JPH11106350A

JPH11106350A - イヌおよびネコの免疫疾病の治療薬、治療方法および予防薬、予防方法

Info

Publication number: JPH11106350A
Application number: JP10133345A
Authority: JP
Inventors: Fumiyoshi Okano; 文義岡野; Masahiro Sato; 昌弘佐藤; Masanari Yamada; 勝成山田
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1997-05-16
Filing date: 1998-05-15
Publication date: 1999-04-20
Anticipated expiration: 2018-05-15
Also published as: JP4632326B2

Abstract

(57)【要約】【課題】ＣａＩＬ１２ｃＤＮＡをクローニングし、それ
を用いて大量生産すること、およびＣａＩＬ１２からな
る製剤を免疫疾患のイヌの治療薬および予防薬として提
供すること。【解決手段】本発明は、配列番号：１または配列番号：
１１と同じあるいはその一部を有するアミノ酸配列と配
列番号：２または配列番号：１２と同じあるいはその一
部を有するアミノ酸配列がヘテロダイマーを形成してで
きるイヌインターロイキン１２を含んでなるイヌおよび
ネコの免疫疾病治療薬および免疫疾病予防薬に関する。
さらに、本発明は、かかるイヌおよびネコの免疫疾病治
療薬・予防薬をイヌおよびネコに注射投与することを特
徴とするイヌおよびネコの免疫疾病治療方法・予防方法
に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、蛋白質の一次構造
がイヌの遺伝情報由来であるイヌインターロイキン１２
（以下、ＣａＩＬ１２と略記する）からなるイヌおよび
ネコの免疫疾病の治療薬および予防薬、また、その薬を
用いたイヌおよびネコの免疫疾病の治療方法および予防
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】インターロイキン１２は、分子量約４０
ｋＤ蛋白質（以下Ｐ４０と略記する）と約３５ｋＤ蛋白
質（以下Ｐ３５と略記する）とのヘテロダイマーよりな
り、ナチュラルキラー細胞および１型ヘルパーＴ細胞
を活性化するなどの生理活性作用を有するサイトカイン
で（文献１、２）、ＩＬ１２と略記される。ＩＬ１２
は、特に細胞性免疫の強力な活性化作用により、腫瘍、
感染症、アレルギーなどのマウスモデル実験において、
驚異的な治癒効果が多くの文献において報告されており
（文献３、４、５）、腫瘍および感染症の治療薬として
臨床試験も始まっている。

【０００３】ヒトと同様、イヌにも乳腺腫瘍など多数の
腫瘍、アトピー性皮膚炎など多くの皮膚炎、パルボウイ
ルス感染症、ジステンバー感染症など多数の感染症など
が知られており、これらはイヌの疾病統計で常に上位に
ランクされている。しかしながら、これらイヌの疾病に
対する有効な治療薬および予防薬は現在のところほとん
どない。例えば腫瘍では、腫溜が大きくなってから来院
するイヌやがほとんどで、手術により切除してもすでに
転移していて、手術後まもなく死亡することが多い。ま
た、イヌに多い皮膚疾病では、ステロイド剤などを用い
て長期にわたり繰り返し治療されているにもかかわら
ず、完治しない例が多く、即効性でかつ持続性のある治
療薬が望まれている。そのような現状の中で、イヌのＩ
Ｌ１２が入手可能となれば、有効な治療薬および予防薬
がないこれらイヌの疾病に対する用途が開かれると期待
される。ネコに関しても同様なことが言える。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、かかる状況に鑑みＣａＩＬ１２ｃＤＮＡをクローニ
ングし、それを用いて大量生産すること、およびＣａＩ
Ｌ１２からなる製剤を免疫疾患のイヌの治療薬および予
防薬として提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
の達成のため、創意工夫を成し、イヌのｃＤＮＡからＣ
ａＩＬ１２のＰ４０とＰ３５をコードするそれぞれの遺
伝子をクローニングすることに成功し、更にはこれらを
発現ベクターに連結した２つのプラスミドを用いてＣａ
ＩＬ１２を生産する細胞の作製、およびこれら遺伝子を
同時に含む組換えバキュロウイルスの作製に成功し、以
って簡単に大量にＣａＩＬ１２を製造する方法を確立
し、さらにはＣａＩＬ１２からなる製剤を従来の治療法
では治療が困難である疾病のイヌに投与すること、また
は疾病のイヌ末梢血からリンパ球を分離してｉｎｖｉ
ｔｒｏでＣａＩＬ１２からなる製剤で刺激後、再び同一
イヌに戻すことによってその病状が驚くほど顕著に改善
されることを見出し、かくして本発明を完成させるに至
った。さらに驚くべきことにＣａＩＬ１２からなる製剤
はネコの疾病にも顕著な治療効果および予防効果がある
ことを見出した。

【０００６】すなわち、本発明の骨子は、下記の各発明
から成る。

【０００７】（１）配列番号：１または配列番号：１
１と同じあるいはその一部を有するアミノ酸配列と配列
番号：２または配列番号：１２と同じあるいはその一部
を有するアミノ酸配列がヘテロダイマーを形成してでき
るイヌインターロイキン１２を含んでなるイヌおよびネ
コの免疫疾病治療薬。

【０００８】（２）イヌおよびネコの免疫疾病が腫
瘍、皮膚炎、感染症またはアレルギー疾病である上記
（１）に記載のイヌおよびネコの免疫疾病治療薬。

【０００９】（３）上記（２）または（２）に記載さ
れたイヌおよびネコの免疫疾病治療薬をイヌおよびネコ
に注射投与することを特徴とするイヌおよびネコの免疫
疾病治療方法。（４）配列番号：１または配列番号：１１と同じある
いはその一部を有するアミノ酸配列と配列番号：２また
は配列番号：１２と同じあるいはその一部を有するアミ
ノ酸配列がヘテロダイマーを形成してできるイヌインタ
ーロイキン１２を含んでなるイヌおよびネコの免疫疾病
予防薬。

【００１０】（５）イヌおよびネコの免疫疾病が腫
瘍、皮膚炎、感染症またはアレルギー疾病である上記
（４）に記載のイヌおよびネコの免疫疾病予防薬。

【００１１】（６）上記（４）または（５）に記載さ
れたイヌおよびネコの免疫疾病予防薬をイヌおよびネコ
に注射投与することを特徴とするイヌおよびネコの免疫
疾病予防方法。（７）配列番号：１または配列番号：１１に示すＤＮ
Ａ配列あるいはその一部を有するＤＮＡ配列と配列番
号：２または配列番号：１２に示すＤＮＡ配列あるいは
その一部を有するＤＮＡ配列を同時に含む組換えバキュ
ロウイルス。

【００１２】（８）上記（７）に記載の組換えバキュ
ロウイルスを昆虫細胞または幼虫に感染させ、イヌイン
ターロイキン１２を採取することを特徴とするイヌイン
ターロイキン１２の製造方法。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明のＣａＩＬ１２蛋白質の２
つのサブユニットをそれぞれコードするＤＮＡを組込ん
だプラスミドは例えば次のようにして製造することがで
きる。すなわち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽
出した後、ｃＤＮＡを合成し、ウシやヒトのＩＬ１２の
２つのサブユニットをそれぞれコードする遺伝子配列を
元にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以
下ＰＣＲと略す）を行うことによってＣａＩＬ１２活性
を示す２つのサブユニットをそれぞれコードする２つの
遺伝子をクローニングすることができる。また、合成し
たｃＤＮＡ組換え体よりファージライブラリーを作製
し、ＰＣＲによって得られた２つの遺伝子断片とプラー
クハイブリダイゼーションを行うことにより、ＣａＩＬ
１２Ｐ４０ｃＤＮＡとＣａＩＬ１２Ｐ３５ｃＤＮＡの全
長をクローニングすることができる。

【００１４】イヌの臟器や細胞、例えばマイトージェン
などで刺激されたイヌ単核球やリンパ球などよりＲＮＡ
を得る方法としては、通常の方法、例えば、ポリソーム
の分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法
などがあげられる。上記イヌ臟器やイヌ細胞よりＲＮＡ
を抽出する方法としては、グアニジン・チオシアネート
処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシ
アネート−塩化セシウム法（文献３）バナジウム複合体
を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活
性剤で処理したのちフェノール抽出を行う方法（文献
４），グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノー
ル法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸
法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロ
ホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理したのち
塩化リチウムで処理してＲＮＡを沈殿させる方法などの
中から適当な方法を選んで行うことができる。

【００１５】イヌ臟器やマイトージェンなどで刺激され
たイヌ単核球やリンパ球より通常の方法、例えば、塩化
リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート
法、オリゴｄＴセルロースカラム法等によりｍＲＮＡを
単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例えば、Ｇ
ｕｂｌｅｒらの方法（文献５），Ｈ．Ｏｋａｙａｍａら
の方法（文献６）等によりｃＤＮＡを合成する。得られ
たｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、基本的にはト
リ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素などを用
いるほか１部プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼな
どを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合成ある
いはクローニング用キットを用いるのが便利である。

