JPH09234085A - イヌインターフェロンγの製造法 - Google Patents
イヌインターフェロンγの製造法Info
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- JPH09234085A JPH09234085A JP8349826A JP34982696A JPH09234085A JP H09234085 A JPH09234085 A JP H09234085A JP 8349826 A JP8349826 A JP 8349826A JP 34982696 A JP34982696 A JP 34982696A JP H09234085 A JPH09234085 A JP H09234085A
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 イヌインターフェロンγの遺伝子工学による
製造方法を提供する。 【解決手段】 イヌインターフェロンγの蛋白質をコー
ドするＤＮＡを組込んだ組換えカイコ核多角体病ウイル
スによりイヌインターフェロンγを大量に生産する。
製造方法を提供する。 【解決手段】 イヌインターフェロンγの蛋白質をコー
ドするＤＮＡを組込んだ組換えカイコ核多角体病ウイル
スによりイヌインターフェロンγを大量に生産する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、蛋白質の一次構造
がイヌの遺伝情報由来であるイヌインタ−フェロンγを
遺伝子操作技術によって量産し、以って医薬品（抗腫瘍
・抗ウイルス・抗アレルギー）とする事を目的とした、
形質転換体、組換えカイコ核多角体病ウイルスおよびそ
れらを利用して生産したイヌインターフェロンγに関す
る。
がイヌの遺伝情報由来であるイヌインタ−フェロンγを
遺伝子操作技術によって量産し、以って医薬品（抗腫瘍
・抗ウイルス・抗アレルギー）とする事を目的とした、
形質転換体、組換えカイコ核多角体病ウイルスおよびそ
れらを利用して生産したイヌインターフェロンγに関す
る。
【０００２】
【従来の技術】インターフェロンは、抗ウイルス作用を
示すところの蛋白質を主成分とする生理活性物質でＩＦ
Ｎと略記される。
示すところの蛋白質を主成分とする生理活性物質でＩＦ
Ｎと略記される。
【０００３】遺伝子操作技術の進歩によりヒトのＩＦＮ
のみならず、ウシ、ウマ、ネコなどの動物のＩＦＮも大
量生産が可能となり、その結果、ウイルス病や腫瘍など
の治療薬としてのＩＦＮの用途開発研究が行われている
ものもある。イヌについても、α，β，γ各タイプのＩ
ＦＮが報告されている（文献１、２）。
のみならず、ウシ、ウマ、ネコなどの動物のＩＦＮも大
量生産が可能となり、その結果、ウイルス病や腫瘍など
の治療薬としてのＩＦＮの用途開発研究が行われている
ものもある。イヌについても、α，β，γ各タイプのＩ
ＦＮが報告されている（文献１、２）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】イヌには、乳腺腫瘍な
ど多数の腫瘍、パルボウイルス感染症、ジステンバ−感
染症など多数のウイルス病および多数のアレルギー性の
皮膚炎などが知られている。
ど多数の腫瘍、パルボウイルス感染症、ジステンバ−感
染症など多数のウイルス病および多数のアレルギー性の
皮膚炎などが知られている。
【０００５】そこで、イヌのＩＦＮが大量生産され、容
易に入手可能となれば、イヌの抗腫瘍剤、抗ウイルス剤
および抗アレルギー剤としての用途が開かれると期待さ
れる。
易に入手可能となれば、イヌの抗腫瘍剤、抗ウイルス剤
および抗アレルギー剤としての用途が開かれると期待さ
れる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、かかる状況
に鑑みＣａＩＦＮγの大量生産を目的とし、創意工夫を
成し、ＣａＩＦＮγの蛋白をコードするｃＤＮＡをクロ
ーン化し、これを発現ベクターに連結して、ＣａＩＦＮ
γを生産するプラスミドを単離し、このプラスミドを動
物細胞に導入してＣａＩＦＮγを生産することに成功
し、またこのプラスミドよりＣａＩＦＮγの成熟蛋白の
みをコードする遺伝子を分離し、これを大腸菌用発現ベ
クターに連結し、大腸菌に導入してＣａＩＦＮγを生産
することにも成功し、さらにはカイコ多角体病ウイルス
のＤＮＡをＣａＩＦＮγの蛋白をコードするＤＮＡで組
換えた組換え体ウイルスを単離し、この組換えウイルス
をカイコ樹立細胞中またはカイコ生体中で増殖させてＣ
ａＩＦＮγを生産することに成功し、もって簡単に大量
にＣａＩＦＮγを製造する方法を確立し、かくして本発
明を完成させるに至った。
に鑑みＣａＩＦＮγの大量生産を目的とし、創意工夫を
成し、ＣａＩＦＮγの蛋白をコードするｃＤＮＡをクロ
ーン化し、これを発現ベクターに連結して、ＣａＩＦＮ
γを生産するプラスミドを単離し、このプラスミドを動
物細胞に導入してＣａＩＦＮγを生産することに成功
し、またこのプラスミドよりＣａＩＦＮγの成熟蛋白の
みをコードする遺伝子を分離し、これを大腸菌用発現ベ
クターに連結し、大腸菌に導入してＣａＩＦＮγを生産
することにも成功し、さらにはカイコ多角体病ウイルス
のＤＮＡをＣａＩＦＮγの蛋白をコードするＤＮＡで組
換えた組換え体ウイルスを単離し、この組換えウイルス
をカイコ樹立細胞中またはカイコ生体中で増殖させてＣ
ａＩＦＮγを生産することに成功し、もって簡単に大量
にＣａＩＦＮγを製造する方法を確立し、かくして本発
明を完成させるに至った。
【０００７】すなわち本発明は、ＣａＩＦＮγの蛋白を
コードするＤＮＡを外来遺伝子として遺伝子組換えされ
た組換えプラスミドと、そのプラスミドを有する大腸菌
の形質転換体およびＣａＩＦＮγの蛋白をコードするＤ
ＮＡを外来遺伝子として遺伝子組換えされた組換えカイ
コ核多角体病ウイルス、および該ウイルスをカイコ樹立
細胞中もしくはカイコ生体中で増殖させるＣａＩＦＮγ
の製造法、さらに得られたＣａＩＦＮγを提供するもの
である。
コードするＤＮＡを外来遺伝子として遺伝子組換えされ
た組換えプラスミドと、そのプラスミドを有する大腸菌
の形質転換体およびＣａＩＦＮγの蛋白をコードするＤ
ＮＡを外来遺伝子として遺伝子組換えされた組換えカイ
コ核多角体病ウイルス、および該ウイルスをカイコ樹立
細胞中もしくはカイコ生体中で増殖させるＣａＩＦＮγ
の製造法、さらに得られたＣａＩＦＮγを提供するもの
である。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下、本発明に関し詳細に説明す
る。
る。
【０００９】ＣａＩＦＮγの蛋白をコードするＤＮＡは
例えば次のようにして製造することができる。すなわ
ち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した後、ｃ
ＤＮＡに転換し、ＣａＩＦＮγをコ−ドする遺伝子配列
を元にしたプライマ−を用いてポリメラーゼ連鎖反応
（以下ＰＣＲと略す）を行うことによってＣａＩＦＮγ
をコ−ドする遺伝子を得ることができる。
例えば次のようにして製造することができる。すなわ
ち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した後、ｃ
ＤＮＡに転換し、ＣａＩＦＮγをコ−ドする遺伝子配列
を元にしたプライマ−を用いてポリメラーゼ連鎖反応
（以下ＰＣＲと略す）を行うことによってＣａＩＦＮγ
をコ−ドする遺伝子を得ることができる。
【００１０】イヌの細胞、例えばマイトージェンなどで
刺激されたイヌリンパ球などよりＲＮＡを得る方法とし
ては、通常の方法、例えば、ポリソームの分離、ショ糖
密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられ
る。上記イヌ細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、
グアニジン・チオシアネート処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠
心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法
（文献３）バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼ
インヒビタ−存在下に界面活性剤で処理したのちフェノ
ール抽出を行う方法（文献４），グアニジン・チオシア
ネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシア
ネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネー
ト−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシ
アネートで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡ
を沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行う
ことができる。
刺激されたイヌリンパ球などよりＲＮＡを得る方法とし
ては、通常の方法、例えば、ポリソームの分離、ショ糖
密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられ
る。上記イヌ細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、
グアニジン・チオシアネート処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠
