JP2003325188A - サイトカイン遺伝子組換えカイコおよびそのタンパク質の製造方法 - Google Patents
サイトカイン遺伝子組換えカイコおよびそのタンパク質の製造方法Info
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- JP2003325188A JP2003325188A JP2003045918A JP2003045918A JP2003325188A JP 2003325188 A JP2003325188 A JP 2003325188A JP 2003045918 A JP2003045918 A JP 2003045918A JP 2003045918 A JP2003045918 A JP 2003045918A JP 2003325188 A JP2003325188 A JP 2003325188A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 カイコを用いた組換え型サイトカインの製造
において、活性のあるサイトカインを絹糸腺または繭糸
に産生させることで、高純度のネコインターフェロンな
どのサイトカインを簡便に製造できるようにする。 【解決手段】 絹糸腺で機能するプロモーターに連結し
たサイトカイン遺伝子とトランスポゾン由来配列などカ
イコへの遺伝子導入に必要な配列と連結した遺伝子配列
を含む遺伝子組換えベクターを用いて、サイトカイン遺
伝子をカイコ染色体へ導入し、遺伝子組換えカイコを得
る。このカイコまたはその子孫の絹糸腺または繭からサ
イトカインを抽出し精製する。
において、活性のあるサイトカインを絹糸腺または繭糸
に産生させることで、高純度のネコインターフェロンな
どのサイトカインを簡便に製造できるようにする。 【解決手段】 絹糸腺で機能するプロモーターに連結し
たサイトカイン遺伝子とトランスポゾン由来配列などカ
イコへの遺伝子導入に必要な配列と連結した遺伝子配列
を含む遺伝子組換えベクターを用いて、サイトカイン遺
伝子をカイコ染色体へ導入し、遺伝子組換えカイコを得
る。このカイコまたはその子孫の絹糸腺または繭からサ
イトカインを抽出し精製する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、サイトカイン遺伝
子が染色体に組み込まれたカイコを利用した組換え型サ
イトカインの製造方法に関する。また、絹糸腺または繭
糸に組換え型サイトカインを産生する性質を持つ遺伝子
組換えカイコ、ならびに、その組換えカイコを作製する
ためのカイコ染色体への外来遺伝子導入用ベクターに関
する。
子が染色体に組み込まれたカイコを利用した組換え型サ
イトカインの製造方法に関する。また、絹糸腺または繭
糸に組換え型サイトカインを産生する性質を持つ遺伝子
組換えカイコ、ならびに、その組換えカイコを作製する
ためのカイコ染色体への外来遺伝子導入用ベクターに関
する。
【０００２】
【従来の技術】近年、遺伝子組換え技術を利用した組換
え型タンパク質の製造に関する検討が、精力的に行わ
れ、得られた組換え型タンパク質は、医薬、診断薬、食
品、化成品製造など幅広い分野で活用されている。従来
の方法では、遺伝子組換えタンパク質は、多くの場合、
そのアミノ酸配列をコードする遺伝子を、細菌、酵母、
またはCOS細胞のようなほ乳類由来の細胞などに導入
し、次に培地中でその細胞を増殖させた後、合成された
タンパク質を回収することで生産されている。細菌また
は酵母の系では、翻訳後修飾に問題があり、タンパク質
を十分機能する形で合成できないことがある。また、ほ
乳類細胞は、タンパク質を機能する形で合成できること
が多いが、一般的に増殖させるのが困難で産生量も低く
経済的ではない。
え型タンパク質の製造に関する検討が、精力的に行わ
れ、得られた組換え型タンパク質は、医薬、診断薬、食
品、化成品製造など幅広い分野で活用されている。従来
の方法では、遺伝子組換えタンパク質は、多くの場合、
そのアミノ酸配列をコードする遺伝子を、細菌、酵母、
またはCOS細胞のようなほ乳類由来の細胞などに導入
し、次に培地中でその細胞を増殖させた後、合成された
タンパク質を回収することで生産されている。細菌また
は酵母の系では、翻訳後修飾に問題があり、タンパク質
を十分機能する形で合成できないことがある。また、ほ
乳類細胞は、タンパク質を機能する形で合成できること
が多いが、一般的に増殖させるのが困難で産生量も低く
経済的ではない。
【０００３】一方、昆虫または昆虫細胞を用いた遺伝子
組み換えタンパク質の生産では、酵素や生理活性を持つ
有用タンパク質等が、比較的安価に量産でき、ほ乳類に
近いタンパク質の翻訳後修飾が得られることが知られて
いる。具体的には、外来タンパク質遺伝子を組み込んだ
バキュロウイルスを、昆虫または昆虫細胞に感染させる
方法で、組換え型タンパク質が比較的安価に量産が可能
であり、医薬品として製品化された生理活性タンパク質
も知られている（特開昭61-9288号公報、特開昭61-9297
号公報）。
組み換えタンパク質の生産では、酵素や生理活性を持つ
有用タンパク質等が、比較的安価に量産でき、ほ乳類に
近いタンパク質の翻訳後修飾が得られることが知られて
いる。具体的には、外来タンパク質遺伝子を組み込んだ
バキュロウイルスを、昆虫または昆虫細胞に感染させる
方法で、組換え型タンパク質が比較的安価に量産が可能
であり、医薬品として製品化された生理活性タンパク質
も知られている（特開昭61-9288号公報、特開昭61-9297
号公報）。
【０００４】免疫調節作用を持つ生理活性物質であり医
薬用途で注目されているサイトカイン類の生産について
挙げるならば、特開平3-139276号公報、特開平9-234085
号公報においてそれぞれネコインターフェロン−ω遺伝
子、イヌインターフェロン−γ遺伝子を組み込んだBmNP
Vを、カイコに接種する方法が開示されている。また、
インターフェロン以外のタンパク質の昆虫における生産
の例としては、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞
によるヒトコラーゲンの生産方法も知られている（特開
平8-23979号公報）。
薬用途で注目されているサイトカイン類の生産について
挙げるならば、特開平3-139276号公報、特開平9-234085
号公報においてそれぞれネコインターフェロン−ω遺伝
子、イヌインターフェロン−γ遺伝子を組み込んだBmNP
Vを、カイコに接種する方法が開示されている。また、
インターフェロン以外のタンパク質の昆虫における生産
の例としては、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞
によるヒトコラーゲンの生産方法も知られている（特開
平8-23979号公報）。
【０００５】しかし、従来の昆虫または昆虫細胞を用い
た組換えタンパク質の生産技術では、外来遺伝子の導入
にウイルスを用いることから、その不活性化や封じ込め
が必要であり、また、ウイルス接種が煩雑であるなどの
問題がある。また、組換えタンパク質が体液中に産生さ
れるため、目的の組換えタンパク質を、カイコ体液由来
の大量の夾雑タンパク質から精製することが必要であ
り、このため高純度な組換えタンパク質を得ることが困
難である。
た組換えタンパク質の生産技術では、外来遺伝子の導入
にウイルスを用いることから、その不活性化や封じ込め
が必要であり、また、ウイルス接種が煩雑であるなどの
問題がある。また、組換えタンパク質が体液中に産生さ
れるため、目的の組換えタンパク質を、カイコ体液由来
の大量の夾雑タンパク質から精製することが必要であ
り、このため高純度な組換えタンパク質を得ることが困
難である。
【０００６】一方、近年、昆虫染色体への外来遺伝子の
組換えが試みられ、核多核体病ウイルスの一種であるAu
tographa californica nuclear polyhedrosis virus (A
cNPV)のDNAを用いて、カイコフィブロインL鎖遺伝子に
クラゲ緑色蛍光タンパク質遺伝子を付加した融合遺伝子
を、相同組み換えにより、カイコ染色体上に導入し、発
現させる方法が開発され（Genes Dev.,13,511-516,199
9）、その技術を用いたヒト・コラーゲン遺伝子を導入
したカイコおよびその製造方法が開示されている（特開
2001-161214号公報）。
組換えが試みられ、核多核体病ウイルスの一種であるAu
tographa californica nuclear polyhedrosis virus (A
cNPV)のDNAを用いて、カイコフィブロインL鎖遺伝子に
クラゲ緑色蛍光タンパク質遺伝子を付加した融合遺伝子
を、相同組み換えにより、カイコ染色体上に導入し、発
現させる方法が開発され（Genes Dev.,13,511-516,199
9）、その技術を用いたヒト・コラーゲン遺伝子を導入
したカイコおよびその製造方法が開示されている（特開
2001-161214号公報）。
【０００７】また最近、外来遺伝子を、鱗翅目昆虫由来
のトランスポゾンであるpiggyBacを用いてカイコ染色体
へ安定に導入し、その外来遺伝子がコードするタンパク
質を発現させる方法が、クラゲ緑色蛍光タンパク質をモ
デルとして研究され、交配により子孫へと遺伝子が安定
に伝わることも確認された（Nature Biotechnology 18,
81-84,2000）。
のトランスポゾンであるpiggyBacを用いてカイコ染色体
へ安定に導入し、その外来遺伝子がコードするタンパク
質を発現させる方法が、クラゲ緑色蛍光タンパク質をモ
デルとして研究され、交配により子孫へと遺伝子が安定
に伝わることも確認された（Nature Biotechnology 18,
81-84,2000）。
【０００８】しかし、上記のAcNPVを用いた緑色蛍光タ
ンパク質は、フィブロインL鎖ポリペプチドと融合して
いるため、発現させた組換え型緑色蛍光タンパク質だけ
を回収することが困難であるという問題点がある。ま
た、この手法でフィブロインL鎖ポリペプチドとサイト
カインなどを融合タンパクとして産生させた場合は、生
理活性が低下するなどの問題点がある。次に、トランス
ポゾンpiggyBacを用いた例では、緑色蛍光タンパク質
は、産生量が十分ではなく、かつ、カイコ全身に産生さ
れるため、発現させた組換え型緑色蛍光タンパク質を高
純度な形で回収するためには、高度な精製技術を必要と
することから、経済的に問題があった。
ンパク質は、フィブロインL鎖ポリペプチドと融合して
いるため、発現させた組換え型緑色蛍光タンパク質だけ
を回収することが困難であるという問題点がある。ま
た、この手法でフィブロインL鎖ポリペプチドとサイト
カインなどを融合タンパクとして産生させた場合は、生
理活性が低下するなどの問題点がある。次に、トランス
ポゾンpiggyBacを用いた例では、緑色蛍光タンパク質
は、産生量が十分ではなく、かつ、カイコ全身に産生さ
れるため、発現させた組換え型緑色蛍光タンパク質を高
純度な形で回収するためには、高度な精製技術を必要と
することから、経済的に問題があった。
【０００９】これまでに、サイトカイン遺伝子など生理
活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をカイコ染
色体に導入し、目的タンパク質を発現させた例は知られ
ていない。また、カイコ体液以外の部位である絹糸腺や
カイコの分泌物である絹糸から、組換え型のサイトカイ
ンを回収し、得られたサイトカインの生理活性を確認し
た例はない。また、こうした性質を、遺伝することので
きるカイコについても前例はない。
活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をカイコ染
色体に導入し、目的タンパク質を発現させた例は知られ
ていない。また、カイコ体液以外の部位である絹糸腺や
カイコの分泌物である絹糸から、組換え型のサイトカイ
ンを回収し、得られたサイトカインの生理活性を確認し
た例はない。また、こうした性質を、遺伝することので
きるカイコについても前例はない。
【００１０】すなわち、このような昆虫染色体への外来
遺伝子の組換え技術においては、生産された組換え型タ
ンパク質の生産量はまだ十分ではなく、さらに、得られ
た組換え型タンパク質を生理活性を保持した形で回収す
る点において大きな課題がある。
遺伝子の組換え技術においては、生産された組換え型タ
ンパク質の生産量はまだ十分ではなく、さらに、得られ
た組換え型タンパク質を生理活性を保持した形で回収す
る点において大きな課題がある。
【００１１】
【特許文献１】特開昭61-9288号公報
【特許文献２】特開昭61-9297号公報
【特許文献３】特開平3-139276号公報
【特許文献４】特開平9-234085号公報
【特許文献５】特開平8-23979号公報
【特許文献６】特開2001-161214号公報
【００１２】
【非特許文献１】Genes Dev.,13,511-516,1999
【非特許文献２】Nature Biotechnology 18,81-84,2000
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】昆虫を用いた組換え型
タンパク質の生産技術は、精力的に研究されているが、
外来遺伝子を組み込んだ組換えバキュロウイルスの封じ
込めの必要があり、また、組換えウイルスの接種が煩雑
であるなどの課題がある。従って、ウイルスを用いない
カイコにおけるサイトカインの生産が望まれる。また、
ウイルスを用いたカイコにおける組換えタンパク質の生
産では、大量の夾雑物を含む体液より目的タンパク質を
抽出、精製することが困難である点に大きな課題があっ
た。カイコ染色体に外来遺伝子を導入する組換えタンパ
ク質の製造技術の検討が行われているが、組換え型タン
パク質の生産量は低く、さらに、目的の組換え型タンパ
ク質を活性のある形で回収できないという課題があっ
た。
タンパク質の生産技術は、精力的に研究されているが、
外来遺伝子を組み込んだ組換えバキュロウイルスの封じ
込めの必要があり、また、組換えウイルスの接種が煩雑
