KR101772366B1

KR101772366B1 - Ｎｐｐ１ 융합 단백질

Info

Publication number: KR101772366B1
Application number: KR1020177003612A
Authority: KR
Inventors: 안토니 퀸; 알렉스 제이. 하베이; 지난 시아
Original assignee: 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드
Priority date: 2011-03-11
Filing date: 2011-09-15
Publication date: 2017-08-28
Also published as: MX361434B; CA2829767C; WO2012125182A1; SG193024A1; CA2829767A1; EP2683742A4; KR20170018473A; AU2011362576A1; CN103443128B; EP2683742B1; MX2013010392A; EP2683742A1; RU2013142583A; RU2601154C2; AU2011362576B2; CN103443128A

Abstract

본 발명은 표적화 모이어티에 융합된 NPP1의 촉매 도메인을 함유하는 신규한 융합 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 통합된 핵산을 함유하는 벡터, 벡터로 형질전환된 숙주 세포 및 융합 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

Description

ＮＰＰ１ 융합 단백질{NPP1 FUSION PROTEINS}

관련 출원

본 출원은 2010년 3월 12일에 출원된 미국 가출원 번호 61/340,066호의 이익을 주장하는, 2011년 3월 11일에 출원된 PCT/US2011/028233호의 이익을 주장한다. 상기 출원의 전체 교시내용은 참조로서 본원에 포함된다.

엑토누클레오티드 피로포스파타제/포스포디에스테라제 1(NPP1/ENPP1/PC-1)은 동종이합체를 형성하는 타입 II 막횡단 당단백질이다. 상기 단백질은 누클레오티드 및 누클레오티드 당의 포스포디에스테르 결합 및 누클레오티드 및 누클레오티드 당의 피로포스페이트 결합을 포함하는 다양한 기질을 분해한다. NPP1 단백질은 누클레오시드 5' 트리포스프타제(triphosphtase)를 상응하는 모노포스페이트로 가수분해하고, 디아데노신 폴리포스페이트로 또한 가수분해하는 작용을 한다. NPP1 유전자에서의 돌연변이는 특발성 영아 동맥 석회화(idiopathic infantile arterial calcification, IIAC), 인슐린 내성, 저인산혈구루병, 및 척추의 후종인대의 골화와 관련되어 있다.

희귀한 보통염색체 열성이며 거의 항상 치명적인 장애인 IIAC는 근육동맥의 내부 탄력층의 석회화 및 근내막 증식으로 인한 협착증을 특징으로 한다. 전세계적으로 보고된 160명을 초과하는 IIAC 환자가 있다. 상기 질병의 증상은 가장 흔하게는 어린 영아에서 나타나며, 상기 질병은 일반적으로 허혈성 심근병증, 및 신동맥협착을 포함하는 폐쇄성 동맥병증의 다른 합병증으로 인해 생후 6개월까지 치명적이다. IIAC의 12명을 초과하는 보고된 환자에서, 큰 관절의 관절주위 석회화가 또한 영아에서 발생하였다. 문헌[Rutsch et al. (2003)]에는 ENPP1에서의 돌연변이가 생애 초기에 자발적 관절주위 및 대동맥 석회화, 및 병에 걸린 개체에서 누클레오티드 피로포스파타제/포스포디에스테라제의 전신 저하를 특징으로 하는 IIAC와 관련되어 있음이 보고되어 있다.

NPP1 단백질에서의 결함이 IIAC와 같은 심각한 질병과 연관되어 있으나, 상기 질병에 걸린 사람들에 대한 당 분야에서 이용 가능한 치료제가 없다. 따라서, IIAC, 인슐린 내성, 저인산혈구루병, 및 척추의 후종인대의 골화의 치료를 위한 효과적이고 안전한 조성물, 제형 및 약제가 긴급히 필요하다.

본 발명은 ＮＰＰ１ 융합 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 표적화 모이어티(targeting moiety)에 융합된 NPP1의 트렁케이션된 도메인(즉, NPP1 성분)의 융합 단백질을 포함한다. 표적화 모이어티는 임상적 또는 생물학적으로 중요한 부위(예를 들어, 석회화의 저하를 필요로 하는 피검체의 석회화 부위)에 NPP1 융합 단백질을 표적화시키는 것의 효율을 향상시키는 작용을 한다. 본 발명을 임의의 특정 이론 또는 작용 메커니즘으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, NPP1 성분은 피로포스페이트(PPi)의 형성을 향상시키고/시키거나, 피로포스페이트를 분해시켜 가용성 포스페이트(Pi)를 생성시키고/시키거나, 아데노신 모노포스페이트(AMP) 및/또는 아데노신의 이용가용성을 증가시킴으로써 석회화를 억제하는 작용을 하는 것으로 생각된다. 표적화 모이어티가 임의의 유용한 위치에서 NPP1 성분의 N-말단 및/또는 C-말단에 부착될 수 있는 것으로 생각된다. 또한, 본원에 개시된 NPP1 융합 단백질은 Fc 단편, PEG, 폴리펩티드 링커 또는 효소 활성, 안정성 또는 표적화를 향상시키는 다른 추가 폴리펩티드 중 하나 이상을 또한 포함할 수 있다.

본 발명의 융합 단백질은 피검체에서 매우 다양한 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질의 투여에 의해 유리하게 치료될 수 있는 임의의 질환이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 하나 이상의 석회화 구조를 감소시키고/시키거나 제거하고/하거나, 피검체, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간 환자에서 석회화 구조가 형성되는 것을 예방함으로써 개선될 수 있는 질환의 치료가 본 발명의 범위에 포함된다. 동맥 폐색과 같은 질환이 본 발명의 융합 단백질을 이용한 치료에 고려된다. 한 특히 유용한 구체예에서, 치료 질환은 영아의 특발성 동맥 석회화 및 영아의 동맥 중막 석회화로도 알려진 영아의 전신 동맥 석회화이다. 인슐린 내성, 저인산혈구루병, 및 척추의 후종인대의 골화와 같은 질환이 또한 치료에 고려된다.

본 발명의 융합 단백질은 세포 배양(예를 들어, CHO 세포, COS 세포, HEK203), 박테리아, 예를 들어, 에스케리키아 콜리(Escherichia coli , E. coli) 및 포유동물 및 조류(예를 들어, 닭, 메추라기, 오리 및 칠면조)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 트랜스제닉 동물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 유용한 단백질 발현 시스템에서 생성될 수 있다.

약학적 조성물(또는 약학적 제형)의 제조는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이러한 약학적 조성물이 본 발명의 융합 단백질에 따른 사용에 고려된다.

일반적으로, 피검체에 투여되는 융합 단백질의 투여량은 수용자의 연령, 건강 및 체중, 동시 치료의 유형, 치료 빈도 등과 같은 공지된 요인에 따라 다양할 것이다. 보통, 활성 성분(즉, 융합 단백질)의 투여량은 체중 킬로그램 당 약 0.0001 내지 약 50 밀리그램일 수 있다. 정확한 투여량, 투여 빈도 및 치료의 기간은 치료 단백질 투여 분야에서 숙련된 의사에 의해 결정될 수 있다.

도 1은 야생형 NPP1 단백질의 아미노산 서열을 예시한다. 세포질 및 막 영역은 밑줄로 표시된다. 잠재적 N-당화 부위는 굵은 글씨로 표시된다. 이탤릭체의 PSCAKE는 시스테인 풍부 영역을 포함하는 가용성 NPP1의 시작부이다.
도 2는 표적 모이어티가 부착되지 않은 NPP1 단백질("sssNPP1")의 촉매 도메인(들)의 아미노산 서열을 예시한다.
도 3은 TAGsssNPP1의 아미노산 서열을 예시한다. 8개의 연속적 아스파르트산 잔기의 표적화 모이어티가 sssNPP1의 N-말단에 융합된다. 신호 펩티드는 밑줄로 표시되고, 표적화 모이어티는 굵은 글씨로 표시된다.
도 4는 sssNPP1의 C-말단에 융합된 10개의 연속적 아스파르트산 잔기의 표적화 모이어티를 함유하는 TAGsssNPP1의 아미노산 서열을 예시한다. 신호 펩티드는 밑줄로 표시되고, 표적화 모이어티는 굵은 글씨로 표시된다.
도 5는 TAGssNPP1 융합 단백질의 핵산 서열을 예시한다. 8개의 연속적 아스파르트산 잔기의 표적화 모이어티가 ssNPP1의 N-말단에 융합된다.
도 6은 TAGssNPP1 융합 단백질의 아미노산 서열을 예시한다. 8개의 연속적 아스파르트산 잔기의 표적화 모이어티가 ssNPP1의 N-말단에 융합된다. 신호 펩티드는 밑줄로 표시되고, 표적화 모이어티는 굵은 글씨로 표시된다.
도 7은 ssNPP1의 핵산 서열을 예시한다.
도 8은 ssNPP1의 아미노산 서열을 예시한다. 신호 펩티드는 밑줄로 표시된다.
도 9는 sNPP1의 핵산 서열을 예시한다.
도 10은 sNPP1의 아미노산 서열을 예시한다. 신호 펩티드는 밑줄로 표시된다.
도 11은 TAGsNPP1의 핵산 서열을 예시한다. 8개의 연속적 아스파르트산 잔기의 표적화 모이어티가 sNPP1의 N-말단에 융합된다.
도 12는 TAGsNPP1의 아미노산 서열을 예시한다. 8개의 연속적 아스파르트산 잔기의 표적화 모이어티가 ssNPP1의 N-말단에 융합된다. 신호 펩티드는 밑줄로 표시되고, 표적화 모이어티는 굵은 글씨로 표시된다.
도 13은 TAGsNPP1의 핵산 서열을 예시한다. 8개의 연속적 아스파르트산 잔기의 표적화 모이어티가 sNPP1의 C-말단에 융합된다.
도 14는 TAGsNPP1의 아미노산 서열을 예시한다. 8개의 연속적 아스파르트산 잔기의 표적화 모이어티가 sNPP1의 N-말단에 융합된다. 신호 펩티드는 밑줄로 표시되고, 표적화 모이어티는 굵은 글씨로 표시된다.
도 15는 링커 펩티드의 아미노산 서열을 예시한다.
도 16은 면역글로불린 Fc 세그먼트의 아미노산 서열을 예시한다.
도 17은 펩티드 링커를 통해 sssNPP1의 N-말단에 융합된 8개의 연속적 아스파르트산 잔기의 표적화 모이어티를 함유하는 TAGsssNPP1의 아미노산 서열을 예시한다. Fc 세그먼트는 표적 모이어티의 N-말단에 융합된다. 신호 펩티드는 밑줄로 표시되고, 표적화 모이어티는 굵은 글씨로 표시된다. 펩티드 링커는 이탤릭체로 표시된다.
도 18은 펩티드 링커를 통해 sssNPP1의 C-말단에 융합된 8개의 연속적 아스파르트산 잔기의 표적화 모이어티를 함유하는 TAGsssNPP1의 아미노산 서열을 예시한다. Fc 세그먼트는 sssNPP1의 N-말단에 융합된다. 신호 펩티드는 밑줄로 표시되고, 표적화 모이어티는 굵은 글씨로 표시된다. 펩티드 링커는 이탤릭체로 표시된다.
도 19는 TAGsNPP1 작제물을 함유하는 발현 벡터(즉, pTT22)의 개략적 대표도이다. 8개의 연속적 아스파르트산 잔기의 표적화 모이어티가 sNPP1의 C-말단에 융합된다.
도 20은 TAGsNPP1의 웨스턴 블롯 분석을 예시한다. 환원 조건; NR, 비-환원 조건.
도 21은 HEK293 세포로부터 생성되고 분리된 TAGsNPP1의 효소 활성을 나타낸다.
도 22A 내지 도 22C는 본원에 기재된 TAGNPP1 융합 단백질 작제물의 개략도를 예시한다.
도 23은 가용성 sNPP1(WT), TAGsNPP1(sNPP1 C-말단에 융합된 D8), 및 sNPP1-Fc로 처리된 인간 대동맥 평활근 세포의 석회화 수준을 나타낸다.
도 24는 TAGsNPP1 작제물을 함유하는 발현 벡터(즉, pTT22)의 개략적 대표도를 도시한다. 8개의 연속적 아스파르트산 잔기의 표적화 모이어티(D8)가 sNPP1의 C-말단에 융합된다.
도 25는 TAGsNPP1 융합 단백질의 핵산 서열을 도시한다.
도 26은 TAGsNPP1 융합 단백질의 아미노산 서열을 도시한다.
도 27은 sNPP1-Fc 융합 작제물을 함유하는 발현 벡터(즉, pTT22)의 개략적 대표도를 도시한다.
도 28은 sNPP1-Fc 융합 단백질의 핵산 서열을 도시한다.
도 29은 sNPP1-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열을 도시한다.

