JPH1198995A - 有用蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 組換えバキュロウイルスによる有用蛋白質の
製造方法を提供する。 【解決手段】 組換えバキュロウイルスを昆虫培養細胞
又はカイコ幼虫にイヌインターフェロン−γ、ネコイン
ターフェロン−ω、イヌインターロイキン−１２又はヒ
トインターフェロン等の有用蛋白質を製造させる際に、
上記昆虫培養細胞の培養ヒ清、又はカイコ幼虫の体液に
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム等の金属キレート
剤を添加したうえで、流通式で紫外線を照射することに
より組換えバキュロウイルスの不活性化と目的蛋白質の
精製を容易にする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、組換えバキュロウ
イルスを用いた遺伝子操作技術によって有用蛋白質を生
産する手法において、組換えバキュロウイルスの不活性
化とその後行程にあたる目的有用蛋白質の精製を容易に
することによって、有用蛋白質の量産化を可能とし、以
って高純度かつ安価な医薬品（抗腫瘍・抗ウイルス剤
等）を製造する事を目的とする有用蛋白質の製造方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子組換え技術を用いた有用蛋白質の
生産方法には多くの技術が報告されているが、近年、遺
伝子組換えしたバキュロウイルスを用いた有用蛋白質の
生産方法についても、ブタ成長ホルモン（特開平3-2244
91号公報）、成人Ｔ細胞白血病ウイルス外皮蛋白質（特
開平2-57191号公報）、インフルエンザウイルスＨＡ蛋
白質（特開平3-108480号公報）、ネコインターフェロン
（特開平3-139276号公報）等が開示されている。しか
し、バキュロウイルスを用いた有用蛋白質の生産方法に
よって特に医薬品などを製造する場合には、安全性の観
点から使用した組換えバキュロウイルスの不活性化が不
可欠である。また、有用蛋白質の生産を目的とした組換
えカイコ核多角体病ウイルスの不活性化においては、組
換えバキュロウイルスの感染力を失わせると同時に、目
的とする有用蛋白質の活性を維持することが必要であ
る。

【０００３】バキュロウイルスの一つであるカイコ核多
角体病ウイルスの不活性化に関しては、Watanabe らが
詳細に報告している（文献１）。しかし、開示されてい
る加熱、紫外線、乾燥など、物理的な不活性化条件、お
よび、フェノール、ホルマリンなどの殺菌剤、アルコー
ルなどによる化学的な不活性化条件では蛋白質の変性が
生じることから、有用蛋白の製造に利用することは困難
である。また、この報告は、野生型カイコ核多角体病ウ
イルスの不活性化に関するものであり、組換えカイコ核
多角体病ウイルスの不活性化については開示されていな
い。

【０００４】特開平４-２０７１９８号公報には、カイ
コ体液をｐＨ０.５〜ｐＨ３.０にすることを特徴とする
組換えカイコ核多角体病ウイルスの不活性化方法が開示
されているが、この方法では酸性に対して安定な有用蛋
白質を製造する場合に限られることから、さらに幅広い
有用蛋白質に対して適用可能な組換えバキュロウイルス
の不活性化方法が求められていた。また、特開昭６１-
１５２２７６号公報には、塩化ベンザルコニウムを用い
た組換え大腸菌の不活性化に関する技術が開示されてい
るが、組換えバキュロウイルスの不活性化方法について
は開示されていない。

【０００５】すなわち、これらの従来技術では組換えバ
キュロウイルスを用いた有用蛋白質の生産において、幅
広い有用蛋白質の活性の維持と組換えバキュロウイルス
の不活性化を両立することは困難であった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】そこで、酸に安定な有
用蛋白質に限らず、すべての有用蛋白質の活性を低下さ
せることなく組換えバキュロウイルスの不活性化が可能
となれば、従来組換えバキュロウイルスを用いて量産が
困難であった有用蛋白質でも量産が容易となると期待で
きる。すなわち、本発明は、組換えバキュロウイルスを
用いた有用蛋白質の製造において、幅広い有用蛋白質に
適用可能な組換えバキュロウイルスの不活性化方法とそ
の後行程にあたる目的有用蛋白質の精製を容易にする方
法を提供することによって、有用蛋白質の量産化を可能
とし、以って高純度かつ安価な医薬品（抗腫瘍・抗ウイ
ルス剤等）の製造を可能とすることを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、こうした状
況に鑑み、鋭意工夫を重ねた結果、組換えバキュロウイ
ルスが感染した昆虫細胞の培養上清、または、組換えバ
キュロウイルスが感染した昆虫幼虫の体液流通式で紫外
線を照射することにより、組換えバキュロウイルスが不
活性化することを見出し本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち本発明は、有用蛋白質をコードす
る遺伝子により組み換えられた組換えバキュロウイルス
を昆虫培養細胞、または、昆虫幼虫に感染させて有用蛋
白質を生産する際に、昆虫細胞培養上清または昆虫幼虫
の体液に流通式で紫外線を照射することを特徴とする有
用蛋白質の製造方法を提供するものである。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明に関し詳細に説明す
る。

