WO1998055511A1

WO1998055511A1 - Nouvelle proteine appelee cytokine canine

Info

Publication number: WO1998055511A1
Application number: PCT/JP1998/002295
Authority: WO
Inventors: Takayuki Imamura; Hiroaki Maeda; Sachio Tokiyoshi; Yasuyuki Eda
Original assignee: Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute
Priority date: 1997-06-03
Filing date: 1998-05-26
Publication date: 1998-12-10
Also published as: JP2002241398A; AU7450998A

Description

明細書

新規なィヌサイトカインタンパク質技術分野

本発明は、新規なポリペプチド、そのホモダイマー又はへテロダイマーからなる新規タンパク質、それをコードする新規 D N A、該 D N Aを含む組換え D N A分子、該組換え D N A分子で形質転換した形質転換体、該新規ポリべプチド又は新規タンパク質に対する抗体、該新規ポリべプチド又は新規タンパク質の製造方法、及び該新規夕ンパク質又は該抗体を含有するィヌウィルス性疾患の治療剤に関する。さらに詳細には、ィヌ細胞障害性 Tリンパ細胞を活性化してウイルス感染細胞を障害せしめる活性をもつ異なる 2種の新規なポリペプチドからなるィヌサイトカインタンパク質（以下、「C L A F」と称することもある）及び該 C L A Fをコードする遺伝子並びに該 C L A Fの製造方法に関する。

背景技術

ィヌはぺットとして昔から人間に愛着のある動物であるが、最近では「伴侶、仲間、相棒としての動物」として人間社会の一員としての地位が確立しつつある。また、警察犬、盲導犬等のように必要不可欠な動物としても社会的に貢献している。一方、医学、薬学、獣医学、心理学などで従来から実験動物として使用されており、最近では医薬品の安全性試験、効果検定にも使用されるようになってきている。このようにィヌの社会的重要性が高まっている状況の中では、ィヌの疾病、特に伝染病に対する関心が高く、その有効な治療法が望まれている。

ィヌのウィルス性疾患は多く、中でもィヌジステンパーウィルス、ィヌパルボウイルス、ィヌ伝染性肝炎ウィルス等の疾患は急性で致死率が高い。これらのウィルス性疾患に対して、予防薬としてのワクチンが開発されているものの、一旦、感染 .発症したィヌに対しては、ワクチンの治療効果は低く、抗生物質、サルファ剤等の二次細菌感染予防や、ビタミン剤ゃ栄養剤による対処療法が主たる療法として行われている。すなわち、ウィルス性疾患に対する有効な治療薬は現在ほとんどない状態である。

ウィルスに限らず、微生物に対する宿主の免疫は、大まかに抗体による液性免疫と免疫リンパ球による細胞性免疫に分けられる。細胞性免疫は感染後 7〜 1 0日くらいをピークにその後速やかに減退していく。これに対し、抗体産生の方は 1週間以後に上昇し始め、 3〜 4週頃最高に達し、その後緩慢に減退していく。中和抗体はウィルスの感染初期や受動免疫に有効であるため、予防を目的としたワクチン開発の主眼は中和抗体を如何に産生させるかにある。し力、し、感染が成立した後では感染の進行と共に中和抗体の有効性が失われているのが一般的である。さらに、ウィルスが細胞内にとどまって、細胞から細胞へと感染する持続感染の場合（例えば、ヘルぺスウィルス）や、ウィルスが感染後も変異しやすく、次々に中和抗体に対して抵抗性を持つようになる場合（例えば、免疫不全ウィルス）などには、中和抗体は余り有効ではない。そのような場合には細胞性免疫が有効であると考えられており、その主体はウイルス感染細胞を発見し破壊除去することができる細胞障害活性 Tリンパ細胞（C T L ) である。一般的に感染が進行し重篤になつた時期には細胞障害活性も低下する傾向にあり、病状の進行を早めてしまう結果になる。その際、細胞障害活性 Tリンパ細胞を活性化することができれば、病状の進行をくい止め、回復を促すことができると考えられる（オールドストーン（M. B . A. O ldstone) ら、 C urrent 1 opics in Microbiology and I 隱細 logy 1 8 9 Springer -Verlag, 1 9 9 4 ) 。ヒトでは末梢から細胞障害性 Tリンパ細胞を回収し、 in vitroで非特異的に活性化して生体内に戻す療法が行われているが、ィヌはヒ卜に比べてはるかに小さいために有効な数の細胞障害性 Tリンパ細胞を末梢から回収することはできず、この療法を行うことはできない。すなわち、現状では、ィヌ細胞障害性 Tリンパ細胞を活性化してウィルス性疾患を治療するための有効な方法は見出されていない。このように、ウィルス感染症の治癒における細胞性免疫の重要性が示唆されている中、ィヌのウィルス性疾患において細胞性免疫とりわけ細胞障害性 Tリンパ球を活性化する治療薬は現在まで報告されていない。

リンパ球細胞の活性化にはサイトカインの関与が考えられる。現在ィヌ由来のサイトカインとして報告されているものにはエリスロポエチン（ゥェン（D. Wen)ら、 Blood Vol.82、 1507— 1516、 1993) 、顆粒球コロニー刺激因子（G— CSF) (シユーェニング（F. G.

Schuening) ら、 Blood Vol.81、 20— 26、 1993) などが挙げられる。しかしながら、今のところこれらのサイト力インが細胞障害性 T リンパ球を活性化するという報告はない。一方、 T細胞を活性化しァインターフ口ン誘導能を示したり、細胞障害性 T細胞を活性化する因子として、すでにヒト及びマウスでは I L 12が知られている。現在までにクロ一二ングされたヒト及びマウスの I L 12は，アルファ鎮（p 35) とべ一夕鎖（p40) からなるヘテロダイマーで活性を示すことが知られている（ Annu. Rev. I隱 unol. Vol.13、 251一 276、 1995)。更にヒ卜とマウスでは I L 12としての活性は種特異性を示すことが報告されている（ゥオルフ（S. F.Wolf) ら、 J. I画 unol. Vol.136、 307 4一 3081、 1991) 。従って、現段階でィヌについては細胞障害性 T細胞を活性化するサイトカインについての報告はないといえる。発明の開示

本発明の目的は、ィヌ細胞障害性 τリンパ細胞の細胞障害活性を増強する CLAF、及びこれを構成するポリべプチド又はその一部を含むポリべプチドを提供することにある。

また、本発明の他の目的は、ィヌ細胞障害性 Tリンパ細胞の細胞障害活性を増強する CL AF、及びこれを構成するポリべプチド又はその一部を含むポリべプチドをコ一ドする遺伝子並びにこれらの遺伝子を発現させるための組換えベクターを提供することにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えべクタ一で形質転換された微生物又は種々の細胞から、ィヌ細胞障害性 Tリンパ細胞の細胞障害活性を増強する CLAF、及びこれを構成するポリべプチド又はその一部を含むポリぺプチドを製造する方法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、ィヌ細胞障害性 Tリンパ細胞の細胞障害活性を増強する C L A Fを主成分とするィヌウイルス性疾患の治療剤を提供するとにめる。

図面の簡単な説明

図 1は、ヒト及びィヌゲノミック D N Aを制限酵素で消化後、サザンブロット解析を行った結果を示す写真で、（A) はヒト I L12p35 c DNAを、（B) はヒト I L 12 p 40 c D N Aをプローブとして用いた。

図 2は、ネコ及びィヌゲノミック DNAを制限酵素で消化後、サザンブロット解析を行った結果を示す写真で、（A) はネコ FLAFp 35 c DNAを、（B) はネコ FLAFp40 c DNAをプローブとして用いた。

図 3は、発現調節領域としてヒトサイトメガロウィルスェンハンサー、ニヮトリ；6ァクチンプロモーター及びゥサギ jSグロビンスプライシングシグナルを有する動物細胞用発現べクタ一 P C AG n—mc s p o 1 y A の模式図である。

図 4は、 CAGcp35もしくは CAGc p 40を単独又は同時に CO S細胞に導入したときの培養上清中のァインターフエ口ン誘導活性を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を重ね、報告されたヒ卜の I L12 c DNA (ゥオルフ、 J · I mmunology Vol.146、 3 074— 3081、 1991) を用いて、ィヌの脾臓 c DNAライブラリ一をスクリーニングし、ィヌの I L 12に相当するものを得ようと、 20 0万プラークのィヌ c DNAライブラリ一のスクリ一二ングを行ったが、目的の遺伝子は得られなかった。