본 발명은 가용성이고, NPP1의 트렁케이션된 생물학적 활성 도메인(들)(즉, 피로포스파타제 및/또는 포스포디에스테라제 활성을 위해 자연 발생 NPP1의 적어도 하나의 세포외 촉매 도메인을 함유하는 NPP1 성분) 및 하나 이상의 표적화 모이어티(즉, "TAG")를 함유하는 신규한 인간 NPP1 융합 단백질을 제공한다. 본 발명의 NPP1 융합 단백질은 적어도 피로포스파타제 및/또는 포스포디에스테라제 활성을 수행하는데 필수적인 NPP1 도메인을 포함한다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 표적화 모이어티에 융합된 SEQ ID NO:1의 아미노산 잔기 A205 내지 L591을 포함하는 분리된 융합 단백질을 특징으로 한다. 표적화 모이어티는 당 분야에 널리 공지된 방법에 의해 NPP1 성분에 재조합적으로 융합되거나 화학적으로 결합(예를 들어, 공유 결합, 이온 결합, 소수성 결합 및 반데르발스힘)될 수 있고, NPP1 성분을 특정 표적 부위로 유도할 수 있으며, 여기에서 부착된 NPP1 성분은 본 발명의 융합 단백질이 투여되는 피검체에서 원하는 효과(예를 들어, PPi와 같은 기질을 용해화시키거나 PPi와 같은 기질의 형성을 방지하는 것과 같은 반응의 촉매작용)를 갖게 될 것이다.

TAGNPP1s

본 발명의 모든 NPP1 융합 단백질("TAGNPP1s")은 자연 발생 인간 NPP1의 N-말단 세포질 및 막횡단 도메인이 제거되었다. 임의로, 본 발명의 TAGNPP1s 융합 단백질은 또한 다양한 길이의 야생형 NPP1의 C-말단 트렁케이션을 함유할 수 있다. 전장 야생형 NPP1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1에 나열되어 있다.

한 구체예에서, 융합 단백질은 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 상의 TAG에 융합된 SEQ ID NO:1의 아미노산 잔기 A205 내지 L591("sssNPP1")을 포함하는 폴리펩티드("TAGsssNPP1")를 함유한다. 한 구체예에서, 융합 단백질은 N-말단 또는 C-말단 상의 TAG에 융합된 SEQ ID NO:1의 아미노산 잔기 A205 내지 D925("ssNPP1")를 포함하는 폴리펩티드("TAGssNPP1")를 포함한다. 한 구체예에서, 융합 단백질은 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 상의 TAG에 융합된 SEQ ID NO:1의 아미노산 잔기 P99 내지 D925("sNPP1")를 포함하는 폴리펩티드("TAGsNPP1")를 포함한다. 적어도 SEQ ID NO:1의 아미노산 잔기 A205 내지 L591을 포함하는 sNPP1의 임의의 연속적 단편이 또한 고려되며, 이러한 폴리펩티드 단편은 N-말단 또는 C-말단 상의 TAG에 융합된다.

세포 배양물 또는 트랜스제닉 동물에서 발현되는 경우, TAGNPP1 융합 단백질은 이의 N-말단에서 신호 펩티드(또는 선도 서열)을 추가로 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 TAGNPP1 융합 단백질을 발현하는 세포의 세포하 소기관을 통해 TAGNPP1 융합 단백질의 운반을 번역동시적으로 또는 번역후에 유도함으로써, TAGNPP1 융합 단백질의 번역후 변형을 결정한다. 신호 펩티드는 융합 단백질의 번역동시적 또는 번역후 단계에서 분해되므로, TAGNNP1 융합 단백질은 일반적으로 일단 분비되고 분리되는 경우에 신호 펩티드가 결여되어 있는 것이 이해되어야 한다. 따라서, TAGNPP1 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 관한 구체예에서, 선도 서열이 또한 본 발명에서 사용되는 것이 고려된다. 예를 들어, SEQ ID NO:2에 나열된 누클레오티드 서열은 이의 5' 말단에 TAGNNP1에 대한 선도 서열의 예를 함유한다.

본원에 개시된 융합 단백질 각각은 하나 이상의 표적화 모이어티("TAG")와 함께 고려된다. 본 발명에 따른 TAG 성분은 4개 이상의 음성으로 하전된 아미노산, 예를 들어, 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. TAG 성분은 음성으로 하전된 아미노산 잔기, 예를 들어, 약 4 내지 약 20개의 아미노산 잔기 길이인 아스파르트산 및/또는 글루탐산의 스트레치(stretch)일 수 있다. TAG는 NPP1 성분의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. TAG는 또한 NPP1 성분의 N-말단 및 C-말단 둘 모두에 융합될 수 있다. 따라서, TAGsNPP1 융합 단백질의 아미노산 서열은, 예를 들어, NPP1 성분의 C-말단 단부를 통한 PSCAKE, 및 NPP1 성분의 N-말단 및/또는 C-말단 단부에 하나 이상의 표적화 모이어티(예를 들어, 폴리글루탐산 태그 또는 폴리아스파르트산 태그)를 포함한다. C-말단에 융합된 TAG를 갖는 NPP1 성분을 포함하는 융합 단백질이 특히 유용한 구체예이다. 한 매우 특정한 구체예에서, 도면에서 TAGsNPP1 및 TAGssNPP1에 대한 예시적 서열에서 관찰될 수 있는 바와 같이 8개의 아스파르트산의 스트레치를 갖는 TAG가 사용되나, 임의의 유용한 수의 음성으로 하전된 아미노산 잔기(예를 들어, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18개)가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. TAG 성분은 도면에서 "A"로 표시된다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 다양한 TAGNPP1 융합 단백질을 인코딩하는 폴리누클레오티드를 포함한다. 따라서, 임의의 TAGNPP1 융합 단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 임의의 핵산 서열이 상응하는 TAGNPP1 융합 단백질을 발현하는 재조합 분자를 발생시키는데 사용될 수 있다. 한 특정 구체예에서, 본 발명은 도 2에 제시된 바와 같이 SEQ ID NO:2의 핵산 서열을 포함하는 폴리누클레오티드를 포함한다.

특정한 특이적 구체예 내에서, 융합 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 다수의 폴리펩티드를 포함하거나, 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 폴리펩티드 및 관련되지 않은 서열을 포함한다. 특정한 바람직한 폴리펩티드는, 예를 들어, 이합체화 및 안정성을 도울 수 있거나, 융합 단백질의 응집을 최소화시킬 수 있다. 예를 들어, 추가 폴리펩티드는 혈청에서의 안정성을 증가시키는 면역글로불린 G1의 Fc 영역일 수 있다. Fc 세그먼트의 사용은 당 분야에 널리 공지되어 있고, 전체 교시내용이 온전히 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 7,902,151호; 및 미국 특허 번호 7,858,297호에 기재되어 있다. 야생형 NPP1의 시스테인 풍부 영역(즉, PSCAKE 내지 NEPQCP; SEQ ID NO:1의 P99 내지 P204의 아미노산 서열)이 TAGNPP1 융합 단백질의 이합체화를 촉진하기 위해 이용될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 TAGNPP1 융합 단백질에 컨쥬게이션될 수 있다. 응집 및 면역원성을 최소화시키거나, 단백질의 용해도를 증가시키거나, 임상적 또는 생물학적으로 중요한 원하는 부위로 단백질이 표적화되는 것을 가능케 하기 위해 다른 폴리펩티드가 선택될 수 있다.

TAGNPP1은 또한 융합 단백질의 확인, 합성, 또는 정제의 용이성을 위해, 또는 TAGNPP1의 활성 및 표적화를 향상시킬 수 있는 NPP1 성분의 고유 구조를 보다 잘 보존시키기 위해 적절한 폴리펩티드 링커 또는 다른 서열에 융합되거나 컨쥬게이션될 수 있다. 특히, 각각의 폴리펩티드가 이의 이차 및 삼차 구조로 폴딩되는 것을 보장하기에 충분한 거리로 제 1 및 제 2 폴리펩티드 성분을 분리시키기 위해 펩티드 링커 서열이 이용될 수 있다. 이러한 펩티드 링커 서열이 당 분야에 널리 공지된 표준 기술을 이용하여 NPP1 성분과 TAG 성분 사이의 융합 단백질로 통합된다. 적합한 펩티드 링커 서열은 유연한 연장된 형태를 채택하는 이들의 능력, 및 NPP1, TAG 또는 본원에 기재된 다른 이차 폴리펩티드(예를 들어, Fc) 상의 기능성 부분과 상호작용할 수 있는 이차 구조를 채택하지 않는 이들의 능력을 기초로 하여 선택될 수 있다. 바람직한 펩티드 링커 서열은 Gly, His, Asn 및 Ser 잔기를 함유한다. 유용한 펩티드 링커는 폴리-Gly, 폴리-His, 폴리-Asn, 또는 폴리-Ser을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 중성에 가까운 아미노산, 예를 들어, Thr 및 Ala가 또한 링커 서열에서 사용될 수 있다. 링커로서 유용하게 사용될 수 있는 아미노산 서열은 문헌[Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc . Natl. Acad Sci. USA 83:8258-8262, 1986; U.S. Pat. No. 4,935,233 및 U.S. Pat. No. 4,751,180]에 개시된 것을 포함한다. 링커 서열은 1 내지 약 20개의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩티드 링커는 약 8 내지 약 12개의 아미노산 길이이다. 한 바람직한 구체예에서, 본 발명에서 사용되는 펩티드 링커는 GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:15)이나, Gly, Ser, His, 또는 Asn의 임의의 기능적 조합이 이용될 수 있다.