【００１０】本発明の有用蛋白質としては特に限定はさ
れないが、紫外線の照射によって活性が損なわれること
のない蛋白質にたいして好ましく応用が可能である。

【００１１】例えば、ヒトインターフェロン（α、β、
γの各タイプ）、ネコインターフェロン、イヌインター
フェロン（α、β、γの各タイプ）などのインターフェ
ロン類などが挙げられる。インターフェロンは、抗ウイ
ルス作用を示すところの蛋白質を主成分とする生理活性
物質でＩＦＮと略記される。また、その他に各種ほ乳動
物由来のインターロイキンなどが挙げられる。本発明の
方法は、特にネコＩＦＮ-ω、または、イヌＩＦＮ-γを
製造する際に好ましく用いられる。

【００１２】イヌインターフェロン-γは参考文献５に
示されているアミノ酸配列からなるポリペプチドである
が、そのアミノ酸配列の一部が置換されたもの、また、
その一部が欠如したもの、あるいは、いくつかのアミノ
酸残基が付加されたものでも、イヌ由来細胞、例えば、
イヌＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）に対し
て、文献１６に示されているようなインターフェロン−
γの本来の生理活性を有するポリペプチドであれば本発
明に含まれる。具体的には、例えば、配列番号５に示す
成熟蛋白質部分のアミノ酸配列からなるポリペプチドが
挙げられる。また、例えば、配列番号６に示す成熟蛋白
質部分のような糖鎖結合部位を欠如させたイヌインター
フェロン-γを挙げることができる。また、配列番号
７、８に示す成熟蛋白質部分のようなＣ末端が欠如した
イヌインターフェロン-γを挙げることができる。

【００１３】遺伝子組換えバキュロウイルスは、例えば
次のようにして作製することができる。すなわち、有用
蛋白質をコードするＤＮＡの上流に核多角体病ウイルス
由来のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片、下流に終止
シグナル以下のＤＮＡ断片を有する組換えプラスミド
と、核多角体病ウイルスのＤＮＡを、例えばＢＭ−Ｎ細
胞のようなカイコ培養細胞に同時に感染させることによ
って、細胞内で外来の有用蛋白質をコードするＤＮＡと
ウイルスＤＮＡの組換えが起こり、遺伝子組換えウイル
スが作製される。このようにして作製された組換えウイ
ルスは、核多角体病ウイルスの多角体蛋白質の遺伝子領
域に外来のＤＮＡが置換または挿入されており多角体を
形成することができないため、非組換えウイルスと容易
に区別することが可能である。

【００１４】このような遺伝子組換え核多角体病ウイル
スとして、例えば、ネコＩＦＮの蛋白質をコードするＤ
ＮＡが組換えられたｒＢＮＶ１００や 、イヌＩＦＮ-γ
の蛋白質をコードするＤＮＡが組換えられたrＢＮＶγ
を挙げることができる。

【００１５】ｒＢＮＶ１００は、特開平４−２０７１９
８に開示された方法によって作製することができる。す
なわち、生命科学研究所にFERM Ｐ-１６３３号として
寄託されている大腸菌の形質転換体から一般的な手法に
より抽出したプラスミドからネコＩＦＮの蛋白質をコー
ドするＤＮＡ部分を、例えばｐＢＭ０３０（文献４）な
どのカイコのクローニングベクターの発現調節部分の下
流に連結するという一般的な遺伝子操作技術によって組
換えプラスミドを作製することができる。この組換えプ
ラスミドとカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡ（文献４）
とを、文献４に示されている方法で、カイコ樹立細胞、
例えば、ＢＭ−Ｎ細胞（文献４）にコ・トランスフェク
ションした後、培養を続ける。培養液中には、非組換え
ウイルス（野生型）と組換えウイルスの両方が出現する
ため、限界希釈法およびプラーク法などの一般的な方法
によって、組換えウイルスをクローニングする。組換え
ウイルスは核多核体の形成能がないことから、野生型ウ
イルスと容易に区別することが可能である。

【００１６】イヌＩＦＮ-γの蛋白質をコードするＤＮ
Ａが組換えられたrＢＮＶγは、例えば次のように作製
することができる。まず、イヌＩＦＮ-γの蛋白をコー
ドするＤＮＡ（文献５）を、例えば次のようにして製造
する。すなわち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽
出した後、ｃＤＮＡに転換し、イヌＩＦＮ-γをコ−ド
する遺伝子配列を元にしたプライマ−を用いてポリメラ
ーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことによって
イヌＩＦＮ-γをコ−ドする遺伝子を得ることができ
る。

【００１７】イヌの細胞、例えばマイト−ジェンなどで
刺激されたイヌリンパ球などよりＲＮＡを得る方法とし
ては、通常の方法、例えば、ポリソ−ムの分離、ショ糖
密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられ
る。上記イヌ細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、
グアニジン・チオシアネ−ト処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠
心を行うグアニジン・チオシアネ−ト−塩化セシウム法
（文献６）バナジウム複合体を用いてリボヌクレア−ゼ
インヒビタ−存在下に界面活性剤で処理したのちフェノ
−ル抽出を行う方法（文献７），グアニジン・チオシア
ネ−ト−ホット・フェノ−ル法、グアニジン・チオシア
ネ−ト−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネ−
ト−フェノ−ル・クロロホルム法、グアニジン・チオシ
アネ−トで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡ
を沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行う
ことができる。

