc tac ttg aaa ctg ttt 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe gac aac ttt aaa gat aac cag atc att caa agg agc atg gat acc atc 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile aag gaa gac atg ctt ggc aag ttc tta cag tca tcc acc agt aag agg 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg gag gac ttc ctt aag ctg att caa att cct gtg aac gat ctg cag gtc 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val cag cgc aag gcg ata aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gat ctc tca 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser cca aga tcc aac taa 447 Pro Arg Ser Asn *** <210> 35 <211> 444 <212> DNA PRT <213> dog <220> <221> CDS <222> (1)...(441) <220> <221> mat#peptide <222> (70)...(441) <400> 35 atg aat tat aca agc tat atc tta gct ttt cag ctt tgc gtg att ttg 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu tgt tct tct ggc tgt aac tgt cag gcc atg ttt ttt aaa gaa ata gaa 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu aac cta aag gaa tat ttt cag gca agt aat cca gat gta tcg gac ggt 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly ggg tct ctt ttc gta gat att ttg aag aaa tgg aga gag gag agt gac 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp aaa aca atc att cag agc caa att gtc tct ttc tac ttg aaa ctg ttt 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe gac aac ttt aaa gat aac cag atc att caa agg agc atg gat acc atc 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile aag gaa gac atg ctt ggc aag ttc tta cag tca tcc acc agt aag agg 336 Lys glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg gag gac ttc ctt aag ctg att caa att cct gtg aac gat ctg cag gtc 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val cag cgc aag gcg aTa aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gat ctc tca 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser cca aga tcc taa 444 Pro Arg Ser *** <210> 36 <211> 459 <212> DNA PRT <213> dog <220> <221> CDS <222> (1)...(456) <220> <221> mat#peptide <222> (70)...(456) <400> 36 atg aat tat aca agc tat atc tta gct ttt cag ctt tgc gtg att ttg 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu tgt tct tct ggc tgt aac tgt cag gcc atg ttt ttt aaa gaa ata gaa 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu aac cta aag gaa tat ttt cag gca agt aat cca gat gta tcg gac ggt 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly ggg Tct ctt ttc gta gat att ttg aag aaa tgg aga gag gag agt gac 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp aaa aca atc att cag agc caa att gtc tct ttc tac ttg aaa ctg ttt 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe gac aac ttt aaa gat aac cag atc att caa agg agc atg gat acc atc 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile aag gaa gac atg ctt ggc aag ttc tta cag tca tcc acc agt aag agg 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg gag gac ttc ctt aag ctg att caa att cct gtg aac gat ctg cag gtc 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val cag cgc aag gcg ata aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gat ctc tca 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser cca aga tcc aac cta agg aag cgg taa 459 Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys Arg *** <210> 37 <211> 462 <212> DNA PRT <213> dog <220> <221> CDS <222> (1)...(459) <220> <221> mat#peptide <222> (70)...