융합 단백질은 또한 관련되지 않은 폴리펩티드와 함께 본 발명의 TAGNPP1을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 관련되지 않은 폴리펩티드는 임상적 또는 생물학적으로 중요한 부위(예를 들어, 석회화 부위)로의 융합 단백질의 표적화를 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 뼈에 대한 높은 친화성을 갖는 펩티드가 전체 교시내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 7,323,542호에 기재되어 있다.

TAGNPP1은 당 분야에 널리 공지된 재조합 기술 또는 화학적 컨쥬게이션을 포함하는 표준 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 핵산 및 단백질을 분리시키고 특성규명하는데 유용한 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 과도한 실험 없이 사용하기에 적합한 프로토콜을 선택하기 위해 표준 분자생물학 및 생화학 매뉴얼이 참고될 수 있다. 예를 들어, 내용이 온전히 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Sambrook et al, 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 2nd ed., Cold Spring Harbor]을 참조하라. 간단히, 폴리펩티드 성분을 인코딩하는 DNA 서열이 개별적으로 어셈블리될 수 있고, 적절한 발현 벡터로 라이게이션될 수 있다. 예를 들어, NPP1 성분을 인코딩하는 DNA 서열의 3' 말단이 펩티드 링커와 함께 또는 펩티드 링커 없이 TAG PEG, 또는 Fc와 같은 제 2의 폴리펩티드 성분을 인코딩하는 DNA 서열의 5' 말단에 라이게이션되어, 서열의 해독틀이 동일 위상에 존재한다. 이는 두 성분 폴리펩티드의 생물학적 활성을 보유하는 단일한 융합 단백질로의 번역을 가능케 한다. 라이게이션된 DNA 서열은 프로모터를 포함하는 적합한 전사 또는 번역 조절 성분에 작동 가능하게 연결된다. DNA의 발현을 담당하는 조절 성분은 신호 펩티드를 인코딩하는 선도 서열과 같은 제 1 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열에 대해 5'에만 위치된다. 유사하게, 번역 및 전사 종료 신호를 중단시키는데 필요한 정지 코돈은 제 2 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열에 대해 3'에만 존재한다.

본 발명은 또한 TAGNPP1 변이체를 포함한다. 바람직한 TAGNPP1 변이체는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 A205 내지 L591과 80%, 85%, 90%, 95%, 더욱 바람직하게는 96%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것이다. 가장 바람직한 TAGNPP1 변이체는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 A205 내지 L591과 적어도 97%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것이다.

본 발명은 또한 SEQ ID NO:2의 상보체 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리누클레오티드 서열에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 엄격한 조건하에서 SEQ ID NO:2에 하이브리드화되는 폴리누클레오티드 서열을 또한 특징으로 하며, 상기 서열의 안티센스 서열은 SEQ ID NO:2와 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 하이브리드화 조건은 문헌[Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152:399-407) 및 Kimmel, A. R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511)]에 교시된 바와 같이 핵산 결합 복합체 또는 프로브의 융해 온도(Tm)를 기초로 하며, 이는 규정된 엄격성에서 이용될 수 있다.

본 발명은 또한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열, 올리고누클레오티드, 펩티드 핵산(PNA), 이들의 단편, 부분 또는 안티센스 분자를 고려한다.

TAGNPP1 및 이의 변이체를 인코딩하는 누클레오티드 서열은 바람직하게는 적절히 선택된 엄격성 조건하에서 TAGNPP1의 누클레오티드 서열에 하이브리드화될 수 있으나, 실질적으로 상이한 코돈 사용빈도(codon usage)를 갖는 TAGNPP1 또는 이의 유도체를 인코딩하는 누클레오티드 서열을 생성시키는 것이 유리할 수 있다. 코돈은 특정 코돈이 숙주에 의해 이용되는 빈도에 따라 특정 원핵생물 또는 진핵생물 숙주에서 펩티드의 발현이 발생하는 속도를 증가시키도록 선택될 수 있다. 인코딩되는 아미노산 서열을 변경시킴이 없이 TAGNPP1 및 이의 유도체를 인코딩하는 누클레오티드 서열을 실질적으로 변경시키는 다른 이유는 더욱 요망되는 특성, 예를 들어, 보다 큰 반감기를 갖는 RNA 전사물의 생성을 포함한다.

본 발명에 의해 포함되는 TAGNPP1을 인코딩하는 변경된 핵산 서열은 TAGNPP1의 동일물 또는 기능성 동등물을 인코딩하는 폴리누클레오티드를 발생시키는 다양한 누클레오티드의 결실, 삽입, 또는 치환을 포함한다. 인코딩된 단백질은 또한 침묵 변화를 발생시키고, 기능적으로 동등한 TAGNPP1을 발생시키는 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 또는 치환을 함유할 수 있다. 계획적인 아미노산 치환은 TAGNPP1의 생물학적 활성이 보유되는 한 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성 특성에서의 유사성을 기초로 하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 양성으로 하전된 아미노산 잔기는 Lys 및 Arg를 포함하고; 음성으로 하전된 아미노산 잔기는 Asp 및 Glu를 포함하며; 유사한 친수성을 갖는 하전되지 않은 극성 머리 기를 갖는 아미노산은 Leu, Ile, 및 Val; Gly 및 Ala; Asp 및 Gln; Ser 및 Thr; Phe 및 Tyr을 포함할 수 있다.

발현 벡터

TAGNPP1을 인코딩하는 서열 및 적절한 전사 및 번역 조절 성분을 함유하는 발현 벡터를 작제하기 위해 당업자에게 널리 공지된 방법이 사용될 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 이러한 기술은, 예를 들어, 교시내용이 온전히 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 및 Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.]에 기재되어 있다.

TAGNPP1을 인코딩하는 서열을 함유하고 발현하도록 하기 위해 다양한 발현 벡터/숙주 시스템이 사용될 수 있다. 이들은 미생물, 예를 들어, 재조합 박테리오파지, 플라스미드, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 배큘로바이러스) 또는 박테리아 발현 벡터(예를 들어, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 감염된 곤충 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템(예를 들어, pTT22 벡터)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

조절 성분 또는 조절 서열은 전사 및 번역을 수행하기 위해 숙주 세포 단백질과 상호작용하는 벡터의 번역되지 않는 영역, 즉, 인핸서, 프로모터, 5' 및 3' 비번역 영역을 포함할 수 있다. 상기 성분들은 이들의 강도 및 특이성에서 다양할 수 있다. 사용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라, 조직 특이적, 항시성 및 유도성 프로모터를 포함하는 임의의 수의 적합한 전사 및 번역 성분이 사용될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 시스템에서 클로닝하는 경우, 유도성 프로모터, 예를 들어, Bluescript™ 파지미드(Stratagene, LaJolla, California) 또는 pSport1™ 플라스미드(Gibco BRL) 등의 하이브리드 lacZ 프로모터가 사용될 수 있다. 포유동물 세포 시스템에서, 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스로부터의 프로모터가 바람직하다. TAGNPP1을 인코딩하는 서열의 다수의 카피를 함유하는 세포주를 생성시키는 것이 필요한 경우, SV40 또는 EBV를 기초로 한 벡터가 적절한 선택 가능한 마커와 함께 사용될 수 있다. 조류 발현 시스템이 사용되는 경우, 다양한 TAGNPP1 작제물을 발현시키기에 적합한 벡터는 전체 교시내용이 온전히 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 6,730,822호; 미국 특허 번호 6,825,396호; 미국 특허 번호 6,875,588호; 미국 특허 번호 7,294,507호; 미국 특허 번호 7,521,591호; 미국 특허 번호 7,534,929호; 및 미국 특허 출원 일련 번호 11/376,023호에 기재되어 있다. 간단히, TAGNPP1을 발현시키기 위해 조류 발현 시스템이 사용되는 경우, 적합한 난관(oviduct)-특이적 프로모터, 비제한적인 예로, 난점질 프로모터, 난알부민 프로모터, 리소자임 프로모터, 콘알부민(conalbumin) 프로모터, 난백뮤신 프로모터, 난트랜스페린 프로모터 및 이들 프로모터 각각의 기능성 부분이 고려된다. 적합한 비특이적 프로모터는, 비제한적인 예로, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, MDOT 프로모터 및 라우스-육종 바이러스(RSV) 프로모터, 뮤린 백혈병 바이러스(MLV) 프로모터, 마우스 유암 바이러스(MMTV) 프로모터 및 SV40 프로모터 및 이들 프로모터 각각의 기능성 부분을 포함할 수 있다. 본 발명에서 유용할 수 있는 다른 프로모터의 비제한적인 예는, 비제한적으로, Pol III 프로모터(예를 들어, 타입 1, 타입 2 및 타입 3 Pol III 프로모터), 예를 들어, H1 프로모터, U6 프로모터, tRNA 프로모터, RNase MPR 프로모터 및 이들 프로모터 각각의 기능성 부분을 포함한다. 통상적으로, 사용되는 프로모터에 따라 본 발명에서 사용하기 위해 기능성 종료자 서열이 선택된다.

숙주 세포

본 발명은, 예를 들어, 개시내용이 참조로서 본원에 온전히 포함되는 미국 특허 번호 7,534,929호와 같이 당 분야에 널리 공지된 바와 같은, 트랜스제닉 조류(예를 들어, 트랜스제닉 닭)에서의 가용성 TAGNPP1의 생성을 포함한다. 표적화 모이어티를 갖거나 갖지 않는 NPP1 성분(예를 들어, ssNPP1, sNPP1, TAGsNPP1 및 TAGssNPP1)의 조류 시스템(예를 들어, 조류 난관)에서의 생성이 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 비제한적으로, 트랜스제닉 조류, 트랜스제닉 포유동물, 세포 배양물(예를 들어, CHO 세포, HEK293 세포, 및 COS 세포), 박테리아, 예를 들어, E. coli, 트랜스제닉 동물, 예를 들어, 포유동물 및 조류(예를 들어, 닭, 메추라기, 오리 및 칠면조)를 포함하는 임의의 유용한 단백질 발현 시스템, 및 덕 위드(duck weed)를 포함하는 식물 시스템에서 생성된 TAGNPP1이 본원에서 고려된다.