【００１８】イヌリンパ球などより通常の方法、例え
ば、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシア
ネ−ト法、オリゴｄＴセルロ−スカラム法等によりｍＲ
ＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例え
ば、Ｇｕｂｌｅｒらの方法（文献８），Ｈ．Ｏｋａｙａ
ｍａらの方法（文献９）等によりｃＤＮＡを合成する。
得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、基本的
にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素な
どを用いるほか１部プライマ−を用いてＤＮＡポリメラ
−ゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合
成あるいはクロ−ニング用キットを用いるのが便利であ
る。このｃＤＮＡを鋳型としてイヌＩＦＮ-γの塩基配
列を基にしたプライマ−を用いてＰＣＲを行うことによ
ってイヌＩＦＮ-γの蛋白質をコ−ドするＤＮＡを得る
ことができる。

【００１９】このイヌＩＦＮ-γの蛋白質をコ−ドする
ＤＮＡをカイコのクローニングベクター（文献４）に連
結して作製した組み換え体プラスミドとカイコ核多角体
病ウイルスＤＮＡとを、カイコ樹立細胞にコトランスフ
ェクションして作製することができる。従って、組み換
え体ウイルスは、ｉｎ ｖｉｖｏ的な方法で作製するこ
とができる。

【００２０】すなわち、イヌＩＦＮ-γの蛋白質をコー
ドするＤＮＡ部分を、例えばｐＢＭ０３０（文献４）な
どのカイコのクローニングベクターの発現調節部分の下
流に連結するという一般的な遺伝子操作に従って組換え
体プラスミドを作製することができる。この組換え体プ
ラスミドとカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡ（文献４）
とを、文献のような方法でカイコ樹立細胞、例えばＢＭ
−Ｎ株（文献４）にコトランスフェクションした後、培
養を続け、培養液中に出現した非組換え体（野性型）と
組換え体のウイルスの中から限界希釈法、もしくはプラ
ーク法などの一般的な方法によって組換え体ウイルスを
クローニングすることができる。組換え体ウイルスは多
角体の形成能がないことから、野性型ウイルスと容易に
区別できる。有用蛋白質の生産は、前記の組換えカイコ
核多角体ウイルスをカイコ樹立細胞中、またはカイコ生
体中で増殖させることにより行なう。

【００２１】カイコ樹立細胞を用いる場合は、前記組換
え体ウイルスを含む培溶液により、ＢＭ−Ｎ細胞を感染
させ、平面培養または浮遊培養により培養する。ＢＭ−
Ｎ細胞を培養する培地としては、例えば牛血清を添加し
たＴＣ−１０培地（文献１２）を使用することができ
る。培養温度は２５〜２８℃が適当である。培養後、培
溶液を遠心分離しその上清から有用蛋白質を回収する。

【００２２】カイコ生体を用いる場合は、前記の組換え
体ウイルスを含む培養液をカイコ幼虫に注射して、クワ
の葉または合成飼料を与えて飼育する。飼育後、カイコ
を切開し得られた体液から有用蛋白質を回収する。

【００２３】以下に、本発明の望ましい実施形態を図面
を参照して説明する。

【００２４】図１は本発明の一実施態様に係る流通式の
紫外線照射装置を示しているが、流通式のものであれば
いかなるものでも使用できる。。図１において１は紫外
線照射装置本体を示す。

【００２５】照射装置は紫外線照射の殺菌灯２と殺菌灯
を取り付けるケーシング３からなる。ケーシングの上部
と下部に溶液の出入り口があり、殺菌灯とケーシングの
間をカイコ細胞培養上清またはカイコ幼虫の体液が流れ
るようになっている。カイコ細胞培養上清またはカイコ
幼虫の体液はポンプ４によりケーシングと殺菌灯の間を
通過させて５の容器に戻し、循環を繰り返す構造になっ
ている。また紫外線照射中に紫外線のエネルギーにより
カイコ細胞培養上清またはカイコ幼虫の体液の温度が上
昇する場合は、照射装置や処理する液体の循環ラインを
冷却するのが好ましい。

【００２６】ケーシングの設置方向は垂直、水平、斜め
などどの方向でもよく、殺菌灯もどの方向に取り付けて
もよいが、ケーシングおよび殺菌灯とも垂直に取り付
け、溶液は下部から上部に流通させるのが好ましい。ケ
ーシングは紫外線が外に漏れない材質がよく、金属製で
内面反射するものが効果的である。

【００２７】組換えバキュロウイルスの不活化のために
照射する紫外線の波長は、バキュロウイルスを不活化す
る波長であれば、いかなる波長でも良いが、好ましくは
２００ｎｍ〜３００ｎｍであり、さらに好ましくは２５
３．７ｎｍである。

【００２８】紫外線照射のための殺菌灯とケーシングと
の距離は、照射する溶液の紫外線透過率により異なる。
例えば蒸留水では１５ｃｍの厚みで透過率は９０％ある
が、ビールでは数ｍｍの厚みであっても１０％程度しか
透過しない。組換えバキュロウイルスの不活化のために
は殺菌灯とケーシングとの距離が短い程効果的であり、
２ｍｍ〜５０ｍｍ程度が好ましい。また紫外線の照度や
処理能力に応じて殺菌灯の数を増やしてもよい。