であるなどの課題がある。従って、ウイルスを用いない
カイコにおけるサイトカインの生産が望まれる。また、
ウイルスを用いたカイコにおける組換えタンパク質の生
産では、大量の夾雑物を含む体液より目的タンパク質を
抽出、精製することが困難である点に大きな課題があっ
た。カイコ染色体に外来遺伝子を導入する組換えタンパ
ク質の製造技術の検討が行われているが、組換え型タン
パク質の生産量は低く、さらに、目的の組換え型タンパ
ク質を活性のある形で回収できないという課題があっ
た。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意検討の
結果、目的とするタンパク質をコードする遺伝子がカイ
コ絹糸腺特異的に発現するプロモーターの下流に結合し
た構造を持つＤＮＡ配列を、トランスポゾン由来のＤＮ
Ａを利用してカイコ染色体に導入することで、目的タン
パク質が、絹糸腺または繭糸中に生理活性を保持した形
で大量に生産されることを見いだし本発明に至った。本
発明では、組換えタンパク質は、大量の夾雑物を含まな
い絹糸腺または絹糸から回収することが可能なため、目
的タンパク質の精製が容易であるという利点がある。さ
らに、バキュロウイルスのようなウイルスを使用しない
ことから、ウイルスの不活化が不要であり、簡便かつ安
全に組換えタンパク質の生産を実施することが可能とな
る。
結果、目的とするタンパク質をコードする遺伝子がカイ
コ絹糸腺特異的に発現するプロモーターの下流に結合し
た構造を持つＤＮＡ配列を、トランスポゾン由来のＤＮ
Ａを利用してカイコ染色体に導入することで、目的タン
パク質が、絹糸腺または繭糸中に生理活性を保持した形
で大量に生産されることを見いだし本発明に至った。本
発明では、組換えタンパク質は、大量の夾雑物を含まな
い絹糸腺または絹糸から回収することが可能なため、目
的タンパク質の精製が容易であるという利点がある。さ
らに、バキュロウイルスのようなウイルスを使用しない
ことから、ウイルスの不活化が不要であり、簡便かつ安
全に組換えタンパク質の生産を実施することが可能とな
る。
【００１５】すなわち、本発明は、染色体にサイトカイ
ン遺伝子を組み込んだ遺伝子組換えカイコを作製し、そ
の絹糸腺または繭糸からサイトカインを回収することを
特徴とする組換え型サイトカインの製造方法に関するも
のである。さらには、サイトカイン遺伝子が組み込まれ
た遺伝子組換えカイコ、および、カイコへのサイトカイ
ン遺伝子導入に用いられる遺伝子組み換えベクターに関
するものである。
ン遺伝子を組み込んだ遺伝子組換えカイコを作製し、そ
の絹糸腺または繭糸からサイトカインを回収することを
特徴とする組換え型サイトカインの製造方法に関するも
のである。さらには、サイトカイン遺伝子が組み込まれ
た遺伝子組換えカイコ、および、カイコへのサイトカイ
ン遺伝子導入に用いられる遺伝子組み換えベクターに関
するものである。
【００１６】
【発明の実施の形態】サイトカインは、様々な細胞によ
り産生され、造血細胞や免疫細胞に対し免疫調節作用、
抗ウイルス作用、血球細胞増殖作用を持つタンパク質で
ある。その作用は的確な高次構造を形成し細胞膜上の特
異的な受容体に結合することにより発揮される。現在ま
でにその作用の特徴からヒトをはじめとする動物に対す
る臨床応用がなされている。
り産生され、造血細胞や免疫細胞に対し免疫調節作用、
抗ウイルス作用、血球細胞増殖作用を持つタンパク質で
ある。その作用は的確な高次構造を形成し細胞膜上の特
異的な受容体に結合することにより発揮される。現在ま
でにその作用の特徴からヒトをはじめとする動物に対す
る臨床応用がなされている。
【００１７】本発明のサイトカイン類としては特に限定
されないが、カイコ体内で発現したときにその生理活性
が保持されるサイトカイン類であればよく、免疫調節作
用、抗ウイルス作用、血球細胞増殖作用などを持つ生理
活性物質であり、医薬・医療用途で注目されているタン
パク質、例えばヒトインターフェロン−α、β、γ(J.I
nterferon Res.5,521-526,1985 ,Nucleic Acids Res.1
0,2487-2501,1982)、ヒトインターロイキン−１２(J.Im
munol.146,3074-3081,1991)、ヒト顆粒球コロニー刺激
因子(Nature,319,415-418,1986)、ヒトエリスロポイエ
チン(Nature,313,806-810,1985)、ヒトトロンボポエチ
ン(Cell.77,1117-1124,1994)、ネコインターフェロン−
ω(Biosci.Biotech.Biochem.,56,211-214,1992、GenBan
k データベース登録番号E04599)、
されないが、カイコ体内で発現したときにその生理活性
が保持されるサイトカイン類であればよく、免疫調節作
用、抗ウイルス作用、血球細胞増殖作用などを持つ生理
活性物質であり、医薬・医療用途で注目されているタン
パク質、例えばヒトインターフェロン−α、β、γ(J.I
nterferon Res.5,521-526,1985 ,Nucleic Acids Res.1
0,2487-2501,1982)、ヒトインターロイキン−１２(J.Im
munol.146,3074-3081,1991)、ヒト顆粒球コロニー刺激
因子(Nature,319,415-418,1986)、ヒトエリスロポイエ
チン(Nature,313,806-810,1985)、ヒトトロンボポエチ
ン(Cell.77,1117-1124,1994)、ネコインターフェロン−
ω(Biosci.Biotech.Biochem.,56,211-214,1992、GenBan
k データベース登録番号E04599)、
【００１８】ネコエリスロポエチン（GenBankデータベ
ース登録番号 FDU00685)、ネコ顆粒球コロニー刺激因子
（Gene,274,263-269,2001）、イヌインターフェロン−
γ(GenBankデータベース登録番号 S41201)、イヌインタ
ーロイキン−１２（特開平10−36397号公報）、イヌ顆
粒球コロニー刺激因子（米国特許第5606024号）などが
挙げられる。サイトカイン類として好ましくは、インタ
ーフェロン類またはコロニー刺激因子類であり、これら
にはインターフェロン−α、β、γ、ω、τや顆粒球コ
ロニー刺激因子、顆粒球・単球コロニー刺激因子、単球
コロニー刺激因子、エリスロポイエチン、トロンボポイ
エチンなどが含まれる。さらに好ましくは、ネコインタ
ーフェロン−ω、ネコ顆粒球コロニー刺激因子、ヒトイ
ンターフェロン−βである。
ース登録番号 FDU00685)、ネコ顆粒球コロニー刺激因子
（Gene,274,263-269,2001）、イヌインターフェロン−
γ(GenBankデータベース登録番号 S41201)、イヌインタ
ーロイキン−１２（特開平10−36397号公報）、イヌ顆
粒球コロニー刺激因子（米国特許第5606024号）などが
挙げられる。サイトカイン類として好ましくは、インタ
ーフェロン類またはコロニー刺激因子類であり、これら
にはインターフェロン−α、β、γ、ω、τや顆粒球コ
ロニー刺激因子、顆粒球・単球コロニー刺激因子、単球
コロニー刺激因子、エリスロポイエチン、トロンボポイ
エチンなどが含まれる。さらに好ましくは、ネコインタ
ーフェロン−ω、ネコ顆粒球コロニー刺激因子、ヒトイ
ンターフェロン−βである。
【００１９】ネコインターフェロン-ω遺伝子は、例え
ばE.Coli(pFeIFN1)（微工研条寄第1633号）から抽出し
たプラスミドから切り出すことで得ることができる。ま
たは、切り出したネコインターフェロン-ω遺伝子を、
カイコのクローニングベクター（T.Horiuchiら、Agric.
Biol.Chem.,51,1573-1580,1987)に連結して作製した組
換えプラスミドとカイコ多核体病ウイルスＤＮＡとを、
カイコ樹立細胞にコ・トランスフェクションして作製し
たrBNV100から得ることも可能である。
ばE.Coli(pFeIFN1)（微工研条寄第1633号）から抽出し
たプラスミドから切り出すことで得ることができる。ま
たは、切り出したネコインターフェロン-ω遺伝子を、
カイコのクローニングベクター（T.Horiuchiら、Agric.
Biol.Chem.,51,1573-1580,1987)に連結して作製した組
換えプラスミドとカイコ多核体病ウイルスＤＮＡとを、
カイコ樹立細胞にコ・トランスフェクションして作製し
たrBNV100から得ることも可能である。
【００２０】ネコ顆粒球コロニー刺激因子遺伝子はネコ
腎臓由来の培養細胞であるCRFK細胞をLPSで刺激した
後、その細胞よりmRNAを回収し、さらに逆転写により得
られたcDNAを鋳型に、GenBank データベース登録番号AB
042552を参考に設定したプライマーを用いてPCRにより
得ることができる。ヒトインターフェロン−β遺伝子
は、そのcDNAをコードするプラスミドpORF-hIFN-β（In
vivogen社）から切り出すことで取得できる。
腎臓由来の培養細胞であるCRFK細胞をLPSで刺激した
後、その細胞よりmRNAを回収し、さらに逆転写により得
られたcDNAを鋳型に、GenBank データベース登録番号AB
042552を参考に設定したプライマーを用いてPCRにより
得ることができる。ヒトインターフェロン−β遺伝子
は、そのcDNAをコードするプラスミドpORF-hIFN-β（In
vivogen社）から切り出すことで取得できる。
【００２１】本発明におけるカイコ染色体への遺伝子導
入方法については、遺伝子が安定に染色体に組み込ま
れ、発現し、交配により子孫にも安定に遺伝子が伝わる
ような遺伝子導入方法であればよく、カイコ卵にマイク
ロインジェクションする方法、遺伝子銃を用いる方法な
どを用いることができるが、好ましくは、トランスポザ
ーゼ遺伝子を含むヘルパープラスミド（Nature Biotech
nology 18, 81-84, 2000）と同時に目的遺伝子を含むカ
イコ染色体への外来遺伝子導入用ベクターをカイコ卵に
マイクロインジェクションする方法が採用される。
入方法については、遺伝子が安定に染色体に組み込ま
れ、発現し、交配により子孫にも安定に遺伝子が伝わる
ような遺伝子導入方法であればよく、カイコ卵にマイク
ロインジェクションする方法、遺伝子銃を用いる方法な
どを用いることができるが、好ましくは、トランスポザ
ーゼ遺伝子を含むヘルパープラスミド（Nature Biotech
nology 18, 81-84, 2000）と同時に目的遺伝子を含むカ
イコ染色体への外来遺伝子導入用ベクターをカイコ卵に
マイクロインジェクションする方法が採用される。
【００２２】目的遺伝子は、マイクロインジェクション
されたカイコ卵から孵化し成長した組換えカイコにおい
て生殖細胞へ導入される。こうして得られた組換えカイ
コの子孫は、その染色体上に目的遺伝子を安定に保持す
ることが可能である。本発明で得られる遺伝子組換えカ
イコは、通常のカイコと同様な方法で、継代維持可能で
ある。すなわち、卵を通常の条件で催青し、孵化した蟻
蚕を人工飼料等へ掃立てし、通常のカイコと同様な条件
で飼育することで５令カイコまで飼育できる。
されたカイコ卵から孵化し成長した組換えカイコにおい
て生殖細胞へ導入される。こうして得られた組換えカイ
コの子孫は、その染色体上に目的遺伝子を安定に保持す
ることが可能である。本発明で得られる遺伝子組換えカ
イコは、通常のカイコと同様な方法で、継代維持可能で
ある。すなわち、卵を通常の条件で催青し、孵化した蟻
蚕を人工飼料等へ掃立てし、通常のカイコと同様な条件
で飼育することで５令カイコまで飼育できる。
【００２３】本発明で得られる遺伝子組換えカイコは、
通常のカイコと同様に蛹化し、繭を作ることができる。
蛹の段階で雌雄を区別し、発蛾したのち雌雄を交尾さ
せ、翌日採卵する。卵は通常のカイコ卵と同様に保存す
ることが可能である。本発明の遺伝子組換えカイコは、
こうした飼育を繰り返すことで継代することが可能であ
り、また、大量に増やすことが可能である。用いるカイ
コ染色体への外来遺伝子導入ベクターについては、ウイ
ルスベクター、トランスポゾン由来ＤＮＡ配列を含んだ
ベクター、または染色体には組み込まれないプラスミド
ベクターなどが利用できる。好ましくはトランスポゾン
由来ＤＮＡ配列を含んだベクターが用いられる。
通常のカイコと同様に蛹化し、繭を作ることができる。
蛹の段階で雌雄を区別し、発蛾したのち雌雄を交尾さ
せ、翌日採卵する。卵は通常のカイコ卵と同様に保存す
ることが可能である。本発明の遺伝子組換えカイコは、
こうした飼育を繰り返すことで継代することが可能であ
り、また、大量に増やすことが可能である。用いるカイ
コ染色体への外来遺伝子導入ベクターについては、ウイ
ルスベクター、トランスポゾン由来ＤＮＡ配列を含んだ
ベクター、または染色体には組み込まれないプラスミド
ベクターなどが利用できる。好ましくはトランスポゾン
由来ＤＮＡ配列を含んだベクターが用いられる。
【００２４】トランスポゾン由来のDNAとしては、ショ
ウジョウバエ由来のトランスポゾンmariner（Third Int
ernational workshop on transgenesis of invertebrat
e organisms,p37-38,1999）, Minos（Insect Mol.Biol.
9,277-281,2000）や鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンで
あるpiggyBac（Nature Biotechnology 18,81-84,2000)
などを用いることが可能であるが、鱗翅目昆虫由来のト
ランスポゾンであるpiggyBac由来のＤＮＡ配列を持った
トランスポゾンが好適に使用される。
ウジョウバエ由来のトランスポゾンmariner（Third Int
ernational workshop on transgenesis of invertebrat
e organisms,p37-38,1999）, Minos（Insect Mol.Biol.