一方、本発明者らは、活性化したネコの脾臓細胞の培養上清中に、ネコリンパ球（特に、細胞障害性 Tリンパ球： CTL) の細胞障害活性を増強するタンパク性因子（新規ネコサイトカインタンパク質；「FLAF」）を発見し、該タンパク質が異なる 2種のポリべプチド（分子量約 40, 0 00のポリペプチド（以下、「FLAFp40」と称する）及び分子量約 35, 000のポリペプチド（以下、「FLAFp35」と称する）からなることを明らかにし、更に該ポリべプチドをコ一ドする核酸塩基配列を決定している（特願平 8— 165249号（W097/46583) ) 。ゥェン（D.Wen) ら（Blood Vol.82、 1507— 1516、 19 93) は、エリスロポエチンのアミノ酸配列を各動物種間で比較し、ィヌとネコの間では 95%> ィヌとヒ卜の間では 84%のホモロジ一があることを示した。前者のホモロジ一値は、後者に比べ、有意に高いと言える。そこで本発明者らは、ヒトの I L 12に相当するものと思われる上記 FL AFをコードする遺伝子をプローブとして用い、 FLAFに相当するィヌ型のサイトカインタンパク質をコードする遺伝子の単離を試み、 2種のポリペプチド（分子量約 40, 000のポリペプチド（以下、「CLAFp 40」と称する）及び分子量約 35, 000のポリべプチド（以下、「C LAFp35」と称する）をコードする遺伝子断片を得た。さらに遺伝子工学技術を応用し、該遺伝子断片を動物細胞にて発現させ、得られたタンパク質（CLAF) がヒト抹消血リンパ細胞からのァインタ一フヱロン誘導活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。本発明者らが見出した FLAFは、細胞障害性 Tリンパ細胞の増強活性を有すること及びウィルス感染に対する症状軽減効果を示すことから、 CLAFも同様にこれらの活性を有することは容易に想像できる。

したがって、本発明は、配列表の配列番号： 1もしくは配列番号： 2に記載のアミノ酸配列で示される CLAF p 40、配列番号： 3もしくは配列番号： 4に記載のアミノ酸配列で示される CLAFp 35、これらのポリぺプチドからなる C L A F、及び前記ポリぺプチドの一部のァミノ酸配列を有するポリべプチドを包含する。

本発明はまた、 CLAFp 40をコードする配列番号： 5もしくは 6に記載の塩基配列、 CLAF p 35をコードする配列番号： 7もしくは 8に記載の塩基配列又はこれらポリベプチドの一部のァミノ酸配列を有するポリベプチドをコ一ドする塩基配列を有する遺伝子断片及び該遺伝子断片を含む組換え DN A分子を包含する。

更に、本発明は、上記組換え DNA分子によって形質転換された組換え体を包含する。本発明はまた、これらの組換え体から、 CLAF、その構成ポリべプチドである CLAFp 40及び CLAFp 35又は該ポリぺプチドの一部のァミノ酸配列を有するポリべプチドを製造する方法を包含する。

以下本発明について更に詳述する。

本発明は、細胞傷害性 Tリンパ球細胞を活性化する活性を有する CL A F及びこれを構成する 2種のポリべプチド（CLAFp 40及び CLAF p35) 、並びに該 CLAF又は該ポリペプチドをコードする遺伝子断片によって特徴付けられる。

細胞障害活性 Tリンパ球細胞の活性を測定する方法は、既にいくつか知られており、それらを利用すれば良い。最も直接的な方法は、 ⁵¹Crラベルした標的細胞を細胞障害性 Tリンパ球が破壊する活性を測定する⁵¹ C r 遊離アツセィ（release assay) である。また、間接的には細胞障害性 T リンパ球が活性化されたときに放出するァインターフロンを測定する方法がある。

CLAFp40および CLAFp35遺伝子のクローン化は、マニアチス (Maniatis) ら (Molecular Cloning, A Laboratory Manual第 2版、 12.30、コールドスプリングハーバーラボラトリ一プレス (Cold Springs Harbor Laboratory Press)、 Ν.Υ·、 1989) が述べているような一般的な mRN Aの調製方法及び c DN Aクロ一ニング方法で対応できる。すなわち、リンパ球刺激物の存在下で培養したィヌ由来のリンパ球細胞から全 RNAを調製し、これを材料にして cDNAライブラリーを作製し、この中から、 FLAFp40及び FLAFp35をコードする遺伝子断片をプローブとして CLAFp 40及び CLAFp 3 5遺伝子をスクリーニングすることにより達成される。

リンパ球刺激物としては、フィ卜へマグルチニン、コンカナバリン八、リポ多糖類、ポークウィードマイトジェン（PWM) などが挙げられるが、とりわけ PWMが好ましい。また、ィヌ由来のリンパ球細胞としては、脾臓細胞、末梢血単核細胞（PBMC) 、ある種の血液癌細胞等が挙げられるが、とりわけィヌ脾臓細胞を用いるのが好ましい。かくしてクロ一ニングされる CLAFp40 cDNA及び CLAFp 35 cDNAの塩基配列は、 DNAシークェンサ一（アプライド ·バイオシステムズ（Applied B iosystems)社、モデル 1373A) により容易に決定することができる。

完全長の CLAFp40 cDNA及び CLAFp35 cDNAあるいは C LA Fの構造領域の一部をコードする cDNA断片を、適当な発現べクタ一に組み込み、これを用いて適当な微生物、動物細胞、昆虫細胞又は植物細胞等を形質転換し、得られる形質転換体を培養することにより、 C L AF、これを構成するポリべプチド又は該ポリべプチドの一部を生産することができる。また、前記発現ベクターを動物体内に導入したトランスジェニック動物を作出し、該トランスジェニック動物にこれらを生産させることも可能である。 CLAFを構成するポリべプチドの一部を生産する場合は、ペプチド合成機を利用することもできる。

本発明の CLAFをコ一ドする DN Aの上流に、分泌のための微生物用又は動物細胞用の適当なシグナル配列を接続することにより、該タンパク質を培地中に分泌発現させることも可能である。このように分泌型に改変した c DNAは、培地中に分泌した該タンパク質を容易に回収できる点で有用である。シグナル配列としては、大腸菌用として p e 1 Bシグナル（レィ（S. P Lei) ら、 J. Bacteriology Vol、 169、 4379— 43 83、 1987)、酵母用として因子のシグナル（ブレイク（A. J.B rake)、 Yeast Genetic Engineerings p 269、ノくタ—ワース（Butt erworth)、 1989) 、動物細胞用としてィムノグロプリンのシグナル 0— 1(前田（H.Maeda) ら、 Hum. Antibod. Hybridomas Vol. 2、. 124— 134、 1 991) 、及び C 25のシグナル（特許、国際公開番号 WO 94/20632) などが挙げられる。

発現ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウィルスベクター等を用いることができる。該発現べクタ一に含まれるプロモータ一は、 SV4 0初期、 SV40後期、 βΎクチン、ポリヘドリン、 Ρ 10などから、宿主として用いる微生物、動物細胞、昆虫細胞又は植物細胞との組み合わせにより適宜選択して使用されるが、最終的に活性型の C L A Fが得られるのであればどのようなものでもよい。形質転換された微生物をスクリー二ングするためのマ一カー遺伝子として、例えば、大腸菌を宿主とする場合にはアンピシリン耐性遺伝子又はテトラサイクリン耐性遺伝子などが、酵母を宿主とする場合には L e u 2遺伝子などが利用される。また、形質転換された動物細胞をスクリ一ニングする場合には、ァミノグリコシド 3' ホスホトランスフユラーゼ（n e o) 遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（d h f r) 遺伝子又はグルタミン合成酵素（G S) 遺伝子などを利用できる。そのような発現ベクターの一例として P C AG n-mc s p o l yAを図 3に示す。選択用添加物質としては、 G— 4 1 8、メソトレキセー卜等が例示される。

具体的には、チャイニーズハムスター卵巣（CHO) 細胞、マウスミエ口一マ細胞又は COS細胞など様々な動物細胞を宿主として C LAFを生産する方法が例示される。前述したように動物細胞で発現させるのに適した CLAF p 35 c DNA発現ベクター及び CLAF p 40 c DNA発現べクタ一を構築し、これらを用いて別々に又は同時に前記細胞を形質転換することにより、 C LAFを一時的又は安定的に生産することが出来る。より具体的には、 COS 7細胞（アフリカミドリザル由来）を宿主として —時的発現を、また、 S FT 34細胞（特許、国際公開番号 WO 94/1 2658) もしくは C H 0細胞を宿主として安定的発現をさせることがでさる。