【００１６】このｃＤＮＡを鋳型としてヒト、マウスお
よびウシの塩基配列を基にしたプライマーを用いてＰＣ
Ｒを行うことによってＣａＩＬ１２活性を示すＰ４０サ
ブユニットおよびＰ３５サブユニットをコードする遺伝
子をクローニングすることができる。また、合成したｃ
ＤＮＡをλファージベクターに連結した後、インビトロ
でλファージのコート蛋白質などと混合することにより
パッケージングし、その生成されたファージ粒子を宿主
となる大腸菌に感染させる。この際、λファージの感染
した大腸菌は溶菌し、１個１個のクローンがプラークと
して回収される。このプラークをニトロセルロースなど
のフィルターに移し、放射標識したＰＣＲで得た遺伝子
をプローブとしたハイブリダイゼーションにより、Ｃａ
ＩＬ１２Ｐ４０ｃＤＮＡおよびＣａＩＬ１２Ｐ３５ｃＤ
ＮＡの全長をクローニングすることができる。

【００１７】宿主としては原核生物又は真核生物を用い
ることができる。原核生物としては細菌、特に大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ），バチルス属
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌、例えばバチルス・ズブチリ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）等を用いる
ことができる。真核生物としては酵母、例えばサッカロ
ミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、例えば
サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の真核性微生物、昆
虫細胞、例えば、ヨガ細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆ
ｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、キャベツルーパー細胞（Ｔｒｉ
ｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）、カイコ細胞（Ｂｏｍｂｙｘ
ｍｏｒｉ）、動物細胞、例えばヒト細胞、サル細胞、
マウス細胞等を使用することができる。本発明において
はさらに、生物体それ自体、例えば昆虫、例えばカイ
コ、キャベツルーパー等を用いることもできる。

【００１８】発現ベクターとしては、プラスミド、ファ
ージ、ファージミド、ウイルス（バキュロ（昆虫）、ワ
クチニア（動物細胞））等が使用できる。発現ベクター
中のプロモーターは宿主細菌に依存して選択され、例え
ば細菌用プロモーターとしてはｌａｃプロモーター、ｔ
ｒｐプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターと
しては、例えばａｄｈ１プロモーター、ｐｑｋプロモー
ター等が使用される。また、昆虫用プロモーターとして
はバキュロウイルスポリヘドリンプロモーター、ｐ１０
プロモーター等、動物細胞としてはＳｉｍｉａｎＶｉ
ｒｕｓ４０のｅａｒｌｙまたはｌａｔｅプロモーター等
があげられるが、これらに限定されない。発現ベクタ
ーによる宿主の形質転換は、当業界においてよく知られ
ている常法により行うことができ、これらの方法は例え
ば、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌ
ｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ
＆Ｓｏｎｓ社、に記載されている。形質転換体の培養
も常法に従って行うことができる。

【００１９】産生されたＣａＩＬ１２は，非還元下、ド
デシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により決定すると、見かけの分子
量が約７０〜８０ｋＤである。

【００２０】ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、７０〜８０ｋＤの
バンドが、還元条件下では分子量約４０ｋＤと約３５ｋ
Ｄの２つのサブユニットを生じる。ＣａＩＬ１２は、
以下の実施例２で示すように、ｉｎｖｉｔｒｏで、イ
ヌ白血球からのインターフェロンγ（以下ＩＦＮγと略
記する）の誘導能およびフィトヘムアグルチニンン（以
下ＰＨＡと略記する）で刺激されたイヌリンパ球の増殖
促進効果により主に特性化される。その他、ＮＫ細胞や
細胞障害性Ｔ細胞を活性化してそれらの標的細胞、例え
ば腫瘍由来のセルラインまたはウイルス感染した線維芽
細胞を融解する活性を有する。

【００２１】遺伝子組換え技術によって製造されたＣａ
ＩＬ１２を単離、精製するための方法に特に限定はな
く、通常の蛋白質の精製方法を用いることができる。例
えばイヌＩＦＮγの誘導活性を指標としながら、イオン
交換性担体、色素担体、ゲル濾過担体、シリカゲル担
体、キレート担体等を用いたクロマトグラフィーや、限
外濾過、ゲル濾過、透析、塩析等による脱塩、濃縮を組
合せることによって精製し単離することができる。

【００２２】本発明に係るイヌおよびネコの免疫疾病治
療薬・予防薬は、腫瘍をはじめ皮膚炎、アレルギー疾
患、感染症など免疫能が低下した疾病、あるいは特に細
胞性免疫反応に比べ、液性免疫反応が中心となったよう
な片寄った免疫反応を示す疾病などさまざまなイヌおよ
びネコのの免疫疾病に対して、従来のこれらイヌおよび
ネコの疾病に対する治療薬・予防薬や治療方法・治療方
法に比べ、驚くべき顕著な治療効果および予防効果を示
す。

【００２３】本発明において、イヌおよびネコの腫瘍と
しては、乳腺腫瘍、好酸球性肉芽腫、類表皮腫、皮膚腫
瘍、脂肪腫、耳血腫、肺水腫、皮膚有茎軟腫または肛門
腫瘍が挙げられ、イヌおよびネコの皮膚炎としては、外
耳道炎、皮膚炎、湿疹、皮膚真菌症、膿皮症、アレルギ
ー性皮膚炎、じん麻疹、外傷性皮膚炎、または脱毛症が
挙げられ、イヌおよびネコの感染症としては、イヌパル
ボウイルス感染症、ジステンバー感染症、ネコエイズお
よびネコ白血病が挙げられ、そしてアレルギー性疾病と
しては、イヌおよびネコの花粉症が挙げられる。

【００２４】また、このイヌおよびネコの免疫疾病治療
薬・予防薬は、ＣａＩＬ１２に加えて任意に他の成分を
含むことができる。本薬に添加される成分は、主とし
て、本薬が投与される方式に依存して決定される。本薬
が個体として用いられる場合は、例えばラクトース等の
充填剤、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン等の結
合剤、着色剤、コーティング剤等を用いることができ、
このような剤は経口投与に好適である。また、担体また
は賦活剤として例えば、白色ワセリン、セルロース誘導
体、界面活性剤、ポリエチレングリコール、シリコー
ン、オリーブ油等を加えてクリーム、乳液、ローション
等の形態として外用薬として患部に塗布して用いること
もできる。また、本薬が液体として投与される場合は、
通常行われている生理学的に許容される溶媒、および乳
化剤、安定剤を含むことができる。溶媒としては水、Ｐ
ＢＳ、等張性生理食塩水等が挙げられ、乳化剤として
は、ポリオキシエチレン系界面活性剤、脂肪酸系界面活
性剤、シリコーン等が例示でき、安定剤としては、イヌ
血清アルブミン、ゼラチン等のポリオール、またはソル
ビトール、トレハロースなどの糖類等が挙げられる。本
発明の治療薬および予防薬の投与方法に特に限定はない
が、注射等よすることにより最も治療効果が期待でき
る。注射投与方法としては静脈内投与、筋肉内投与、皮
下投与、腹腔内投与、胸腔内投与いずれの方法にも限定
されない。

【００２５】投与量は、個体の大きさ、投与方法、疾病
の種類、症状などに依存して決定されるであろうが、治
療効果および予防効果を示すのに十分な量を投与すれば
よく、例えば、１用量、１日当たり、０．１ｐｇから１
００μｇ／ｋｇのＣａＩＬ１２の投与で十分な効果が得
られる。

【００２６】また、養子免疫療法では１ー１００ｍｌの
イヌまたはネコの血液から分離したリンパ球に対し、
０．００１ｐｇから１μｇのＣａＩＬ１２で１２時間か
ら６日間刺激した後に再び体内に戻すことによって十分
な効果が得られる。

【００２７】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定され
るものではない。

【００２８】［実施例１］ＣａＩＬ１２Ｐ４０、Ｐ３５遺伝子のクローニング：（１）イヌｃＤＮＡの調製イヌ肝臓、ＬＰＳ（５０μｇ／ｍｌ）で４８時間刺激し
たイヌ末梢血単核球およびニワトリニューカッスル病ウ
イルスで７時間処理した（１０⁷ ｐｆｕ／ｍｌ）イヌ脾
臓由来リンパ球よりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）
を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で５
分間処理した後、１ＭＬｉＣｌを含むＴＥを同量加え
た。０．５ＭＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴ
ｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩
衝液にて洗浄した。さらに０．３ＭＬｉＣｌを含むＴ
Ｅにて洗浄後、０．０１％ＳＤＳを含む２ｍＭＥＤＴ
Ａ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出し
た。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖
ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌの
ミクロ遠心チューブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．
５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１８ｍｅｒ）を
入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加えて１
２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベートしたのち
氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ８．４），５００ｍＭＫＣｌ溶液を２μｌ，２
５ｍＭＭｇＣｌ₂ を２μｌ，１０ｍＭｄＮＴＰを１
μｌおよび０．１ＭＤＴＴを２μｌそれぞれ加え、４
２℃で５分間インキュベートしたのち、２００ユニット
のＧｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ
ＲＴを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュ
ベートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で
１５分間インキュベートして反応を停止し、氷上に５分
間置いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃｏｌｉＲＮａ
ｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分
間インキュベートした。

【００２９】（２）イヌｃＤＮＡファージライブラリー
の調製上記（１）で得られたポリ（Ａ）ＲＮＡ１μｇづつを用
い、ファルマシア社のタイムセーバーｃＤＮＡ合成キッ
トにて添付のマニュアルに従い、オリゴｄＴプライマー
を用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成し、さらにＥｃｏＲＩ／
ＮｏｔＩアダプターを連結した。これを用いて、アマシ
ャム社のｃＤＮＡラピットクローニングモジュール−λ
ｇｔ１０にて添付のマニュアルに従い、組換えλｇｔ１
０ベクターを作製し、さらにアマシャム社のインビトロ
パッケージングモジュールにて添付のマニュアルに従
い、組換え体ファージ作製した。