숙주 세포 계통은 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 원하는 방식으로 발현된 TAGNPP1을 처리하는 능력에 대해 선택될 수 있다. TAGNNP1의 폴리펩티드의 상기 변형은 아세틸화, 카르복실화, 시알릴화, 당화, 인산화, 지질화, 및 아실화를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 번역후 활성을 위한 특이적 세포 기구 및 특징적 메커니즘을 갖는 다양한 숙주 세포, 예를 들어, CHO, COS, HeLa, MDCK, HEK293, 및 W138이 본 발명의 융합 단백질의 정확한 변형 및 가공을 보장하기 위해 선택될 수 있다. 조류 종양 세포주가 또한 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키기 위한 숙주 세포로서 고려된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 유용한 조류 세포주의 예(예를 들어, 조류 난관 종양 세포주)가 전체 교시내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 공개 번호 2009/0253176호에 기재되어 있다.

TAGNPP1의 생성

TAGNPP1은 다양한 널리 공지된 기술 중 임의의 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이 DNA 서열에 의해 인코딩된 TAGNPP1은 본원에 기재되거나 당업자에게 널리 공지된 다양한 발현 벡터 중 임의의 벡터를 이용하여 DNA 서열로부터 용이하게 제조될 수 있다. 발현은 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 분자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환되거나 트랜스펙션된 임의의 적절한 숙주 세포에서 달성될 수 있다. 배양 배지로 재조합 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 분비하는 적합한 숙주/벡터 시스템으로부터의 상층액이 시판되는 필터를 이용하여 먼저 농축될 수 있다. 농축 후, 농축물이 적합한 정제 매트릭스, 예를 들어, 친화성 매트릭스 또는 이온 교환 수지에 적용될 수 있다. 하나 이상의 역상 HPLC 단계가 재조합 폴리펩티드를 추가로 정제하기 위해 사용될 수 있다.

재조합 단백질의 고수율 생성을 위해, 안정적 발현이 바람직하다. TAGNPP1을 안정적으로 발현하는 세포주가 동일한 벡터 또는 별개의 벡터 상에 바이러스 복제 기점 및/또는 내인성 발현 성분 및/또는 선택 가능한 마커 유전자를 함유하는 발현 벡터를 이용하여 형질전환될 수 있다. 벡터의 도입 후, 세포는 이들이 선택 배지로 교환되기 전에 강화 배지에서 1-2일 동안 성장하는 것이 허용될 수 있다. 선택가능한 마커의 목적은 선택에 대한 내성을 부여하는 것이며, 이의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장 및 회수를 가능케 한다. 안정적으로 형질전환된 세포의 내성 클론은 세포 유형에 대해 적절한 조직 배양 기술을 이용하여 증식될 수 있다. 포유동물 세포주에서 외인성 단백질을 생성시키는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 조류 세포에서 TAGNPP1 융합 단백질과 같은 이종성 폴리펩티드의 생성을 위한 본 발명의 상기 및 다른 양태 및 구체예의 예시적 예는 각각이 온전히 참조로서 본원에 포함되는 2002년 8월 8일에 U.S. 2002/0108132-A1호로 공개된 2001년 6월 8일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 09/877,374호, 및 2002년 9월 18일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 10/251,364호에 충분히 개시되어 있다. 조류 종양 세포주에서 외인성 단백질을 생성시키는 예는 또한 전체 교시내용이 온전히 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 공개 번호 2009/0253176호에 기재되어 있다.

본 발명은 특히 트랜스제닉 조류 시스템에서의 본원에 개시된 TAGNPP1 단백질의 생성을 고려한다. 한 특히 유용한 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따라 닭과 같은 트랜스제닉 조류의 난관에서 생성될 수 있는 TAGNPP1의 생성에 주목한다. 트랜스제닉 조류 발현 시스템에서 외인성 단백질을 생성시키는 예는 또한 전체 교시내용이 온전히 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 6,730,822호에 기재되어 있다. 간단히, 닭 난관에서 인코딩 서열의 발현을 유도하는 조직-특이적 또는 항상성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 TAGNPP1 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 함유하는 상기 기재된 적합한 조류 벡터가 닭 단계 X 배아 세포에 도입된다. 형질전환된 배아 세포가 살아있는 병아리를 부화시키는데 도움이 되는 조건하에서 인큐베이션된다. 살아있는 병아리는 성숙한 키메라 닭으로 양육되고, 이는 자연적으로 또는 인공수정을 통해 비-트랜스제닉 닭과 교배된다. 트랜스제닉 닭은 단백질을 인코딩하는 서열의 점라인 통합에 대해 자손을 스크리닝함으로써 확인된다. 트랜스제닉 자손은 또 다른 트랜스제닉 또는 비-트랜스제닉 닭과 교배되어 TAGNPP1 융합 단백질을 함유하는 계란을 생성할 수 있다. 이후, TAGNPP1은 당 분야에 널리 공지된 방법에 의해 분리되고 정제된다. 따라서, 본 발명은 트랜스제닉 조류에 의해 생성된 재조합 TAGNPP1 융합 단백질을 제공한다.

약학적 조성물

본 발명은 또한 분리되고 실질적으로 정제된 TAGNPP1 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 복합 분자를 포함하는 상기 담체를 포함하는 조성물은 전체 교시내용이 참조로서 본원에 포함되는 널리 공지된 통상적 방법(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 14th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. 참조)에 의해 제형화된다. 담체는 희석제를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 약학적 담체는 액체일 수 있고, 융합 단백질은 용액의 형태일 수 있다. 약학적 담체는 왁스, 지방, 또는 알콜일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 약학적으로 허용되는 담체는 분말, 동결건조된 분말, 또는 정제 형태의 고체일 수 있다. 한 구체예에서, 담체는 리포솜 또는 미세캡슐을 포함할 수 있다.

약학적 조성물은 희석제와의 재구성 후 주사를 위한 멸균의 동결건조된 분말의 형태일 수 있다. 희석제는 주사용수, 주사용 정균수, 또는 멸균 염수일 수 있다. 동결건조된 분말은 건조 형태의 단백질을 생성시키기 위해 융합 단백질의 용액을 동결 건조시킴으로써 생성될 수 있다. 당 분야에서 공지된 바와 같이, 동결건조된 단백질은 일반적으로 단백질의 액체 용액보다 증가된 안정성 및 긴 저장기간을 갖는다.

정의:

본원에서 사용되는 제형, 조성물 또는 성분과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "허용되는"은 치료받는 피검체의 전반적 건강에 지속적인 유해한 효과를 갖지 않는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "투여" 또는 "투여하는"은 치료가 필요한 피검체에게 본 발명의 융합 단백질을 제공하는 것을 말한다.

본원에서 사용되는 "변경"은 하이브리드화 검정을 이용하여 검출될 수 있는 결실, 삽입, 및 점돌연변이를 포함하는 TAGNPP1을 인코딩하는 폴리누클레오티드의 서열 내에서의 임의의 변경을 포함한다.

용어 "동물"은 조류 및 포유동물, 예를 들어, 래트, 마우스 및 인간을 포함하는 모든 척추동물을 포함하는 것으로 본원에서 사용된다. 이는 또한 배아 및 태아 단계를 포함하는 모든 발달 단계의 개별적 동물을 포함한다.

융합 단백질 분자의 아미노산 서열을 나타내기 위해 "아미노산 서열"이 본원에서 언급되는 경우, "아미노산 서열" 및 유사 용어, 예를 들어, "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 아미노산 서열을 언급된 단백질 또는 폴리펩티드 분자와 관련된 완전한 아미노산 서열로 제한하는 것을 의미하는 것이 아니다.

본원에서 사용되는 용어 "조류"는 분류학적 부류 아바(ava)의 유기체, 비제한적인 예로, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기, 꿩, 앵무새, 피리새류, 매, 까마귀 및 타조, 에뮤 및 화식조를 포함하는 주금류와 같은 유기체의 임의의 종, 아종 또는 계통을 나타낸다. 상기 용어는 갈루스 갈루스(Gallus gallus), 또는 닭(예를 들어, 화이트 레그혼(White Leghorn), 브라운 레그혼(Brown Leghorn), 베어드-락(Barred-Rock), 서섹스(Sussex), 뉴 햄프셔(New Hampshire), 로드 아일랜드(Rhode Island), 오스트랄로프(Ausstralorp), 미놀카(Minorca), 암록스(Amrox), 캘리포니아 그레이(California Gray), 이탈리안 파트리지-컬러드(Italian Partridge-colored))의 다양한 공지된 계통, 뿐만 아니라 칠면조, 꿩, 메추라기, 오리, 타조 및 상업적 양으로 통상적으로 양육되는 다른 가금의 계통을 포함한다.

특정 레트로바이러스를 기초로 하거나 이로부터 유래되거나, 특정 레트로바이러스의 누클레오티드 서열을 기초로 하는 레트로바이러스 벡터에서와 같은 구 "기초로 하는" 또는 "~로부터 유래된"은 레트로바이러스 벡터의 유전체가 특정 레트로바이러스의 유전체의 누클레오티드 서열의 많은 부분을 함유하는 것을 의미한다. 상기 많은 부분은 특정 유전자 또는 누클레오티드 서열, 예를 들어, gag, pol 및/또는 env 단백질을 인코딩하는 누클레오티드 서열 또는 바이러스 유전체의 다른 구조성 또는 기능성 누클레오티드 서열, 예를 들어, LTR을 인코딩하는 서열일 수 있거나, 실질적으로 완전한 레트로바이러스 유전체, 예를 들어, 레트로바이러스 유전체의 대부분(예를 들어, 60% 이상 또는 70% 이상 또는 80% 이상 또는 90% 이상) 또는 모두일 수 있으며, 이는 당업자의 지식에 따라 명세서 내의 문맥으로부터 명백할 것이다. 레트로바이러스를 기초로 하거나 이로부터 유래되는 레트로바이러스 벡터의 예는 문헌[Cosset et al., Journal of Virology (1991) vol 65, p 3388-3394]에 개시된 바와 같이 ALV 레트로바이러스를 기초로 하는 NL 레트로바이러스 벡터(예를 들어, NLB)이다.

본원에서 사용되는 용어 "생물학적 활성"은 자연 발생 NPP1 단백질의 피로포스파타제/포스포디에스테라제의 구조적, 조절 또는 생화학적 기능을 갖는 융합 단백질을 나타낸다.

