JP3287869B2 - ヒト神経成長因子２の製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト神経成長因子２
(以下、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３と略称することもあ
る。)製造のための組換えＤＮＡ技術に関する。
(以下、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３と略称することもあ
る。)製造のための組換えＤＮＡ技術に関する。
【０００２】
【従来の技術および課題】神経栄養因子群は、神経成長
因子(nerve growth factor，ＮＧＦ)がレヴィーモンタ
ルチーニ(Levi−Monntalcini)［アニュアル ニューヨ
ーク アカデミーオブ サイエンス(Anu. N.Y. Acad. S
ci)５５，３３０(１９５２))およびコーエン(Cohen)ら
(Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ４０，１０１４(１
９５４))によって見出されて以来、多数の因子が見い出
されている。これらの因子は、神経細胞の分化、成熟、
生存、機能維持、増殖などの多様な機能を担っているも
のと考えられている。これらの因子は具体的には、先に
上げたＮＧＦ以外に、脳由来神経栄養因子(brain deviv
ed neurotrophic factor ＢＤＮＦ，Barde Ｙ−Ａ，et
al ＥＭＢＯ J. １５４９−５５３(１９８２))，毛様
体神経栄養因子(ciliary neurotrophic factor；ＣＮＴ
Ｆ，Watters. D. et al J. Neurochem ４９７０５−７
１３，(１９８７)などがある。また、線維芽細胞増殖因
子(fibroblast growth factors；ＦＧＦＳ)，上皮細胞
成長因子(epidermal growth factor；ＥＧＦ)，インス
リン様成長因子(insulin likegrowth factor；ＩＧ
Ｆ)，インタロイキン６(interleukin６；ＩＬ−６)など
にも神経栄養活性のあることが認められている。ＮＧＦ
遺伝子と高い塩基配列相同性を保っている因子として、
改正ら(ヨーロッパ特許出願公開第３８６,７５２号公
報，ＦＥＢＳ Letters，２６６，１８７−１９１(１９
９０))によって、ヒト神経成長因子２が見い出された。
これと同じ因子が、Hohn ら，Nature，３４４，３９９
(１９９０)などの文献に発表されている。該ヒト神経成
長因子２を、本明細書においては、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ
−３と略称することもある。ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３
は、その作用機作、組織になお不明の部分が多く残され
ているものの少くとも以下のことがわかっている。すな
わち、ヒト(１)ＮＧＦ２／ＮＴ−３遺伝子は脳中の海
馬，小脳に強く発現している。(２)成熟動物(ラット)よ
りも新生仔の方が発現が強い。(３)ＮＧＦ，ＢＤＮＦが
作用を示さないか弱い作用を示すような神経細胞(例え
ば nodose ganglion 由来神経細胞)に作用を示す。これ
らのことから、ＮＧＦ２／ＮＴ−３は神経系の発達時に
重要な働きをしていると考えられる。
因子(nerve growth factor，ＮＧＦ)がレヴィーモンタ
ルチーニ(Levi−Monntalcini)［アニュアル ニューヨ
ーク アカデミーオブ サイエンス(Anu. N.Y. Acad. S
ci)５５，３３０(１９５２))およびコーエン(Cohen)ら
(Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ４０，１０１４(１
９５４))によって見出されて以来、多数の因子が見い出
されている。これらの因子は、神経細胞の分化、成熟、
生存、機能維持、増殖などの多様な機能を担っているも
のと考えられている。これらの因子は具体的には、先に
上げたＮＧＦ以外に、脳由来神経栄養因子(brain deviv
ed neurotrophic factor ＢＤＮＦ，Barde Ｙ−Ａ，et
al ＥＭＢＯ J. １５４９−５５３(１９８２))，毛様
体神経栄養因子(ciliary neurotrophic factor；ＣＮＴ
Ｆ，Watters. D. et al J. Neurochem ４９７０５−７
１３，(１９８７)などがある。また、線維芽細胞増殖因
子(fibroblast growth factors；ＦＧＦＳ)，上皮細胞
成長因子(epidermal growth factor；ＥＧＦ)，インス
リン様成長因子(insulin likegrowth factor；ＩＧ
Ｆ)，インタロイキン６(interleukin６；ＩＬ−６)など
にも神経栄養活性のあることが認められている。ＮＧＦ
遺伝子と高い塩基配列相同性を保っている因子として、
改正ら(ヨーロッパ特許出願公開第３８６,７５２号公
報，ＦＥＢＳ Letters，２６６，１８７−１９１(１９
９０))によって、ヒト神経成長因子２が見い出された。
これと同じ因子が、Hohn ら，Nature，３４４，３９９
(１９９０)などの文献に発表されている。該ヒト神経成
長因子２を、本明細書においては、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ
−３と略称することもある。ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３
は、その作用機作、組織になお不明の部分が多く残され
ているものの少くとも以下のことがわかっている。すな
わち、ヒト(１)ＮＧＦ２／ＮＴ−３遺伝子は脳中の海
馬，小脳に強く発現している。(２)成熟動物(ラット)よ
りも新生仔の方が発現が強い。(３)ＮＧＦ，ＢＤＮＦが
作用を示さないか弱い作用を示すような神経細胞(例え
ば nodose ganglion 由来神経細胞)に作用を示す。これ
らのことから、ＮＧＦ２／ＮＴ−３は神経系の発達時に
重要な働きをしていると考えられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】このようなＮＧＦ２／
ＮＴ−３を大量に製造することができれば、生理活性の
解明や、工業化に途をひらくことができる。
ＮＴ−３を大量に製造することができれば、生理活性の
解明や、工業化に途をひらくことができる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の事
情に鑑み、鋭意研究したところ、神経成長因子のプロ領
域をコードするＤＮＡをヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３をコー
ドするＤＮＡの５′末端側に有するように構築したベク
ターにより、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３を安定にしかも大
量発現させうることを見い出し、これに基づいてさらに
研究した結果、本発明を完成した。本発明は、(１）、
ヒト神経成長因子２をコードするＤＮＡの５′末端に神
経成長因子のプロ領域をコードするＤＮＡを有するＤＮ
Ａを含む組換えベクター，(２)、上記(１)記載のベクタ
ーで形質転換された形質転換体，および(３)、上記２記
載の形質転換体を培地に培養することを特徴とするヒト
神経成長因子２の製造法である。本発明で得られる組換
え型ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３は、図９〜図１０のmature
と示されたアミノ酸残基数１１９個からなるもの、ある
いは、それにＮ末端にメチオニンが付加したものであっ
てもよい。また、該ＮＧＦ２／ＮＴ−３は、Ｎ末端から
１〜５残基が欠損したムテインであってもよい。ムテイ
ンの場合、さらに好ましくは、Ｎ末端から５残基欠失
し、アミノ酸残基数１１４個からなる分子が挙げられ
る。
情に鑑み、鋭意研究したところ、神経成長因子のプロ領
域をコードするＤＮＡをヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３をコー
ドするＤＮＡの５′末端側に有するように構築したベク
ターにより、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３を安定にしかも大
量発現させうることを見い出し、これに基づいてさらに
研究した結果、本発明を完成した。本発明は、(１）、
ヒト神経成長因子２をコードするＤＮＡの５′末端に神
経成長因子のプロ領域をコードするＤＮＡを有するＤＮ
Ａを含む組換えベクター，(２)、上記(１)記載のベクタ
ーで形質転換された形質転換体，および(３)、上記２記
載の形質転換体を培地に培養することを特徴とするヒト
神経成長因子２の製造法である。本発明で得られる組換
え型ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３は、図９〜図１０のmature
と示されたアミノ酸残基数１１９個からなるもの、ある
いは、それにＮ末端にメチオニンが付加したものであっ
てもよい。また、該ＮＧＦ２／ＮＴ−３は、Ｎ末端から
１〜５残基が欠損したムテインであってもよい。ムテイ
ンの場合、さらに好ましくは、Ｎ末端から５残基欠失
し、アミノ酸残基数１１４個からなる分子が挙げられ
る。
【０００５】本発明で用いられるヒトＮＧＦ２／ＮＴ−
３遺伝子としては、例えばヒトゲノムライブラリーから
クローニングによって得られたもの、ヒトcＤＮＡライ
ブラリーからクローニングによって得られたもの，ヒト
ゲノムＤＮＡ，mＲＮＡ，cＤＮＡからポリメラーゼチェ
ーンリアクション(ＰＣＲ)法によって得られたもの、ま
たは化学合成によって得られたものなどが挙げられる。
ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３遺伝子のクローニングは、例え
ばNeuron，４，７６７−７７３(１９９０)に記載されて
いる方法で行うことができる。
３遺伝子としては、例えばヒトゲノムライブラリーから
クローニングによって得られたもの、ヒトcＤＮＡライ
ブラリーからクローニングによって得られたもの，ヒト
ゲノムＤＮＡ，mＲＮＡ，cＤＮＡからポリメラーゼチェ
ーンリアクション(ＰＣＲ)法によって得られたもの、ま
たは化学合成によって得られたものなどが挙げられる。
ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３遺伝子のクローニングは、例え
ばNeuron，４，７６７−７７３(１９９０)に記載されて
いる方法で行うことができる。
【０００６】該遺伝子としては、たとえば、ヨーロッパ
特許出願公開第３８６,７５２号公報に記載のもの、Mai
sonpierre, P. C. et. al.：Science ２４７ １４４６
−１４５１(１９９０)，Rosenthal，A. e t. al. ：Neur
on ４，７６７−７７３(１９９０)，Ernfors, P. et. a
l,：Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ８７ ５４５４−
５４５８(１９９０)，Kaisho, Y. et. al. ：ＦＥＢＳ
Lett, ２６６ １８７−１９１(１９９０)に記載のもの
などが挙げられる。
特許出願公開第３８６,７５２号公報に記載のもの、Mai
sonpierre, P. C. et. al.：Science ２４７ １４４６
−１４５１(１９９０)，Rosenthal，A. e t. al. ：Neur
on ４，７６７−７７３(１９９０)，Ernfors, P. et. a
l,：Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ８７ ５４５４−
５４５８(１９９０)，Kaisho, Y. et. al. ：ＦＥＢＳ
Lett, ２６６ １８７−１９１(１９９０)に記載のもの
などが挙げられる。
【０００７】上述の如く、本発明においては、ヒトＮＧ
Ｆ２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡの５′末端にＮＧＦ
のプロ領域をコードするＤＮＡを連結するが、さらにそ
の上流にシグナルペプチドをコードするＤＮＡを連結す
ることが望ましい。動物細胞で発現させる場合には、該
シグナルペプチドとしては、たとえばヒトＮＧＦ２／Ｎ
Ｔ−３を分泌させることが可能なものであれば何でもよ
く、例えば、ラット，マウス等のＮＧＦ２／ＮＴ−３の
シグナルペプチド，マウス，ブタ，ヒト，ラットＢＤＮ
Ｆ，ヒト，ラット，マウス，ウシ，ニワトリＮＧＦのシ
グナルペプチド卵白リゾチームのシグナルペプチドおよ
びその変異体、ヒトインターロイキン−２のシグナルペ
プチドなどが挙げられる。
Ｆ２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡの５′末端にＮＧＦ
のプロ領域をコードするＤＮＡを連結するが、さらにそ
の上流にシグナルペプチドをコードするＤＮＡを連結す
ることが望ましい。動物細胞で発現させる場合には、該
シグナルペプチドとしては、たとえばヒトＮＧＦ２／Ｎ
Ｔ−３を分泌させることが可能なものであれば何でもよ
く、例えば、ラット，マウス等のＮＧＦ２／ＮＴ−３の
シグナルペプチド，マウス，ブタ，ヒト，ラットＢＤＮ
Ｆ，ヒト，ラット，マウス，ウシ，ニワトリＮＧＦのシ
グナルペプチド卵白リゾチームのシグナルペプチドおよ
びその変異体、ヒトインターロイキン−２のシグナルペ
プチドなどが挙げられる。
【０００８】上記の方法の他に、他のタンパクとヒトＮ
ＧＦ２／ＮＴ−３との融合蛋白として分泌生産させて
後、適当なプロテアーゼで切断することによってヒトＮ
ＧＦ２／ＮＴ−３を得ることもできる。
ＧＦ２／ＮＴ−３との融合蛋白として分泌生産させて
後、適当なプロテアーゼで切断することによってヒトＮ
ＧＦ２／ＮＴ−３を得ることもできる。
【０００９】上記のヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３をコードす
るＤＮＡなどを用いてヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３発現ベク
ターを構築する。発現させる宿主としては、たとえば動
物細胞，酵母などが挙げられる。
るＤＮＡなどを用いてヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３発現ベク
ターを構築する。発現させる宿主としては、たとえば動
物細胞，酵母などが挙げられる。
【００１０】ＮＧＦのプロ領域としては例えば、ヒトＮ
ＧＦ，マウスＮＧＦ，ウシＮＧＦ，ニワトリＮＧＦ，ラ
ットＮＧＦ，ヘビＮＧＦのプロ領域が挙げられる。これ
らのプロ領域をコードするＤＮＡは、動物のゲノムＤＮ
Ａライブラリー，cＤＮＡライブラリーからクローン化
して得ることができるが、それらのアミノ酸配列に基づ
いて化学合成しても得ることもできる。なお、上記のＮ
ＧＦのプロ領域としてはアミノ酸配列の一部が挿入、付
加、欠失、置換などによって変異したものを用いても良
い。
ＧＦ，マウスＮＧＦ，ウシＮＧＦ，ニワトリＮＧＦ，ラ
ットＮＧＦ，ヘビＮＧＦのプロ領域が挙げられる。これ
らのプロ領域をコードするＤＮＡは、動物のゲノムＤＮ
Ａライブラリー，cＤＮＡライブラリーからクローン化
して得ることができるが、それらのアミノ酸配列に基づ
いて化学合成しても得ることもできる。なお、上記のＮ
ＧＦのプロ領域としてはアミノ酸配列の一部が挿入、付
加、欠失、置換などによって変異したものを用いても良
い。
【００１１】該プロ領域の具体例としては、例えばヒト
ＮＧＦ遺伝子のプロ領域としてUllrich, A. et. al. Na
ture ３０３，８２１−８２５(１９８３)に記載のも
の，ラットのそれとしてWhittemore, S. R. et. al. J.