【００３０】（３）ＣａＩＬ１２Ｐ４０遺伝子のクロー
ニングヒトＩＬ１２Ｐ４０のＮ末端およびＣ末端の塩基配列
（文献１）をもとに、５´ＡＴＧＴＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＣＡＴ
ＣＴＣＴＴＧＧＴＴＴ３´（配列番号３）と５´ＣＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣ
Ａ３´（配列番号４）の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成
した。上記（１）のイヌ肝臓およびＬＰＳ刺激イヌ末梢
血より得られたｃＤＮＡを別々の０．５ｍｌのミクロ遠
心チューブに２μｌづつ取り、各プライマーを２０ｐｍ
ｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．
５ｍＭＭｇＣｌ₂ 、２５ｍＭＫＣｌ，１００μｇ／
ｍｌゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１
００μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プ
ライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマ
ーの伸長条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−
ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラー
を用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロー
スゲルにて電気泳動し、約９９０ｂｐのＤＮＡ断片を常
法（文献７）に従って調製した。

【００３１】このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社
のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）のＤＮＡＬｉｇａ
ｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．１を用いて連結した。これ
を用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質
転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次
にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを
前述と同じ条件のＰＣＲによって確認し、Ｇｅｎｅｓｉ
ｓ２０００ＤＮＡａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍ
（デュポン社）を用いて、ダイデオキシ法（文献９）で
ＣａＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユニット
のうち一方のＰ４０サブユニットＤＮＡの塩基配列を決
定した。この配列を配列番号１に示す。

【００３２】また、この配列を含む、９９０ｂｐのＤＮ
Ａ断片に宝酒造（株）のＲａｎｄｏｍＰｒｉｍｅｒ
ＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔを用いて３２Ｐを標
識し、プローブを作製した。上記（２）で得られたイヌ
肝臓ｃＤＮＡから作製した組換え体ファージライブラリ
ーを大腸菌ＮＭ５１４上でプラークとして形成させ、ア
マシャム社のＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋に常法に従って転写し
た。

【００３３】Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋は、５×ＳＳＰＥ
（０．９ＭＮａＣｌ，５０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄，５ｍＭ
ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４），５×デンハルト溶液（０．
１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．
１％ウシ血清アルブミン）、０．１％ＳＤＳ、１００μ
ｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中、６５℃で２時間インキュベ
ートし、ついで同じ溶液中で上述のようにして作製した
標識プローブ１×１０⁶ｃｐｍ／ｍｌとハイブリダイズ
した。６５℃で１晩インキュベートした後、Ｈｙｂｏｎ
ｄ−Ｎ＋を０．２×ＳＳＣ（３０ｍＭＮａＣｌ，３ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ中１５分、３
回洗浄し、富士写真フィルム（株）の富士イメージング
プレートに１２時間露出し、富士写真フィルム（株）の
バイオイメージングアナライザーにて解析した。陽性の
シグナルを有するプラークは常法に従い、再スクリーニ
ングを行った。３回のスクリーニングの結果、陽性シグ
ナルを有する１個の組換え体ファージを得た。この組換
え体ファージより常法に従ってファージＤＮＡを抽出
し、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、１％アガロース
ゲル電気泳動にて得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を
常法に従い調製し、宝酒造（株）のＤＮＡＬｉｇａｔ
ｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２を用いて、宝酒造（株）の
ｐＵＣ１１８ＢＡＰ処理ＤＮＡ（ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ）
と連結した。これを用いてプラスミドＤＮＡを常法によ
り調製し、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー
社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プ
ロトコールに従って、パーキンエルマー社のダイターミ
ネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得ら
れたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。このうち、Ｃａ
ＩＬ１２Ｐ４０をコードする配列を配列番号１１に示
す。

【００３４】（４）ＣａＩＬ１２Ｐ３５遺伝子のクロー
ニングヒトＩＬ１２Ｐ３５のＮ末端（文献１）およびウシＩＬ
１２Ｐ３５のＣ末端の塩基配列をもとに、５´ＡＧＣＡＴＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＣＴ
ＣＣＴＣＣＴＴＧＴＣＧＣＴＡＣＣＣＴＧ３´（配列番
号５）と５´ＣＴＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＧＡＴＡＧＣＴＣＡ
ＴＣＡＴＴＣＴＧＴＣＧＡＴＧＧＴ３´（配列番号６）の２種類のプライマ−をＤＮＡシンセサイザーにて合成
した。上記（１）の鶏ニューカッスル病ウイルスで処理
したイヌ脾臓由来リンパ球より得られたｃＤＮＡを鋳型
として上記（３）と同様にして約６７０ｂｐのＤＮＡ断
片を得、Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ＣａＩＬ１２活性
を示すと思われる２つのサブユニットのうち一方のＰ３
５サブユニットＤＮＡの塩基配列を決定した。この配列
を配列番号２に示す。

【００３５】また、この配列を含む６７０ｂｐのＤＮＡ
断片を用いて標識プローブを作製した。上記（２）で得
られた鶏ニューカッスル病ウイルスで処理したイヌ脾臓
由来リンパ球より得られたｃＤＮＡから作製した組換え
体ファージライブラリーを上記（３）と同様にして標識
プローブとハイブリダイズし、スクリーニングを行っ
た。その結果得られた陽性シグナルを有する１個の組換
え体ファージよりＤＮＡを抽出し、制限酵素ＮｏｔＩで
切断した後、１％アガロースゲル電気泳動にて得られた
約１．２ｋｂのＤＮＡ断片をＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社の
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩのＮｏｔＩサイトに常法に
従い連結した。これを用いてプラスミドＤＮＡを調製
し、蛍光ＤＮＡシーケンサーを用いて、得られたＤＮＡ
断片の塩基配列を決定した。このうち、ＣａＩＬ１２Ｐ
３５をコードする配列を配列番号１２に示す。

【００３６】［実施例２］ＣａＩＬ１２の生産：（１）ＣａＩＬ１２発現ベクターの調製発現ベクターｐＣＤＬ−ＳＲα２９６（文献９）を制限
酵素ＥｃｏＲＩで切断し、バクテリア由来アルカリホス
ファターゼで末端を脱リン酸化した。これを１％アガロ
ースゲル電気泳動にて約３．６ｋｂのＤＮＡ断片を常法
に従い調製した。一方、ＣａＩＬ１２Ｐ４０ＤＮＡ断
片は５´ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡ
ＧＴＴＧＧＴＣＡＴＣＴＣＴＴＧＧ３´（配列番号７）と５´ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡ
ＣＡＧＡＴＧＣＣＣＡＧＴＣＧＣＴ３´（配列番号８）の２種類のＥｃｏＲＩ切断部位を付加したプライマーを
作製し、実施例１（２）で調製したＴ−Ｖｅｃｔｏｒに
挿入したＣａＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブ
ユニットのうち一方のＰ４０サブユニットＤＮＡを鋳型
として、ＤＮＡの変性条件を９４℃、１分、プライマー
のアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長
条件を７２℃，３分、サイクル数３０でＰＣＲを行い、
エタノール沈殿後、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、１％
アガロースゲル電気泳動にて約９９０ｂｐのＤＮＡ断片
を調製した。また、５´ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＴＣＣＴＣＡＧＣＡ
ＧＴＴＧＧＴＣＡＴＣＴＣＣＴＧＧ３´（配列番号１
３）と５´ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡ
ＣＡＧＡＴＧＣＣＣＡＧＴＣＧＣＴ３´（配列番号１
４）の２種類のＥｃｏＲＩ切断部位を付加したプライマーを
作製し、実施例１（２）で調製したｐＵＣ１１８に挿入
したＣａＩＬ１２Ｐ４０ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを
行い、ＥｃｏＲＩで切断し、約９９０ｂｐのＤＮＡ断片
を調製した。得られたそれぞれのＣａＩＬ１２Ｐ４０Ｄ
ＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて上述のようにし
て調製したｐＣＤＬ−ＳＲα２９６に連結した。これを
用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプ
ラスミドＤＮＡを調製し、ＣａＩＬ１２Ｐ４０を発現す
るＦＯＣａＩＬ１２Ｐ４０およびＦＯＣａＩＬ１２Ｐ４
０ＦＬを得た。

【００３７】また、ｐＣＤＬ−ＳＲα２９６を制限酵素
ＰｓｔＩで切断し脱リン酸化後、電気泳動にて約３．６
ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。ＣａＩＬ１２Ｐ３５Ｄ
ＮＡ断片は５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＧ
ＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＣ３´（配列番号９）と５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣ
ＡＧＡＴＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴ３´（配列番号１
０）の２種類のＰｓｔＩ切断部位を付加したプライマー
を作製し、実施例１（３）で調製したＴ−Ｖｅｃｔｏｒ
に挿入したＣａＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサ
ブユニットのうち一方のＰ３５サブユニットＤＮＡを鋳
型として、９４℃，１分、５５℃，２分、７２℃，３
分、３０サイクルでＰＣＲを行い、エタノール沈殿後、
制限酵素ＰｓｔＩで切断した。これを１％アガロースゲ
ル電気泳動にて約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。
また、５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧ
ＣＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＧ３´（配列番号１
５）と５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＡ
ＧＡＴＡＡＣＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴ３´（配列番号１
６）の２種類のＰｓｔＩ切断部位を付加したプライマーを作
製し、実施例１（２）で調製したｐＵＣ１１８に挿入し
たＣａＩＬ１２Ｐ３５ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行
い、ＰｓｔＩで切断し、約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を調
製した。得られたそれぞれのＣａＩＬ１２Ｐ３５ＤＮＡ
断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて上述のように、Ｐｓ
ｔＩで切断し調製したｐＣＤＬ−ＳＲα２９６に連結、
大腸菌形質転換、プラスミドＤＮＡ調製を行い、ＣａＩ
Ｌ１２Ｐ３５を発現するＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５および
ＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５ＦＬを得た。

