JP2002241398A

JP2002241398A - 新規なイヌサイトカインタンパク質

Info

Publication number: JP2002241398A
Application number: JP16193697A
Authority: JP
Inventors: Takayuki Imamura; 隆幸今村; Hiroaki Maeda; 浩明前田; Yukio Tokiyoshi; 幸男時吉; Yasuyuki Eda; 康幸江田
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1997-06-03
Filing date: 1997-06-03
Publication date: 2002-08-28
Also published as: WO1998055511A1; AU7450998A

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明はイヌ細胞障害性Tリンパ細胞の細胞
障害活性を増強する活性を有し、イヌのウイルス性疾患
の治療薬として有用である新規なイヌサイトカインタン
パク質を提供する。【構成】イヌ細胞障害性Tリンパ細胞の細胞障害活性
を増強する活性を有し、異なる２種のポリペプチドから
なる新規イヌサイトカインタンパク質、該タンパク質を
コードするＤＮＡ配列及びその発現のための組換えＤＮ
Ａ、該組換えＤＮＡを含む発現ベクター、該発現ベクタ
ーで形質転換した形質転換体、該形質転換体を培養する
ことによる該タンパク質の製造方法、該蛋白質に対する
抗体、該抗体又は該タンパク質を主成分とするイヌウイ
ルス性疾患の治療剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なポリペプチ
ド、そのホモダイマー又はヘテロダイマーからなる新規
タンパク質、それをコードする新規ＤＮＡ、該ＤＮＡを
含む組換えＤＮＡ分子、該組換えＤＮＡ分子で形質転換
した形質転換体、該新規ポリペプチド又は新規タンパク
質に対する抗体、該新規ポリペプチド又は新規タンパク
質の製造方法、及び該新規タンパク質又は該抗体を含有
するイヌウイルス性疾患の治療剤に関する。さらに詳細
には、イヌ細胞障害性Tリンパ細胞を活性化してウイル
ス感染細胞を障害せしめる活性をもつ異なる２種の新規
なポリペプチドからなるイヌサイトカインタンパク質及
び該サイトカインタンパク質をコードする遺伝子並びに
イヌサイトカインタンパク質の製造方法に関する。

【０００２】

【従来技術】イヌはペットとして昔から人間に愛着のあ
る動物であるが、最近では「伴侶、仲間、相棒としての
動物」として人間社会の一員としての地位が確立しつつ
ある。また、警察犬、盲導犬等のように必要不可欠な動
物としても社会的に貢献している。一方、医学、薬学、
獣医学、心理学などで従来から実験動物として使用され
ており、最近では医薬品の安全性試験、効果検定にも使
用されるようになってきている。このようにイヌの社会
的重要性が高まっている状況の中では、イヌの疾病、特
に伝染病に対する関心が高く、その有効な治療法が望ま
れている。

【０００３】イヌのウイルス性疾患は多く、中でもイヌ
ジステンパーウイルス、イヌパルボウイルス、イヌ伝染
性肝炎ウイルス等の疾患は急性で致死率が高い。これら
のウイルス性疾患に対して、予防薬としてのワクチンが
開発されているものの、一旦、感染・発症したイヌに対
しては、ワクチンの治療効果は低く、抗生物質、サルフ
ァ剤等の二次細菌感染予防や、ビタミン剤や栄養剤によ
る対処療法が主たる療法として行われている。すなわ
ち、ウイルス性疾患に対する有効な治療薬は現在ほとん
どない状態である。

【０００４】ウイルスに限らず、微生物に対する宿主の
免疫は、大まかに抗体による液性免疫と免疫リンパ球に
よる細胞性免疫に分けられる。細胞性免疫は感染後7〜1
0日くらいをピークにその後速やかに減退していく。こ
れに対し、抗体産生の方は1週間以後に上昇し始め、3〜
4週頃最高に達し、その後緩慢に減退していく。中和抗
体はウイルスの感染初期や受動免疫に有効であるため、
予防を目的としたワクチン開発の主眼は中和抗体を如何
に産生させるかにある。しかし、感染が成立した後では
感染の進行と共に中和抗体の有効性が失われているのが
一般的である。さらに、ウイルスが細胞内にとどまっ
て、細胞から細胞へと感染する持続感染の場合(例え
ば、ヘルペスウイルス)や、ウイルスが感染後も変異し
やすく、次々に中和抗体に対して抵抗性を持つようにな
る場合(例えば、免疫不全ウイルス)などには、中和抗体
は余り有効でない。そのような場合には細胞性免疫が有
効であると考えられており、その主体はウイルス感染細
胞を発見し破壊除去することができる細胞障害活性Tリ
ンパ細胞である。一般的に感染が進行し重篤になった時
期には細胞障害活性も低下する傾向にあり、病状の進行
を早めてしまう結果になる。その際、細胞障害活性Tリ
ンパ細胞を活性化することができれば、病状の進行をく
い止め、回復を促すことができると考えられる（A.Capr
on et al.Current Topics in Microbiology and Immuno
logy 189 Springer-Verlag,1994）。

【０００５】ヒトでは末梢から細胞障害性Tリンパ細胞
を回収し、in vitroで非特異的に活性化して、生体内に
戻す療法が行われているが、イヌはヒトに比べてはるか
に小さいために有効な数の細胞障害性Tリンパ細胞を末
梢から回収することはできず、この療法を行うことはで
きない。すなわち、現状では、イヌ細胞障害性Tリンパ
細胞を活性化してウイルス性疾患を治療するための有効
な方法は見出されていない。このように、ウイルス感染
症の治癒における細胞性免疫の重要性が示唆されている
中、イヌのウイルス性疾患において細胞性免疫とりわけ
細胞障害性Tリンパ球を活性化する治療薬は現在まで報
告されていない。

【０００６】リンパ球細胞の活性化にはサイトカインの
関与が考えられる。現在イヌ由来のサイトカインとして
報告されているものにはエリスロポエチン（D.Wen et a
l .BloodVol. 82, 1507-1516 ,1993）、顆粒球コロニー
刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）(F.G.Schuening et al. Blood
Vol.81,20-26,1993)などが挙げられる。しかし、今のと
ころこれらのサイトカインが細胞障害性Tリンパ球を活
性化するという報告はない。一方、T細胞を活性化しγ
インターフェロン誘導能を示したり、細胞障害性T細胞
を活性化する因子として、すでにヒト及びマウスではIL
12が知られている。現在までにクローニングされたヒト
及びマウスのIL12は,アルファ鎖(p35)とベータ鎖(p40)
からなるヘテロダイマーで活性を示すことが知られてい
る(Annu.Rev.Immunol.Vol.13,251-276,1995)。更にヒト
とマウスではIL12としての活性は種特異性を示すことが
報告されている。(S.F.Wolf et al. J.Immunol.Vol.13
6,3074-3081,1991) 従って現段階でイヌについては細胞
障害性T細胞を活性化するサイトカインについての報告
はないといえる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、イヌ
細胞障害性Tリンパ細胞の細胞障害活性を増強する新規
イヌサイトカインタンパク質及びその一部のアミノ酸配
列を含むポリペプチドを提供することにある。

【０００８】また、本発明の他の目的は、イヌ細胞障害
性Tリンパ細胞の細胞障害活性を増強する新規イヌサイ
トカインタンパク質及びその一部のアミノ酸配列を含む
ポリペプチドをコードする遺伝子並びにその遺伝子を発
現させるための組換えベクターを提供することにある。