Neurosci. Res ２０４０３−４１０(１９８８)に記載
のもの，マウスのそれとしてScott. J. et. al. Nature
３０２ ５３８−５４０(１９８３)に記載のもの，ウ
シ・ニワトリのそれらとしてMeier, R. et. al. ＥＭＢ
Ｏ J. ５ １４８９−１４９３(１９８６)に記載のも
のが挙げられる。該プロ領域としては、ヒトＮＧＦのプ
ロ領域が特に好ましい。
ＮＧＦ遺伝子のプロ領域としてUllrich, A. et. al. Na
ture ３０３，８２１−８２５(１９８３)に記載のも
の，ラットのそれとしてWhittemore, S. R. et. al. J.
Neurosci. Res ２０４０３−４１０(１９８８)に記載
のもの，マウスのそれとしてScott. J. et. al. Nature
３０２ ５３８−５４０(１９８３)に記載のもの，ウ
シ・ニワトリのそれらとしてMeier, R. et. al. ＥＭＢ
Ｏ J. ５ １４８９−１４９３(１９８６)に記載のも
のが挙げられる。該プロ領域としては、ヒトＮＧＦのプ
ロ領域が特に好ましい。
【００１２】ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３を動物細胞で発現
させる際に、発現ベクターの構築に用いるベクターとし
ては、例えばpＢＲ３２２およびその誘導体、ＳＶ４０
系ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、レトロ
ウイルスベクター、ＢＫウイルスベクターなどが挙げら
れる。そのほかにＥＢウイルス、単純ヘルペスウイルス
などの動物ウイルスをベクターとして用いることもでき
る。動物細胞で発現させる際に、発現ベクターに用いる
プロモーターとしては、動物細胞で機能するものであれ
ばいずれでもよく、例えば、ＳＶ４０プロモーター、Ｌ
ＴＲプロモーター、メタロチオインプロモーター、サイ
トメガロウイルスプロモーターなどが挙げられる。発現
ベクターには、以上のほかに、エンハンサー、ＲＮＡス
プライシングのシグナル、ポリＡ付加のシグナル、選択
マーカーなどを用いる。発現ベクターを構築する方法自
体は公知であり、例えば、モレキュラー クローニング
(Molecular Cloning)、ア ラボラトリー マニュア
ル、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー(A
Laboratory Mannul、Cold Spring HarborLaboratory)
(１９８２)に記載されている。
させる際に、発現ベクターの構築に用いるベクターとし
ては、例えばpＢＲ３２２およびその誘導体、ＳＶ４０
系ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、レトロ
ウイルスベクター、ＢＫウイルスベクターなどが挙げら
れる。そのほかにＥＢウイルス、単純ヘルペスウイルス
などの動物ウイルスをベクターとして用いることもでき
る。動物細胞で発現させる際に、発現ベクターに用いる
プロモーターとしては、動物細胞で機能するものであれ
ばいずれでもよく、例えば、ＳＶ４０プロモーター、Ｌ
ＴＲプロモーター、メタロチオインプロモーター、サイ
トメガロウイルスプロモーターなどが挙げられる。発現
ベクターには、以上のほかに、エンハンサー、ＲＮＡス
プライシングのシグナル、ポリＡ付加のシグナル、選択
マーカーなどを用いる。発現ベクターを構築する方法自
体は公知であり、例えば、モレキュラー クローニング
(Molecular Cloning)、ア ラボラトリー マニュア
ル、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー(A
Laboratory Mannul、Cold Spring HarborLaboratory)
(１９８２)に記載されている。
【００１３】このようにして作製したヒトＮＧＦ２／Ｎ
Ｔ−３発現ベクターを用いて動物細胞を形質転換し、形
質転換体を作製する。動物細胞としては、例えばサル V
ero細胞、サルＣＶ−１細胞、ヒト Hela細胞、チャイニ
ーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１
２７細胞、マウスＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、ラットＮＲＫ
細胞、およびリンパ球系細胞、例えばマウスＳp２／０
などが挙げられる。特にチャイニーズハムスターＣＨＯ
細胞が好ましい。動物細胞を形質転換する方法は公知で
あり、例えば、グラハム(Graham)の方法〔ウィロロジー
(Virolory)，５２，４５６(１９７３)〕などが挙げられ
る。以上のようにしてヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３発現ベク
ターで形質転換された動物細胞が得られる。
Ｔ−３発現ベクターを用いて動物細胞を形質転換し、形
質転換体を作製する。動物細胞としては、例えばサル V
ero細胞、サルＣＶ−１細胞、ヒト Hela細胞、チャイニ
ーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１
２７細胞、マウスＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、ラットＮＲＫ
細胞、およびリンパ球系細胞、例えばマウスＳp２／０
などが挙げられる。特にチャイニーズハムスターＣＨＯ
細胞が好ましい。動物細胞を形質転換する方法は公知で
あり、例えば、グラハム(Graham)の方法〔ウィロロジー
(Virolory)，５２，４５６(１９７３)〕などが挙げられ
る。以上のようにしてヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３発現ベク
ターで形質転換された動物細胞が得られる。
【００１４】上記のヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３発現ベクタ
ーで形質転換された動物細胞を用いてヒトＮＧＦ２／Ｎ
Ｔ−３遺伝子を安定に発現させる方法としては、ＮＧＦ
２／ＮＴ−３発現ベクターが導入細胞の染色体に組み込
まれる方法と、導入細胞においてＮＧＦ発現ベクターが
染色体に組み込まれることなく安定に存在させる方法が
ある。前者の場合には、例えばジヒドロ葉酸還元酵素
(ＤＨＦＲ)遺伝子などの増幅系〔ジャーナル オブ モ
レキュラー バイオロジー(J. Mol. Biol.)１５ ９，６
０１(１９８２)〕を利用してヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３の
生産量を増大させることができる。
ーで形質転換された動物細胞を用いてヒトＮＧＦ２／Ｎ
Ｔ−３遺伝子を安定に発現させる方法としては、ＮＧＦ
２／ＮＴ−３発現ベクターが導入細胞の染色体に組み込
まれる方法と、導入細胞においてＮＧＦ発現ベクターが
染色体に組み込まれることなく安定に存在させる方法が
ある。前者の場合には、例えばジヒドロ葉酸還元酵素
(ＤＨＦＲ)遺伝子などの増幅系〔ジャーナル オブ モ
レキュラー バイオロジー(J. Mol. Biol.)１５ ９，６
０１(１９８２)〕を利用してヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３の
生産量を増大させることができる。
【００１５】形質転換された動物細胞(クローン)を選択
する方法自体は公知であり、例えば実験医学、臨時増刊
号、Vol. ５，No. １１,１９８７に記載されている。具
体的には、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３遺伝子と共に選択マ
ーカー遺伝子を指標にして形質転換株を選択する。この
場合、選択マーカーをヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３遺伝子と
同一ベクターに乗せて細胞に導入しても良く、また選択
マーカーを別のベクターに乗せ、これよりも多量のヒト
ＮＧＦ２／ＮＴ−３遺伝子をもつベクターとともに別の
ベクターに乗せ、細胞に導入(co-transformation)して
も良い。これらの選択マーカーとしては、例えばジヒド
ロ葉酸還元酵素(ＤＨＦＲ)〔メトトレキセート(ＭＴＸ)
耐性〕、チミジンキナーゼ、Ｅcogpt遺伝子(ミコフェノ
ール酸耐性)、neo遺伝子(Ｇ４１８耐性)，ハイグロマイ
シンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子(ハイグロマイ
シンＢ耐性)などが挙げられる。
する方法自体は公知であり、例えば実験医学、臨時増刊
号、Vol. ５，No. １１,１９８７に記載されている。具
体的には、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３遺伝子と共に選択マ
ーカー遺伝子を指標にして形質転換株を選択する。この
場合、選択マーカーをヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３遺伝子と
同一ベクターに乗せて細胞に導入しても良く、また選択
マーカーを別のベクターに乗せ、これよりも多量のヒト
ＮＧＦ２／ＮＴ−３遺伝子をもつベクターとともに別の
ベクターに乗せ、細胞に導入(co-transformation)して
も良い。これらの選択マーカーとしては、例えばジヒド
ロ葉酸還元酵素(ＤＨＦＲ)〔メトトレキセート(ＭＴＸ)
耐性〕、チミジンキナーゼ、Ｅcogpt遺伝子(ミコフェノ
ール酸耐性)、neo遺伝子(Ｇ４１８耐性)，ハイグロマイ
シンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子(ハイグロマイ
シンＢ耐性)などが挙げられる。
【００１６】このようにして得られた動物細胞を培養す
る際、培地としては、例えば０.５〜２０％の胎児牛血
清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス(Science)，１２２，
５０１(１９５２)〕、ＤＭＥＭ培地〔ウィロロジー(Vir
ology)，８，３９６(１９５９)〕、ＲＰＭＩ １６４０
培地〔ジャーナル オブ アメリカン メディカルアソ
シエーション(J. Am. Med. Assoc.)，１９９，５１９
(１９６７)，１９９培地〔プロシージングス オブ ソ
サイェティ オブ エクスペリメント バイオロジカル
メディシン(Proc. Soc. Exp. Biol. Med. ７３、１
(１９５０)〕などが挙げられる。pＨは約６〜８である
のが望ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃，１〜１０
日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
る際、培地としては、例えば０.５〜２０％の胎児牛血
清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス(Science)，１２２，
５０１(１９５２)〕、ＤＭＥＭ培地〔ウィロロジー(Vir
ology)，８，３９６(１９５９)〕、ＲＰＭＩ １６４０
培地〔ジャーナル オブ アメリカン メディカルアソ
シエーション(J. Am. Med. Assoc.)，１９９，５１９
(１９６７)，１９９培地〔プロシージングス オブ ソ
サイェティ オブ エクスペリメント バイオロジカル
メディシン(Proc. Soc. Exp. Biol. Med. ７３、１
(１９５０)〕などが挙げられる。pＨは約６〜８である
のが望ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃，１〜１０
日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００１７】酵母で発現させる場合のシグナルペプチド
としては、上述の動物細胞に発現させる場合のそれらと
同様のものが挙げられる。さらにヒトリゾチームのシグ
ナル配列，卵白リゾチームのシグナル配列，卵白リゾチ
ームのシグナル配列の変異体(改良型シグナル配列)，サ
ッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)のα−ファクター，フォスターゼ，インベルターゼ，
キラー因子のシグナル配列，アスペルギルス アワモリ
(Aspergillus awamori)のグルコアミラーゼのシグナル
配列などが挙げられる。
としては、上述の動物細胞に発現させる場合のそれらと
同様のものが挙げられる。さらにヒトリゾチームのシグ
ナル配列，卵白リゾチームのシグナル配列，卵白リゾチ
ームのシグナル配列の変異体(改良型シグナル配列)，サ
ッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)のα−ファクター，フォスターゼ，インベルターゼ，
キラー因子のシグナル配列，アスペルギルス アワモリ
(Aspergillus awamori)のグルコアミラーゼのシグナル
配列などが挙げられる。
【００１８】上記のシグナル配列−ＮＧＦのプロ領域−
ヒトＮＧＦをコードするＤＮＡを用いて酵母用のヒトＮ
ＧＦ発現ベクターを構築する。ヒトＮＧＦ発現ベクター
の構築に用いるベクターとしては，酵母で機能するもの
であれば何でも良く、例えば、pＳＨ１９，pＳＨ１５，
pＳＨ３２，およびこれらの誘導体が挙げられる。発現
ベクターに用いるプロモーターとしては、酵母で機能す
るものであれば何でも良く、例えば、ＧＬＤプロモータ
ー，α−ファクタープロモーター，ＧＡＬ１０プロモー
ター，ＧＡＬ１プロモーター，ＰＨＯ５プロモーター，
ＰＧＫプロモーターなどが挙げられる。ヒトＮＧＦをコ
ードするＤＮＡの下流にターミネーターを挿入すること
によって発現を高めることができる。このターミネータ
ーとしては、例えばＰＧＫターミネーターなどが挙げら
れる。発現ベクターを構築する方法自体は公知であり、
例えば、モレキュラー クローニング(Molecular Cloni
ng)，ア ラボラトリー マニュアル，コールド スプ
リング ハーバー ラボラトリー(A Laboratory Manua
l, Cold Spring HarborLaboratory)(１９８２)に記載さ
れている。
ヒトＮＧＦをコードするＤＮＡを用いて酵母用のヒトＮ
ＧＦ発現ベクターを構築する。ヒトＮＧＦ発現ベクター
の構築に用いるベクターとしては，酵母で機能するもの
であれば何でも良く、例えば、pＳＨ１９，pＳＨ１５，
pＳＨ３２，およびこれらの誘導体が挙げられる。発現
ベクターに用いるプロモーターとしては、酵母で機能す
るものであれば何でも良く、例えば、ＧＬＤプロモータ
ー，α−ファクタープロモーター，ＧＡＬ１０プロモー
ター，ＧＡＬ１プロモーター，ＰＨＯ５プロモーター，
ＰＧＫプロモーターなどが挙げられる。ヒトＮＧＦをコ
ードするＤＮＡの下流にターミネーターを挿入すること
によって発現を高めることができる。このターミネータ
ーとしては、例えばＰＧＫターミネーターなどが挙げら
れる。発現ベクターを構築する方法自体は公知であり、
例えば、モレキュラー クローニング(Molecular Cloni
ng)，ア ラボラトリー マニュアル，コールド スプ
リング ハーバー ラボラトリー(A Laboratory Manua
l, Cold Spring HarborLaboratory)(１９８２)に記載さ
れている。
【００１９】このようにして作成したヒトＮＧＦ発現ベ
クターを用いて酵母を形質転換し、形質転換体を作製す
る。酵母としては Saccharomyces cerevisiae ＡＨ２２
Ｒ-，S. cerevisiae ＮＡ７４−３Ａρ-，S. cerevisia