【００３８】さらに、作製したこれら４つの発現プラス
ミド中のＣａＩＬ１２Ｐ４０ＤＮＡおよびＣａＩＬ１２
Ｐ３５ＤＮＡの塩基配列を確認した。

【００３９】（２）サルＣＯＳ細胞でのＣａＩＬ１２の
生産上記（１）で得られたそれぞれ５μｇのＦＯＣａＩＬ１
２Ｐ４０およびＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５を５０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、４００μｇ／ｍｌのＤＥ
ＡＥデキストラン（ファルマシア製）および１００μＭ
のクロロキン（シグマ社）を含む４ｍｌのＥＲＤＦ培地
（極東製薬（株）社製）に加えておく。一方、直径１０
ｃｍのディッシュを用いて１０％ウシ胎児血清（ギブコ
社、以下ＦＢＳと略記する）で５０％コンフルエントに
なるまで増殖させたＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ
−１６５０）をＰＢＳで一回洗浄した後、上記で得た４
ｍｌのＤＮＡ混合液を加え、５％ＣＯ₂ 、３７℃の条件
で培養した。４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、２
０ｍｌのＥＲＤＦ培地にて５％ＣＯ₂ ，３７℃の条件で
４日間培養し、ＣａＩＬ１２が生産された培養上清を得
た。

【００４０】（３）ＣａＩＬ１２産生組換えバキュロウ
イルスの作製バキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＡＢ３
（ファーミンジェン社製）のプロモーター下流の制限酵
素ＸｂａＩおよびＳｍａＩ切断部位にそれぞれＰ４０お
よびＰ３５サブユニットｃＤＮＡを常法に従って連結
し、組換えトランスファーベクターを得た。さらにファ
ーミンジェン社製のバキュロウイルストランスフェクシ
ョンキットを用いてその添付マニュアルに従って、組換
えバキュロウイルスを作製した。（４）昆虫細胞でのＣａＩＬ１２の生産上記（３）で得られた組換えバキュロウイルスを、ファ
ーミンジェン社製のバキュロゴールドＰｒｏｔｅｉｎ−
ＦｒｅｅＩｎｓｅｃｔＭｅｄｉｕｍで７５ｃｍ²の
フラスコでコンフルエントまで平面培養したＳｆ２１細
胞（ＳｐｏｎｄｏｐｔｅｒａＦｌｕｇｉｐｅｒｄａ由
来、ファーミンジェン社より入手）に感染させ、４日間
培養した後、ＣａＩＬ１２が生産された培養上清を得
た。

【００４１】（５）ＣａＩＬ１２の活性測定上記（２）、（４）で生産されたＣａＩＬ１２の活性測
定は以下のようにして行った。イヌリンパ球からのイ
ヌＩＦＮγ誘導活性検定のために、抗ウイルス活性およ
びイヌ細胞のクラスＩＩＭＨＣ発現増強活性を測定し
た。

【００４２】イヌ脾臓よりリンパ球を分離し、１０％Ｆ
ＢＳ−ＥＲＤＦに１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で
懸濁し、このうち２．５ｍｌとヒトＩＬ２（Ｇｅｎｚｙ
ｍｅ社製）２５０Ｕを６ｃｍディッシュに添加した。こ
れに上記（２）で得られた培養上清２．５ｍｌとヒトＩ
Ｌ２（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）２５０Ｕを加え、５％ＣＯ
₂ 、３７℃の条件で２日間培養し、ウイルスとしてＶｅ
ｓｉｃｕｌａｒＳｔｏｍａｔｉｔｉｓＶｉｒｕｓ，感
受性細胞としてＭＤＣＫ（ＡＴＣＣＣＣＬ−３４）を用
い、文献１０のＣＰＥ法に従ってこの培養液の抗ウイル
ス活性を測定した。その結果、２ｘ１０⁵ 希釈単位／ｍ
ｌ以上の抗ウイルス活性が確認された。また、上記
（４）で得られた培養上清の抗ウイルス活性を同様にし
て測定した結果、１０⁷希釈単位／ｍｌ以上の抗ウイル
ス活性が検出された。一方、１０μｇのｐＣＤＬ−ＳＲ
α２９６を上記（２）と同様にＣＯＳ−１細胞に導入し
たコントロールの細胞培養液およびＳｆ２１細胞を３日
間培養した培養液では抗ウイルス活性は全く認められな
かった。

【００４３】また、クラスＩＩＭＨＣを発現したイヌ乳
腺腫瘍組織由来細胞株ＦＣＢＲ１を用いて、上記の各培
養液中のクラスＩＩＭＨＣの発現増強活性を測定した。
６ｃｍディッシュに、１０⁵個のＦＣＢＲ１を接着さ
せ、これに上記の各培養液５ｍｌを添加し、５％Ｃ
Ｏ₂、３７℃の各条件で１晩培養した。培養後、トリプ
シンにて細胞を剥離し、１．５ｍｌのミクロ遠心チュー
ブにて遠心した。これに、１０μｌのラット抗イヌクラ
スＩＩＭＨＣモノクローナル抗体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ社製）を添加し、さらに５０μｌの１０％ＦＢＳ−Ｅ
ＲＤＦで懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄
した後、５μｌのＦＩＴＣ標識ラビット抗ラットモノク
ローナル抗体（セロテック社製）および５０μｌの１０
％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで懸濁し、氷上で１時間静置した。
ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン（株）のＦＡ
ＣＳｃａｎにて解析した。その結果、ＣＯＳ１およびＳ
ｆ２１で産生させたＣａＩＬ１２は、ＦＣＢＲ１上のク
ラスＩＩＭＨＣの発現量をそれぞれ約２０％、６０％上
昇させた。これらのことから、ＣａＩＬ１２はイヌリン
パ球に作用して、イヌＩＦＮγを誘導する活性を有する
ことが判明した。

【００４４】また、芽球化したイヌリンパ球の増殖促進
活性を測定した。イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、１
０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦに１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞
密度で懸濁し、このうち５ｍｌを６ｃｍディッシュに添
加した。これにＰＨＡを５μｇ／ｍｌの濃度で添加し、
５％ＣＯ₂ 、３７℃の条件で３日間培養してリンパ球を
芽球化させた。この芽球化リンパ球を１０％ＦＢＳ−Ｅ
ＲＤＦに１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で懸濁し、
９６穴マイクロプレート１穴あたり、５０μｌを添加し
た。これに上記（２）で得られた培養上清を１穴あたり
５０μｌ加えた。また、コントロールとして１０％ＦＢ
Ｓ−ＥＲＤＦのみを１穴あたり５０μｌ加えた。これら
をさらに５％ＣＯ₂ 、３７℃の条件で３日間培養後、文
献１１のＭＴＴアッセイ法により、ＣａＩＬ１２の芽球
化リンパ球の増殖促進活性を測定した。すなわち、５ｍ
ｇ／ｍｌのＭＴＴ（シグマ社製）溶液を１穴あたり１０
μｌづつ添加し、さらに６時間培養した。１５０μｌの
０．０１Ｎ塩酸イソプロパノール溶液を加えた後、超音
波にて細胞を破砕し、マイクロプレートリーダー（ＢＩ
Ｏ−ＲＡＤ社製Ｍｏｄｅｌ１３５５０）にて波長５９５
ｎｍの吸光度を測定した。その結果、コントロールの吸
光度が平均０．６９であったのに対し、ＣＯＳ−１で産
生したＣａＩＬ１２は平均１．５２であり、約２倍以上
の芽球化リンパ球の増殖促進活性が認められた。

【００４５】さらに、ＣａＩＬ１２のイヌ腫瘍に対する
抗腫瘍作用を検討した。イヌ末梢血よりリンパ球を分離
し、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで５x１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍ
ｌの細胞密度に懸濁し、このうち５ｍｌを６ｃｍディッ
シュに添加した。これにベーリンガーマンハイム社
（株）のリコンビナントヒトＩＬ２を５００Ｕ添加し、
５％ＣＯ₂、３７℃の条件で３日間培養した。一方、イ
ヌ腫瘍細胞ＦＣＢＲ１およびＡ７２（ＡＴＣＣＣＲＬ
−１５４２）を１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦでそれぞれ１０
５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に懸濁し、９６穴プレー
ト１穴あたり５０μｌづつ添加し、プレートに接着させ
た。これにヒトＩＬ２で刺激したイヌリンパ球５０μｌ
を加え、さらにＣａＩＬ１２を発現している上記（２）
で得られた培養上清１００μｌもしくはコントロールと
して１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ１００μｌを添加し、５％
ＣＯ₂、３７℃の条件で２日間培養した。培養後、上清
を完全に取り除き、ＭＴＴアッセイを行った。％細胞障
害性を次の式にて算出した。

【００４６】％細胞障害性＝（１ーＯＤ２／ＯＤ１）ｘ１００ここで、ＯＤ１＝培地のみで培養したイヌ腫瘍細胞の波
長５９５ｎｍの吸光度ＯＤ２＝イヌリンパ球と共に培養
したイヌ腫瘍細胞の波長５９５ｎｍの吸光度を表す。