【０００９】本発明の更に他の目的は、上記組換えベク
ターで形質転換された微生物および動物細胞から、イヌ
細胞障害性Tリンパ細胞の細胞障害活性を増強する新規
イヌサイトカインタンパク質及びその一部のアミノ酸配
列を含むポリペプチドを製造する方法を提供することに
ある。

【００１０】本発明の更に他の目的は、イヌ細胞障害性
Tリンパ細胞の細胞障害活性を増強する新規イヌサイト
カインタンパク質を主成分とするイヌウイルス性疾患の
治療剤を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために鋭意研究を重ね、報告されたヒトのIL
12cDNA(S.F.Wolf J.Immunology Vol. 146,3074-3081,1
991)を用いて、イヌの脾臓cDNAライブラリーをスクリー
ニングし、イヌのIL12に相当するものを得ようと、２０
０万プラークのイヌcDNAライブラリーのスクリーニング
を行ったが、目的の遺伝子は得られなかった。一方、本
発明者らは、活性化したネコの脾臓細胞の培養上清中
に、ネコリンパ球（特に、細胞障害性Tリンパ球：CTL）
の細胞障害活性を増強するタンパク性因子（新規ネコサ
イトカインタンパク質ＦＬＡＦ）を発見し、該タンパ
ク質が異なる２種のポリペプチドからなることを明らか
にし（分子量約40,000のポリペプチドをFLAFp40、分子
量約35,000のポリペプチドをFLAFp35と称する）、更に
ＦＬＡＦをコードする核酸塩基配列を明らかにした（特
願平８−１６５２４９）。ウェン（D.Wen）の報告によ
ると(Blood Vol. 82, 1507-1516 ,1993) 各動物種間の
エリスロポエチンのアミノ酸配列は、イヌとネコの間の
ホモロジーは９５％であり、イヌとヒトとのホモロジー
８４％と比べても有意に高いと言える。そこで本発明者
らは、ヒトのIL12に相当するものと思われる上記ＦＬＡ
Ｆをコードする遺伝子をプローブとして用い、ＦＬＡＦ
に相当するイヌ型のサイトカインタンパク質（ＣＬＡ
Ｆ）をコードする遺伝子の単離を試み、これに成功し
た。さらに遺伝子工学技術を応用し、該遺伝子を動物細
胞にて発現させ、得られた新規イヌサイトカインタンパ
ク質がヒト抹消血リンパ細胞からのγインターフェロン
誘導活性を有することを見い出し、本発明を完成するに
至った。本発明者等が見いだしたＦＬＡＦは、細胞障害
性Tリンパ細胞の増強活性を有すること、及び、ウイル
ス感染に対する症状軽減効果を示すことから、ＣＬＡＦ
も同様にこれらの活性を有することは容易に想像でき
る。

【００１２】すなわち、本発明の目的は、配列表の配列
番号：１又は配列番号：２に記載のアミノ酸配列によっ
て特徴づけられる分子量約40,000のタンパク質（以下、
CLAFp40と称することがある）及び配列番号：３又は配
列番号：４に記載のアミノ酸配列によって特徴づけられ
る分子量約35,000のタンパク質（以下、CLAFp35と称す
ることがある）あるいは上記蛋白質の一部のアミノ酸配
列を含有するペプチドによって達成される。

【００１３】また、本発明は、上記の新規イヌサイトカ
インタンパク質をコードし、CLAFp40に対しては配列番
号：５又は６に記載の塩基配列、またCLAFp35に対して
は配列番号：７又は８に記載の塩基配列で示される遺伝
子断片あるいは該タンパク質の一部のアミノ酸配列を含
有するペプチドをコードする遺伝子断片並びにこれらの
遺伝子断片を含む組換えＤＮＡ分子を包含する。

【００１４】更に、上記組換えＤＮＡ分子を含むプラス
ミドなどの発現ベクターによって形質転換された組換え
微生物および動物細胞を包含する。また、これらの形質
転換体を用いて、目的とする新規イヌサイトカインタン
パク質又はその一部のアミノ酸配列を含むペプチドを製
造する方法を包含する。以下本発明について更に詳述す
る。

【００１５】CLAFp40およびCLAFp35遺伝子のクローン化
は、マニアチス（Maniatis）ら（Molecular cloning, A
Laboratory Manual 2nd.ed.12.30, Cold Springs Harb
or Laboratory Press,N.Y.,1989）が述べているような
一般的なmRNAの調製方法及びcDNAクローニング方法で対
応できる。すなわち、リンパ球刺激物の存在下で培養し
たイヌ由来のリンパ球細胞から全RNAを調整し、これを
材料にしてcDNA ライブラリーを作製し、この中から、F
LAFp40及びFLAFp35をコードする遺伝子断片をプローブ
としてCLAFp40及びCLAFp35遺伝子をスクリーニングする
ことができる。リンパ球刺激物としては、フィトヘマグ
ルチニン、コンカナバリンA、リポ多糖類、ポークウィ
ードマイトジェンが挙げられるが、とりわけポークウィ
ードマイトジェン（PWM）が好ましい。また、イヌ由来
のリンパ球細胞としては、脾臓細胞、末梢血単核細胞、
ある種の血液癌細胞等が挙げられるが、とりわけイヌ脾
臓細胞を用いるのが好ましい。

【００１６】かくしてクローニングされたCLAFp40cDNA
及びCLAFp35cDNAの塩基配列は、DNAシークエンサー（Mo
del 1373A）により決定することができる。また、上記
のcDNAの新規性は、その全塩基配列と既存のデータベー
ス（例えば、GenBank、SWISS-PROTなど）とのホモロジ
ー検索を行うことにより確認できる。

【００１７】完全長のCLAFp40cDNA及びCLAFp35cDNAある
いはＣＬＡＦタンパク質の構造領域の一部をコードする
cDNA断片を、適当な発現ベクターに組み込み、これを用
いて適当な微生物又は動物細胞を形質転換し、形質転換
体を培養することにより、ＣＬＡＦ又はその一部の蛋白
質を生産することができる。ＣＬＡＦ蛋白の一部を生産
する場合は、ペプチド合成機を利用することもできる。

【００１８】本発明のタンパク質をコードするDNAの上
流に、分泌のための微生物用又は動物細胞用の適当なシ
グナル配列を接続すれば、該タンパク質を培地中に分泌
発現させることも可能である。このように分泌型に改変
したcDNAは、培地中に分泌した該タンパク質を容易に回
収できる点で有用である。シグナル配列としては、大腸
菌用としてpel Bシグナル(S.P Lei et al.J. Bacteriol
ogy Vol .169, 4379-4383, 1987)、酵母用としてαfact
orのシグナル(A.J.Brake, Yeast Genetic Engineering,
p269 Butterworth,1989)、動物細胞用としてイムノグロ
ブリンのシグナルSG-1(H.Maeda et al. Hum.Antibod. H
ybridomas Vol.2,124-134,1991), C25のシグナル(特
許、国際公開番号WO 94/20632) などが挙げられる。