e ＴＢ３９ρ-，およびこれらの変異株などが挙げられ
る。形質転換の方法それ自体は公知であり、例えば、リ
チウム法〔伊藤ら，「ジャーナル・オブ・バクテリオロ
ジー(J. Bacterial.)」，１５３，１６３(１９８
３)〕，プロトプラスト法〔ヒンネン(Hinnen)ら，プロ
シーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. S
ci. ＵＳＡ)７５，１９２７(１９７８)〕などが挙げら
れる。
クターを用いて酵母を形質転換し、形質転換体を作製す
る。酵母としては Saccharomyces cerevisiae ＡＨ２２
Ｒ-，S. cerevisiae ＮＡ７４−３Ａρ-，S. cerevisia
e ＴＢ３９ρ-，およびこれらの変異株などが挙げられ
る。形質転換の方法それ自体は公知であり、例えば、リ
チウム法〔伊藤ら，「ジャーナル・オブ・バクテリオロ
ジー(J. Bacterial.)」，１５３，１６３(１９８
３)〕，プロトプラスト法〔ヒンネン(Hinnen)ら，プロ
シーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. S
ci. ＵＳＡ)７５，１９２７(１９７８)〕などが挙げら
れる。
【００２０】このようにして得られた形質転換株を、そ
れ自体公知の方法で培養する。培地としては、例えばバ
ークホルダー(Burkholder)最小培地〔「アメリカンジャ
ーナル オブ ボタニー(Amer. J. Bat.)，３０，２０
６(１９４３)〕あるいはその改変培地〔東江(Toh-e，
A.)ら、「ジャーナル オブ バクテリオロジー(J. Bac
teriol.)」，１１３，７２７(１９７３)〕などが挙げら
れる。培養は通常１５℃〜４０℃、好ましくは２４℃〜
３０℃で１０〜１６８時間、好ましくは４８〜９６時間
行なう。振とう培養でも静置でも良いが必要に応じて通
気や撹拌を加える。
れ自体公知の方法で培養する。培地としては、例えばバ
ークホルダー(Burkholder)最小培地〔「アメリカンジャ
ーナル オブ ボタニー(Amer. J. Bat.)，３０，２０
６(１９４３)〕あるいはその改変培地〔東江(Toh-e，
A.)ら、「ジャーナル オブ バクテリオロジー(J. Bac
teriol.)」，１１３，７２７(１９７３)〕などが挙げら
れる。培養は通常１５℃〜４０℃、好ましくは２４℃〜
３０℃で１０〜１６８時間、好ましくは４８〜９６時間
行なう。振とう培養でも静置でも良いが必要に応じて通
気や撹拌を加える。
【００２１】本発明のヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３は細胞内
または細胞外に生成、蓄積する。細胞内ヒトＮＧＦ２／
ＮＴ−３を培養物から抽出するに際しては、培養後公知
の方法で細胞を集め、塩酸グアニジンや尿素などの蛋白
変性剤を含む緩衝液やトライトンＸ−１００などの界面
活性剤を含む緩衝液中に細胞を懸濁させたのち、遠心分
離によりヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３を含む上澄液を得る方
法、あるいは超音波処理や凍結融解法によって細胞を破
壊したのち、遠心分離によりヒトＮＧＦを含む上澄液を
得る方法などを適宜用い得る。これらの上澄液や細胞外
に生成、蓄積したヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３を分離、精製
するには自体公知の分離、精製法を適切に組み合わせて
実施すればよい。これらの公知の分離、精製法として
は、塩析や溶媒沈殿法などの溶解度の差を利用する方
法、透析法、限外ろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用
する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の
差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー
などの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロ
マトグラフィー(ＨＰＬＣ)などの疎水性の差を利用する
方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方
法などが挙げられる。このようにして、活性体として、
９０％(w／w)以上の純度のものが得られる。該純度は、
ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、生物活性から測定され
る。生物活性測定法としては、ニワトリ胚脊椎後根神経
節における神経突起の伸長を指標とした生物活性測定法
があげられる。(細胞成長因子、日本組織培養学会編、
朝倉書店、１９８４年)。
または細胞外に生成、蓄積する。細胞内ヒトＮＧＦ２／
ＮＴ−３を培養物から抽出するに際しては、培養後公知
の方法で細胞を集め、塩酸グアニジンや尿素などの蛋白
変性剤を含む緩衝液やトライトンＸ−１００などの界面
活性剤を含む緩衝液中に細胞を懸濁させたのち、遠心分
離によりヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３を含む上澄液を得る方
法、あるいは超音波処理や凍結融解法によって細胞を破
壊したのち、遠心分離によりヒトＮＧＦを含む上澄液を
得る方法などを適宜用い得る。これらの上澄液や細胞外
に生成、蓄積したヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３を分離、精製
するには自体公知の分離、精製法を適切に組み合わせて
実施すればよい。これらの公知の分離、精製法として
は、塩析や溶媒沈殿法などの溶解度の差を利用する方
法、透析法、限外ろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用
する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の
差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー
などの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロ
マトグラフィー(ＨＰＬＣ)などの疎水性の差を利用する
方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方
法などが挙げられる。このようにして、活性体として、
９０％(w／w)以上の純度のものが得られる。該純度は、
ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、生物活性から測定され
る。生物活性測定法としては、ニワトリ胚脊椎後根神経
節における神経突起の伸長を指標とした生物活性測定法
があげられる。(細胞成長因子、日本組織培養学会編、
朝倉書店、１９８４年)。
【００２２】以上のようにして得られるヒトＮＧＦ２／
ＮＴ−３は、脳神経系の研究に用いる試薬として有用で
あり、また老人性痴ほうの治療薬としても期待できる。
ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３をこれらの研究のために用いる
には、たとえばヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３を動物細胞培養
用培地１mlあたり約０.１〜１,０００ng／ml、さらに好
ましくは約１〜１００ngとなる量を加えることが好まし
い。
ＮＴ−３は、脳神経系の研究に用いる試薬として有用で
あり、また老人性痴ほうの治療薬としても期待できる。
ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３をこれらの研究のために用いる
には、たとえばヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３を動物細胞培養
用培地１mlあたり約０.１〜１,０００ng／ml、さらに好
ましくは約１〜１００ngとなる量を加えることが好まし
い。
【００２３】なお、本願発明明細書および図面におい
て、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰ
ＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclatu
re による略号あるいは当該分野における慣用略号に基
づくものであり、その例を次にあげる。またアミノ酸に
関して光学異性体がありうる場合は、特に明示しなけれ
ばＬ体を示すものとする。 ＤＮＡ デオキシリボ核酸 Ａ アデニン Ｃ シトニン Ｇ グアニン Ｔ チミン Ａla ：アラニン Ａrg ：アルギニン Ａsn ：アスパラギン Ａsp ：アスパラギン酸 Ｃys ：システイン Ｇln ：グルタミン Ｇlu ：グルタミン酸 Ｇly ：グリシン Ｈis ：ヒスチジン Ｉle ：イソロイシン Ｌeu ：ロイシン Ｌys ：リジン Ｍet ：メチオニン Ｐhe ：フェニールアラニン Ｐro ：プロリン Ｓer ：セリン Ｔhr ：スレオニン Ｔrp ：トリプトファン Ｔyr ：チロシン Ｖal ：バリン
て、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰ
ＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclatu
re による略号あるいは当該分野における慣用略号に基
づくものであり、その例を次にあげる。またアミノ酸に
関して光学異性体がありうる場合は、特に明示しなけれ
ばＬ体を示すものとする。 ＤＮＡ デオキシリボ核酸 Ａ アデニン Ｃ シトニン Ｇ グアニン Ｔ チミン Ａla ：アラニン Ａrg ：アルギニン Ａsn ：アスパラギン Ａsp ：アスパラギン酸 Ｃys ：システイン Ｇln ：グルタミン Ｇlu ：グルタミン酸 Ｇly ：グリシン Ｈis ：ヒスチジン Ｉle ：イソロイシン Ｌeu ：ロイシン Ｌys ：リジン Ｍet ：メチオニン Ｐhe ：フェニールアラニン Ｐro ：プロリン Ｓer ：セリン Ｔhr ：スレオニン Ｔrp ：トリプトファン Ｔyr ：チロシン Ｖal ：バリン
【００２４】後述の実施例４で得られた形質転換体ＣＨ
Ｏ−Ｎ２−１は、平成３年１月２２日から財団法人発酵
研究所(ＩＦＯ)に受託番号ＩＦＯ ５０３０７として寄
託されており、また該形質転換体は平成３年１月２９日
から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所(ＦＲ
Ｉ)に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３２５５として寄託さ
れている。
Ｏ−Ｎ２−１は、平成３年１月２２日から財団法人発酵
研究所(ＩＦＯ)に受託番号ＩＦＯ ５０３０７として寄
託されており、また該形質転換体は平成３年１月２９日
から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所(ＦＲ
Ｉ)に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３２５５として寄託さ
れている。
【００２５】
【実施例】以下に、参考例、実施例を挙げて、本発明を
さらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定され
ることはない。
さらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定され
ることはない。
【００２６】参考例１ ヒトＮＧＦ発現ベク ターの構築
(１) ヒト白血球ＤＮＡより作製されたλＥＭＢＬ３ゲノムラ
イブラリー〔クロンテック(Clontech)社〕を大腸菌ＮＭ
５３８に感染させたのち、軟寒天プレート上に約３×１
０4クローンずつ撒いた。プラークをナイロンメンブラ
ン(アマシャム社、ハイボンド-Ｎ)上に移した後、０.５
Ｎ ＮaＯＨ−１.５Ｍ ＮaＣl溶液に６分間浸し、ファー
ジＤＮＡを変性させた後、０.５Ｍ Ｔris-ＨＣl(pＨ８.
０)-１.５Ｍ ＮaＣl溶液に６分間浸した。本メンブラン
を２×ＳＳＣ溶液に浸し、風乾後８０℃、２時間処理す
ることによりＤＮＡをメンブランに固定した。一方、既
知〔アルリッチ(Ullrich, A.)ら、ネイチャー(Nature)
３０３，８２１(１９８３)〕のヒトＮＧＦ遺伝子を参考
にしてヒトβＮＧＦをコードするＤＮＡ(０.３８kb)を
化学合成し、これをＤＮＡラベリングキット(ニッポン
ジーン社)を用いて32Ｐで標識したものをプローブとし
た。ＤＮＡを固定したフィルターを、標識プローブを含
む、６×ＳＳＣ(１×ＳＳＣ＝０.１５Ｍ ＮaＣl，０.０
１５Ｍクエン酸ナトリウム)，５×Denhardt's，０.５％
ＳＤＳ，２０μg／ml変性サケ精子ＤＮＡ溶液１０ml中
で６５℃、１６時間、保温した。反応後、フィルターを
２×ＳＳＣ，０.１％ＳＤＳ溶液中で室温で５分ずつ３
回、１×ＳＳＣ，０.１％ＳＤＳ溶液中で、６０℃で６
０分洗浄した。洗浄したフィルターを乾燥させた後、ラ
ジオオートグラムをとり、プローブと反応するクローン
を検索した。この方法により得られたクローンλβＬＮ
２１１３よりデイヴィス(Davis)らの方法(Davisら、
〔アドバンスト・バクテリアル・ジ ェネティクス(Adva
nced Bacterial Genetics)〕，Cold Spring Harbor Lab
oratory １９８０)によりファージＤＮＡを抽出した。
次にλβＬＮ２１１３をＳmaＩとＡpaＩで切断し、ヒト
ＮＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ(約１kb)を切り出し、プラス
ミドpBluscript IIＫＳ−(Stratagene 社，ＵＳＡ)のＳ
maＩ，ＡpaＩ部位に挿入し、プラスミドpＮＧＦ１０７
Ｇを得た。また、pBluescript II ＫＳ−(Stratagene
社)のＳmaＩ，ＡpaＩ部位に同ＤＮＡ断片を挿入するこ
とによりpＮＧＦＰ１０８６を得た。pＮＧＦＰ１０７６
およびpＮＧＦＰ１０８６に挿入された部分の塩基配列
をシークナーゼ(United States Biochemical Corporari
on)を用いて決定した。決定された塩基配列はネイチャ
ー(Nature)，３０３，８２１(１９８３)に記載されてい
る配列と、蛋白コード領域では完全に一致した。上記の
ファージλβＬＮ２１１３ＤＮＡを制限酵素Ｂgl IIで
切断し、ヒトＮＧＦを含むＤＮＡ断片(１.８kb)を単離
した。一方、動物細胞用の発現ベクターpＫＳＶ-１０
(ファルマシア)を制限酵素Ｂgl IIで切断し、上記のヒ
トＮＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片(１.８kb)とＴ４ＤＮ
Ａリガーゼで連結した。この反応液を用いてエシェリヒ
ア コリ(Escherichia coli)ＤＨ１の形質転換を行い、
アンピシリン耐性の形質転換体の１つ〔エシェリヒア
コリ(Escherichia coli)ＤＨ１／pＭＮＧＦ１０１〕か
ら単離したプラスミドをpＭＮＧＦ１０１と命名した。
(１) ヒト白血球ＤＮＡより作製されたλＥＭＢＬ３ゲノムラ
イブラリー〔クロンテック(Clontech)社〕を大腸菌ＮＭ
５３８に感染させたのち、軟寒天プレート上に約３×１
０4クローンずつ撒いた。プラークをナイロンメンブラ
ン(アマシャム社、ハイボンド-Ｎ)上に移した後、０.５
Ｎ ＮaＯＨ−１.５Ｍ ＮaＣl溶液に６分間浸し、ファー
ジＤＮＡを変性させた後、０.５Ｍ Ｔris-ＨＣl(pＨ８.
