npp1融合蛋白
相关申请
本申请要求2011年3月11日提交的PCT/US2011/028233的权益,PCT/US2011/028233要求2010年3月12日提交的美国临时申请号61/340,066的权益。将上述申请的全部传授内容通过引用结合在此。
发明背景
胞外核苷酸(ectonucleotide)焦磷酸酶/磷酸二酯酶1(NPP1/ENPP1/PC-1)是形成同型二聚体的II型跨膜糖蛋白。这种蛋白切割多种底物,包括核苷酸与核苷酸糖的磷酸二酯键以及核苷酸与核苷酸糖的焦磷酸键。NPP1功能是将5’核苷三磷酸酶(triphosphtase)水解为任一相应的单磷酸酯并且还水解多磷酸二腺苷。已经将NPP1基因中的突变与特发性婴儿动脉钙化(IIAC)、胰岛素抗性、低磷酸盐血症性佝偻病、以及脊椎后纵韧带骨化症相关联。
IIAC,一种罕见的常染色体隐性且几乎总是致命的紊乱,特征为肌性动脉内弹性膜的钙化以及归因于肌内膜增生的狭窄。全世界范围内已经报告了超过160例IIAC。通常,由于缺血性心肌病,以及阻塞性动脉病的其他并发病(包括肾动脉狭窄),该疾病的症状最常由早期婴儿表现出,并且该疾病对6月龄婴儿是致命的。在超过十几例报告的IIAC中,在婴儿中还发展了大关节的关节周钙化。Rutsch(如特斯彻)等人,(2003)报告了ENPP1中的突变与其特征为生命早期中的自发性关节周与主动脉钙化以及受累者中的核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶活性的系统性降低的IIAC相关。
虽然NPP1蛋白的缺陷已经牵涉到如此严重的疾病(如IIAC)中,但在该领域中没有针对遭受该疾病折磨的患者的可用治疗。因此,存在对用于治疗IIAC、胰岛素抗性、低磷酸盐血症性佝偻病、以及脊椎后纵韧带骨化症有效且安全的组合物、配制品以及药物的迫切需求。
发明概述
本发明包括与靶向部分融合的、NPP1的截短结构域(即,NPP1组分)的多种融合蛋白。靶向部分的功能是增强将NPP1融合蛋白靶向到临床或生物学上重要位点(例如,在需要降低钙化的受试者体内的钙化位点)的效力。无意将本发明局限于任何具体理论或工作机制,认为NPP1组分功能是通过增强焦磷酸(PPi)的形成和/或通过切割焦磷酸以产生可溶性磷酸(Pi)和/或通过增加腺苷单磷酸(AMP)和/或腺苷的可用性来抑制钙化。在此考虑了该靶向部分可以在任何有用位置处被附接到该NPP1组分的N-端和/或C-端。额外地,在此披露的NPP1融合蛋白还可以包括Fc片段、PEG、多肽接头或其他额外多肽中的一种或多种,以增强该酶的活性、稳定性或靶向性。
本发明的融合蛋白可以用于治疗受试者体内的多种多样的病症。可以通过给予本发明的融合蛋白有益地治疗的任何病症都包括在本发明范围内。例如,可以在受试者(如,哺乳动物,例如,人类患者)体内通过减少和/或消除一个或多个钙化结构和/或预防钙化结构形成得以改善的病症的治疗在本发明范围内。考虑通过采用本发明的融合蛋白治疗病症(例如动脉阻塞)。在一个特别有用的实施例中,待治疗的病症是婴儿型全身性动脉钙化,也称作婴儿型特发性动脉钙化和婴儿型动脉基质钙化。还考虑了病症如胰岛素抗性、低磷酸盐血症性佝偻病以及脊椎后纵韧带骨化症的治疗。
可以在任何有用的蛋白表达系统中生产本发明的融合蛋白,该表达系统包括但不局限于,细胞培养系(例如,CHO细胞、COS细胞、HEK203);细菌(例如大肠杆菌(E.coli))以及转基因动物,包括但不局限于,哺乳动物和禽类(例如,鸡、鹌鹑、鸭和火鸡)。
药物组合物(或药物配制品)的制造是本领域中所熟知的并且此类药物组合物被考虑为根据本发明的融合蛋白使用。
一般地,向受试者给予的融合蛋白的剂量将取决于已知因素而改变,这些因素例如接受者的年龄、健康状态与体重,并行治疗的类型、治疗频率,等。通常,活性成分(即,融合蛋白)的剂量可以在约0.0001至约50毫克每公斤体重之间。可由治疗性蛋白的给予领域的医师来确定精确的剂量、给予频率和治疗时间间隔。
附图简要说明
图1示例了野生型NPP1蛋白的氨基酸序列。加下划线的为胞质和跨膜区域。粗体为潜在的N-糖基化位点。斜体的PSCAKE是包括富含半胱氨酸的区域的可溶性NPP1的起点。
图2示例了不具有附接的靶向部分的NPP1蛋白的一个或多个催化结构域的氨基酸序列(“sssNPP1”)。
图3示例了TAGsssNPP1的氨基酸序列。八个连续天冬氨酸残基的靶向部分与sssNPP1的N-端融合。加下划线的为信号肽,并且靶向部分用粗体表示。
图4示例了TAGsssNPP1的氨基酸序列,该序列包含与sssNPP1的C-端融合的、十个连续天冬氨酸残基的靶向部分。加下划线的为信号肽,并且靶向部分用粗体表示。
图5示例了TAGssNPP1融合蛋白的核酸序列。八个连续天冬氨酸残基的靶向部分与ssNPP1的N-端融合。
图6示例了TAGssNPP1融合蛋白的氨基酸序列。八个连续天冬氨酸残基的靶向部分与ssNPP1的N-端融合。加下划线的为信号肽,并且靶向部分用粗体表示。
图7示例了ssNPP1的核酸序列。
图8示例了ssNPP1的氨基酸序列。加下划线的为信号肽。
图9示例了sNPP1的核酸序列。
图10示例了sNPP1的氨基酸序列。加下划线的为信号肽。
图11示例了TAGsNPP1的核酸序列。八个连续天冬氨酸残基的靶向部分与sNPP1的N-端融合。
图12示例了TAGsNPP1的氨基酸序列。八个连续天冬氨酸残基的靶向部分与ssNPP1的N-端融合。加下划线的为信号肽,并且靶向部分用粗体表示。
图13示例了TAGsNPP1的核酸序列。八个连续天冬氨酸残基的靶向部分与sNPP1的C-端融合。
图14示例了TAGsNPP1的氨基酸序列。八个连续天冬氨酸残基的靶向部分与该sNPP1的N-端融合。加下划线的为信号肽,并且靶向部分用粗体表示。
图15示例了连接肽的氨基酸序列。
图16示例了免疫球蛋白Fc区段的氨基酸序列。
图17示例了TAGsssNPP1的氨基酸序列,该序列包含经由肽接头与sssNPP1的N-端融合的、八个连续天冬氨酸残基的靶向部分。Fc区段与靶向部分的N-端融合。加下划线的为信号肽并且靶向部分用粗体表示。斜体为肽接头。
图18示例了TAGsssNPP1的氨基酸序列,该序列包含经由肽接头与sssNPP1的C-端融合的、八个连续天冬氨酸残基的靶向部分。Fc区段与sssNPP1的N-端融合。加下划线的为信号肽并且靶向部分用粗体表示。斜体为肽接头。
