PT98695A - Gene codificador do factor neurotrofico de ligacao a heparina - Google Patents

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Description

Este invento está relacionado com uma nova sequência de DMA codificadora do factor neurotrófico de ligação a heparina (HBNF). A sequência do inventa codifica uma proteína que é capaz de induzir o crescimento e diferenciação de células nervosas, assim como a manutenção e reparação de células nervosas, tanto in vivo como in vitro» A proteína em questão é normalmente produzida no cérebro humano e existem formas homólogas numa série de espécies diferentes. As proteínas também foram anteriormente referidas como mítogénios do cérebro de ligação a heparina <HBBMs>, Se bem que as proteínas purificadas sejam conhecidas, a única fonte disponível das proteínas tem sido extracios de tecido do cérebro. 0 processo para o isolamento de tecido de cérebro é trabalhoso e dá quantidades relativamente pequenas de HBNF. 0 gene codificador de HBNF humano foi agora isolado a partir de uma biblioteca de de cDNA obtida a partir de RNA de cérebro humano recem-nascido. é uma sequência de 411 nucleótidos que faz prever uma proteína tendo Í36 aminoácidos com um peso molecular de aproximadamente 15 KD. 0 gene foi sequenciado e expresso em E. coli e a proteína assim produzida retem a activi-dade neurotrófica do HBNF nativo.
FUNDAMENTO DQ INVENTO
Nos últimos anos foram identifiçados e isolados uma série de polipeptídeos relativamente pequenos, conhecidos como factores de crescimento,. 0 termo “factores de crescimento” refere-se a uma classe de substâncias de sinalizaçãoque afectam o crescimento de diferenciação de certos tipos de animais? este efeito pode ser observado no animal e em cultura de tecidos. Um determinado factor de crescimento pode ter um efeito em mais de um tipo de células.
Muitos dos factores de crescimento melhor conhecidos tfíft actividade neurotrófica significativa, i.e., eles são capazes de manter ou estimular o crescimento de células nervosas. A primeira descoberta de tais factores neurotráficos foi a factor de crescimento de células nervosas ÍNSF; Bospodarowicz, <3. Biol. Chem. 25Θs 2515-2520, 1975. Factores de crescimento semelhantes que estão na mesma família do NBF são o factor neurotrófico derivada da cérebro (8DNF; Leibrock et alNaturs 341:149-153, 19B9) e o factor neurotrófico—3 (NT—3; Maisonpierre et al., Science 247s 1446-1451, 199Θ). Outros factores de crescimento incluem factor neurotrófico ciliar (CNTF; Lin et alScience 246;1023-1025, 1980, I8F-II ÍMill et al., PNAS USA 82:7126-7130, 1985), activina (Shubert et al.. Nature 344:868—870, 1990) e purpurina (Berman et al.Cei1 51;135-142, 1987).
Uma série de outros factores conhecidos caem dentro de uma superfamília relacionada com o factor de crescimento de fibroblastos (FBF)5 esta inclui F8F básico<bFBF), Esch et al., PNAS USA 81:5364-5363? PNAS USA 82:6507-6511), FGF ácido < aFSF), ÍBohlen et al., EMBO J. 4:1951-1956, 1985; Bimenez-Gallego et ah, Science 230; 1385- i288, 1985), assim como produtos dos oncogenes int-2 (Dickense Peters, Nature 326:833, 1984), hst/KS (Delli Bovi et al.. Cell 50:729-737, 1987) FSF-5 (Zhan et al., iiol. Ce 11 Biol- 8:3487-3495, 1988), F8F-6 (Marics et al·..
Oncogene 4:335-340, 1989) e KBF (Finch et al.. Science 245:752-755, 1989). Estes são todos (esícepto KBF) mitogénios das células endoteliais vasculares e também todos se ligam fartemente à heparina. São conhecidos outros factores de crescimento que se ligam à heparina, tais como VESF/VPF (Keck et_al. Science 246:13€*9-1312, 1989). Estes factores de crescimento que se ligam à beparina são também frequentemente isolados a partir de tecido cerebral e podem desempenhar um papel importante no crescimento e desenvolvimento de células do cérebro.
Em EP 326 Θ75 foi descrita uma proteína de liagação à heparina até então desconhecida e que foi referida ccitno ΗΒΒΪΊ; ela foi descrita como um mito-génio do cérebro assim como um factor de formação, manutenção e reparação de tecidos, particularmente do tecido neuronal. Também não está estruturalmente relacionado com qualquer dos factores de crescimentoatrás referidos, se bem que pareça sstar estruturalmente relacionado com uma proteína cujo gene foi anterior-mente referido como MK (Kadomatsu. et al., Biochem Bipphvs. Res. Comm. 151; 1312-1318·, 1988) e uma forma humana da proteína MK, descrita no pedido de patente copendente e entregue simultaneamente do mesmo autor M9 de Série 07/568,473. A homologia entre os genes e proteínas HBNF ε MK é muita elevada e eles são assumidos como constituindo uma nova família de factores neurotróficos. A proteína "HB8M" é a proteína "HBNF” do presente invento. No entanto, conforme indicado no Pedido de Patente Europeia atrás referido, foi necessária isolar a proteína directamente a partir de tecida cerebral por um processo que envolve vários passos croroatográf .icos, uma vez que eram desconhecidas a sequência completa da proteína e a sequência do gene.