０)-１.５Ｍ ＮaＣl溶液に６分間浸した。本メンブラン
を２×ＳＳＣ溶液に浸し、風乾後８０℃、２時間処理す
ることによりＤＮＡをメンブランに固定した。一方、既
知〔アルリッチ(Ullrich, A.)ら、ネイチャー(Nature)
３０３，８２１(１９８３)〕のヒトＮＧＦ遺伝子を参考
にしてヒトβＮＧＦをコードするＤＮＡ(０.３８kb)を
化学合成し、これをＤＮＡラベリングキット(ニッポン
ジーン社)を用いて32Ｐで標識したものをプローブとし
た。ＤＮＡを固定したフィルターを、標識プローブを含
む、６×ＳＳＣ(１×ＳＳＣ＝０.１５Ｍ ＮaＣl，０.０
１５Ｍクエン酸ナトリウム)，５×Denhardt's，０.５％
ＳＤＳ，２０μg／ml変性サケ精子ＤＮＡ溶液１０ml中
で６５℃、１６時間、保温した。反応後、フィルターを
２×ＳＳＣ，０.１％ＳＤＳ溶液中で室温で５分ずつ３
回、１×ＳＳＣ，０.１％ＳＤＳ溶液中で、６０℃で６
０分洗浄した。洗浄したフィルターを乾燥させた後、ラ
ジオオートグラムをとり、プローブと反応するクローン
を検索した。この方法により得られたクローンλβＬＮ
２１１３よりデイヴィス(Davis)らの方法(Davisら、
〔アドバンスト・バクテリアル・ジ ェネティクス(Adva
nced Bacterial Genetics)〕，Cold Spring Harbor Lab
oratory １９８０)によりファージＤＮＡを抽出した。
次にλβＬＮ２１１３をＳmaＩとＡpaＩで切断し、ヒト
ＮＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ(約１kb)を切り出し、プラス
ミドpBluscript IIＫＳ−(Stratagene 社，ＵＳＡ)のＳ
maＩ，ＡpaＩ部位に挿入し、プラスミドpＮＧＦ１０７
Ｇを得た。また、pBluescript II ＫＳ−(Stratagene
社)のＳmaＩ，ＡpaＩ部位に同ＤＮＡ断片を挿入するこ
とによりpＮＧＦＰ１０８６を得た。pＮＧＦＰ１０７６
およびpＮＧＦＰ１０８６に挿入された部分の塩基配列
をシークナーゼ(United States Biochemical Corporari
on)を用いて決定した。決定された塩基配列はネイチャ
ー(Nature)，３０３，８２１(１９８３)に記載されてい
る配列と、蛋白コード領域では完全に一致した。上記の
ファージλβＬＮ２１１３ＤＮＡを制限酵素Ｂgl IIで
切断し、ヒトＮＧＦを含むＤＮＡ断片(１.８kb)を単離
した。一方、動物細胞用の発現ベクターpＫＳＶ-１０
(ファルマシア)を制限酵素Ｂgl IIで切断し、上記のヒ
トＮＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片(１.８kb)とＴ４ＤＮ
Ａリガーゼで連結した。この反応液を用いてエシェリヒ
ア コリ(Escherichia coli)ＤＨ１の形質転換を行い、
アンピシリン耐性の形質転換体の１つ〔エシェリヒア
コリ(Escherichia coli)ＤＨ１／pＭＮＧＦ１０１〕か
ら単離したプラスミドをpＭＮＧＦ１０１と命名した。
【００２７】参考例２ ヒトＮＧＦ発現ベク ターの構築
(２) 参考例１で得られたプラスミドpＮＧＦＰ１０７Ｇを制
限酵素ＢclＩおよびＡpaＩで切断し、ヒトＮＧＦ遺伝子
を含むＤＮＡ断片(０.８kb)を単離した。この０.８kb
ＢclＩ−ＡpaＩ断片と化学合成アダプターＳＮ１，ＳＮ
２およびＳＮ３とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結
したのち、Ｂgl IIで切断することによって０.８kb Ｈi
nd III−Ｂgl II ＤＮＡ断片が得られた。 ＳＮ１：5′-AGC TTG CCG CCA CCA TGT CCA TGT TGT TCT ACA CTC T-3′(37mer) （配列表：配列番号１） ＳＮ２：5′-GAT CAG AGT GTA GAA CAA CAT GGA CAT GGT GGC GGC A-3′(37mer) （配列表：配列番号２） ＳＮ３：5′-CAG ATC TGG GCC-3′ (12mer)（配列表：配列番号３） Bgl II ApaＩ プラスミドpＳＶ２−gpt〔サイエンス(Science)，２０
９，１４２２(１９８０)〕を制限酵素ＥcoＲＩとＨind
IIIで切断し、ＳＶ４０プロモーターを含む２.6kb Ｅco
ＲＩ−Ｈind III ＤＮＡ断片を単離した。次にプラスミ
ドpＭＴＶdhfr〔ネイチャー(Nature)，２９４，２２８
(１９８１)〕よりpolyＡ付加領域を含む１.６kb Ｂgl I
I−ＥcoＲＩ断片を単離した。上記のＳＶ４０プロモー
ターを含む２.６kb ＥcoＲＩ-Ｈind III ＤＮＡ断片、
ヒトＮＧＦ遺伝子を含む０.８kb Ｈind III−Ｂgl II
ＤＮＡ断片およびpolyＡ 付加領域を含む１.６kb Ｂgl
II−ＥcoＲＩ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し た。
この反応液を用いてエシェリヒア コリ(Escherichia c
oli)ＤＨ１の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質
転換体〔エシェリヒア コリ(Escherichia coli)ＤＨ１
／pＭＮＧＦ２０１〕から単離したプラスミドをpＭＮＧ
Ｆ２０１と命名した。
(２) 参考例１で得られたプラスミドpＮＧＦＰ１０７Ｇを制
限酵素ＢclＩおよびＡpaＩで切断し、ヒトＮＧＦ遺伝子
を含むＤＮＡ断片(０.８kb)を単離した。この０.８kb
ＢclＩ−ＡpaＩ断片と化学合成アダプターＳＮ１，ＳＮ
２およびＳＮ３とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結
したのち、Ｂgl IIで切断することによって０.８kb Ｈi
nd III−Ｂgl II ＤＮＡ断片が得られた。 ＳＮ１：5′-AGC TTG CCG CCA CCA TGT CCA TGT TGT TCT ACA CTC T-3′(37mer) （配列表：配列番号１） ＳＮ２：5′-GAT CAG AGT GTA GAA CAA CAT GGA CAT GGT GGC GGC A-3′(37mer) （配列表：配列番号２） ＳＮ３：5′-CAG ATC TGG GCC-3′ (12mer)（配列表：配列番号３） Bgl II ApaＩ プラスミドpＳＶ２−gpt〔サイエンス(Science)，２０
９，１４２２(１９８０)〕を制限酵素ＥcoＲＩとＨind
IIIで切断し、ＳＶ４０プロモーターを含む２.6kb Ｅco
ＲＩ−Ｈind III ＤＮＡ断片を単離した。次にプラスミ
ドpＭＴＶdhfr〔ネイチャー(Nature)，２９４，２２８
(１９８１)〕よりpolyＡ付加領域を含む１.６kb Ｂgl I
I−ＥcoＲＩ断片を単離した。上記のＳＶ４０プロモー
ターを含む２.６kb ＥcoＲＩ-Ｈind III ＤＮＡ断片、
ヒトＮＧＦ遺伝子を含む０.８kb Ｈind III−Ｂgl II
ＤＮＡ断片およびpolyＡ 付加領域を含む１.６kb Ｂgl
II−ＥcoＲＩ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し た。
この反応液を用いてエシェリヒア コリ(Escherichia c
oli)ＤＨ１の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質
転換体〔エシェリヒア コリ(Escherichia coli)ＤＨ１
／pＭＮＧＦ２０１〕から単離したプラスミドをpＭＮＧ
Ｆ２０１と命名した。
【００２８】参考例３ ヒトＮＧＦ発現ベク ターの構築 参考例２で得られたプラスミドpＭＮＧＦ２０１をＨind
IIIで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＫlenow フラグメン
ト反応により平滑化したのち、Ｂgl IIで切断して約０.
８kb ＤＮＡ断片を分離した。一方プラスミドpＴＢ３９
９(特開昭６１−６３２８２に記載)をＥcoＲＩで切断
後、Ｋlenow フラグメント反応により平滑化したのち、
Ｂgl IIで切断して約３.９kb ＤＮＡ断片を得た。これ
ら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ反応により環
状化し、プラスミドpＴＢ１０５４を得た。
IIIで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＫlenow フラグメン
ト反応により平滑化したのち、Ｂgl IIで切断して約０.
８kb ＤＮＡ断片を分離した。一方プラスミドpＴＢ３９
９(特開昭６１−６３２８２に記載)をＥcoＲＩで切断
後、Ｋlenow フラグメント反応により平滑化したのち、
Ｂgl IIで切断して約３.９kb ＤＮＡ断片を得た。これ
ら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ反応により環
状化し、プラスミドpＴＢ１０５４を得た。
【００２９】参考例４ ヒトＮＧＦ２／ＮＴ −３発現ベ
クターの構築 (１)ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３ cＤＮＡを有するプラスミ
ドpＨＮＴ２(ヨーロッパ特許出願公開第３８６,７５２
号公報参照)を制限酵素ＳtuＩで切断し、Ｂgl IIリンカ
ーをＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合させた。このＤＮＡ
を制限酵素ＥcoＲＩおよびＢgl IIで切断することによ
り、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３ cＤＮＡを含む１.０kbの
ＤＮＡ断片を得た。一方、動物細胞用発現プラスミドp
ＴＢ３９９(Cell Struct. Funct. １２ ２０５(１９８
７))を制限酵素ＥcoＲＩおよびＢgl IIで切断し、約３.
８kbのＤＮＡ断片を得た。両ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼにより連結させプラスミドpＴＢ１０５５を得
た。次に、ハムスタージヒドロ葉酸還元酵素(ＤＨＦＲ)
cＤＮＡを有するプラスミドpＴＢ３４８(特開昭６１−
６３２８２に記載)を制限酵素ＳalＩ，Ｈind IIIで切断
し、これにプラスミドpＴＢ１０５５を制限酵素Ｓal
Ｉ，Ｈind IIIで切断することによって得られた約２.６
kb ＤＮＡ断片を連結することにより、プラスミドpＴＢ
１０５９を得た(図１参照)。 (２)上記(１)項記載のプラスミドpＨＮＴ２に含まれる
ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３遺伝子は５′上流にin frame
のＡＴＧ配列が存在する(ヨーロッパ特許出願公開第３
８６,７５２号公報の第２図参照)。このＡＴＧ配列を除
くために以下の２つのＤＮＡオリゴマーを合成した。 Primer１：5′TAC AGG TGA ATT CGG CCA TGT CCA TCT TG 3′ （配列表：配列番号４） Primer２：5′AGA GAT GCG AAT TCA TGT TCT TC 3′（配列表：配列番号５） Primer１および２を用いて、以下の手順でポリメラーゼ
チェーンリアクション(ＰＣＲ)を行った。プラスミドp
ＨＮＴ２を制限酵素ＢamＨＩで切断し直鎖状にし、フェ
ノール抽出後、エタノールで抽出、蒸発乾固し、蒸留水
に溶解した。ＰＣＲは、ＧeneＡmpTMＤＮＡ増幅試薬マ
キット(パーキン・エルマー・シータスＵＳＡ)を用い、
鋳型ＤＮＡとして前述の直鎖状pＨＮＴ２を０.３ng，プ
ライマーとしてPrimer１,２を各１.０μＭ加えて行っ
た。反応は、ＤＮＡサーマルサイクラー(パーキン・エ
ルマー・シータス)を用い、９４℃，１分，５５℃，２
分，７２℃，３分を３０回くり返すことによって行っ
た。その結果、約０.８kbのＤＮＡ断片を得ることがで
きた。Primer１，２には、制限酵素ＥcoＲＩの認識部位
が存在するので、得られた断片をＥcoＲＩで切断し、p
ＵＣ１１９のＥcoＲＩ部位にサブクローニングした。こ
の組換えプライマーpＴＢ１３３７を大腸菌ＭＶ１１８
４株に導入して得られる一本鎖ＤＮＡから塩基配列を確
認したところ、一塩基の誤りもなく遺伝子が増幅されて
いたことがわかった。このpＴＢ１３３７を制限酵素Ｅc
oＲＩおよびＡpaＩで切り出し０.２３kbのＤＮＡ断片を
得た。上記（１）項記載のプラスミドpＴＢ１０５５を
制限酵素ＥcoＲＩおよびＡpaＩで切断して得られる約
４.６kbのＤＮＡに、この０.２３kbのＤＮＡを連結し、
プラスミドpＴＢ１３３８を得た。pＴＢ１３３８を制限
酵素ＳalＩとＨind IIIで切断し、上記（１）項と同様
の方法でハムスターＤＨＦＲ遺伝子を導入し、発現プラ
スミドpＴＢ１３３９を得た(図２〜図３参照)。このプ
ラスミドpＴＢ１３３９上に存在するＮＧＦ２／ＮＴ−
３のプロ領域をコードするＤＮＡ，ＮＧＦ２／ＮＴ−３
をコードするＤＮＡおよびその付近のＤＮＡを図７〜図
８に示す（配列表：配列番号６）。
クターの構築 (１)ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３ cＤＮＡを有するプラスミ
ドpＨＮＴ２(ヨーロッパ特許出願公開第３８６,７５２
号公報参照)を制限酵素ＳtuＩで切断し、Ｂgl IIリンカ
ーをＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合させた。このＤＮＡ
を制限酵素ＥcoＲＩおよびＢgl IIで切断することによ
り、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３ cＤＮＡを含む１.０kbの
ＤＮＡ断片を得た。一方、動物細胞用発現プラスミドp
ＴＢ３９９(Cell Struct. Funct. １２ ２０５(１９８
７))を制限酵素ＥcoＲＩおよびＢgl IIで切断し、約３.