宿主細胞の形質転換は公知の方法、例えば、燐酸カルシウム法、 DEA Eデキストラン法、リポフユクチン等を用いる沈殿法、プロトプラストポリエチレン融合法、エレクトロポレーシヨン法などが利用でき、用いる宿主細胞により適当な方法を選択すればよ L、。

こうして得られる形質転換細胞から生産される本発明の CL A Fは、前述の⁵¹ C r遊離アツセィ又はィンターフヱロン誘導活性を指標にし、タンパク質化学において通常使用される方法、例えば、塩析法、限外濾過法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー法、逆相クロマトグラフィ一、ァフィ二ティーク口マトグラフィ一法等を適宜選択して分離 ·精製することができる。

このような CLAFは、ィヌ細胞障害性 Tリンパ細胞の細胞障害活性を増強する活性を有するものである。該 CLAFは、ィヌのウィルス性疾患治療剤又は抗癌剤として、単独であるいは薬剤として投与可能な適当な担体、希釈液又は安定剤を添加することにより、注射剤、経口剤、坐薬、点眼剤等の任意慣用の方法で医薬品に使用される。

具体的には、本発明の CLAFは、ィヌのウィルス性疾患、例えば、ィヌジステンパーウィルス、ィヌパルボウイルス、ィヌ伝染性肝炎ウィルスなどのウィルス感染症の治療に用いることができる。また、細胞傷害性 T リンパ球を活性化することから抗腫瘍剤として使用することができる。上述の CLAF、これを構成するポリべプチドである CLAF p 40及び CLAFp35又は該ポリぺプチドの一部のァミノ酸配列を含むポリぺプチドは、今や常法となっている方法により、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を作製するための免疫原として使用される。また、上記ポリべプチドをコ一ドする遺伝子もしくはその一部を組み込んだ発現べクターは、該ベクターを通常の方法に従って動物体内に導入し、該動物体内で発現させることにより、前記ポリべプチドに対する抗体を作製するために使用される。かくして得られる CLAF、 CLAFp40、 CLAFp 35又はこれらの一部のアミノ酸配列を含むポリべプチド及びこれらとの結合能を有する抗体は、ウェスタンブロット法、 EL I S A法などの抗原検出系に利用することができ、診断薬を構築する材料となる。また、上記の抗体を適当な担体に結合させ、これを用いたァフィ二ティ一クロマトグラフィーにより、上記の抗原夕ンパク質を精製することができる。

本発明によると、ァインターフヱロン誘導活性を示す CLAF p 35および C L AF p 40のへテロダイマ—のタンパク質並びにそれぞれのタンパク質をコードする c DNAが提供される。

今回、本発明者らが見出した CLAFは、これまでにィヌでは見出されていない新規タンパク質であり、ィヌリンパ球を活性化してウィルス感染細胞を破壊させる活性を持つ分子を構成している重要なサブュニットである。このように、活性を持った CL A Fをコ一ドした遺伝子の単離、発現ベクタ一の構築及び安定発現細胞の作製など、 CLAFを実用化するための技術的な問題は本発明により解決され、ィヌ感染症治療薬としての工業レベルでの製造が可能になった。

また、本発明の C LAFは特定のウイルスに特異的な因子ではないので、ほとんどのウィルスに適応することが可能である。そのような対象ウィルスの候補として、ィヌジステンパーウィルス、ィヌパルボウイルス、ィヌ伝染性肝炎ウィルス等が挙げられる。また、 CTLを活性化することから、組織適合系クラス I抗原を介する免疫反応には全て応用することが可能である。そのような例として抗腫瘍効果なども期待できる。

以下に、実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明する。なお、以下に示す実施例では、特に断りのない限り、和光純薬、宝酒造、東洋紡およびニュー ·ィングランド ·バイオラブズ（New England B ioLabs)社製の試薬を使用した。

実施例 1 c DNAライブラリ一のスクリ一ニングに用いるプローブの調製

CLAF遺伝子をクローニングするためのプローブとしては、ヒト I L 12遺伝子あるいは FL A F遺伝子が考えられる。そこで、ヒト I L 12 遺伝子及び FL A F遺伝子がィヌ遺伝子とどの程度反応性を有するかをゲノミックサザン法に従って検討した。まず、ヒトゲノミック DNAをヒト末梢血リンパ球より、ィヌゲノミック DNAをィヌ肝臓より、また、ネコゲノミック DNAをネコ肝臓より、マニアチスら、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 2版、 9.16、コールドスプリングハーバ一ラボラトリープレス、 N. Y.、 1989) に記載の方法に従って調製した。これらの DNAlO^gを制限酵素 BamHI、 E c o R I及び H i ndl [[で消化後、マニアチスら、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 2版、 9.31、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、 N.Y.、 1989) に記載の方法に従ってサザンプロット解析を行つた。まず、ィヌとヒトのゲノミック DN Aが転写されたナイロンフィルタ一に対して、ウルフら（ J. I誦 unology, Vol.146、 p3074— 30 81、 1991) が報告したヒト I L12の P35及び p40 cDNA 部分をプローブとして解析を行った結果、図 1に示すように、ィヌのゲノミック DNAは、ヒト I L 12の ρ 35及び ρ 40 cDNA部分と弱くしカヽ反応しなカヽった。

—方、ィヌとネコのゲノミック DN Aが転写されたナイロンフィルターに対して、本発明者らによりクローニングされた FLAF p 35および F LAF p 40の c DN Aをプローブとして解析を行ったところ、図 2に示すように、ィヌのゲノミック DN Aはネコのゲノミック DN Aと同程度の反応性を示した。これらのことは、 CLAF遺伝子をクローニングするときのプローブとしては、 FLAFp 35及び FLAF p 40の cDNAの方が好ましいことを示している。事実、ヒト I L 12の p 35及び p 40 c DNAをプローブとした c DNAライブラリーのスクリーニングでは、 200万プラーク中、全く陽性クローンは得られなかった。以上のことから、 C LAF遺伝子のクローニングに用いるプローブとして、本発明者らによりクローニングされた FLAFp35及び FLAFp40の cDNA を用いた。 CLAFp35 eDNAのクローニングにあたっては、出願人により寄託されているプラスミド（PFLAF20) [微ェ研菌寄第 B P— 5876号] (原寄託：微ェ研菌寄第 P— 15583号）の FLAF P 35をコードする領域を用いた。また、 CLAFp40 cDNAのクローニングにあたっては、出願人により寄託されているプラスミド（pF LAF 12) [微ェ研菌寄第 BP— 5877号] (原寄託：微ェ研菌寄第 P— 15584号）の FLAFp40をコードする領域を用いた。

実施例 2 CLAFp35 cDNAのクロ一ニング

CLAF p 35 cDNAのクローニングは、活性化ィヌ脾臓 cDNA ライブラリーから行った。 c DNAライブラリ一は以下のようにして調製した。まず、ィヌの脾臓細胞（0.01%PWM存在下、 18時間培養、 3 10⁸個）より I SOGEN試薬（二ツボンジーン社）とそのプロトコールに従って全 RNAを調製した。この全 RNAよりポリ（A) クイツクキット（ストラタジーン（STRATAGENE)社）を用いてポリ A を有する RNA (ポリ A + RNA) を調製した。このポリ A + RNAより U n i— ZAP XRベクターキット（ストラタジーン社）とそのプロトコ —ルに従ってィヌ脾臓 cDN Aライブラリ一を作製した。プローブは先に述べた、プラスミド（pFLAF20) の FLAFp35をコードする領域を用いた。このプローブを用いてマニアチスら、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 2版、 8.46、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、 N. Y.、 1989) に記載の方法に従って、 20 0万プラークのスクリーニングを行ったところ、 2個の陽性プラークを得た。これらのクローン（クローン 7、 10) の制限酵素パターンを制限酵素 Ec oR I、 B amH E c oRV、 Xb a Iを用いて比較したところ、全く同じパターンを示したことから、この 2つのクローンは同じものと考えられた。そこで、クローン 7が有するプラスミド（pCLAF7) についてインサート部分（約 1.3 k b) の全塩基配列を決定した。塩基配列の決定はアプライド ·バイオシステムズ社のダイプライマーサイクルシークェンシングキット（Dye Primer Cycle Sequencing) (T 7/ S P 6および一 21/RP) を用いてモデル 1373A DNAシークェンサ一で行った。明らかになった塩基配列からオープンリーディングフレームを求めたところ、 FLAFp 35のアミノ酸残基数と全く同じ数のァミノ酸残基からなるタンパク質のコード領域が認められた。さらに、このタンパク質のアミノ酸配列は FLAFp 35とアミノ酸レベルで 91%の高いホモロジ一を示したことから、このクローン 7は、 CLAFp35の cDNAの全長を含むと考えられる。なおこのクローン 7に認められたプラスミド（pCLAF7) を有する大腸菌 CLAF 7は、ブダペスト条約に基づき、平成 10年 4月 6日付にて工業技術院生命工学工業技術研究所 (茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号）に受託番号 FERM BP— 631 9 (平成 9年 5月 20日に寄託された微ェ研菌寄第 P— 16235号より移管）として出願人により寄託されている。