Mais recentemente, proteínas HBNF foram isoladas a partir de rato (Rauvaia, ES1B0 J« 8^2933-2941, 1989; Huber et al» Neurochem Res. 15ϊ435~439, 3.990) e vaca (Milner et al. Biochem. Biophys. Res Comíiu 165s 1096-1103, 1989; Huber et al, Neurochem Res. ί5ϊ435-439, 199€>3 e determinadas as sequências terminais amina. De forma semelhante, as sequências de aminoácidos M-termi-naxs das proteínas humana e de galinha foram determinadas (EP 326075; Huber et ah, Neurochem. Res. 15x435-439, 1990)« Ainda, não tinha sido conseguida até agora qualquer determinação da
sequência de DNAdo HBNF, 0 presente inventa proporciona uma sequência completa do gene de HBNF humano, assim como vectores de clonagem e células hospedeiras capazes de expressarem o gene e produtoras da proteína HBNF pura. O invento também proporciona métodos in vitro e in vivo de promoção do crescimento, reparação e manutenção das células nervosas.
BREVE DESCRIC-SO DOS DESENHOS
A Figura 1 está relacionada com clonagem de DNft complementar, sequências deduzidas de nucleótidos e de aminoácidos do HBNF humano, (a) Diagrama de quatro cDNAs codificadores de HBNF que se sobrepoem parcialmente. A linha de topo indica o mRNA com barras a cheio e a tracejado representando a região codificadora de HBNF e o segmento poliíA) 3* respectivamenta»Sítios de restrição; H=HindIIII, K=KpnI, P=PstI; rst-comprimento dos clones em nucleétidos, (b) Sequência de nucleótidos combinados dos clones HHC7, 8, 10 e 12 coroa sequência de aminoácidos deduzida ícódigo de uma só letra). Os aminoácidos apresentados no tipo normal indicam os 136 aminoácidos de HBNF humano maduro precedido de mais 32 aminoácidos a carregado representando uma potencial proteína precursora de 168 aminoácidos. As sequências de aminoácidos sublinhadas indicam os dois peptídeos utilizados na projec-ção dos oligonucleotídeos sondausados na clonagem dos genes. Os trts nucleótidos que faltam no clone HHC7 estão delimitados e o início da proteína madura está indicado por uma seta, A Figura 2 ilustra a expressão e caracterização funcional da proteína HBNF humana. ía) electroforese em gel de SDS-PABE de amostras da proteína HBNF. Os padrões proteicos foram da BRL. Faixa N, HBNF bovino purificado (l&O ng). Fainas + e - culturas induzidas e não induzidas por isopropil-B-D-tioglactopiranosido (IPT8) contendo a construção de expressão bacteriana pETHH8,
(b)Ensaio do crescimento de neuritos en neurões de cérebro de rato na ausência <ft> ou na presença da HBNF da cérebro de rato HBNF (32® ng/ml) (B), HBNF humano purificado produzido em bactérias (16® ng/ml> \C> ou <32® ng/ml) (D).
ft Figura 3 mostra, análise de transferência Northern do mRNft de HBNF em tecidos de murganho e humano adultos. (a> De cada um dos tecidos, coração, pulmão, cérebro, timo, estômago, músculo da perna, fígado, rim, baço usou-se 2® pg de RNA total por faixa* (b) análise de RN comparando 1Θ pg de RNA total de cérebro de murganho e humano adulto. A Figura 4 mostra a expressão do gene HBNF durante a embriogénese do rata, A partir de cada tecida aplicou-se 2® pg de RNA total por faixa e hibridou-se com uma sonda de cDNA de HBNF humano marcado com "Τ*. Os tecidos usados no isolamento de RNA foram embrião completo adequado para E8 e El®, cabeças para E12 e E14, cérebro total para Elè, EIS, E2®, P2 e adulto. A Figura 5 mostra uma sequência parcial de 114 aminoá-eidos de HBNF bovino.
SUMÁRIO DQ INVENTO 0 presente invento está relacionado com um novo gene e sequência de DNA que codifica um factor neurotrófica de ligação à heparina, referido aqui como HBNF. é também divulgada uma sequência completa de aminoácidos da proteína humana e uma sequência de aminoâcidos parcial da proteína bovina. A disponibilidade da sequência do gene permite a expressão da proteína HBNF numa variedade de células hospedeiras. Assim, o invento também está relacionado com um método para a -7-
produçlo de uma proteína HEtNF purificada que compreende a trans-formaçlo de uma célula hospedeira com um gene HBNF e cultura da célula hospedeira em condições que permitem a expressão do gene na célula hospedeira, ft recuperação da proteína HBNF pode ser feita a partir do sobrenadants da cultura ou directamente a partir da célula hospedeira, dependendo do método de expressão no hospedeiro. A transformação das células hospedeiras pode ser conseguida tíirectamente por DMA nu ou por vectores de expressão manipulados de forma a transportarem a sequência de DNA codificadora de HBNF humano. 0 invento engloba pois células hospedeiras transformadas com a sequência reivindicada, assim como vectores de expressão compreendendo a sequência. A proteína HBNF é útil na manutenção, crescimento e reparação de tecidos, particularmente tecido neuronal. Assim o inventa também está relacionado com métodos terapêuticos que compreendem a administração de quantidades eficazes do HBNF in vivo a um indíviduo in vivo necessitado de tal tratamento. Isto pode ser conseguido pela administração directa da proteína purificada ou pode também ser onseguido pelo transplante de células hospedeiras transgénicas capazes de produzir a proteína, na região do corpo necessitada de tal tratamento. A proteína HBNF purificada também tem utilidade como um componente em cultura de tecidos, particularmente em cultura de tecidos de células neuronais, para manter o crescimento das células nele.