８kbのＤＮＡ断片を得た。両ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼにより連結させプラスミドpＴＢ１０５５を得
た。次に、ハムスタージヒドロ葉酸還元酵素(ＤＨＦＲ)
cＤＮＡを有するプラスミドpＴＢ３４８(特開昭６１−
６３２８２に記載)を制限酵素ＳalＩ，Ｈind IIIで切断
し、これにプラスミドpＴＢ１０５５を制限酵素Ｓal
Ｉ，Ｈind IIIで切断することによって得られた約２.６
kb ＤＮＡ断片を連結することにより、プラスミドpＴＢ
１０５９を得た(図１参照)。 (２)上記(１)項記載のプラスミドpＨＮＴ２に含まれる
ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３遺伝子は５′上流にin frame
のＡＴＧ配列が存在する(ヨーロッパ特許出願公開第３
８６,７５２号公報の第２図参照)。このＡＴＧ配列を除
くために以下の２つのＤＮＡオリゴマーを合成した。 Primer１：5′TAC AGG TGA ATT CGG CCA TGT CCA TCT TG 3′ （配列表：配列番号４） Primer２：5′AGA GAT GCG AAT TCA TGT TCT TC 3′（配列表：配列番号５） Primer１および２を用いて、以下の手順でポリメラーゼ
チェーンリアクション(ＰＣＲ)を行った。プラスミドp
ＨＮＴ２を制限酵素ＢamＨＩで切断し直鎖状にし、フェ
ノール抽出後、エタノールで抽出、蒸発乾固し、蒸留水
に溶解した。ＰＣＲは、ＧeneＡmpTMＤＮＡ増幅試薬マ
キット(パーキン・エルマー・シータスＵＳＡ)を用い、
鋳型ＤＮＡとして前述の直鎖状pＨＮＴ２を０.３ng，プ
ライマーとしてPrimer１,２を各１.０μＭ加えて行っ
た。反応は、ＤＮＡサーマルサイクラー(パーキン・エ
ルマー・シータス)を用い、９４℃，１分，５５℃，２
分，７２℃，３分を３０回くり返すことによって行っ
た。その結果、約０.８kbのＤＮＡ断片を得ることがで
きた。Primer１，２には、制限酵素ＥcoＲＩの認識部位
が存在するので、得られた断片をＥcoＲＩで切断し、p
ＵＣ１１９のＥcoＲＩ部位にサブクローニングした。こ
の組換えプライマーpＴＢ１３３７を大腸菌ＭＶ１１８
４株に導入して得られる一本鎖ＤＮＡから塩基配列を確
認したところ、一塩基の誤りもなく遺伝子が増幅されて
いたことがわかった。このpＴＢ１３３７を制限酵素Ｅc
oＲＩおよびＡpaＩで切り出し０.２３kbのＤＮＡ断片を
得た。上記（１）項記載のプラスミドpＴＢ１０５５を
制限酵素ＥcoＲＩおよびＡpaＩで切断して得られる約
４.６kbのＤＮＡに、この０.２３kbのＤＮＡを連結し、
プラスミドpＴＢ１３３８を得た。pＴＢ１３３８を制限
酵素ＳalＩとＨind IIIで切断し、上記（１）項と同様
の方法でハムスターＤＨＦＲ遺伝子を導入し、発現プラ
スミドpＴＢ１３３９を得た(図２〜図３参照)。このプ
ラスミドpＴＢ１３３９上に存在するＮＧＦ２／ＮＴ−
３のプロ領域をコードするＤＮＡ，ＮＧＦ２／ＮＴ−３
をコードするＤＮＡおよびその付近のＤＮＡを図７〜図
８に示す（配列表：配列番号６）。
【００３０】参考例５ ヒトＮＧＦ２／ＮＴ −３の生物
活性の測定 ニワトリ有精卵を３７.５℃でふ卵器で８日〜１０日揺
卵して胚発生を行った胎児から後根神経節(Dorsal root
ganglion，以下ＤＲＧ)を摘出した。ＤＲＧを０.１２
５％トリプシン−ＰＢＳ溶液で３７℃２０分処理し、ピ
ペッティングを行うことで、細胞を分散させた。これ
を、１０％牛胎児血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ培−５０
μg／mlカナマイシンに懸濁し、３７℃，５％ＣＯ2存在
下２〜４時間培養することにより線維芽細胞等を培養シ
ャーレに付着させ、非付着細胞のみを分取した。非付着
細胞を遠心(８００rpm，５分)により集め、１０％牛胎
児血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ培地／ハムＦ−１２培地
(混合比１：１)−１μＭサイトシンアラビノシド(Ａra
C，シグマ社，ＵＳＡ)−５０μg／mlカナマイシンを含
む培地に１００００細胞／mlとなるように再懸濁し、
０.５ml／ウェルずつ、ポリレーオルニチンコート済み
４８穴プレートに播種した。この培地にサンプルとなる
溶液を０.５〜２０μl加え、３７℃，５％ＣＯ2存在下
で３日間培養し、生存細胞数を計測した。
活性の測定 ニワトリ有精卵を３７.５℃でふ卵器で８日〜１０日揺
卵して胚発生を行った胎児から後根神経節(Dorsal root
ganglion，以下ＤＲＧ)を摘出した。ＤＲＧを０.１２
５％トリプシン−ＰＢＳ溶液で３７℃２０分処理し、ピ
ペッティングを行うことで、細胞を分散させた。これ
を、１０％牛胎児血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ培−５０
μg／mlカナマイシンに懸濁し、３７℃，５％ＣＯ2存在
下２〜４時間培養することにより線維芽細胞等を培養シ
ャーレに付着させ、非付着細胞のみを分取した。非付着
細胞を遠心(８００rpm，５分)により集め、１０％牛胎
児血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ培地／ハムＦ−１２培地
(混合比１：１)−１μＭサイトシンアラビノシド(Ａra
C，シグマ社，ＵＳＡ)−５０μg／mlカナマイシンを含
む培地に１００００細胞／mlとなるように再懸濁し、
０.５ml／ウェルずつ、ポリレーオルニチンコート済み
４８穴プレートに播種した。この培地にサンプルとなる
溶液を０.５〜２０μl加え、３７℃，５％ＣＯ2存在下
で３日間培養し、生存細胞数を計測した。
【００３１】実施例１ ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３発現ベ
クターの構築 プラスミドpＨＮＴ５(pＨＮＴ２のＥcoＲＩ挿入断片の
方向が逆向き)を大腸菌ＭＶ１１８３に導入することに
より(−)鎖一本鎖ＤＮＡを常法により調製した。一方プ
ラスミドpＮＧＦＰ１０８６(参考例１参照)を用いヒト
ＮＧＦ(−)鎖一本鎖ＤＮＡを調製した。これらに対し、 oligo１；５′ＡＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＣＴＣＡＴＣＡＴＣＣＣＡ ３′ （配列表：配列番号７） oligo２；５′ＴＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＣＴＡＣＧＣＧＧＡＧＣＡＴ ３′ （配列表：配列番号８） を合成し、これを用いて部位特異的な塩基変異を導入
し、ＮＧＦおよびＮＧＦ２／ＮＴ−３のそれぞれに制限
酵素Ｅco４７IIIの認識部位（ＡＧＣＧＣＴ）を導入し
た。この反応は、in Vitro Mutagenesis System，Ver.
２.０（アマシャム，ＵＫ）を使用した。この結果、ヒ
トＮＧＦ遺伝子中にＥco４７III部位を有する プラスミ
ドpＴＢ１３４０，ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３遺伝子中に
Ｅco４７III部位を有するプラスミドpＴＢ１３４１を得
た。pＴＢ１３４０を制限酵素ＫpnＩおよびＥco４７III
で切断することにより約３.０kbのＤＮＡ断片を得た。p
ＴＢ１３ ４１を制限酵素ＫpnＩおよびＥco４７IIIで切
断することにより、０.６７kbのＤＮＡの断片を得た。
両者をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させることによ
り、プレプロ領域がＮＧＦ，mature 領域がＮＧＦ２／
ＮＴ−３となるハイブリッドタ ンパクをコードする遺
伝子を持つプラスミドpＴＢ１３４２を得た。pＴＢ１３
４２を制限酵素ＳtuＩで切断後、合成Ｂal IIリンカー
を連結し、これを制限酵素 ＭluＩおよびＢｇl IIで切
断することにより０.８kbのＤＮＡ断片を得た。これ を
制限酵素ＭluＩおよびＢｇl IIでpＴＢ１０５４（参考
例３参照）を切断して 得られる約４.１kbのＤＮＡ断片
に挿入し、発現プラスミドpＴＢ１３４３を得た（図４
〜図６参照）。さらにこれをＳalＩおよびＨind IIIで
切断して得た約２.６kbのＤＮＡ断片をpＴＢ３４８のＳ
alＩ−Ｈind III部位に挿入することによりpＴＢ１３４
４を得た(図４〜図６参照)。該プラスミドpＴＢ１３４
４上に存在するＮＧＦのプロ領域をコードするＤＮＡ、
ＮＧＦ２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡおよびその付近
のＤＮＡを図９〜図１０に示す（配列表：配列番号
９）。
クターの構築 プラスミドpＨＮＴ５(pＨＮＴ２のＥcoＲＩ挿入断片の
方向が逆向き)を大腸菌ＭＶ１１８３に導入することに
より(−)鎖一本鎖ＤＮＡを常法により調製した。一方プ
ラスミドpＮＧＦＰ１０８６(参考例１参照)を用いヒト
ＮＧＦ(−)鎖一本鎖ＤＮＡを調製した。これらに対し、 oligo１；５′ＡＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＣＴＣＡＴＣＡＴＣＣＣＡ ３′ （配列表：配列番号７） oligo２；５′ＴＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＣＴＡＣＧＣＧＧＡＧＣＡＴ ３′ （配列表：配列番号８） を合成し、これを用いて部位特異的な塩基変異を導入
し、ＮＧＦおよびＮＧＦ２／ＮＴ−３のそれぞれに制限
酵素Ｅco４７IIIの認識部位（ＡＧＣＧＣＴ）を導入し
た。この反応は、in Vitro Mutagenesis System，Ver.
２.０（アマシャム，ＵＫ）を使用した。この結果、ヒ
トＮＧＦ遺伝子中にＥco４７III部位を有する プラスミ
ドpＴＢ１３４０，ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３遺伝子中に
Ｅco４７III部位を有するプラスミドpＴＢ１３４１を得
た。pＴＢ１３４０を制限酵素ＫpnＩおよびＥco４７III
で切断することにより約３.０kbのＤＮＡ断片を得た。p
ＴＢ１３ ４１を制限酵素ＫpnＩおよびＥco４７IIIで切
断することにより、０.６７kbのＤＮＡの断片を得た。
両者をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させることによ
り、プレプロ領域がＮＧＦ，mature 領域がＮＧＦ２／
ＮＴ−３となるハイブリッドタ ンパクをコードする遺
伝子を持つプラスミドpＴＢ１３４２を得た。pＴＢ１３
４２を制限酵素ＳtuＩで切断後、合成Ｂal IIリンカー
を連結し、これを制限酵素 ＭluＩおよびＢｇl IIで切
断することにより０.８kbのＤＮＡ断片を得た。これ を
制限酵素ＭluＩおよびＢｇl IIでpＴＢ１０５４（参考
例３参照）を切断して 得られる約４.１kbのＤＮＡ断片
に挿入し、発現プラスミドpＴＢ１３４３を得た（図４
〜図６参照）。さらにこれをＳalＩおよびＨind IIIで
切断して得た約２.６kbのＤＮＡ断片をpＴＢ３４８のＳ
alＩ−Ｈind III部位に挿入することによりpＴＢ１３４
４を得た(図４〜図６参照)。該プラスミドpＴＢ１３４
４上に存在するＮＧＦのプロ領域をコードするＤＮＡ、
ＮＧＦ２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡおよびその付近
のＤＮＡを図９〜図１０に示す（配列表：配列番号
９）。
【００３２】実施例２ ＣＨＯ細胞の形質転換およびク
ローニング ハムスターＣＨＯ細胞(ＤＨＦＲ-)を５％牛胎児血清を
含むＨamＦ−１２培地でファルコンシャーレ(径６cm)に
４×１０5個まいた。５％ＣＯ2存在下３７℃で一晩培養
後、培地を交換し、さらに４時間培養を行い、実施例１
で得られたヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３発現プラスミドpＴ
Ｂ１０５９，pＴＢ１３３９，pＴＢ１３４４をそれぞ
れ、シャーレ一枚あたり１０μｇ リン酸カルシウム法
(グラハムらウィロロジー（Virology）５２ ４５６−
４６７(１９７３))によりＣＨＯ細胞に導入した。培養
４時間後、培地を交換し一晩培養後、選択培地(５％牛
胎児血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ−５０μg／mlカナマ
イシン−３５μg／mlプロリン)に培地を置き換え培養を
続けた。１０〜１５日後ＤＨＦＲ+となった細胞がコロ
ニーを形成したので、シングルコロニーアイソレーショ
ンを行いクローニングした。
ローニング ハムスターＣＨＯ細胞(ＤＨＦＲ-)を５％牛胎児血清を
含むＨamＦ−１２培地でファルコンシャーレ(径６cm)に
４×１０5個まいた。５％ＣＯ2存在下３７℃で一晩培養
後、培地を交換し、さらに４時間培養を行い、実施例１
で得られたヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３発現プラスミドpＴ
Ｂ１０５９，pＴＢ１３３９，pＴＢ１３４４をそれぞ
れ、シャーレ一枚あたり１０μｇ リン酸カルシウム法
(グラハムらウィロロジー（Virology）５２ ４５６−
４６７(１９７３))によりＣＨＯ細胞に導入した。培養
４時間後、培地を交換し一晩培養後、選択培地(５％牛
胎児血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ−５０μg／mlカナマ
イシン−３５μg／mlプロリン)に培地を置き換え培養を
続けた。１０〜１５日後ＤＨＦＲ+となった細胞がコロ
ニーを形成したので、シングルコロニーアイソレーショ
ンを行いクローニングした。
【００３３】実施例３ 形質転換体によるヒトＮＧＦ２
／ＮＴ−３遺伝子の発現 実施例２によって得られたＣＨＯ形質転換体の培養上清
を採取し、参考例５に示した方法で培養上清中のヒトＮ
ＧＦ２／ＮＴ−３活性を測定した。この結果、pＴＢ１
０５９，pＴＢ１３３９，pＴＢ１３４４のいずれによっ
て形質転換した場合にも生物活性が認められた。
／ＮＴ−３遺伝子の発現 実施例２によって得られたＣＨＯ形質転換体の培養上清
を採取し、参考例５に示した方法で培養上清中のヒトＮ
ＧＦ２／ＮＴ−３活性を測定した。この結果、pＴＢ１
０５９，pＴＢ１３３９，pＴＢ１３４４のいずれによっ
て形質転換した場合にも生物活性が認められた。
【００３４】実施例４ ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３高産生
ＣＨＯ細胞株の確立 実施例２，３で示した形質転換株をそれぞれ、１００n
Ｍメトトレキセートを含む選択培地(実施例２に記載)で
培養した。この培地で生存してきたクローンについて
は、更に選択培地中のメトトレキセート濃度を１μＭ，
１０μＭへと段階的に上げながら培養を続けた。その結
果、プラスミドpＴＢ１０５９によって形質転換した株
Ａ１００２，プラスミドpＴＢ１３３９によって形質転
換した株ＣＨＯ−dＮ２−１７およびＣＨＯ−dＮ２−１
９，プラスミドpＴＢ１３４４によって形質転換した株
ＣＨＯ−Ｎ２−１（ＩＦＯ ５０３０７，ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−３２５５）およびＣＨＯ−Ｎ２−３７を得た。これ
らのＮＧＦ２／ＮＴ−３の産生量)は以下のとおりであ
った。 この表において産生量は参考例５に示した生物活性測定
方法によって、マウスβＮＧＦ当量として算出した。こ
の例では、限界希釈点を０.０２ng／mlβＮＧＦ当量点
とした。
ＣＨＯ細胞株の確立 実施例２，３で示した形質転換株をそれぞれ、１００n
Ｍメトトレキセートを含む選択培地(実施例２に記載)で
培養した。この培地で生存してきたクローンについて
は、更に選択培地中のメトトレキセート濃度を１μＭ，
１０μＭへと段階的に上げながら培養を続けた。その結
果、プラスミドpＴＢ１０５９によって形質転換した株
Ａ１００２，プラスミドpＴＢ１３３９によって形質転
換した株ＣＨＯ−dＮ２−１７およびＣＨＯ−dＮ２−１
９，プラスミドpＴＢ１３４４によって形質転換した株
ＣＨＯ−Ｎ２−１（ＩＦＯ ５０３０７，ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−３２５５）およびＣＨＯ−Ｎ２−３７を得た。これ
らのＮＧＦ２／ＮＴ−３の産生量)は以下のとおりであ
った。 この表において産生量は参考例５に示した生物活性測定
方法によって、マウスβＮＧＦ当量として算出した。こ
の例では、限界希釈点を０.０２ng／mlβＮＧＦ当量点
とした。
【００３５】実施例５ ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３の単離 実施例１で得られた細胞株ＣＨＯ−Ｎ２−１を５％牛胎
児血清、３５μg／mlプロリン，５０μg／mlカナマイシ
ンおよび２μＭメトトレキセートを含むダルベッコ改変
培地で２×１０4細胞／cm2の濃度で播種し、５％ＣＯ2
存在下、３７℃，７日間培養した。ニワトリ胚ＤＲＧに
対する活性測定から、この培地中には、１０μg ＮＧＦ
−１当量以上の組換え型ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３が産生
されていることがわかった。この培養液は、使用時まで
−２０℃で凍結保存した。凍結保存培養上清１リットル
を遠心８０００rpm，１５分，４℃または濾過(東洋濾紙
No.２)することで細胞残渣を除き、これを終濃度が１m
Ｍ ＥＤＴＡ，０.０５％ＣＨＡＰＳとなるように調整
し、２Ｎ酢酸でpＨ６.０に補正した。これを再び遠心又
は濾過し、不溶性画分を除き陽イオン交換樹脂に通し
た。陽イオン交換樹脂としては、Ｓ−セファロース フ
ァーストフロー(ファルマシアＬＫＢ，スウェーデン)を
０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液pＨ６.０−１mＭ ＥＤ
ＴＡ−０.０５％ＣＨＡＰＳで平衡化し、これを径２.６
cm高さ１０cmのカラムに詰めたものを用いた。調製済み
培養上清を４℃で６０ml／hrの流速でこのカラムを通す
ことにより、吸着を行った。吸着後、カラムを０.１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液pＨ６.０−１mＭ ＥＤＴＡ−
０.０５％ＣＨＡＰＳを流速６０ml／hrで４時間洗浄
し、０.５Ｍ ＮaＣl−０.１Ｍリン酸ナトリウム(pＨ６.