9,277-281,2000）や鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンで
あるpiggyBac（Nature Biotechnology 18,81-84,2000)
などを用いることが可能であるが、鱗翅目昆虫由来のト
ランスポゾンであるpiggyBac由来のＤＮＡ配列を持った
トランスポゾンが好適に使用される。
【００２５】piggyBac由来のDNA配列の構造としては、T
TAA配列を含む１対の末端逆位配列が必須であり、そのD
NA配列の間にサイトカイン遺伝子など外来遺伝子が挿入
された構造を有するものである。トランスポゾン由来の
DNA配列を利用して外来遺伝子をカイコ染色体へ導入す
るためには、さらにtransposaseを利用することが好ま
しい。例えば、piggyBac由来のtransposaseを発現する
ことが可能なDNAを同時に導入することで、カイコ細胞
内において転写・翻訳されたtransposaseがその２対の
末端逆位配列を認識してその間の遺伝子断片を切り出
し、カイコ染色体へと転移させることにより、カイコ染
色体へ遺伝子が導入される頻度を著しく向上させること
ができる。
TAA配列を含む１対の末端逆位配列が必須であり、そのD
NA配列の間にサイトカイン遺伝子など外来遺伝子が挿入
された構造を有するものである。トランスポゾン由来の
DNA配列を利用して外来遺伝子をカイコ染色体へ導入す
るためには、さらにtransposaseを利用することが好ま
しい。例えば、piggyBac由来のtransposaseを発現する
ことが可能なDNAを同時に導入することで、カイコ細胞
内において転写・翻訳されたtransposaseがその２対の
末端逆位配列を認識してその間の遺伝子断片を切り出
し、カイコ染色体へと転移させることにより、カイコ染
色体へ遺伝子が導入される頻度を著しく向上させること
ができる。
【００２６】本発明において用いるサイトカイン遺伝子
をカイコ染色体に導入する目的で使用される外来遺伝子
導入ベクターは、サイトカインの発現を的確に制御する
ように設計されるならば特に限定されないが、通常は、
サイトカイン遺伝子に対して絹糸腺特異的に発現するプ
ロモーターを上流に、任意のポリＡ配列を下流に連結し
た構造を持ち、これら遺伝子配列の外側に、１対のトラ
ンスポゾン由来のＤＮＡ配列を有する。さらにはプロモ
ーターとの間に任意の遺伝子由来のシグナル配列などを
連結してもよく、ポリＡとの間にも任意の遺伝子配列を
連結してもよい。また人工的に設計、合成された遺伝子
配列を連結することもできる。
をカイコ染色体に導入する目的で使用される外来遺伝子
導入ベクターは、サイトカインの発現を的確に制御する
ように設計されるならば特に限定されないが、通常は、
サイトカイン遺伝子に対して絹糸腺特異的に発現するプ
ロモーターを上流に、任意のポリＡ配列を下流に連結し
た構造を持ち、これら遺伝子配列の外側に、１対のトラ
ンスポゾン由来のＤＮＡ配列を有する。さらにはプロモ
ーターとの間に任意の遺伝子由来のシグナル配列などを
連結してもよく、ポリＡとの間にも任意の遺伝子配列を
連結してもよい。また人工的に設計、合成された遺伝子
配列を連結することもできる。
【００２７】また、必要に応じてバクテリア宿主内で複
製するための配列、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク
遺伝子、LacZ遺伝子などを連結することもできる。例え
ば、適切なプロモーター下流に結合された緑色蛍光タン
パク質ＧＦＰの遺伝子を、１対のトランスポゾン由来Ｄ
ＮＡ配列の間の適切な部位に導入することができる。こ
のことによって、遺伝子組換えカイコのスクリーニング
を容易にすることが可能である。また、本ベクターは、
pUC9、19など、大腸菌由来プラスミドの一部または全て
を含むこともできる。
製するための配列、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク
遺伝子、LacZ遺伝子などを連結することもできる。例え
ば、適切なプロモーター下流に結合された緑色蛍光タン
パク質ＧＦＰの遺伝子を、１対のトランスポゾン由来Ｄ
ＮＡ配列の間の適切な部位に導入することができる。こ
のことによって、遺伝子組換えカイコのスクリーニング
を容易にすることが可能である。また、本ベクターは、
pUC9、19など、大腸菌由来プラスミドの一部または全て
を含むこともできる。
【００２８】さらに、ここで用いるプロモーターは特に
限定されず、どのような生物由来のプロモーターであっ
てもカイコ細胞内で有効に働くプロモーターであればよ
いが、カイコ絹糸腺で特異的にタンパク質の発現を誘導
するように工夫されたプロモーターが好ましい。例え
ば、フィブロインＨ鎖プロモーター、フィブロインＬ鎖
プロモーター、p25プロモーター、セリシンプロモータ
ーなどのカイコ絹糸腺タンパク質のプロモーターが挙げ
られる。
限定されず、どのような生物由来のプロモーターであっ
てもカイコ細胞内で有効に働くプロモーターであればよ
いが、カイコ絹糸腺で特異的にタンパク質の発現を誘導
するように工夫されたプロモーターが好ましい。例え
ば、フィブロインＨ鎖プロモーター、フィブロインＬ鎖
プロモーター、p25プロモーター、セリシンプロモータ
ーなどのカイコ絹糸腺タンパク質のプロモーターが挙げ
られる。
【００２９】そのほかプロモーター以外に用いられる遺
伝子配列については、シグナル配列、ポリＡ配列や、そ
の他遺伝子の発現を制御する配列などが挙げられる。こ
れらは特定のものに限定されず、目的タンパク質の発現
に適したものを選択することができる。例えば、ネコイ
ンターフェロン−ωなどサイトカインのシグナル配列や
ポリＡ配列など目的タンパク質由来のもの、宿主となる
カイコなど昆虫タンパク質のシグナル配列、ポリＡ配列
が挙げられる。または、SV40ポリＡやウシ成長ホルモン
ポリＡなどの一般的にタンパク質の発現に実績のあるも
のなどが挙げられる。上記のプロモーターやその他サイ
トカイン類遺伝子と連結する遺伝子配列を変えることに
より、その発現する部位や発現量を操作することが可能
である。
伝子配列については、シグナル配列、ポリＡ配列や、そ
の他遺伝子の発現を制御する配列などが挙げられる。こ
れらは特定のものに限定されず、目的タンパク質の発現
に適したものを選択することができる。例えば、ネコイ
ンターフェロン−ωなどサイトカインのシグナル配列や
ポリＡ配列など目的タンパク質由来のもの、宿主となる
カイコなど昆虫タンパク質のシグナル配列、ポリＡ配列
が挙げられる。または、SV40ポリＡやウシ成長ホルモン
ポリＡなどの一般的にタンパク質の発現に実績のあるも
のなどが挙げられる。上記のプロモーターやその他サイ
トカイン類遺伝子と連結する遺伝子配列を変えることに
より、その発現する部位や発現量を操作することが可能
である。
【００３０】本発明で用いられる遺伝子組換えカイコと
は、サイトカイン遺伝子がカイコ染色体に導入されたカ
イコのことであり、そのカイコ染色体ＤＮＡを常法に従
って制限酵素処理したのち、常法に従って標識したサイ
トカイン遺伝子をプローブとしてサザンブロッティング
を行う時、ポジティブなシグナルを与えるカイコのこと
である。サイトカイン遺伝子が導入される染色体上の遺
伝子座位は、カイコの発生、分化、成長を阻害しない部
位であればに特に制限はない。
は、サイトカイン遺伝子がカイコ染色体に導入されたカ
イコのことであり、そのカイコ染色体ＤＮＡを常法に従
って制限酵素処理したのち、常法に従って標識したサイ
トカイン遺伝子をプローブとしてサザンブロッティング
を行う時、ポジティブなシグナルを与えるカイコのこと
である。サイトカイン遺伝子が導入される染色体上の遺
伝子座位は、カイコの発生、分化、成長を阻害しない部
位であればに特に制限はない。
【００３１】本発明で使用する遺伝子組換えカイコを効
率よく取得するために、導入するサイトカイン遺伝子と
ともにマーカー遺伝子を導入することができる。例え
ば、１対のトランスポゾン配列の間に、適切なプロモー
タ下流に結合した蛍光緑色タンパク遺伝子をサイトカイ
ン遺伝子とタンデムに配置した遺伝子導入用ベクターを
使用し、transposase をコードする遺伝子を持つプラス
ミドと同時にカイコ卵にインジェクションする。通常の
条件で催青し、孵化した幼虫を５令まで飼育し成虫を得
る（G0世代）。得られたG0成虫の雌雄を交配し卵を得、
これらの卵を催青し孵化させる。得られた幼虫、好まし
くは１〜２令のカイコのうち緑色蛍光を示すカイコをス
クリーニングすることで、目的とする遺伝子組換えカイ
コを簡便にかつ高確率で得ることができる。
率よく取得するために、導入するサイトカイン遺伝子と
ともにマーカー遺伝子を導入することができる。例え
ば、１対のトランスポゾン配列の間に、適切なプロモー
タ下流に結合した蛍光緑色タンパク遺伝子をサイトカイ
ン遺伝子とタンデムに配置した遺伝子導入用ベクターを
使用し、transposase をコードする遺伝子を持つプラス
ミドと同時にカイコ卵にインジェクションする。通常の
条件で催青し、孵化した幼虫を５令まで飼育し成虫を得
る（G0世代）。得られたG0成虫の雌雄を交配し卵を得、
これらの卵を催青し孵化させる。得られた幼虫、好まし
くは１〜２令のカイコのうち緑色蛍光を示すカイコをス
クリーニングすることで、目的とする遺伝子組換えカイ
コを簡便にかつ高確率で得ることができる。
【００３２】このようにして得られた遺伝子組み換えカ
イコの絹糸腺または繭糸より、適当な抽出操作によっ
て、サイトカイン類タンパク質を活性を保った状態で得
ることができる。絹糸腺または繭糸からのサイトカイン
の抽出に使用する溶媒については特に制限はないが、サ
イトカインを活性を保持した状態で回収するためには水
溶媒系が好ましい。抽出に使用する水溶液は、サイトカ
インの抽出を促進させるために適切な溶質を含むことが
可能である。例えば、リン酸などの無機酸、酢酸、クエ
ン酸、リンゴ酸などの有機酸や、食塩、尿素、塩酸グア
ニジン、塩化カルシウムなどの塩類、エタノール、メタ
ノール、アセトニトリル、アセトンなどの極性有機溶媒
などが挙げられる。また、抽出溶液のｐＨも特に限定は
なく、目的とするサイトカインを失活させないｐＨであ
れば、任意のｐＨを用いることができる。
イコの絹糸腺または繭糸より、適当な抽出操作によっ
て、サイトカイン類タンパク質を活性を保った状態で得
ることができる。絹糸腺または繭糸からのサイトカイン
の抽出に使用する溶媒については特に制限はないが、サ
イトカインを活性を保持した状態で回収するためには水
溶媒系が好ましい。抽出に使用する水溶液は、サイトカ
インの抽出を促進させるために適切な溶質を含むことが
可能である。例えば、リン酸などの無機酸、酢酸、クエ
ン酸、リンゴ酸などの有機酸や、食塩、尿素、塩酸グア
ニジン、塩化カルシウムなどの塩類、エタノール、メタ
ノール、アセトニトリル、アセトンなどの極性有機溶媒
などが挙げられる。また、抽出溶液のｐＨも特に限定は
なく、目的とするサイトカインを失活させないｐＨであ
れば、任意のｐＨを用いることができる。
【００３３】抽出されたサイトカイン類を単離・精製す
るための方法に特に限定はなく、通常の蛋白質の精製方
法を用いることができる。例えば、目的とする有用蛋白
質が本来有する活性を指標としながら、シリカゲル担
体、イオン交換性担体、ゲル濾過担体、キレート性担
体、色素担持担体等を用いたクロマトグラフィーや、限
外濾過、ゲル濾過、透析、塩析等による脱塩、濃縮を組
み合わせることによって精製し単離することができる。
るための方法に特に限定はなく、通常の蛋白質の精製方
法を用いることができる。例えば、目的とする有用蛋白
質が本来有する活性を指標としながら、シリカゲル担
体、イオン交換性担体、ゲル濾過担体、キレート性担
体、色素担持担体等を用いたクロマトグラフィーや、限
外濾過、ゲル濾過、透析、塩析等による脱塩、濃縮を組
み合わせることによって精製し単離することができる。
【００３４】例えば、ネコインターフェロン-ωは、ネ
コインターフェロン-ωの遺伝子を導入したカイコの絹
糸腺または繭糸を、20mMリン酸緩衝液（pH7.0）をホモ
ジナイズして得られる可能性画分に回収することができ
る。さらに、得られた抽出液を、例えばブルーセファロ
ース担体に吸着させ、洗浄後、塩類を含む緩衝液で溶出
することにより、ネコインターフェロン-ωの純度を上
げることができる。
コインターフェロン-ωの遺伝子を導入したカイコの絹
糸腺または繭糸を、20mMリン酸緩衝液（pH7.0）をホモ
ジナイズして得られる可能性画分に回収することができ
る。さらに、得られた抽出液を、例えばブルーセファロ
ース担体に吸着させ、洗浄後、塩類を含む緩衝液で溶出
することにより、ネコインターフェロン-ωの純度を上
げることができる。
【００３５】このように製造されたサイトカイン類は、
従来の他の製造方法で製造されたサイトカインと同様
に、医薬用途や各種の測定、診断用途に用いることがで
きる。この場合、各種添加剤を加えた混合物として使用
してもよい。またサイトカイン類を発現したカイコの組
織、もしくは繭糸は、そのまま、もしくは加工して、医
療用または衣料用の繊維として用いることができる。
従来の他の製造方法で製造されたサイトカインと同様
に、医薬用途や各種の測定、診断用途に用いることがで
きる。この場合、各種添加剤を加えた混合物として使用
してもよい。またサイトカイン類を発現したカイコの組
織、もしくは繭糸は、そのまま、もしくは加工して、医
療用または衣料用の繊維として用いることができる。
【００３６】
【実施例】以下、実施例をもって本発明を具体的に説明
する。参考例. 染色体ＤＮＡの抽出法 サンプルを200μg/mlのProteinase Kの入った抽出バッ
ファー（50mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、100mM NaC
l）(Nature Biotechnology 18,81-84,2000）中でホモジ
ナイズした後、1/9量の10％SDSを加え、50℃、２時間反
応させる。その一部を常法により、フェノール抽出した
後、エタノール沈殿し、その沈殿をTE（10mM Tris-HCl
(pH8.0)、1mM EDTA）に溶解することにより染色体DNAを
得た。
する。参考例. 染色体ＤＮＡの抽出法 サンプルを200μg/mlのProteinase Kの入った抽出バッ
ファー（50mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、100mM NaC
l）(Nature Biotechnology 18,81-84,2000）中でホモジ
ナイズした後、1/9量の10％SDSを加え、50℃、２時間反
応させる。その一部を常法により、フェノール抽出した
後、エタノール沈殿し、その沈殿をTE（10mM Tris-HCl
(pH8.0)、1mM EDTA）に溶解することにより染色体DNAを
得た。
【００３７】抗ウイルス活性測定法
インターフェロンの生理活性は抗ウイルス活性として以
下の方法により行った。ウイルスとしてVesicular Stom
atitis Virus(VSV)を用い、感受性細胞としてはネコイ
ンターフェロン−ωの場合にはネコFc9細胞（J.K.Yamam
otoら；Vet.Immunol.and Immunopathol.,11,1-19,198
6）を、ヒトインターフェロン−βにはヒトＦＬ細胞を
用いて、CPE法により測定した。すなわち、96穴マイク
ロプレート上にコンフルーエントとなるまで37℃で培養
された感受性細胞にサンプルの希釈液を上端の行に加
え、下端に向かって２倍ずつ段階希釈した。
下の方法により行った。ウイルスとしてVesicular Stom
atitis Virus(VSV)を用い、感受性細胞としてはネコイ