본원에서 사용되는 "작제물"은 자연원으로부터 분리된 누클레오티드 서열의 하나 이상의 세그먼트로부터 어셈블리되거나, 화학적으로 합성되는 DNA와 같은 선형 또는 원형 누클레오티드 서열, 또는 이들의 조합물을 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "상보성"은 서로 특이적 상호작용을 형성할 수 있는 2개의 핵산 분자를 나타낸다. 특이적 상호작용에서, 2개의 핵산 가닥이 반대 극성인 경우 핵산의 한 가닥 내의 아데닌 염기는 제 2의 핵산 가닥 내의 티민과 2개의 수소결합을 형성할 수 있다. 또한, 특이적 상호작용에서, 2개의 핵산 가닥이 반대 극성인 경우 핵산의 한 가닥 내의 구아닌 염기는 제 2의 핵산 가닥 내의 시토신과 3개의 수소결합을 형성할 수 있다. 본원에서 언급되는 바와 같은 상보성 핵산은 변형된 염기를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 변형된 아데닌은 티민 또는 변형된 티민과 수소결합을 형성할 수 있고, 변형된 시토신은 구아닌 또는 변형된 구아닌과 수소결합을 형성할 수 있다.

본원에서 사용되는 "결실"은 하나 이상의 아미노산 또는 누클레오티드 잔기가 각각 부재하는 아미노산 또는 누클레오티드 서열에서의 변화를 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "발현된" 또는 "발현"은 유전자의 2개의 핵산 가닥 중 하나의 영역과 적어도 부분적으로 상보적인 RNA 핵산 분자를 제공하는 유전자로부터의 전사를 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "발현된" 또는 "발현"은 또한 단백질 또는 펩티드를 생성시키는 RNA의 번역을 나타낼 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "발현 벡터"는 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 누클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자 발현 조절 영역, 예를 들어, 프로모터 또는 프로모터 성분을 포함하는 핵산 벡터를 나타낸다.

"기능성 부분" 또는 "기능성 단편"은 상호교환적으로 사용되고, 본원에서 사용되는 바와 같이 전체 기능을 전체적 또는 부분적으로 수행할 수 있는 전체의 부분 또는 단편을 의미한다. 예를 들어, 분자의 생물학적 기능성 부분은 전체 또는 온전한 분자의 생물학적 기능을 수행하는 분자의 부분을 의미한다. 예를 들어, 유전자 발현 조절 영역의 기능성 부분은 생물학적 시스템 내에서 유전자 발현을 전체적으로 또는 부분적으로 조절하거나 제어하는(예를 들어, 전체적으로 또는 부분적으로 촉진하는) 특정 유전자 발현 조절 영역의 단편 또는 부분이다(예를 들어, 프로모터). 기능성 부분은 임의의 유용한 크기일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "유전자 발현 조절 영역"은 코딩 서열과 관련되고, 코딩 서열의 발현을 전체적으로 또는 부분적으로 조절하는, 예를 들어, 코딩 서열의 전사를 전체적 또는 부분적으로 조절하는 누클레오티드 서열을 나타낸다. 유전자 발현 조절 영역은 자연 발생원으로부터 분리될 수 있거나, 화학적으로 합성될 수 있고, 적절한 세포 내에서 조절된 전사를 가능케 하는 핵산 벡터로 통합될 수 있다. "유전자 발현 조절 영역"은 mRNA로 전사될 수 있는 코딩 서열의 5' 말단 영역에 존재하는 핵산 서열의 영역 앞에 존재할 수 있으나, 앞에 존재하는 것으로 제한되지는 않는다.

용어 "이종성", "외인성" 및 "외래"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 일반적으로 특정 유기체 또는 특정 세포, 조직 또는 유기체 내에 함유되거나 유기체에 의해 생성되는 다른 성분에서 일반적으로 발견되지 않는 핵산 또는 단백질과 같은 생체분자를 나타낸다. 예를 들어, 난(egg)에 대해 이종성이거나 외인성인 단백질은 난에서 일반적으로 발견되지 않는 단백질이다. 핵산, 예를 들어, DNA 및 RNA와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "이종성", "외인성" 및 "외래"는 상호교환적으로 사용되며, 이는 존재하는 염색체, 유전체 또는 세포의 일부로서 자연 발생하지 않거나, 자연적으로 발생하는 위치(들) 및/또는 양과 상이한 위치(들) 및/또는 양으로 발견되는 핵산을 나타낸다. 이는 유전체, 염색체 또는 세포에 대해 내인성이 아니고, 유전체, 염색체 또는 세포로 외인적으로 도입된 핵산일 수 있다. 이종성 DNA의 예는 유전자 발현 조절 영역을 포함하는 DNA 및 생성물 또는 생성물들, 예를 들어, RNA 또는 단백질 생성물을 인코딩하는 DNA를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이종성 DNA의 예는 조류로부터 분리된 후, 이후, 예를 들어, 조류 유전체로의 재도입 후에 사용되는 바와 같은 본원에 개시된 유전자 발현 조절 영역 또는 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "분리된 핵산"은, 예를 들어, (a) 자연적으로 발생하는 유전체 분자의 일부의 서열을 갖지만, 자연 발생하는 종의 유전체 내의 분자의 일부의 측면에 존재하는 서열의 적어도 하나의 측면에 존재하지 않는 DNA; (b) 생성된 벡터 또는 유전체 DNA가 핵산이 수득되는 자연 발생 DNA와 동일하지 않도록 하는 방식으로 벡터 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 유전체 DNA로 통합되는 핵산; (c) 독립된 분자, 예를 들어, cDNA, 유전체 단편, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응(LCR) 또는 화학적 합성에 의해 생성된 단편, 또는 제한 단편; (d) 하이브리드 유전자, 즉, 융합 단백질을 인코딩하는 유전자의 일부인 재조합 누클레오티드 서열; 및 (e) 자연 발생되지 않는 하이브리드 서열의 일부인 재조합 누클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 분리된 핵산 분자는, 예를 들어, 자연 대립유전자 변이체, 뿐만 아니라 누클레오티드 결실, 삽입, 역전, 또는 치환에 의해 변형된 핵산 분자를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 "삽입" 또는 "첨가"는 TAGNPP1 분자와 비교시 하나 이상의 아미노산 또는 누클레오티드 잔기의 첨가를 각각 발생시키는 아미노산 또는 누클레오티드 서열에서의 변화를 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "핵산"은 누클레오티드 및 누클레오시드의 임의의 선형 또는 연속적 어레이, 예를 들어, cDNA, 유전체 DNA, mRNA, tRNA, 올리고누클레오티드, 올리고누클레오시드 및 이들의 유도체를 나타낸다. 논의의 용이함을 위해, 비자연 발생 핵산이 작제물로 본원에서 언급될 수 있다. 핵산은 발현, 클로닝, 코스미드 및 형질전환 벡터를 포함하는 박테리아 플라스미드 벡터, 예를 들어, 동물 바이러스 벡터, 비제한적인 예로, 변형된 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 폴리오 바이러스, 폭스 바이러스, 레트로바이러스, 예를 들어, 조류 백혈증 바이러스(ALV) 레트로바이러스 벡터, 뮤린 백혈병 바이러스(MLV) 레트로바이러스 벡터, 및 렌티바이러스 벡터 등 및 이들의 단편을 포함할 수 있다. 또한, 핵산은 조류 백혈증 바이러스(ALV) 레트로바이러스 벡터, 뮤린 백혈병 바이러스(MLV) 레트로바이러스 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터 및 이들의 단편의 LTR일 수 있다. 핵산은 또한 NL 벡터, 예를 들어, NLB, NLD 및 NLA 및 이들의 단편 및 합성 올리고누클레오티드, 예를 들어, 화학적으로 합성된 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 핵산은 변형되거나 유도체화된 누클레오티드 및 누클레오시드, 비제한적인 예로, 할로겐화된 누클레오티드, 비제한적인 예로, 5-브로모우라실, 및 유도체화된 누클레오티드, 예를 들어, 비오틴-표지된 누클레오티드를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 "핵산 서열"은 올리고누클레오티드, 누클레오티드, 또는 폴리누클레오티드, 및 이들의 단편 또는 일부, 및 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, 센스 또는 안티센스 가닥인 유전체 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 나타낸다.

용어 "작동 가능하게 연결된"은 성분들의 배열을 나타내며, 여기서 상기 기재된 성분들은 이들의 일반적인 기능을 수행하도록 배열된다. 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자 발현 조절 영역 또는 프로모터(예를 들어, 프로모터 성분)는 코딩 서열을 발현시킬 수 있다. 조절 서열은 이들이 코딩 서열의 발현을 유도하는 기능을 하는 한 코딩 서열과 연속적일 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 사이에 존재하는 아직 번역되지 않은 전사된 서열이 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "난관 특이적 프로모터"는 기능성인, 즉, 새의 난관 세포에서 크게, 예를 들어, 주로(즉, 난관 세포에서 생성되는 특정 프로모터 유형에 의해 동물에서 생성되는 전사 생성물의 50% 이상) 또는 배타적으로 코딩 서열의 전사를 제공하는 프로모터 및 프로모터 성분을 나타낸다. 유용한 난관 특이적 프로모터의 예는 난알부민 프로모터, 난점질 프로모터, 오보인히비터(ovoinhibitor) 프로모터, 리소자임 프로모터 및 난트랜스페린 프로모터 및 이들 프로모터의 기능성 부분, 예를 들어, 프로모터 성분을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