(459) <400> 37 atg aat tat aca agc tat atc tta gct ttt cag ctt tgc gtg att ttg 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu tgt tct tct ggc tgt aac tgt cag gcc atg ttt ttt aaa gaa ata gaa 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu aac cta aag gaa tat ttt cag gca agt aat cca gat gta tcg gac ggt 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly ggg Tct ctt ttc gta gat att ttg aag aaa tgg aga gag gag agt gac 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp aaa aca atc att cag agc caa att gtc tct ttc tac ttg aaa ctg ttt 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe gac aac ttt aaa gat aac cag atc att caa agg agc atg gat acc atc 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile aag gaa gac atg ctt ggc aag ttc tta cag tca tcc acc agt aag agg 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg gag gac ttc ctt aag ctg att caa att cct gtg aac gat ctg cag gtc 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val cag cgc aag gcg ata aat gaa ctc atc aaa gtg atg aat gat ctc tca 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser cca aga tcc aac cta agg aag cgg aaa taa 462 Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys Arg Lys *** <210> 38 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 38 gcgggatcct taccgcttcc ttaggttgga tcttggtgag ag 42 <210> 39 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 39 gcgggatcct tatttccgct tccttaggtt ggatcttggt ga 42 <210> 40 <211> 475 <212> DNA <213> dog <400> 40 gcagatctat gaattataca agctatatct tagcttttca gctttgcgtg attttgtgtt 60 cttctggctg taactgtcag gccatgtttt ttaaagaaat agaaaaccta aaggaatatt 120 ttaatgcaag taatccagat gtatcggacg gtgggtctct tttcgtagat attttgaaga 180 aatggagaga ggagagtgac aaaacaatca ttcagagcca aattgtctct ttctacttga 240 aactgtttga caactttaaa gataaccaga tcattcaaag gagcatggat accatcaagg 300 aagacatgct tggcaagttc ttaaatagca gcaccagtaa gagggaggac ttccttaagc 360 tgattcaaat tcctgtgaac gatctgcagg tccagcgcaa ggcgataaat gaactcatca 420 aagtgatgaa tgatctctca ccaagatcca acctaaggaa gcggtaagaa ttcgc 475 <210> 41 <211> 478 <212> DNA <213> dog <400> 41 gcagatctat gaattataca agctatatct tagcttttca gctttgcgtg attttgtgtt 60 cttctggctg taactgtcag gccatgtttt ttaaagaaat agaaaaccta aaggaatatt 120 ttaatgcaag taatccagat gtatcggacg gtgggtctct tttcgtagat attttgaaga 180 aatggagaga ggagagtgac aaaacaatca ttcagagcca aattgtctct ttctacttga 240 aactgtttga caactttaaa gataaccaga tcattcaaag gagcatggat accatcaagg 300 aagacatgct tggcaagttc ttaaatagca gcaccagtaa gagggaggac ttccttaagc 360 tgattcaaat tcctgtgaac gatctgcagg tccagcgcaa ggcgataaat gaactcatca 420 aagtgatgaa tgatctctca ccaagatcca acctaaggaa gcggaaataa gaattcgc 478 <210> 42 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 42 ggcggatcct tatcttggtg agagatcatt catcacttt 39 <210> 43 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 43 ggcggatcct taccttaggt tggatcttgg tgagagatc 39 <210> 44 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 44 ggcggatcct tacttcctta ggttggatct tggtgagag 39 <210> 45 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 45 ggcggatcct tataggttgg atcttggtga gagatcatt 39 <210> 46 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 46 ggcggatcct tagttggatc ttggtgagag atcattcat 39 <210> 47 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 47 ggcggatcct taggatcttg gtgagagatc attcatcac 39 <210> 48 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 48 ggcggatcct taccgcttcc ttaggttgga tcttggtga 39 <210> 49 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 49 ggcggatcct tatttccgct tccttaggtt ggatcttgg 39 <210> 50 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 50 ggcggatcct tatggtgaga gatcattcat cactttgat 39 <210> 51 <211> 453 <212> DNA <213> dog <400> 51 ccgaccatgg ctcaggccat gttttttaaa gaaatagaaa acctaaagga