图19是包含TAGsNPP1构建体的表达载体(即,pTT22)的示意性图示。八个连续天冬氨酸残基的靶向部分与sNPP1的C-端融合。
图20示例了TAGsNPP1的蛋白印迹分析。还原性条件;NR,非还原性条件。
图21展示了生产并分离自HEK293细胞的TAGsNPP1的酶活性。
图22A-22C示例了在此描述的TAGNPP1融合蛋白构建体的示意图。
图23展示了用可溶性sNPP1(WT)、TAGsNPP1(D8与sNPP1C-端融合)、以及sNPP1-Fc处理的人主动脉平滑肌细胞的钙化水平。
图24描绘了包含TAGsNPP1构建体的表达载体(即,pTT22)的示意性图示。八个连续天冬氨酸残基(D8)的靶向部分与sNPP1的C-端融合。
图25描绘了TAGsNPP1融合蛋白的核酸序列。
图26描绘了TAGsNPP1融合蛋白的氨基酸序列。
图27描绘了包含sNPP1-Fc融合构建体的表达载体(即,pTT22)的示意性图示。
图28描绘了sNPP1-Fc融合蛋白的核酸序列。
图29描绘了sNPP1-Fc融合蛋白的氨基酸序列。
发明详细说明
本发明提供了新颖的人NPP1融合蛋白,该蛋白是可溶性的并且包含NPP1的一个或多个截短的且生物活性的结构域(即,包含天然发生的NPP1的至少一个细胞外催化结构域的NPP1组分,用于焦磷酸酶和/或磷酸二酯酶活性)以及一个或多个靶向部分(即:“TAG”)。本发明的NPP1融合蛋白至少包括执行该焦磷酸酶和/或磷酸二酯酶活性必需的NPP1结构域。因此,本发明特征是与一个或多个靶向部分融合的、分离的融合蛋白,包括SEQ ID NO:1的从A205到L591的氨基酸残基。在给予本发明的融合蛋白的受试者体内,通过本领域中熟知的方法,该靶向部分可以与该NPP1组分重组融合或化学键合(例如,共价键、离子键、疏水键以及范德华力)并且引导该NPP1组分到其中附接的NPP1组分将具有希望的效果(例如,反应催化,例如增溶底物(例如PPi)或预防底物(例如PPi)的形成)的某个靶部位。
TAGNPP1s
本发明的全部NPP1融合蛋白(“TAGNPP1s”)去除了天然发生的人NPP1的N-端胞质和跨膜结构域。任选地,本发明的TAGNPP1s融合蛋白还可以包含不同长度的、野生型NPP1的C-端截短。全长野生型NPP1的氨基酸序列在SEQ ID NO:1中列出。
在一个实施例中,该融合蛋白包括多肽,该多肽包括SEQ ID NO:1的从A205到L591的氨基酸残基(“sssNPP1”),这些残基在该多肽的N-亦或C-端上与TAG融合(“TAGsssNPP1”)。在一个实施例中,该融合蛋白包括多肽,该多肽包括SEQ ID NO:1的从A205到D925的氨基酸残基(“ssNPP1”),这些残基在N-亦或C-端上与TAG融合(“TAGssNPP1”)。在一个实施例中,该融合蛋白包括多肽,该多肽包括SEQ ID NO:1的从P99到D925的氨基酸残基(“sNPP1”),这些残基在该多肽的N-亦或C-端上与TAG融合(“TAGsNPP1”)。还考虑了sNPP1的任何连续片段,该片段至少包括SEQ ID NO:1的从A205到L591的氨基酸残基并且该多肽片段在N-亦或C-端上与TAG融合。
当在细胞培养系或转基因动物中表达时,TAGNPP1融合蛋白在其N-端可以进一步包括信号肽(或前导序列)。该信号肽共翻译或翻译后引导TAGNPP1融合蛋白运输穿过表达TAGNPP1融合蛋白的细胞的亚细胞器,并且由此确定TAGNPP1融合蛋白的翻译后修饰。应理解,由于信号肽在融合蛋白的共翻译或翻译后阶段被切割,所以TAGNPP1融合蛋白在一旦分泌和分离时通常缺乏信号肽。因此,在描述针对编码TAGNPP1融合蛋白的核酸序列的实施例中,在本发明中使用时,也考虑前导序列。例如,在SEQ ID NO:2中列出的核苷酸序列在其5’端包含用于TAGNNP1的前导序列的实例。
考虑在此披露的每一种融合蛋白具有一个或多个靶向部分(“TAG”)。根据本发明的TAG组分包括四个或更多个带负电荷的氨基酸,例如天冬氨酸和谷氨酸。TAG组分可以是带负电荷的氨基酸残基的一个延伸(stretch),例如,长度约4至约20个氨基酸残基之间的天冬氨酸和/或谷氨酸。TAG可以与NPP1组分的N-亦或C-端融合。TAG还可以与NPP1组分的N-与C-端融合。因此,TAGsNPP1融合蛋白的氨基酸序列包括,例如,穿过NPP1组分的C-端的PSCAKE以及在NPP1组分的N-和/或C-端末端处的一个或多个靶向部分(例如,聚谷氨酸标签或聚天冬氨酸标签)。包括具有与C-端融合的TAG的NPP1组分的融合蛋白是一个特别有用的实施例。虽然根据本发明可以使用任何有用数量的带负电荷的氨基酸残基(例如,4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15、16、17、或18个),但是在一个非常具体的实施例中,如在图中的TAGsNPP1与TAGssNPP1的示例性序列中可以看到的,采用具有八个天冬氨酸的一个延伸的TAG。在图中,TAG组分表示为“A”。
本发明还涵盖编码在此描述的不同TAGNPP1融合蛋白的多核苷酸。因此,可以使用编码任何TAGNPP1融合蛋白的氨基酸序列的任何核酸序列来产生表达相应TAGNPP1融合蛋白的重组分子。在一个具体实施例中,本发明涵盖包括如在图2中所示的SEQ ID NO:2的核酸序列的多核苷酸。
在某些具体实施例中,融合蛋白包括如在此描述的多个多肽,或包括如在此描述的至少一个多肽以及一个不相关的序列。例如,某些优选的多肽可以协助二聚体形成以及稳定性或最小化融合蛋白的聚集。例如,额外的多肽可以是免疫球蛋白G1的Fc区从而增加血清中的稳定性。Fc区段的使用是本领域中熟知的并且描述于美国专利号(U.S.Pat.No.)7,902,151;以及美国专利号7,858,297中,将全部传授内容通过引用以其整体结合在此。野生型NPP1的富含半胱氨酸区(即,PSCAKE至NEPQCP;SEQ IDNO:1的从P99至P204的氨基酸序列)可以用于促进这些TAGNPP1融合蛋白的二聚体形成。
在另一个实施例中,聚乙二醇(PEG)可以共轭连接到该TAGNPP1融合蛋白上。可以选择其他多肽以便于最小化聚集和免疫原性,从而增加该蛋白的可溶性,或使得该蛋白能够靶向所希望的、临床或生物学重要的部位。