【００４７】その結果、ＦＣＢＲ１ではコントロールが
３４％であったのに対し、ＣＯＳ−１で生産したＣａＩ
Ｌ１２は約７５％の細胞障害性を示した。また、Ａ７２
ではコントロールが２２％であったのに対し、ＣａＩＬ
１２は約８３％の細胞障害性を示した。ＣａＩＬ１２は
イヌリンパ球を活性化して、イヌ腫瘍細胞に対して抗腫
瘍作用を発揮することが判明した。

【００４８】［実施例３］ＣａＩＬ１２の精製：実施例２（４）で得られた細胞培
養上清２５０ｍｌを、スルホプロピル担体を充填したカ
ラムにアプライした後、十分量の２０ｍＭリン酸緩衝液
でカラムを洗浄し、０．５〜１ＭのＮａＣｌで溶出して
得られた吸着画分をさらにブルーセファロース担体を充
填したカラムにアプライし、同様にして洗浄後、１．１
〜２ＭのＮａＣｌで溶出した画分を得た。得られた画分
を透析によって脱塩して、精製したＣａＩＬ１２画分５
ｍｌを得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によると、この画分
中のＣａＩＬ１２の純度は９５％以上であった。

【００４９】［実施例４］ＣａＩＬ１２製剤の製造：実施例３で得られた精製Ｃａ
ＩＬ１２溶液に、注射用生理食塩水、注射用低分子ゼラ
チン（新田ゼラチン（株））、ソルビトールを加えて、
ゼラチンの終濃度０．５％、ソルビトールの終濃度３０
％に調製した。さらに、ポジダイン（ポール（株））で
処理してパイロジェンを除去した後、２５０℃で２時間
乾熱滅菌したガラスバイアルに１ｍｌづつ分注した。そ
の後、無菌的に凍結乾燥することによって、１バイアル
中に１ｐｇから５μｇのＣａＩＬ１２を含むＣａＩＬ１
２製剤を得た。このＣａＩＬ１２製剤は、室温条件下で
安定であり、また、蒸留水または生理食塩水によって良
好に溶解した。

【００５０】［実施例５］細胞レベルでのＣａＩＬ１２製剤の薬効評価：（１）腫瘍ＣａＩＬ１２製剤の抗腫瘍効果を見るために、担ガンマ
ウスを作製し、ＣａＩＬ１２製剤で刺激されたイヌリン
パ球を移入して腫瘍の縮小効果を検討した。６週齢のメ
スヌードマウス（ＢＡＬＢ／Ｃｎｕ／ｎｕ）１０匹を
日本クレア（株）より購入した。それぞれの背部皮下に
イヌ乳腺腫瘍細胞株ＦＣＢＲ１を１０⁸ｃｅｌｌｓ移植
し、約１ヶ月後、平均３３ｍｍｘ２５ｍｍの腫瘤を有す
る担ガンマウスを作製した。一方、ＦＣＢＲ１を樹立す
る際に、Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅらの方法（文献１４）によ
り分離した腫瘍内浸潤リンパ球（以下ＴＩＬと略記す
る）１０⁸ｃｅｌｌｓを２０ｍｌの１０％ＦＢＳ−ＥＲ
ＤＦで懸濁し、実施例４で調製したＣａＩＬ１２製剤１
０ｎｇを添加して５％ＣＯ₂、３７℃の条件で２日間培
養し、ＣａＩＬ１２製剤で刺激されたＴＩＬを得た。ま
たコントロールとしてＣａＩＬ１２製剤を添加せずに同
様の条件で培養した１０⁸ｃｅｌｌｓのＴＩＬを準備し
た。これら２種類のＴＩＬを担ガンヌードマウスの尾静
脈より１匹あたり１０⁷ｃｅｌｌｓ、５匹づつ移入し
た。移入７日後、ノギスにて腫瘍重量を測定し、ＴＩＬ
移入前との腫瘍重量の変化を調べた。なお、腫瘍重量は
次の式にて算出した。

【００５１】腫瘍重量＝（長径ｘ短径²／２）その結果、ＣａＩＬ１２製剤で刺激されたＴＩＬを移入
した担ガンヌードマウスは５匹のうち３匹で完全に腫瘍
が退縮し、２匹でＴＩＬ移入前の腫瘍重量を１とした相
対腫瘍重量で０．２以下であった。一方、コントロール
のＴＩＬを移入した担ガンヌードマウスは５匹とも腫瘍
が増大し、相対腫瘍重量ですべて１．２５以上であっ
た。以上のことから担ガンマウスを用いた系において、
ＣａＩＬ１２製剤はＴＩＬを活性化して腫瘍縮小効果を
発揮することが判明した。

【００５２】（２）アレルギーＣａＩＬ１２製剤の抗アレルギー効果を見るために、ア
レルギーの患犬由来リンパ球をＣａＩＬ１２製剤で刺激
し、ＩｇＥなどアレルギーの原因となる因子の発現調節
の有無について検討した。アトピー性皮膚炎と診断され
た患犬５頭からそれぞれ１０ｍｌの血液を採取した。こ
れらより直ちにリンパ球を分離し、抗ヒトＣＤ３ポリク
ローナル抗体（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）で固相化した１０
ｃｍディッシュにて１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦでＣａＩＬ
１２製剤をそれぞれ１０ｎｇづつ加えて３日間培養し
た。なおコントロールとしてＣａＩＬ１２製剤を添加せ
ずに同様の条件で培養したイヌリンパ球を準備した。培
養後、各ディッシュ中の一部のリンパ球を回収し、実施
例１に記載の方法によりｃＤＮＡを合成し、イヌＩｇＥ
およびイヌＩｇＥレセプター遺伝子に特異的なプライマ
ーを用いてＰＣＲを行い、それら遺伝子の発現を調べ
た。その結果、ＣａＩＬ１２製剤を添加して培養したイ
ヌリンパ球のそれら遺伝子の発現はＣａＩＬ１２製剤を
添加しなかったものと比較していずれも抑制されてい
た。このことから、ＣａＩＬ１２製剤はイヌリンパ球に
作用してアレルギーの原因因子の１つであるＩｇＥおよ
びＩｇＥレセプターの発現を抑制することが判明した。
また、抗ヒトＣＤ４ポリクローナル抗体（Ｇｅｎｚｙｍ
ｅ社製）を用いたパンニング法（文献１５）により各デ
ィッシュ中の残りのリンパ球から主にヘルパーＴ細胞集
団からなるＣＤ４陽性細胞を得た。これを用いてｃＤＮ
Ａを合成し、ＣａＩＬ５およびＣａＩＦＮγ遺伝子に特
異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、それら遺伝子
の発現を調べた。その結果、ＣａＩＬ５遺伝子の発現に
関してはＣａＩＬ１２製剤の添加によりいずれも発現が
抑制されていた。一方、ＣａＩＦＮγ遺伝子の発現に関
してはＣａＩＬ１２製剤の添加によりいずれも発現が増
強されていた。ＩＬ５はアレルギー反応などの液性免疫
反応を引き起こす２型ヘルパーＴ細胞から産生され、一
方ＩＦＮγは細胞性免疫を引き起こし液性免疫を抑制す
る１型ヘルパーＴ細胞から産生される。このことから、
ＣａＩＬ１２製剤はイヌリンパ球中の２型ヘルパーＴ細
胞を抑制し、１型ヘルパーＴ細胞を活性化する作用を有
することが示唆された。以上のことから、ＣａＩＬ１２
製剤はイヌのアレルギー性疾患の治療に有望であること
が判明した。

【００５３】［実施例６］ＣａＩＬ１２製剤のイヌに対する毒性試験：ＣａＩＬ１
２製剤の毒性を試験した。試験動物としてビーグル犬３
頭を用いた。試験は以下の要領にて実施した。

【００５４】(1) 投与方法２日おきに計５回投与を行った。投与量は順次増やして
いった（初回：１ｎｇ／ｋｇ体重、５ｎｇ／ｋｇ体重、
２５ｎｇ／ｋｇ体重、２５０ｎｇ／ｋｇ体重、５回目：
１μｇ／ｋｇ体重）。また投与ルートは静脈投与により
行った。

【００５５】(2) 観察検査期間、観察検査項目、観察点観察期間は投与開始前１週から投与開始後３週までとし
た。観察検査項目は臨床症状（呼吸様式、元気、食欲、
活動性、可視粘膜、流延、嘔吐、排便行動、傾眠）、体温、心拍数、体重、血液学的検査（血球系（白血球
数、ヘマトクリット、血小板数、血液像）、電解質（Ｎ
ａ，Ｋ，Ｃｌ）、生化学的検査（ＢＵＮ，Ｃｒｅａ．，
ＧＯＴ，ＧＰＴ，ＣＰＫ，Ｇｌｕｃｏｓｅ，ＴＰ，Ａｌ
ｂ，Ｇｌｏｂ，Ａ／Ｇ）、尿所見、循環器および自律神
経系所見とした。観察点は体重に関しては投与日から７
日目毎に１回測定し、その他の項目に関しては、投与開
始１週前、投与日の投与直前、投与１０分後、３０分
後、１時間後、１．５時間後、２時間後、４時間後、６
時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、投与開
始２週後および投与開始３週後に測定した。

【００５６】以上の要領にて試験を行った結果、ＣａＩ
Ｌ１２製剤の投与によって問題となる変化は認められな
かったことから、ＣａＩＬ１２製剤は少なくとも１μｇ
／ｋｇ体重の投与量まではイヌに対して毒性がないこと
が明らかになった。