心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法
（文献３）バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼ
インヒビタ−存在下に界面活性剤で処理したのちフェノ
ール抽出を行う方法（文献４），グアニジン・チオシア
ネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシア
ネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネー
ト−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシ
アネートで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡ
を沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行う
ことができる。
【００１１】イヌリンパ球などより通常の方法、例え
ば、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシア
ネート法、オリゴｄＴセルロ−スカラム法等によりｍＲ
ＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例え
ば、Ｇｕｂｌｅｒらの方法（文献５），Ｈ．Ｏｋａｙａ
ｍａらの方法（文献６）等によりｃＤＮＡを合成する。
得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、基本的
にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素な
どを用いるほか１部プライマーを用いてＤＮＡポリメラ
ーゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合
成あるいはクローニング用キットを用いるのが便利であ
る。このｃＤＮＡを鋳型としてＣａＩＦＮγの塩基配列
を基にしたプライマーを用いてＰＣＲを行うことによっ
てＣａＩＦＮγの蛋白質をコードするＤＮＡを得ること
ができる。
ば、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシア
ネート法、オリゴｄＴセルロ−スカラム法等によりｍＲ
ＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例え
ば、Ｇｕｂｌｅｒらの方法（文献５），Ｈ．Ｏｋａｙａ
ｍａらの方法（文献６）等によりｃＤＮＡを合成する。
得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、基本的
にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素な
どを用いるほか１部プライマーを用いてＤＮＡポリメラ
ーゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合
成あるいはクローニング用キットを用いるのが便利であ
る。このｃＤＮＡを鋳型としてＣａＩＦＮγの塩基配列
を基にしたプライマーを用いてＰＣＲを行うことによっ
てＣａＩＦＮγの蛋白質をコードするＤＮＡを得ること
ができる。
【００１２】このＤＮＡを発現プラスミドベクターに組
込んだ合成プラスミドを、例えばサルのＣＯＳ細胞に導
入することによって、ＣａＩＦＮγを生産させることが
できる。このような合成プラスミドの１つがｐＳＲαγ
であり、これを含有する形質転換体大腸菌がＥ．ｃｏｌ
ｉ（ｐＳＲαγ）である。
込んだ合成プラスミドを、例えばサルのＣＯＳ細胞に導
入することによって、ＣａＩＦＮγを生産させることが
できる。このような合成プラスミドの１つがｐＳＲαγ
であり、これを含有する形質転換体大腸菌がＥ．ｃｏｌ
ｉ（ｐＳＲαγ）である。
【００１３】また、大腸菌の発現ベクターにＣａＩＦＮ
γの蛋白質をコ−ドするＤＮＡを連結し、大腸菌を形質
転換させてＣａＩＦＮγ生産性大腸菌を製造することが
できる。このような大腸菌の１つがＥ．ｃｏｌｉ（ｐＥ
Ｔγ）である。
γの蛋白質をコ−ドするＤＮＡを連結し、大腸菌を形質
転換させてＣａＩＦＮγ生産性大腸菌を製造することが
できる。このような大腸菌の１つがＥ．ｃｏｌｉ（ｐＥ
Ｔγ）である。
【００１４】また、ＣａＩＦＮγは、カイコに感染する
組換えカイコ核多角体病ウイルスを作製することによっ
て、カイコ発現系を用いても生産することができる。組
換えカイコ核多角体病ウイルスは、ＣａＩＦＮγの蛋白
質をコ−ドするＤＮＡをカイコのクローニングベクター
（文献７）に連結して作製した組み換え体プラスミドと
カイコ核多角体病ウイルスＤＮＡとを、カイコ樹立細胞
にコトランスフェクションして作製することができる。
従って、組み換え体ウイルスは、ｉｎ ｖｉｖｏ的な方
法で作製することができる。
組換えカイコ核多角体病ウイルスを作製することによっ
て、カイコ発現系を用いても生産することができる。組
換えカイコ核多角体病ウイルスは、ＣａＩＦＮγの蛋白
質をコ−ドするＤＮＡをカイコのクローニングベクター
（文献７）に連結して作製した組み換え体プラスミドと
カイコ核多角体病ウイルスＤＮＡとを、カイコ樹立細胞
にコトランスフェクションして作製することができる。
従って、組み換え体ウイルスは、ｉｎ ｖｉｖｏ的な方
法で作製することができる。
【００１５】すなわち、ＣａＩＦＮγの蛋白質をコード
するＤＮＡ部分を、例えばｐＢＭ０３０（文献７）など
のカイコのクローニングベクターの発現調節部分の下流
に連結するという一般的な遺伝子操作に従って組換え体
プラスミドを作製することができる。この組換え体プラ
スミドとカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡ（文献７）と
を、文献のような方法でカイコ樹立細胞、例えばＢＭ−
Ｎ株（文献７）にコトランスフェクションした後、培養
を続け、培養液中に出現した非組換え体（野性型）と組
換え体のウイルスの中から限界希釈法、もしくはプラー
ク法などの一般的な方法によって組換え体ウイルスをク
ローニングすることができる。組換え体ウイルスは多角
体の形成能がないことから、野性型ウイルスと容易に区
別できる。 ＣａＩＦＮγの生産は、前記の組換えカイ
コ核多角体ウイルスをカイコ樹立細胞中、またはカイコ
生体中で増殖させることにより行なう。
するＤＮＡ部分を、例えばｐＢＭ０３０（文献７）など
のカイコのクローニングベクターの発現調節部分の下流
に連結するという一般的な遺伝子操作に従って組換え体
プラスミドを作製することができる。この組換え体プラ
スミドとカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡ（文献７）と
を、文献のような方法でカイコ樹立細胞、例えばＢＭ−
Ｎ株（文献７）にコトランスフェクションした後、培養
を続け、培養液中に出現した非組換え体（野性型）と組
換え体のウイルスの中から限界希釈法、もしくはプラー
ク法などの一般的な方法によって組換え体ウイルスをク
ローニングすることができる。組換え体ウイルスは多角
体の形成能がないことから、野性型ウイルスと容易に区
別できる。 ＣａＩＦＮγの生産は、前記の組換えカイ
コ核多角体ウイルスをカイコ樹立細胞中、またはカイコ
生体中で増殖させることにより行なう。
【００１６】カイコ樹立細胞を用いる場合は、前記組換
え体ウイルスを含む培溶液により、ＢＭ−Ｎ細胞を感染
させ、平面培養または浮遊培養により培養する。ＢＭ−
Ｎ細胞を培養する培地としては、例えば牛胎児血清（ギ
ブコ社製、以下ＦＢＳと略記する。）を添加したＴＣ−
１０培地（文献８）やＴＣ−１００培地（日本農産工業
（株）製）を使用することができる。培養温度は２５〜
２８℃が適当である。培養後、培養液を遠心分離しその
上清からＣａＩＦＮγを回収する。
え体ウイルスを含む培溶液により、ＢＭ−Ｎ細胞を感染
させ、平面培養または浮遊培養により培養する。ＢＭ−
Ｎ細胞を培養する培地としては、例えば牛胎児血清（ギ
ブコ社製、以下ＦＢＳと略記する。）を添加したＴＣ−
１０培地（文献８）やＴＣ−１００培地（日本農産工業
（株）製）を使用することができる。培養温度は２５〜
２８℃が適当である。培養後、培養液を遠心分離しその
上清からＣａＩＦＮγを回収する。
【００１７】カイコ生体を用いる場合は、前記の組換え
体ウイルスを含む培養液をカイコ幼虫に注射して、人工
飼料を与えて飼育する。飼育後、体液を採取しその上清
からＣａＩＦＮγを回収する。
体ウイルスを含む培養液をカイコ幼虫に注射して、人工
飼料を与えて飼育する。飼育後、体液を採取しその上清
からＣａＩＦＮγを回収する。
【００１８】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。
に説明する。
【００１９】実施例１ イヌｃＤＮＡの調製 イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、フィトヘムアグルチ
ニン（ＰＨＡ）を５０μｇ／ｍｌの終濃度で４８時間刺
激した。刺激後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン（株）
製）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１
ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で