TAGNPP1还可以与适当的多肽接头或其他序列融合或共轭以便于该融合蛋白的识别、合成、或纯化,或更好地保护可以增强TAGNPP1的活性和靶向性的NPP1组分的天然结构。确切地,可以采用肽接头序列来分离该第一和第二多肽组分到足以确保每个多肽折叠为其二级和三级结构的距离。使用本领域中熟知的标准技术,将这样一个肽接头序列结合到该融合蛋白的NPP1组分与TAG组分之间。可以基于它们采取灵活延伸的构象的能力以及它们采取二级结构的无能选择适合的肽接头序列,该二级结构可以与NPP1、TAG或在此描述的其他二级多肽(例如,Fc)上的功能部分相互作用。优选的肽接头序列包含Gly、His、Asn以及Ser残基。有用的肽接头包括,并非出于限制,poly-Gly、poly-His、poly-Asn、或poly-Ser。其他近中性氨基酸,例如Thr和Ala也可以用于该接头序列中。可以有用地用作接头的氨基酸序列包括以下披露的那些:Maratea(马拉泰亚)等人,Gene(《基因》)40:39-46,1985;Murphy(墨菲)等人,Proc.Natl.Acad Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)83:8258-8262,1986;美国专利号4,935,233以及美国专利号4,751,180。该接头序列的长度可以是从1至约20个氨基酸残基。优选地,该多肽接头的长度在约8至约12个氨基酸之间。虽然可以使用Gly、Ser、His、或Asn的任何功能性组合,但是在一个优选实施例中,在本发明中使用的肽接头是GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:15)。
融合蛋白还可以包括本发明的TAGNPP1连同一个不相关的多肽。优选地,不相关的多肽能够增强融合蛋白靶向临床或生物学重要的部位(例如,钙化的部位)。例如,具有对骨的高亲和性的肽描述于美国专利号7,323,542中,将全部传授内容通过引用结合在此。
可以使用标准方法制备TAGNPP1,包括本领域中熟知的重组技术或化学共轭。对于分离和表征本发明的核酸与蛋白有用的技术是本领域普通技术人员熟知的,并且可以查询标准分子生物学和生物化学手册以选择适合的实验方案而无需过多实验即可使用。参见,例如,Sambrook(萨姆布鲁克)等人,1989,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,”(《分子克隆:实验室手册》),第二版,Cold Spring Harbor(冷泉港),将其内容通过引用以其整体结合在此。简言之,编码这些多肽组分的DNA序列可以分别装配,并且连接到适当的表达载体中。例如,编码该NPP1组分的DNA序列的3’端经由或不经由肽接头连接到编码第二多肽组分(例如TAG PEG或Fc)的DNA序列的5’端上,使得这些序列的阅读框同相(in phase)。这容许翻译为单融合蛋白,该融合蛋白保留这两种组分多肽的生物活性。所连接的DNA序列可操作地连接到包括启动子的、适合的转录或翻译调控元件上。负责DNA表达的这些调控元件仅位于编码该第一多肽的DNA序列(例如编码信号肽的前导序列)的5’端,。类似地,结束翻译必需的终止密码子以及转录终止信号仅存在于编码该第二多肽的DNA序列的3’端。
本发明还涵盖TAGNPP1变体。优选的TAGNPP1变体与SEQ ID NO:1的从A205到L591的氨基酸序列具有80%、85%、90%、95%并且更优选地96%的氨基酸序列同一性。最优选的TAGNPP1变体与SEQ ID NO:1的从A205到L591的氨基酸序列具有至少97%的氨基酸序列同一性。
本发明还涉及包括SEQ ID NO:2的组分的多核苷酸序列或其变体。此外,本发明特征还有多核苷酸序列,这些序列在严格条件下与SEQ ID NO:2杂交并且其反义序列与SEQ ID NO:2具有85%、90%、95%、97%、98%、或99%的同一性。杂交条件基于该核酸结合复合体或探针的解链温度(Tm),如在Wahl,G.M.(沃尔)与S.L.Berger(伯杰)(1987;MethodsEnzymol.(《酶学方法》)152:399-407)以及Kimmel,A.R.(基梅尔)(1987;Methods Enzymol.(《酶学方法》)152:507-511)中所传授的,并且可以在限定的严格性下使用。
额外地,本发明考虑了编码多肽的核酸序列,寡核苷酸,肽核酸(PNA),其片段、部分或反义分子。
虽然编码TAGNPP1及其变体的核苷酸序列优选地能够在适当选择的严格条件下与TAGNPP1的核苷酸序列杂交,但是会有利地是生产编码用于实质上不同的密码子使用的TAGNPP1或其衍生物的核苷酸序列。可以根据该宿主利用的具体密码子的频率选择密码子,以增加具体原核或真核宿主中在此处发生肽表达的比率。用于实质上改变编码TAGNPP1及其衍生物的核苷酸序列而不改变所编码的氨基酸序列的其他原因包括具有更加希望的特性(如,更长的半衰期)的RNA转录本的产生。
本发明涵盖的、编码TAGNPP1的、改变的核酸序列包括不同核苷酸的缺失、插入或置换,生成编码与TAGNPP1相同或功能上等效的多肽。所编码的蛋白还可以包含氨基酸残基的缺失、插入或置换,这产生沉默改变或生成功能上等效的TAGNPP1。在这些残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性、和/或两亲性类似的基础上,可以进行有意的氨基酸置换,只要保留TAGNPP1的生物活性。例如,带正电荷的氨基酸残基包括Lys和Arg;带负电荷的氨基酸残基包括Asp和Glu;并且具有类似亲水性、携带不带电的极性头基团的氨基酸可以包括Leu、Ile、与Val;Gly与Ala;Asp与Gln;Ser与Thr;Phe与Tyr。
表达载体
可以使用本领域普通技术人员熟知的方法来构建包含编码TAGNPP1的序列以及适当的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术、以及体内遗传重组。此类技术描述于,例如,Sambrook,J.(萨姆布鲁克)等人,(1989)Molecular Cloning,A LaboratoryManual(《分子克隆:实验室手册》),Cold Spring Harbor Press(冷泉港出版社),Plainview(普莱恩维尤),纽约州,以及Ausubel,F.M.(奥苏贝尔)等人,(1989)Current Protocols in Molecular Biology(《分子生物学当前技术》),John Wiley&Sons(约翰威利父子出版社),纽约州,纽约市,将这些传授内容通过引用以其整体结合在此。