DESCRΪçgQ DETALHADA DO INVENTO A sequência de BNA humano codificadora de HBNFfai clanada utilizando uma combinação de reacção em cadeia com polimerase (PCR) e despiste de uma biblioteca de cDNAderivado de
células de cérebro humano de recém-nascido* Ί3 sequência de aminoácidos de HBNF bovino foi usada como ponto de partida para a projecção de oligonuoleótidos para uma reacção de amplificação por PCR» Na Figura 5 é proporcionada uma sequência parcial de 114 aminoácios do HBNF bovina. Espera-se que o comprimento total da proteína seja de 136 aminoácidos tal como acontece com a proteína humana» RNft poli (A) + de cérebro de rata adulta foi sujeito a transcrição reversa para produzir um cDNA complementar» Esta cadeia foi então usada como molde para a reacção de PCR com iniciadores específicos da sequência, 0 produto esperado de PCR com 282 pares de bases foi então isolado e clonado num vector adequado» A sequenciação de BNA identifica o fragmento clonado que codifica o peptídeo HBNF de rato. A .inserção clonada foi isolada5 marcada e usada como sonda para fazer o despiste de uma biblioteca de cDNA. de aprosimadamente um milhão e meio de fagos despistadosforam isolados quatro candidatos, subclonados e sequenciados» A sequência de cDNA de HBNF humano está apresentada na Figura 1»
A sequência de cDNA indica que a proteína HBNF humana tem 136 aminoácidos de comprimento, Existe uma única diferença nos aminoácidos entre a sequência bovina no resíduo 98 (Asp na bovina, Slu na humana). Com base na sequência N-terminal da proteína e na informação sequência completa do cDNA, o peso molecular esperado para a proteína será de 15 KD, a qual é menor da que a proteína 18 KD anteriormente observada em SDS-PASE (Rauvala, EMBO J. 8;2933~294I, 19895 Milner et al« Biochem. Biophys. Res. Comm. 154s1096-11Θ3, 1989)» Portanto assume-se que a diferença de tamanhos observada é devida ao efeito da basici-dade da proteína na sua migração no gel.
Também, duas formas mais pequenas da proteína humana foram anteriormente identificadas <EP 326 Φ75)^ estas 9- 9-
provaveImante representam formas truncadas no extremo Cda proteína de tamanho completo gerada pela troca durante a extracção/iso-lamento quando estão ausentes inibidores da enzima* Um codâo putativo para a metionina de iniciação da tradução está situado 32 aminoácidos antes da glicina N~terminaIda proteína madura? esta pré-sequência não é semelhante às sequências sinal anterior-mente identificadas* (Von Heijne, J. Mal.Bio. 134:99-105, 1985)» No entanto, se a tradução da proteína for iniciada nesta metioni-na, a pré-sequência representará a única região hidrofófaica numa proteína altamente hidrofílica. 0 sítio de processamento da proteína que precede a proteína HBNF madura, está de acordo com determinantes estruturaispara a clivagem de uma sequência sinal de uma proteína madura ívon Heijne, Nucl. ftcids Res. 14 e4683-469θ, 1986). »
Para proporcionar uma fonte de proteína HBNF madura sem proteínas eucarióticas contaminantes, um dos clones, HHC8 foi usado como molde para a amplificação por PCR com iniciadores destinado a colocar um codão da metionina imediatamente 5* relativamente à glicina N-terminal (Fig. 1b), 0 produto amplificado foi danado numa forma modificada do vector de expressão pET-3a (Studier et al., Meth. Enzymol. 185í6€*~ó9, Í99€í> e o plasmídeo resultante, pETHH8 transformado na estirpe BL21 LysS (id.). Um extracto de proteína da cultura induzida com IPTS contendo pETHHS {Fig. 2a faixa 3) mostra uma banda forte de proteína com aproximadamente O mesmo tamanho de HBNF bovino maduro (faixa 1), comparado com uma banda fraca de proteína na posição correspondente para a cultura não induzida Cfaixa 2). 0 facto de HBNF produzido por bactérias migrar na mesma posição em 8DS-PABE do HBNF bovino e derivado de rato e ser biologicamente activo sugere que existe um mínimo, se alguma, modificação('Ses) da proteína HBNF nativa comparado com HBNF expresso em E* coli. A 10- ausfncia de um sinal de glicosilação reconhecível.- na sequência de HBNF apoia esta hipótese»
A proteína HBNF humana é purificada a partir de culturas bacterianas induzidas por IPTS através da utilização da sua afinidade para a heparina» A sua sequência de aminoácidos N-ter— minai foi confirmada por sequenciação de proteína e a proteína foi testada quanta è actividade neurotrófica num ensaio de crescimento de neuritos. Este HBNF humano derivado de bactérias apresentou actividade comparável à de HBNF bovino e de rato (Fig, 2b). Assim, consistente com as observações descritas atrás, encontrámos que HBNF maduro tem actividade neurotrófica.