【００２９】照射時間は紫外線の照度以外に、ケーシン
グ内の滞留液量と循環する液量によって決定される。実
際に紫外線を照射する時間は運転時間にケーシング内の
滞留液量と処理する全液量の比によって異なるが、好ま
しくは１０分〜数時間程度である。

【００３０】ケーシング内の滞留時間は処理溶液量やポ
ンプ能力、紫外線照射による液温度上昇の許容範囲、ス
ラッジの沈降速度などにより規定される。

【００３１】また、カイコ細胞培養上清またはカイコ幼
虫の体液が、微量の金属と結合したり、空気による酸化
などで変成して着色が起こると、紫外線の透過率が低下
して、ウイルスの不活化が起こりにくくなることがあ
る。これを防止する目的で金属キレート剤を添加するの
が好ましい。金属キレート剤としては、エチレンジアミ
ン四酢酸、エチレンジアミン三酢酸、エチレンジアミン
二酢酸またはこれらのアルカリ金属塩などが好ましく、
さらに好ましくは、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウ
ムである。添加量としては、処理する液体に対し、０．
１ｍＭから１００ｍＭが好ましく、さらに好ましくは、
１ｍＭから１０ｍＭである。

【００３２】こうして遺伝子組み換え技術によって製造
された有用蛋白質を単離・精製するための方法に特に限
定はなく、通常の蛋白質の精製方法を用いることができ
る。例えば、目的とする有用蛋白質が本来有する活性を
指標としながら、シリカゲル担体、イオン交換性担体、
ゲル濾過担体、キレート性担体、色素担持担体等を用い
たクロマトグラフィーや、限外濾過、ゲル濾過、透析、
塩析等による脱塩、濃縮を組み合わせることによって精
製し単離することができる。

【００３３】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明の範囲がこれに限定されるもので
はない。

【００３４】参考例１ ＜イヌＩＦＮ-γをコードするＤＮＡを導入した組換え
カイコ核多核体病ウイルスの作成＞ （１）イヌｃＤＮＡの調製 イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、フィトヘムアグルチ
ニン（ＰＨＡ）を５０μｇ／ｍｌの終濃度で４８時間刺
激した。刺激後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジ−ン社）を
用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で５分間
処理した後、１Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加えた。
０．５ＭＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセ
ルロ−スカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液に
て洗浄した。さらに０．３Ｍ ＬｉＣｌを含むＴＥにて
洗浄後、０．０１％ ＳＤＳを含む２ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出し
た。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖
ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌの
ミクロ遠心チュ−ブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．
５μｇのオリゴｄＴプライマ−（１２−１８ｍｅｒ）を
入れ、ジエチルピロカルボネ−ト処理滅菌水を加えて１
２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベ−トしたのち
氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ８．４），５００ｍＭ ＫＣｌ溶液を２μｌ，２５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 を２μｌ，１０ｍＭ ｄＮＴＰを１μｌ
および０．１Ｍ ＤＴＴを２μｌそれぞれ加え、４２℃
で５分間インキュベ−トしたのち、２００ユニットのＧ
ｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒ
Ｔを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベ−
トしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５
分間インキュベ−トして反応を停止し、氷上に５分間置
いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ
Ｈ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間イ
ンキュベ−トした。

【００３５】（２）イヌＩＦＮ-γ遺伝子の調製 イヌＩＦＮ-γのＮ末端およびＣ末端の塩基配列（文献
５）をもとに、５´ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＡ
ＴＡＣＡＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ３´ （配列番
号１）と５´ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧ
ＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＡＡ３´（配列番号２） の２種類の末端にＥｃｏＲＩ切断部位を付加したプライ
マ−をＤＮＡシンセサイザ−にて合成した。上記（１）
で得られたｃＤＮＡを０．５ｍｌのミクロ遠心チュ−ブ
に２μｌづつ取り、各プライマ−を２０ｐｍｏｌ，２０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）、１．５ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ₂ 、２５ｍＭ ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ ゼラ
チン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位 Ｔａｑ ＤＮＡポ
リメラ−ゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌ
とする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマ−
のアニ−リング条件を５５℃、２分、プライマ−の伸長
条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ
ｒ Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサ−マルサイクラ−を用い、
３０サイクル反応させた。これを１％アガロ−スゲルに
て電気泳動し、約５６０ｂｐのＤＮＡ断片を常法（文献
１０）に従って調製した。このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ社のＴ−ＶｅｃｔｏｒにＴＡＫＡＲＡ社のＤ
ＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて
１６℃、２時間反応を行い、連結した。これを用いて常
法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体より
プラスミドＤＮＡを常法に従い調製した。次にこのプラ
スミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ
条件のＰＣＲによって確認し、Ｇｅｎｅｓｉｓ ２００
０ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（デュポ
ン社）を用いて、ダイデオキシ法（文献１１）でイヌＩ
ＦＮ-γＤＮＡの塩基配列を確認した。

【００３６】（３）カイコ発現用プラスミドの作製 ベクターｐＢＭ０３０（文献４）１μｇを３０ユニット
の制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃、１６時間消化した後、
１ユニットのバクテリア由来アルカリホスファターゼで
末端を脱リン酸化した。これを１％アガロ−スゲルにて
電気泳動し、約１１．３ＫｂのＤＮＡ断片を常法に従い
調製した。