【００１９】発現ベクターとしては、プラスミド、ウイ
ルスベクター等を用いることができる。該発現ベクター
に含まれるプロモーターは、宿主として用いる微生物又
は動物細胞との組み合わせにより、SV40初期、SV40後
期、βアクチンなど、最終的に活性型のＣＬＡＦタンパ
ク質が得られるのであればどのようなものでも良い。マ
ーカー遺伝子として、微生物細胞用発現ベクターを用い
る場合は、宿主として大腸菌を用いる場合にはアンピシ
リン耐性遺伝子又はテトラサイクリン耐性遺伝子など
が、宿主として酵母を用いる場合にはLeu2遺伝子などが
利用される。また、動物細胞用発現ベクターを用いる場
合にはアミノグリコシド3'ホスホトランスフェラーゼ(n
eo)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子又はグ
ルタミン合成酵素(GS)遺伝子などを利用できる。そのよ
うな発現ベクターの一例としてpCAGn-mcs polyAを図３
に示す。選択用添加物質としては、G-418、メソトレキ
セート等が例示される。

【００２０】動物細胞用の発現ベクターの場合、宿主細
胞として、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、マ
ウスミエローマ細胞又はCOS細胞など様々な細胞が利用
可能である。このようにして構築したCLAFp35cDNA発現
ベクター及びCLAFp40cDNA発現ベクターの組み合わせで
ＣＬＡＦを、例えば、COS7細胞(アフリカミドリザル由
来)を宿主として一時的発現および、SFT34細胞（特許、
国際公開番号WO 94/12658)又はCHO細胞を宿主として安
定的発現させることができる。

【００２１】宿主細胞の形質転換は公知の方法、例え
ば、燐酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、リポフェ
クチン等を用いる沈殿法、プロトプラストポリエチレン
融合法、エレクトロポレーション法などが利用でき、用
いる宿主細胞により適当な方法を選択すればよい。

【００２２】本発明の新規イヌサイトカインタンパク質
は、以下の方法により製造される。上記の安定的発現を
させた細胞を通常のリンパ球培養条件、例えば、選択マ
ーカとしてネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、
1 mg/mlのG-418及び10％FCSを含有するRPMI培地で培養
し、G-418耐性細胞を得た後、インターフェロン誘導活
性を指標とする限界希釈法により、ＣＬＡＦを生産する
形質転換細胞をスクリーニングする。該ＣＬＡＦ産生形
質転換細胞を大量培養し、回収したその培養上清から、
インターフェロン誘導活性を指標にした前述の方法によ
り、新規イヌサイトカインタンパク質を製造することが
できる。

【００２３】かくして得られる新規なイヌサイトカイン
タンパク質は、イヌ細胞障害性Tリンパ細胞の細胞障害
活性を増強する活性を有するものである。該新規イヌサ
イトカインタンパク質は、イヌのウイルス性疾患治療剤
又は抗癌剤として、単独であるいは薬剤として投与可能
な適当な担体、希釈液又は安定剤を添加することによ
り、注射剤、経口剤、坐薬、点眼剤等の任意慣用の方法
で医薬品に使用される。

【００２４】本発明の新規イヌサイトカインタンパク質
は、イヌのウイルス性疾患、例えば、イヌジステンパー
ウイルス、イヌパルボウイルス、イヌ伝染性肝炎ウイル
スなどのウイルス感染症の治療に用いることができる。
また、細胞傷害性Tリンパ球を活性化することから抗腫
瘍剤として使用することができる。

【００２５】上述の新規イヌサイトカインタンパク質及
びその一部のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、今や
常法となっている方法により、ポリクローナル抗体及び
モノクローナル抗体を作製するための免疫原として使用
される。また、上記ポリペプチドをコードする遺伝子も
しくはその一部を組み込んだ発現ベクターは、該ベクタ
ーを通常の方法に従って動物体内に導入し、該動物体内
で発現させることにより、前記ポリペプチドに対する抗
体を作製するために使用される。かくして得られる新規
イヌサイトカインタンパク質及びその一部のアミノ酸配
列を含むポリペプチドとの結合能を有する抗体並びに該
タンパク質又はポリペプチドは、ウエスタンブロット
法、ELISA法などの抗原検出系に利用することができ、
診断薬を構築する材料となる。また、上記の抗体を適当
な担体に結合させ、これを用いたアフィニティークロマ
トグラフィーにより、上記の抗原タンパク質を精製する
ことができる。

【００２６】

【発明の効果】本発明によると、γインターフェロン誘
導活性を示すCLAFp35およびCLAFp40のヘテロダーマーの
タンパク質並びにそれぞれのタンパク質をコードするcD
NAが提供される。

【００２７】今回、本発明者が見出したＣＬＡＦは、こ
れまでにイヌでは見出されていない新規タンパク質であ
り、イヌリンパ球を活性化してウイルス感染細胞を破壊
させる活性を持つ分子を構成している重要なサブユニッ
トである。このように、活性を持ったＣＬＡＦをコード
した遺伝子の単離、発現ベクター構築及び安定発現細胞
の作製など、ＣＬＡＦを実用化するための技術的な問題
は本発明により解決され、イヌ感染症治療薬としての工
業レベルでの製造が可能になった。

【００２８】また、本発明のＣＬＡＦは特定のウイルス
に特異的な因子ではないので、ほとんどのウイルスに適
応することが可能である。そのような対象ウイルスの候
補として、イヌジステンパーウイルス、イヌパルボウイ
ルス、イヌ伝染性肝炎ウイルス等があげられる。

【００２９】また、CTLを活性化することから、組織適
合系クラスI抗原を介する免疫反応には全て応用するこ
とが可能である。そのような例として抗腫瘍効果なども
期待できる。以下に、実施例をあげて本発明をさらに具
体的に説明する。なお、以下に示す実施例では、特に断
りのない限り、和光純薬、宝酒造、東洋紡およびNew En
gland BioLabs社製の試薬を使用した。

【００３０】

【実施例】実施例１ cDNAライブラリーのスクリーニン
グに用いるプローブの調製ＣＬＡＦ遺伝子をクローニングするためのプローブとし
ては、ヒトIL12遺伝子あるいはＦＬＡＦ遺伝子が考えら
れる。そこで、ヒトIL12遺伝子及びＦＬＡＦ遺伝子がイ
ヌ遺伝子とどの程度反応性を有するかをゲノミックサザ
ン法に従って検討した。まず、ヒトゲノミックＤＮＡを
ヒト末梢血リンパ球より、イヌゲノミックＤＮＡをイヌ
肝臓より、また、ネコゲノミックＤＮＡをネコ肝臓よ
り、Molecular cloning, A Laboratory Manual（2nd.e
d.9.16,Cold Springs Harbor Laboratory Press,N.Y.,1
989）に記載の方法に従って調製した。これらのＤＮＡ
１０μｇを制限酵素BamHI、EcoRI及びHindIIIで消化
後、Molecular cloning, A Laboratory Manual（2nd.e
d.9.31,Cold Springs Harbor Laboratory Press,N.Y.,1
989）に記載の方法に従ってサザンブロット解析を行っ
た。まず、イヌとヒトのゲノミックＤＮＡが転写された
ナイロンフィルターに対して、ウルフ（S.F.Wolf）等
（J.Immunology,Vol.146, p3074-3081,1991）が報告し
たヒトIL12のp35及びp40cDNA部分をプローブとして解析
を行った結果、図１に示すように、イヌのゲノミックＤ
ＮＡは、ヒトIL12のp35及びp40cDNA部分と弱く反応し
た。一方、イヌとネコのゲノミックＤＮＡが転写された
ナイロンフィルターに対して、本発明者らによりクロー
ニングされたFLAFp35およびFLAFp40のcDNAをプローブと
して解析を行ったところ、図２に示すように、イヌのゲ
ノミックＤＮＡはネコのゲノミックＤＮＡと同程度の反
応性を示した。これらのことは、ＣＬＡＦ遺伝子をクロ
ーニングするときのプローブとしては、FLAFp35及びFLA
Fp40のcDNAの方が好ましいことを示している。事実、ヒ
トIL12のp35及びp40cDNAをプローブとしたcDNAライブラ
リーのスクリーニングでは、２００万プラーク中、全く
陽性クローンは得られなかった。以上のことから、ＣＬ
ＡＦ遺伝子のクローニングに用いるプローブとして、本
発明者等によりクローニングされたFLAFp35及びFLAFp40
のcDNAを用いた。CLAFp35cDNAのクローニングにあたっ
ては、出願人により寄託されているプラスミド(pFLAF2
0)［微工研菌寄第P-15583号］のFLAFp35をコードする領
域を用いた。また、CLAFp40cDNAのクローニングにあた
っては、出願人により寄託されているプラスミド(pFLAF
12)［微工研菌寄第P-15584号］のFLAFp40をコードする
領域を用いた。