Os exemplos que se seguem ilustram a clonagem e expressão do gene de HBNF num sistema de expressão com RNA—poliroerase de T4, No entanto, se bem que este sistema de expressão tenha-se mostrada muita eficaz deve-se compreender que este não é o único meio pelo qual se pode produzir HBNF humano recombinante. A produção de HBNF pode ser conseguida pela incorporação do gene de HBNF em qualquer vector de expressão adequado e subsequente transformação de uma célula hospedeira adequada com o vector; como alternativa a transformação das células hospedeiras pode ser conseguida directamente por DMA nu. sem a utilização de um vector. A produção de HBNF por células eucarióticas ou procarióticas está comtemplada no presente invento. Exemplos de células eucarióticas adequadas incluem células de mamífero, células vegetais, células de levedura e células de insecto. De modo semelhante, hospedeiros procarióticos adequados, para além de E» coli. incluem Bacillus suhtilis
Outros vectores de expressão adequados podem também ser empregues e são seleccionados com base na escolha da célula hospedeira. Por exemplo, são bem conhecidos numerosos vectores 11
adequados para usar na transformação ds células bacterianas» Por exemplo, os plasmídeos e bacteriófagos, tais como fago lambda, são os vectores mais vulgarmente usadas nos hospedeiros bactéria-nos, e para E. coli em particular» Tanto em células de mamífero como em células de insectos os vectores de vírus são frequentemente usados para se obter expressão de DMA exógeno» Em particular as células de mamífero são normaIments transformadas com SV40 ou vírus poliornaq e as células de insectos em cultura podem ser transformadas com vectores de expressão baculovírus» Os sistemas vector de leveduras incluem plasmídeos centrómeros de levedura, plasmídeos epissomais de levedura e plasmídeos integradores de levedura.
Será também entendido que a realização do inventD não está limitada à utilização da sequência exacta do gene HBNF humano como definida na Figura 1. modificações da sequência tais como deleções, inserções ou substituições na sequência que produzem alterações silenciosas na molécula de proteína resultante estão também incluidas. Por exemplo a alteração na sequência do gene que reflete a degenerescência do código genético ou que resulta na produção de um aminoácido quimicamente equivalente num determinado sítio, estão englobadas? assim, um codão para o aminoácido alanina, um aminoácido hidrofóbico, pode ser substituído por um codão codificador de um outro resíduo menos hidrofóbico, coma seja glicina, ou um resíduo mais hidrofóbico, como seja valina, leucina ou isoleucina» De modo semelhante, as alterações que resultem na substituição de um resíduo carregado negativamen--te por um outro, como seja ácido aspártico por ácido glutãmico ou um resíduo carregado positivamente por um outro, como seja lisina por arginina, pode esperar-se que produza um produto biologicamente equivalente» Ainda, uma vez que é essencialmente a fracção central da proteína que é conservada entre as espécies, as alterações de nucleótidos que resultem na alteração das fracções N-terminal e C-terminal da molécula proteica será de esperar que não alterem a actividade da proteína» De facto, as variantes de tamanho de "HBEtfl" descritas em EP 326,075 incluem a truncagem C-terminal da proteína HBNF* Pode também ser desejável eliminar uma ou mais das císteinas presentes na sequência, uma ves que a presença das císteinas pode resultar na formação indesejável de multímeros quando a proteína é produzidapor via recombinante, complicando assim os processos de purificação e de cristalização» Cada uma das modificações propostas está dentro da rotina dos familiarizados com a matéria, tal como a determinação da retenção da actividade biológica dos produtos codificados. Portanto, sempre que a frase ''sequência de DNA de HBNF" ou “gene HBNF" é aqui usada na especificação e nas reivindicações, deve-se entender que engloba todas as modificações e variações que resultam na produção de uma proteína HBNF biologicamente equivalente. Em particular, o invento engloba as sequências de DNA que são sufieientemente duplicativas da sequência da Figura Ide forma a permitir hibridação com ela nas condições convencionais dehibri— dação Southern com elevada restringtncia, tais como as descritas em Haniatis et al». (Molecular Cloning» A Laboratory Manual» Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)»