実施例 3 CLAF p 40 cDNAのクローニング

実施例 2で作製した活性化ィヌ脾臓 cDNAライブラリーを用い、 CL AF p 40 c DN Aのクローニングを行った。プローブは先に述べた、プラスミ K(pFLAF12) の？乙八 40をコードする領域を用ぃた。実施例 2で示した方法に従って、 200万プラークのスクリーニングを行ったところ、 1個の陽性プラークを得た。このクローンが有するブラスミド（p CL AF 5) についてィンサート部分（約 2.2 k b) の全塩基配列を前記と同様の方法により決定した。明らかになった塩基配列からオープンリーディングフレームを求めたところ、 FLAFp40のァミノ酸残基数より 1個多いアミノ酸残基からなるタンパク質のコード領域が認められた。さらに、このタンパク質のアミノ酸配列は FLAFp40とァミノ酸レベルで 92%の高いホモロジ一を示したことから、この p CL A F5は、 CLAFp 40の cDNAの全長を含むと考えられる。なお、 p CLAF5を有する大腸菌 CLAF5は、ブダぺス卜条約に基づき、平成 10年 4月 6日付にて工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号）に受託番号 FERM BP— 6318 (平成 9年 5 月 20曰に寄託された微ェ研菌寄第 P— 16234号より移管）として出願により寄託されている。

実施例 4 CLAFp35と CLAFp40の発現ブラスミドの構築実施例 2および 3で得られた完全長の CLAFp35と CLAFp40 の c D N Aを適当な動物細胞用発現べクタ一に組み込み、その発現実験を行った。発現ベクターには p C AGn— mc s p o 1 y A (図 3) を用いた。 pCAGn— mc s p o 1 y Aベクターは発現調節領域としてヒトサイトメガロウィルスェンハンサー、ニヮトリ 3ァクチンプロモーター及びゥサギ^グロビンスプライシングシグナルを持つものである。このべクタ一の構築は以下の方法に従った。 CAGェンハンサ一 ·プロモーターの Sa l I—EcoRI断片（丹羽（Η· Niwa) ら、 Gene、 108、 1 93 (1991) ) を平滑末端化し、 pBluescript II SK+ベクターの E c oRVサイ卜に挿入して両端をそれぞれ E c 0 R I— H i n dieサイトに変換し、 pUC18ベクターの Ec oRI— H i n dmサイトに揷入した。このプラスミドより E c oR I— B amH I断片を調製し、 Hi nd IEサイトを欠失させた P S V 2 n e oベクター（サザーン（P. J.

Southern) ら、 J . Mol. Appl. Genet， 1、 327 (1982) ) の E c o R I— B amH Iサイ卜に挿入し、さらに pCB25ァ SDZBcB gプラスミド（特開平 3— 201986) 由来の B amH I— B g 1 Πのポリ A付加シグナルを含む DN A断片を B amH Iサイ卜に挿入して p C AGn— mc s ρ o 1 y Aベクターを構築した。

実施例 2で得られた CLAFp35の cDNAを pCLAF7より制限酵素 Ps t Iおよび X ho Iで切り出し、 T 4 DN Aポリメラーゼを用いて切断部位を平滑末端にした。ついで、制限酵素 S a 1 Iで切断し T4D NAポリメラーゼを用いて平滑末端に処理し、さらに細菌アル力リホスファターゼを用いて 5'端のリン酸を除いた C AGn— mc s p o 1 y Aべクターに、この CLAFp35 c DN A断片を T 4リガーゼを用いて結合させ、 CLAFp 35発現プラスミド（CAGcp35) を構築した。次にじし？ 40の発現プラスミドを構築するために、実施例 3で得られた CLAFp 40の cDNAを pCLAF5より制限酵素 B amH I および X ho Iで切り出し、 T 4 DN Aポリメラーゼを用いて切断部位を平滑末端にした。ついで、この DNA断片を、 CLAFp 35発現プラスミドの構築に用いた C AGn— mc s p o 1 y Aベクターに、 T4リガーゼを用いて結合させ、 CLAFp 40発現プラスミド（CAGcp40) を構築した。

実施例 5 COS細胞を宿主とした発現実験

FLAFの場合、 FLAFp35と FLAFp40の両方の発現ブラスミドを同時に動物細胞に導入することで、 yインタ一フエロン誘導活性を示す FLAFの発現が確認された。そこで、実施例 4で得られた CAGc p35もしくは CAGcp40を単独で、又は両方の発現ブラスミドを同時に、リボフクトエース試薬（ギブコ（G I BC〇， BRL) ) を用いて COS 7 (ATCC No. CRL 1651)細胞に導入し、その一時発現を試みた。

トランスフユク卜の前日（20時間前）に COS 7細胞を 6ゥエルプレ一ト 1ゥエルあたり 2 X 10⁵個播き込み、翌日、リボフク卜エース試薬と発現プラスミド（1ゥエル当たり l /g) を混合後、室温で 15分放置し、 COS 7細胞上に添加し、さらに無血清培地 Op t i -MEM (ギブコ）を 2ml添加した。翌日、無血清培地（ASF104、味の素株式会社製）を添加し、さらに 2日間培養を行ない、培養上清を回収し、その培養上清中に存在するヒト P B M Cに対するァインターフエ口ン誘導活性を測定した。その結果、それぞれの発現プラスミドを単独で導入したものでは、陰性対照として用いた P CAGn-mc s po l y Aをトランスフエクトしたゥエルの培養上清と同様に、全くァインタ一フニロン誘導活性は認められなかったが、 CAGcp35と CAGc p40の両方の発現プラスミドを同時に導入したものでは、ァインターフヱロン誘導活性が認められた（図 4) 。以上のことから、本発明の CL AF p 35と CLAF ρ 40はへテロダ一マーの形でァインタ一フヱロン誘導活性を示すことが明らかとなった。

CLAFは、アミノ酸配列のホモロジ一の高さから、 FLAFに相当するィヌ型のサイトカインタンパク質と考えられる。 FLAFは、本発明者らにより CTL活性を増強することが明らかにされており、 CLAFも同様に C T L増強活性を有することは容易に想像できる。

実施例 6 CLAF産生安定形質転換体の作製

実施例 5で行った COS 7細胞での発現は一時的なものであり、医薬品として使用するためには、 C LAFを安定して産生する細胞を作製する必要がある。そこで宿主としてマウスミエローマ由来の S FT34細胞（特許、国際公開番号 W094 12658) を用いて安定形質転換体の作製を行った。 S FT 34細胞は浮遊性に優れ無血清培養に順応性のある細胞である。選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を有する C AGべクターに、 CLAFp35と CLAFp40の両方の c DN Aをそれぞれ導入し、リボフェクトエース試薬を用いて同時に S FT 34細胞に導入した。その後、 2週間、 lmg/m 1の G— 418を含む 10%FCS/RPM I培地で培養し、 G— 418耐性の SFT34細胞を得た。このトランスフォーマントより限界希釈法を用いてクローニングを行い、培養上清中のァインターフユ口ン誘導活性を指標にして C L A F産生安定形質転換体を得、安定して CLAFを得ることが可能になった。