【００３１】実施例２ CLAFp35cDNAのクローニング CLAFp35cDNAのクローニングは、活性化イヌ脾臓cDNAラ
イブラリーから行った。cDNAライブラリーは以下のよう
にして調製した。まず、イヌの脾臓細胞(0.01%PWM存在
下18hr.培養、3X10⁸個)よりISOGEN試薬(ニッポンジーン
社)とそのプロトコールに従って全RNAを調製した。この
全RNAよりpoly(A) quik kit(STRATAGENE社)を用いてpol
yAを有するRNA（polyA⁺RNA）を調製した。このpolyA⁺RN
AよりUni-ZAP XRベクターキット(STRATAGENE社)とその
プロトコールに従ってイヌ脾臓cDNAライブラリーを作製
した。プローブは先に述べた、プラスミド(pFLAF20)のF
LAFp35をコードする領域を用いた。このプローブを用い
てMolecular cloning, A Laboratory Manual (2nd.ed.
8.46, Cold Springs Harbor Laboratory Press,N.Y.,19
89)に記載の方法に従って、２００万プラークのスクリ
ーニングを行ったところ、2個の陽性プラークを得た。
これらのクローン（クローン７、１０）の制限酵素パタ
ーンを制限酵素EcoRI,BamHI,EcoRV,XbaIを用いて比較し
たところ、全く同じパターンを示したことから、この２
つのクローンは同じものと考えられた。そこで、クロー
ン７が有するプラスミド（pCLAF7）についてインサート
部分（約１.３ｋｂ）の全塩基配列を決定した。塩基配
列の決定はアプライドバイオシステムズ社のDye Primer
Cycle Sequencingキット(T7/SP6および-21/RP)を用い
てModel373A DNAシークエンサーで行った。明らかにな
った塩基配列からオープンリーディングフレームを求め
たところ、FLAFp35のアミノ酸残基数と全く同じ数のア
ミノ酸残基からなるタンパク質のコード領域が認められ
た。さらに、このタンパク質のアミノ酸配列はFLAFp35
とアミノ酸レベルで９１％の高いホモロジーを示した事
から、このクローン７は、CLAFp35のcDNAの全長を含む
と考えられる。なおこのクローン７に認められたプラス
ミド（pCLAF7）を有する大腸菌ＣＬＡＦ７は、ブダペス
ト条約に基づき、平成９年５月２０日付工業技術院生命
工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＰ−１６２３
５として出願人により寄託されている。

【００３２】実施例３ CLAFp40cDNAのクローニング次に、実施例２で作製した活性化イヌ脾臓cDNAライブラ
リーを用いて、CLAFp40cDNAのクローニングをおこなっ
た。プローブは先に述べた、プラスミド(pFLAF12)のFLA
Fp40をコードする領域を用いた。実施例２で示した方法
に従って、２００万プラークのスクリーニングを行った
ところ、１個の陽性プラークを得た。このクローンが有
するプラスミド（pCLAF5）についてインサート部分（約
２.２ｋｂ）の全塩基配列を前記と同様の方法により決
定した。明らかになった塩基配列からオープンリーディ
ングフレームを求めたところ、FLAFp40のアミノ酸残基
数より１個多いアミノ酸残基からなるタンパク質のコー
ド領域が認められた。さらに、このタンパク質のアミノ
酸配列はFLAFp40とアミノ酸レベルで９２％の高いホモ
ロジーを示した事から、このpCLAF5は、CLAFp40のcDNA
の全長を含むと考えられる。なお、pCLAF5を有する大腸
菌ＣＬＡＦ５は、ブダペスト条約に基づき、平成９年５
月２０日付工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番
号ＦＥＲＭＰ−１６２３４として出願により寄託されて
いる。

【００３３】実施例４ CLAFp35とCLAFp40の発現プラス
ミドの構築実施例２および３で得られた完全長のCLAFp35とCLAFp40
のcDNAを適当な動物細胞用発現ベクターに組み込み、そ
の発現実験を行った。発現ベクターにはpCAGn-mcs poly
A(図３)を用いた。pCAGn-mcs polyAベクターは発現調
節領域として、ヒトサイトメガロウイルスエンハンサー
およびニワトリβアクチンプロモーター、ウサギβグロ
ビンスプライシングシグナルを持つものである。CAGエ
ンハンサー・プロモーターのSalI-EcoRI断片(H. Niwaら
Gene, 108, 193 (1991))を平滑末端化し、pBluescript
II SK+ベクターのEcoRVサイトに挿入して両端をそれぞ
れEcoRI-HindIIIサイトに変換し、pUC18ベクターのEcoR
I-HindIIIサイトに挿入した。このプラスミドよりEcoRI
-BamHI断片を調製し、HindIIIサイトを欠失させたpSV2n
eoベクター(P. J. Southern et al., J. Mol. Appl. Ge
net., 1, 327 (1982))のEcoRI-BamHIサイトに挿入し、
さらにpCB25γSD/BcBgプラスミド(特開平3-201986)由来
のBamHI-BglIIのpolyA付加シグナルを含むDNA断片をBam
HIサイトに挿入してpCAGn-mcs polyAベクターを構築し
た。実施例２で得られたCLAFp35のcDNAをpCLAF7より制
限酵素PstIおよびXhoIで切り出し、T4DNApolymeraseを
用いて切断部位を平滑末端にした。ついで、制限酵素Sa
lIで切断しT4DNApolymeraseを用いて平滑末端に処理
し、さらにBacterial Alkaline Phosphataseを用いて5'
端のリン酸を除いたCAGn-mcs poly Aベクターに、このC
LAFp35cDNA断片をT4ligaseを用いて結合させ、CLAFp35
発現プラスミド（CAGcp35）を構築した。次にCLAFp40の
発現プラスミドを構築するために、実施例３で得られた
CLAFp40のcDNAをpCLAF5より制限酵素BamHIおよびXhoIで
切り出し、T4DNApolymeraseを用いて切断部位を平滑末
端にした。ついで、このＤＮＡ断片を、CLAFp35発現プ
ラスミドの構築に用いたCAGn-mcs poly Aベクターに、T
4ligaseを用いて結合させ、CLAFp40発現プラスミド（CA
Gcp40）を構築した。