Como se referiu atrás e como se mostra nos exemplos abaixo, a proteína codificada pela sequência do gene de HBNF apresenta actividade neurotrófica in vitro» Especificamente, a proteína quando adicionada a neurões perinatais em cultura, estimula o crescimento de neuritos. Como tal, as proteínas HBNF são úteis tanto in vivo como in vitro , no crescimento, manutenção e reparação da células nervosas dos sistemas nervosos periférico e central. Um exemplo de u.ma aplicação in vitro é na manutenção de implantes de cérebro embrionário que são agora propostos para o tratamento da doença de Parkinson» -13-
A administração in vivo de HBNF está significativamente simplificada pela descoberta da sequência do gene, particularmen-te no tratamento de perturbações da sistema nervoso central ou periférico» A identificaçSo da sequência do gene e a sua sequência permite a construção de células transgénicas tais como fibroblastos, monécitos ou macrófagos, as quais podem ser manipuladas para oermitir a expressão do gene HBNF e usado como um implante para o tratamento de perturbações neurodegenerativas, reparação dos nervos periféricas após cirúrgia ou quaisquer estados em que o aumento do crescimento das células nervosas ε/ou reparação sejam desejáveis» i
Ainda, a utilização terapêutica de HBNF não está limitada ao tratamento de apenas humanos» De facto, face à natureza conservada desta proteína entre espécies distantemente relacionadas, pode ser igualmente benéfico a administração de HBNF a qualquer espécie pode ser benéfico para aplicação veterinária» As composições farmacêuticas compreendem HBNF em quantidades suficientes para produzir o efeito biológico desejado, em combinação com um veiculo sólido ou liquido farmaceuticamente aceitável. Como alternativa, a composição compreende uma agregação farmaceuticamente aceitável de células transgénicas compatíveis capazes de expressar HBNF in vivo» como um implante para as reparações do sistema nervoso periférico e central ou tratamento de diferenciação»
Face ao papel aparente de HBNF na diferenciação da proteína é também proposto como factor geral de diferenciação de tecidos» Em particular,HBNF pode ser útil no tratamento de células tumorais para induzir a reversão para o estado diferenciado. 14 0 exemplo que se segue é apresentado para fins ilustra™ tis'as apenas e não deve ser considerada coma limitante do ‘âmbito do presente invento,
EXEMPLO > w <i) Purificação da Proteína HBNF e
Análise da Sequência de Aminoácidos
A proteína HBNF foi isolada a partir de cérebro bovino segundo protocolos descritos anteriormente em EP 326 075* que é aqui incluido coroo referência na sua totalidade. Resumidamente, HBNF purificado por HPLC de fase reversa é quimicamente modificado por redução em mercaptoetanol e alquilação de resíduos cístei™ na com ácido iodo-í2-14c)~acéticode acordo com um processa descrito anteriormente (Gautschi—Sova et al«, Biochem. Biophys. Res. Comm. i4®ϊ1874-1880, 1986). A proteína carboximetilada foi purificada por HPLC de fase reversa usando unja coluna Brownlee Aquapore C8 (25 x 0,46 cm, 7 pm de tamanho de partícula, Applied Biosystems) usando cqí?so fase móvel®, 1% de ácido trifluoroacético num gradiente de acetonitrilo. Amostras correspondendo a 3 nmoles de HBNF carboximetilado foram diluidas com tampão de digestão com enzimas para reduzir a concentração de acetonitrilo na amostra para aproximadamente 10% e digerido com as seguintes proteases; Staphvlococcus aursus V8 (clivagem a seguir aos resíduos de ácido glutãmico), Arg~C (clivagem a seguir á arginina), ftsp-N (clivagem antes do ácido aspártico) e quimotripsina (clivagem parcial a seguir aos resíduos aromáticos). As enzimas são da Boehringer Mannheim e a clivagem è realizada essencialmente como sugerido pelo fabricante. Após digestão os peptídeos foram separados por HPLC em fase reversa numa coluna CB usando um gradiente linear de 9® minutos de acetonitrilo em ®,1% de ácido trifluoroacético para eluição de peptídeos ío teor em acetonitrilo no inicio 12-16%, no finais 3Θ~44%, dependendo do tipo de digestão). Para avaliar a homogeneidade dos peptídeos purificados, fracçoes contendo o material peptídico foram sujeitas a um segundo passo de HPLC em fase reversa, (coluna C8, $,1¾ de ácido heptafluorobutírico num gradiente côncava de acetonitrilo adequado). Amostras de 5~5€í€* picomoles dos peptídeos isolados foram sequencisdas num micro~se~ quenciador Applied Biosystems 477A fase gasosa/líquida. Os derivados de aminoácidos com feniltio-hidantoina (PTH) foram identificados num analisador de afflinoácidos PTH Modelo 12ÔA (Applied Biosystems) ligado ao sequenciador. Os protocolos experimentais para ambos os processos são os fornecidos pelo fabricante do aparelho. A sequência dos primeirod 114 aminoácidos (de um total de 136 esperados) está apresentada na Figura 5. (2) Reacclo em Cadeia, com Polimerase (PCR) A sequência de aminoácidos de HBNF bovino foi usada para projectar oligonucleótidos