実施例 7 CLAFp 35 c DN A改変による動物細胞を宿主とした組換え CLAFの発現量の増大

実施例 5に示したごとく、 CLAFp40と CLAFp35の cDNA を動物細胞用の発現ベクターに組込み、この 2種類の発現プラスミドを同時に動物細胞に導入することで生物活性を示す C L A Fを得ることができる。しかし、この方法で得られる CLAFは 1リットル当たり数 gであり実用的な系とはいえない。そこで以下に示すような方法を用いて CL A Fp 35 cDN Aの改変を行うことで、発現量の増大が可能となった。ステップ 1

まず、実施例 2で得られたプラスミド P CLAF 7を制限酵素 B smA Iで切断後、その断片の両端を T 4 D N Aポリメラーゼを用いて平滑末端に処理した。その後、この断片を制限酵素 S a c Iで切断後、約 800 b Pの断片をァガロースゲルより切り出した。この断片を、制限酵素 E co RVと S a c Iで処理を行ったベクター pBluescriptにサブクローニングした。

ステップ 2

次にこのプラスミドを铸型として、配列表の配列番号 3に示す一 25番から一 3番のァミノ酸配列 Met— Cys— Pro— Pro— Arg— Gly— Leu— Leu— Leu— Val— Thr— I le— Leu— Val— Leu— Leu— Ser— His— Leu— Asp— His— Leu— Thrに対応する配列番号 9に示す配列を持つ合成プライマーと、市販の T7プライマー（宝酒造）を用いてアンプリタツク DN Aポリメラ一ゼ（Amplitaq DNA polymerase) (宝酒造）による 95°C1分、 60°C2分、 72°C2分の 35サイクルの PCR反応を行つた。配列番号 9に示すプライマ一は翻訳の効率を高めると言われている K 0 z a k配列（J. Cell. Biol Vol.108、 229— 233(1989)) を N末端側に含んでいる。この反応で得られた DNAフラグメントを制限酵素 S a c Iおよび Xb a Iで切断し、この断片を回収した。このとき同時に、ステップ 1で得られたプラスミドを、あらかじめ同じ酵素処理を行い、このステップ 2で得られた断片を S a c Iおよび Xb a Iサイ卜に導入した。このステップで得られたプラスミドのインサート部分について塩基配列を決定しフレームシフトなどの変異が起こっていないことを確認し 7L。

ステップ 3

コーディング領域のァミノ酸のうち配列表の配列番号： 3に示す 64— Leu, 68 -Leu. 124— Leuのコドンは TT Aを使用している。 Leu のコドンは 6種類存在するがこの T T Aは哺乳動物細胞での使用頻度は最も低いものである (Current Protocols in Molecular Biology、

Supplement 12、 A.1.9)。そこで、この 3つの Leuのコドンを最も使用頻度の高い CTGに置き換えることを行った。まずこの領域に存在する制限酵素切断部位 E c oRVサイト付近の配列に対応する合成 DNA：

GGAGGCCTGCCTGCCACTGGAACTGACCATGAA

TGAGAGTTGC CTG (配列番号： 10)

及び、 B amH Iサイト付近の配列に対応する合成 D N A：

GAA (配列番号： 11)

を合成した。この 2種類の合成 DN Aをプライマ一としてステップ 2で得られた DN Aを铸型としてステップ 2で述べた条件で PC R反応を行った。この反応で増幅した断片をァガロースゲル電気泳動で分離後、ゲルよりこの DNAを回収した。この DNAを BamHI、 EcoRVで切断後、同じ制限酵素で処理したステップ 2で得られたプラスミドと結合反応を行つた。得られたプラスミドの、 PCR断片と置き換わった部分について塩基配列を決定し、フレームシフトなどの変異が起こっていないことを確認した。配列表の配列番号： 12はステップ 1からステップ 3の操作で得られた改変した CLAFp35 c DN Aの塩基配列を示したものである。この DNA断片を制限酵素 S a 1 Iで切断し、実施例 4に示した発現ベクター pCAGn— mc sの Sa i lサイトに導入し、新規な CLAFp35発現プラスミドを構築した（CAGcp35V2)。

ここで得られた C AG c p 35 V2と実施例 4に示した C AG c p 40とを、実施例 5で示した方法に従って S FT 34細胞に導入し安定形質転換体を作製した。この安定形質転換体と実施例 5で得られた安定形質転換体をそれぞれ 2リットル培養した。それぞれの培養上清について、出願人等により作成された、 FLAF p 35の合成べプチドに対するモノクローナル抗体を固定化したゲル（W097/46583) を用いて精製を行った。その結果、 C AG c p 35 V 2を導入して得られた培養上清は C AG c p 35を導入して得られた培養上清と比べて約 20倍量の精製 CLAFが得られた。

配列表

配列番号： 1

配列の長さ： 3 3 0

配列の型：アミノ酸

鎖の数： 1本鎮

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

2 2

起源

生物名：ィヌ脾臓細胞

配列

Met His Pro Gin Gin Leu Val lie Ser Trp Phe Ser Leu Val Leu

-20 -15 -10

Leu Ala Ser Pro Leu Met Ala lie rrp Glu Leu Glu Lys Asp Val

-5 - 1 1 5

Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp His Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met

10 15 20

Val Val Leu Thr Cys His Thr Pro Glu Glu Asp Asp lie Thr Trp

25 30 35

Thr Ser Ala Gin Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu

40 45 50

Thr lie Gin Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gin Tyr Thr Cys

55 60 65

His Lys Gly Gly Lys Val Leu Ser Arg Ser Leu Leu Phe Asp Ser

70 75 80 Thr Lys Lys Lys Asp Gly lie Trp Ser Thr Asp He Leu Lys Glu

85 90 95

Gin Lys Glu Ser Lys Asn Lys lie Phe Leu Lys Cys Glu Ala Lys

100 105 110

Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Ala lie Ser

115 120 125

Thr Asp Leu Lys Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Phe Ser Asp

130 135 140

Pro Gin Gly Val Thr Cys Gly Ala Val Thr Leu Ser Ala Glu Arg

145 150 155

Val Arg Val Asp Asn Arg Asp Tyr Lys Lys Tyr Thr Val Glu Cys

160 165 170

Gin Glu Gly Ser Ala Cys Pro Ser Ala Glu Glu Ser Leu Pro lie

175 180 185

Glu Val Val Val Asp Ala lie His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr

190 195 200

Thr Ser Ser Phe Phe lie Arg Asp lie lie Lys Pro Asp Pro Pro

205 210 215

Thr Asn Leu Gin Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg His Val Glu

220 225 230

Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr

235 240 245

Phe Ser Leu Thr Phe Cys lie Gin Ala Gin Gly Lys Asn Asn Arg

250 255 260 Glu Lys Lys Asp Arg Leu Cys Val Asp Lys Thr Ser Ala Lys Val

265 270 275

Val Cys His Lys Asp Ala Lys lie Arg Val Gin Ala Arg Asp Arg

280 285 290

Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Asp Trp Ala Ser Val Ser Cys Ser

295 300 305 配列番号： 2

配列の長さ： 3 0 8

配列の型：アミノ酸

鎖の数： 1本鑌

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド生物名：ィヌ脾臓細胞

配列

lie Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val 1 5

Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp His Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met

10 15 20

Val Val Leu Thr Cys His Thr Pro Glu Glu Asp Asp lie Thr Trp

25 30 35

Thr Ser Ala Gin Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu 40 45 50 Thr lie Gin Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gin Tyr Thr Cys

55 60 65

His Lys Gly Gly Lys Val Leu Ser Arg Ser Leu Leu Phe Asp Ser

70 75 80

Thr Lys Lys Lys Asp Gly lie Trp Ser Thr Asp lie Leu Lys Glu

85 90 95

Gin Lys Glu Ser Lys Asn Lys lie Phe Leu Lys Cys Glu Ala Lys

100 105 110

Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Ala lie Ser

115 120 125

Thr Asp Leu Lys Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Phe Ser Asp

130 135 140

Pro Gin Gly Val Thr Cys Gly Ala Val Thr Leu Ser Ala Glu Arg

145 150 155

Val Arg Val Asp Asn Arg Asp Tyr Lys Lys Tyr Thr Val Glu Cys

160 165 170

Gin Glu Gly Ser Ala Cys Pro Ser Ala Glu Glu Ser Leu Pro lie

175 180 185

Glu Val Val Val Asp Ala lie His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr

190 195 200

Thr Ser Ser Phe Phe lie Arg Asp lie lie Lys Pro Asp Pro Pro

205 210 215

Thr Asn Leu Gin Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg His Val Glu