용어 "폴리누클레오티드", "올리고누클레오티드", "누클레오티드 서열" 및 "핵산 서열"은 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있고, 이는 코딩 서열, 즉, 적절한 조절 또는 제어 서열의 제어하에 위치되는 경우 시험관내 또는 생체 내에서 폴리펩티드로 전사되고 번역되는 폴리누클레티드(들) 또는 핵산 서열(들); 조절 서열, 예를 들어, 번역 시작 및 정지 코돈, 프로모터 서열, 리보솜 결합 부위, 아데닐중합체형성 신호, 전사 인자 결합 부위, 전사 종료 서열, 업스트림 및 다운스트림 조절 도메인, 인핸서, 사일런서(silencer), 전사 인자(들)이 결합하고, 유전자의 프로모터의 활성을 양성(유도)으로 또는 음성(억제)으로 변경시키는 DNA 서열 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 길이 또는 합성 기원에 대한 제한이 본원에 기재된 용어에 의해 제안되지는 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용될 수 있고, 이는 펩티드 결합을 통해 연결된 연속적 어레이의 3개 이상의 아미노산의 아미노산들의 중합체를 나타낸다. 용어 "폴리펩티드"는 단백질, 예를 들어, 융합 단백질, 단백질 단편, 단백질 유사체, 올리고펩티드 등을 포함한다. 용어 "폴리펩티드"는 핵산에 의해 인코딩되거나, 재조합 기술을 통해 생성(예를 들어, 트랜스제닉 새로부터 분리됨)되거나, 화학적으로 합성되는 상기 정의된 바와 같은 폴리펩티드를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "프로모터"는 조류 세포에서 RNA 중합효소에 의한 전사 개시를 개시시키는데 유용한 DNA 서열을 나타낸다. "프로모터 성분"은 단독으로 또는 다른 DNA 서열과 함께 전사를 수행하거나 촉진할 수 있는 DNA 서열이다. 본원에 개시되고 청구된 특이적 프로모터 성분, 예를 들어, 난알부민 프로모터 성분, 난점질 프로모터 성분 및 리소자임 프로모터 성분 및 다른 프로모터 및 프로모터 성분은 특이적 프로모터 서열을 기재하지 않는다. 오히려, 이들은 코딩 서열의 전사를 수행하거나 촉진하는데 유용한 각각의 프로모터의 임의의 서열 또는 서열 단편을 포함한다. 예를 들어, 난점질 프로모터 성분은 참조로서 본원에 온전히 포함되는 2007년 5월 17일에 공개된 미국 공개 번호 11/649,543호에 개시된 약 1.8 kb, 약 3.9 kb 및 약 10 kb의 난점질 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "프로모터 성분"은 또한 RNA 전사를 개시시키는 작용을 하는 재배열된 유전자 발현 조절 영역 및 RNA 전사를 개시시키는 작용을 하는 자연 발생 DNA 서열 및/또는 합성 DNA 서열로 구성된 하이브리드 DNA 분자를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "재조합 핵산" 및 "재조합 DNA"는 진핵생물 또는 원핵생물 세포에서 자연 발견되지 않는 적어도 2개의 핵산 서열의 조합물을 나타낸다. 핵산 서열은 핵산 벡터, 유전자 발현 조절 성분, 복제 기점, 발현되는 경우 항생제 내성을 부여하는 적합한 유전자 서열, 단백질-인코딩 서열 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 용어 "재조합 폴리펩티드" 또는 "재조합 단백질"은 재조합 DNA 기술에 의해 생성되어, 위치, 순도 또는 구조에 있어서 자연 발생 폴리펩티드와 상이한 폴리펩티드를 포함하는 것을 의미한다. 일반적으로, 이러한 재조합 폴리펩티드는 일반적으로 자연적으로 관찰되는 것과 상이한 양으로 세포에 존재할 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "엄격한 조건"은 약 Tm-5℃(프로브의 융해 온도(Tm)보다 5℃ 아래) 내지 Tm 보다 약 20℃ 내지 25℃ 아래 범위 내에서 발생하는 "엄격성"이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 동일하거나 관련된 폴리누클레오티드 서열을 확인하거나 검출하기 위해 하이브리드화의 엄격성이 변경될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "피검체" 또는 "환자"는 포유동물 및 비포유동물을 포함한다. 포유동물의 예는 인간, 침팬지, 유인원, 원숭이, 소, 말, 양, 염소, 돼지, 토끼, 개, 고양이, 래트, 마우스, 기니아 피그 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 비포유동물의 예는 새, 어류 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본원에서 사용되는 "치환"은 하나 이상의 아미노산 또는 누클레오티드의 상이한 아미노산 또는 누클레오티드 각각에 의한 대체를 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "치료적 유효량"은 상기 양을 투여받지 않은 상응하는 피검체와 비교하여 질병, 장애, 또는 부작용의 개선된 치료, 치유, 예방, 또는 개선, 또는 질병 또는 장애의 진행 속도의 감소를 발생시키는 화합물의 임의의 양을 나타낸다. 상기 용어는 또한 이의 범위 내에 정상적인 생리학적 기능을 향상시키는데 효과적인 양을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "TAGNPP1", "융합 단백질", "TAGNPP1 폴리펩티드" 및 "표적화 모이어티에 융합된 NPP1 성분"은 상호교환적으로 사용된다.

본원에서 사용되는 용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 질병 또는 질환 증상을 경감시키거나, 감소시키거나, 개선시키거나, 추가 증상을 예방하거나, 증상의 근본 원인을 개선시키거나, 예방하거나, 질병 또는 질환을 억제하거나, 질병 또는 질환의 발생을 억제하거나, 질병 또는 질환을 경감시키거나, 질병 또는 질환의 퇴축을 야기시키거나, 질병 또는 질환에 의해 야기되는 질환을 경감시키거나, 질병 또는 질환의 증상을 예방적 및/또는 치료적으로 중지시키는 방법을 나타낸다.

본원에서 사용되는 TAGNPP1의 "변이체"는 하나 이상의 아미노산에 의해 변경되는 아미노산 서열을 나타낸다. 바람직하게는, 변이체는 보존성 치환을 함유한다. "보존성 치환"은 아미노산이 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되어, 펩티드 화학의 당업자가 폴리펩티드의 이차 구조 및 하이드로패틱 성질(hydropathic nature)이 실질적으로 변화되지 않는 것을 예상할 수 있는 것이다. 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 친양매성 특성에서의 유사성을 기초로 하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음성으로 하전된 아미노산은 Asp 및 Glu를 포함하고; 양성으로 하전된 아미노산은 리신 및 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수성 값을 갖는 하전되지 않은 극성 머리 기를 갖는 아미노산은 Leu, Ile 및 Val; Gly 및 Ala; Asp 및 Gln; 및 Ser, Thr, Phe 및 Tyr을 포함한다. 보존성 변화를 나타낼 수 있는 아미노산의 다른 군은 Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr; (3) Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; 및 (5) Phe, Tyr, Trp, His를 포함한다. 변이체는 또한 또는 대안적으로 비보존성 변화를 함유할 수 있다. 한 바람직한 구체예에서, 변이체 폴리펩티드는 5개의 아미노산 또는 그 미만의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해, 또는, 예를 들어, Gly의 Trp에 의한 대체에 의해 자연 서열과 상이하다. 변이체는 또한(또는 대안적으로), 예를 들어, NPP1 성분의 면역원성, 이차 구조 및 하이드로패틱 성질(hydropathic nature)에 최소한의 영향을 미치는 아미노산의 결실 또는 첨가에 의해 변형될 수 있다. 어떤 아미노산 잔기가 생물학적 또는 면역학적 활성을 파괴함이 없이 치환되거나, 삽입되거나, 결실될 수 있는 것을 결정하는데 있어서의 지침은 당 분야에 널리 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 발견될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "벡터" 및 "핵산 벡터"는 세포로 트랜스펙션되거나 형질전환될 수 있고, 숙주 세포 유전체와 독립적으로 또는 숙주 세포 유전체 내에서 복제할 수 있는 자연 또는 합성의 단일 또는 이중 가닥 플라스미드 또는 바이러스 핵산 분자를 나타낸다. 원형 이중 가닥 벡터는 벡터의 누클레오티드 서열을 기초로 하여 적절한 제한 효소를 이용한 처리에 의해 선형화될 수 있다. 핵산은 벡터를 제한 효소로 절단하고, 원하는 단편들을 함께 라이게이션시킴으로써 벡터에 삽입될 수 있다.

융합 단백질과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "일부"는 상기 단백질의 단편을 나타낸다. 단편은 4개의 아미노산 잔기 내지 전체 아미노산 서열에서 하나의 아미노산이 빠진 크기의 범위일 수 있다. 따라서, "SEQ ID NO:1의 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함하는" 단백질은 전장 TAGNPP1 및 이의 단편을 포함한다.

본원에서 사용되는 "형질전환" 또는 "트랜스펙션"은 당 분야에 널리 공지된 다양한 방법을 이용하여 외인성 DNA가 진입하고 수용체 세포를 변화시키는 과정을 기재한다. 형질전환은 외래 핵산 서열의 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포로의 삽입을 위한 임의의 공지된 방법에 의존할 수 있다. 상기 방법은 형질전환되는 숙주 세포를 기초로 하여 선택되고, 이는 전기천공, 입자 분사법(particle bombardment), 바이러스 감염, 및 리포펙션(lipofection)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 "형질전환된" 세포는 삽입된 DNA가 자율적으로 복제하는 플라스미드로서 또는 숙주 염색체의 일부로서 복제될 수 있는 안정적으로 형질전환된 세포를 포함한다. 이들은 또한 제한된 기간 동안 삽입된 DNA 또는 RNA를 일시적으로 발현하는 세포를 포함한다.

실시예

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 이러한 실시예는 단지 예시 목적을 위한 것으로, 본 발명을 어떠한 방식으로든 제한하고자 하는 것이 아니며, 본 발명을 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 간주되어선 안 된다.

실시예 I

sNPP1에 융합된 8개의 연속적 아스파르트산을 갖는 표적화 모이어티를 함유하는 TAGsNNP1 작제물을 EcoRI 및 HindIII 부위를 이용하여 pTT22 벡터에 라이게이션시켰다(pTT22-sNPP1.D8; 도 19). pTT22-sNPP1.D8을 HEK203E 세포에 트랜스펙션시키고, 형질전환체를 배양하여 TAGsNNP1을 발현시켰다. TAGsNNP1을 당 분야에 널리 공지된 바와 같이 배양 배지로부터 분리시키고, 부분적으로 정제하였다. 정제 후, TAGsNPP1의 피로포스파제/포스포디에스테라제 활성을 티미딘 5' 모노포스페이트 p-니트로페닐 에스테르를 가수분해시키는 이의 능력에 대해 측정하였다. 간단히, TAGsNPP1을 50 mM Tris, 250 mM NaCl, pH 9.5 중에서 1 ng/μL로 희석시켰다. 1 ng/μL TAGsNPP1의 50 μL를 함유하는 플레이트에서, 50 μL의 10 mM 티미딘 5' 모노포스페이트 p-니트로페닐 에스테르(Sigma™, Catalog #T4510) 기질을 첨가하였다. TAGsNPP1의 효소 활성을 5분 동안 동역학 모드로 405 nm(흡광도)에서 측정하였다. 도 21에 제시된 바와 같이, TAGsNPP1의 활성은 TAGsNPP1을 함유하지 않는 대조군에서 관찰된 수준을 초과하는 것으로 검출되었다. 특히, HEK203D6으로부터 생성된 TAGsNPP1은 효소 활성의 가장 높은 수준을 나타내었다. 이러한 결과는 표적화 모이어티에 융합된 트렁케이션된 NPP1(즉, D8)이 누클레아제로서의 이의 정상 기능을 충분히 유지한 것을 강하게 암시하였다.