degenerados a partir da reaeçKo de ampliação por PCR. Um iniciador codificador totlmente degene-radofoi feito com a seguinte sequência de aminoácidos!: BCBEWOUi (Fig. i) começando com um sítio de restrição HindIII e compreendendo a sequências 5 *-CAAGCTTBGAPvTGP1GSN6ftPuTSSCAPuTS6~3?. Um iniciador anti-codâo totalmente degenerado foi feito com a sequência de aminoácidoss NADCQRT (Fig. 1) começando com um sítio de restrição EcoRl e compreedendo a sequência de DNAs 5? - GB A ATT CCGTP vTTP v T (3PuCfiPuT CNGCPuTT -5 * . RNA total de cérebro de ratofoi isolado a partir de cérebros de ratos Sprague-Dawlwey pelo método de isotiocianato de guanidinío-cloreto de césio e o RNA poli (A)-*· foi seleccionado por dois ciclos de ligação a oligo (dT)-celulose (Aviv e Leder, PNAS USA 69»14BS8-14125 1972). 0 RNA poli <A) + de cérebro de ratofoi sujeito á acção de trranscriptase reversa com oliídT) e transcriptase reversa de AMV (Maniatis et ai.. Molecular Cloning. A Lafaoratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cald Spring Harbor, NY 1982.) A reacção de PCR foi realizada num molde de DNA complementar, com 30 ciclos, com um minuto de empareihamento a 500C, dois minutos de extensão a 72*C e um minuto de desnaturação a 94*C durante 3© ciclos usando DiMA-pol imerase Taq (USB),. í 3) Clonaaem e Seguenciacão de HBNF Humano 0 produto de PCR de HBNF tendo 282 pares de bases foi danado no vector Blue Scribe (Ή CStratagene) e usada como sonda no despiste de uma biblioteca de cDNftde cérebro humano e de glnglios basais de recem-nascido em lambda gtil (Kamholz, PNAS USA 83x4962-4966, 1986) Trinta clones HHC foram inicialmente identificados e após análise de restrição preliminar, os quatro clones foram isolados, subclonados no sítio EcoRI de Blue Scribe ¢+) e sequenciados pelo método de terminação de cadeias com tíidesoxinucleótidos (Sanger et aL, PNAS USA 74x5463-5467, 1988). Três dos clones têm sequências idênticas na região codificadora e o quarto clone tem uma deleção de três nucleótidosna mesma grelha de leitura resultando rsa remoção de alanina na posição 119. Estas sequências estão ilustradas na Figura 1. (4) Expressão ds HBNF Recombinante 0 clone HHC8 (Fig. la) foi escolhido para usar como molde para amplificação por PCR com inciadores projectados para colocar um codão de metionina e um sítio de restrição Ndel imediatamente 5? relativamente à glicina N-terminal. 0 produto de PCR purificada foi clonado num derivado do vector da expressão pET-3a, o qual foi modificado pela deleção do fragmento SalI/PvuII de 1400 pb e inserção de uma origem fl de replicação no sítio EcoRI. Após sequenciação da inserção para confirmar a fidelidade da amplificação por PCR, o plasmídeo (designado pETHHS) foi usado para transformar a estirpe BL21 lys-B e induzida a produção de proteína com IPTS como descrito (Studieret al., supra). Os sedimentos de culturas de um ml foram ressuspensos em i€>® μΐ de tampão SOS ÍLaemmli, Nature 227í68©-685, 197©) e 2,5 μΐ migraram num gel de SDS--PA8E com 15% de acrilamida. 0 gel foi corado com azul Coomassie. HBNF nativo foi purificada a partir de cérebros de rato e o HBNF recombinante a partirdo extracto de bactérias na resina heparina-sefarose CL.-6B (Pharmacia) em 1© mM Tris, pH 7,® e eluido com um gradiente de ®-2 M NaCl a 1-1,3 M NaCl» Ainda a purificação foi conseguida em colunas de Mono S (Pharmacia) em fosfato de sódio 5® mH, pH 6,8, usando um gradiente de concentração crescente de sal de © a 1M NaCl para a eluição.
(5) Ensaio para a Activida.de Neurtrófica de HBNF
Para determinar a actividade neurotrófica do HBNF recombinante, fizeram-se observações acerca da sua capacidade para estimular os neurões de de cérebro de rato em comparação com HBNF nativo de cérebro de rato. 0 processo foi realizado de acordo com o método de Rauvala s Pihlaskari (J. Biol. Chem» 2*2s Ièè25~lóé35, 1987) usando HBNF recombinante eluido de Mono S a 0,6 M NaCl como descrita atrás. Os cérebros de ratos fetais com 18 dias foram removidos em condições estéreis. Ds cérebros foram dispersos em células individuais em DMEM contendo 10'Â FCS usando uma seringa, estéril de 5 ml. A suspensão de células foi centrifu— gada durante 1-2 minutos a 50© rpm e o sobrenadante removido e sujeito a contagem de células num contador Coulter. A concentra- 5 ção foi ajustada a 5 κ 1® células/ml em DMEM/1®% FCS e a suspensão de células foi colocada em placas de cultura de tecida que foram previamente revestidas durante 3® minutos <â temperatura ambiente com 5© μα/ml poli-C-lisina. As culturas foram incubadas durante 24 horas a 37°C, 107, CO^,, após o que o meio foi mudado