５分間処理した後、１Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加
えた。０．５Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリ
ゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同
緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ ＬｉＣｌを含む
ＴＥにて洗浄後、０．０１％ ＳＤＳを含む２ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶
出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一
本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍ
ｌのミクロ遠心チュ−ブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと
０．５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１８ｍｅ
ｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加
えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベ−トし
たのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ トリス
塩酸（ｐＨ８．４），５００ｍＭ ＫＣｌ溶液を２μ
ｌ，２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 を２μｌ，１０ｍＭ ｄＮＴ
Ｐを１μｌおよび０．１Ｍ ＤＴＴを２μｌそれぞれ加
え、４２℃で５分間インキュベートしたのち、２００ユ
ニットの逆転写酵素（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製、Ｓｕｐｅ
ｒＳｃｒｉｐｔII）を１μｌ加え、４２℃でさらに５０
分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さ
らに７０℃で１５分間インキュベートして反応を停止
し、氷上に５分間置いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃ
ｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、
３７℃で２０分間インキュベートした。
ニン（ＰＨＡ）を５０μｇ／ｍｌの終濃度で４８時間刺
激した。刺激後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン（株）
製）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１
ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で
５分間処理した後、１Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加
えた。０．５Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリ
ゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同
緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ ＬｉＣｌを含む
ＴＥにて洗浄後、０．０１％ ＳＤＳを含む２ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶
出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一
本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍ
ｌのミクロ遠心チュ−ブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと
０．５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１８ｍｅ
ｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加
えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベ−トし
たのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ トリス
塩酸（ｐＨ８．４），５００ｍＭ ＫＣｌ溶液を２μ
ｌ，２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 を２μｌ，１０ｍＭ ｄＮＴ
Ｐを１μｌおよび０．１Ｍ ＤＴＴを２μｌそれぞれ加
え、４２℃で５分間インキュベートしたのち、２００ユ
ニットの逆転写酵素（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製、Ｓｕｐｅ
ｒＳｃｒｉｐｔII）を１μｌ加え、４２℃でさらに５０
分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さ
らに７０℃で１５分間インキュベートして反応を停止
し、氷上に５分間置いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃ
ｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、
３７℃で２０分間インキュベートした。
【００２０】実施例２ ＣａＩＦＮγ遺伝子の調製 ＣａＩＦＮγのＮ末端およびＣ末端の塩基配列（文献
２）をもとに、５´ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＡ
ＴＡＣＡＡＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ３´（配列番
号１）と５´ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧ
ＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＡＡ３´（配列番号２）
の２種類の末端にＥｃｏＲＩ切断部位を付加したプライ
マーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。実施例１で
得られたｃＤＮＡを０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに
２μｌづつ取り、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2 、２５ｍＭ ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ ゼラチ
ン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位 ＥｘＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ（宝酒造（株）製）となるように各試薬を加
え、全量１００μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４
℃，１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２
分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分の各条件でＰ
ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマ
ルサイクラーを用い、３０サイクル反応させた。これを
１％アガロ−スゲルにて電気泳動し、約５６０ｂｐのＤ
ＮＡ断片を常法（文献８）に従って調製した。このＤＮ
Ａ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに
宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖ
ｅｒ．１を用いて１６℃、２時間反応を行い、連結し
た。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得ら
れた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法に従い調製
した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されてい
ることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認し、蛍光
ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシー
ケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従
って、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイク
ルシーケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片
がＣａＩＦＮγ ＤＮＡの塩基配列であることを確認し