０)−１mＭ ＥＤＴＡ−０.０５％ＣＨＡＰＳを流速５０
ml／hrで流すことにより溶出を行った。ヒトＮＧＦ２／
ＮＴ−３を含む画分をヨーロッパ特許出願公開第３８
６,７５２号公報の参考例１に記載の抗ポリペプチド
(Ｉ)Ｎ末ペプチド抗体を用いたウェスタンブロッティン
グにより決定し、これを集めウルトラフリー２０(ミリ
ポア，ＵＳＡ)により約２０倍濃縮した。得られた濃縮
液を２０mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ７.４)−０.１５Ｍ Ｎa
Ｃl−１mＭ ＥＤＴＡ−０.０５％ＣＨＡＰＳで平衡化さ
せたセファクリルＳ−１００ＨＲ(ファルマシアＬＫ
Ｂ，スウェーデン)カラム(径１.６cm×８５cm)によりゲ
ル濾過した。先に示したのと同様に、ウェスタンブロッ
ティングによりヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３画分を同定し、
この画分をウルトラフリー２０で約２０倍に濃縮した。
得られた濃縮液を逆相ＨＰＬＣにかけ、ヒトＮＧＦ−２
を精製した。即ち、この濃縮液をAsahipak ＯＤＰ−５
０(旭化成，日本，径８mm×１５０mm)カラムを通し、
０.１％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)を含む０−９０％ア
セトニトリルの濃度勾配にかけ、精製ヒトＮＧＦ２／Ｎ
Ｔ−３を約６０μg得た。こうして得られた組換え型ヒ
トＮＧＦ２／ＮＴ−３をＳＤＳ−ＰＡＧＥ(１５％(３
５.１：１))により分析したところ、分子量１４０００
付近にほぼ単一なバンドとして検出された(図１１)。ま
た、これはＥＰ−３８６,７５２の参考例１に示す抗体
と反応した(図１２)。図１１では、この精製過程をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで分析し、銀染色を行った図を示し、図１
２ではＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ウェスタンブロッティングを
行ったものを示した。図１１，図１２ともレーン１はヨ
ーロッパ特許出願公開第３８６,７５２号公報に記載の
方法で得られたポリペプチド(Ｉ)を、レーン２は実施例
５中の逆相クロマトグラフィーにかけたサンプルを、レ
ーン３は逆相クロマトグラフィーで素通しした画分を、
レーン４は逆相クロマトグラフィーでアセトニトリルの
濃度勾配をかけることによって溶出されてきた画分(Ｎ
ＧＦ２／ＮＴ−３画分)をそれぞれ示す。
児血清、３５μg／mlプロリン，５０μg／mlカナマイシ
ンおよび２μＭメトトレキセートを含むダルベッコ改変
培地で２×１０4細胞／cm2の濃度で播種し、５％ＣＯ2
存在下、３７℃，７日間培養した。ニワトリ胚ＤＲＧに
対する活性測定から、この培地中には、１０μg ＮＧＦ
−１当量以上の組換え型ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３が産生
されていることがわかった。この培養液は、使用時まで
−２０℃で凍結保存した。凍結保存培養上清１リットル
を遠心８０００rpm，１５分，４℃または濾過(東洋濾紙
No.２)することで細胞残渣を除き、これを終濃度が１m
Ｍ ＥＤＴＡ，０.０５％ＣＨＡＰＳとなるように調整
し、２Ｎ酢酸でpＨ６.０に補正した。これを再び遠心又
は濾過し、不溶性画分を除き陽イオン交換樹脂に通し
た。陽イオン交換樹脂としては、Ｓ−セファロース フ
ァーストフロー(ファルマシアＬＫＢ，スウェーデン)を
０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液pＨ６.０−１mＭ ＥＤ
ＴＡ−０.０５％ＣＨＡＰＳで平衡化し、これを径２.６
cm高さ１０cmのカラムに詰めたものを用いた。調製済み
培養上清を４℃で６０ml／hrの流速でこのカラムを通す
ことにより、吸着を行った。吸着後、カラムを０.１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液pＨ６.０−１mＭ ＥＤＴＡ−
０.０５％ＣＨＡＰＳを流速６０ml／hrで４時間洗浄
し、０.５Ｍ ＮaＣl−０.１Ｍリン酸ナトリウム(pＨ６.
０)−１mＭ ＥＤＴＡ−０.０５％ＣＨＡＰＳを流速５０
ml／hrで流すことにより溶出を行った。ヒトＮＧＦ２／
ＮＴ−３を含む画分をヨーロッパ特許出願公開第３８
６,７５２号公報の参考例１に記載の抗ポリペプチド
(Ｉ)Ｎ末ペプチド抗体を用いたウェスタンブロッティン
グにより決定し、これを集めウルトラフリー２０(ミリ
ポア，ＵＳＡ)により約２０倍濃縮した。得られた濃縮
液を２０mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ７.４)−０.１５Ｍ Ｎa
Ｃl−１mＭ ＥＤＴＡ−０.０５％ＣＨＡＰＳで平衡化さ
せたセファクリルＳ−１００ＨＲ(ファルマシアＬＫ
Ｂ，スウェーデン)カラム(径１.６cm×８５cm)によりゲ
ル濾過した。先に示したのと同様に、ウェスタンブロッ
ティングによりヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３画分を同定し、
この画分をウルトラフリー２０で約２０倍に濃縮した。
得られた濃縮液を逆相ＨＰＬＣにかけ、ヒトＮＧＦ−２
を精製した。即ち、この濃縮液をAsahipak ＯＤＰ−５
０(旭化成，日本，径８mm×１５０mm)カラムを通し、
０.１％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)を含む０−９０％ア
セトニトリルの濃度勾配にかけ、精製ヒトＮＧＦ２／Ｎ
Ｔ−３を約６０μg得た。こうして得られた組換え型ヒ
トＮＧＦ２／ＮＴ−３をＳＤＳ−ＰＡＧＥ(１５％(３
５.１：１))により分析したところ、分子量１４０００
付近にほぼ単一なバンドとして検出された(図１１)。ま
た、これはＥＰ−３８６,７５２の参考例１に示す抗体
と反応した(図１２)。図１１では、この精製過程をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで分析し、銀染色を行った図を示し、図１
２ではＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ウェスタンブロッティングを
行ったものを示した。図１１，図１２ともレーン１はヨ
ーロッパ特許出願公開第３８６,７５２号公報に記載の
方法で得られたポリペプチド(Ｉ)を、レーン２は実施例
５中の逆相クロマトグラフィーにかけたサンプルを、レ
ーン３は逆相クロマトグラフィーで素通しした画分を、
レーン４は逆相クロマトグラフィーでアセトニトリルの
濃度勾配をかけることによって溶出されてきた画分(Ｎ
ＧＦ２／ＮＴ−３画分)をそれぞれ示す。
【００３６】実施例６ ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３遺伝子
の動物細胞での発現(II) 参考例４で得られたプラスミドpＴＢ１０５９，pＴＢ１
３３９，および実施例１で得られたpＴＢ１３４４につ
いてサルＣＯＳ−７細胞での発現を検討した。遺伝子導
入は実施例２で示したリン酸カルシウム法により行っ
た。ただし、培地としては１０％牛胎児血清−ダルベッ
コ改変ＭＥＭ培地を用い、遺伝子導入後は、０.５％牛
胎児血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ培地を用いた。遺伝子
導入４８時間後に培地を採集した。１００μｌの培養上
清に１０μlの１００％(w／v)トリクロロ酢酸を加え冷
却(０℃１０分)することによりタンパクを沈殿させ、こ
れをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。Western blotting
を常法により行い、ＥＰ−３８６,７５２の参考例１に
示した抗ポリペプチド(Ｉ)Ｎ末ペプチド抗体を用いて組
換え体を検出した。(図１３)。この系ではpＴＢ１３３
９が最もよく組換え体を産生した。図１３において、レ
ーン１はヨーロッパ特許出願公開第３８６,７５２号公
報に記載の方法で得られたポリペプチド(Ｉ)の、レーン
２はプラスミドpＴＢ１０５９によるＣＯＳ上清の、レ
ーン３はプラスミドpＴＢ１３４４によるＣＯＳ上清
の、レーン４はプラスミドpＴＢ１３３９によるＣＯＳ
上清の結果をそれぞれ示す。
の動物細胞での発現(II) 参考例４で得られたプラスミドpＴＢ１０５９，pＴＢ１
３３９，および実施例１で得られたpＴＢ１３４４につ
いてサルＣＯＳ−７細胞での発現を検討した。遺伝子導
入は実施例２で示したリン酸カルシウム法により行っ
た。ただし、培地としては１０％牛胎児血清−ダルベッ
コ改変ＭＥＭ培地を用い、遺伝子導入後は、０.５％牛
胎児血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ培地を用いた。遺伝子
導入４８時間後に培地を採集した。１００μｌの培養上
清に１０μlの１００％(w／v)トリクロロ酢酸を加え冷
却(０℃１０分)することによりタンパクを沈殿させ、こ
れをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。Western blotting
を常法により行い、ＥＰ−３８６,７５２の参考例１に
示した抗ポリペプチド(Ｉ)Ｎ末ペプチド抗体を用いて組
換え体を検出した。(図１３)。この系ではpＴＢ１３３
９が最もよく組換え体を産生した。図１３において、レ
ーン１はヨーロッパ特許出願公開第３８６,７５２号公
報に記載の方法で得られたポリペプチド(Ｉ)の、レーン
２はプラスミドpＴＢ１０５９によるＣＯＳ上清の、レ
ーン３はプラスミドpＴＢ１３４４によるＣＯＳ上清
の、レーン４はプラスミドpＴＢ１３３９によるＣＯＳ
上清の結果をそれぞれ示す。
【００３７】実施例７ 実施例１で得られたＣＨＯ−Ｎ２−１株をそれぞれ用い
大量培養による調製を行った。調製法を実施例５を基に
し、一部以下のように改変した。培養は５％牛胎児血
清，３５μg／mlプロリン，５０μg／mlカナマイシン，
２μＭメトトレキセートを含むダルベッコ改変ＭＥＭ培
地で２×１０4／cm2の濃度で播種し、５％ＣＯ2存在
下，３７℃，７日間培養した。培養上清を採集後、１％
牛胎児血清−３５μg／mlプロリン−５０μg／mlカナマ
イシン−２μＭメトトレキセートを含むダルベッコ改変
ＭＥＭ培地／ハムＦ−１２培地(１：１混合培地)(以
下、調製培地と略す)に置き換え３〜４日間培養した。
この培養上清を採集後、さらに調製培地で３〜４日培養
し培養上清を採集した。１２０枚の１０cmシャーレから
この一連の培養で５リットルの培養上清を得ることがで
きた。これを２回くり返し１０リットルの培養上清を得
た。培養上清は−２０℃で保管した。実施例５記載の方
法で培養上清を処理し、Ｓ−セファロースカラム(径５
×２０cm)にかけた。実施例５に記載した方法により活
性画分を溶出し、１２ml／フラクションずつ分画した
(図１４)。この画分に対し、５０％飽和になるように硫
安を加え、０℃で２時間放置し、遠心(１００００rpm，
１５分 ４℃，サーバルＳＳ３４ローター(ＵＳＡ))に
より沈殿を回収した。沈殿を４０mlの２０mＭ Ｔris−
ＨＣl(pＨ７.４)１mＭ ＥＤＴＡ−０.０５％ＣＨＡＰＳ
に溶解した。ゲル濾過を行う前に遠心（１５０００rp
m，１５分 ４℃，サーバルＳＳ３４ローター）し、不
溶性物質を除いた。ゲル濾過は実施例１に記載の方法で
行った。ただし、カラムは径２.６cm×９０cmのものを
用い、流速は１００ml／h，サンプル量１０mlにした(図
１５)。溶出画分はウルトラフリー２０(ミリポア，ＵＳ
Ａ)で濃縮した。これを実施例５記載の方法で逆相クロ
マトグラフィーを行い精製した(１ml ／フラクション)
(図１６)。これらの各ステップでの精製過程を表１に示
す。こ れらについてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した図を
図１７および図１８に示した。最終標品は、ほぼ単一の
バンドを示した。以上のことから、約１０リットルの培
養上清から組換え標品が２１０μg得られたことがわか
った。なお、図１７は、銀染色の結果を、図１８は、ウ
エスタンブロッティングの結果をそれぞれ示す。図１７
および図１８において、レーン１はヨーロッパ特許出願
公開第３８６,７５２号公報に記載の方法で得られたポ
リペプチド(Ｉ)０.０１μgについての、レーン２はＣＨ
Ｏ−Ｎ２−１細胞培養上清１０μgについての、レーン
３はＳ−セファロース素通し画分１０μgについての、
レーン４はＳ−セファロース溶出画分１μgについて
の、レーン５は硫安沈殿画分１μgについての、レーン
６はゲル濾過溶出画分０.１μgについての、レーン７は
逆相ＨＰＬＣ溶出画分０.１μgについての結果をそれぞ
れ示す。なお、精製開始時は、総タンパクの０.００１
〜０.０１％程度のものが、最終的には純度９５％以上
にまで精製(効率１０4倍)されていることを示すために
ウエスタンブロッティング(図１８)と銀染色(図１７)を
並置した。
大量培養による調製を行った。調製法を実施例５を基に
し、一部以下のように改変した。培養は５％牛胎児血
清，３５μg／mlプロリン，５０μg／mlカナマイシン，
２μＭメトトレキセートを含むダルベッコ改変ＭＥＭ培
地で２×１０4／cm2の濃度で播種し、５％ＣＯ2存在
下，３７℃，７日間培養した。培養上清を採集後、１％
牛胎児血清−３５μg／mlプロリン−５０μg／mlカナマ
イシン−２μＭメトトレキセートを含むダルベッコ改変
ＭＥＭ培地／ハムＦ−１２培地(１：１混合培地)(以
下、調製培地と略す)に置き換え３〜４日間培養した。
この培養上清を採集後、さらに調製培地で３〜４日培養
し培養上清を採集した。１２０枚の１０cmシャーレから
この一連の培養で５リットルの培養上清を得ることがで
きた。これを２回くり返し１０リットルの培養上清を得
た。培養上清は−２０℃で保管した。実施例５記載の方
法で培養上清を処理し、Ｓ−セファロースカラム(径５
×２０cm)にかけた。実施例５に記載した方法により活
性画分を溶出し、１２ml／フラクションずつ分画した
(図１４)。この画分に対し、５０％飽和になるように硫
安を加え、０℃で２時間放置し、遠心(１００００rpm，
１５分 ４℃，サーバルＳＳ３４ローター(ＵＳＡ))に
より沈殿を回収した。沈殿を４０mlの２０mＭ Ｔris−
ＨＣl(pＨ７.４)１mＭ ＥＤＴＡ−０.０５％ＣＨＡＰＳ
に溶解した。ゲル濾過を行う前に遠心（１５０００rp
m，１５分 ４℃，サーバルＳＳ３４ローター）し、不
溶性物質を除いた。ゲル濾過は実施例１に記載の方法で
行った。ただし、カラムは径２.６cm×９０cmのものを
用い、流速は１００ml／h，サンプル量１０mlにした(図
１５)。溶出画分はウルトラフリー２０(ミリポア，ＵＳ
Ａ)で濃縮した。これを実施例５記載の方法で逆相クロ
マトグラフィーを行い精製した(１ml ／フラクション)
(図１６)。これらの各ステップでの精製過程を表１に示
す。こ れらについてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した図を
図１７および図１８に示した。最終標品は、ほぼ単一の
バンドを示した。以上のことから、約１０リットルの培
養上清から組換え標品が２１０μg得られたことがわか
った。なお、図１７は、銀染色の結果を、図１８は、ウ
エスタンブロッティングの結果をそれぞれ示す。図１７
および図１８において、レーン１はヨーロッパ特許出願
公開第３８６,７５２号公報に記載の方法で得られたポ
リペプチド(Ｉ)０.０１μgについての、レーン２はＣＨ
Ｏ−Ｎ２−１細胞培養上清１０μgについての、レーン
３はＳ−セファロース素通し画分１０μgについての、
レーン４はＳ−セファロース溶出画分１μgについて
の、レーン５は硫安沈殿画分１μgについての、レーン
６はゲル濾過溶出画分０.１μgについての、レーン７は
逆相ＨＰＬＣ溶出画分０.１μgについての結果をそれぞ
れ示す。なお、精製開始時は、総タンパクの０.００１
〜０.０１％程度のものが、最終的には純度９５％以上
にまで精製(効率１０4倍)されていることを示すために
ウエスタンブロッティング(図１８)と銀染色(図１７)を
並置した。
【表１】
【００３８】実施例８ 精製組換え体の生物活性(Ｉ） 実施例７で得られた最終精製標品について、参考例５で
示した方法により生物活性を測定した。コントロールと