실시예 II

본 비제한적 예언적 실시예는 TAGNPP1 융합 단백질을 포함하는 제형을 투여함으로써 특발성 영아 동맥 석회화를 치료하는 방법을 기재한다.

임상의는 환자가 동맥에서 높은 수준의 석회화를 갖는 것을 확인하기 위해 진단 시험을 이용한다. 유전적 시험은 또한 문헌[Rutsch et al. (2003), Nature Genetics 34:379-81]에 기재된 바와 같이 NPP1 결함에 대해 수행될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 정맥내 투여되나, 피내, 근내 또는 경구 투여가 특정 상황에서 이용된다.

임상의는 환자의 성별, 연령, 건강, 및 체중에 따라 변할 수 있는 용량을 결정한다. 적절한 투여량 또는 투여 경로의 결정은 보통의 의사의 기술 내에 충분히 포함된다.

TAGNPP1을 함유하는 제형이 매주 주 당 약 10 ㎎/㎏ 내지 약 1000 ㎎/㎏으로 주입될 수 있다. 10-30 ㎎/㎏이 1회 투여될 수 있다. 주입 기간 동안, 환자는 면밀히 관찰되고, 적절한 임상적 개재가 유해 사례의 경우에 수행된다. 치료는 적어도 1개월 또는 환자의 생애 동안 지속된다. 48시간의 기간이 각각의 주입에 대해 허용될 수 있다. 시간이 지남에 따라 주입 속도를 증가시키는 주입 스케줄이 유해 사례를 감소시키거나 배제시킨다. 영아에 대한 주입은 다음과 같은 스케줄에 따라 투여될 수 있다: 각 기간에서 60분 동안 5-10 cc/hr.

또 한편으로, 연속적 정맥내 투여가 요망되는 경우, 서방형 시스템의 통상적 예는 1-100 ㎎/㎏의 효과적인 TAGNPP1 단백질이 1일 이상 동안 연속적으로 방출될 수 있는 것을 포함한다.

실시예 III

가용성 TAGsNPP1-D8의 정제

TAGsNPP1의 가용성 형태(C-말단 태깅된 D8)(SEQ ID NO:20 및 도 26 참조)를 HEK293 적응용 배지로부터 정제하였다. 적응용 배지(500㎖)를 하이드록시아파타이트(HA)-완충액 A(10mM Na₃PO₄, pH 6.8)로 평형화시키고, 0.2μm Sartobran P Size 8 MidiCap Filter(Sartorius Stedim)로 여과시켰다. 20㎖ HA-Ultrogel 컬럼(Pall Life Sciences)을 5 컬럼 부피(CV)의 완충액 A로 평형화시킨 후, 여과된 적응용 배지를 3㎖/분으로 로딩하였다. 컬럼을 완충액 A를 이용하여 UV 기준선으로 세척하였다. 단백질을 5㎖ 분획을 수거하면서 각각 2.5CV의 HA-완충액 B(150mM Na₃PO₄, pH 6.8), HA-완충액 C(250mM Na₃PO₄, pH 6.8), 및 HA-완충액 D(500mM Na₃PO₄, pH 6.8)를 이용하여 단계적으로 용리시켰다. HA-컬럼으로부터의 활성 분획을 풀링(50㎖)시키고, WGA-완충액 A(20mM Tris, pH 8.0, 150mM NaCl, 0.7% CHAPS)로 평형화시켰다. 여과 후, 6-7㎎의 전체 단백질(15-18㎖)을 5CV의 WGA-완충액 A로 평형화된 1㎖ 밀 배아 응집소(WGA) 중력 컬럼(EMD Chemicals)에 로딩하였다. 컬럼을 7CV의 WGA-완충액 A로 세척한 후, 단백질을 5x1㎖ WGA-완충액 B(20mM Tris, pH 8.0, 150mM NaCl, 500mM N-아세틸글루코사민, 0.7% CHAPS 완충액)으로 용리시켰다. WGA-완충액 B를 10분 동안 실온에서 컬럼과 함께 인큐베이션시킨 후, 1㎖ 분획을 수거하였다. 시작 물질 모두가 WGA-컬럼에 의해 정제될 때까지 상기 과정을 반복하였다(전체 4회 수행). 활성 분획(29㎖)을 풀링시키고, 100,000 분자량 컷오프(cut off)(MWCO) Vivaspin-15(Sartorius Stedim)를 이용하여 1.2㎖로 농축시키고, 동시에 PBS로 완충액 교환하였다.

활성 sNPP1-D8(TAGsNPP1)을 HPLC를 기초로 하여 91.5%로 정제하였다. 최종 풀을 SDS-PAGE에 의해 분석하는 경우, 이합체 밴드는 비환원 조건하에서 ~210kD에 상응하였고, 환원 조건하에서, 단량체 밴드는 ~105kD에 상응하였다.

실시예 IV

인간 대동맥 평활근 세포를 48웰 플레이트에 웰 당 1x10⁴개의 세포로 플레이팅하고, 표준 조건하에서 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM)에서 유지시켰다. 2일 후, DMEM에 NaPO₄ 및 ATP를 각각 3.8 mM 및 50 uM로 보충하였다. sNPP1(WT; 도 9), C-말단에 융합된 8개의 연속적 아스파르트산 잔기를 갖는 TAGsNPP1(D8)(도 26) 및 sNPP1-Fc(도 29)를 1 ㎍/㎖로 보충하였다. 배지를 격일에 동일 배지로 대체하였다. 5일 후, 배지를 배양물로부터 제거하고, 100 ㎕의 0.6N HCl로 대체하고, 용액으로 칼슘 포스페이트를 용해시키면서 실온에서 16-20시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 칼슘 수준을 Cayman Chemical Company(Ann Arbor, MI)사로부터의 Calcium Assay Kit(#700550)를 이용하여 비색 칼슘-크레졸프탈레인 반응에 의해 정량하였다.

도 23에 제시된 바와 같이, TAGsNPP1은 sNPP1(WT)의 석회화에 비해 석회화에 대한 증가된 억제를 나타내었고, 이는 TAGsNPP1에 함유된 D8 도메인이 석회화 부위로의 증가된 귀소(homing) 능력 및/또는 향상된 억제 효과를 제공하는 것을 암시한다.

실시예 V

sNPP1-Fc의 효소 활성 검정

1 ㎍의 sNPP1-Fc(도 29)의 첨가는 70% 순도를 기초로 하였다(즉, ~1.1 ㎍의 sNPP1-Fc를 본 검정에서 사용하였다). HPLC 크기 배제 컬럼(SEC)은 sNPP1-Fc가 ~78% 순도임을 나타낸다. 비환원 겔은 예상 크기(~250kD)의 이합체를 나타내었다. 이합체 밴드는 DTT로 처리하는 경우에 예상 단량체 크기(~125kD)로 감소되었다. 웨스턴 블롯 분석으로 이합체 및 단량체 밴드를 확인하였다. PNGase F를 이용한 sNPP1-Fc 샘플의 처리는 단량체 밴드를 ~125kD으로부터 ~100kD으로 감소시켰고, 이는 sNPP1-Fc가 12개의 N-글리칸 부위를 함유한 것을 고려한 예상 분자량이다. 78% 순도에서, 최종 정량은 ~0.808 ㎎의 sNPP1-Fc(2.2 ㎍/㎖의 적응용 배지)를 생성시켰다. sNPP1-Fc의 효소 활성을 당 분야에 공지된 바와 같이 결정하였다.

상기 명세서 내의 각 실시예는 본 발명의 설명의 목적으로 제공되며, 본 발명을 제한하지는 않는다. 사실, 다양한 변형, 조합, 추가, 결실 및 변화가 본 발명의 범위 또는 사상을 벗어남이 없이 본 발명에서 이루어질 수 있음이 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들어, 한 구체예의 일부로서 예시되거나 기재된 특징은 또 다른 구체예에서 사용되어 또 다른 추가 구체예를 발생시킬 수 있다. 본 발명은 상기 변형, 조합, 추가, 결실, 및 변화를 포함하는 것으로 의도된다.