た。
２）をもとに、５´ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＡ
ＴＡＣＡＡＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ３´（配列番
号１）と５´ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧ
ＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＡＡ３´（配列番号２）
の２種類の末端にＥｃｏＲＩ切断部位を付加したプライ
マーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。実施例１で
得られたｃＤＮＡを０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに
２μｌづつ取り、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ2 、２５ｍＭ ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ ゼラチ
ン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位 ＥｘＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ（宝酒造（株）製）となるように各試薬を加
え、全量１００μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４
℃，１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２
分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分の各条件でＰ
ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマ
ルサイクラーを用い、３０サイクル反応させた。これを
１％アガロ−スゲルにて電気泳動し、約５６０ｂｐのＤ
ＮＡ断片を常法（文献８）に従って調製した。このＤＮ
Ａ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに
宝酒造（株）のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖ
ｅｒ．１を用いて１６℃、２時間反応を行い、連結し
た。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得ら
れた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法に従い調製
した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されてい
ることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認し、蛍光
ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシー
ケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従
って、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイク
ルシーケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片
がＣａＩＦＮγ ＤＮＡの塩基配列であることを確認し
た。
【００２１】実施例３ ＣａＩＦＮγをコードするＤＮ
Ａを含む動物細胞発現用組換えプラスミドの作製 実施例２で得られたプラスミド１μｇを３０ユニットの
制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃、１６時間消化し、アガロ
ースゲルにて電気泳動し、約５６０ｂｐのＣａＩＦＮγ
のＤＮＡ断片を常法に従い調製した。
Ａを含む動物細胞発現用組換えプラスミドの作製 実施例２で得られたプラスミド１μｇを３０ユニットの
制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃、１６時間消化し、アガロ
ースゲルにて電気泳動し、約５６０ｂｐのＣａＩＦＮγ
のＤＮＡ断片を常法に従い調製した。
【００２２】一方、クローニングベクターｐＣＤＬ−Ｓ
Ｒα２９６（文献１０）１μｇを３０ユニットの制限酵
素ＥｃｏＲＩで３７℃、１６時間消化した後、１ユニッ
トのバクテリア由来アルカリホスファターゼ（宝酒造
（株）製）で末端を脱リン酸化した。これを１％アガロ
ースゲルにて電気泳動し、約３．７ｋｂのＤＮＡ断片を
常法に従い調製した。 ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋ
ｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて、１６℃、１６時間ライゲー
ション反応を行い、上記のように調製した、ｐＣＤＬ−
ＳＲα２９６と、ＣａＩＦＮγのＤＮＡ断片を連結し
た。これを用いて常法に従い大腸菌ＨＢ１０１を形質転
換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプ
レート上に生育するコロニーの中から、ＣａＩＦＮγを
コードするＤＮＡの開始コドンから２７ｂｐまでを含む
プライマー、すなわち、５’ＡＴＧＡＡＴＴＡＴＡＣＡ
ＡＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ３’（配列番号３）と
ｐＣＤＬ−ＳＲα２９６のクローニングサイトＥｃｏＲ
Ｉから下流の３０ｂｐのプライマー、すなわち、５’Ｔ
ＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴ
ＧＴＣＣ３’（配列番号４）の２種類のプライマーを用
いて、ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーの
アニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条
件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３
０サイクルでＰＣＲを行い、約６５０ｂｐのＤＮＡ断片
が得られた、ＣａＩＦＮγをコードするＤＮＡがｐＣＤ
Ｌ−ＳＲα２９６に正方向に組み込まれているプラスミ
ドを得た。この組換え体プラスミドをｐＳＲαγとし
た。このプラスミドを含有する大腸菌をＥ．ｃｏｌｉ
（ｐＳＲαγ）と名付けた。
Ｒα２９６（文献１０）１μｇを３０ユニットの制限酵
素ＥｃｏＲＩで３７℃、１６時間消化した後、１ユニッ
トのバクテリア由来アルカリホスファターゼ（宝酒造
（株）製）で末端を脱リン酸化した。これを１％アガロ
ースゲルにて電気泳動し、約３．７ｋｂのＤＮＡ断片を
常法に従い調製した。 ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋ
ｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて、１６℃、１６時間ライゲー
ション反応を行い、上記のように調製した、ｐＣＤＬ−
ＳＲα２９６と、ＣａＩＦＮγのＤＮＡ断片を連結し
た。これを用いて常法に従い大腸菌ＨＢ１０１を形質転
換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプ
レート上に生育するコロニーの中から、ＣａＩＦＮγを
コードするＤＮＡの開始コドンから２７ｂｐまでを含む
プライマー、すなわち、５’ＡＴＧＡＡＴＴＡＴＡＣＡ
ＡＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ３’（配列番号３）と
ｐＣＤＬ−ＳＲα２９６のクローニングサイトＥｃｏＲ
Ｉから下流の３０ｂｐのプライマー、すなわち、５’Ｔ
ＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴ
ＧＴＣＣ３’（配列番号４）の２種類のプライマーを用
いて、ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーの
アニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条
件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３
０サイクルでＰＣＲを行い、約６５０ｂｐのＤＮＡ断片
が得られた、ＣａＩＦＮγをコードするＤＮＡがｐＣＤ
Ｌ−ＳＲα２９６に正方向に組み込まれているプラスミ
ドを得た。この組換え体プラスミドをｐＳＲαγとし
た。このプラスミドを含有する大腸菌をＥ．ｃｏｌｉ
（ｐＳＲαγ）と名付けた。
【００２３】実施例４ ＣａＩＦＮγをコードするＤＮ
Ａを含む大腸菌発現用組換えプラスミドの作製 ＣａＩＦＮγの成熟蛋白をコードするＤＮＡを得るた
め、実施例２で得られたプラスミドを鋳型として、制限
酵素ＮｃｏＩ切断部位を付加したプライマー、すなわち
５’ＣＣＧＡＣＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧＧＣＣＡＴＧＴＴ
ＴＴＴＴＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＡＡＡＡＣ３’（配列番