してマウスβＮＧＦ（和光純薬)を用いた。結果を図１
９に示す。図１９において□を黒でぬりつぶした印はマ
ウスβＮＧＦの結果を、●はＮＧＦ２／ＮＴ−３の結果
をそれぞれ示す。図１９に示すようにＮＧＦ２／ＮＴ−
３は、この系においてβＮＧＦよりも活性が弱いことが
わかった。
示した方法により生物活性を測定した。コントロールと
してマウスβＮＧＦ（和光純薬)を用いた。結果を図１
９に示す。図１９において□を黒でぬりつぶした印はマ
ウスβＮＧＦの結果を、●はＮＧＦ２／ＮＴ−３の結果
をそれぞれ示す。図１９に示すようにＮＧＦ２／ＮＴ−
３は、この系においてβＮＧＦよりも活性が弱いことが
わかった。
【００３９】実施例９ 精製組換え体の生物活性(II) ラットＰＣ１２細胞に対する生物活性を測定した。活性
測定法はバイオケミカル アンド バイオフィジカル
リサーチ コミュニケーションズ １７１巻１１６〜１
２２頁(１９９０年)に記載の方法により行った。この結
果を図２０に示した。図２０において、□を黒でぬりつ
ぶした印はマウスＮＧＦβの結果を、●はＮＧＦ２／Ｎ
Ｔ−３の結果をそれぞれ示す。組換え型ＮＧＦ２はＰＣ
１２細胞に対し神経突起の伸長を惹き起こす活性は非常
に低く、マウスβＮＧＦ(和光純薬)に対して１／１０3
かそれ以下の活性であることがわかった。
測定法はバイオケミカル アンド バイオフィジカル
リサーチ コミュニケーションズ １７１巻１１６〜１
２２頁(１９９０年)に記載の方法により行った。この結
果を図２０に示した。図２０において、□を黒でぬりつ
ぶした印はマウスＮＧＦβの結果を、●はＮＧＦ２／Ｎ
Ｔ−３の結果をそれぞれ示す。組換え型ＮＧＦ２はＰＣ
１２細胞に対し神経突起の伸長を惹き起こす活性は非常
に低く、マウスβＮＧＦ(和光純薬)に対して１／１０3
かそれ以下の活性であることがわかった。
【００４０】実施例１０ 実施例１で得られたＣＨＯ−Ｎ２−１株を、実施例５と
同様に播種，培養した。培地を無血清培地（Cosmediu
m；コスモバイオ社）に交換し、さらに２日間培養し
た。１リッターの培養上清を１００個の１０−cm皿から
集めた。０.５mＭＰＭＳＦと１mＭのベンズアミジンを
集められた培養上清とカラムの緩衝液に加えて、実施例
５と同様の方法でＮＧＦ２／ＮＴ−３を精製した。逆相
ＨＰＬＣによって、保持時間が２４分(Ｐ１)，２６分
(Ｐ２)および２８分(Ｐ３)の３つのピークを与えた(図
２１)。Ｐ２とＰ３は、ニワトリ胎児ＤＲＧ神経に対す
る生物的活性を有していたが、Ｐ１は有していなかっ
た。Ｐ２蛋白質は、ＰＡＧＥにおいて大腸菌により生産
された組換えＮＧＦ−２と同時に移動したが、Ｐ３蛋白
質はそれらより少しさらに速く移動した(図２３)。Ｐ２
蛋白質のみが、ウエスタン・ブロッティングにより、抗
ポリペプチド(Ｉ)Ｎ−末端ペプチド抗体(ＥＰ−Ａ−３
８６,７５２の参考例２で得られたもの)を認識した(図
２２)。図２２において、レーン(ａ)は大腸菌形質転換
体により生産されたＮＧＦ−２を、レーン（ｂ)は逆相
ＨＰＬＣクロマトグラフィー(図２１)で得られたフラク
ション２４(Ｐ１)を、レーン(ｃ)は逆相ＨＰＬＣクロマ
トグラフィー(図２１)で得られたフラクション２６(Ｐ
２)を、レーン(ｄ)は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー
(図２１)で得られたフラクション２８(Ｐ３)をそれぞけ
示す。図２３において、レーン(ｅ)は大腸菌形質転換体
により生産されたＮＧＦを、レーン(ｆ)は逆相ＨＰＬＣ
クロマトグラフィー(図２１)で得られたフラクション２
５を、レーン(ｇ)は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー
(図２１)で得られたフラクション２６(Ｐ２)を、レーン
(ｈ)は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー(図２１)で得ら
れたフラクション２７を、レーン(ｉ)は逆相ＨＰＬＣク
ロマトグラフィー(図２１)で得られたフラクション２８
(Ｐ３)を、レーン(ｊ)は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィ
ー(図２１)で得られたフラクション２９をそれぞれ示
す。
同様に播種，培養した。培地を無血清培地（Cosmediu
m；コスモバイオ社）に交換し、さらに２日間培養し
た。１リッターの培養上清を１００個の１０−cm皿から
集めた。０.５mＭＰＭＳＦと１mＭのベンズアミジンを
集められた培養上清とカラムの緩衝液に加えて、実施例
５と同様の方法でＮＧＦ２／ＮＴ−３を精製した。逆相
ＨＰＬＣによって、保持時間が２４分(Ｐ１)，２６分
(Ｐ２)および２８分(Ｐ３)の３つのピークを与えた(図
２１)。Ｐ２とＰ３は、ニワトリ胎児ＤＲＧ神経に対す
る生物的活性を有していたが、Ｐ１は有していなかっ
た。Ｐ２蛋白質は、ＰＡＧＥにおいて大腸菌により生産
された組換えＮＧＦ−２と同時に移動したが、Ｐ３蛋白
質はそれらより少しさらに速く移動した(図２３)。Ｐ２
蛋白質のみが、ウエスタン・ブロッティングにより、抗
ポリペプチド(Ｉ)Ｎ−末端ペプチド抗体(ＥＰ−Ａ−３
８６,７５２の参考例２で得られたもの)を認識した(図
２２)。図２２において、レーン(ａ)は大腸菌形質転換
体により生産されたＮＧＦ−２を、レーン（ｂ)は逆相
ＨＰＬＣクロマトグラフィー(図２１)で得られたフラク
ション２４(Ｐ１)を、レーン(ｃ)は逆相ＨＰＬＣクロマ
トグラフィー(図２１)で得られたフラクション２６(Ｐ
２)を、レーン(ｄ)は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー
(図２１)で得られたフラクション２８(Ｐ３)をそれぞけ
示す。図２３において、レーン(ｅ)は大腸菌形質転換体
により生産されたＮＧＦを、レーン(ｆ)は逆相ＨＰＬＣ
クロマトグラフィー(図２１)で得られたフラクション２
５を、レーン(ｇ)は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー
(図２１)で得られたフラクション２６(Ｐ２)を、レーン
(ｈ)は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー(図２１)で得ら
れたフラクション２７を、レーン(ｉ)は逆相ＨＰＬＣク
ロマトグラフィー(図２１)で得られたフラクション２８
(Ｐ３)を、レーン(ｊ)は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィ
ー(図２１)で得られたフラクション２９をそれぞれ示
す。
【００４１】Ｎ末端アミノ酸を分析したところ、Ｐ２は
成熟型ＮＧＦ２／ＮＴ−３のＮ末端配列と一致したが、
Ｐ３はＮ末端５残基欠失型ＮＧＦ２／ＮＴ−３に相当す
ることが分かった〔表２〕
成熟型ＮＧＦ２／ＮＴ−３のＮ末端配列と一致したが、
Ｐ３はＮ末端５残基欠失型ＮＧＦ２／ＮＴ−３に相当す
ることが分かった〔表２〕
【表２】 ＮＤ：決定されていない
【００４２】
【発明の効果】本発明の神経成長因子のプロ領域をコー
ドするＤＮＡをヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３をコードするＤ
ＮＡの５′末端に含むように構築されたベクターを用い
ることにより、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３を安定にしかも
大量に製造することができる。
ドするＤＮＡをヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３をコードするＤ
ＮＡの５′末端に含むように構築されたベクターを用い
ることにより、ヒトＮＧＦ２／ＮＴ−３を安定にしかも
大量に製造することができる。
【００４３】
配列番号：１ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：アダプター 配列： AGCTTGCCGC CACCATGTCC ATGTTGTTCT ACACTCT 37
【００４４】 配列番号：２ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：アダプター 配列： GATCAGAGTG TAGAACAACA TGGACATGGT GGCGGCA 37
【００４５】 配列番号：３ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：アダプター 配列： CAGATCTGGG CC 12
【００４６】 配列番号：４ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：アダプター 配列： TACAGGTGAA TTCGGCCATG TCCATCTTG 29
【００４７】 配列番号：５ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：アダプター 配列： AGAGATGCGA ATTCATGTTC TTC 23
【００４８】 配列番号：６ 配列の長さ：９６９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 株名：細胞 配列： G AAT TCG GCC ATG TCC ATC TTG TTT TAT GTG ATA TTT CTC GCT TAT 46 Met Ser Ile Leu Phe Tyr Val Ile Phe Leu Ala Tyr -135 -130 CTC CGT GGC ATC CAA GGT AAC AAC ATG GAT CAA AGG AGT TTG CCA GAA 94 Leu Arg Gly Ile Gln Gly Asn Asn Met Asp Gln Arg Ser Leu Pro Glu -125 -120 -115 GAC TCG CTC AAT TCC CTC ATT ATT AAG CTG ATC CAG GCA GAT ATT TTG 142 Asp Ser Leu Asn Ser Leu Ile Ile Lys Leu Ile Gln Ala Asp Ile Leu -110 -105 -100 AAA AAC AAG CTC TCC AAG CAG ATG GTG GAC GTT AAG GAA AAT TAC CAG 190 Lys Asn Lys Leu Ser Lys Gln Met Val Asp Val Lys Glu Asn Tyr Gln -95 -90 -85 -80 AGC ACC CTG CCC AAA GCT GAG GCT CCC CGA GAG CCG GAG CGG GGA GGG 238 Ser Thr Leu Pro Lys Ala Glu Ala Pro Arg Glu Pro Glu Arg Gly Gly -75 -70 -65 CCC GCC AAG TCA GCA TTC CAG CCA GTG ATT GCA ATG GAC ACC GAA CTG 286 Pro Ala Lys Ser Ala Phe Gln Pro Val Ile Ala Met Asp Thr Glu Leu -60 -55 -50 CTG CGA CAA CAG AGA CGC TAC AAC TCA CCG CGG GTC CTG CTG AGC GAC 334 Leu Arg Gln Gln Arg Arg Tyr Asn Ser Pro Arg Val Leu Leu Ser Asp -45 -40 -35 AGC ACC CCC TTG GAG CCC CCG CCC TTG TAT CTC ATG GAG GAT TAC GTG 382 Ser Thr Pro Leu Glu Pro Pro Pro Leu Tyr Leu Met Glu Asp Tyr Val -30 -25 -20 GGC AGC CCC GTG GTG GCG AAC AGA ACA TCA CGG CGG AAA CGG TAC GCG 430 Gly Ser Pro Val Val Ala Asn Arg Thr Ser Arg Arg Lys Arg Tyr Ala -15 -10 -5 1 GAG CAT AAG AGT CAC CGA GGG GAG TAC TCG GTA TGT GAC AGT GAG AGT 478 Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys Asp Ser Glu Ser 5 10 15 CTG TGG GTG ACC GAC AAG TCA TCG GCC ATC GAC ATT CGG GGA CAC CAG 526 Leu Trp Val Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ile Asp Ile Arg Gly His Gln 20 25 30 GTC ACG GTG CTG GGG GAG ATC AAA ACG GGC AAC TCT CCC GTC AAA CAA 574 Val Thr Val Leu Gly Glu Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro Val Lys Gln 35 40 45 50 TAT TTT TAT GAA ACG CGA TGT AAG GAA GCC AGG CCG GTC AAA AAC GGT 622 Tyr Phe Tyr Glu Tyr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Val Lys Asn Gly 55 60 65 TGC AGG GGT ATT GAT GAT AAA CAC TGG AAC TCT CAG TGC AAA ACA TCC 670 Cys Arg Gly Ile Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gln Cys Lys Thr Ser 70 75 80 CAA ACC TAC GTC CGA GCA CTG ACT TCA GAG AAC AAT AAA CTC GTG GGC 718 Gln Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu Val Gly 85 90 95 TGG CGG TGG ATA CGG ATA GAC ACG TCC TGT GTG TGT GCC TTG TCG AGA 766 Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala Leu Ser Arg 100 105 110 AAA ATC GGA AGA ACA TGAATTGGCA TCTCTCCCCA TATATAAATT ATTACTTTAA 821 Lys Ile Gly Arg Thr 115 ATTATATGAT ATGCATGTAG CATATAAATG TTTATATTGT TTTTATATAT TATAAGTTGA 881 CCTTTATTTA TTAAACTTCA GCAACCCTAC AGTATATAGG CTTTTTTCTC AATAAAATCA 941 GTGTGCTTGC CTTCCCTCAG GCAGATCT 969
【００４９】 配列番号：７ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：リンカー 配列： TCACGGCGGA AGCGCTACGC GGAGCAT 27
【００５０】 配列番号：８ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：リンカー 配列： AGGAGCAAGC GCTCATCATC CCA 23