【００３４】実施例５ COS細胞を宿主とした発現実験ＦＬＡＦの場合、FLAFp35とFLAFp40の両方の発現プラス
ミドを同時に動物細胞に導入することで、ガンマインタ
ーフェロン誘導活性を示すＦＬＡＦの発現が確認され
た。そこで、実施例４で得られたCAGcp35もしくはCAGcp
40を単独で、又は両方の発現プラスミドを同時に、リポ
フェクトエース試薬(GIBCO,BRL)を用いてCOS7（ATCC N
o. CRL1651）細胞に導入し、その一時発現を試みた。ト
ランスフェクトの前日(20時間前)にCOS7細胞を6ウェル
プレート1穴あたり2x10⁵個播き込み、翌日、リポフェク
トエース試薬と発現プラスミド(1ウェル当たり1μg)を
混合後、室温で15分放置し、COS7細胞上に添加し、さら
に無血清培地Opti-MEM(Gibco BRL)を2ml添加した。翌
日、無血清培地(ASF104、味の素株式会社)を添加し、さ
らに2日間培養を行ない、培養上清を回収し、その培養
上清中に存在するヒトPBMCに対するγインターフェロン
誘導活性を測定した。その結果、それぞれの発現プラス
ミドを単独で導入したものでは、陰性対照として用いた
pCAGn-mcs polyAをトランスフェクトしたウェルの培養
上清と同様に、全くγインターフェロン誘導活性は認め
られなかったが、CAGcp35とCAGcp40の両方の発現プラス
ミドを同時に導入したものでは、γインターフェロン誘
導活性が認められた(図４）。以上の事から、本発明のC
LAFp35とCLAFp40はヘテロダーマーの形でγインターフ
ェロン誘導活性を示すことが明らかとなった。ＣＬＡＦ
はアミノ酸配列のホモロジーの高さから、ＦＬＡＦのイ
ヌのＦＬＡＦに相当するものと考えられる。ＦＬＡＦ
は、本発明者らによりCTL活性を増強することが明らか
にされており、ＣＬＡＦも同様にCTL増強活性を有する
事は容易に想像できる。

【００３５】実施例６ＣＬＡＦ産生安定形質転換体の
作製実施例５で行ったCOS7細胞での発現は一時的なものであ
り、医薬品として使用するためには、ＣＬＡＦを安定し
て産生する細胞を作製する必要がある。そこで宿主とし
てマウスミエローマ由来のSFT34細胞(特許,国際公開番
号WO 94/12658)を用いて安定形質転換体の作製を行っ
た。SFT34細胞は浮遊性に優れ無血清培養に順応性のあ
る細胞である。選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺
伝子を有するCAGベクターに、CLAFp35とCLAFp40の両方
のcDNAをそれぞれ導入し、リポフェクトエース試薬を用
いて同時にSFT34細胞に導入した。その後、2週間1mg/ml
のG-418を含む10%FCS/RPMI培地で培養し、G-418耐性のS
FT34細胞を得た。このトランスフォーマントより限界希
釈法を用いてクローニングを行い、培養上清中のγイン
ターフェロン誘導活性を指標にしてＣＬＡＦ産生安定形
質転換体を得、安定してＣＬＡＦを得る事が可能になっ
た。

【００３６】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：３３０配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：イヌ脾臓細胞配列 Met His Pro Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Leu -20 -15 -10 Leu Ala Ser Pro Leu Met Ala Ile Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val -5 -1 1 5 Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp His Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met 10 15 20 Val Val Leu Thr Cys His Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp 25 30 35 Thr Ser Ala Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu 40 45 50 Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys 55 60 65 His Lys Gly Gly Lys Val Leu Ser Arg Ser Leu Leu Phe Asp Ser 70 75 80 Thr Lys Lys Lys Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Glu 85 90 95 Gln Lys Glu Ser Lys Asn Lys Ile Phe Leu Lys Cys Glu Ala Lys 100 105 110 Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Ala Ile Ser 115 120 125 Thr Asp Leu Lys Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Phe Ser Asp 130 135 140 Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Val Thr Leu Ser Ala Glu Arg 145 150 155 Val Arg Val Asp Asn Arg Asp Tyr Lys Lys Tyr Thr Val Glu Cys 160 165 170 Gln Glu Gly Ser Ala Cys Pro Ser Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile 175 180 185 Glu Val Val Val Asp Ala Ile His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr 190 195 200 Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro 205 210 215 Thr Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg His Val Glu 220 225 230 Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr 235 240 245 Phe Ser Leu Thr Phe Cys Ile Gln Ala Gln Gly Lys Asn Asn Arg 250 255 260 Glu Lys Lys Asp Arg Leu Cys Val Asp Lys Thr Ser Ala Lys Val 265 270 275 Val Cys His Lys Asp Ala Lys Ile Arg Val Gln Ala Arg Asp Arg 280 285 290 Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Asp Trp Ala Ser Val Ser Cys Ser 295 300 305

【００３７】配列番号：２配列の長さ：３０８配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：イヌ脾臓細胞配列 Ile Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val 1 5 Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp His Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met 10 15 20 Val Val Leu Thr Cys His Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp 25 30 35 Thr Ser Ala Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu 40 45 50 Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys 55 60 65 His Lys Gly Gly Lys Val Leu Ser Arg Ser Leu Leu Phe Asp Ser 70 75 80 Thr Lys Lys Lys Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Glu 85 90 95 Gln Lys Glu Ser Lys Asn Lys Ile Phe Leu Lys Cys Glu Ala Lys 100 105 110 Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Ala Ile Ser 115 120 125 Thr Asp Leu Lys Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Phe Ser Asp 130 135 140 Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Val Thr Leu Ser Ala Glu Arg 145 150 155 Val Arg Val Asp Asn Arg Asp Tyr Lys Lys Tyr Thr Val Glu Cys 160 165 170 Gln Glu Gly Ser Ala Cys Pro Ser Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile 175 180 185 Glu Val Val Val Asp Ala Ile His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr 190 195 200 Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro 205 210 215 Thr Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg His Val Glu 220 225 230 Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr 235 240 245 Phe Ser Leu Thr Phe Cys Ile Gln Ala Gln Gly Lys Asn Asn Arg 250 255 260 Glu Lys Lys Asp Arg Leu Cys Val Asp Lys Thr Ser Ala Lys Val 265 270 275 Val Cys His Lys Asp Ala Lys Ile Arg Val Gln Ala Arg Asp Arg 280 285 290 Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Asp Trp Ala Ser Val Ser Cys Ser 295 300 305

【００３８】配列番号：３配列の長さ：２２２配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：イヌ脾臓細胞配列 Met Cys Pro Pro Arg Gly Leu Leu Leu Val Thr Ile Leu Val Leu -25 -20 -15 Leu Ser His Leu Asp His Leu Thr Trp Ala Arg Ser Leu Pro Thr -10 -5 -1 1 5 Ala Ser Pro Ser Pro Gly Ile Phe Gln Cys Leu Asn His Ser Gln 10 15 20 Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Thr Leu Gln Lys Ala Arg Gln 25 30 35 Thr Leu Glu Leu Tyr Ser Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu 40 45 50 Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro 55 60 65 Leu Glu Leu Thr Met Asn Glu Ser Cys Leu Ala Ser Arg Glu Ile 70 75 80 Ser Leu Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Gly Lys Ala Ser 85 90 95 Phe Met Thr Val Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys 100 105 110 Met Tyr Gln Met Glu Phe Lys Ala Met Asn Ala Lys Leu Leu Met 115 120 125 Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Thr Ala 130 135 140 Ile Asp Glu Leu Leu Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Val Thr Val 145 150 155 Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys 160 165 170 Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val 175 180 185 Thr Ile Asp Arg Met Met Ser Tyr Leu Asn Ser Ser 190 195