para DMEMcon tendo 1 mg /ml de E?SA e σ HBNF foi adicionado nasa seguintes concentraçõess HBNF de cérebro de rato 32Θ mg/mlj HBNF humano recombinante - 16$ ng/ml e 32Θ ng/ml. Os resultadas apresentados na Figura 2b indicam que HBNF recombinante tem actividade neurotrófica equivalente à do HBNF nativo de rato, 16) Expressão de HBNF em Tecidos de Murganho
A ei-tpressSo do gene HBNF foi estudada em tecidas de murganho, RNA celular total foi isolado pelo método do isotiocia-nato de guanídinia-cloreto de césio, analisado num gel de 1% de agarose contendo 6,66 M de formaldeído e transferido para filtros de membrana de nylon com formamida tendo sondas de cDNA marcadas com "*"P preparadas por iniciação ao acaso oligonucleétidos» Os filtros foram lavadas a 65*C em 1h SSC (0,15 M NaCl, 15 mil Na-citrato pH 7,0), 0,2¾ SDS e expostos a filmes de raios X. A análide de hibridaçSEo Northern do RNA de murganho de uma variedade de tecidos usando cDNA de HBNF humano como sonda indica que apenas α cérebro expressa um mensageiro de 1650 nucleótidos (Fig, 3a>» Isto é consistente com estudos anteriores sobre a localização da proteína HBNF, os quais mostram que ele está presente apenas no cérebro CHuber et al,. supras Rauvala et al« EMBG 3. 8s2933-2941, 1989) ao contrário de uma publicação recente indicando também a sua presença no útero bovino (Milner et al«; Biochem, Biophys. Res, Comm, 1ό5ϊ1096-1130, 1989), A análise de RNA humano total indica que o mRNA humano tem aprox imadaments 1600 nucleótidos de comprimento, ligeiramente mais curto que o de murgan ho (Fig. 3b). (7> Depósito de Materiais Biológicos
Uma E„ coli, estirpe BL 21 lysS, portadora do plasmítíeo -19- pETHHSj foi depositada na American Cyanamid Company5s Culture Collection mantida em Psarl River, New York e na American Type Culture Collection, 123Φ1 Parklawn Drive, Rockville, Ma.ryland, em 13 de Agosto, 1990, com o número de acesso ATCC 68385« ]

Claims (5)

  1. REIVINDICAÇÕES? lã. - Sene isolado e purificado, caraterizado por ser codificador de um factar neurotràfica de ligação a heparina (HBNFí. 2;1. ~ Sene de acordo com a Reivindicação '1, caracteri-zado por apresentar a sequência descrita na Figura que se segues .......... 1 AAGTAAATAAACTTTAAAAATGGCCTCAGTTAAGTGTATTAAAAAGAAGAAATAGTCGTAAGATGGCAtrr 71 ATMATTCATCTCTGCTTTTMTAAGCTTCCCAATCAGCTCTCGAGTGCAMGCGCTCTCCCTCCCTCGC 141 CCAGCCTTCGTCCTCCTGGCCCGCTCCTCTCATCCCTCCCATTCTCCATTTCCCTTCCGTTCCCTCCCTG fc 211 TCAGGGCGTAATTGAGTCAAAGGCAGGATCAGGTTCCCCGCCTTCCAGTCCAAAAATCCCGCCAAGAGAG 281 CCCCAGAGCAGAGGAAAATCCAAAGTGGAGAGAGGGGAAGAAAGAGACCAGTGAGTCATCCGTCCAGAAG 351 GCGGGGAGAGCAGCAGCGGCCCAAGCAGGAGCTGCAGCGAGCCGGGTACCTGGACTCAGCGGTAGCAACC 421 TCGCCCCTTGCAACAAAGGCAGACTGAGCGCCAGAGAGGACGTTTCCAACTCAAAA 477 ATG CAG GCT CAA CAG TAC CAG CAG CAG CGT CGA AAA TTT GCA GCT GCC TTC TTG -32 H Q A Q Q Y G Q Q R R K F A A A F L 531 GCA TTC ATT TTC ATA CTG GCA GCT GTG GAT ACT GCT GAA GCA' GGG AAG AAA GAG -14 A F r F r L A A V D T A E A G K K E 585 AAA CCA GAA AAA AAA GTG AAG AAG TCT GAC TGT GGA GAA TGG CAG TGG AGT GTG 5 K P E K K V K K $ D C G E y q y S V 639 TGT GTG CCC ACC AGT GGA GAC TGT GGG CTG GGC ACA CGG GAG GGC ACT CGG ACT 23 C V P T S G D C G L G T R E G T R T 693 GGA GCT GAG TGC AAG CAA ACC ATG AAG ACC CAG AGA TGT AAG ATC CCC TGC AAC 41 G A E C K Q T M K T Q R C K r p C N 747 ‘TGG AAG AAG CAA TTT GGC GCG GAG TGC AAA TAC CAG TTC CAG GCC TGG GGA GAA 59 U K K Q F G A E C K Y Q F Q a y G E 801 TGT GAC CTG AAC ACA GCC CTG AAG ACC AGA ACT GGA AGT CTG AAG CGA GCC CTG i 77 C D L N T A L K T R T G S L K R A L 855 CAC AAT GCC GAA TGC CAG AAG ACT GTC ACC ATC TCC AAG CCC TGT GGC AAA CTG 95 H N A E C Q K T V T I S K P C G K L - 909 ACC AAG CCC AAA CCT CAA GCA GAA TCT AAG AAG AAG AAA AAG GAA GGC AAG AAA 113 T K P K P Q A E s K K K K K E G K K 963 CAG GAG AAG ATG CTG GAT TAA 131 Q E K M L D * 984 AAGAT GTCACCT GTGGAACAT AAAAAGGACATCAGCAAACAGGATCAGTT AACT ATT GCATTT AT AT GT A 1054 CCGTAGGCTTTGTATTCAAAAATTATCTATAGCTAAGTACACAATAAGCAAAAACAACCAATTTGGGTTC 1124 TGCAGGTACATAGAAGTTGCCAGCTTTTCTTGCCATCCTCGCCATTCGAATTTCAGTTCTGTACATCTGC 1194 CT AT ATTCCTTGT GAT AGT GCTTT GCTTTTTCATAGATAAGCTTCCTCCTT GCCTTT CGAAGCATCTTTT 1264 GGGCAAACTTCTTTCTCAGGCGCTTGATCTTCAGCTCTGCGAAATTCCTTCGCTTTTTCTTAAGGGTTTC 1334 TGGCACAGCAGGAACCTCCTTCTTCTTCTCTTCTACACCCTCTATGTACC
    ou uma sua fracção, que codifica uma proteína HBNF biologicamente activa»
  2. 31. - Sene de acordo com a Reiyindicação 1 que é hibridável com a sequência descrita na Figura referida na Reivindicação 2 em condições convencionais de restringência elevada. 4â. - Método para a preparação de proteína HBNF substancialmente pura, caracterizado por compreender a transfarmação de uma célula hospedeira com o gene da Reivindicação 1 e cultura da célula hospedeira em condições que permitam a expressão do gene pela célula hospedeira.