ンターフェロン−ωの場合にはネコFc9細胞（J.K.Yamam
otoら；Vet.Immunol.and Immunopathol.,11,1-19,198
6）を、ヒトインターフェロン−βにはヒトＦＬ細胞を
用いて、CPE法により測定した。すなわち、96穴マイク
ロプレート上にコンフルーエントとなるまで37℃で培養
された感受性細胞にサンプルの希釈液を上端の行に加
え、下端に向かって２倍ずつ段階希釈した。
【００３８】37℃で20〜24時間培養した後、VSVを加え
さらに37℃で16〜20時間培養した。生存してマイクロプ
レート上に付着している感受性細胞を20％ホルマリンを
含むクリスタルバイオレット染色液で染色し、マイクロ
プレート上のクリスタルバイオレットの量を570nmにお
ける吸光度を測定することによって、スタンダードとの
比較により、抗ウイルス活性を求めた。スタンダードと
してはネコインターフェロン−ωにはインターキャット
（東レ（株）製）を細胞培養用培地で1000 Unit/mlに調
整したものを、ヒトインターフェロン−βにはフェロン
（東レ（株）製）を細胞培養用培地で1000 Unit/mlに調
整したものを用いた。またサンプルは細胞培養用培地で
１５倍希釈した後、抗ウイルス活性測定に用いた。
さらに37℃で16〜20時間培養した。生存してマイクロプ
レート上に付着している感受性細胞を20％ホルマリンを
含むクリスタルバイオレット染色液で染色し、マイクロ
プレート上のクリスタルバイオレットの量を570nmにお
ける吸光度を測定することによって、スタンダードとの
比較により、抗ウイルス活性を求めた。スタンダードと
してはネコインターフェロン−ωにはインターキャット
（東レ（株）製）を細胞培養用培地で1000 Unit/mlに調
整したものを、ヒトインターフェロン−βにはフェロン
（東レ（株）製）を細胞培養用培地で1000 Unit/mlに調
整したものを用いた。またサンプルは細胞培養用培地で
１５倍希釈した後、抗ウイルス活性測定に用いた。
【００３９】実施例１．遺伝子の調製
用いた遺伝子は既知の配列を利用して、その両端配列の
プライマーを作製し、適当なDNAソースを鋳型にしてＰ
ＣＲすることにより取得した。プライマーの端側には後
の遺伝子構築操作のために制限酵素部位を付加した。
プライマーを作製し、適当なDNAソースを鋳型にしてＰ
ＣＲすることにより取得した。プライマーの端側には後
の遺伝子構築操作のために制限酵素部位を付加した。
【００４０】ネコインターフェロン−ω遺伝子（GenBan
k登録番号S62636の塩基番号９〜593番目）はネコインタ
ーフェロン−ω遺伝子をコードするバキュロウイルスrB
NV100を鋳型にプライマー３（配列番号３）とプライマ
ー４（配列番号４）の２種類のプライマーを用いてPCR
により取得した。rBNV100は、例えばE.Coli(pFeIFN1)
（微工研条寄第1633号）から抽出したプラスミドからFe
IFNの遺伝子を切り出して、カイコのクローニングベク
ター（T.Horiuchiら、Agric.Biol.Chem.,51,1573-1580,
1987)に連結して作製した組換えプラスミドとカイコ多
核体病ウイルスDNAとを、カイコ樹立細胞にコ・トラン
スフェクションして作製することができる。
k登録番号S62636の塩基番号９〜593番目）はネコインタ
ーフェロン−ω遺伝子をコードするバキュロウイルスrB
NV100を鋳型にプライマー３（配列番号３）とプライマ
ー４（配列番号４）の２種類のプライマーを用いてPCR
により取得した。rBNV100は、例えばE.Coli(pFeIFN1)
（微工研条寄第1633号）から抽出したプラスミドからFe
IFNの遺伝子を切り出して、カイコのクローニングベク
ター（T.Horiuchiら、Agric.Biol.Chem.,51,1573-1580,
1987)に連結して作製した組換えプラスミドとカイコ多
核体病ウイルスDNAとを、カイコ樹立細胞にコ・トラン
スフェクションして作製することができる。
【００４１】セリシン−１遺伝子のプロモーター（GenB
ank登録番号AB007831の塩基番号599〜1656番目）はカイ
コ染色体DNAを鋳型にプライマー５（配列番号５）とプ
ライマー６（配列番号６）の２種類のプライマーを用い
てPCRにより取得した。フィブロインＨ鎖遺伝子のプロ
モーター（GenBank登録番号V00094の塩基番号255〜574
番目）はカイコ染色体DNAを鋳型にプライマー７（配列
番号７）とプライマー８（配列番号８）の２種類のプラ
イマーを用いてPCRにより取得した。ウシ成長ホルモン
遺伝子ポリＡ（pcDNA3.1(+)配列番号1011〜1253番目）
はプラスミドpcDNA3.1(+)ベクター（Invitrogen社製）
を鋳型にプライマー９（配列番号９）とプライマー10
（配列番号10）の２種類のプライマーを用いてPCRによ
り取得した。
ank登録番号AB007831の塩基番号599〜1656番目）はカイ
コ染色体DNAを鋳型にプライマー５（配列番号５）とプ
ライマー６（配列番号６）の２種類のプライマーを用い
てPCRにより取得した。フィブロインＨ鎖遺伝子のプロ
モーター（GenBank登録番号V00094の塩基番号255〜574
番目）はカイコ染色体DNAを鋳型にプライマー７（配列
番号７）とプライマー８（配列番号８）の２種類のプラ
イマーを用いてPCRにより取得した。ウシ成長ホルモン
遺伝子ポリＡ（pcDNA3.1(+)配列番号1011〜1253番目）
はプラスミドpcDNA3.1(+)ベクター（Invitrogen社製）
を鋳型にプライマー９（配列番号９）とプライマー10
（配列番号10）の２種類のプライマーを用いてPCRによ
り取得した。
【００４２】PCRはKODplus（東洋紡（株）製）を用いて
添付のプロトコールに従って行った。すなわち、それぞ
れの鋳型を、プラスミドの場合には10ng、染色体DNAの
場合には100ng加え、各プライマーを30pmol、添付の10
×PCRバッファーを10μl、１mM MgCl2、0.2mM dNTPs、
２単位KODplusとなるように各試薬を加え、全量100μl
とする。DNAの変性条件を94℃、15秒、プライマーのア
ニーリング条件を55℃,30秒、伸長条件を68℃,30秒〜60
秒の条件でPerkin-Elmer社のDNAサーマルサイクラーを
用い、30サイクル反応させた。
添付のプロトコールに従って行った。すなわち、それぞ
れの鋳型を、プラスミドの場合には10ng、染色体DNAの
場合には100ng加え、各プライマーを30pmol、添付の10
×PCRバッファーを10μl、１mM MgCl2、0.2mM dNTPs、
２単位KODplusとなるように各試薬を加え、全量100μl
とする。DNAの変性条件を94℃、15秒、プライマーのア
ニーリング条件を55℃,30秒、伸長条件を68℃,30秒〜60
秒の条件でPerkin-Elmer社のDNAサーマルサイクラーを
用い、30サイクル反応させた。
【００４３】これらの反応液を1〜1.5％アガロースゲル
にて電気泳動し、それぞれネコインターフェロン−ω遺
伝子では約580bp、セリシン-１プロモーターでは約１kb
p、フィブロインＨ鎖プロモーターでは約320bp、ウシ成
長ホルモンポリＡでは約230bpのDNA断片を常法に従って
抽出、調製した。これらのDNA断片をポリヌクレオチド
キナーゼ（宝酒造（株）製）によりリン酸化した後、Hi
nｃIIで切断後脱リン酸化処理したpUC19ベクターに宝酒
造（株）のDNA Ligation Kit Ver.2を用いて16℃、終夜
反応を行い、連結した。
にて電気泳動し、それぞれネコインターフェロン−ω遺
伝子では約580bp、セリシン-１プロモーターでは約１kb
p、フィブロインＨ鎖プロモーターでは約320bp、ウシ成
長ホルモンポリＡでは約230bpのDNA断片を常法に従って
抽出、調製した。これらのDNA断片をポリヌクレオチド
キナーゼ（宝酒造（株）製）によりリン酸化した後、Hi
nｃIIで切断後脱リン酸化処理したpUC19ベクターに宝酒
造（株）のDNA Ligation Kit Ver.2を用いて16℃、終夜
反応を行い、連結した。
【００４４】これらを用いて常法に従い大腸菌を形質転
換し、得られた形質転換体にPCR断片が挿入されている
ことを、得られたコロニーを前述と同じ条件でＰＣＲす
ることによって確認し、PCR断片の挿入されたプラスミ
ドを常法によって調製した。これらのプラスミドをシー
クエンスすることにより、得られた断片がそれぞれの遺
伝子の塩基配列であることを確認した。
換し、得られた形質転換体にPCR断片が挿入されている
ことを、得られたコロニーを前述と同じ条件でＰＣＲす
ることによって確認し、PCR断片の挿入されたプラスミ
ドを常法によって調製した。これらのプラスミドをシー
クエンスすることにより、得られた断片がそれぞれの遺
伝子の塩基配列であることを確認した。
【００４５】実施例２．遺伝子導入用プラスミドの作製
遺伝子導入用プラスミドにはpigA3GFP（Nature Biotech
nology 18,81-84,2000)を利用した。すなわち、米国特
許第6218185号に開示されるプラスミドp3E1.2よりtrans
posaseをコードする領域を取り除き、その部分にＡ３プ
ロモーター（GenBank登録番号U49854の塩基番号1764〜2
595番目）およびpEGFP-N1ベクター（Clontech社製）由
来のGFPおよびSV40由来ポリＡ付加配列（GenBank登録番
号U55762の塩基番号659〜2578番目）を挿入したベクタ
ーがpigA3GFPであり、このベクターは独立行政法人農業
生物資源研究所から分与可能である。
nology 18,81-84,2000)を利用した。すなわち、米国特
許第6218185号に開示されるプラスミドp3E1.2よりtrans
posaseをコードする領域を取り除き、その部分にＡ３プ
ロモーター（GenBank登録番号U49854の塩基番号1764〜2
595番目）およびpEGFP-N1ベクター（Clontech社製）由
来のGFPおよびSV40由来ポリＡ付加配列（GenBank登録番
号U55762の塩基番号659〜2578番目）を挿入したベクタ
ーがpigA3GFPであり、このベクターは独立行政法人農業
生物資源研究所から分与可能である。
【００４６】そのA3プロモーターの上流側にあるXhoＩ
部位にネコインターフェロン−ω遺伝子の発現単位を挿
入した。導入する遺伝子の発現単位としては、セリシン
−１遺伝子プロモーター−ネコインターフェロン−ω−
ウシ成長ホルモンポリＡ付加配列（配列番号１）、また
はフィブロインＨ鎖遺伝子プロモーター−ネコインター
フェロン−ω−ウシ成長ホルモンポリＡ付加配列（配列
番号２）を用いた。以下に具体的な方法を示す。
部位にネコインターフェロン−ω遺伝子の発現単位を挿
入した。導入する遺伝子の発現単位としては、セリシン
−１遺伝子プロモーター−ネコインターフェロン−ω−
ウシ成長ホルモンポリＡ付加配列（配列番号１）、また
はフィブロインＨ鎖遺伝子プロモーター−ネコインター
フェロン−ω−ウシ成長ホルモンポリＡ付加配列（配列
番号２）を用いた。以下に具体的な方法を示す。
【００４７】実施例１で調製したプラスミドより、あら
かじめプライマー内に設定しておいた制限酵素部位を利
用して遺伝子を切り出した。すなわち、セリシン−１遺
伝子プロモーターおよびフィブロインＨ鎖遺伝子プロモ
ーターではEcoRI,SalIを用いて、ネコインターフェロン
−ω遺伝子ではSalI,XbaIを用いて、ウシ成長ホルモン
ポリＡではXbaI、BamHIを用いてインサート断片を切り
出し、1〜1.5％アガロースゲルにて電気泳動した後、常
法により断片を抽出、精製した。
かじめプライマー内に設定しておいた制限酵素部位を利
用して遺伝子を切り出した。すなわち、セリシン−１遺
伝子プロモーターおよびフィブロインＨ鎖遺伝子プロモ
ーターではEcoRI,SalIを用いて、ネコインターフェロン
−ω遺伝子ではSalI,XbaIを用いて、ウシ成長ホルモン
ポリＡではXbaI、BamHIを用いてインサート断片を切り
出し、1〜1.5％アガロースゲルにて電気泳動した後、常
法により断片を抽出、精製した。
【００４８】セリシン−１遺伝子プロモーター断片200n
g、ネコインターフェロン−ω遺伝子断片100ng、ウシ成
長ホルモンポリＡ50ngを混合し、等量の宝酒造（株）の
DNALigation Kit Ver.2を加えて16℃、終夜反応を行っ
た。反応液0.5μlをプライマー11（配列番号11）とプラ
イマー12（配列番号12）を用いて実施例１と同様の条件
で伸長条件２分でPCRを行う。これらの反応液を１％ア
ガロースゲルにて電気泳動し、増幅した約1.9kbのDNA断
片（SIB断片）を常法に従って抽出、調製した。
g、ネコインターフェロン−ω遺伝子断片100ng、ウシ成
長ホルモンポリＡ50ngを混合し、等量の宝酒造（株）の
DNALigation Kit Ver.2を加えて16℃、終夜反応を行っ
た。反応液0.5μlをプライマー11（配列番号11）とプラ
イマー12（配列番号12）を用いて実施例１と同様の条件
で伸長条件２分でPCRを行う。これらの反応液を１％ア
ガロースゲルにて電気泳動し、増幅した約1.9kbのDNA断
片（SIB断片）を常法に従って抽出、調製した。
【００４９】同様にフィブロインＨ鎖遺伝子プロモータ
ー断片70ng、ネコインターフェロン−ω遺伝子断片100n
g、ウシ成長ホルモンポリＡ50ngを混合し、等量の宝酒
造（株）のDNA Ligation Kit Ver.2を加えて16℃、終夜
反応を行った。反応液0.5μlをプライマー13（配列番号
13）とプライマー12（配列番号12）を用いて実施例１と
同様の条件で伸長条件２分でPCRを行った。これらの反
応液を１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅した約
1.15kbのDNA断片（FIB断片）を常法に従って抽出、調製
した。
ー断片70ng、ネコインターフェロン−ω遺伝子断片100n
g、ウシ成長ホルモンポリＡ50ngを混合し、等量の宝酒
造（株）のDNA Ligation Kit Ver.2を加えて16℃、終夜
反応を行った。反応液0.5μlをプライマー13（配列番号
13）とプライマー12（配列番号12）を用いて実施例１と
同様の条件で伸長条件２分でPCRを行った。これらの反
応液を１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅した約
1.15kbのDNA断片（FIB断片）を常法に従って抽出、調製
した。
【００５０】これらの断片をXhoIにより消化した後、Xh
oIで切断後脱リン酸化処理したpigA3GFPに宝酒造（株）
のDNA Ligation Kit Ver.2を用いて16℃、終夜反応を行
い、連結した。SIB断片を挿入したプラスミドをpigSIB
（図１）、FIB断片を挿入したプラスミドをpigFIB（図
２）とし、塩化セシウム法により超遠心２回で精製し、
遺伝子導入実験に用いた。
oIで切断後脱リン酸化処理したpigA3GFPに宝酒造（株）
のDNA Ligation Kit Ver.2を用いて16℃、終夜反応を行
い、連結した。SIB断片を挿入したプラスミドをpigSIB
（図１）、FIB断片を挿入したプラスミドをpigFIB（図
２）とし、塩化セシウム法により超遠心２回で精製し、
遺伝子導入実験に用いた。
【００５１】実施例３．遺伝子組換えカイコの作製（フ
ィブロインＨ鎖遺伝子プロモーター） pigFIBとヘルパープラスミドpHA3PIG（図３、Nature Bi
otechnology 18,81-84,2000、独立行政法人農業生物資
源研究所より分与可能）をそれぞれ200ng/mlの濃度で0.