【００５７】［実施例７］ＣａＩＬ１２製剤によるイヌ疾病の治療および予防：表
皮に腫瘤を持つ患犬、計１２頭に対してＣａＩＬ１２製
剤を局所注射および静脈内注射投与した。どの患犬にも
さまざまな大きさの腫瘤が複数個存在していた。１２頭
中８頭に対しては、腫瘤１個につき、１０ｎｇ−１μｇ
のＣａＩＬ１２を３ー４日間隔で３ー１０回、腫瘍局所
に直接、注射投与した。その結果、ＣａＩＬ１２製剤を
投与した腫瘤の９割が完全に消失し、残りの腫瘤も全て
半分以下に縮小した。４頭は大きさが１００ｃｍ³以上
の腫瘤を持っており、全てすでに肺、肝臓、腎臓などの
内臓に転移していた。これら３頭については外科的手術
により表皮の腫瘤を切除した直後にＣａＩＬ１２製剤を
静脈内に１０ｎｇ／ｋｇ投与し、以後５００ｎｇ／ｋｇ
の投与量で連日７日間にわたって投与を続けた。その結
果、内臓に転移していた腫瘍は全て消失し、以後６ヵ月
間観察したが、再発は全くみられなかった。

【００５８】また、アトピー性皮膚炎と診断された患犬
７頭に対してＣａＩＬ１２製剤を静脈内注射投与した。
これら患犬は皮膚に紅斑、湿疹および脱毛などの臨床症
状が観察され、また血液中には多量のＩｇＥが検出さ
れ、その白血球画分にはＩＬ４，ＩＬ５，ＩＬ１０，Ｉ
Ｌ１３の各ｍＲＮＡが高発現していた。ＣａＩＬ１２製
剤を１回当り０．１ー１００ｎｇ／ｋｇの投与量で３日
間隔で３ー５回、静脈内に投与した結果、１回の投与で
臨床症状が速やかに改善され、３ー５回で完治にいたっ
た。

【００５９】さらに、花粉症と診断された患犬３頭に対
してＣａＩＬ１２製剤を静脈内注射投与した。投与量は
０．１−１０ｐｇ／ｋｇで１回の投与でクシャミ、鼻水
等の臨床症状が速やかに改善された。

【００６０】［実施例８］ＣａＩＬ１２製剤を用いた養子免疫療法によるイヌ疾病
の治療：表皮に腫瘤を持つ患犬５頭、患猫２頭およびア
トピー性皮膚炎と診断された患犬３頭それぞれから２５
ｍｌの血液を採取した。これらより直ちにリンパ球を分
離し、抗ヒトＣＤ３ポリクローナル抗体（Ｇｅｎｚｙｍ
ｅ社製）で固相化した１０ｃｍディッシュにて１０％Ｆ
ＢＳ−ＥＲＤＦでヒトＩＬ２（Ｚｅｎｚｙｍｅ社製）５
０ＵとＣａＩＬ１２製剤を１００ｎｇ加えて４日間培養
した。培養後、リンパ球を回収し、それぞれのイヌおよ
びネコに静脈内注射した。その結果、アトピー性皮膚炎
の患犬は３頭ともすべて完治し、また、腫瘍の患犬およ
び患猫もすべてに腫瘤の縮小傾向が認められ、同様の操
作を１週間おきに３〜５回繰り返したところ、すべての
腫瘍が完全に退縮した。

【００６１】

【発明の効果】本発明によれば、イヌおよびネコの腫
瘍、皮膚病、感染症、アレルギー疾病の優れた治療薬・
予防薬および優れた治療方法・予防方法を提供できる。

【００６２】参考文献：１．Ｗｏｌｆら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６，３０７
４−３０８１（１９９１）．２．Ｓｈｏｅｎｈａｕｔら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４
８，３４３３−３４４０（１９９２）．３．Ｎａｓｔａｌａら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３，
１６９７−１７０６（１９９４）．４．Ｇａｚｚｉｎｅｌｌｉら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０，６１１５−６１１９
（１９９３）．５．Ｇａｚｚｉｎｅｌｌｉら：Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１
８０，２１９９−２２０８（１９９４）．６．Ｃｈｉｒｇｗｉｎら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
１８，５２９４（１９７９）．７．Ｂｅｒｇｅｒら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１
８，５１４３（１９７９）．８．Ｇｕｂｌｅｒら：Ｇｅｎｅ２５，２３６−２６９
（１９８３）．９．Ｏｋａｙａｍａら：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２，１６１，（１９８２）＆３，２８０，
（１９８３）．１０．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬｏｂｏｒａｔｏｒ
ｙ．ＮｅｗＹｏｒｋ．１９８２．１１．Ｐｒｏｂｅｒら：Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８，３３
６−３４１（１９８７）．１２．Ｔａｋｅｂｅら：Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，４４６−４７２（１９
８８）．１３．Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｂａｍら：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５
４，５３６（１９７３）．１４．Ｗｈｅｔｅｓｉｄｅら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ９０，２２１−２２３（１９８６）．１５．Ｓｅｅｄら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ８４，３３６５−３３６９（１９８
６）．配列表配列番号：1 配列の長さ：990 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：イヌ配列の特徴特徴を表わす記号：peptide 存在位置：1..987 特徴を決定した方法：S 配列 ATG TGT CAC CAG CAG TTG GTC ATC TCT TGG TTT TCC CTC GTT TTG CTG 48 Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Leu Leu GCG TCT CCC CTC ATG GCC ATA TGG GAA CTG GAG AAA GAT GTT TAT GTT 96 Ala Ser Pro Leu Met Ala Ile Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val GTA GAG TTG GAC TGG CAC CCT GAT GCC CCC GGA GAA ATG GTG GTC CTC 144 Val Glu Leu Asp Trp His Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu ACC TGC CAT ACC CCT GAA GAA GAT GAC ATC ACT TGG ACC TCA GCG CAG 192 Thr Cys His Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Ala Gln AGC AGT GAA GTC CTA GGT TCT GGT AAA ACT CTG ACC ATC CAA GTC AAA 240 Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys GAA TTT GGA GAT GCT GGC CAG TAT ACC TGC CAT AAA GGA GGC AAG GTT 288 Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Lys Val CTG AGC CGC TCA CTC CTG TTG ATT CAC AAA AAA GAA GAT GGA ATT TGG 336 Leu Ser Arg Ser Leu Leu Leu Ile His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp TCC ACT GAT ATC TTA AAG GAA CAG AAA GAA TCC AAA AAT AAG ATC TTT 384 Ser Thr Asp Ile Leu Lys Glu Gln Lys Glu Ser Lys Asn Lys Ile Phe CTG AAA TGT GAG GCA AAG AAT TAT TCT GGA CGT TTC ACA TGC TGG TGG 432 Leu Lys Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp CTG ACG GCA ATC AGT ACT GAT TTG AAA TTC AGT GTC AAA AGT AGC AGA 480 Leu Thr Ala Ile Ser Thr Asp Leu Lys Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg GGC TTC TCT GAC CCC CAA GGG GTG ACA TGT GGA GCA GTG ACA CTT TCA 528 Gly Phe Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Val Thr Leu Ser GCA GAG AGG GTC AGA GTG GAC AAC AGG GAT TAT AAG AAG TAC ACA GTG 576 Ala Glu Arg Val Arg Val Asp Asn Arg Asp Tyr Lys Lys Tyr Thr Val GAG TGT CAG GAG GGC AGT GCC TGC CCC TCT GCC GAG GAG AGC CTA CCC 624 Glu Cys Gln Glu Gly Ser Ala Cys Pro Ser Ala Glu Glu Ser Leu Pro ATC GAG GTC GTG GTG GAT GCT ATT CAC AAG CTC AAG TAT GAA AAC TAC 672 Ile Glu Val Val Val Asp Ala Ile His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr ACC AGC AGC TTC TTC ATC AGA GAC ATC ATC AAA CCA GAC CCA CCC ACA 720 Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Thr AAC CTG CAG CTG AAG CCA TTG GAA AAT TCT CGG CAC GTG GAG GTC AGC 768 Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Glu Asn Ser Arg His Val Glu Val Ser TGG GAA TAC CCC GAC ACC TGG AGC ACC CCA CAT TCC TAC TTC TCC CTG 816 Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu ACA TTT TGC ATA CAG GCC CAG GGC AAG AAC AAT AGA GAA AAG AAA GAT 864 Thr Phe Cys Ile Gln Ala Gln Gly Lys Asn Asn Arg Glu Lys Lys Asp AGA CTC TGC GTG GAC AAG ACC TCA GCC AAG GTC GTG TGC CAC AAG GAT 912 Arg Leu Cys Val Asp Lys Thr Ser Ala Lys Val Val Cys His Lys Asp GCC AAG ATC CGC GTG CAA GCC CGA GAC CGC TAC TAT AGT TCA TCC TGG 960 Ala Lys Ile Arg Val Gln Ala Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp AGC GAC TGG GCA TCT GTG CCC TGC AGT TAG 990 Ser Asp Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser ***