【００３７】ＴＡＫＡＲＡ社のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏ
ｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１を用いて、１６℃、１６時間ラ
イゲ−ション反応を行い、上記のように調製した、ｐＢ
Ｍ０３０と、実施例２で調製したイヌＩＦＮ-γのＤＮ
Ａ断片を連結した。これを用いて常法に従い大腸菌ＨＢ
１０１を形質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含むＬＢプレート上に生育するコロニーの中から、
イヌＩＦＮ-γをコードするＤＮＡの開始コドンから２
７ｂｐまでを含むプライマー、すなわち、５’ＡＴＧＡ
ＡＴＴＡＴＡイヌＡＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ３’
（配列番号３）とｐＢＭ０３０のクローニングサイトＥ
ｃｏＲＩから下流の２６ｂｐのプライマー、すなわち、
５’ＡＴＣＡＡＣＡＡＣＧＣＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＡＣ
ＧＣＴ３’（配列番号４）の２種類のプライマーを用い
て、ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマ−のア
ニ−リング条件を５５℃、２分、プライマ−の伸長条件
を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサ−マルサイクラ−を用い、３０
サイクルでＰＣＲを行い、約６５０ｂｐのＤＮＡ断片が
得られた、イヌＩＦＮ-γをコードするＤＮＡがｐＢＭ
０３０に正方向に組み込まれているプラスミドを得た。
この組換え体プラスミドをｐＢＭγとした。このプラス
ミドを含有する大腸菌をＥ．ｃｏｌｉ（ｐＢＭγ）と名
付けた。

【００３８】（４）イヌＩＦＮ-γをコードするＤＮＡ
で組換えられた組換えカイコ核多角体病ウイルスの作製 参考文献４の方法で組換えウイルスを作製した。すなわ
ち、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、
０.２８Ｍ ＮａＣｌ、０.７ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、０.
７ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄からなる２.５ｍｌの溶液に、２.
５ｍｌのＤＮＡ混合液（０.２５Ｍ ＣａＣｌ₂、カイコ
核多角体病ウイルスＢｍＮＰＶ Ｔ３株（文献４）のＤ
ＮＡ１０μｇ、組換え体プラスミドｐＢＭγのＤＮＡ６
５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを５
ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ−１０培地（文献１
３）中、２５ｃｍ²のフラスコで平面培養した約３×１
０⁵個のＢｍＮ細胞の培養基に加え、カイコ細胞にＤＮ
Ａを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換し、さら
に７日間培養後、培養液を回収した。その培養液を遠心
して清澄化した上清を希釈して平面に培養したＢＭ−Ｎ
細胞の培養基に添加して８日間培養後、顕微鏡観察によ
りウイルス感染が見られ、かつ多角体が形成していない
培養基を選択した（限界希釈法）。

【００３９】限界希釈法を７回繰り返し、組換え体ウイ
ルスをクローニングした。ここで作製したイヌＩＦＮγ
をコードするＤＮＡを含む組換えウイルスをｒＢＮＶγ
とした。

【００４０】（５）ｒＢＮＶγウイルス液の調製 ７５ｃｍ２のフラスコ底面で、１５ｍｌの１０％ＦＢＳ
を含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０⁶個
のＢｍＮ細胞に、前記（４）でクローニングした組換え
体ウイルスを含むＢＭ−Ｎ細胞の培養液５０μｌをＢＭ
−Ｎ細胞に添加して、２７℃で５日間培養後、培養液を
３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、遠心上清を組
換え体ウイルス液として得た。ウイルス液を１０〜７倍
希釈し、その１ｍｌをＢＭ−Ｎ細胞の培養基に添加して
２７℃で７日間培養を続けると、顕微鏡観察によって培
養基のＢＭ−Ｎ細胞にウイルス感染が認められた。

【００４１】参考例２ ＜抗ウイルス活性測定法＞抗ウイルス活性は、文献１１
に従ってＣＰＥ法により測定した。測定用ウイルスとし
てＶｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒ
ｕｓを用い、感受性細胞としては、イヌＩＦＮ-γの抗
ウイルス活性を測定する場合にはイヌＭＤＣＫ（ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ−３４）細胞を用いた。すなわち、９６穴マ
イクロプレート上にコンフルーエントとなるまで３７℃
で培養されたイヌＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）
細胞にイヌＩＦＮ-γを含むサンプルの希釈液を加え、
さらに、３７℃で２０時間から２４時間培養し抗ウイル
ス活性を誘導させた。ＶＳＶを加え３７℃で２４時間培
養した後、生存してマイクロプレート上に付着している
イヌＭＤＣＫ細胞を２０％ホルマリンを含むクリスタル
バイオレット染色液で染色した。マイクロプレート上の
クリスタルバイオレットの量を５７０nm における吸光
度を測定することによって、細胞を５０％生存させる時
のイヌＩＦＮ-γの量を求め、この時のイヌＩＦＮ-γの
量を、抗ウイルス活性１ユニット（１Ｕ）と定義した。

【００４２】参考例３ ＜細胞変性効果によるウイルス濃度の定量＞文献１４の
方法に従って、組換えウイルス濃度を定量した。すなわ
ち、組換えカイコ核多角体病ウイルスを感染させたカイ
コ培養細胞培養上清、または、カイコ幼虫体液抽出液を
希釈し、５×１０⁵個／ｍｌのＢＭ−Ｎ細胞培養液に添
加した。２７℃で１０日間培養した後に、顕微鏡観察に
よってＢＭ−Ｎ細胞に対する細胞変性効果を確認し、感
染性ウイルス量を算定した。感染性ウイルス量は、文献
１５に従ってＴＣＩＤ₅₀（５０％ tissue culture infe
ctious dose）を求めることによって決定した。