【００５１】 配列番号：９ 配列の長さ：９２３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ および ｃＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 株名：細胞 配列： TAG CTT GCC GCC ACC ATG TCC ATG TTG TTC TAC ACT CTG ATC ACA GCT 48 Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala -125 -120 TTT CTG ATC GGC ATA CAG GCG GAA CCA CAC TCA GAG AGC AAT GTC CCT 96 Phe Leu Ile Gly Ile Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro -115 -110 -100 -95 GCA GGA CAC ACC ATC CCC CAA GTC CAC TGG ACT AAA CTT CAG CAT TCC 144 Ala Gly His Thr Ile Pro Gln Val His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser -90 -85 -80 CTT GAC ACT GCC CTT CGC AGA GCC CGC AGC GCC CCG GCA GCG GCG ATA 192 Leu Asp Thr Ala Leu Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile -75 -70 -65 GCT GCA CGC GTG GCG GGG CAG ACC CGC AAC ATT ACT GTG GAC CCC AGG 240 Ala Ala Arg Val Ala Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg -60 -55 -50 CTG TTT AAA AAG CGG CGA CTC CGT TCA CCC CGT GTG CTG TTT AGC ACC 288 Leu Phe Lys Lys Arg Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr -45 -40 -35 CAG CCT CCC CGT GAA GCT GCA GAC ACT CAG GAT CTG GAC TTC GAG GTC 336 Gln Pro Pro Arg Glu Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val -30 -25 -20 -15 GGT GGT GCT GCC CCC TTC AAC AGG ACT CAC AGG AGC AAG CGC TAC GCG 384 Gly Gly Ala Ala Pro Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Tyr Ala -10 -5 1 GAG CAT AAG AGT CAC CGA GGG GAG TAC TCG GTA TGT GAC AGT GAG AGT 432 Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys Asp Ser Glu Ser 5 10 15 CTG TGG GTG ACC GAC AAG TCA TCG GCC ATC GAC ATT CGG GGA CAC CAG 480 Leu Trp Val Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ile Asp Ile Arg Gly His Gln 20 25 30 GTC ACG GTG CTG GGG GAG ATC AAA ACG GGC AAC TCT CCC GTC AAA CAA 528 Val Thr Val Leu Gly Glu Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro Val Lys Gln 35 40 45 50 TAT TTT TAT GAA ACG CGA TGT AAG GAA GCC AGG CCG GTC AAA AAC GGT 576 Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Val Lys Asn Gly 55 60 65 TGC AGG GGT ATT GAT GAT AAA CAC TGG AAC TCT CAG TGC AAA ACA TCC 624 Cys Arg Gly Ile Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gln Cys Lys Thr Ser 70 75 80 CAA ACC TAC GTC CGA GCA CTG ACT TCA GAG AAC AAT AAA CTC GTG GGC 672 Gln Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu Val Gly 85 90 95 TGG CGG TGG ATA CGG ATA GAC ACG TCC TGT GTG TGT GCC TTG TCG AGA 720 Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala Leu Ser Arg 100 105 110 AAA ATC GGA AGA ACA TGAATTGGCA TCTCTCCCCA TATATAAATT ATTACTTTAA 775 Lys Ile Gly Arg Thr 115 ATTATATGAT ATGCATGTAG CATATAAATG TTTATATTGT TTTTATATAT TATAAGTTGA 835 CCTTTATTTA TTAAACTTCA GCAACCCTAC AGTATATAGG CTTTTTTCTC AATAAAATCA 895 GTGTGCTTGC CTTCCCTCAG GCAGATCT 923
【図１】は、実施例１で得られた、プラスミドpＴＢ１
０５６の構築図を示す。
０５６の構築図を示す。
【図２】および
【図３】は、実施例１で得られた、プラスミドpＴＢ１
３３９の構築図を示す。
３３９の構築図を示す。
【図４】，
【図５】および
【図６】は、実施例１で得られた、プラスミドpＴＢ１
３４４の構築図を示す。
３４４の構築図を示す。
【図７】および
【図８】は、参考例４で得られた、プラスミドｐＴＢ１
３３９上に存在するＮＧＦ２／ＮＴ−３のプロ領域をコ
ードするＤＮＡ、ＮＧＦ２／ＮＴ−３をコードするＤＮ
Ａおよびその付近のＤＮＡ配列を示す。
３３９上に存在するＮＧＦ２／ＮＴ−３のプロ領域をコ
ードするＤＮＡ、ＮＧＦ２／ＮＴ−３をコードするＤＮ
Ａおよびその付近のＤＮＡ配列を示す。
【図９】および
【図１０】は、実施例１で得られたプラスミドpＴＢ１
３４４上に存在するＮＧＦのプロ領域をコードするＤＮ
Ａ，ＮＧＦ２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡおよびその
付近のＤＮＡ配列を示す。
３４４上に存在するＮＧＦのプロ領域をコードするＤＮ
Ａ，ＮＧＦ２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡおよびその
付近のＤＮＡ配列を示す。
【図１１】は、実施例５で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
の結果を示す。
の結果を示す。
【図１２】は、実施例５で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
の結果を示す。
の結果を示す。
【図１３】は、実施例６で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
の結果を示す。
の結果を示す。
【図１４】は、実施例７で得られた、ＣＨＯ−Ｎ２−１
株の培養上清のＳ−セファロースカラムの溶出画分を示
す。
株の培養上清のＳ−セファロースカラムの溶出画分を示
す。
【図１５】は、実施例７で得られた、ゲル濾過の溶出画
分を示す。
分を示す。
【図１６】は、実施例７で得られた、逆相クロマトグラ
フィーの結果を示す。
フィーの結果を示す。
【図１７】は、実施例７で得られた、各精製過程におけ
る生成物についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
る生成物についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１８】は、実施例７で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
の結果を示す。
の結果を示す。
【図１９】は、実施例８で得られた、生物活性の測定結
果を示す。
果を示す。
【図２０】は、実施例９で得られた、生物活性の測定結
果を示す。
果を示す。
【図２１】は、実施例１０で得られた、逆相ＨＰＬＣク
ロマトグラフィーの結果を示す。
ロマトグラフィーの結果を示す。
【図２２】は、実施例１０で得られた、ウエスタン・ブ
ロッティングの結果を示す。
ロッティングの結果を示す。
【図２３】は、実施例１０で得られた、ＰＡＧＥの結果
を示す。
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (56)参考文献 特開 平３−183485（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−139285（ＪＰ，Ａ) 国際公開92／20365（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 C12N 5/10 C12P 21/02 C07K 14/71 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (9)
- 【請求項１】ヒト神経成長因子２をコードするＤＮＡの
５'末端に神経成長因子のプロ領域をコードするＤＮＡ
を有するＤＮＡを含む組換えベクター。 - 【請求項２】神経成長因子のプロ領域がヒト神経成長因
子のプロ領域である請求項１記載のベクター。 - 【請求項３】請求項１または請求項２記載のベクターで
形質転換された形質転換体。 - 【請求項４】宿主が動物細胞である請求項３記載の形質
転換体。 - 【請求項５】宿主がチャイニーズハムスターＣＨＯ細胞
である請求項４記載の形質転換体。 - 【請求項６】請求項３記載の形質転換体を培地に培養す
ることを特徴とするヒト神経成長因子２の製造法。 - 【請求項７】配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有
するタンパク質をコードするＤＮＡを含む請求項１記載
の組換えベクター。 - 【請求項８】配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有
するタンパク質をコードするＤＮＡが配列番号：９で表
される塩基配列の第１６番目ないし第７３５番目の塩基
配列を有するＤＮＡである請求項７記載の組換えベクタ
ー。 - 【請求項９】ＣＨＯ−Ｎ２−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−３２
５５）である請求項３記載の形質転換体。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02920992A JP3287869B2 (ja) | 1991-02-18 | 1992-02-17 | ヒト神経成長因子２の製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3-23579 | 1991-02-18 | ||
| JP2357991 | 1991-02-18 | ||
| JP02920992A JP3287869B2 (ja) | 1991-02-18 | 1992-02-17 | ヒト神経成長因子２の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05103675A JPH05103675A (ja) | 1993-04-27 |
| JP3287869B2 true JP3287869B2 (ja) | 2002-06-04 |
Family
ID=12114473
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02920992A Expired - Fee Related JP3287869B2 (ja) | 1991-02-18 | 1992-02-17 | ヒト神経成長因子２の製造法 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP0499993B1 (ja) |
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| CA (1) | CA2061362C (ja) |
| DE (1) | DE69220259T2 (ja) |
| DK (1) | DK0499993T3 (ja) |
| ES (1) | ES2104743T3 (ja) |
| GR (1) | GR3024350T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| EP0625574A1 (en) * | 1993-05-19 | 1994-11-23 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Production for biologically active polypeptide |
| JP4671372B2 (ja) * | 1996-11-15 | 2011-04-13 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | ニューロトロフィンの精製 |
| EP1305040B1 (en) * | 2000-07-28 | 2009-09-09 | Christopher J. Murphy | Transplant media |
| US20070207209A1 (en) * | 2004-08-27 | 2007-09-06 | Murphy Christopher J | Trophic factor combinations for nervous system treatment |
| EP1926746A1 (en) * | 2005-09-23 | 2008-06-04 | Associazione Levi-Montalcini A.P.S. | Method for the production of biologically active rhngf |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6709837B1 (en) * | 1989-03-10 | 2004-03-23 | Takeda Chemical Industries, Inc. | Polypeptide and production thereof |
| GR1000980B (el) * | 1989-08-30 | 1993-03-31 | Max Planck Gesellschaft | Νευροτροφινη-3,ενας νεος neυροτροφικος παραγοντας που σχετιζεται με τον παραγοντα αναπτυξης νευρων και τον νευροτροφικο παραγοντα που προερχεται απο τον εγκεφαλο. |
-
1992
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- 1992-02-15 ES ES92102555T patent/ES2104743T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-15 AT AT92102555T patent/ATE154389T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-02-15 EP EP92102555A patent/EP0499993B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-15 DK DK92102555.7T patent/DK0499993T3/da active
- 1992-02-17 JP JP02920992A patent/JP3287869B2/ja not_active Expired - Fee Related
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