【００６３】配列番号：2 配列の長さ：669 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：イヌ配列の特徴特徴を表わす記号：peptide 存在位置：1..666 特徴を決定した方法：S 配列 ATG TGT CCA GCG CGC AGC CTC CTC CTT GTC GCT ACC CTG GTC CTG CTA 48 Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu AGC CAC CTG GAC CAC CTT ACT TGG GCC AGG AGC CTC CCC ACA GCC TCA 96 Ser His Leu Asp His Leu Thr Trp Ala Arg Ser Leu Pro Thr Ala Ser CCA AGC CCA GGA ATA TTC CAG TGC CTC AAC CAC TCC CAA AAC CTG CTG 144 Pro Ser Pro Gly Ile Phe Gln Cys Leu Asn His Ser Gln Asn Leu Leu AGA GCC GTC AGC AAC ACG CTT CAG AAG GCC AGA CAA ACT CTA GAA TTA 192 Arg Ala Val Ser Asn Thr Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Leu TAT TCC TGC ACT TCC GAA GAG ATT GAT CAT GAA GAT ATC ACA AAG GAT 240 Tyr Ser Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp AAA ACC AGC ACA GTG GAG GCC TGC TTA CCA CTG GAA TTA ACC ATG AAT 288 Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Met Asn GAG AGT TGC CTG GCT TCC AGA GAG ATC TCT TTG ATA ACT AAC GGG AGT 336 Glu Ser Cys Leu Ala Ser Arg Glu Ile Ser Leu Ile Thr Asn Gly Ser TGC CTG GCC TCT GGA AAG GCC TCT TTT ATG ACG GTC CTG TGC CTT AGC 384 Cys Leu Ala Ser Gly Lys Ala Ser Phe Met Thr Val Leu Cys Leu Ser AGC ATC TAT GAG GAC TTG AAG ATG TAC CAG ATG GAA TTC AAG GCC ATG 432 Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Met Glu Phe Lys Ala Met AAC GCA AAG CTT TTA ATG GAT CCC AAG AGG CAG ATC TTT CTG GAT CAA 480 Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln AAC ATG CTG ACG GCT ATC GAT GAG CTG TTA CAG GCC CTG AAT TTC AAC 528 Asn Met Leu Thr Ala Ile Asp Glu Leu Leu Gln Ala Leu Asn Phe Asn AGT GTG ACT GTG CCA CAG AAA TCC TCC CTT GAA GAG CCG GAT TTT TAT 576 Ser Val Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr AAA ACT AAA ATC AAG CTC TGC ATA CTT CTT CAT GCT TTC AGA ATT CGT 624 Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg GCG GTG ACC ATC GAC AGA ATG ATG AGC TAT CTG AGT TCT TCC TAG 669 Ala Val Thr Ile Asp Arg Met Met Ser Tyr Leu Ser Ser Ser ***

【００６４】配列番号：3 配列の長さ：33 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATGTGTCACC AGCAGTTGGT CATCTCTTGG TTT 33

【００６５】配列番号：4 配列の長さ：24 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CTAACTGCAG GGCACAGATG CCCA 24

【００６６】配列番号：5 配列の長さ：42 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AGCATGTGTC CAGCGCGCAG CCTCCTCCTT GTCGCTACCC TG 42

【００６７】配列番号：6 配列の長さ：39 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CTAGGAAGAA CTCAGATAGC TCATCATTCT GTCGATGGT 39

【００６８】配列番号：7 配列の長さ：39 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGGGAATTCA TGTGTCACCA GCAGTTGGTC ATCTCTTGG 39

【００６９】配列番号：8 配列の長さ：39 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCCGAATTCC TAACTGCAGG GCACAGATGC CCAGTCGCT 39

【００７０】配列番号：9 配列の長さ：39 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGGCTGCAGA TGTGTCCAGC GCGCAGCCTC CTCCTTGTC 39

【００７１】配列番号：10 配列の長さ：39 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGGCTGCAGC TAGGAAGAAC TCAGATAGCT CATCATTCT 39

【００７２】配列番号：11 配列の長さ：990 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：イヌ配列の特徴特徴を表わす記号：peptide 存在位置：1..987 特徴を決定した方法：S 配列 ATG CAT CCT CAG CAG TTG GTC ATC TCC TGG TTT TCC CTC GTT TTG CTG 48 Met His Pro Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Leu Leu GCG TCT CCC CTC ATG GCC ATA TGG GAA CTG GAG AAA GAT GTT TAT GTT 96 Ala Ser Pro Leu Met Ala Ile Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val GTA GAG TTG GAC TGG CAC CCT GAT GCC CCC GGA GAA ATG GTG GTC CTC 144 Val Glu Leu Asp Trp His Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu ACC TGC CAT ACC CCT GAA GAA GAT GAC ATC ACT TGG ACC TCA GCG CAG 192 Thr Cys His Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Ala Gln AGC AGT GAA GTC CTA GGT TCT GGT AAA ACT CTG ACC ATC CAA GTC AAA 240 Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys GAA TTT GGA GAT GCT GGC CAG TAT ACC TGC CAT AAA GGA GGC AAG GTT 288 Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Lys Val CTG AGC CGC TCA CTC CTG TTG ATT CAC AAA AAA GAA GAT GGA ATT TGG 336 Leu Ser Arg Ser Leu Leu Leu Ile His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp TCC ACT GAT ATC TTA AAG GAA CAG AAA GAA TCC AAA AAT AAG ATC TTT 384 Ser Thr Asp Ile Leu Lys Glu Gln Lys Glu Ser Lys Asn Lys Ile Phe CTG AAA TGT GAG GCA AAG AAT TAT TCT GGA CGT TTC ACA TGC TGG TGG 432 Leu Lys Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp CTG ACG GCA ATC AGT ACT GAT TTG AAA TTC AGT GTC AAA AGT AGC AGA 480 Leu Thr Ala Ile Ser Thr Asp Leu Lys Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg GGC TTC TCT GAC CCC CAA GGG GTG ACA TGT GGA GCA GTG ACA CTT TCA 528 Gly Phe Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Val Thr Leu Ser GCA GAG AGG GTC AGA GTG GAC AAC AGG GAT TAT AAG AAG TAC ACA GTG 576 Ala Glu Arg Val Arg Val Asp Asn Arg Asp Tyr Lys Lys Tyr Thr Val GAG TGT CAG GAG GGC AGT GCC TGC CCC TCT GCC GAG GAG AGC CTA CCC 624 Glu Cys Gln Glu Gly Ser Ala Cys Pro Ser Ala Glu Glu Ser Leu Pro ATC GAG GTC GTG GTG GAT GCT ATT CAC AAG CTC AAG TAT GAA AAC TAC 672 Ile Glu Val Val Val Asp Ala Ile His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr ACC AGC AGC TTC TTC ATC AGA GAC ATC ATC AAA CCA GAC CCA CCC ACA 720 Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Thr AAC CTG CAG CTG AAG CCA TTG AAA AAT TCT CGG CAC GTG GAG GTC AGC 768 Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg His Val Glu Val Ser TGG GAA TAC CCC GAC ACC TGG AGC ACC CCA CAT TCC TAC TTC TCC CTG 816 Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu ACA TTT TGC ATA CAG GCC CAG GGC AAG AAC AAT AGA GAA AAG AAA GAT 864 Thr Phe Cys Ile Gln Ala Gln Gly Lys Asn Asn Arg Glu Lys Lys Asp AGA CTC TGC GTG GAC AAG ACC TCA GCC AAG GTC GTG TGC CAC AAG GAT 912 Arg Leu Cys Val Asp Lys Thr Ser Ala Lys Val Val Cys His Lys Asp GCC AAG ATC CGC GTG CAA GCC CGA GAC CGC TAC TAT AGT TCA TCC TGG 960 Ala Lys Ile Arg Val Gln Ala Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp AGC GAC TGG GCA TCT GTG TCC TGC AGT TAG 990 Ser Asp Trp Ala Ser Val Ser Cys Ser ***

【００７３】配列番号：12 配列の長さ：669 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：イヌ配列の特徴特徴を表わす記号：peptide 存在位置：1..666 特徴を決定した方法：S 配列 ATG TGC CCG CCG CGC GGC CTC CTC CTT GTG ACC ATC CTG GTC CTG CTA 48 Met Cys Pro Pro Arg Gly Leu Leu Leu Val Thr Ile Leu Val Leu Leu AGC CAC CTG GAC CAC CTT ACT TGG GCC AGG AGC CTC CCC ACA GCC TCA 96 Ser His Leu Asp His Leu Thr Trp Ala Arg Ser Leu Pro Thr Ala Ser CCG AGC CCA GGA ATA TTC CAG TGC CTC AAC CAC TCC CAA AAC CTG CTG 144 Pro Ser Pro Gly Ile Phe Gln Cys Leu Asn His Ser Gln Asn Leu Leu AGA GCC GTC AGC AAC ACG CTT CAG AAG GCC AGA CAA ACT CTA GAA TTA 192 Arg Ala Val Ser Asn Thr Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Leu TAT TCC TGC ACT TCC GAA GAG ATT GAT CAT GAA GAT ATC ACA AAG GAT 240 Tyr Ser Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp AAA ACC AGC ACA GTG GAG GCC TGC TTA CCA CTG GAA TTA ACC ATG AAT 288 Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Met Asn GAG AGT TGC CTG GCT TCC AGA GAG ATC TCT TTG ATA ACT AAC GGG AGT 336 Glu Ser Cys Leu Ala Ser Arg Glu Ile Ser Leu Ile Thr Asn Gly Ser TGC CTG GCC TCT GGA AAG GCC TCT TTT ATG ACG GTC CTG TGC CTT AGC 384 Cys Leu Ala Ser Gly Lys Ala Ser Phe Met Thr Val Leu Cys Leu Ser AGC ATC TAT GAG GAC TTG AAG ATG TAC CAG ATG GAA TTC AAG GCC ATG 432 Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Met Glu Phe Lys Ala Met AAC GCA AAG CTT TTA ATG GAT CCC AAG AGG CAG ATC TTT CTG GAT CAA 480 Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln AAC ATG CTG ACA GCT ATC GAT GAG CTG TTA CAG GCC CTG AAT TTC AAC 528 Asn Met Leu Thr Ala Ile Asp Glu Leu Leu Gln Ala Leu Asn Phe Asn AGT GTG ACT GTG CCA CAG AAA TCC TCC CTT GAA GAG CCG GAT TTT TAT 576 Ser Val Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr AAA ACT AAA ATC AAG CTC TGC ATA CTT CTT CAT GCT TTC AGA ATT CGT 624 Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg GCG GTG ACC ATC GAT AGA ATG ATG AGT TAT CTG AAT TCT TCC TAA 669 Ala Val Thr Ile Asp Arg Met Met Ser Tyr Leu Asn Ser Ser ***