【００４３】実施例１ ＜紫外線照射によるカイコ体液中の組換えカイコ核多角
体病ウイルスの不活性化＞５令２日目のカイコ幼虫に、
参考例１の（５）で得た組換え体ウイルスのウイルス液
を２μｌ／頭注射し、２５℃で４日間、市販の人工飼料
（カネボウシルクエレガンス社製）を与えて飼育した。
８０頭のカイコの腹部を切り、１頭あたり１０ｍｌの冷
水で、体液を抽出した。体液抽出液８００ｍｌを５°Ｃ
で冷却しながら、図１に示す紫外線照射装置に送り、定
格７Ｗ、波長２５３．７ｎｍの紫外線を殺菌灯を用いて
照射した。ケーシング内の滞留液量約３００ｍｌ、殺菌
灯からケーシングまでの最大距離は１０ｍｍ、体液抽出
液の滞留時間は３分で循環した。

【００４４】このときの体液抽出液を１０倍希釈し、紫
外線透過率を分光光度計（日立製）を用いて測定したと
ころ２１％（１０ｍｍセル）であった。

【００４５】１．５時間後、および４時間後に体液抽出
液をサンプリングし、参考例２および３の方法でカイコ
細胞とともに培養してウイルスの増殖を調べた。１．５
時間後の体液抽出液（滞留時間を考慮した実際に紫外線
を照射した時間は０．６時間）では７５％のウイルスが
不活化しており、４時間後の体液抽出液（滞留時間を考
慮した実際に紫外線を照射した時間は１．７時間）では
１００％のウイルスが不活化していた。

【００４６】イヌインターフェロンの力価をバイオアッ
セイ法により測定したところ３×１０⁶ＬＵ／ｍｌであ
った。

【００４７】比較例１ 定格１５Ｗの殺菌灯５灯の直下１００ｍｍに、３０ｃｍ
角のバットをおき、実施例２と同様の体液抽出液１８０
ｍｌを、液高さ２ｍｍまで入れて紫外線を照射した。実
施例２と同様の評価をしたところ、７５％のウイルスが
不活化するのに７時間、１００％のウイルスが不活化す
るのに８時間かかった。流通式に比べ、処理時間が長く
かかる上、処理量も少ない。

【００４８】実施例２ ＜紫外線照射によるカイコ体液中の組換えカイコ核多角
体病ウイルスの不活性化＞５令２日目のカイコ幼虫に、
参考例１の（５）で得た組換え体ウイルスのウイルス液
を２μｌ／頭注射し、２５℃で４日間、市販の人工飼料
（カネボウシルクエレガンス社製）を与えて飼育した。
８０頭のカイコの腹部を切り、１頭あたり２．５ｍＭ／
ｌのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを含む１０ｍ
ｌの冷水で、体液を抽出した。体液抽出液８００ｍｌを
５°Ｃで冷却しながら、図１に示す紫外線照射装置に送
り、定格７Ｗ、波長２５３．７ｎｍの紫外線を殺菌灯を
用いて照射した。ケーシング内の滞留液量約３００ｍ
ｌ、殺菌灯からケーシングまでの最大距離は１０ｍｍ、
体液抽出液の滞留時間は３分で循環した。

【００４９】このときの体液抽出液を１０倍希釈し、紫
外線透過率を分光光度計（日立製）を用いて測定したと
ころ２６％（１０ｍｍセル）であった。

【００５０】１時間後、および２．５時間後に体液抽出
液をサンプリングし、参考例２および３の方法でカイコ
細胞とともに培養してウイルスの増殖を調べた。１時間
後の体液抽出液（滞留時間を考慮した実際に紫外線を照
射した時間は０．４時間）では７５％のウイルスが不活
化しており、２．５時間後の体液抽出液（滞留時間を考
慮した実際に紫外線を照射した時間は１時間）では１０
０％のウイルスが不活化していた。

【００５１】イヌインターフェロンの力価をバイオアッ
セイ法により測定したところ３×１０⁶ＬＵ／ｍｌであ
った。

【００５２】

【発明の効果】組換えバキュロウイルスを用いた有用蛋
白質の製造において、組換えバキュロウイルスの不活性
化が幅広い有用蛋白質の製造において可能となり、か
つ、目的とする有用蛋白質の精製が容易になる。以って
有用蛋白質の量産化を可能とし、高純度かつ安価な医薬
品（抗腫瘍・抗ウイルス剤等）の製造が可能となる。