본원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원, 인터넷 사이트, 및 등록 번호/데이터베이스 서열(폴리누클레오티드 및 폴리펩티드 서열 둘 모두를 포함함)은 각각의 개별적인 간행물, 특허, 특허 출원, 인터넷 사이트, 및 등록 번호/데이터베이스 서열이 참조로서 포함되는 것으로 명확하고 개별적으로 지정되는 것과 동일한 정도로 모든 목적상 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Synageva BioPharma Corp. <120> NPP1 Fusion Proteins <130> SYN-077CIPWO <140> PCT/US2011/051858 <141> 2011-09-15 <150> PCT/US2011/028233 <151> 2011-03-11 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 925 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Arg Asp Gly Cys Ala Gly Gly Gly Ser Arg Gly Gly Glu Gly 1 5 10 15 Gly Arg Ala Pro Arg Glu Gly Pro Ala Gly Asn Gly Arg Asp Arg Gly 20 25 30 Arg Ser His Ala Ala Glu Ala Pro Gly Asp Pro Gln Ala Ala Ala Ser 35 40 45 Leu Leu Ala Pro Met Asp Val Gly Glu Glu Pro Leu Glu Lys Ala Ala 50 55 60 Arg Ala Arg Thr Ala Lys Asp Pro Asn Thr Tyr Lys Val Leu Ser Leu 65 70 75 80 Val Leu Ser Val Cys Val Leu Thr Thr Ile Leu Gly Cys Ile Phe Gly 85 90 95 Leu Lys Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys Lys Gly Arg Cys 100 105 110 Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala Ala Cys Val Glu 115 120 125 Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Ile Glu Pro Glu 130 135 140 His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Lys Arg Leu Thr 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ccagtcagca gtgaagtcat caaagccttg 960 cagagggttg atggtatggt tggtatgctg atggatggtc tgaaagagct gaacttgcac 1020 agatgcctga acctcatcct tatttcagat catggcatgg aacaaggcag ttgtaagaaa 1080 tacatatatc tgaataagta tttgggggat gttaaaaata ttaaagttat ctatggacct 1140 gcagctcgat tgagaccctc tgatgtccca gataaatact attcatttaa ctatgaaggc 1200 attgcccgaa atctttcttg ccgggaacca aaccagcact tcaaacctta tctgaaacat 1260 ttcttgccta agcgtttgca ctttgctaag agtgatagaa ttgagccctt gacattctat 1320 ttggaccctc agtggcaact tgcattgaat ccctcagaaa ggaaatattg tggaagtgga 1380 tttcatggct ctgacaatgt gttttcaaat atgcaagccc tctttgttgg ctatggacct 1440 ggattcaagc atggcattga ggctgacacc tttgaaaaca ttgaagtcta taacttgatg 1500 tgtgatttgc tgaatttgac accggctcct aataacggaa ctcatggaag tcttaaccac 1560 cttctgaaga atcctgttta tacgccaaag catcccaaag aagtgcaccc cctggtgcag 1620 tgccccttca caagaaaccc cagagataac cttggctgct catgtaaccc ttccattttg 1680 ccgattgagg attttcaaac acagttcaat ctgaccgtgg cagaagagaa gattattaag 1740 catgaaactt tgccctatgg aagacctaga gttctccaga aggaaaacac catctgtctt 1800 ctttcccagc accagtttat gagtggatac agccaagaca tcttgatgcc cctttggaca 1860 tcctataccg tggacagaaa tgacagtttc tctacggaag acttctccaa ctgtctgtac 1920 caggacttta gaattcctct tagtcctgtc cataaatgtt cattttataa aaataacacc 1980 aaagtgagtt acgggttcct ctccccacca caactgaata agaattcaag tggaatatat 2040 tctgaagcct tgcttactac aaatatagtg ccaatgtacc agagttttca agttatatgg 2100 cgctactttc atgacaccct cttgcgaaag tatgcagaag aaagaaatgg tgtcaatgtc 2160 gtcagtggtc ctgtgtttga ctttgattat gatggacgtt gtgattcctt ggagaatttg 2220 aggcaaaaaa gaagagtcat ccgtaaccaa gaaattttga ttccaactca tttcttcatt 2280 gtgctgacaa gctgtaaaga tacatctcag acgcctttgc actgtgaaaa cctggacacc 2340 ttggctttca ttttgcctca caggactgat aacagcgaga gctgtgtgca tgggaagcat 2400 gactcctcat gggttgaaga attgttgatg ttgcacagag cacggatcac agacgtcgag 2460 cacatcactg gactcagctt ttatcaacaa agaaaagagc cagtttcaga cattttgaag 2520 ttgaaaacac atttgccaac ctttagccaa gaagatgatg acgatgatga cgacgattga 2580 <210> 20 <211> 859 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C-terminal D8 TAGsNPP1 fusion protein <400> 20 Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val 20 25 30 Lys Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg 35 40 45 Cys Asp Ala Ala Cys Val Glu Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln 50 55 60 Glu Thr Cys Ile Glu Pro Glu His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg 65 70 75 80 Cys Gly Glu Lys Arg Leu Thr Arg Ser Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp 85 90 95 Cys Lys Asp Lys Gly Asp Cys Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln 100 105 110 Gly Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro 115 120 125 Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu 130 135 140 Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro 145 150 155 160 Val Ile Ser Lys Leu Lys Lys Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg 165 170 175 Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr 180 185 190 Gly Leu Tyr Pro Glu 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Thr Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys 820 825 830 Glu Pro Val Ser Asp Ile Leu Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe 835 840 845 Ser Gln Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp 850 855 <210> 21 <211> 3255 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding sNPP1-Fc fusion protein <400> 21 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatgccaag ttgtgccaaa gaagttaaaa gttgcaaagg tcgctgtttc 120 gagagaacat ttgggaactg tcgctgtgat gctgcctgtg ttgagcttgg aaactgctgt 180 ttggattacc aggagacgtg catagaacca gaacatatat ggacttgcaa caaattcagg 240 tgtggtgaga aaagattgac cagaagcctc tgtgcctgtt cagatgattg caaggacaag 300 ggcgactgct gcatcaacta cagttcagtg tgtcaaggtg agaaaagttg ggtggaagaa 360 ccatgtgaga gcattaatga gccacagtgc ccagcagggt ttgaaacgcc tcctacactc 420 ttgttttctt tggatggatt cagggcagaa tatttgcaca cttggggtgg acttcttcct 480 gttattagca aactcaaaaa atgtggaaca tatactaaaa acatgagacc ggtgtatcca 540 acaaaaactt tccccaatca ctacagcatt gtcaccggat tgtatccaga atctcatggc 600 ataatcgaca ataagatgta tgatcccaaa atgaatgctt ccttttcact taaaagtaaa 660 gagaaattta atccggagtg gtacaaagga gaaccaattt gggtcacagc taagtatcaa 720 ggcctcaagt ctggcacatt tttctggcca ggatcagatg tggaaattaa cggaattttc 780 ccagacatct ataaaatgta taatggttca gtgccatttg aagaaaggat tttggctgtt 840 cttcagtggc tgcagcttcc aaaagatgaa agaccacact tttacacttt gtatttggaa 900 gaaccagatt cttcaggtca ttcatatgga ccagtcagca gtgaagtcat caaagccttg 960 cagagggttg atggtatggt tggtatgctg atggatggtc tgaaagagct gaacttgcac 1020 agatgcctga acctcatcct tatttcagat catggcatgg aacaaggcag ttgtaagaaa 1080 tacatatatc tgaataagta tttgggggat gttaaaaata ttaaagttat ctatggacct 1140 gcagctcgat tgagaccctc tgatgtccca gataaatact attcatttaa ctatgaaggc 1200 attgcccgaa atctttcttg ccgggaacca aaccagcact tcaaacctta tctgaaacat 1260 ttcttgccta agcgtttgca ctttgctaag agtgatagaa ttgagccctt gacattctat 1320 ttggaccctc agtggcaact tgcattgaat ccctcagaaa ggaaatattg tggaagtgga 1380 tttcatggct ctgacaatgt gttttcaaat atgcaagccc tctttgttgg ctatggacct 1440 ggattcaagc atggcattga ggctgacacc tttgaaaaca ttgaagtcta taacttgatg 1500 tgtgatttgc tgaatttgac accggctcct aataacggaa ctcatggaag tcttaaccac 1560 cttctgaaga atcctgttta tacgccaaag catcccaaag aagtgcaccc cctggtgcag 1620 tgccccttca caagaaaccc cagagataac cttggctgct catgtaaccc ttccattttg 1680 ccgattgagg attttcaaac acagttcaat ctgaccgtgg cagaagagaa gattattaag 1740 catgaaactt tgccctatgg aagacctaga gttctccaga aggaaaacac catctgtctt 1800 ctttcccagc accagtttat gagtggatac agccaagaca tcttgatgcc cctttggaca 1860 tcctataccg tggacagaaa tgacagtttc tctacggaag acttctccaa ctgtctgtac 1920 caggacttta gaattcctct tagtcctgtc cataaatgtt cattttataa aaataacacc 1980 aaagtgagtt acgggttcct ctccccacca caactgaata agaattcaag tggaatatat 2040 tctgaagcct tgcttactac aaatatagtg ccaatgtacc agagttttca agttatatgg 2100 cgctactttc atgacaccct cttgcgaaag tatgcagaag aaagaaatgg tgtcaatgtc 2160 gtcagtggtc ctgtgtttga ctttgattat gatggacgtt gtgattcctt ggagaatttg 2220 aggcaaaaaa gaagagtcat ccgtaaccaa gaaattttga ttccaactca tttcttcatt 2280 gtgctgacaa gctgtaaaga tacatctcag acgcctttgc actgtgaaaa cctggacacc 2340 ttggctttca ttttgcctca caggactgat aacagcgaga gctgtgtgca tgggaagcat 2400 gactcctcat gggttgaaga attgttgatg ttgcacagag cacggatcac agacgtcgag 2460 cacatcactg gactcagctt ttatcaacaa agaaaagagc cagtttcaga cattttgaag 2520 ttgaaaacac atttgccaac ctttagccaa gaagatgagc ccaaatcttg tgacaaaact 2580 cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 2640 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 2700 gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 2760 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 2820 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 2880 tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 2940 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 3000 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 3060 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 3120 ttcttcctct atagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 3180 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 3240 tccccgggta aatga 3255 <210> 22 <211> 1084 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sNPP1-Fc fusion protein <400> 22 Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val 20 25 30 Lys Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg 35 40 45 Cys Asp Ala Ala Cys Val Glu Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln 50 55 60 Glu Thr Cys Ile Glu Pro Glu His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg 65 70 75 80 Cys Gly Glu Lys Arg Leu Thr Arg Ser Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp 85 90 95 Cys Lys Asp Lys Gly Asp Cys Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln 100 105 110 Gly Glu Lys Ser Trp Val Glu Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro 115 120 125 Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu 130 135 140 Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro 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565 570 575 Lys Ile Ile Lys His Glu Thr Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu 580 585 590 Gln Lys Glu Asn Thr Ile Cys Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser 595 600 605 Gly Tyr Ser Gln Asp Ile Leu Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val 610 615 620 Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr 625 630 635 640 Gln Asp Phe Arg Ile Pro Leu Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr 645 650 655 Lys Asn Asn Thr Lys Val Ser Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu 660 665 670 Asn Lys Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn 675 680 685 Ile Val Pro Met Tyr Gln Ser Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His 690 695 700 Asp Thr Leu Leu Arg Lys Tyr Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val 705 710 715 720 Val Ser Gly Pro Val Phe Asp Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser 725 730 735 Leu Glu Asn Leu Arg Gln Lys Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile 740 745 750 Leu Ile Pro Thr His Phe Phe Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr 755 760 765 Ser Gln Thr Pro Leu His Cys Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile 770 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985 990 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 995 1000 1005 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 1010 1015 1020 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 1025 1030 1035 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 1040 1045 1050 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 1055 1060 1065 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1070 1075 1080 Lys

Claims

NPP1 성분, 및 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 분리된 NPP1 융합 단백질로서,
a) NPP1 성분은 시스테인-풍부 영역 및 NPP1의 C-말단 촉매 도메인을 포함하고,
b) Fc 영역은 NPP1 성분의 C-말단에 위치해 있으며,
c) 분리된 NPP1 융합 단백질은 피로포스파타제 활성, 포스포디에스테라제 활성, 또는 피로포스파타제 및 포스포디에스테라제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 분리된 NPP1 융합 단백질.
제 1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 재조합 단백질인 것을 특징으로 하는, 분리된 NPP1 융합 단백질.
제 1항에 있어서, 상기 NPP1 성분은 SEQ ID NO:1의 P99 내지 D925로 이루어진 것을 특징으로 하는, 분리된 NPP1 융합 단백질.
제 1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 신호 펩티드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 분리된 NPP1 융합 단백질.
제 1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 동종이합체를 형성하는 것을 특징으로 하는, 분리된 NPP1 융합 단백질.
제 1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 단량체인 것을 특징으로 하는, 분리된 NPP1 융합 단백질.
제 1항에 있어서, 상기 Fc 영역은 상기 NPP1의 촉매 도메인의 C-말단에 융합된 것을 특징으로 하는, 분리된 NPP1 융합 단백질.
제 1항의 분리된 NPP1 융합 단백질을 인코딩하는 분리된 핵산.
제 8항의 분리된 핵산을 갖는 복제 또는 발현 벡터.