5mMリン酸バッファー（pH7.0）、5mM KCl中で調整し、1
5〜20nlを産卵後４時間以内のカイコ卵に対してマイク
ロインジェクションした。
ィブロインＨ鎖遺伝子プロモーター） pigFIBとヘルパープラスミドpHA3PIG（図３、Nature Bi
otechnology 18,81-84,2000、独立行政法人農業生物資
源研究所より分与可能）をそれぞれ200ng/mlの濃度で0.
5mMリン酸バッファー（pH7.0）、5mM KCl中で調整し、1
5〜20nlを産卵後４時間以内のカイコ卵に対してマイク
ロインジェクションした。
【００５２】そのカイコ卵より孵化した幼虫を飼育し、
得られた成虫（G0）を群内で掛け合わせ得られた次世代
（G1）をネコインターフェロン−ω遺伝子と同時に導入
した緑色蛍光タンパク質の蛍光を観察することにより、
ネコインターフェロン−ω遺伝子が染色体への導入され
たカイコをスクリーニングした。遺伝子導入カイコの得
られた蛾区の割合を表１に示す。カイコ卵へのインジェ
クションを２回実施し、２回目において１蛾区から遺伝
子組換えカイコが得られた。
得られた成虫（G0）を群内で掛け合わせ得られた次世代
（G1）をネコインターフェロン−ω遺伝子と同時に導入
した緑色蛍光タンパク質の蛍光を観察することにより、
ネコインターフェロン−ω遺伝子が染色体への導入され
たカイコをスクリーニングした。遺伝子導入カイコの得
られた蛾区の割合を表１に示す。カイコ卵へのインジェ
クションを２回実施し、２回目において１蛾区から遺伝
子組換えカイコが得られた。
【００５３】
【表１】
【００５４】その蛾区より得られた遺伝子導入カイコの
サザンブロッティングの結果を図４に示す。サザンブロ
ッティング法はG1世代の蛾より染色体DNAを抽出し、制
限酵素処理したサンプルを電気泳動後、DNAを転写させ
たメンブレンをネコインターフェロン−ω特異的な核酸
プローブを用いてAlkPhos Direct Labelling and Detec
tion System（アマシャムファルマシア）を用いた化学
発光により検出した。G1蛾11匹を調べたところ、10匹の
カイコにネコインターフェロン−ω遺伝子が導入されて
いることが確認できた。
サザンブロッティングの結果を図４に示す。サザンブロ
ッティング法はG1世代の蛾より染色体DNAを抽出し、制
限酵素処理したサンプルを電気泳動後、DNAを転写させ
たメンブレンをネコインターフェロン−ω特異的な核酸
プローブを用いてAlkPhos Direct Labelling and Detec
tion System（アマシャムファルマシア）を用いた化学
発光により検出した。G1蛾11匹を調べたところ、10匹の
カイコにネコインターフェロン−ω遺伝子が導入されて
いることが確認できた。
【００５５】実施例４．ネコインターフェロン産生の確
認（フィブロインＨ鎖プロモーター） ネコインターフェロン−ωは抗ウイルス活性を持つこと
から、その力価よりネコインターフェロン−ωの存在を
知ることができる。実施例３で得られた陽性蛾区のカイ
コ（Ｇ１）を野生カイコと交配し得られた世代（Ｇ２）
のうち、ネコインターフェロン−ω遺伝子の導入が確認
されたカイコの５齢幼虫の中部絹糸腺および後部絹糸腺
を摘出した。
認（フィブロインＨ鎖プロモーター） ネコインターフェロン−ωは抗ウイルス活性を持つこと
から、その力価よりネコインターフェロン−ωの存在を
知ることができる。実施例３で得られた陽性蛾区のカイ
コ（Ｇ１）を野生カイコと交配し得られた世代（Ｇ２）
のうち、ネコインターフェロン−ω遺伝子の導入が確認
されたカイコの５齢幼虫の中部絹糸腺および後部絹糸腺
を摘出した。
【００５６】それらを20mMリン酸ナトリウムバッファー
(pH7.0)をもちいてホモジナイズし、得られた抽出液を
ネコ細胞を用いた抗ウイルス活性測定の系により測定し
た。その結果、遺伝子導入カイコの絹糸腺抽出液から
は、中部絹糸腺、後部絹糸腺ともに抗ウイルス活性が検
出されたが、コントロールとなる野生カイコの絹糸腺抽
出液からは検出されなかった。その結果を図５に示す。
(pH7.0)をもちいてホモジナイズし、得られた抽出液を
ネコ細胞を用いた抗ウイルス活性測定の系により測定し
た。その結果、遺伝子導入カイコの絹糸腺抽出液から
は、中部絹糸腺、後部絹糸腺ともに抗ウイルス活性が検
出されたが、コントロールとなる野生カイコの絹糸腺抽
出液からは検出されなかった。その結果を図５に示す。
【００５７】フィブロインＨ鎖プロモーター制御下では
ネコインターフェロン−ωは主に後部絹糸腺に発現され
ていると考えられ、その後、フィブロインと同様に中
部、前部絹糸腺へと移動すると考えられ、生理活性の分
布もそれに一致しているものと考えられる。一方、遺伝
子を導入していないカイコからは抗ウイルス活性は全く
検出されなかった。このことからネコインターフェロン
−ω遺伝子導入カイコではネコインターフェロン−ωタ
ンパク質が、生理活性を保ったまま発現していることが
明らかとなった。
ネコインターフェロン−ωは主に後部絹糸腺に発現され
ていると考えられ、その後、フィブロインと同様に中
部、前部絹糸腺へと移動すると考えられ、生理活性の分
布もそれに一致しているものと考えられる。一方、遺伝
子を導入していないカイコからは抗ウイルス活性は全く
検出されなかった。このことからネコインターフェロン
−ω遺伝子導入カイコではネコインターフェロン−ωタ
ンパク質が、生理活性を保ったまま発現していることが
明らかとなった。
【００５８】実施例５．ネコインターフェロンの精製
実施例４で得られたG2世代５令カイコの後部絹糸腺の抽
出液からネコインターフェロンの精製を行った。抽出液
１mlをHiTrap Bluesepharose カラム（Amersham pharma
cia社製）に通液し、その後10mlの20mMリン酸ナトリウ
ムバッファー(pH7.0)で洗浄した。続いて10mlの20mMリ
ン酸ナトリウムバッファー(pH8.0)-0.5M NaCl、さらに1
0mlの20mMリン酸ナトリウムバッファー(pH8.0)-１M NaC
lで溶出した。洗浄画分、0.5M溶出画分、および１M溶出
画分を分取し、脱塩・濃縮を行い約１mlとした。抽出液
および各精製フラクションの抗ウイルス活性およびタン
パク定量した結果を表２に示す。
出液からネコインターフェロンの精製を行った。抽出液
１mlをHiTrap Bluesepharose カラム（Amersham pharma
cia社製）に通液し、その後10mlの20mMリン酸ナトリウ
ムバッファー(pH7.0)で洗浄した。続いて10mlの20mMリ
ン酸ナトリウムバッファー(pH8.0)-0.5M NaCl、さらに1
0mlの20mMリン酸ナトリウムバッファー(pH8.0)-１M NaC
lで溶出した。洗浄画分、0.5M溶出画分、および１M溶出
画分を分取し、脱塩・濃縮を行い約１mlとした。抽出液
および各精製フラクションの抗ウイルス活性およびタン
パク定量した結果を表２に示す。
【００５９】
【表２】
【００６０】精製操作により、１M溶出画分に抗ウイル
ス活性すなわちネコインターフェロン−ωが回収でき、
その比活性は抽出液に比べて約10倍となった。
ス活性すなわちネコインターフェロン−ωが回収でき、
その比活性は抽出液に比べて約10倍となった。
【００６１】実施例６．遺伝子組換えカイコの作製（セ
リシン１プロモーター） pigSIBとヘルパープラスミドをそれぞれ200ng/mlの濃度
で0.5mMリン酸バッファー（pH7.0）、5mM ＫＣｌ中で調
整し、15〜20nlを産卵後４時間以内のカイコ卵に対して
マイクロインジェクションした。そのカイコ卵より孵化
した幼虫を飼育し、得られた成虫（G0）を群内で掛け合
わせ得られた次世代（G1）より緑色蛍光タンパク質の蛍
光を観察することにより、ネコインターフェロン−ω遺
伝子の染色体への導入を調べた。２回の実験において、
それぞれ1218、1375個の卵にセリシンプロモーターに連
結したネコインターフェロン−ω遺伝子を含む遺伝子組
換えベクターをマイクロインジェクションし、それぞ
れ、12蛾区ずつの陽性蛾区を得ることができた（表
３）。
リシン１プロモーター） pigSIBとヘルパープラスミドをそれぞれ200ng/mlの濃度
で0.5mMリン酸バッファー（pH7.0）、5mM ＫＣｌ中で調
整し、15〜20nlを産卵後４時間以内のカイコ卵に対して
マイクロインジェクションした。そのカイコ卵より孵化
した幼虫を飼育し、得られた成虫（G0）を群内で掛け合
わせ得られた次世代（G1）より緑色蛍光タンパク質の蛍
光を観察することにより、ネコインターフェロン−ω遺
伝子の染色体への導入を調べた。２回の実験において、
それぞれ1218、1375個の卵にセリシンプロモーターに連
結したネコインターフェロン−ω遺伝子を含む遺伝子組
換えベクターをマイクロインジェクションし、それぞ
れ、12蛾区ずつの陽性蛾区を得ることができた（表
３）。
【００６２】
【表３】
【００６３】得られた陽性蛾区のうち、１回目の実験の
３蛾区、２回目の実験の２蛾区からそれぞれ１頭ずつの
遺伝子の導入が確認されたカイコ（G1）を選び、その絹
糸腺よりゲノムＤＮＡを抽出した。それらをEcoRIまた
はBglII処理したのち、ネコインターフェロン−ω遺伝
子をプローブにしてサザンブロッティング解析を行った
結果を図６に示す。その結果、すべてのカイコのゲノム
中にネコインターフェロン−ω遺伝子の導入が確認され
た。また検出位置の違いにより、蛾区によってゲノムへ
の遺伝子導入部位が異なっていることがわかった。
３蛾区、２回目の実験の２蛾区からそれぞれ１頭ずつの
遺伝子の導入が確認されたカイコ（G1）を選び、その絹
糸腺よりゲノムＤＮＡを抽出した。それらをEcoRIまた
はBglII処理したのち、ネコインターフェロン−ω遺伝
子をプローブにしてサザンブロッティング解析を行った
結果を図６に示す。その結果、すべてのカイコのゲノム
中にネコインターフェロン−ω遺伝子の導入が確認され
た。また検出位置の違いにより、蛾区によってゲノムへ
の遺伝子導入部位が異なっていることがわかった。
【００６４】次にネコインターフェロン−ω遺伝子のmR
NA発現を調べた。サザンブロッティングでネコインター
フェロン-ω遺伝子の導入が確認されたG1世代カイコを
任意に７頭選び、そのmRNAを抽出し、RT-PCRによりネコ
インターフェロン−ω遺伝子ｍＲＮＡの発現を調べた。
ｍＲＮＡの抽出・精製にはISOGEN（ニッポンジーン）お
よびオリゴテックスdT-30（ロシュディアグノスティク
ス）を、cDNA合成にはReady-To-Go T-Primed First-Str
and Kit（アマシャムファルマシア）を用い、添付のプ
ロトコールに従い行った。PCRは実施例１のネコインタ
ーフェロン−ω遺伝子取得時の条件で行った結果、全頭
よりネコインターフェロン−ω遺伝子のｍＲＮＡの発現
が確認された（図７）。
NA発現を調べた。サザンブロッティングでネコインター
フェロン-ω遺伝子の導入が確認されたG1世代カイコを
任意に７頭選び、そのmRNAを抽出し、RT-PCRによりネコ
インターフェロン−ω遺伝子ｍＲＮＡの発現を調べた。
ｍＲＮＡの抽出・精製にはISOGEN（ニッポンジーン）お
よびオリゴテックスdT-30（ロシュディアグノスティク
ス）を、cDNA合成にはReady-To-Go T-Primed First-Str
and Kit（アマシャムファルマシア）を用い、添付のプ
ロトコールに従い行った。PCRは実施例１のネコインタ
ーフェロン−ω遺伝子取得時の条件で行った結果、全頭
よりネコインターフェロン−ω遺伝子のｍＲＮＡの発現
が確認された（図７）。
【００６５】実施例７．中部絹糸腺および繭糸でのネコ
インターフェロン産生の確認 実施例６で得られた遺伝子組換えカイコ３頭、野生カイ
コ１頭の中部絹糸腺を摘出し、20mMリン酸ナトリウムバ
ッファー(pH7.0)をもちいてホモジナイズし、遠心分離
して抽出液を調製した。また、遺伝子組換えカイコおよ
び野生カイコ由来の繭１個ずつについても同様に抽出し
た。これらの抽出液の抗ウイルス測定したところ、全頭
の遺伝子組換えカイコの中部絹糸腺より抗ウイルス活性
が検出され、野生カイコの絹糸腺からは検出されなかっ
た。さらに遺伝子組換えカイコの繭からも抗ウイルス活
性が検出された（図８）。
インターフェロン産生の確認 実施例６で得られた遺伝子組換えカイコ３頭、野生カイ
コ１頭の中部絹糸腺を摘出し、20mMリン酸ナトリウムバ
ッファー(pH7.0)をもちいてホモジナイズし、遠心分離
して抽出液を調製した。また、遺伝子組換えカイコおよ
び野生カイコ由来の繭１個ずつについても同様に抽出し
た。これらの抽出液の抗ウイルス測定したところ、全頭
の遺伝子組換えカイコの中部絹糸腺より抗ウイルス活性
が検出され、野生カイコの絹糸腺からは検出されなかっ
た。さらに遺伝子組換えカイコの繭からも抗ウイルス活
性が検出された（図８）。
【００６６】このことから、遺伝子組換えカイコでは、
ネコインターフェロン−ωが生理活性を保ったまま発現
しており、その活性は糸として吐糸されてもなお残存し
ていることがわかった。
ネコインターフェロン−ωが生理活性を保ったまま発現