【００５３】参考文献 １．Ｓ．Ｗａｔａｎａｂｅら：Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．，２１，２９９−３１３（１９５１） ２．Ｎ．Ｙａｍａｍｏｔｏrら：Ｂｏｋｉｎ Ｂｏｂａ
ｉ，１６，５０５−５０８（１９８８） ３．Ｍ．Ｗａｔａｎａｂｅら：日本蚕糸学雑誌，３７，
２１３−２１８（１９６８） ４．Ｔ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉら：Ａｇｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，５１，１５７３−１５８０，（１９８７）． ５．Ｄｅｖｏｓら：Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ
ｅｒｃｈ，１２，９５−１０２（１９９２）． ６．Ｃｈｉｒｇｗｉｎら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
１８、５２９４（１９７９）． ７．Ｂｅｒｇｅｒら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１
８，５１４３（１９７９）． ８．Ｇｕｂｌｅｒら：Ｇｅｅｎ．２５，２３６−２６９
（１９８３）． ９．Ｏｋａｙａｍａら：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２，１６１，（１９８２）＆ ３，２８０，（１
９８３）． １０．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒ
ｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１９８２． １１．Ｐｒｏｂｅｒら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８，３３
６−３４１（１９８７）． １２．日本生化学会編：続生化学実験講座第５巻、（１
９８６）．Ｐ２５０−２５６、東京化学同人． １３．G. R. Ｇａｒｄｉｎｅｒら：Ｊ．Ｉｎｖｅｒｔｅ
ｂｒａｔｅ Ｐｈａｔｈｏｌ．２５，３６３−３７０
（１９７５） １４．Ｊ．Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏら：Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏ ｐａｔｈｏｌ．，１
１，１−１９（１９８６） １５．モダンバイオロジーシリーズ２３、動物組織培養
法（１９７６）Ｐ２９６−３００、共立出版 １６．Ｉｊｚｅｒｍａｎｎｓら：Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ，１７９，４５６−４７３（１９８９）

【００５４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GAATTCATGAATTATACAAGCTATATCTTAGC

【００５５】配列番号：２ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GCGAATTCTTATTTCGATGCTCTGCGGCCTCGAAA

【００５６】配列番号：３ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATGAATTATACAAGCTATATCTTAGCT

【００５７】配列番号：４ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ATCAACAACGCACAGAATCTAACGCT

【００５８】配列番号：5 配列の長さ：501 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：イヌ 配列の特徴 特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：1..72 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：73..498 特徴を決定した方法：S 配列 ATG AAT TAT ACA AGC TAT ATC TTA GCT TTT CAG CTT TGC GTG ATT TTG 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu TGT TCT TCT GGC TGT AAC TGT CAG GCC ATG TTT TTT AAA GAA ATA GAA 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu AAC CTA AAG GAA TAT TTT AAT GCA AGT AAT CCA GAT GTA TCG GAC GGT 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Asn Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly GGG TCT CTT TTC GTA GAT ATT TTG AAG AAA TGG AGA GAG GAG AGT GAC 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp AAA ACA ATC ATT CAG AGC CAA ATT GTC TCT TTC TAC TTG AAA CTG TTT 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe GAC AAC TTT AAA GAT AAC CAG ATC ATT CAA AGG AGC ATG GAT ACC ATC 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile AAG GAA GAC ATG CTT GGC AAG TTC TTA AAT TCA TCC ACC AGT AAG AGG 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Asn Ser Ser Thr Ser Lys Arg GAG GAC TTC CTT AAG CTG ATT CAA ATT CCT GTG AAC GAT CTG CAG GTC 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val CAG CGC AAG GCG ATA AAT GAA CTC ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTC TCA 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser CCA AGA TCC AAC CTA AGG AAG CGG AAA AGG AGT CAG AAT CTG TTT CGA 480 Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe Arg GGC CGC AGA GCA TCG AAA TAA 501 Gly Arg Arg Ala Ser Lys ***

【００５９】配列番号：6 配列の長さ：501 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：イヌ 配列の特徴 特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：1..72 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：73..498 特徴を決定した方法：S 配列 ATG AAT TAT ACA AGC TAT ATC TTA GCT TTT CAG CTT TGC GTG ATT TTG 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu TGT TCT TCT GGC TGT AAC TGT CAG GCC ATG TTT TTT AAA GAA ATA GAA 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu AAC CTA AAG GAA TAT TTT CAG GCA AGT AAT CCA GAT GTA TCG GAC GGT 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly GGG TCT CTT TTC GTA GAT ATT TTG AAG AAA TGG AGA GAG GAG AGT GAC 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp AAA ACA ATC ATT CAG AGC CAA ATT GTC TCT TTC TAC TTG AAA CTG TTT 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe GAC AAC TTT AAA GAT AAC CAG ATC ATT CAA AGG AGC ATG GAT ACC ATC 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile AAG GAA GAC ATG CTT GGC AAG TTC TTA CAG TCA TCC ACC AGT AAG AGG 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg GAG GAC TTC CTT AAG CTG ATT CAA ATT CCT GTG AAC GAT CTG CAG GTC 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val CAG CGC AAG GCG ATA AAT GAA CTC ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTC TCA 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser CCA AGA TCC AAC CTA AGG AAG CGG AAA AGG AGT CAG AAT CTG TTT CGA 480 Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe Arg GGC CGC AGA GCA TCG AAA TAA 501 Gly Arg Arg Ala Ser Lys ***