号５）と、制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位を付加したプラ
イマー、すなわち５’ＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＴＣＧＡ
ＴＧＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＡＡＣＡＧ３’（配
列番号６）の２種類のプライマーを用いて、ＤＮＡの変
性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件
を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分
の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社の
ＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３０サイクルでＰＣ
Ｒを行い、約５００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。これを３
０ユニットの制限酵素ＮｃｏＩで消化しエタノ−ル沈殿
後、３０ユニットの制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、１％
アガロ−スゲルにて電気泳動し、常法に従いＤＮＡ断片
を調製した。
Ａを含む大腸菌発現用組換えプラスミドの作製 ＣａＩＦＮγの成熟蛋白をコードするＤＮＡを得るた
め、実施例２で得られたプラスミドを鋳型として、制限
酵素ＮｃｏＩ切断部位を付加したプライマー、すなわち
５’ＣＣＧＡＣＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧＧＣＣＡＴＧＴＴ
ＴＴＴＴＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＡＡＡＡＣ３’（配列番
号５）と、制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位を付加したプラ
イマー、すなわち５’ＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＴＣＧＡ
ＴＧＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＡＡＣＡＧ３’（配
列番号６）の２種類のプライマーを用いて、ＤＮＡの変
性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件
を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分
の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社の
ＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３０サイクルでＰＣ
Ｒを行い、約５００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。これを３
０ユニットの制限酵素ＮｃｏＩで消化しエタノ−ル沈殿
後、３０ユニットの制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、１％
アガロ−スゲルにて電気泳動し、常法に従いＤＮＡ断片
を調製した。
【００２４】一方、大腸菌発現ベクターであるｐＥＴ８
ｃ１μｇを３０ユニットの制限酵素ＮｃｏＩで消化しエ
タノ−ル沈殿後、３０ユニットの制限酵素ＢａｍＨＩで
消化し、１％アガロ−スゲルにて電気泳動しおよびＢａ
ｍＨＩで切断し、常法に従いＤＮＡ断片を調製した。
ｃ１μｇを３０ユニットの制限酵素ＮｃｏＩで消化しエ
タノ−ル沈殿後、３０ユニットの制限酵素ＢａｍＨＩで
消化し、１％アガロ−スゲルにて電気泳動しおよびＢａ
ｍＨＩで切断し、常法に従いＤＮＡ断片を調製した。
【００２５】ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅ
ｒ．１を用いて、１６℃、１６時間ライゲーション反応
を行い、上記のように調製した、ｐＥＴ８ｃとＣａＩＦ
ＮγのＤＮＡ断片を連結した。これを用いて常法に従い
大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。１００μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含むＬＢプレート上に生育するコロニー
のうち１５個を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む
３ｍｌのＬＢ培地中で８時間培養し、集めた菌体からプ
ラスミドを抽出、精製後、制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａ
ｍＨＩで切断し、約５００ｂｐのＤＮＡ断片が得られた
ＣａＩＦＮγのＤＮＡ断片を含んだプラスミドを得た。
この組換えプラスミドをｐＥＴγとし、これを用いて定
法に従い、大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。この大腸菌
をＥ．ｃｏｌｉ（ｐＥＴγ）と名付けた。
ｒ．１を用いて、１６℃、１６時間ライゲーション反応
を行い、上記のように調製した、ｐＥＴ８ｃとＣａＩＦ
ＮγのＤＮＡ断片を連結した。これを用いて常法に従い
大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。１００μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含むＬＢプレート上に生育するコロニー
のうち１５個を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む
３ｍｌのＬＢ培地中で８時間培養し、集めた菌体からプ
ラスミドを抽出、精製後、制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａ
ｍＨＩで切断し、約５００ｂｐのＤＮＡ断片が得られた
ＣａＩＦＮγのＤＮＡ断片を含んだプラスミドを得た。
この組換えプラスミドをｐＥＴγとし、これを用いて定
法に従い、大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。この大腸菌
をＥ．ｃｏｌｉ（ｐＥＴγ）と名付けた。
【００２６】実施例５ 活性測定法 ＣａＩＦＮγの活性は抗ウイルス作用およびイヌ細胞株
上のクラスＩＩＭＨＣの発現増強作用を指標にした。
上のクラスＩＩＭＨＣの発現増強作用を指標にした。
【００２７】抗ウイルス活性は、ウイルスとしてＶｅｓ
ｉｃｕｌａｒ ＳｔｏｍａｔｉｔｉｓＶｉｒｕｓ，感受
性細胞としてイヌＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）
を用い、文献１１のＣＰＥ法に従って測定した。
ｉｃｕｌａｒ ＳｔｏｍａｔｉｔｉｓＶｉｒｕｓ，感受
性細胞としてイヌＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）
を用い、文献１１のＣＰＥ法に従って測定した。
【００２８】また、クラスIIＭＨＣを発現したイヌ乳腺
腫瘍組織由来細胞株ＦＣＢＲ１を文献１２の方法に従っ
て樹立し、これを用いてクラスＩＩＭＨＣの発現増強活
性を測定した。２４ウエルプレートに１穴あたり１０4
個のＦＣＢＲ１を接着させ、これに発現させたＣａＩＦ
Ｎγを添加し、５％ＣＯ2 、３７℃の条件で１晩培養し
た。培養後、トリプシンにて細胞を剥離し、１．５ｍｌ
のミクロ遠心チューブにて遠心した。これに１０μｌの
ラット抗イヌＭＨＣクラスＩＩモノクローナル抗体（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を添加し、さらに５０μｌの
１０％ＦＢＳを添加したＥＲＤＦ培地（極東製薬株式会
社製）で懸濁後、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄
した後、５μｌのＦＩＴＣ標識ラビット抗ラットモノク
ローナル抗体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）および５０
μｌの１０％ＦＢＳを添加したＥＲＤＦ培地で懸濁し、
氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディ
ッキンソン株式会社のＦＡＣＳｃａｎにて解析した。
腫瘍組織由来細胞株ＦＣＢＲ１を文献１２の方法に従っ
て樹立し、これを用いてクラスＩＩＭＨＣの発現増強活
性を測定した。２４ウエルプレートに１穴あたり１０4
個のＦＣＢＲ１を接着させ、これに発現させたＣａＩＦ
Ｎγを添加し、５％ＣＯ2 、３７℃の条件で１晩培養し
た。培養後、トリプシンにて細胞を剥離し、１．５ｍｌ
のミクロ遠心チューブにて遠心した。これに１０μｌの
ラット抗イヌＭＨＣクラスＩＩモノクローナル抗体（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を添加し、さらに５０μｌの
１０％ＦＢＳを添加したＥＲＤＦ培地（極東製薬株式会
社製）で懸濁後、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄
した後、５μｌのＦＩＴＣ標識ラビット抗ラットモノク
ローナル抗体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）および５０