しており、その活性は糸として吐糸されてもなお残存し
ていることがわかった。
【００６７】実施例８．ヒトインターフェロン−β遺伝
子導入用プラスミドの作製 ヒトインターフェロン−β遺伝子導入用プラスミドの作
製は、実施例１から３に示したネコインターフェロン−
ω遺伝子の場合と同様の方法により行った。すなわちヒ
トインターフェロン−β遺伝子をコードするプラスミド
pORF-hIFN-β（Invivogen社）を鋳型にプライマー14
（配列番号14）およびプライマー１５（配列番号１５）
を用いてＰＣＲを行い、ヒトインターフェロン−β遺伝
子断片を得た。
子導入用プラスミドの作製 ヒトインターフェロン−β遺伝子導入用プラスミドの作
製は、実施例１から３に示したネコインターフェロン−
ω遺伝子の場合と同様の方法により行った。すなわちヒ
トインターフェロン−β遺伝子をコードするプラスミド
pORF-hIFN-β（Invivogen社）を鋳型にプライマー14
（配列番号14）およびプライマー１５（配列番号１５）
を用いてＰＣＲを行い、ヒトインターフェロン−β遺伝
子断片を得た。
【００６８】この断片を制限酵素SalIおよびXbaI処理し
た後、５’末端側ににフィブロインH鎖遺伝子プロモー
ターまたはセリシン遺伝子プロモーターを、３’末端側
にウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリＡシグナルを連結
した遺伝子発現用配列（フィブロインH鎖遺伝子プロモ
ーター−ヒトインターフェロン−β遺伝子−ウシ成長ホ
ルモン遺伝子ポリＡシグナル（FhIB）：配列番号16、セ
リシン遺伝子プロモーター−ヒトインターフェロン−β
−ウシ成長ホルモン遺伝子ポリＡシグナル（ShIB）：配
列番号17）を含むプラスミドを構築した。
た後、５’末端側ににフィブロインH鎖遺伝子プロモー
ターまたはセリシン遺伝子プロモーターを、３’末端側
にウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリＡシグナルを連結
した遺伝子発現用配列（フィブロインH鎖遺伝子プロモ
ーター−ヒトインターフェロン−β遺伝子−ウシ成長ホ
ルモン遺伝子ポリＡシグナル（FhIB）：配列番号16、セ
リシン遺伝子プロモーター−ヒトインターフェロン−β
−ウシ成長ホルモン遺伝子ポリＡシグナル（ShIB）：配
列番号17）を含むプラスミドを構築した。
【００６９】それらのプラスミドより上記の遺伝子発現
用配列FhIBおよびShIBをそれぞれXhoI処理により切りだ
し、XhoIで切断後脱リン酸化処理したpigA3GFPに連結し
た。FhIB断片を挿入したプラスミドをpigFhIB、ShIB断
片を挿入したプラスミドをpigShIBとし、塩化セシウム
法により超遠心２回で精製し、遺伝子導入実験に用い
た。
用配列FhIBおよびShIBをそれぞれXhoI処理により切りだ
し、XhoIで切断後脱リン酸化処理したpigA3GFPに連結し
た。FhIB断片を挿入したプラスミドをpigFhIB、ShIB断
片を挿入したプラスミドをpigShIBとし、塩化セシウム
法により超遠心２回で精製し、遺伝子導入実験に用い
た。
【００７０】実施例９．ヒトインターフェロン−β遺伝
子組換えカイコの作製 ヒトインターフェロン−β遺伝子組換えカイコの作製
は、実施例８において作製した遺伝子導入用プラスミド
を用いて、実施例３において示したネコインターフェロ
ン−ω遺伝子組換えカイコの作製と同様の方法により行
った。
子組換えカイコの作製 ヒトインターフェロン−β遺伝子組換えカイコの作製
は、実施例８において作製した遺伝子導入用プラスミド
を用いて、実施例３において示したネコインターフェロ
ン−ω遺伝子組換えカイコの作製と同様の方法により行
った。
【００７１】すなわち、pigFhIBおよびpigShIBをそれぞ
れヘルパープラスミドpHA3PIGとともにカイコ卵に対し
てマイクロインジェクションし、得られた成虫をかけあ
わせた次世代をスクリーニングした。それぞれ600個ず
つの卵にインジェクションしたところ、pigFhIB導入カ
イコでは７蛾区、pigShIB導入カイコでは５蛾区より緑
色蛍光陽性のカイコが得られ、PCRにより染色体への遺
伝子導入が確認された。これらのカイコの絹糸腺および
絹糸を採取し、その抽出液を用いてヒトインタフェロン
−βの生理活性である抗ウイルス活性を測定した。値は
サンプル中の全タンパク質濃度で補正して表記した。
れヘルパープラスミドpHA3PIGとともにカイコ卵に対し
てマイクロインジェクションし、得られた成虫をかけあ
わせた次世代をスクリーニングした。それぞれ600個ず
つの卵にインジェクションしたところ、pigFhIB導入カ
イコでは７蛾区、pigShIB導入カイコでは５蛾区より緑
色蛍光陽性のカイコが得られ、PCRにより染色体への遺
伝子導入が確認された。これらのカイコの絹糸腺および
絹糸を採取し、その抽出液を用いてヒトインタフェロン
−βの生理活性である抗ウイルス活性を測定した。値は
サンプル中の全タンパク質濃度で補正して表記した。
【００７２】
【表４】
【００７３】その結果、pigFhIB導入カイコの後部絹糸
腺および中部絹糸腺より抗ウイルス活性が検出され、pi
gShIB導入カイコの中部絹糸腺および絹糸より抗ウイル
ス活性が検出されたことから、ヒトインターフェロン−
βのカイコ絹糸腺組織での産生が確認された。
腺および中部絹糸腺より抗ウイルス活性が検出され、pi
gShIB導入カイコの中部絹糸腺および絹糸より抗ウイル
ス活性が検出されたことから、ヒトインターフェロン−
βのカイコ絹糸腺組織での産生が確認された。
【００７４】実施例１０．ネコ顆粒球コロニー刺激因子
遺伝子導入用プラスミドの作製 ネコ顆粒球コロニー刺激因子遺伝子導入用プラスミドの
作製は、実施例１から３に示したネコインターフェロン
−ω遺伝子の場合と同様の方法により行った。ネコ顆粒
球コロニー刺激因子遺伝子は、Yamamotoらの報告（Gen
e,274,263-269,2001）に従い、10μg/mlのLPSで24時間
刺激したCRFK細胞より得られたcDNAより、プライマー18
（配列番号18）およびプライマー19（配列番号19）を用
いてＰＣＲを行い、ネコ顆粒球コロニー刺激因子遺伝子
断片を得た。
遺伝子導入用プラスミドの作製 ネコ顆粒球コロニー刺激因子遺伝子導入用プラスミドの
作製は、実施例１から３に示したネコインターフェロン
−ω遺伝子の場合と同様の方法により行った。ネコ顆粒
球コロニー刺激因子遺伝子は、Yamamotoらの報告（Gen
e,274,263-269,2001）に従い、10μg/mlのLPSで24時間
刺激したCRFK細胞より得られたcDNAより、プライマー18
（配列番号18）およびプライマー19（配列番号19）を用
いてＰＣＲを行い、ネコ顆粒球コロニー刺激因子遺伝子
断片を得た。
【００７５】この断片を制限酵素Sal IおよびXba I処理
した後、５’末端側ににフィブロインH鎖遺伝子プロモ
ーターまたはセリシン遺伝子プロモーターを、３’末端
側にウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリＡシグナルを連
結した遺伝子発現用配列（フィブロインH鎖遺伝子プロ
モーター−ネコ顆粒球コロニー刺激因子遺伝子−ウシ成
長ホルモン遺伝子ポリＡシグナル（FGB）：配列番号2
0、セリシン遺伝子プロモーター−ネコ顆粒球コロニー
刺激因子−ウシ成長ホルモン遺伝子ポリＡシグナル（SG
B）：配列番号21）を含むプラスミドを構築した。
した後、５’末端側ににフィブロインH鎖遺伝子プロモ
ーターまたはセリシン遺伝子プロモーターを、３’末端
側にウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリＡシグナルを連
結した遺伝子発現用配列（フィブロインH鎖遺伝子プロ
モーター−ネコ顆粒球コロニー刺激因子遺伝子−ウシ成
長ホルモン遺伝子ポリＡシグナル（FGB）：配列番号2
0、セリシン遺伝子プロモーター−ネコ顆粒球コロニー
刺激因子−ウシ成長ホルモン遺伝子ポリＡシグナル（SG
B）：配列番号21）を含むプラスミドを構築した。
【００７６】それらのプラスミドより上記の遺伝子発現
用配列FGBおよびSGBをそれぞれXhoI処理により切りだ
し、XhoIで切断後脱リン酸化処理したpigA3GFPに連結し
た。FGB断片を挿入したプラスミドをpigFGB、SGB断片を
挿入したプラスミドをpigSGBとし、塩化セシウム法によ
り超遠心２回で精製し、遺伝子導入実験に用いた。
用配列FGBおよびSGBをそれぞれXhoI処理により切りだ
し、XhoIで切断後脱リン酸化処理したpigA3GFPに連結し
た。FGB断片を挿入したプラスミドをpigFGB、SGB断片を
挿入したプラスミドをpigSGBとし、塩化セシウム法によ
り超遠心２回で精製し、遺伝子導入実験に用いた。
【００７７】実施例１１．ネコ顆粒球コロニー刺激因子
遺伝子組換えカイコの作製 ネコ顆粒球コロニー刺激因子遺伝子組換えカイコの作製
は、実施例１０において作製した遺伝子導入用プラスミ
ドを用いて、実施例３において示したネコインターフェ
ロン−ω遺伝子組換えカイコの作製と同様の方法により
行った。すなわち、pigFGBおよびpigSGBをそれぞれヘル
パープラスミドpHA3PIGとともにカイコ卵に対してマイ
クロインジェクションし、得られた成虫をかけあわせた
次世代をスクリーニングした。
遺伝子組換えカイコの作製 ネコ顆粒球コロニー刺激因子遺伝子組換えカイコの作製
は、実施例１０において作製した遺伝子導入用プラスミ
ドを用いて、実施例３において示したネコインターフェ
ロン−ω遺伝子組換えカイコの作製と同様の方法により
行った。すなわち、pigFGBおよびpigSGBをそれぞれヘル
パープラスミドpHA3PIGとともにカイコ卵に対してマイ
クロインジェクションし、得られた成虫をかけあわせた
次世代をスクリーニングした。
【００７８】それぞれ600個ずつの卵にインジェクショ
ンしたところ、pigFGB導入カイコでは３蛾区、pigSGB導
入カイコでは７蛾区より緑色蛍光陽性のカイコが得ら
れ、PCRにより染色体への遺伝子導入が確認された。こ
れらのカイコの絹糸腺および絹糸を採取し、その抽出液
を用いてネコ顆粒球コロニー刺激因子の生理活性である
NFS-60細胞（ATCC)の増殖促進活性を測定した。
ンしたところ、pigFGB導入カイコでは３蛾区、pigSGB導
入カイコでは７蛾区より緑色蛍光陽性のカイコが得ら
れ、PCRにより染色体への遺伝子導入が確認された。こ
れらのカイコの絹糸腺および絹糸を採取し、その抽出液
を用いてネコ顆粒球コロニー刺激因子の生理活性である
NFS-60細胞（ATCC)の増殖促進活性を測定した。
【００７９】増殖促進活性の測定は以下のように行っ
た。まずNFS-60細胞をM-CSF非存在下に96ウェルプレー
トに2×104個ずつまき、30分後にサンプルを10μｌ加
え、さらに培養を24時間行った後に、Cell Counting Ki
t-8（Dojindo）を用いて細胞増殖活性を測定した。増殖
促進最大効果の50％を与えるサンプル量（ED50）を１Un
it/mlとし、希釈倍数を乗じてサンプル中の生理活性を
算出した。値はサンプル中の全タンパク質濃度で補正し
て表記した。
た。まずNFS-60細胞をM-CSF非存在下に96ウェルプレー
トに2×104個ずつまき、30分後にサンプルを10μｌ加
え、さらに培養を24時間行った後に、Cell Counting Ki
t-8（Dojindo）を用いて細胞増殖活性を測定した。増殖
促進最大効果の50％を与えるサンプル量（ED50）を１Un
it/mlとし、希釈倍数を乗じてサンプル中の生理活性を
算出した。値はサンプル中の全タンパク質濃度で補正し
て表記した。
【００８０】
【表５】
【００８１】その結果、pigFGB導入カイコの後部絹糸腺
および中部絹糸腺より増殖促進活性が検出され、pigSGB
導入カイコの中部絹糸腺および絹糸より増殖促進活性が
検出されたことから、ネコ顆粒球コロニー刺激因子のカ
イコ絹糸腺組織での産生が確認された。
および中部絹糸腺より増殖促進活性が検出され、pigSGB
導入カイコの中部絹糸腺および絹糸より増殖促進活性が
検出されたことから、ネコ顆粒球コロニー刺激因子のカ
イコ絹糸腺組織での産生が確認された。
【００８２】
【発明の効果】サイトカイン遺伝子をカイコ絹糸腺で機
能するプロモーターと連結したプラスミドベクターを作
製し、カイコ染色体へ遺伝子導入することにより得られ
た遺伝子組換えカイコの絹糸腺または繭糸から、サイト
カインを生理活性を保ったまま大量に回収することが可
能となった。また、得られたサイトカイン抽出液は、夾
雑タンパクが少なく、従来法と比較して精製が容易とな
る。
能するプロモーターと連結したプラスミドベクターを作
製し、カイコ染色体へ遺伝子導入することにより得られ
た遺伝子組換えカイコの絹糸腺または繭糸から、サイト
カインを生理活性を保ったまま大量に回収することが可
能となった。また、得られたサイトカイン抽出液は、夾
雑タンパクが少なく、従来法と比較して精製が容易とな
る。
【００８３】
【配列表】
<110>東レ株式会社、Toray Industries,Inc.