各种表达载体/宿主系统可被利用以包含并表达编码TAGNPP1的序列。这些包括但不局限于,微生物,例如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌;用酵母表达载体转化的酵母;用病毒表达载体(例如,杆状病毒)或用细菌表达载体(例如,Ti或pBR322质粒)感染的昆虫细胞系统;或动物细胞系统(例如,pTT22载体)。
这些控制元件或调控序列可以包括载体增强子的那些非翻译区、启动子、5’和3’非翻译区-与宿主细胞蛋白相互作用从而执行转录和翻译。此类元件的强度和特异性可以改变。取决于载体系统和所用的宿主,可以使用任何数量的适合的转录和翻译元件,包括,组织特异性启动子、组成型启动子以及诱导型启动子。例如,当在细菌系统中进行克隆时,可以使用诱导型启动子,例如BluescriptTM质粒(Stratagene公司,加利福尼亚州,拉荷亚(LaJolla))的杂交lacZ启动子或pSport1TM质粒(Gibco BRL公司)等。在哺乳动物细胞系统中,优选地是来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。如果需要产生包含多拷贝的编码TAGNPP1的序列的细胞系,可以使用具有适当的选择性标记的、基于SV40或EBV的载体。当使用禽类表达系统时,用于表达不同TAGNPP1构建体的适合的载体描述于美国专利号6,730,822;美国专利号6,825,396;美国专利号6,875,588;美国专利号7,294,507;美国专利号7,521,591;美国专利号7,534,929;以及美国专利申请系列号11/376,023,将全部传授内容通过引用以其整体结合在此。简言之,当采用禽类表达系统表达TAGNPP1时,考虑了适合的输卵管-特异性启动子,例如且非出于限制地,类卵黏蛋白启动子、卵白蛋白启动子、溶菌酶启动子、伴清蛋白启动子、卵黏蛋白启动子、卵传铁蛋白启动子以及这些启动子各自的功能性部分。适合的非特异性启动子可以包括,例如且非出于限制,巨细胞病毒(CMV)启动子、MDOT启动子以及劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、鼠白血病病毒(MLV)启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子以及SV40启动子以及这些启动子各自的功能性部分。可用于本发明的其他启动子的非限制性实例包括但不局限于,Pol III启动子(例如,1型、2型和3型Pol III启动子),如H1启动子、U6启动子、tRNA启动子、RNase MPR启动子以及这些启动子各自的功能性部分。典型地,根据所采用的启动子选择用于本发明的功能性终止子序列。
宿主细胞
本发明包括如在本领域中熟知(例如,在美国专利号7,534,929中,将该披露通过引用以其整体结合在此)的转基因禽类(例如,转基因鸡)系统中生产可溶性TAGNPP1。在具有或不具有至靶向部分的NPP1组分(例如,ssNPP1、sNPP1、TAGsNPP1以及TAGssNPP1)的禽类系统中(例如,在禽类输卵管中)的生产在本发明范围内。此外,在此考虑了在任何有用的蛋白表达系统以及植物系统中(包括浮萍(duck weed))中生产TAGNPP1,这些蛋白表达系统包括但不局限于,转基因禽类、转基因哺乳动物、细胞培养系(例如,CHO细胞、HEK293细胞以及COS细胞)、细菌(例如大肠杆菌(E.coli))、转基因动物,例如哺乳动物和禽类(例如,鸡、鹌鹑、鸭和火鸡)。
可以因其具有调节插入序列的表达或以所希望的方式加工所表达的TAGNPP1s能力而选择宿主细胞株。TAGNNP1多肽的此类修饰包括但不局限于,乙酰化、羧化、唾液酸化、糖基化、磷酸化、脂化、以及酰化。可以选择具有用于此类翻译后活性的特定细胞机械和特征机制的、不同的宿主细胞,例如CHO、COS、HeLa、MDCK、HEK293、以及W138,来确保本发明融合蛋白的正确修饰和加工。还考虑将禽类肿瘤细胞系作为用于表达本发明多肽的宿主细胞。可以用于本发明的有用禽类细胞系(例如,禽类输卵管肿瘤细胞系)的实例描述于美国专利公开号No.2009/0253176中,将全部传授内容通过引用结合在此。
TAGNPP1的生产
可以使用多种熟知技术中的任一种来生产TAGNPP1。由如上所述DNA序列编码的TAGNPP1可以使用在此描述的或本领域普通技术人员熟知的多种表达载体中的任一种,从这些DNA序列容易地制备。可以在任何适当的宿主细胞中实现表达,该宿主细胞已经用包含编码本发明重组多肽的DNA分子的表达载体转化或转染。首先可以将来自分泌重组融合蛋白或多肽到培养基中的、适合的宿主/载体系统的上清液,使用可商购的过滤器浓缩。浓缩后,可以将浓缩物施加到适合的纯化基质(例如亲和性基质或离子交换树脂)上。可以采用一个或多个反相HPLC步骤来进一步纯化重组多肽。
对于重组蛋白的高产率生产,优选地是稳定表达。可以使用在相同或分离的载体上包含病毒复制起点和/或内源性表达元件和/或选择性标记基因的表达载体转化稳定表达TAGNPP1的细胞系。导入载体后,在转换到选择性培养基中之前,可以允许细胞在富集培养基中生长1-2天。选择性标记的目的是赋予选择抗性,并且它的存在允许成功表达所导入序列的细胞生长和恢复。可以使用适合于该细胞类型的组织培养技术使稳定转化的细胞的抗性克隆增殖。在哺乳动物细胞系中生产外源蛋白的方法在本领域中是熟知的。本发明的、用于在禽类细胞中生产异源多肽(例如,TAGNPP1融合蛋白)的这个或其他方面和实施例的示例性实例完全披露于美国专利申请系列号09/877,374,2001年6月8日提交、2002年8月8日公开为U.S.2002/0108132-A1;以及2002年9月18日提交的美国专利申请系列号10/251,364中,将它们各自通过引用以其整体结合在此。在禽类肿瘤细胞系中生产外源蛋白的实例还披露于美国专利公开号2009/0253176中,将全部传授内容通过引用以其整体结合在此。