μｌの１０％ＦＢＳを添加したＥＲＤＦ培地で懸濁し、
氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディ
ッキンソン株式会社のＦＡＣＳｃａｎにて解析した。
【００２９】実施例６ ＣＯＳ−１細胞でのＣａＩＦＮ
γの生産 実施例３で得られた５μｇのｐＳＲαγを５０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、４００μｇ／ｍｌのＤＥ
ＡＥデキストラン（ファルマシアバイオテク（株）製）
および１００μＭのクロロキン（シグマ社製）を含む４
ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＥＲＤＦ培地に加えてお
く。一方、直径１０ｃｍのディッシュを用いて１０％Ｆ
ＢＳを添加したＥＲＤＦ培地で５０％コンフルエントに
なるまで増殖させたＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
−１６５０）をＰＢＳで一回洗浄した後、上記で得た４
ｍｌのＤＮＡ混合液を加え、５％ＣＯ2 、３７℃の条件
で培養した。４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、２
０ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＥＲＤＦ培地にて５％
ＣＯ2 ，３７℃の条件で４日間培養し、ＣａＩＦＮγが
生産された培養上清を得た。この培養上清の抗ウイルス
活性を測定したところ、１０4希釈単位／ｍｌ以上の活
性が認められた。
γの生産 実施例３で得られた５μｇのｐＳＲαγを５０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、４００μｇ／ｍｌのＤＥ
ＡＥデキストラン（ファルマシアバイオテク（株）製）
および１００μＭのクロロキン（シグマ社製）を含む４
ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＥＲＤＦ培地に加えてお
く。一方、直径１０ｃｍのディッシュを用いて１０％Ｆ
ＢＳを添加したＥＲＤＦ培地で５０％コンフルエントに
なるまで増殖させたＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
−１６５０）をＰＢＳで一回洗浄した後、上記で得た４
ｍｌのＤＮＡ混合液を加え、５％ＣＯ2 、３７℃の条件
で培養した。４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、２
０ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＥＲＤＦ培地にて５％
ＣＯ2 ，３７℃の条件で４日間培養し、ＣａＩＦＮγが
生産された培養上清を得た。この培養上清の抗ウイルス
活性を測定したところ、１０4希釈単位／ｍｌ以上の活
性が認められた。
【００３０】実施例７ 大腸菌でのＣａＩＦＮγの生産 実施例４で得られたＥ．ｃｏｌｉ（ｐＥＴγ）のシング
ルコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５
ｍｌのＬＢ培地に植菌した。ＯＤ600 が約０．７になる
まで３７℃で培養し、終濃度０．５ｍＭのイソプロピル
ーβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加え
て、さらに１．５時間培養した。
ルコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５
ｍｌのＬＢ培地に植菌した。ＯＤ600 が約０．７になる
まで３７℃で培養し、終濃度０．５ｍＭのイソプロピル
ーβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加え
て、さらに１．５時間培養した。
【００３１】培養液１．５ｍｌを１．５ｍｌのマイクロ
遠心チューブに取り、１２０００ｒｐｍで５分間遠心
後、上清を捨て、１．５ｍｌの１０ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ７．５）に懸濁し、氷上にてハンディーソニックを用
いて菌体を破砕した。２００００ｒｐｍで３０分間遠心
し、可溶性画分（上清）を得た。
遠心チューブに取り、１２０００ｒｐｍで５分間遠心
後、上清を捨て、１．５ｍｌの１０ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ７．５）に懸濁し、氷上にてハンディーソニックを用
いて菌体を破砕した。２００００ｒｐｍで３０分間遠心
し、可溶性画分（上清）を得た。
【００３２】この画分の抗ウイルス活性を測定したとこ
ろ、１０7希釈単位／ｍｌ以上の活性が認められた。ま
た、クラスＩＩＭＨＣの発現増強作用を測定したとこ
ろ、イヌ乳腺腫瘍細胞株ＦＣＢＲ１上のクラスＩＩＭＨ
Ｃの発現量を１００％上昇させた。
ろ、１０7希釈単位／ｍｌ以上の活性が認められた。ま
た、クラスＩＩＭＨＣの発現増強作用を測定したとこ
ろ、イヌ乳腺腫瘍細胞株ＦＣＢＲ１上のクラスＩＩＭＨ
Ｃの発現量を１００％上昇させた。
【００３３】実施例８ カイコ発現用プラスミドの作製 ベクターｐＢＭ０３０（文献７）１μｇを３０ユニット
の制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃、１６時間消化した後、
１ユニットのバクテリア由来アルカリホスファターゼ
（宝酒造（株）製）で末端を脱リン酸化した。これを１
％アガロ−スゲルにて電気泳動し、約１１．３ＫｂのＤ
ＮＡ断片を常法に従い調製した。
の制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃、１６時間消化した後、
１ユニットのバクテリア由来アルカリホスファターゼ
（宝酒造（株）製）で末端を脱リン酸化した。これを１
％アガロ−スゲルにて電気泳動し、約１１．３ＫｂのＤ
ＮＡ断片を常法に従い調製した。
【００３４】ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅ
ｒ．１を用いて、１６℃、１６時間ライゲ−ション反応
を行い、上記のように調製した、ｐＢＭ０３０と、実施
例２で調製したＣａＩＦＮγのＤＮＡ断片を連結した。
これを用いて常法に従い大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し
た。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレー
ト上に生育するコロニーの中から、ＣａＩＦＮγをコー
ドするＤＮＡの開始コドンから２７ｂｐまでを含むプラ
イマー、すなわち、５’ＡＴＧＡＡＴＴＡＴＡＣＡＡＧ
ＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ３’（配列番号３）とｐＢ
Ｍ０３０のクローニングサイトＥｃｏＲＩから下流の２
６ｂｐのプライマー、すなわち、５’ＡＴＣＡＡＣＡＡ
ＣＧＣＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＡＣＧＣＴ３’（配列番号
７）の２種類のプライマーを用いて、ＤＮＡの変性条件
を９４℃，１分、プライマ−のアニ−リング条件を５５
℃、２分、プライマ−の伸長条件を７２℃、３分の各条
件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡ
サ−マルサイクラ−を用い、３０サイクルでＰＣＲを行
い、約６５０ｂｐのＤＮＡ断片が得られた、ＣａＩＦＮ
γをコードするＤＮＡがｐＢＭ０３０に正方向に組み込
まれている組換えベクターを得た。この組換え体プラス
ミドをｐＢＭγとした。このプラスミドを含有する大腸
菌をＥ．ｃｏｌｉ（ｐＢＭγ）と名付けた。
ｒ．１を用いて、１６℃、１６時間ライゲ−ション反応
を行い、上記のように調製した、ｐＢＭ０３０と、実施
例２で調製したＣａＩＦＮγのＤＮＡ断片を連結した。
これを用いて常法に従い大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し
た。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレー
ト上に生育するコロニーの中から、ＣａＩＦＮγをコー
ドするＤＮＡの開始コドンから２７ｂｐまでを含むプラ
イマー、すなわち、５’ＡＴＧＡＡＴＴＡＴＡＣＡＡＧ
ＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ３’（配列番号３）とｐＢ
Ｍ０３０のクローニングサイトＥｃｏＲＩから下流の２
６ｂｐのプライマー、すなわち、５’ＡＴＣＡＡＣＡＡ
ＣＧＣＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＡＣＧＣＴ３’（配列番号
７）の２種類のプライマーを用いて、ＤＮＡの変性条件
を９４℃，１分、プライマ−のアニ−リング条件を５５
℃、２分、プライマ−の伸長条件を７２℃、３分の各条
件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡ
サ−マルサイクラ−を用い、３０サイクルでＰＣＲを行
い、約６５０ｂｐのＤＮＡ断片が得られた、ＣａＩＦＮ
γをコードするＤＮＡがｐＢＭ０３０に正方向に組み込
まれている組換えベクターを得た。この組換え体プラス
ミドをｐＢＭγとした。このプラスミドを含有する大腸