【００３９】配列番号：４配列の長さ：１９７配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：イヌ脾臓細胞配列 Arg Ser Leu Pro Thr 1 5 Ala Ser Pro Ser Pro Gly Ile Phe Gln Cys Leu Asn His Ser Gln 10 15 20 Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Thr Leu Gln Lys Ala Arg Gln 25 30 35 Thr Leu Glu Leu Tyr Ser Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu 40 45 50 Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro 55 60 65 Leu Glu Leu Thr Met Asn Glu Ser Cys Leu Ala Ser Arg Glu Ile 70 75 80 Ser Leu Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Gly Lys Ala Ser 85 90 95 Phe Met Thr Val Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys 100 105 110 Met Tyr Gln Met Glu Phe Lys Ala Met Asn Ala Lys Leu Leu Met 115 120 125 Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Thr Ala 130 135 140 Ile Asp Glu Leu Leu Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Val Thr Val 145 150 155 Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys 160 165 170 Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val 175 180 185 Thr Ile Asp Arg Met Met Ser Tyr Leu Asn Ser Ser 190 195

【００４０】配列番号：５配列の長さ：２１５４配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源生物名：イヌ脾臓細胞配列 T CCACAGGAAG GAGCAGACCC AGGGAACCTT GCAGCCTGGC CAGAAGCAAG 51 ATG CAT CCT CAG CAG TTG GTC ATC TCC TGG TTT TCC CTC GTT TTG CTG 99 GCG TCT CCC CTC ATG GCC ATA TGG GAA CTG GAG AAA GAT GTT TAT GTT 147 GTA GAG TTG GAC TGG CAC CCT GAT GCC CCC GGA GAA ATG GTG GTC CTC 195 ACC TGC CAT ACC CCT GAA GAA GAT GAC ATC ACT TGG ACC TCA GCG CAG 243 AGC AGT GAA GTC CTA GGT TCT GGT AAA ACT CTG ACC ATC CAA GTC AAA 291 GAA TTT GGA GAT GCT GGC CAG TAT ACC TGC CAT AAA GGA GGC AAG GTT 339 CTG AGC CGC TCA CTC CTG TTT GAT TCC ACA AAA AAG AAA GAT GGA ATT 387 TGG TCC ACT GAT ATC TTA AAG GAA CAG AAA GAA TCC AAA AAT AAG ATC 435 TTT CTG AAA TGT GAG GCA AAG AAT TAT TCT GGA CGT TTC ACA TGC TGG 483 TGG CTG ACG GCA ATC AGT ACT GAT TTG AAA TTC AGT GTC AAA AGT AGC 531 AGA GGC TTC TCT GAC CCC CAA GGG GTG ACA TGT GGA GCA GTG ACA CTT 579 TCA GCA GAG AGG GTC AGA GTG GAC AAC AGG GAT TAT AAG AAG TAC ACA 627 GTG GAG TGT CAG GAG GGC AGT GCC TGC CCC TCT GCC GAG GAG AGC CTA 675 CCC ATC GAG GTC GTG GTG GAT GCT ATT CAC AAG CTC AAG TAT GAA AAC 723 TAC ACC AGC AGC TTC TTC ATC AGA GAC ATC ATC AAA CCA GAC CCA CCC 771 ACA AAC CTG CAG CTG AAG CCA TTG AAA AAT TCT CGG CAC GTG GAG GTC 819 AGC TGG GAA TAC CCC GAC ACC TGG AGC ACC CCA CAT TCC TAC TTC TCC 867 CTG ACA TTT TGC ATA CAG GCC CAG GGC AAG AAC AAT AGA GAA AAG AAA 915 GAT AGA CTC TGC GTG GAC AAG ACC TCA GCC AAG GTC GTG TGC CAC AAG 963 GAT GCC AAG ATC CGC GTG CAA GCC CGA GAC CGC TAC TAT AGT TCA TCC 1011 TGG AGC GAC TGG GCA TCT GTG TCC TGC AGT TAG GTTCCACCCC CAGGATGAAT 1064 CTTGGAGGGA AAGTGGAAGA TATTATGCAA AATTTTCTAA GGACACATTG AAGAGGCTCC 1124 AAAAGTTATT TTCTGCCTAA TTTTCTTTTT GTAAAGGGTC ATTATTGTGT CTTCGCAATA 1184 TTTTTTACAT TTAAATGCCA AATGCCCACT GAAACAATCA GCTACTTTAT TTATAGATTT 1244 TCAGCTAGCA GGCTGCCACT GACCTTAATG CTATTTAAAT ATTTAAGTAA TTTATGTATT 1304 TATTAATTTA TTGTTATTGA ACACTTGTGT GCCAAGATAT ATTGTATGTT TCATACCCTC 1364 AGGACCTGAT CTGTAAGGAA TAGGCCCTAT TATGCAAAAT GTGAATTTAT GTGTTATTTA 1424 TACTGACAAC TTTTCAAGCA AGAATGTATC ATTTTTATGA CAACCAGTGA GCACACAATA 1484 TTATGATGCC AGCACCATAA TATATTTGTG ATGGATGGGA ACACAGAGGT AGTTAAATAG 1544 AGACATGGAG ACACGAATCC ATTTGAGAAG TTTCTGGAGA CGGAGATGTT AGATCCTGTA 1604 TCCATAAAGA CTTCCTTGCG GTGGTGTTGA TAAAGCAATT CAGGGCCACT TGCATTTTTA 1664 AGCAAGTTTA GTTTTTGGAT GCCTGAATTT AGAAAGACCT GAGACAAATA ACTCAAATTG 1724 AGATTCAGCT TCAGCCACCT TGCCAGTCCC CATCCCCATC TATCTGTAAG TCATTGGAGA 1784 GTGACCCAGG GACACTGTAA GTGTCTGGAA GTAAAAAGGT CTTATGATCC AAGAGGGAGA 1844 ACCAACATGG CCAAGCACAA AAAATTGTCA GAATTTCCAG CTGCTCCTTA ATAGCCAGGC 1904 AAAAAAAGCA CATGGATGCA AAGAAAATGG TCAAGAATTG CTTACTGGAC AGCGCAAGTG 1964 AACCTGACTG GTGGATGTGA CCAGAAAGTG CCAATCGCTG AGGTGCTACT TTTAAGTAAT 2024 GAATGTGCTT TCTGTAAAGT GATTTCATTT CTTTTCTGTT TACTTATTTG TTTTTGCATT 2084 CTGACAATGC ACTAATAAAA ATATAACTCT TGTTTGCAAT AATAAAAAAA AAAAAAAAAA 2144 AAAAAAAAAA 2154