本发明确切考虑了在此披露的TAGNPP1蛋白在转基因禽类系统中的生产。在一个特别有用的实施例中,本发明被引至根据本发明,可以在转基因禽类(例如鸡)的输卵管中生产的TAGNPP1的生产。在转基因禽类表达系统中生产外源蛋白的实例还披露于美国专利号6,730,822中,将全部传授内容通过引用以其整体结合在此。简言之,将上文描述的适合的禽类载体导入鸡X期胚细胞中,该载体包含编码TAGNPP1融合蛋白的核酸序列,可操作地连接到组织特异性或组成型启动子上,该启动子在鸡输卵管中驱动该编码序列的表达。在有助于孵化活的小鸡的条件下孵育所转化的胚细胞。将活小鸡养育为成熟嵌合体鸡,使该嵌合体鸡与非转基因鸡自然交配或经由人工受精进行交配。通过针对蛋白编码序列的种系合并来筛选后代而识别转基因鸡。可以将该转基因后代与另一转基因或非转基因鸡进行交配以生产包含该TAGNPP1融合蛋白的鸡蛋。然后通过本领域中熟知的方法分离并纯化TAGNPP1。因此,本发明提供了已经由转基因禽类生产的重组TAGNPP1融合蛋白。
药物组合物
本发明特征还有包括分离的且实质上纯净的TAGNPP1的药物组合物或其药学上可接受的盐。本发明的药物组合物还可以包括用于其的药学上可接受的载体或赋形剂(expient)。通过熟知的常规方法(参见,例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿制药科学》),第14版,MackPublishing Co.(马克出版有限公司),Easton,Pa.(宾夕法尼亚州,伊斯顿))配制包括此类载体的组合物,包括复合分子,将全部传授内容通过引用结合在此。该载体可以包括稀释剂。在一个实施例中,该药物载体可以是液体并且该融合蛋白可能处于溶液的形式。该药物载体可以是蜡、脂肪或醇。在另一个实施例中,该药学上可接受的载体可以是处于粉末、冻干粉或片剂形式的固体。在一个实施例中,该载体可以包括脂质体或微囊剂。
该药物组合物可以处于无菌冻干粉的形式,用于与稀释剂重建后注射。该稀释剂可以是用于注射的水、用于注射的抑菌水或无菌盐水。可以通过冻干该融合蛋白的溶液生产处于干型的蛋白,来生产该冻干粉。如在本领域中已知,冻干蛋白通常比该蛋白的液体溶液具有增加的稳定性以及更长的保质期。
定义:
如在此使用的,关于在此使用的配制品、组合物或成分,术语“可接受的”意指对进行治疗的受试者的总体健康状况没有持续的不利影响。
如在此使用的,术语“给予(administration或administering)”是指向需要治疗的受试者提供本发明的融合蛋白。
如在此使用,“变更”包括编码TAGNPP1的多核苷酸序列的任意变更,包括可以使用杂交试验检测出的缺失、插入、和点突变。
在此使用的术语“动物”包括所有脊椎动物,包括禽类与哺乳类,例如大鼠、小鼠和人。还包括在所有发育阶段的个体动物,包括胚期和胎期。
在此列举的“氨基酸序列”是指融合蛋白分子的氨基酸序列,“氨基酸序列”以及类似术语,例如“多肽”或“蛋白”并非意在限制该氨基酸序列为与所列举的蛋白或多肽分子相关的完整的氨基酸序列。
在此使用的术语“禽类”是指分类学纲ava的有机体的任何种、亚种或品系,例如,但不局限于此类有机体,如鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦以及平胸鸟包括鸵鸟、鸸鹋以及鹤鸵。该术语包括原鸡(Gallus gallus)或鸡(chicken)的不同已知品系(例如,白来杭鸡(WhiteLeghorn)、棕色来杭鸡(Brown Leghorn)、条纹岩鸡(Barred-Rock)、苏塞克斯鸡(Sussex)、新罕布什尔鸡(New Hampshire)、罗德岛鸡(RhodeIsland)、Ausstralorp、米诺卡鸡(Minorca)、Amrox、加利福尼亚灰鸡(California Gray)、意大利彩鹧鸪(Italian Partridge-colored)),连同火鸡、雉、鹌鹑、鸭、鸵鸟以及通常以商业数量繁殖的其他家禽。
如在基于或衍生自具体反转录病毒或基于具体反转录病毒的核苷酸序列的反转录病毒载体中的短语“基于”或“衍生自”意思是,该反转录病毒载体的基因组包含该具体反转录病毒基因组的核苷酸序列的一个实质部分。该实质部分可以是一个具体的基因或核苷酸序列(例如编码gag、pol和/或env蛋白的核苷酸序列)或该病毒基因组的其他结构性或功能性核苷酸序列(例如编码LTR的序列),或者可以是基本上完整的反转录病毒基因组,例如,该反转录病毒基因组的大部分(例如,超过60%或超过70%或超过80%或超过90%)或全部,对于本领域普通技术人员的知识而言,这在本说明书背景中将是明显的。基于或衍生自反转录病毒的反转录病毒载体的实例是基于ALV反转录病毒的NL反转录病毒载体(例如,NLB),如在Cosset(珂赛特)等人,Journal of Virology(《病毒学杂志》)(1991)vol65,p3388-3394中披露的。
如在此使用的,术语“生物活性的”是指具有天然发生的NPP1蛋白的焦磷酸酶/磷酸二酯酶的结构、调控或生化功能的融合蛋白。
如在此使用的,术语“构建体”是指线性或环状核苷酸序列,例如已经由超过一个的、已经分离自天然来源或已经化学合成的核苷酸序列区段装配的DNA或其组合。
如在此使用的,术语“互补的”是指彼此可以形成特异性相互作用的两个核酸分子。在这些特异性相互作用中,当这两条核酸链极性相反时,一条核酸链中的腺嘌呤碱基可以与第二条核酸链中的胸腺嘧啶形成两个氢键。同样地,在这些特异性相互作用中,当这两条核酸链极性相反时,一条核酸链中的鸟嘌呤碱基可以与第二条核酸链中的胞嘧啶形成三个氢键。如在此提及,互补的核酸可以进一步包含经修饰的碱基,其中经修饰的腺嘌呤可以与胸腺嘧啶或经修饰的胸腺嘧啶形成氢键,并且经修饰的胞嘧啶可以与鸟嘌呤或经修饰的鸟嘌呤形成氢键。
如在此使用,“缺失”是指氨基酸亦或核苷酸序列中的变化,其中各自地一个或多个氨基酸或核苷酸残基缺乏。
如在此使用,术语“表达的”或“表达”是指从基因转录以给出至少部分地与该基因的两条核酸链之一的区域互补的RNA核酸分子。如在此使用,术语“表达的”或“表达”还指RNA的翻译以产生蛋白或肽。
如在此使用的,术语“表达载体”是指包括基因表达控制区(例如启动子或启动子组件)的核酸载体,该载体可操作地连接到编码至少一个多肽的核苷酸序列上。
如在此使用且互换使用,“功能部分”或“功能片段”是指整体或部分能够执行整体功能的一个整体的一个部分或片段。例如,一个分子的生物学功能部分意指执行该整体或完整分子的生物学功能的该分子的一部分。例如,基因表达控制区的一个功能部分是该指定基因表达控制区的一个片段或部分,该基因表达控制区整体或部分在一个生物系统中调控或控制基因表达(例如,整体或部分地促进)(例如,启动子)。功能部分可以是任何有用的大小。