菌をＥ．ｃｏｌｉ（ｐＢＭγ）と名付けた。
【００３５】実施例９ ＣａＩＦＮγをコードするＤＮ
Ａで組換えられた組換えカイコ核多角体病ウイルスの作
製 文献２の方法で組換えウイルスを作製した。すなわち、
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、０．
２８Ｍ ＮａＣｌ、０．７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、０．７
ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4からなる２．５ｍｌの溶液に、２．
５ｍｌのＤＮＡ混合液（０．２５Ｍ ＣａＣｌ2、カイ
コ核多角体病ウイルスＢｍＮＰＶ Ｔ３株（文献２）の
ＤＮＡ１０μｇ、組換え体プラスミドｐＢＭγのＤＮＡ
６５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを
５ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ−１０培地（文献
２）中、２５ｃｍ2のフラスコで平面培養した約３×１
０5個のＢｍＮ細胞の培養基に加え、カイコ細胞にＤＮ
Ａを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換し、さら
に７日間培養後、培養液を回収した。その培養液を遠心
して清澄化した上清を希釈して平面に培養したＢＭ−Ｎ
細胞の培養基に添加して８日間培養後、顕微鏡観察によ
りウイルス感染が見られ、かつ多角体が形成していない
培養基を選択した（限界希釈法）。
Ａで組換えられた組換えカイコ核多角体病ウイルスの作
製 文献２の方法で組換えウイルスを作製した。すなわち、
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、０．
２８Ｍ ＮａＣｌ、０．７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、０．７
ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4からなる２．５ｍｌの溶液に、２．
５ｍｌのＤＮＡ混合液（０．２５Ｍ ＣａＣｌ2、カイ
コ核多角体病ウイルスＢｍＮＰＶ Ｔ３株（文献２）の
ＤＮＡ１０μｇ、組換え体プラスミドｐＢＭγのＤＮＡ
６５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを
５ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ−１０培地（文献
２）中、２５ｃｍ2のフラスコで平面培養した約３×１
０5個のＢｍＮ細胞の培養基に加え、カイコ細胞にＤＮ
Ａを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換し、さら
に７日間培養後、培養液を回収した。その培養液を遠心
して清澄化した上清を希釈して平面に培養したＢＭ−Ｎ
細胞の培養基に添加して８日間培養後、顕微鏡観察によ
りウイルス感染が見られ、かつ多角体が形成していない
培養基を選択した（限界希釈法）。
【００３６】限界希釈法を７回繰り返し、組換え体ウイ
ルスをクローニングした。ここで作製したＣａＩＦＮγ
をコードするＤＮＡを含む組換えウイルスをｒＢＮＶγ
とした。
ルスをクローニングした。ここで作製したＣａＩＦＮγ
をコードするＤＮＡを含む組換えウイルスをｒＢＮＶγ
とした。
【００３７】実施例１０ 組換え体ウイルス液の調製 ７５ｃｍ2のフラスコ底面で、１５ｍｌの１０％ＦＢＳ
を含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０6個
のＢｍＮ細胞に、前記（４）でクローニングした組換え
体ウイルスを含むＢＭ−Ｎ細胞の培養液５０μｌをＢＭ
−Ｎ細胞に添加して、２７℃で５日間培養後、培養液を
３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、遠心上清を組
換え体ウイルス液として得た。ウイルス液を１０7倍希
釈し、その１ｍｌをＢＭ−Ｎ細胞の培養基に添加して２
７℃で７日間培養を続けると、顕微鏡観察によって培養
基のＢＭ−Ｎ細胞にウイルス感染が認められた。
を含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０6個
のＢｍＮ細胞に、前記（４）でクローニングした組換え
体ウイルスを含むＢＭ−Ｎ細胞の培養液５０μｌをＢＭ
−Ｎ細胞に添加して、２７℃で５日間培養後、培養液を
３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、遠心上清を組
換え体ウイルス液として得た。ウイルス液を１０7倍希
釈し、その１ｍｌをＢＭ−Ｎ細胞の培養基に添加して２
７℃で７日間培養を続けると、顕微鏡観察によって培養
基のＢＭ−Ｎ細胞にウイルス感染が認められた。
【００３８】実施例１１ カイコ樹立細胞でのＣａＩＦ
Ｎγの生産 前記で得た組換え体ウイルス液を、０．５ｍｌづつ、２
５ｃｍ2のフラスコで１０％のＦＢＳを含むＴＣ−１０
培地中で平面培養した約３×１０6個のＢｍＮ細胞に加
えた。３０分後、新鮮な５ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＴ
Ｃ−１０培地と交換し、２７℃で３日間培養した。培養
液の遠心上清をとり、活性を調べた結果、１０5希釈単
位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が得られた。
Ｎγの生産 前記で得た組換え体ウイルス液を、０．５ｍｌづつ、２
５ｃｍ2のフラスコで１０％のＦＢＳを含むＴＣ−１０
培地中で平面培養した約３×１０6個のＢｍＮ細胞に加
えた。３０分後、新鮮な５ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＴ
Ｃ−１０培地と交換し、２７℃で３日間培養した。培養
液の遠心上清をとり、活性を調べた結果、１０5希釈単
位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が得られた。
【００３９】実施例１２ カイコ生体中でのＣａＩＦＮ
γの生産 ５令２日目のカイコ幼虫に、前記（５）で得た組換え体
ウイルスのウイルス液を５０μｌ／頭注射し、２５℃で
４日間、市販の人工飼料（カネボウシルクエレガンス社
製）を与えて飼育後、１０頭のカイコの腹部を切り、体
液を氷冷したエッペンドルフチューブに採取し、遠心分
離後の上清を得、０．２２μｍのフィルターでろ過滅菌
後、活性を測定した結果、１０7希釈単位／ｍｌ以上の
抗ウイルス活性が得られた。また、クラスＩＩＭＨＣの
発現増強作用を測定したところ、イヌ乳腺腫瘍細胞株Ｆ
ＣＢＲ１上のクラスＩＩＭＨＣの発現量を１００％上昇
させた。
γの生産 ５令２日目のカイコ幼虫に、前記（５）で得た組換え体
ウイルスのウイルス液を５０μｌ／頭注射し、２５℃で
４日間、市販の人工飼料（カネボウシルクエレガンス社
製）を与えて飼育後、１０頭のカイコの腹部を切り、体
液を氷冷したエッペンドルフチューブに採取し、遠心分
離後の上清を得、０．２２μｍのフィルターでろ過滅菌
後、活性を測定した結果、１０7希釈単位／ｍｌ以上の
抗ウイルス活性が得られた。また、クラスＩＩＭＨＣの
発現増強作用を測定したところ、イヌ乳腺腫瘍細胞株Ｆ
ＣＢＲ１上のクラスＩＩＭＨＣの発現量を１００％上昇
させた。
【００４０】
【発明の効果】本発明によれば、イヌの抗ウイルス剤、
抗腫瘍剤および抗アレルギー剤として期待されるＣａＩ
ＦＮγを大量生産することができる。
抗腫瘍剤および抗アレルギー剤として期待されるＣａＩ
ＦＮγを大量生産することができる。
【００４１】参考文献 １．Ａｄｏｌｆら：Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ
ｅｒｃｈ，７，１７３−１８３（１９８７）． ２．Ｄｅｖｏｓら：Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ
ｅｒｃｈ，１２，９５−１０２（１９９２）． ３．Ｃｈｉｒｇｗｉｎら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
１８、５２９４（１９７９）． ４．Ｂｅｒｇｅｒら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１
８，５１４３（１９７９）． ５．Ｇｕｂｌｅｒら：Ｇｅｅｎ．２５，２３６−２６９
（１９８３）． ６．Ｏｋａｙａｍａら：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２，１６１，（１９８２） ＆ ３，２８０，
（１９８３）． ７．Ｔ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉら：Ａｇｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，５１，１５７３−１５８０，（１９８７）． ８．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ．
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１９８２． ９．Ｐｒｏｂｅｒら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８，３３６