220 225 230 Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr

235 240 245

Phe Ser Leu Thr Phe Cys lie Gin Ala Gin Gly Lys Asn Asn Arg

250 255 260

Glu Lys Lys Asp Arg Leu Cys Val Asp Lys Thr Ser Ala Lys Val

265 270 275

Val Cys His Lys Asp Ala Lys lie Arg Val Gin Ala Arg Asp Arg

280 285 290

Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Asp Trp Ala Ser Val Ser Cys Ser

295 300 305 配列番号： 3

配列の長さ： 2 2 2

配列の型：アミノ酸

鎖の数： 1本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

起源

生物名：ィヌ脾臓細胞

配列

Met Cys Pro Pro Arg Gly Leu Leu Leu Val Thr lie Leu Val Leu -25 -20 -15

Leu Ser His Leu Asp His Leu Thr Trp Ala Arg Ser Leu Pro Thr -10 -5 -1 1 5 Ala Ser Pro Ser Pro Gly lie Phe Gin Cys Leu Asn His Ser Gin

10 15 20

Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Thr Leu Gin Lys Ala Arg Gin

25 30 35

Thr Leu Glu Leu Tyr Ser Cys Thr Ser Glu Glu lie Asp His Glu

40 45 50

Asp lie Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro

55 60 65

Leu Glu Leu Thr Met Asn Glu Ser Cys Leu Ala Ser Arg Glu lie

70 75 80

Ser Leu lie Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Gly Lys Ala Ser

85 90 95

Phe Met Thr Val Leu Cys Leu Ser Ser lie Tyr Glu Asp Leu Lys

100 105 110

Met Tyr Gin Met Glu Phe Lys Ala Met Asn Ala Lys Leu Leu Met

115 120 125

Asp Pro Lys Arg Gin lie Phe Leu Asp Gin Asn Met Leu Thr Ala

130 135 140 lie Asp Glu Leu Leu Gin Ala Leu Asn Phe Asn Ser Val Thr Val

145 150 155

Pro Gin Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys

160 165 170 lie Lys Leu Cys lie Leu Leu His Ala Phe Arg lie Arg Ala Val

175 180 185 83

08 Si U

3n nig Sjy iss nsq SAQ J3S usy 3H ι¾ na ηχ nsq

99 09 99

o-id naq s BTV nio IBA Jqi J3S sAq dsy sAq iq 9Π dsy

05 ^ 0

nTD STH dsy 3χι ηχο JQS iqi SAQ las ιλχ ngq ηχ^ ng iqx

5S OS

ui3 3jy ^TV sAq uij) naq 丄 usy J9S ^TV 3·ΐγ n9q nsq usy

02 51 01

^U J9S sin usy ngq SAQ ufj) 3qj 9χι Αχ^ OJJ s OJJ JQS BTV

5 ΐ

ュ ojj ngq JQS 3iy

»K¾[ 2i ：呦^ m mm :— ^ α ίΗ 翳本 I ：凝 ©翳丄 6 τ :

： ½灘31

561 061

-I3S usy ngq ιΑ J9S 3R 3ュ V dsy 3χι jq丄

S6rZ0/86dT/13«I USSS/86 O Ser Leu lie Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Gly Lys Ala Ser 85 90 95

Phe Met Thr Val Leu Cys Leu Ser Ser lie Tyr Glu Asp Leu Lys

100 105 110

Met Tyr Gin Met Glu Phe Lys Ala Met Asn Ala Lys Leu Leu Met

115 120 125

Asp Pro Lys Arg Gin lie Phe Leu Asp Gin Asn Met Leu Thr Ala

130 135 140 lie Asp Glu Leu Leu Gin Ala Leu Asn Phe Asn Ser Val Thr Val

145 150 155

Pro Gin Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys

160 165 170 lie Lys Leu Cys lie Leu Leu His Ala Phe Arg lie Arg Ala Val

175 180 185

Thr lie Asp Arg Met Met Ser Tyr Leu Asn Ser Ser

190 195 配列番号： 5

配列の長さ： 2 1 5 4

配列の型：核酸

鎖の数： 2本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： c D N A

起源

生物名：ィヌ脾臓細胞配列

T CCACAGGAAG GAGCAGACCC AGGGAACCH GCAGCCTGGC CAGAAGCAAG 51

ATG CAT CCT CAG CAG TTG GTC ATC TCC TGG TTT TCC CTC GTT TTG CTG 99 GCG TCT CCC CTC ATG GCC ATA TGG GAA CTG GAG AAA GAT GTT TAT GTT 147 GTA GAG TTG GAC TGG CAC CCT GAT GCC CCC GGA GAA ATG GTG GTC CTC 195

ACC TGC CAT ACC CCT GAA GAA GAT GAC ATC ACT TGG ACC TCA GCG CAG 243

AGC AGT GAA GTC CTA GGT TCT GGT AAA ACT CTG ACC ATC CAA GTC AAA 291

GAA m GGA GAT GCT GGC CAG TAT ACC TGC CAT AAA GGA GGC AAG GTT 339

CTG AGC CGC TCA CTC CTG TTT GAT TCC ACA AAA AAG AAA GAT GGA ΑΠ 387

TGG TCC ACT GAT ATC TTA AAG GAA CAG AAA GAA TCC AAA AAT AAG ATC 435

TTT CTG AAA TGT GAG GCA AAG AAT TAT TCT GGA CGT TTC ACA TGC TGG 483

TGG CTG ACG GCA ATC AGT ACT GAT HG AAA TTC AGT GTC AAA AGT AGC 531

AGA GGC TTC TCT GAC CCC CAA GGG GTG ACA TGT GGA GCA GTG ACA CTT 579

TCA GCA GAG AGG GTC AGA GTG GAC AAC AGG GAT TAT AAG AAG TAC ACA 627

GTG GAG TGT CAG GAG GGC AGT GCC TGC CCC TCT GCC GAG GAG AGC CTA 675

CCC ATC GAG GTC GTG GTG GAT GCT ATT CAC AAG CTC AAG TAT GAA AAC 723

TAC ACC AGC AGC TTC TTC ATC AGA GAC ATC ATC AAA CCA GAC CCA CCC 771

ACA AAC CTG CAG CTG AAG CCA TTG AAA AAT TCT CGG CAC GTG GAG GTC 819

AGC TGG GAA TAC CCC GAC ACC TGG AGC ACC CCA CAT TCC TAC TTC TCC 867

CTG ACA ΠΤ TGC ATA CAG GCC CAG GGC AAG AAC AAT AGA GAA AAG AAA 915

GAT AGA CTC TGC GTG GAC AAG ACC TCA GCC AAG GTC GTG TGC CAC AAG 963

GAT GCC AAG ATC CGC GTG CAA GCC CGA GAC CGC TAC TAT AGT TCA TCC 1011

TGG AGC GAC TGG GCA TCT GTG TCC TGC AGT TAG GTTCCACCCC CAGGATGAAT 1064

OTGGAGGGA AAGTGGAAGA TATTATGCAA MTTTTCTAA GGACACAHG AAGAGGCTCC 1124

AAAAGHAH TTCTGCCTAA ΤΠΤΟΓΓΤΠ GTAAAGGGTC A ATTGTGT CHCGCAATA 1184 TTTTTTACAT HAAATGCCA AATGCCCACT GAAACAATCA GCTACTTTAT TTATAGAm 1244