【００６０】配列番号：7 配列の長さ：441 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：イヌ 配列の特徴 特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：1..72 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：73..438 特徴を決定した方法：S S 配列 ATG AAT TAT ACA AGC TAT ATC TTA GCT TTT CAG CTT TGC GTG ATT TTG 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu TGT TCT TCT GGC TGT AAC TGT CAG GCC ATG TTT TTT AAA GAA ATA GAA 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu AAC CTA AAG GAA TAT TTT CAG GCA AGT AAT CCA GAT GTA TCG GAC GGT 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly GGG TCT CTT TTC GTA GAT ATT TTG AAG AAA TGG AGA GAG GAG AGT GAC 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp AAA ACA ATC ATT CAG AGC CAA ATT GTC TCT TTC TAC TTG AAA CTG TTT 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe GAC AAC TTT AAA GAT AAC CAG ATC ATT CAA AGG AGC ATG GAT ACC ATC 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile AAG GAA GAC ATG CTT GGC AAG TTC TTA CAG TCA TCC ACC AGT AAG AGG 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg GAG GAC TTC CTT AAG CTG ATT CAA ATT CCT GTG AAC GAT CTG CAG GTC 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val CAG CGC AAG GCG ATA AAT GAA CTC ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTC TCA 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser CCA AGA TAA 441 Pro Arg ***

【００６１】配列番号：8 配列の長さ：453 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：イヌ 配列の特徴 特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：1..72 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：73..450 特徴を決定した方法：S S 配列 ATG AAT TAT ACA AGC TAT ATC TTA GCT TTT CAG CTT TGC GTG ATT TTG 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu TGT TCT TCT GGC TGT AAC TGT CAG GCC ATG TTT TTT AAA GAA ATA GAA 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu AAC CTA AAG GAA TAT TTT CAG GCA AGT AAT CCA GAT GTA TCG GAC GGT 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly GGG TCT CTT TTC GTA GAT ATT TTG AAG AAA TGG AGA GAG GAG AGT GAC 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp AAA ACA ATC ATT CAG AGC CAA ATT GTC TCT TTC TAC TTG AAA CTG TTT 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe GAC AAC TTT AAA GAT AAC CAG ATC ATT CAA AGG AGC ATG GAT ACC ATC 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile AAG GAA GAC ATG CTT GGC AAG TTC TTA CAG TCA TCC ACC AGT AAG AGG 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg GAG GAC TTC CTT AAG CTG ATT CAA ATT CCT GTG AAC GAT CTG CAG GTC 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val CAG CGC AAG GCG ATA AAT GAA CTC ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTC TCA 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser CCA AGA TCC AAC CTA AGG TAA 453 Pro Arg Ser Asn Leu Arg ***

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の紫外線照射装置の構成を示す図であ
る。

【符号の説明】

１ 紫外線照射装置本体 ２ 殺菌灯 ３ ケーシング ４ ポンプ ５ バキュウロウイルスの入った昆虫体液

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 7/04 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｆ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 38/21 ＡＤＵ 37/66 ＡＤＵＢ ＡＤＹ ＡＤＹＢ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:92）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 組換えバキュロウイルスを感染させた昆
   虫培養細胞の培養上清、または、組換えバキュロウイル
   スを感染させたカイコ幼虫の体液に流通式で紫外線を照
   射することを特徴とする有用蛋白質の製造方法。
2. 【請求項２】 有用蛋白質がイヌインターフェロン-
   γ、ネコインターフェロン-ω、イヌインターロイキン-
   １２またはヒトインターフェロンであることを特徴とす
   る請求項１記載の有用蛋白質の製造方法。
3. 【請求項３】イヌインターフェロン-γが配列番号５か
   ら８のいずれかに示したアミノ酸配列からなるポリペプ
   チドであることを特徴とする請求項２記載の有用蛋白質
   の製造方法。
4. 【請求項４】 組換えバキュロウイルスを感染させた昆
   虫培養細胞または組み替えバキュロウイルスを感染させ
   たカイコ幼虫の体液に金属キレート剤を添加することを
   特徴とする請求項１〜３に記載の有用蛋白質の製造方
   法。
5. 【請求項５】 紫外線の波長が２００〜３００ｎｍであ
   ることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の
   有用蛋白質の製造方法。
6. 【請求項６】 金属キレート剤がエチレンジアミン四酢
   酸二ナトリウムであることを特徴とする請求項１から５
   のいずれか１項記載の有用蛋白質の製造方法。
7. 【請求項７】 金属キレート剤を、組換えバキュロウイ
   ルスを感染させた昆虫培養細胞の培養上清または組換え
   バキュロウイルスを感染させたカイコ幼虫の体液に対し
   て、０．１ｍＭ〜１００ｍＭ添加することを特徴とする
   請求項１から６のいずれか１項記載の有用蛋白質の製造
   方法。
8. 【請求項８】 金属キレート剤を、組換えバキュロウイ
   ルスを感染させた昆虫培養細胞の培養上清または組換え
   バキュロウイルスを感染させたカイコ幼虫の体液に対し
   て、１ｍＭ〜１０ｍＭ添加することを特徴とする請求項
   ７記載の有用蛋白質の製造方法。
9. 【請求項９】 組換えバキュロウイルスが、イヌインタ
   ーフェロン-γ、ネコインターフェロン-ω、イヌインタ
   ーロイキン-１２またはヒトインターフェロンの蛋白質
   をコードするＤＮＡにより、遺伝子組換えされた組換え
   カイコ核多角体病ウイルスであることを特徴とする請求
   項１から８のいずれか１項記載の有用蛋白質の製造方
   法。