如在此使用,术语“基因表达控制区”是指与编码序列相关联的核苷酸序列,并且整体或部分地调控该编码序列的表达,例如,整体或部分地调控该编码序列的转录。基因表达控制区可以分离自天然发生的来源或可以是化学合成的并且可以被合并到核酸载体中从而使能够在适当的细胞中调控转录。该“基因表达控制区”可以在该核酸序列的区域之前,但不局限于该区域之前,位于可以转录为mRNA的编码序列的5’末端区域中。
术语“异源的”、“外源的”以及“外来的”在此可互换地使用,并且一般是指在某种有机体中或在某种细胞、组织或包含在有机体中或有机体生产的其他组分中正常未发现的生物分子,例如核酸或蛋白。例如,蛋的异源或外源的蛋白是指在该蛋中一般未发现的蛋白。如在此使用的,关于核酸,例如DNA和RNA,术语“异源的”、“外源的”以及“外来的”可互换地使用,并且是指不作为它存在于其中的、天然发生的染色体、基因组或细胞的一部分的核酸,或发现于与自然发生的一个或多个位置不同的这个或这些位置中的和/或以与自然发生的量不同的量存在的核酸。它可以是该基因组、染色体或细胞的非内源性的并且已经被外源性地引入该基因组、染色体或细胞的核酸。异源DNA的实例包括但不局限于,包括基因表达控制区的DNA以及编码一种或多种产物(例如,RNA或蛋白产物)的DNA。异源DNA的实例包括但不局限于,曾经分离自禽类并且之后使用(例如,在重新导入禽类基因组中之后)的、在此披露的基因表达控制区或启动子。
如在此使用,术语“分离的核酸”覆盖,例如,(a)DNA,该DNA具有天然发生的基因组分子的一部分的序列,但侧翼不是插入它在其中自然发生的种的基因组中的该分子部分的侧翼的这些序列中的至少一个;(b)核酸,该核酸已经被合并到载体或原核生物或真核生物的基因组DNA中,以使得所得载体或基因组DNA与该核酸获得自其的天然发生的DNA不具有同一性的方式;(c)分离的分子,例如cDNA,基因组片段,由聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)或化学合成产生的片段,或限制性片断;(d)重组核苷酸序列,该序列是杂合基因(即,编码融合蛋白的基因)的一部分,以及(e)重组核苷酸序列,该序列是非天然发生的杂合序列的一部分。本发明的分离的核酸分子可以包括,例如,天然的等位基因变体连同由核苷酸缺失、插入、倒位或置换修饰的核酸分子。
如在此使用,“插入”或“添加”各自是指与TAGNPP1分子相比,一个或多个氨基酸或核苷酸残基的添加导致的氨基酸或核苷酸序列的变化。
如在此使用,术语“核酸”是指任何线性或顺序排列的核苷酸和核苷,例如,cDNA、基因组DNA、mRNA、tRNA、寡核苷酸、寡核苷及其衍生物。为了便于讨论,在此将非天然发生的核酸称作构建体。核酸可以包括细菌质粒载体,该细菌质粒载体包括表达、克隆、粘粒和转化载体,例如,动物病毒载体,例如但不局限于,经修饰的腺病毒、流行性感冒病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、反转录病毒像禽类造白细胞组织增生(ALV)病毒反转录病毒载体、鼠白血病病毒(MLV)反转录病毒载体,以及慢病毒载体等及其片段。此外,该核酸可以是的禽类造白细胞组织增生(ALV)病毒反转录病毒载体、鼠白血病病毒(MLV)反转录病毒载体,或慢病毒载体及其片段的LTR。核酸还可以包括NL载体,如NLB、NLD和NLA及其片段以及合成寡核苷酸,例如化学合成的DNA或RNA。核酸可以包括修饰的或衍生的核苷酸和核苷,例如但不局限于,卤化的核苷酸,例如但不仅是5-溴尿嘧啶,并且衍生的核苷酸例如生物素标记的核苷酸。
如在此使用,术语“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分,并且是指基因组或合成来源的DNA或RNA,该DNA或RNA可以是单链或双链的,并且表示正义或反义链。
术语“可操作地连接的”是指多个元件的安排,其中这样配置如此描述的这些组件,以执行它们的通常功能。可操作地连接到编码序列上的基因表达控制区或启动子(例如,启动子组件)能够影响该编码序列的表达。这些控制序列无需与该编码序列邻接,只要它们行使引导其表达的功能。因此,例如,插入的已转录但未翻译的序列可以存在于启动子序列与该编码序列之间,并且该启动子序列仍可被视为是与该编码序列“可操作地连接的”。
如在此使用,术语“输卵管特异性启动子”是指具有功能的启动子和启动子组件,即,在很大程度上,例如,在鸟类的输卵管细胞中主要地(即,在该动物中由具体启动子类型生产的转录产物的超过50%生产于输卵管细胞中)或专有地提供编码序列的转录。有用的输卵管特异性启动子的实例包括但不局限于,卵白蛋白启动子、类卵黏蛋白启动子、卵抑制剂启动子、溶菌酶启动子以及卵传铁蛋白启动子以及这些启动子的功能性部分,例如,启动子组件。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核苷酸序列”以及“核酸”在此可以互换地使用,并且包括但不局限于,编码序列,即,放置在适当的调控或控制序列控制下时,在体外或体内转录并翻译为多肽的一个或多个多核苷酸或一个或多个核酸序列;控制序列,例如,翻译起始和终止密码子、启动子序列、核糖体结合部位、多聚腺苷酸化信号、转录因子结合位点、转录终止序列、上游和下游调控域、增强子、沉默子、一个或多个转录因子结合到其上并正向地(诱导)亦或负向地(抑制)改变基因的启动子活性的DNA序列等。在此描述的这些术语对长度或合成起点未提出限制。
如在此使用的,术语“多肽”和“蛋白”可以互换地使用,并且是指通过肽键连接的连续排列中的三个或更多个氨基酸的氨基酸多聚体。术语“多肽”包括蛋白,例如融合蛋白、蛋白片段、蛋白类似物、低聚肽等。术语“多肽”包括如上文定义的、由核酸编码的、通过重组技术(例如,自转基因鸟中分离)生产的、或化学合成的多肽。
如在此使用,术语“启动子”是指在禽类细胞中对由RNA聚合酶转录起始的起始有用的DNA序列。“启动子组件”是自身或与其他DNA序列组合可以影响或促进转录的DNA序列。特异性启动子组件,如卵白蛋白启动子组件、类卵黏蛋白启动子组件和溶菌酶启动子组件以及在此披露和要求的其他启动子和启动子组件未说明特异性启动子序列。相反地,它们涵盖对影响或促进编码序列转录有用的对应启动子的任何序列或序列片段。例如,类卵黏蛋白启动子组件包括但不局限于约1.8kb、约3.9kb以及约10kb的类卵黏蛋白启动子,披露于2007年5月17日公开的美国申请号11/649,543中,将其通过引用以其整体结合在此。“启动子组件”还可以涵盖功能是起始RNA转录的重排的基因表达控制区,以及由天然发生的DNA序列和/或合成的DNA序列组成的、其功能是起始RNA转录的杂合DNA分子。