【００７４】配列番号：13 配列の長さ：39 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGGGAATTCA TGCATCCTCA GCAGTTGGTC ATCTCCTGG 39

【００７５】配列番号：14 配列の長さ：39 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCCGAATTCC TAACTGCAGG ACACAGATGC CCAGTCGCT 39

【００７６】配列番号：15 配列の長さ：39 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGGCTGCAGA TGTGCCCGCC GCGCGGCCTC CTCCTTGTG 39

【００７７】配列番号：16 配列の長さ：39 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGGCTGCAGT TAGGAAGAAT TCAGATAACT CATCATTCT 39

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｋ 15/09 ＺＮＡＡ６１Ｋ 37/02 ＡＦＫＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：１または配列番号：１１と同じ
あるいはその一部を有するアミノ酸配列と配列番号：２
または配列番号：１２と同じあるいはその一部を有する
アミノ酸配列がヘテロダイマーを形成してできるイヌイ
ンターロイキン１２を含んでなるイヌおよびネコの免疫
疾病治療薬。
【請求項２】イヌおよびネコの免疫疾病が腫瘍、皮膚
炎、感染症またはアレルギー疾病である請求項１に記載
のイヌおよびネコの免疫疾病治療薬。
【請求項３】腫瘍が乳腺腫瘍、好酸球性肉芽腫、類表皮
腫、皮膚腫瘍、脂肪腫、耳血腫、肺水腫、皮膚有茎軟腫
または肛門腫瘍である請求項２に記載のイヌおよびネコ
の免疫疾病治療薬。
【請求項４】皮膚炎が外耳道炎、皮膚炎、湿疹、皮膚真
菌症、膿皮症、アレルギー性皮膚炎、じん麻疹、外傷性
皮膚炎、または脱毛症である請求項２に記載のイヌおよ
びネコの免疫疾病治療薬。
【請求項５】感染症がイヌパルボウイルス感染症、ジス
テンバー感染症、ネコエイズおよびネコ白血病である請
求項２に記載のイヌおよびネコの免疫疾病治療薬。
【請求項６】アレルギー性疾病が花粉症である請求項２
に記載のイヌおよびネコの免疫疾病治療薬。
【請求項７】配列番号：１または配列番号：１１と同じ
あるいはその一部を有するアミノ酸配列と配列番号：２
または配列番号：１２と同じあるいはその一部を有する
アミノ酸配列がヘテロダイマーを形成してできるイヌイ
ンターロイキン１２が遺伝子組換え手法を用いて製造さ
れたイヌインターロイキン１２であることを特徴とする
請求項１〜６のいずれか１項記載のイヌおよびネコの免
疫疾病治療薬。
【請求項８】配列番号：１または配列番号：１１と同じ
あるいはその一部を有するアミノ酸配列と配列番号：２
または配列番号：１２と同じあるいはその一部を有する
アミノ酸配列がヘテロダイマーを形成してできるイヌイ
ンターロイキン１２が配列番号：１または配列番号：１
１と同じあるいはその一部を有するＤＮＡ配列と配列番
号：２または配列番号：１２と同じあるいはその一部を
有するＤＮＡ配列を同時に導入された動物細胞または配
列番号：１または配列番号：１１と同じあるいはその一
部を有するＤＮＡ配列と配列番号：２または配列番号：
１２と同じあるいはその一部を有するＤＮＡ配列を同時
に含む組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞ま
たは幼虫を用いて製造されたイヌインターロイキン１２
であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項記
載のイヌおよびネコの免疫疾病治療薬。
【請求項９】請求項１から８のいずれか１項に記載され
たイヌおよびネコの免疫疾病治療薬をイヌおよびネコに
注射投与することを特徴とするイヌおよびネコの免疫疾
病治療方法。
【請求項１０】注射が静脈注射、皮下注射、または局所
注射であることを特徴とする請求項９記載のイヌおよび
ネコの免疫疾病治療方法。
【請求項１１】一回当りの投与量が０．１ｐｇ／ｋｇ
（体重）から１００μｇ／ｋｇ（体重）であることを特
徴とする請求項９または１０記載のイヌおよびネコの免
疫疾病治療方法。
【請求項１２】請求項１から８のいずれか１項に記載さ
れたイヌおよびネコの免疫疾病治療薬をイヌおよびネコ
末梢血から分離したリンパ球に作用させた後、再びイヌ
およびネコ体内に戻すことを特徴とするイヌおよびネコ
の免疫疾病治療方法。
【請求項１３】配列番号：１または配列番号：１１と同
じあるいはその一部を有するアミノ酸配列と配列番号：
２または配列番号：１２と同じあるいはその一部を有す
るアミノ酸配列がヘテロダイマーを形成してできるイヌ
インターロイキン１２を含んでなるイヌおよびネコの免
疫疾病予防薬。
【請求項１４】イヌおよびネコの免疫疾病が腫瘍、皮膚
炎、感染症またはアレルギー疾病である請求項１３に記
載のイヌおよびネコの免疫疾病予防薬。
【請求項１５】腫瘍が乳腺腫瘍、好酸球性肉芽腫、類表
皮腫、皮膚腫瘍、脂肪腫、耳血腫、肺水腫、皮膚有茎軟
腫または肛門腫瘍である請求項１４に記載のイヌおよび
ネコの免疫疾病予防薬。
【請求項１６】皮膚炎が外耳道炎、皮膚炎、湿疹、皮膚
真菌症、膿皮症、アレルギー性皮膚炎、じん麻疹、外傷
性皮膚炎、または脱毛症である請求項１４に記載のイヌ
およびネコの免疫疾病予防薬。
【請求項１７】感染症がイヌパルボウイルス感染症、ジ
ステンバー感染症、ネコエイズおよびネコ白血病である
請求項１４に記載の免疫疾病予防薬。
【請求項１８】アレルギー性疾病が花粉症である請求項
１４に記載のイヌおよびネコの免疫疾病予防薬。
【請求項１９】配列番号：１または配列番号：１１と同
じあるいはその一部を有するアミノ酸配列と配列番号：
２または配列番号：１２と同じあるいはその一部を有す
るアミノ酸配列がヘテロダイマーを形成してできるイヌ
インターロイキン１２が遺伝子組換え手法を用いて製造
されたイヌインターロイキン１２であることを特徴とす
る請求項１３〜１８のいずれか１項記載のイヌおよびネ
コの免疫疾病予防薬。
【請求項２０】配列番号：１または配列番号：１１と同
じあるいはその一部を有するアミノ酸配列と配列番号：
２または配列番号：１２と同じあるいはその一部を有す
るアミノ酸配列がヘテロダイマーを形成してできるイヌ
インターロイキン１２が配列番号：１または配列番号：
１１と同じあるいはその一部を有するＤＮＡ配列と配列
番号：２または配列番号：１２と同じあるいはその一部
を有するＤＮＡ配列を同時に導入された動物細胞または
配列番号：１または配列番号：１１と同じあるいはその
一部を有するＤＮＡ配列と配列番号：２または配列番
号：１２と同じあるいはその一部を有するＤＮＡ配列を
同時に含む組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細
胞または幼虫を用いて製造されたイヌインターロイキン
１２であることを特徴とする請求項１３〜１８のいずれ
か１項記載のイヌおよびネコの免疫疾病予防薬。
【請求項２１】請求項１３から２０のいずれか１項に記
載されたイヌおよびネコの免疫疾病予防薬をイヌおよび
ネコに注射投与することを特徴とするイヌおよびネコの
免疫疾病予防方法。
【請求項２２】注射が静脈注射、皮下注射、または局所
注射であることを特徴とする請求項２１記載のイヌおよ
びネコの免疫疾病予防方法。
【請求項２３】一回当りの投与量が０．１ｐｇ／ｋｇ
（体重）から１００μｇ／ｋｇ（体重）であることを特
徴とする請求項２１または２２記載のイヌおよびネコの
免疫疾病予防方法。
【請求項２４】請求項１３から２０のいずれか１項に記
載されたイヌおよびネコの免疫疾病予防薬をイヌおよび
ネコ末梢血から分離したリンパ球に作用させた後、再び
イヌ体内に戻すことを特徴とするイヌおよびネコの免疫
疾病予防方法。
【請求項２５】配列番号：１または配列番号：１１に示
すＤＮＡ配列あるいはその一部を有するＤＮＡ配列と配
列番号：２または配列番号：１２に示すＤＮＡ配列ある
いはその一部を有するＤＮＡ配列を同時に含む組換えバ
キュロウイルス。
【請求項２６】請求項２５に記載のバキュロウイルスを
昆虫細胞または幼虫に感染させ、イヌインターロイキン
１２を採取することを特徴とするイヌインターロイキン
１２の製造方法。