TCAGCTAGCA GGCTGCCACT GACCTTAATG CTATTTAAAT AT TAAGTAA T TATGTATT 1304

ΤΑΤΤΑΑΠΤΑ TTG ATTGA ACACTTGTGT GCCAAGATAT A GTATG TCATACCCTC 1364

AGGACCTGAT CTGTAAGGAA TAGGCCCTAT TATGCAAAAT GTGAATTTAT GTGHATTTA 1424

TACTGACAAC TTTTCAAGCA AGAATGTATC ATTTTTATGA CAACCAGTGA GCACACAATA 1484

TTATGATGCC AGCACCATAA TATATTTGTG ATGGATGGGA ACACAGAGGT AGWAAATAG 1544

AGACATGGAG ACACGAATCC ATTTGAGAAG THCTGGAGA CGGAGATGH AGATCCTGTA 1604

TCCATAAAGA CTTCCTTGCG GTGGTGTTGA TAAAGCAAH CAGGGCCACT TGCATTTTTA 1664

AGCAAGrTTA GTTTI GGAT GCCTGAATTT AGAAAGACCT GAGACAAATA ACTCAAATTG 1724

AGATTCAGCT TCAGCCACCT TGCCAGTCCC CATCCCCATC TATCTGTAAG TCATTGGAGA 1784

GTGACCCAGG GACACTGTAA GTGTCTGGAA GTAAAAAGGT CTTATGATCC AAGAGGGAGA 1844

ACCAACATGG CCAAGCACAA AAAAHGTCA GAATTTCCAG CTGCTCCTTA ATAGCCAGGC 1904

AAAAAAAGCA CATGGATGCA AAGAAAATGG TCAAGAAHG CTTACTGGAC AGCGCAAGTG 1964

AACCTGACTG GTGGATGTGA CCAGAAAGTG CCAATCGCTG AGGTGCTACT TTTAAGTAAT 2024

GAATGTGCTT TCTGTAAAGT GATTTCATTT CTTTTCTG TACTTAT TG TTTTTGCAn 2084

CTGACAATGC ACTAATAAAA ATATAACTCT TGTTTGCAAT AATAAAAAAA AAAAAAAAAA 2144

AAAAAAAAAA 2154 配列番号： 6

配列の長さ： 9 2 4

配列の型：核酸

鎖の数： 2本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： c D N A

起源生物名：ィヌ脾臓細胞

配列

ATA TGG GAA CTG GAG AAA GAT GTT TAT GTl 30

GTA GAG TTG GAC TGG CAC CCT GAT GCC CCC GGA GAA ATG GTG GTC CTC 78 ACC TGC CAT ACC CCT GAA GAA GAT GAC ATC ACT TGG ACC TCA GCG CAG 126 AGC AGT GAA GTC CTA GGT TCT GGT AAA ACT CTG ACC ATC CAA GTC AAA 174

GAA ΤΠ GGA GAT GCT GGC CAG TAT ACC TGC CAT AAA GGA GGC AAG GTT 222

CTG AGC CGC TCA CTC CTG ΤΠ GAT TCC ACA AAA AAG AAA GAT GGA ATT 270

TGG TCC ACT GAT ATC ΠΑ AAG GAA CAG AAA GAA TCC AAA AAT AAG ATC 318

ΠΤ CTG AAA TGT GAG GCA AAG AAT TAT TCT GGA CGT TTC ACA TGC TGG 366

TGG CTG ACG GCA ATC AGT ACT GAT TTG AAA TTC AGT GTC AAA AGT AGC 414

AGA GGC TTC TCT GAC CCC CAA GGG GTG ACA TGT GGA GCA GTG ACA CTT 462

TCA GCA GAG AGG GTC AGA GTG GAC AAC AGG GAT TAT AAG AAG TAC ACA 510

GTG GAG TGT CAG GAG GGC AGT GCC TGC CCC TCT GCC GAG GAG AGC CTA 558

CCC ATC GAG GTC GTG GTG GAT GCT ΑΠ CAC AAG CTC AAG TAT GAA AAC 606

TAC ACC AGC AGC TTC TTC ATC AGA GAC ATC ATC AAA CCA GAC CCA CCC 654

ACA AAC CTG CAG CTG AAG CCA TTG AAA AAT TCT CGG CAC GTG GAG GTC 702

AGC TGG GAA TAC CCC GAC ACC TGG AGC ACC CCA CAT TCC TAC TTC TCC 750

CTG ACA m TGC ATA CAG GCC CAG GGC AAG AAC AAT AGA GAA AAG AAA 798

GAT AGA CTC TGC GTG GAC AAG ACC TCA GCC AAG GTC GTG TGC CAC AAG 846

GAT GCC AAG ATC CGC GTG CAA GCC CGA GAC CGC TAC TAT AGT TCA TCC 894

TGG AGC GAC TGG GCA TCT GTG TCC TGC AGT 924 P T

配列番号： 7

配列の長さ： 1 2 8 2

配列の型：核酸

鎖の数： 2本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： c D N A

起源

生物名：ィヌ脾臓細胞

配列

GGCAC 5

GAGGCCGCGT CCGCAGTCCG CGTCCAGCGC CCGCCGGGGT CCACGCAGCG CCCGCCCAGC 65 ATG TGC CCG CCG CGC GGC CTC CTC CTT GTG ACC ATC CTG GTC CTG CTA 113 AGC CAC CTG GAC CAC CTT ACT TGG GCC AGG AGC CTC CCC ACA GCC TCA 161 CCG AGC CCA GGA ATA TTC CAG TGC CTC AAC CAC TCC CAA AAC CTG CTG 209 AGA GCC GTC AGC AAC ACG CTT CAG AAG GCC AGA CAA ACT CTA GAA ΠΑ 257 TAT TCC TGC ACT TCC GAA GAG ATT GAT CAT GAA GAT ATC ACA AAG GAT 305 AAA ACC AGC ACA GTG GAG GCC TGC ΠΑ CCA CTG GAA ΠΑ ACC ATG AAT 353 GAG AGT TGC CTG GCT TCC AGA GAG ATC TCT HG ATA ACT AAC GGG AGT 401 TGC CTG GCC TCT GGA AAG GCC TCT ΠΤ ATG ACG GTC CTG TGC CTT AGC 449 AGC ATC TAT GAG GAC TTG AAG ATG TAC CAG ATG GAA TTC AAG GCC ATG 497 AAC GCA AAG CTT TTA ATG GAT CCC AAG AGG CAG ATC TTT CTG GAT CAA 545 AAC ATG CTG ACA GCT ATC GAT GAG CTG TTA CAG GCC CTG AAT TTC AAC 593 AGT GTG ACT GTG CCA CAG AAA TCC TCC CTT GAA GAG CCG GAT ΓΓΤ TAT 641 AAA ACT AAA ATC AAG CTC TGC ATA CTT CTT CAT GCT TTC AGA ΑΠ CGT 689 GCG GTG ACC ATC GAT AGA ATG ATG AGT TAT CTG AAT TCT TCC TAA 734 AAAGCTGAGG TCTCTCTCGA CTTTAAAGTC ATTCTTATAA AAATGTGAAC CAAAAGAATT 794

TTTCATAAGA TAGGGGHAA GAACCAGGGA GGGGGTGGCT TGACCTGGTC CTACTTAAGC 854

TAGTACGATA ATTCTCATGC nGTHACAT TAG GCCAC TCAAA而 G AAAGATGTGA 914

CTGTTATATC CACACGATGC CTTTGACCAA GTATATTTCA CATTTACTAT GGATAAGHA 974

AGTGnCGTG AGCAAAHGC TAAAGAGGAA AAATGTCCTC ACCGAACATG ΤΤΓΓΤΑΤΤΠ 1034

CCCTTTAATA GAAGAGCAAG ACTTTATAAG CTATTTCTGT ACCAAACTGT HGTAGAAAC 1094

AAACACTCAA GCATAATTTA TTTAAAAATA CTTATTTATA TAA而 GTG TTCATGAAAG 1154

CATGTGAAn ΑΑΠ ΑΤΑΤΤ TATTTATGTT ΑΤΑΓΓΤΑΤΤΑ AAGTATTTAT TATCAAGTGG 1214

ATTTGGGATA TCTTATGTTC TAAAAATAAA ATGATTGAGT AGGAAAAAAA AAAAAAAAAA 1274

AAAAAAAA 1282 配列番号： 8

配列の長さ： 5 9 1

配列の型：核酸

鎖の数： 2本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： c D N A

起源

生物名：ィヌ脾臓細胞

配列

AGG AGC CTC CCC ACA GCC TCA 21 CCG AGC CCA GGA ATA TTC CAG TGC CTC AAC CAC TCC CAA AAC CTG CTG 69 AGA GCC GTC AGC AAC ACG CTT CAG AAG GCC AGA CAA ACT CTA GAA TTA 117 TAT TCC TGC ACT TCC GAA GAG ATT GAT CAT GAA GAT ATC ACA AAG GAT 165 AAA ACC AGC ACA GTG GAG GCC TGC ΠΑ CCA CTG GAA TTA ACC ATG AAT 213 GAG AGT TGC CTG GCT TCC AGA GAG ATC TCT ΉQ ATA ACT AAC GGG AGT 261