如在此使用,术语“重组核酸”和“重组DNA”是指非天然发现于真核或原核细胞中的至少两个核酸序列的组合。这些核酸序列可以包括但不局限于,核酸载体、基因表达调控元件、复制起点、适合的基因序列(当表达时赋予抗生素抗性)、蛋白编码序列等。术语“重组多肽”或“重组蛋白”意在包括由重组DNA技术生产的多肽,使得其与天然发生的多肽在位置、纯度亦或结构上不同。通常,这样一种重组多肽将以不同于自然中正常观察到的量存在于细胞中。
如在此使用,术语“严格条件”是发生在从约Tm-5℃(低于探针的解链温度(Tm)5℃)至约低于Tm20℃至25℃范围内的“严格性”。本领域普通技术人员将理解,可以改变杂合的严格性以识别或检测相同或相关的多核苷酸序列。
如在此使用的,术语“受试者”或“患者”涵盖哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不局限于,人类、黑猩猩、猿猴、牛、马、绵羊、山羊、猪;兔、狗、猫、大鼠、小鼠、豚鼠、等。非哺乳动物的实例包括但不局限于,鸟、鱼等。
如在此使用,“置换”是指一个或多个氨基酸或核苷酸各自由不同的氨基酸或核苷酸替代。
如在此使用,术语“治疗有效量”是指与相应的未接受这样量的受试者相比,导致疾病、紊乱或副作用的改进的治疗、治愈、预防或改善或疾病或紊乱进展速率的降低的任何化合物量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理机能的量。
如在此使用的,术语“TAGNPP1”、“融合蛋白”、“TAGNPP1多肽”以及“与靶向部分融合的NPP1组分”可互换地使用。
如在此使用的,术语“治疗(treat或treating或treatment)”是指预防上和/或治疗上缓解、消除或改善疾病或病症症状,预防额外的症状,改善或预防潜在症状的发生,抑制该疾病或病症,阻止该疾病或病症的发展,减轻该疾病或病症,产生该疾病或病症的退化,减轻由该疾病或病症引起的状况,或终止该疾病或病症的症状的方法。
如在此使用,术语TAGNPP1的“变体”是指一个或多个氨基酸改变的氨基酸序列。优选地,变体包含保守性置换。“保守性置换”是其中一个氨基酸被具有类似特性的另一个氨基酸置换的一种置换,以、使得肽化学领域的普通技术人员预期该多肽的二级结构和亲水性质基本上未改变。在这些残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或两亲性相似的基础上一般可以进行氨基酸置换。例如,带负电荷的氨基酸包括Asp和Glu;带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸;并且具有类似亲水性值、携带不带电的极性头基团的氨基酸包括Leu、Ile、与Val;Gly与Ala;Asp与Gln;以及Ser、Thr、Phe与Tyr。可以表示保守性变化的氨基酸的其他基团包括:Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr;(2)Cys、Ser、Tyr、Thr;(3)Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe;(4)Lys、Arg、His;以及(5)Phe、Tyr、Trp、His。变体还包含或可替代地包含非保守变化。在一个优选的实施例中,变体多肽不同于五个或更少氨基酸置换、缺失或添加的,或通过,例如,用Trp替代Gly的天然序列。变体还可以(或可替代地)通过,例如,对NPP1组分的免疫原性、二级结构和亲水性质具有最低限度影响的氨基酸的缺失或添加进行修饰。可以使用本领域中熟知的计算机程序发现确定哪些氨基酸残基可以被置换、插入或缺失而不消除生物或免疫活性的指导。
如在此使用,术语“载体”或“核酸载体”是指可以被转染或转化到细胞中并且单独、或在该宿主细胞基因组中复制的天然或合成的单链或双链的质粒或病毒核酸分子。基于该载体的核苷酸序列,通过用适当的限制性内切酶可以使环状双链载体线性化。通过用限制性内切酶切断该载体并且将希望的断片连接在一起可以将核酸插入到载体中。
如在此使用,关于融合蛋白,术语“部分”是指该蛋白的片段。这些片段大小的范围可以为从四个氨基酸残基至减去一个氨基酸的整个氨基酸序列。因此,“包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的至少一部分”的一个部分涵盖全长的TAGNPP1及其片段。
如在此使用,术语“转化”或“转染”描述的是通过其使用本领域中熟知的不同方法,使得外源DNA进入并且改变受体细胞的一个程序。转化可以依赖于用于将外来核酸序列插入到原核或真核宿主细胞中的任何已知方法。基于进行转化的宿主细胞选择该方法,并且该方法可以包括但不局限于,电穿孔、粒子轰击、病毒感染、以及脂转染。此类“转化的”细胞包括稳定转化的细胞,其中这一插入的DNA能够作为自主复制质粒亦或作为宿主染色体的一部分进行复制。它们还包括瞬时表达这一插入的DNA或RNA持续有限的时段的细胞。
实例
本发明通过以下实例进一步示例。这些实例仅出于说明性的目的并且无意、也不应当被解读为以任何方式对本发明进行限制。
实例I
使用EcoRI和HindIII位点,将包含具有八个连续天冬氨酸的、与sNPP1融合的靶向部分的TAGsNNP1构建体连接到pTT22载体中(pTT22-sNPP1.D8;图19)。将pTT22-sNPP1.D8转染到HEK203E细胞中并且培养转染体以表达TAGsNNP1。将TAGsNNP1从培养基中分离出并且如在本领域中所熟知的进行部分纯化。纯化后,针对其水解胸腺嘧啶5’单磷酸酯p-硝基苯酯的能力,测量TAGsNPP1的焦磷酸酯/磷酸二酯酶活性。简言之,将TAGsNPP1在50mM Tris、250mM NaCl、pH9.5中稀释为1ng/μL。在一个包含50μL的1ng/μL TAGsNPP1的板中,添加50μL的10mM胸腺嘧啶5’单磷酸酯p-硝基苯酯(SigmaTM,目录号#T4510)底物。在动力学模型中,于405nm(吸光度)下测量TAGsNPP1的酶活性,持续5分钟。如在图21中所示,检出的TAGsNPP1的活性高于在不含TAGsNPP1的对照中观察到的水平。具体而言,生产自HEK203D6的TAGsNPP1展示出了最高水平的酶活性。该结果强烈地提示,与靶向部分(即,D8)融合的截短NPP1充分维持了其作为核酸酶的正常功能。