【００４１】配列番号：６配列の長さ：９２４配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源生物名：イヌ脾臓細胞配列 ATA TGG GAA CTG GAG AAA GAT GTT TAT GTT 30 GTA GAG TTG GAC TGG CAC CCT GAT GCC CCC GGA GAA ATG GTG GTC CTC 78 ACC TGC CAT ACC CCT GAA GAA GAT GAC ATC ACT TGG ACC TCA GCG CAG 126 AGC AGT GAA GTC CTA GGT TCT GGT AAA ACT CTG ACC ATC CAA GTC AAA 174 GAA TTT GGA GAT GCT GGC CAG TAT ACC TGC CAT AAA GGA GGC AAG GTT 222 CTG AGC CGC TCA CTC CTG TTT GAT TCC ACA AAA AAG AAA GAT GGA ATT 270 TGG TCC ACT GAT ATC TTA AAG GAA CAG AAA GAA TCC AAA AAT AAG ATC 318 TTT CTG AAA TGT GAG GCA AAG AAT TAT TCT GGA CGT TTC ACA TGC TGG 366 TGG CTG ACG GCA ATC AGT ACT GAT TTG AAA TTC AGT GTC AAA AGT AGC 414 AGA GGC TTC TCT GAC CCC CAA GGG GTG ACA TGT GGA GCA GTG ACA CTT 462 TCA GCA GAG AGG GTC AGA GTG GAC AAC AGG GAT TAT AAG AAG TAC ACA 510 GTG GAG TGT CAG GAG GGC AGT GCC TGC CCC TCT GCC GAG GAG AGC CTA 558 CCC ATC GAG GTC GTG GTG GAT GCT ATT CAC AAG CTC AAG TAT GAA AAC 606 TAC ACC AGC AGC TTC TTC ATC AGA GAC ATC ATC AAA CCA GAC CCA CCC 654 ACA AAC CTG CAG CTG AAG CCA TTG AAA AAT TCT CGG CAC GTG GAG GTC 702 AGC TGG GAA TAC CCC GAC ACC TGG AGC ACC CCA CAT TCC TAC TTC TCC 750 CTG ACA TTT TGC ATA CAG GCC CAG GGC AAG AAC AAT AGA GAA AAG AAA 798 GAT AGA CTC TGC GTG GAC AAG ACC TCA GCC AAG GTC GTG TGC CAC AAG 846 GAT GCC AAG ATC CGC GTG CAA GCC CGA GAC CGC TAC TAT AGT TCA TCC 894 TGG AGC GAC TGG GCA TCT GTG TCC TGC AGT 924

【００４２】配列番号：７配列の長さ：１２８２配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源生物名：イヌ脾臓細胞配列 GGCAC 5 GAGGCCGCGT CCGCAGTCCG CGTCCAGCGC CCGCCGGGGT CCACGCAGCG CCCGCCCAGC 65 ATG TGC CCG CCG CGC GGC CTC CTC CTT GTG ACC ATC CTG GTC CTG CTA 113 AGC CAC CTG GAC CAC CTT ACT TGG GCC AGG AGC CTC CCC ACA GCC TCA 161 CCG AGC CCA GGA ATA TTC CAG TGC CTC AAC CAC TCC CAA AAC CTG CTG 209 AGA GCC GTC AGC AAC ACG CTT CAG AAG GCC AGA CAA ACT CTA GAA TTA 257 TAT TCC TGC ACT TCC GAA GAG ATT GAT CAT GAA GAT ATC ACA AAG GAT 305 AAA ACC AGC ACA GTG GAG GCC TGC TTA CCA CTG GAA TTA ACC ATG AAT 353 GAG AGT TGC CTG GCT TCC AGA GAG ATC TCT TTG ATA ACT AAC GGG AGT 401 TGC CTG GCC TCT GGA AAG GCC TCT TTT ATG ACG GTC CTG TGC CTT AGC 449 AGC ATC TAT GAG GAC TTG AAG ATG TAC CAG ATG GAA TTC AAG GCC ATG 497 AAC GCA AAG CTT TTA ATG GAT CCC AAG AGG CAG ATC TTT CTG GAT CAA 545 AAC ATG CTG ACA GCT ATC GAT GAG CTG TTA CAG GCC CTG AAT TTC AAC 593 AGT GTG ACT GTG CCA CAG AAA TCC TCC CTT GAA GAG CCG GAT TTT TAT 641 AAA ACT AAA ATC AAG CTC TGC ATA CTT CTT CAT GCT TTC AGA ATT CGT 689 GCG GTG ACC ATC GAT AGA ATG ATG AGT TAT CTG AAT TCT TCC TAA 734 AAAGCTGAGG TCTCTCTCGA CTTTAAAGTC ATTCTTATAA AAATGTGAAC CAAAAGAATT 794 TTTCATAAGA TAGGGGTTAA GAACCAGGGA GGGGGTGGCT TGACCTGGTC CTACTTAAGC 854 TAGTACGATA ATTCTCATGC TTGTTTACAT TAGTTGCCAC TCAAATTTTG AAAGATGTGA 914 CTGTTATATC CACACGATGC CTTTGACCAA GTATATTTCA CATTTACTAT GGATAAGTTA 974 AGTGTTCGTG AGCAAATTGC TAAAGAGGAA AAATGTCCTC ACCGAACATG TTTTTATTTT 1034 CCCTTTAATA GAAGAGCAAG ACTTTATAAG CTATTTCTGT ACCAAACTGT TTGTAGAAAC 1094 AAACACTCAA GCATAATTTA TTTAAAAATA CTTATTTATA TAATTTTGTG TTCATGAAAG 1154 CATGTGAATT AATTTATATT TATTTATGTT ATATTTATTA AAGTATTTAT TATCAAGTGG 1214 ATTTGGGATA TCTTATGTTC TAAAAATAAA ATGATTGAGT AGGAAAAAAA AAAAAAAAAA 1274 AAAAAAAA 1282

【００４３】配列番号：８配列の長さ：５９１配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源生物名：イヌ脾臓細胞配列 AGG AGC CTC CCC ACA GCC TCA 21 CCG AGC CCA GGA ATA TTC CAG TGC CTC AAC CAC TCC CAA AAC CTG CTG 69 AGA GCC GTC AGC AAC ACG CTT CAG AAG GCC AGA CAA ACT CTA GAA TTA 117 TAT TCC TGC ACT TCC GAA GAG ATT GAT CAT GAA GAT ATC ACA AAG GAT 165 AAA ACC AGC ACA GTG GAG GCC TGC TTA CCA CTG GAA TTA ACC ATG AAT 213 GAG AGT TGC CTG GCT TCC AGA GAG ATC TCT TTG ATA ACT AAC GGG AGT 261 TGC CTG GCC TCT GGA AAG GCC TCT TTT ATG ACG GTC CTG TGC CTT AGC 309 AGC ATC TAT GAG GAC TTG AAG ATG TAC CAG ATG GAA TTC AAG GCC ATG 357 AAC GCA AAG CTT TTA ATG GAT CCC AAG AGG CAG ATC TTT CTG GAT CAA 405 AAC ATG CTG ACA GCT ATC GAT GAG CTG TTA CAG GCC CTG AAT TTC AAC 453 AGT GTG ACT GTG CCA CAG AAA TCC TCC CTT GAA GAG CCG GAT TTT TAT 501 AAA ACT AAA ATC AAG CTC TGC ATA CTT CTT CAT GCT TTC AGA ATT CGT 549 GCG GTG ACC ATC GAT AGA ATG ATG AGT TAT CTG AAT TCT TCC 59

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト及びイヌゲノミックＤＮＡを制限酵素で消
化後、サザンブロット解析を行った結果を示す写真で、
（Ａ）はヒトIL12p35cDNAを、（Ｂ）はヒトIL12p40cDNA
をプローブとして用いた。

【図２】ネコ及びイヌゲノミックＤＮＡを制限酵素で消
化後、サザンブロット解析を行った結果を示す写真で、
（Ａ）はネコFLAFp35cDNAを、（Ｂ）はネコFLAFp40cDNA
をプローブとして用いた。