TGC CTG GCC TCT GGA AAG GCC TCT TTT ATG ACG GTC CTG TGC OT AGC 309

AGC ATC TAT GAG GAC TTG AAG ATG TAC CAG ATG GAA TTC AAG GCC ATG 357

AAC GCA AAG CTT ΠΑ ATG GAT CCC AAG AGG CAG ATC ΤΠ CTG GAT CAA 405

AAC ATG CTG ACA GCT ATC GAT GAG CTG TTA CAG GCC CTG AAT TTC AAC 453

AGT GTG ACT GTG CCA CAG AAA TCC TCC CTT GAA GAG CCG GAT TTT TAT 501

AAA ACT AAA ATC AAG CTC TGC ATA CTT CTT CAT GCT TTC AGA ΑΠ CGT 549

3

5

GCG GTG ACC ATC GAT AGA ATG ATG AGT TAT CTG AAT TCT TCC 591

配列番号： 9

配列の長さ： 9 5

配列の型：核酸

鎖の数： 1本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 D N A)

配列

CCGAGCTCGG GTCGACGGCC GCCGCCATGT GCCCCCCCCG CGGCCTCCTC 50 CTGGTGACCA TCCTGGTCCT GCTGAGCCAC CTGGACCACC HACT 95

配列番号： 1 0

配列の長さ： Ί 9

配列の型：核酸

鎖の数： 1本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 D N A) 配列

TGAAGATATC ACAAAGGATA AAACCAGCAC AGTGGAGGCC TGCCTGCCAC 50

TGGAACTGAC CATGAATGAG AGTTGCCTG 79 配列番号： 1 1

配列の長さ： 3 6

配列の型：核酸

鎖の数： 1本鎖

トポロジー：直鑌状

配列の種類：他の核酸（合成 D N A)

配列

GGGATCCATC AGAAGCHTG CGTTCATGGC CHGAA 36 配列番号： 1 2

配列の長さ： 6 8 9

配列の型：核酸

鎖の数： 2本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： c D N A

起源

生物名：ィヌ脾臓細胞

配列

GCC GCC 6

ATG TGC CCC CCC CGC GGC CTC CTC CTG GTG ACC ATC CTG GTC CTG CTG 54 AGC CAC CTG GAC CAC CTT ACT TGG GCC AGG AGC CTC CCC ACA GCC TCA 102 CCG AGC CCA GGA ATA TTC CAG TGC CTC AAC CAC TCC CAA AAC CTG CTG 150 AGA GCC GTC AGC AAC ACG CH CAG AAG GCC AGA CAA ACT CTA GAA TTA 198 TAT TCC TGC ACT TCC GAA GAG ΑΠ GAT CAT GAA GAT ATC ACA AAG GAT 246 AAA ACC AGC ACA GTG GAG "GCC TGC CTG CCA CTG GAA CTG ACC ATG AAT 294 GAG AGT TGC CTG GCT TCC AGA GAG ATC TCT TTG ATA ACT AAC GGG AGT 342 TGC CTG GCC TCT GGA AAG GCC TCT TTT ATG ACG GTC CTG TGC CTT AGC 390 AGC ATC TAT GAG GAC AAG ATG TAC CAG ATG GAA TTC AAG GCC ATG 438 AAC GCA AAG CTT CTG ATG GAT CCC AAG AGG CAG ATC TTT CTG GAT CAA 486 AAC ATG CTG ACA GCT ATC GAT GAG CTG TTA CAG GCC CTG AAT TTC AAC 534 AGT GTG ACT GTG CCA CAG AAA TCC TCC CTT GAA GAG CCG GAT ΤΠ TAT 582 AAA ACT AAA ATC AAG CTC TGC ATA CH CTT CAT GCT TTC AGA ΑΠ CGT 630 GCG GTG ACC ATC GAT AGA ATG ATG AGT TAT CTG AAT TCT TCC TAA AAA 678 GCT GAG GTC TC 689

Claims

請求の範囲

1. リンパ球を活性化する活性を有するタンパク質であって、

(1)配列表の配列番号： 1又は配列表の配列番号： 2で示されるァミノ酸配列を有するポリペプチド、

(2)上記（1) に記載のアミノ酸配列に対し、少なくとも 1アミノ酸が欠失、付加又は置換されたァミノ酸配列を有するポリべプチド、

(3)配列表の配列番号： 1で示されるアミノ酸配列の一部を有するポリペプチド，又は

(4)遺伝子組換え技術により得られる組換え型ポリべプチドである上記 (1) から（3) のいずれかに記載のポリペプチド

より選ばれる 1ポリペプチドと、

(a)配列表の配列番号： 3又は配列表の配列番号： 4で示されるァミノ酸配列を有するポリべプチド、

(b)上記（a) に記載のアミノ酸配列に対し、少なくとも 1アミノ酸が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有するポリべプチド、

(c)配列表の配列番号： 3で示されるアミノ酸配列の一部を有するポリペプチド，又は

(d)遺伝子組換え技術により得られる組換え型ポリべプチドである上記 (a) から（c) のいずれかに記載のポリペプチド

より選ばれる 1ポリペプチド

とからなる前記タンパク質。

2. 前記リンパ球がィヌ由来であることを特徴とする請求項 1に記載のタンパク質。

3. 前記リンパ球が細胞傷害性 Tリンパ球であることを特徴とする請求項 1又は 2に記載のタンパク質。

4. (1)配列表の配列番号： 1又は配列表の配列番号： 2で示されるァミノ酸配列を有するポリベプチド、

より選ばれるポリペプチド。

5. (a)配列表の配列番号： 3又は配列表の配列番号： 4で示されるァミノ酸配列を有するポリぺプチド、

(b)上記（a) に記載のアミノ酸配列に対し、少なくとも 1アミノ酸が欠失、付加又は置換されたァミノ酸配列を有するポリぺプチド、

より選ばれるポリべプチド。

6. 請求項 4に記載の（1) から（4) のいずれかのポリペプチドのホモダイマー。

7. 請求項 1から 3のいずれかに記載のタンパク質、請求項 4又は 5に記載のポリべプチド、又は請求項 6に記載のホモダイマーをコードする塩基配列を含むことを特徵とする DNA。

8. 配列表の配列番号： 5、 6、 7、 8もしくは 12のいずれかで示される塩基配列を含むことを特徵とする請求項 7に記載の D N A。

9. 配列番号： 5もしくは 7で示される塩基配列の一部を含むことを特徵とする請求項 7に記載の D N A。

1 0. 配列表の配列番号： 5、 7もしくは 1 2のいずれかで示される塩基配列に相補的な塩基配列を有する D N Aとハイブリダィズし、ィヌリンパ球細胞を活性化する活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする D N A。

1 1 . 請求項 7から 1 0のいずれかに記載の D N Aを含むことを特徵とする組換え D NA分子。

1 2. 組換え D N A分子の構成部分であるべクタ一が、プラスミド、ゥィルスべクタ一、コスミドより選ばれる請求項 1 1に記載の組換え D N A 分子。

1 3. 請求項 7もしくは 1 0のいずれかに記載の D N A又は請求項 1 1 もしくは 1 2に記載の組換え D N A分子で形質転換した形質転換体。

1 4. 前記形質転換体が、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞より選ばれる宿主である請求項 1 3に記載の形質転換体。

1 5. 請求項 1から 3のいずれかに記載のタンパク質、請求項 4又は 5 に記載のポリぺプチド、又は請求項 6に記載のホモダイマーを認識することを特徵とする抗体。

1 6. 前記抗体がモノクローナル抗体又はポリクロ一ナル抗体である請求項 1 5に記載の抗体。

1 7. 請求項 1 3もしくは 1 4に記載の形質転換体を培養し、請求項 1 から 3のいずれかに記載のタンパク質、請求項 4又は 5に記載のポリぺプチド、又は請求項 6に記載のホモダイマーを生産させ、該タンパク質、ポリベプチド又はホモダイマーを精製することを特徴とする、請求項 1から 3のいずれかに記載のタンパク質、請求項 4又は 5に記載のポリぺプチド- 又は請求項 6に記載のホモダイマーの製造方法。

1 8. 請求項 1 5又は 1 6に記載の抗体を用いることを特徵とする請求項 1 7に記載の製造方法。

1 9. 請求項 6に記載のホモダイマ一を主成分とするィヌ自己免疫疾患の治療剤。

2 0. 請求項 1から 3のいずれかに記載のタンパク質を主成分とするィヌウィルス性疾患の治療剤。

2 1. 請求項 1 5もしくは 1 6に記載の抗体を主成分とするィヌウィルス性疾患の治療剤。