实例II
这个非限制性预先的实例描述了如何通过给予包括TAGNPP1融合蛋白的配制品来治疗特发性婴儿动脉钙化。
临床医生使用诊断性试验来证实患者在动脉中具有高水平的钙化。还可以针对NPP1缺陷进行遗传试验,如在Rutsch(如特斯彻)等人,(2003)Nature Genetics(《自然遗传学》)34:379-81中描述。
虽然在某些情况下采用真皮内、肌内或口服给予,但是本发明的药物组合物优选地由静脉内给予。
临床医生确定可以取决于患者的性别、年龄、健康状况和体重而变化的剂量。适当剂量或给予途径的确定很好地在普通医师的技术之内。
可以在约10mg/kg至约1000mg/kg每周地每周一次地输注包含TAGNPP1的配制品。一次可以给予10-30mg/kg。在输注过程中,密切监护患者并且在不良事件中采取适当的临床干预。治疗持续至少1个月或该患者的一生。每次输注可以允许48小时的窗口。输注时间表减少或消除了不良事件,在该表中,输注速率随着时间增加。可以根据以下时间表给予对婴儿的输注:5-10cc/hr,每次间隔60分钟。
一方面,当希望连续静脉内给予时,缓释系统的典型实例包括可以持续释放1-100mg/kg的有效的TAGNPP1蛋白,持续超过1天。
实例III
可溶性TAGsNPP1-D8的纯化
从HEK293条件培养基中纯化TAGsNPP1(C-端标记D8)的可溶性形式(参见,SEQ ID NO:20以及图26)。将该条件培养基(500ml)平衡至羟基磷灰石(HA)-缓冲液A(10mM Na3PO4,pH6.8)中,并且用0.2μmSartobran P Size8MidiCap过滤器(Sartorius Stedim(赛多利斯公司))进行过滤。在以3ml/min的速率装入过滤的条件培养液之前,将20mlHA-Ultrogel柱((Pall Life Sciences)颇尔生命科学公司)用5倍柱体积(CV)的缓冲液A进行平衡。将该柱用缓冲液A洗涤达UV基线。使用2.5CV的每一HA-缓冲液B(150mM Na3PO4,pH6.8)、HA-缓冲液C(250mMNa3PO4,pH6.8)、以及HA-缓冲液D(500mM Na3PO4,pH6.8)分段洗脱该蛋白,同时收集5ml的部分(fraction)。合并来自HA-柱的活性部分(50ml),并且平衡至WGA-缓冲液A(20mM Tris,pH8.0,150mM NaCl,0.7%CHAPS)。过滤后,将6-7mg的总蛋白(15-18ml)装入1ml麦胚凝集素(WGA)重力柱(EMD Chemicals公司)中,该柱已经用5CV的WGA-缓冲液A平衡。将该柱用7CV的WGA-缓冲液A洗涤,并且然后将该蛋白用5x1ml WGA-缓冲液B(20mM Tris,pH8.0,150mM NaCl,500mMN-乙酰葡糖胺,0.7%CHAPS缓冲液)进行洗脱。在收集1ml部分前,允许将该WGA-缓冲液B用管柱在室温下孵育10分钟。重复该程序直到全部起始材料已经通过WGA-柱纯化(总计运行4次)。合并这些活性部分(29ml)并且使用100,000截留分子量(MWCO)Vivaspin-15(赛多利斯公司)、同时缓冲液更换至PBS中将其浓缩至1.2ml。
基于HPLC,将活性sNPP1-D8(TAGsNPP1)纯化至91.5%。当通过SDS-PAGE对最终的合并物进行分析时,在非还原条件下有一个对应于约210kD的二聚体条带,并且在还原条件下有一个对应于约105kD的单体条带。
实例IV
将人主动脉平滑肌细胞以1x104细胞每孔装到48孔板中,并且在标准条件下保持在杜氏改良培养基(DMEM)中。2天之后,各自用3.8mM与50uM的NaPO4与ATP增补DMEM。以1ug/ml增补sNPP1(WT;图9),具有与C-端融合的八个连续天冬氨酸残基(D8)的TAGsNPP1(图26)以及sNPP1-Fc(图29)。每隔一天将培养基用相同培养基进行替代。5天后,将培养基从该培养系中去除并且用100ul的0.6N HCl替代并且在室温下孵育16-20小时,将磷酸钙溶解到该溶液中。然后通过钙-甲酚酞比色反应,使用来自于Cayman Chemical Company,Ann Arbor,MI(卡曼化学品公司,密歇根州,安阿伯)的钙测定试剂盒(#700550)对钙水平进行定量。
如在图23中所示,TAGsNPP1证明了与sNPP1(WT)相比对钙化的增加的抑制,提示包含在TAGsNPP1中的D8结构域提供了对钙化部位的增加的寻靶能力和/或增强的抑制效果。
实例V
sNPP1-Fc的酶活性测定
1ug sNPP1-Fc(图29)的添加基于70%的纯度(即,在该测定中使用了约1.1μg的sNPP1-Fc)。HPLC尺寸排阻柱(SEC)表明sNPP1-Fc是约78%纯的。在预期大小(约250kD)处非还原性凝胶示出一种二聚体。当用DTT进行处理时,该二聚体条带被还原为预期的单体大小(约125kD)。蛋白印迹分析确认该二聚体和单体条带。用PNGase F处理该sNPP1-Fc样品将该单体条带从约125kD还原为约100kD,这是所预期的、被认为是包含12N-聚糖位点的sNPP1-Fc的分子量。在78%纯度,获得的最终定量约0.808mg sNPP1-Fc(2.2μg/ml条件培养基)。如本领域中已知的确定sNPP1-Fc的酶活性。
表1.sNPP1-Fc的酶活性
样品 |
OD405 |
终OD405 |
Neg.Cntrl(非-NPPl蛋白) |
0.053 |
0.000 |
lug Wt sNPPl(可溶性sNPPl) |
0.296 |
0.243 |
lug NPPl-Fc(c-端) |
0.397 |
0.344 |
* * *
上文说明书中以解释本发明而非限制本发明的方式提供了每个实例。事实上,对本领域的普通技术人员而言将明显地是可以对本发明进行多种修改、组合、添加、删除和变更而不偏离本发明的范围或精神。例如,作为一个实施例的一部分说明或描述的特性可以用于另一个实施例以获得仍另一个实施例。本发明意在覆盖此类修改、组合、添加、删除和变更。
在此引用的所有出版物、专利、专利申请、互联网网站、以及检索号/数据库序列(包括多核苷酸和多肽序列)出于所有的目的以其整体通过引用由此合并,与就像每个单独的出版物、专利、专利申请、互联网网站、或检索号/数据库序列确切地和单独表示为通过引用这样合并的程度相同。