【図３】発現調節領域として、ヒトサイトメガロウイル
スエンハンサー及びニワトリβアクチンプロモーター及
びウサギβグロビンスプライシングシグナルを有する動
物細胞用発現ベクターpCAGn-mcs polyAの模式図。

【図４】CAGcp35もしくはCAGcp40を単独で、又は両発現
ベクターを同時にCOS細胞に導入したときの培養上清中
のγインターフェロン誘導活性を示した図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 ４Ｈ０４５Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＦＥ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91） 15/00 ＺＮＡＡＦターム(参考） 4B024 AA10 BA21 BA25 BA41 CA02 CA04 DA01 DA02 DA06 DA12 EA02 EA04 EA06 FA02 FA06 FA18 GA11 HA01 4B064 AG02 AG12 AG27 CA02 CA06 CA10 CA11 CA19 CC24 DA01 DA05 4B065 AA90X AA90Y AA92X AA95Y AC14 BA02 BA25 BB37 BB40 CA24 CA25 CA43 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA22 BA44 CA17 CA53 DA01 DA39 MA31 MA52 MA58 MA66 NA05 ZB022 ZB262 ZB332 ZC612 4C085 AA13 AA14 BB17 EE01 GG01 GG08 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA01 DA75 DA76 DA86 EA20 EA22 EA29 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号：１で示されるアミノ
酸配列を有することを特徴とする新規ポリペプチド。
【請求項２】配列表の配列番号：１で示されるアミノ
酸配列に対し１もしくは数個がアミノ酸残基の欠失、付
加、あるいは置換されたアミノ酸配列を有することを特
徴とする新規ポリペプチド。
【請求項３】配列表の配列番号：２で示されるアミノ
酸配列を有することを特徴とする新規ポリペプチド。
【請求項４】配列表の配列番号：２で示されるアミノ
酸配列に対し１もしくは数個がアミノ酸残基の欠失、付
加、あるいは置換されたアミノ酸配列を有することを特
徴とする新規ポリペプチド。
【請求項５】配列表の配列番号：１で示されるアミノ
酸配列の一部からなる新規ポリペプチド。
【請求項６】遺伝子組換え技術により得られる組換え
型ポリペプチドである請求項１ないし５のいずれかに記
載の新規ポリペプチド。
【請求項７】請求項１ないし６のいずれかに記載の新
規ポリペプチドのホモダイマー。
【請求項８】配列表の配列番号：３で示されるアミノ
酸配列を有することを特徴とする新規ポリペプチド。
【請求項９】配列表の配列番号：３で示されるアミノ
酸配列に対し１もしくは数個がアミノ酸残基の欠失、付
加、あるいは置換されたアミノ酸配列を有することを特
徴とする新規ポリペプチド。
【請求項１０】配列表の配列番号：４で示されるアミ
ノ酸配列を有することを特徴とする新規ポリペプチド。
【請求項１１】配列表の配列番号：４で示されるアミ
ノ酸配列に対し１もしくは数個がアミノ酸残基の欠失、
付加、あるいは置換されたアミノ酸配列を有することを
特徴とする新規ポリペプチド。
【請求項１２】配列表の配列番号：３で示されるアミ
ノ酸配列の一部からなる新規ポリペプチド。
【請求項１３】遺伝子組換え技術により得られる組換
え型ポリペプチドである請求項８ないし１２のいずれか
に記載の新規ポリペプチド。
【請求項１４】請求項１ないし６のいずれかに記載の
ポリペプチド並びに請求項８ないし１３いずれかに記載
のポリペプチドからなる新規タンパク質。
【請求項１５】リンパ球細胞を活性化する活性を有す
る請求項１４に記載の新規タンパク質。
【請求項１６】リンパ球細胞がイヌ由来である請求項
１５に記載の新規タンパク質。
【請求項１７】リンパ球細胞が細胞傷害性Ｔリンパ球
である請求項１５もしくは１６に記載の新規タンパク
質。
【請求項１８】請求項１ないし１３のいずれかに記載
の新規ポリペプチド又は請求項１４ないし１７のいずれ
かに記載の新規タンパク質をコードする塩基配列を含有
することを特徴とする新規ＤＮＡ。
【請求項１９】前記ＤＮＡが配列表の配列番号：５に
記載の塩基配列を含有する請求項１８記載の新規ＤＮ
Ａ。
【請求項２０】前記ＤＮＡが配列表の配列番号：６に
記載の塩基配列を含有する請求項１８記載の新規ＤＮ
Ａ。
【請求項２１】前記ＤＮＡが配列表の配列番号：７に
記載の塩基配列を含有する請求項１８記載の新規ＤＮ
Ａ。
【請求項２２】前記ＤＮＡが配列表の配列番号：８に
記載の塩基配列を含有する請求項１８記載の新規ＤＮ
Ａ。
【請求項２３】前記ＤＮＡが配列表の配列番号：５に
記載の塩基配列の一部である請求項１８記載の新規ＤＮ
Ａ。
【請求項２４】前記ＤＮＡが配列表の配列番号：７に
記載の塩基配列の一部である請求項１８記載の新規ＤＮ
Ａ。
【請求項２５】配列表の配列番号：５もしくは７に記
載の塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとハイ
ブリダイズし、イヌリンパ球細胞を活性化する活性を有
するタンパク質をコードすることを特徴とする新規ＤＮ
Ａ。
【請求項２６】請求項１８ないし２５のいずれかに記
載の新規ＤＮＡを含むことを特徴とする組換えＤＮＡ分
子。
【請求項２７】組換えＤＮＡ分子の構成部分であるベ
クターがプラスミド、ウイルスベクター、コスミドより
選ばれる請求項２６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項２８】請求項１８ないし２５のいずれかに記
載の新規ＤＮＡ又は請求項２６もしくは２７に記載の組
換えＤＮＡ分子で形質転換した形質転換体。
【請求項２９】形質転換体が、大腸菌、酵母、昆虫細
胞、動物細胞、植物細胞より選ばれる宿主である請求項
２８に記載の形質転換体。
【請求項３０】請求項１ないし１３のいずれかに記載
の新規ポリペプチドあるいは請求項１４ないし１７のい
ずれかに記載の新規タンパク質を認識することを特徴と
する新規抗体。
【請求項３１】前記抗体がモノクローナル抗体である
請求項３０に記載の新規抗体。
【請求項３２】前記抗体がポリクローナル抗体である
請求項３０に記載の新規抗体。
【請求項３３】請求項２８もしくは２９に記載の形質
転換体を培養し、該形質転換体に請求項１ないし１３の
いずれかに記載の新規ポリペプチドあるいは請求項１４
ないし１７のいずれかに記載の新規タンパク質を生産さ
せ、該新規ポリペプチド又は新規タンパク質を精製する
ことを特徴とする、請求項１ないし１３のいずれかに記
載の新規ポリペプチドあるいは請求項１４ないし１７の
いずれかに記載の新規タンパク質の製造方法。
【請求項３４】請求項３０ないし３２のいずれかに記
載の抗体を用いることを特徴とする請求項３３に記載の
ペプチド又はタンパク質の製造方法。
【請求項３５】請求項７に記載のホモダイマーを主成
分とするイヌ自己免疫疾患の治療剤。
【請求項３６】請求項１４ないし１７のいずれかに記
載の新規タンパク質を主成分とするイヌウイルス性疾患
の治療剤。
【請求項３７】請求項３０ないし３２のいずれかに記
載の新規抗体を主成分とするイヌウイルス性疾患の治療
剤。