−３４１（１９８７）． １０．Ｔａｋｅｂｅら：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
８、４４６−４７２（１９８８）． １１．日本生化学会編：続生化学実験講座第５巻、（１
９８６）．Ｐ２５０−２５６、東京化学同人． １２．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ，９０，２２１−２２３（１９８６）．
ｅｒｃｈ，７，１７３−１８３（１９８７）． ２．Ｄｅｖｏｓら：Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ
ｅｒｃｈ，１２，９５−１０２（１９９２）． ３．Ｃｈｉｒｇｗｉｎら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
１８、５２９４（１９７９）． ４．Ｂｅｒｇｅｒら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１
８，５１４３（１９７９）． ５．Ｇｕｂｌｅｒら：Ｇｅｅｎ．２５，２３６−２６９
（１９８３）． ６．Ｏｋａｙａｍａら：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２，１６１，（１９８２） ＆ ３，２８０，
（１９８３）． ７．Ｔ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉら：Ａｇｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，５１，１５７３−１５８０，（１９８７）． ８．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ．
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１９８２． ９．Ｐｒｏｂｅｒら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８，３３６
−３４１（１９８７）． １０．Ｔａｋｅｂｅら：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
８、４４６−４７２（１９８８）． １１．日本生化学会編：続生化学実験講座第５巻、（１
９８６）．Ｐ２５０−２５６、東京化学同人． １２．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ，９０，２２１−２２３（１９８６）．
【００４２】
配列番号：１ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GAATTCATGAATTATACAAGCTATATCTTAGC
【００４３】配列番号：２ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GCGAATTCTTATTTCGATGCTCTGCGGCCTCGAAA
【００４４】配列番号：３ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATGAATTATACAAGCTATATCTTAGCT
【００４５】配列番号：４ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCC
【００４６】配列番号：５ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CCGACCATGGCTCAGGCCATGTTTTTTAAAGAAATAGAAAAC
【００４７】配列番号：６ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GGATCCTTATTTCGATGCTCTGCGGCCTCGAAACAG
【００４８】配列番号：７ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATCAACAACGCACAGAATCTAACGCT
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/21 ＡＦＥ Ａ６１Ｋ 37/66 ＡＢＦ Ｃ０７Ｈ 21/04 ＡＤＵＢ Ｃ１２Ｎ 1/21 ＡＤＹ 5/10 ＡＥＲ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＦＥ // Ｃ０７Ｋ 14/57 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (10)
- 【請求項１】 イヌインターフェロンγの蛋白質をコー
ドするＤＮＡを組込んだ組換えベクター。 - 【請求項２】 イヌインターフェロンγの蛋白質をコー
ドするＤＮＡを組込んだ組換えベクターにより宿主細胞
を形質転換してなる形質転換体。 - 【請求項３】 宿主細胞が大腸菌である請求項２に記載
の形質転換体。 - 【請求項４】 宿主細胞が真核細胞である請求項２に記
載の形質転換体。 - 【請求項５】 請求項３に記載の形質転換体を培養する
ことを特徴とするイヌインターフェロンγの製造法。 - 【請求項６】 請求項４に記載の形質転換体を培養する
ことを特徴とするイヌインターフェロンγの製造法。 - 【請求項７】 イヌインターフェロンγの蛋白質をコー
ドするＤＮＡにより、遺伝子組換えされた組換えカイコ
核多角体病ウイルス。 - 【請求項８】 請求項７に記載の組換えカイコ核多角体
病ウイルスを増殖させることを特徴とするイヌインター
フェロンγの製造法。 - 【請求項９】 カイコ樹立細胞中またはカイコ生体中で
増殖させることを特徴とする請求項８に記載のイヌイン
ターフェロンγの製造法。 - 【請求項１０】請求項７に記載の組換えカイコ核多角体
病ウイルスを増殖させて得られるイヌインターフェロン
γ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8349826A JPH09234085A (ja) | 1995-12-28 | 1996-12-27 | イヌインターフェロンγの製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7-342918 | 1995-12-28 | ||
| JP34291895 | 1995-12-28 | ||
| JP8349826A JPH09234085A (ja) | 1995-12-28 | 1996-12-27 | イヌインターフェロンγの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09234085A true JPH09234085A (ja) | 1997-09-09 |
Family
ID=26577384
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8349826A Pending JPH09234085A (ja) | 1995-12-28 | 1996-12-27 | イヌインターフェロンγの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09234085A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0862918A3 (en) * | 1997-03-06 | 2000-02-23 | Toray Industries, Inc. | Therapeutic agent for canine intractable dermatitis |
| EP1013667A3 (en) * | 1998-11-09 | 2000-07-05 | Nippon Biocapital Limited | Process for preparation of cytokine using a sendai virus expression system |
| JP2008512130A (ja) * | 2004-09-13 | 2008-04-24 | ワイス | 出血性ネコカリシウイルス、カリシウイルスワクチンおよびカリシウイルス感染または疾患を予防するための方法 |
-
1996
- 1996-12-27 JP JP8349826A patent/JPH09234085A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0862918A3 (en) * | 1997-03-06 | 2000-02-23 | Toray Industries, Inc. | Therapeutic agent for canine intractable dermatitis |
| EP1013667A3 (en) * | 1998-11-09 | 2000-07-05 | Nippon Biocapital Limited | Process for preparation of cytokine using a sendai virus expression system |
| JP2008512130A (ja) * | 2004-09-13 | 2008-04-24 | ワイス | 出血性ネコカリシウイルス、カリシウイルスワクチンおよびカリシウイルス感染または疾患を予防するための方法 |
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|
| A02 | Decision of refusal |
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