  3. 51. - Vector de expressão, caracterizado por compreender o gene da Reivindicação 1.
  4. 61. - Célula hospedeira, caracterizada por compreender o gene da Reivindicação 1.
  5. 71. - Célula de acordo com a Reivindicação 6, caracterizada por estar depositada na American Type Culture Collection como ATCC 68385» 81« - Método de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por se preparar a proteína HBNF isolada e purificada tendo uma sequência descrita na Figura referida na Reivindicação 2 ou na Figura que se segue; ΜΧ·**"' -24-
    LO IO CL „ í- 10 CZ CD CZ L. ° SZ o >, <=> LO —1 -> 1— | Tf |—. 1 LD _J I CO c 1 —· LD CZ CJ) 1 CL I 3 1 UI S_ S- cu >, O | < 1 1— 1 | o CL 1 c. 1 c 1 CL 1 CL L. x; UI UI U| t— | 1— I <c I C I <E 1 3 1 1 UI 1 UI 1 CÍ —' —* s —· LD I LD 1 o CJ c >- 1 3 1 o 1 3 1 CZ —' —* s_ —* - UI LD I LD I Ο ι LD 1 <E | ui 1 CD 1 αι 1 >1 1 UI >s ΙΓ5 *- LO in —· in — C_J | “J <r CD | in ►—i 1 1— LD I cr> IC t * CL 1 L. 1 Ul 1 CL 1 3 I UI Ul s: L. <U >, <n I t— | —I I 1— | _J I 1 í_ 1 >1 1 UI 1 CÍ 1 d 1 4_ ω >. —' —- SZ uo 1 tD 1 o 1 C | c 1 1— I LO I 3 CD 1 c 1 CD 1 3 cu s_ —' C. cu _J 1 I c 1 LD 1 <r I _J | Ul 1 >> 1 CZ 1 CU 1 UI 1 Ul —* SZ >. _J I LD 1 LD I Ο ι _1 1 É 1 1 W 1 L. 1 c 1 3 1 CD >s CS t—> ^ CD _c CD -- L - -lj fíl tH > I « V in i— I ld 1 CT> _J I — LD I 1 in Q. 1 UI 1 1 í_ 1 Ul >> Ul >, > cu >> | C | _l 1 \— I CJ 1 o 1 1 UI 1 >, 1 -H 1 LO 1 >* 1 o —- CL) —' L. _1 1 LD Σ I _J I LD I Q_ 1 1 3 1 L. 1 4- 1 10 1 c. 1 LO QJ sz >, SZ >* LD I (/) I f- I o | 1— I _J ( I o 1 í. 1 C 1 3 1 CD 1 5_ L. sz —- —* C. ω Ο ι l·- I LD I LD I c | 00 | w 1 o 1 UI 1 CS 1 L_ tn cu > LD LO >-. LO —· in sz CD —'· _J 1 u ' rt OJ 4- Tf _J | vO <E 1 00 l·-1 « i-—« I 1 3 1 1 UI 1 >1 1 LO 1 L. — ci >·, —> -C LD I > I o 1 LD I 1 1— 1 Ui UI 1 3 (D 1 3 1 >1 >» SZ CL) cJ I o I LD I Cl. 1 _J 1 D» 1 1 Ul 1 1 <5 1 CZ 1 a 1 c. d —* JC -J | >· I C I LD 1 <z t Κ Ι 1 > 1 í_ 1 >. LO 1 i. ui -—· cu sz >> LD 00 LD _l l— 25- e seus homólogos ou fragmentos que retenham a actividade biológica de HBNF« 9§« - Processo para. a preparação de uma composição terapêutica, caracterizado por s© incluir na referida composição uma quantidade eficaz da proteína da Reivindicação S, em combinação com um veículo farmaceuiicament© aceitável. 1&§« - Método para a manutenção ou promoção do crescimento de células nervosas in vitro, caracterizado por compreender a cultura das células na presença de uma quantidade eficaz da proteína da Reivindicação 8. ílã. - Método para a reparação ou tratamento in vivo de células nervosas danificadas, caracterizado por compreender a administração a um índividuo necessitado de tal tratamento de uma quantidade eficaz de células transgénicias compatíveis capazes de expressarem a proteína da Reivindicação S. 12ã. - Método para a indução da diferenciação de células não diferenciadas, caracterizado por compreender a aplicação as células de uma quantidade eficaz de uma proteína HBNF. Lisboa, ló de Agosto de iv91
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