atattttaat 60 gcaagtaatc cagatgtatc ggacggtggg tctcttttcg tagatatttt gaagaaatgg 120 agagaggaga gtgacaaaac aatcattcag agccaaattg tctctttcta cttgaaactg 180 tttgacaact ttaaagataa ccagatcatt caaaggagca tggataccat caaggaagac 240 atgcttggca agttcttaaa tagcagcacc agtaagaggg aggacttcct taagctgatt 300 caaattcctg tgaacgatct gcaggtccag cgcaaggcga taaatgaact catcaaagtg 360 atgaatgatc tctcaccaag atccaaccta aggaagcgga aaaggagtca gaatctgttt 420 cgaggccgca gagcatcgaa ataaggatcc gcc 453 <210> 52 <211> 393 <212> DNA <213> dog <400> 52 ccgaccatgg ctcaggccat gttttttaaa gaaatagaaa acctaaagga atattttaat 60 gcaagtaatc cagatgtatc ggacggtggg tctcttttcg tagatatttt gaagaaatgg 120 agagaggaga gtgacaaaac aatcattcag agccaaattg tctctttcta cttgaaactg 180 tttgacaact ttaaagataa ccagatcatt caaaggagca tggataccat caaggaagac 240 atgcttggca agttcttaaa tagcagcacc agtaagaggg aggacttcct taagctgatt 300 caaattcctg tgaacgatct gcaggtccag cgcaaggcga taaatgaact catcaaagtg 360 atgaatgatc tctcaccaag ataaggatcc gcc 393 <210> 53 <211> 405 <212> DNA <213> dog <400> 53 ccgaccatgg ctcaggccat gttttttaaa gaaatagaaa acctaaagga atattttaat 60 gcaagtaatc cagatgtatc ggacggtggg tctcttttcg tagatatttt gaagaaatgg 120 agagaggaga gtgacaaaac aatcattcag agccaaattg tctctttcta cttgaaactg 180 tttgacaact ttaaagataa ccagatcatt caaaggagca tggataccat caaggaagac 240 atgcttggca agttcttaaa tagcagcacc agtaagaggg aggacttcct taagctgatt 300 caaattcctg tgaacgatct gcaggtccag cgcaaggcga taaatgaact catcaaagtg 360 atgaatgatc tctcaccaag atccaaccta aggtaaggat ccgcc 405 <210> 54 <211> 408 <212> DNA <213> dog <400> 54 ccgaccatgg ctcaggccat gttttttaaa gaaatagaaa acctaaagga atattttaat 60 gcaagtaatc cagatgtatc ggacggtggg tctcttttcg tagatatttt gaagaaatgg 120 agagaggaga gtgacaaaac aatcattcag agccaaattg tctctttcta cttgaaactg 180 tttgacaact ttaaagataa ccagatcatt caaaggagca tggataccat caaggaagac 240 atgcttggca agttcttaaa tagcagcacc agtaagaggg aggacttcct taagctgatt 300 caaattcctg tgaacgatct gcaggtccag cgcaaggcga taaatgaact catcaaagtg 360 atgaatgatc tctcaccaag atccaaccta aggaagtaag gatccgcc 408 <210> 55 <211> 402 <212> DNA <213> dog <400> 55 ccgaccatgg ctcaggccat gttttttaaa gaaatagaaa acctaaagga atattttaat 60 gcaagtaatc cagatgtatc ggacggtggg tctcttttcg tagatatttt gaagaaatgg 120 agagaggaga gtgacaaaac aatcattcag agccaaattg tctctttcta cttgaaactg 180 tttgacaact ttaaagataa ccagatcatt caaaggagca tggataccat caaggaagac 240 atgcttggca agttcttaaa tagcagcacc agtaagaggg aggacttcct taagctgatt 300 caaattcctg tgaacgatct gcaggtccag cgcaaggcga taaatgaact catcaaagtg 360 atgaatgatc tctcaccaag atccaaccta taaggatccg cc 402 <210> 56 <211> 399 <212> DNA <213> dog <400> 56 ccgaccatgg ctcaggccat gttttttaaa gaaatagaaa acctaaagga atattttaat 60 gcaagtaatc cagatgtatc ggacggtggg tctcttttcg tagatatttt gaagaaatgg 120 agagaggaga gtgacaaaac aatcattcag agccaaattg tctctttcta cttgaaactg 180 tttgacaact ttaaagataa ccagatcatt caaaggagca tggataccat caaggaagac 240 atgcttggca agttcttaaa tagcagcacc agtaagaggg aggacttcct taagctgatt 300 caaattcctg tgaacgatct gcaggtccag cgcaaggcga taaatgaact catcaaagtg 360 atgaatgatc tctcaccaag atccaactaa ggatccgcc 399 <210> 57 <211> 396 <212> DNA <213> dog <400> 57 ccgaccatgg ctcaggccat gttttttaaa gaaatagaaa acctaaagga atattttaat 60 gcaagtaatc cagatgtatc ggacggtggg tctcttttcg tagatatttt gaagaaatgg 120 agagaggaga gtgacaaaac aatcattcag agccaaattg tctctttcta cttgaaactg 180 tttgacaact ttaaagataa ccagatcatt caaaggagca tggataccat caaggaagac 240 atgcttggca agttcttaaa tagcagcacc agtaagaggg aggacttcct taagctgatt 300 caaattcctg tgaacgatct gcaggtccag cgcaaggcga taaatgaact catcaaagtg 360 atgaatgatc tctcaccaag atcctaagga tccgcc 396 <210> 58 <211> 411 <212> DNA <213> dog <400> 58 ccgaccatgg ctcaggccat gttttttaaa gaaatagaaa acctaaagga atattttaat 60 gcaagtaatc cagatgtatc ggacggtggg tctcttttcg tagatatttt gaagaaatgg 120 agagaggaga gtgacaaaac aatcattcag agccaaattg tctctttcta cttgaaactg 180 tttgacaact ttaaagataa ccagatcatt caaaggagca tggataccat caaggaagac 240 atgcttggca agttcttaaa tagcagcacc agtaagaggg aggacttcct taagctgatt 300 caaattcctg tgaacgatct gcaggtccag cgcaaggcga taaatgaact catcaaagtg 360 atgaatgatc tctcaccaag atccaaccta aggaagcggt aaggatccgc c 411 <210> 59 <211> 413 <212> DNA <213> dog <400> 59 ccgaccatgg ctcaggccat gttttttaaa gaaatagaaa acctaaagga atattttaat 60 gcaagtaatc cagatgtatc ggacggtggg tctcttttcg tagatatttt gaagaaatgg 120 agagaggaga gtgacaaaac aatcattcag agccaaattg tctctttcta cttgaaactg 180 tttgacaact ttaaagataa ccagatcatt caaaggagca tggataccat caaggaagac 240 atgcttggca agttcttaaa tagcagcacc agtaagaggg aggacttcct taagctgatt 300 caaattcctg tgaacgatct gcaggtccag cgcaaggcga taaatgaact catcaaagtg 360 atgaatgatc tctcaccaag atccaaccta aggaagcgga aataaggatc gcc 413 <210> 60 <211> 390 <212> DNA <213> dog <400> 60 ccgaccatgg ctcaggccat gttttttaaa gaaatagaaa acctaaagga atattttaat 60 gcaagtaatc cagatgtatc ggacggtggg tctcttttcg tagatatttt gaagaaatgg 120 agagaggaga gtgacaaaac aatcattcag agccaaattg tctctttcta cttgaaactg 180 tttgacaact ttaaagataa ccagatcatt caaaggagca tggataccat caaggaagac 240 atgcttggca agttcttaaa tagcagcacc agtaagaggg aggacttcct taagctgatt 300 caaattcctg tgaacgatct gcaggtccag cgcaaggcga taaatgaact catcaaagtg 360 atgaatgatc tctcaccata aggatccgcc 390

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １１７ 43/00 １１７ Ｃ１２Ｎ 1/21 // Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 (Ｃ１２Ｎ 1/21 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｐ 21/02 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/66 Ｄ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA25 CA04 CA20 DA02 DA06 EA02 EA04 GA11 GA18 GA19 HA03 4B064 AG12 CA02 CA10 CA19 CC01 CC24 CD09 CE02 CE06 CE09 CE10 CE11 CE12 CE20 DA01 DA13 4B065 AA26X AA90X AA90Y AA95X AB01 AC14 BA02 BB01 BC01 BC03 BC50 BD14 BD16 BD17 BD18 BD50 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 BA22 BA23 DA24 MA66 NA20 ZA891 ZA892 ZB261 ZB262 ZB311 ZB312 ZB331 ZB332 ZC611 ZC612 4H045 AA20 BA10 BA53 CA40 DA18 EA20 EA50 GA01 GA10 GA21 GA23 GA26

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 インターフェロン−γの活性を有するタ
   ンパク質を、金属をキレート結合させた担体、イオン交
   換担体および色素担体から選ばれる少なくとも１種の担
   体と接触させることを特徴とするインターフェロン−γ
   の活性を有するタンパク質の高純度製造法。
2. 【請求項２】 インターフェロン−γの活性を有するタ
   ンパク質を、金属をキレート結合させた担体、イオン交
   換担体および色素担体に接触させることを特徴とする請
   求項１に記載のインターフェロン−γの活性を有するタ
   ンパク質の高純度製造法。
3. 【請求項３】 インターフェロン−γの活性を有するタ
   ンパク質を含む溶液を、金属をキレート結合させた担体
   に接触させ、担体への非吸着物を回収することを特徴と
   する請求項１または２記載のインターフェロン−γの活
   性を有するタンパク質の高純度製造法。
4. 【請求項４】 イオン交換担体がアニオン交換担体であ
   ることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の
   インターフェロン−γの活性を有するタンパク質の高純
   度製造法。
5. 【請求項５】インターフェロン−γの活性を有するタン
   パク質の溶液中に界面活性剤を添加して担体に接触させ
   ることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項記載
   のインターフェロン−γの活性を有するタンパク質の高
   純度製造法。
6. 【請求項６】界面活性剤がポリオキシエチレン硬化ヒマ
   シ油であることを特徴とする請求項５に記載のインター
   フェロン−γの活性を有するタンパク質の高純度製造
   法。
7. 【請求項７】インターフェロン−γの活性を有するタン
   パク質の純度が９０％以上であることを特徴とするイヌ
   インターフェロン−γの活性を有する高純度タンパク
   質。
8. 【請求項８】請求項１から６のいずれか１項記載の方法
   で製造されたイヌインターフェロン−γの活性を有する
   タンパク質または請求項７に記載のイヌインターフェロ
   ン−γの活性を有するタンパク質を含んでなるイヌ疾病
   の治療剤。
9. 【請求項９】イヌ疾病の治療剤が抗ウイルス治療剤、腫
   瘍治療剤、感染症治療剤または皮膚病治療剤から選ばれ
   る少なくとも１つの治療剤であることを特徴とする請求
   項８に記載のイヌ疾病の治療剤。
10. 【請求項１０】請求項８または９に記載のイヌ疾病の治
    療剤をイヌに注射投与することを特徴とするイヌ疾病の
    治療方法。