<110>独立行政法人農業生物資源研究所、National Institute of Agrobiologica
l Science
<120>サイトカイン遺伝子組換えカイコおよびそのタンパク質の製造方法
<130>
<160>13
<210>1
<211>1910
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<221>CDS
<222>(1071)...(1652)
<221>sig_peptide
<222>(1071)...(1139)
<221>mat_peptide
<222>(1140)...(1652)
<400>1
ctcgagggtc agaaaccttg ttaaccaata gagccaaata tagttaacac aatagaaatt 60
tatccaaata ttattcgtgt attgtttata gcctttgtca agtcttttac aaggcaagat 120
aataagtaat attccgtgat tggacgtaac atttcccgga agatccttag ccgataagtc 180
gaagagccgc atgtggctag agagacgcgg gtttccgacc actggcttag gcgcttattc 240
cgccataata gatgtacgtg ttcacaatta gcacccgaaa ttcgtaatag ctacgagaag 300
tatcgaatat caaaaatcta tatattaata cgtgaagcaa aaactttgta tcccttttta 360
cgaaaattgc gaggacggag gagtatgaaa tttcccacac ttatagagaa tacagagaag 420
aagtgcacaa tgctaatatt tttttaaaat aatgcataaa agatacttta aatcaataaa 480
gaaaacagca cacacactac ataccatgta tttgacgcac acacgcatgt atactattta 540
ttgtcaaact tttgttcttg acgtctgtgt tcaaactgag aatagattaa atattgtttg 600
tctttattaa tattttttaa tagtgtagtc ttggcgaaat ttgtgattat agaagtataa 660
aatacaatca taatagtgta caaacttaca attcccaatt aattatagtc gaatttcgac 720
tactgcggga cctctagtat taataattct ctttaaaaaa aaacagagca tcaaatactg 780
tcacaaatgt caagcgggtc tcaacgagcc atgaataaat tagaaatcaa ttaataacat 840
aaaataggca aacaaaataa aaccatttac atagagaacg tttgttgaac aaaaacaata 900
acttgtatac attgtttgca caaatgtttg aaccgaaaat ttattactct ctacgtaagc 960
ttgatcaaac ttcgttttcg tataaaacgc gttggcccaa ccactttggc atagtcgtct 1020
tatcatcggg tctctaagga tcaagcgatc caaagaccgc caacgtcgac atg gcg 1076
Met Ala
1
ctg ccc tct tcc ttc ttg gtg gcc ctg gtg gcg ctg ggc tgc aac tcc 1124
Leu Pro Ser Ser Phe Leu Val Ala Leu Val Ala Leu Gly Cys Asn Ser
5 10 15
gtc tgc gtg ctg ggc tgt gac ctg cct cag acc cac ggc ctg ctg aac 1172
Val Cys Val Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Gly Leu Leu Asn
20 25 30
agg agg gcc ttg acg ctc ctg gga caa atg agg aga ctc cct gcc agc 1220
Arg Arg Ala Leu Thr Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Pro Ala Ser
35 40 45 50
tcc tgt cag aag gac aga aat gac ttc gcc ttc ccc cag gac gtg ttc 1268
Ser Cys Gln Lys Asp Arg Asn Asp Phe Ala Phe Pro Gln Asp Val Phe
55 60 65
ggt gga gac cag tcc cac aag gcc caa gcc ctc tcg gtg gtg cac gtg 1316
Gly Gly Asp Gln Ser His Lys Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val
70 75 80
acg aac cag aag atc ttc cac ttc ttc tgc aca gag gcg tcc tcg tct 1364
Thr Asn Gln Lys Ile Phe His Phe Phe Cys Thr Glu Ala Ser Ser Ser
85 90 95
gct gct tgg aac acc acc ctc ctg gag gaa ttt tgc acg gga ctt gat 1412
Ala Ala Trp Asn Thr Thr Leu Leu Glu Glu Phe Cys Thr Gly Leu Asp
100 105 110
cgg cag ctg acc cgc ctg gaa gcc tgt gtc ctg cag gag gtg gag gag 1460
Arg Gln Leu Thr Arg Leu Glu Ala Cys Val Leu Gln Glu Val Glu Glu
115 120 125 130
gga gag gct ccc ctg acg aac gag gac att cat ccc gag gac tcc atc 1508
Gly Glu Ala Pro Leu Thr Asn Glu Asp Ile His Pro Glu Asp Ser Ile
135 140 145
ctg agg aac tac ttc caa aga ctc tcc ctc tac ctg caa gag aag aaa 1556
Leu Arg Asn Tyr Phe Gln Arg Leu Ser Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Lys
150 155 160
tac agc cct tgt gcc tgg gag atc gtc aga gca gaa atc atg aga tcc 1604
Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser
165 170 175
ttg tat tat tca tca aca gcc ttg cag aaa aga tta agg agc gag aaa 1652
Leu Tyr Tyr Ser Ser Thr Ala Leu Gln Lys Arg Leu Arg Ser Glu Lys
180 185 190
tga tctagaccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg 1705
***
ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt 1765
cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg 1825
gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg 1885
atgcggtggg ctctatggcc tcgag 1910
<210>2
<211>1172
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<221>CDS
<222>(333)...(914)
<221>sig_peptide
<222>(333)...(401)
<221>mat_peptide
<222>(402)...(914)
<400>2
ctcgagggga gaaagcatga agtaagttct ttaaatatta caaaaaaatt gaacgatatt 60
ataaaattct ttaaaatatt aaaagtaaga acaataagat caattaaatc ataattaatc 120
acattgttca tgatcacaat ttaatttact tcatacgttg tattgttatg ttaaataaaa 180
agattaattt ctatgtaatt gtatctgtac aatacaatgt gtagatgttt attctatcga 240
aagtaaatac gtcaaaactc gaaaattttc agtataaaaa ggttcaactt tttcaaatca 300
gcatcagttc ggttccaact ctcaaggtcg ac atg gcg ctg ccc tct tcc ttc 353
Met Ala Leu Pro Ser Ser Phe
1 5
ttg gtg gcc ctg gtg gcg ctg ggc tgc aac tcc gtc tgc gtg ctg ggc 401
Leu Val Ala Leu Val Ala Leu Gly Cys Asn Ser Val Cys Val Leu Gly
10 15 20
tgt gac ctg cct cag acc cac ggc ctg ctg aac agg agg gcc ttg acg 449
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Gly Leu Leu Asn Arg Arg Ala Leu Thr
25 30 35
ctc ctg gga caa atg agg aga ctc cct gcc agc tcc tgt cag aag gac 497
Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Pro Ala Ser Ser Cys Gln Lys Asp
40 45 50 55
aga aat gac ttc gcc ttc ccc cag gac gtg ttc ggt gga gac cag tcc 545
Arg Asn Asp Phe Ala Phe Pro Gln Asp Val Phe Gly Gly Asp Gln Ser
60 65 70
cac aag gcc caa gcc ctc tcg gtg gtg cac gtg acg aac cag aag atc 593
His Lys Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Thr Asn Gln Lys Ile
75 80 85
ttc cac ttc ttc tgc aca gag gcg tcc tcg tct gct gct tgg aac acc 641
Phe His Phe Phe Cys Thr Glu Ala Ser Ser Ser Ala Ala Trp Asn Thr
90 95 100
acc ctc ctg gag gaa ttt tgc acg gga ctt gat cgg cag ctg acc cgc 689
Thr Leu Leu Glu Glu Phe Cys Thr Gly Leu Asp Arg Gln Leu Thr Arg
105 110 115
ctg gaa gcc tgt gtc ctg cag gag gtg gag gag gga gag gct ccc ctg 737
Leu Glu Ala Cys Val Leu Gln Glu Val Glu Glu Gly Glu Ala Pro Leu
120 125 130 135
acg aac gag gac att cat ccc gag gac tcc atc ctg agg aac tac ttc 785
Thr Asn Glu Asp Ile His Pro Glu Asp Ser Ile Leu Arg Asn Tyr Phe
140 145 150
caa aga ctc tcc ctc tac ctg caa gag aag aaa tac agc cct tgt gcc 833
Gln Arg Leu Ser Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala
155 160 165
tgg gag atc gtc aga gca gaa atc atg aga tcc ttg tat tat tca tca 881
Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Tyr Tyr Ser Ser
170 175 180
aca gcc ttg cag aaa aga tta agg agc gag aaa tga tctagaccgc 927
Thr Ala Leu Gln Lys Arg Leu Arg Ser Glu Lys ***
185 190
tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg 987
ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt 1047
gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc 1107
aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggcc 1167
tcgag 1172
<210>3
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthesized oligonucleotide
<400>3
acgcgtcgac atgggcgctg ccctcttcct t 31
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthesized oligonucleotide
<400>4
ctagtctaga tcatttctcg ctccttaatc 30
<210>5
<211>29
<212>DNA
<223>Artificial sequence
<220>
<223>Synthesized oligonucleotide
<400>5
ccggaattcg gtcagaaacc ttgttaacc 29
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthesized oligonucleotide
<400>6
acgcgtcgac gttggcggtc tttggatcgc 30
<210>7
<211>29
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthesized oligonucleotide
<400>7
ccggaattcg ggagaaagca tgaagtaag 29
<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthesized oligonucleotide
<400>8
acgcgtcgac cttgagagtt ggaaccgaac 30
<210>9
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthesized oligonucleotide
<400>9
ctagtctaga ccgctgatca gcctcgactg 30
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthesized oligonucleotide
<400>10
cgcggatccg ccatagagcc caccgcatcc 30
<210>11
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthesized oligonucleotide
<400>11
gacctcgagg gtcagaaacc ttgttaacca atag 34
<210>12
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthesized oligonucleotide
<400>12
gacctcgagg ccatagagcc caccgcatcc 30
<210>13
<211>29
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthesized oligonucleotide
<400>13
gacctcgagg ggagaaagca tgaagtaag 29
<210>14
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthesized oligonucleotide
<400>14
acgcgtcgac atgaccaaca agtgtctcct c 31
<210>15
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthesized oligonucleotide
<400>15
ctagtctaga tcagtttcgg aggtaacctg 30
<210>16
<211>1151
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<221>CDS
<222>(333)...(893)
<221>sig_peptide
<222>(333)...(395)
<221>mat_peptide
<222>(396)...(893)
<400>16
ctcgagggga gaaagcatga agtaagttct ttaaatatta caaaaaaatt gaacgatatt 60
ataaaattct ttaaaatatt aaaagtaaga acaataagat caattaaatc ataattaatc 120
acattgttca tgatcacaat ttaatttact tcatacgttg tattgttatg ttaaataaaa 180
agattaattt ctatgtaatt gtatctgtac aatacaatgt gtagatgttt attctatcga 240
aagtaaatac gtcaaaactc gaaaattttc agtataaaaa ggttcaactt tttcaaatca 300
gcatcagttc ggttccaact ctcaaggtcg ac atg acc aac aag tgt ctc ctc 353
Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu
1 5
caa att gct ctc ctg ttg tgc ttc tcc act aca gct ctt tcc atg agc 401
Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser
10 15 20
tac aac ttg ctt gga ttc cta caa aga agc agc aat ttt cag tgt cag 449
Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln
25 30 35
aag ctc ctg tgg caa ttg aat ggg agg ctt gaa tac tgc ctc aag gac 497
Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp
40 45 50 55
agg atg aac ttt gac atc cct gag gag att aag cag ctg cag cag ttc 545
Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe
60 65 70
cag aag gag gac gcc gca ttg acc atc tat gag atg ctc cag aac atc 593
Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile
75 80 85
ttt gct att ttc aga caa gat tca tct agc act ggc tgg aat gag act 641
Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr
90 95 100
att gtt gag aac ctc ctg gct aat gtc tat cat cag ata aac cat ctg 689
Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu
105 110 115
aag aca gtc ctg gaa gaa aaa ctg gag aaa gaa gat ttc acc agg gga 737
Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly
120 125 130 135
aaa ctc atg agc agt ctg cac ctg aaa aga tat tat ggg agg att ctg 785
Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu
140 145 150
cat tac ctg aag gcc aag gag tac agt cac tgt gcc tgg acc ata gtc 833
His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val
155 160 165
aga gtg gaa atc cta agg aac ttt tac ttc att aac aga ctt aca ggt 881
Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly
170 175 180
tac ctc cga aac tga tctagaccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc 936
Tyr Leu Arg Asn
185
cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc 996
actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct 1056
attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg 1116
catgctgggg atgcggtggg ctctatggcc tcgag 1151
<210>17
<211>1849
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<221>CDS
<222>(1071)...(1631)
<221>sig_peptide
<222>(1071)...(1133)
<221>mat_peptide
<222>(1134)...(1631)
<400>17
ctcgagggtc agaaaccttg ttaaccaata gagccaaata tagttaacac aatagaaatt 60
tatccaaata ttattcgtgt attgtttata gcctttgtca agtcttttac aaggcaagat 120
aataagtaat attccgtgat tggacgtaac atttcccgga agatccttag ccgataagtc 180
gaagagccgc atgtggctag agagacgcgg gtttccgacc actggcttag gcgcttattc 240
cgccataata gatgtacgtg ttcacaatta gcacccgaaa ttcgtaatag ctacgagaag 300
tatcgaatat caaaaatcta tatattaata cgtgaagcaa aaactttgta tcccttttta 360
cgaaaattgc gaggacggag gagtatgaaa tttcccacac ttatagagaa tacagagaag 420
aagtgcacaa tgctaatatt tttttaaaat aatgcataaa agatacttta aatcaataaa 480
gaaaacagca cacacactac ataccatgta tttgacgcac acacgcatgt atactattta 540
ttgtcaaact tttgttcttg acgtctgtgt tcaaactgag aatagattaa atattgtttg 600
tctttattaa tattttttaa tagtgtagtc ttggcgaaat ttgtgattat agaagtataa 660
aatacaatca taatagtgta caaacttaca attcccaatt aattatagtc gaatttcgac 720
tactgcggga cctctagtat taataattct ctttaaaaaa aaacagagca tcaaatactg 780
tcacaaatgt caagcgggtc tcaacgagcc atgaataaat tagaaatcaa ttaataacat 840
aaaataggca aacaaaataa aaccatttac atagagaacg tttgttgaac aaaaacaata 900
acttgtatac attgtttgca caaatgtttg aaccgaaaat ttattactct ctacgtaagc 960
ttgatcaaac ttcgttttcg tataaaacgc gttggcccaa ccactttggc atagtcgtct 1020
tatcatcggg tctctaagga tcaagcgatc caaagaccgc caacgtcgac atg acc 1076
Met Thr
1
aac aag tgt ctc ctc caa att gct ctc ctg ttg tgc ttc tcc act aca 1124
Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser Thr Thr
5 10 15
gct ctt tcc atg agc tac aac ttg ctt gga ttc cta caa aga agc agc 1172
Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser
20 25 30
aat ttt cag tgt cag aag ctc ctg tgg caa ttg aat ggg agg ctt gaa 1220
Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu
35 40 45 50
tac tgc ctc aag gac agg atg aac ttt gac atc cct gag gag att aag 1268
Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys
55 60 65
cag ctg cag cag ttc cag aag gag gac gcc gca ttg acc atc tat gag 1316
Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu
70 75 80
atg ctc cag aac atc ttt gct att ttc aga caa gat tca tct agc act 1364
Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr
85 90 95
ggc tgg aat gag act att gtt gag aac ctc ctg gct aat gtc tat cat 1412
Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His
100 105 110
cag ata aac cat ctg aag aca gtc ctg gaa gaa aaa ctg gag aaa gaa 1460
Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu
115 120 125 130
gat ttc acc agg gga aaa ctc atg agc agt ctg cac ctg aaa aga tat 1508
Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr
135 140 145
tat ggg agg att ctg cat tac ctg aag gcc aag gag tac agt cac tgt 1556
Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys
150 155 160
gcc tgg acc ata gtc aga gtg gaa atc cta agg aac ttt tac ttc att 1604
Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile
165 170 175
aac aga ctt aca ggt tac ctc cga aac tga cagccatctg ttgtttgccc 1654
Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
180 185
ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa 1714
tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg 1774
gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg 1834
ctctatggcc tcgag 1849
<210>18
<211>28
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthesized oligonucleotide
<400>18
acgcgtcgac atgaagctga ccgccctg 28
<210>19
<211>28
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthesized oligonucleotide
<400>19
ctagtctaga tcagggcttg gtgaagtg 28
<210>20
<211>1175
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<221>CDS
<222>(333)...(917)
<221>sig_peptide
<222>(333)...(401)
<221>mat_peptide
<222>(402)...(917)
<400>2
ctcgagggga gaaagcatga agtaagttct ttaaatatta caaaaaaatt gaacgatatt 60
ataaaattct ttaaaatatt aaaagtaaga acaataagat caattaaatc ataattaatc 120
acattgttca tgatcacaat ttaatttact tcatacgttg tattgttatg ttaaataaaa 180
agattaattt ctatgtaatt gtatctgtac aatacaatgt gtagatgttt attctatcga 240
aagtaaatac gtcaaaactc gaaaattttc agtataaaaa ggttcaactt tttcaaatca 300
gcatcagttc ggttccaact ctcaaggtcg ac atg aag ctg acc gcc ctg cag 353
Met Lys Leu Thr Ala Leu Gln
1 5
ctg ctg ctg tgg cac agc gca ctc tgg atg gtg caa gaa gcc acc ccc 401
Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Met Val Gln Glu Ala Thr Pro
10 15 20
ttg ggc cct acc agc tcc ctg ccc cag agc ttc ctg ctc aag tgc tta 449
Leu Gly Pro Thr Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu
25 30 35
gaa caa gtg agg aag gtc cag gct gat ggc aca gcg ctg cag gag agg 497
Glu Gln Val Arg Lys Val Gln Ala Asp Gly Thr Ala Leu Gln Glu Arg
40 45 50 55
ctg tgc gcc gcc cac aag ctg tgc cac cct gag gag ctg gtg ctg ctt 545
Leu Cys Ala Ala His Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu
60 65 70
ggg cac gct ctg ggc atc ccc cag gct ccc ctg agc agc tgc tcc agc 593
Gly His Ala Leu Gly Ile Pro Gln Ala Pro Leu Ser Ser Cys Ser Ser
75 80 85
cag gcc ctg cag ctg acg ggc tgc ctg cgt caa ctc cac agt ggc ctc 641
Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Arg Gln Leu His Ser Gly Leu
90 95 100
ttc ctc tac cag ggc ctc ctg cag gcc ctg gca ggg ata tcc ccc gag 689
Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile Ser Pro Glu
105 110 115
tta gcc ccc acc ctg gac atg ctg cag ctg gac atc acc gac ttt gct 737
Leu Ala Pro Thr Leu Asp Met Leu Gln Leu Asp Ile Thr Asp Phe Ala
120 125 130 135
atc aac atc tgg cag cag atg gaa gac gtg ggg atg gcc cct gca gtg 785
Ile Asn Ile Trp Gln Gln Met Glu Asp Val Gly Met Ala Pro Ala Val
140 145 150
ccg ccc acc cag ggc acc atg cca acc ttc acc tcg gcc ttc cag cgc 833
Pro Pro Thr Gln Gly Thr Met Pro Thr Phe Thr Ser Ala Phe Gln Arg
155 160 165
cgg gca gga ggc acc ctg gtt gcc tcc aac ctg cag agc ttc ctg gag 881
Arg Ala Gly Gly Thr Leu Val Ala Ser Asn Leu Gln Ser Phe Leu Glu
170 175 180
gtg gca tac cgt gct ctg cgc cac ttc acc aag ccc tga tctagaccgc 930
Val Ala Tyr Arg Ala Leu Arg His Phe Thr Lys Pro
185 190 195
tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg 990
ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt 1050
gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc 1110
aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggcc 1170
tcgag 1175
<210>21
<211>1873
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<221>CDS
<222>(1071)...(1655)
<221>sig_peptide
<222>(1071)...(1139)
<221>mat_peptide
<222>(1140)...(1655)
<400>21
ctcgagggtc agaaaccttg ttaaccaata gagccaaata tagttaacac aatagaaatt 60
tatccaaata ttattcgtgt attgtttata gcctttgtca agtcttttac aaggcaagat 120
aataagtaat attccgtgat tggacgtaac atttcccgga agatccttag ccgataagtc 180
gaagagccgc atgtggctag agagacgcgg gtttccgacc actggcttag gcgcttattc 240
cgccataata gatgtacgtg ttcacaatta gcacccgaaa ttcgtaatag ctacgagaag 300
tatcgaatat caaaaatcta tatattaata cgtgaagcaa aaactttgta tcccttttta 360
cgaaaattgc gaggacggag gagtatgaaa tttcccacac ttatagagaa tacagagaag 420
aagtgcacaa tgctaatatt tttttaaaat aatgcataaa agatacttta aatcaataaa 480
gaaaacagca cacacactac ataccatgta tttgacgcac acacgcatgt atactattta 540
ttgtcaaact tttgttcttg acgtctgtgt tcaaactgag aatagattaa atattgtttg 600
tctttattaa tattttttaa tagtgtagtc ttggcgaaat ttgtgattat agaagtataa 660
aatacaatca taatagtgta caaacttaca attcccaatt aattatagtc gaatttcgac 720
tactgcggga cctctagtat taataattct ctttaaaaaa aaacagagca tcaaatactg 780
tcacaaatgt caagcgggtc tcaacgagcc atgaataaat tagaaatcaa ttaataacat 840
aaaataggca aacaaaataa aaccatttac atagagaacg tttgttgaac aaaaacaata 900
acttgtatac attgtttgca caaatgtttg aaccgaaaat ttattactct ctacgtaagc 960
ttgatcaaac ttcgttttcg tataaaacgc gttggcccaa ccactttggc atagtcgtct 1020
tatcatcggg tctctaagga tcaagcgatc caaagaccgc caacgtcgac atg aag 1076
Met Lys
1
ctg acc gcc ctg cag ctg ctg ctg tgg cac agc gca ctc tgg atg gtg 1124
Leu Thr Ala Leu Gln Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Met Val
5 10 15
caa gaa gcc acc ccc ttg ggc cct acc agc tcc ctg ccc cag agc ttc 1172
Gln Glu Ala Thr Pro Leu Gly Pro Thr Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe
20 25 30
ctg ctc aag tgc tta gaa caa gtg agg aag gtc cag gct gat ggc aca 1220
Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Val Gln Ala Asp Gly Thr
35 40 45 50
gcg ctg cag gag agg ctg tgc gcc gcc cac aag ctg tgc cac cct gag 1268
Ala Leu Gln Glu Arg Leu Cys Ala Ala His Lys Leu Cys His Pro Glu
55 60 65
gag ctg gtg ctg ctt ggg cac gct ctg ggc atc ccc cag gct ccc ctg 1316
Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ala Leu Gly Ile Pro Gln Ala Pro Leu
70 75 80
agc agc tgc tcc agc cag gcc ctg cag ctg acg ggc tgc ctg cgt caa 1364
Ser Ser Cys Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Arg Gln
85 90 95
ctc cac agt ggc ctc ttc ctc tac cag ggc ctc ctg cag gcc ctg gca 1412
Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala
100 105 110
ggg ata tcc ccc gag tta gcc ccc acc ctg gac atg ctg cag ctg gac 1460
Gly Ile Ser Pro Glu Leu Ala Pro Thr Leu Asp Met Leu Gln Leu Asp
115 120 125 130
atc acc gac ttt gct atc aac atc tgg cag cag atg gaa gac gtg ggg 1508
Ile Thr Asp Phe Ala Ile Asn Ile Trp Gln Gln Met Glu Asp Val Gly
135 140 145
atg gcc cct gca gtg ccg ccc acc cag ggc acc atg cca acc ttc acc 1556
Met Ala Pro Ala Val Pro Pro Thr Gln Gly Thr Met Pro Thr Phe Thr
150 155 160
tcg gcc ttc cag cgc cgg gca gga ggc acc ctg gtt gcc tcc aac ctg 1604
Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Thr Leu Val Ala Ser Asn Leu
165 170 175
cag agc ttc ctg gag gtg gca tac cgt gct ctg cgc cac ttc acc aag 1652
Gln Ser Phe Leu Glu Val Ala Tyr Arg Ala Leu Arg His Phe Thr Lys
180 185 190
ccc tga cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg 1708
Pro
195
tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag 1768
gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga 1828
caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggcc tcgag 1873
【図１】遺伝子導入ベクターpigSIBの制限酵素地図を示
す図である。
す図である。
【図２】遺伝子導入ベクターpigFIBの制限酵素地図を示
す図である。
す図である。
【図３】transposaseを持つプラスミドpHA3PIGの制限酵
素地図を示す図である。
素地図を示す図である。
【図４】表１の陽性蛾区より得られた１１頭のカイコ
（G1）のゲノムDNAをEcoRV, XmnI処理した後、ネコイン
ターフェロン−ω遺伝子をプローブにしてサザンブロッ
ティング解析を行った結果を示す図である。
（G1）のゲノムDNAをEcoRV, XmnI処理した後、ネコイン
ターフェロン−ω遺伝子をプローブにしてサザンブロッ
ティング解析を行った結果を示す図である。
【図５】フィブロインＨ鎖プロモーターに連結したネコ
インターフェロン-ω遺伝子を導入した組換えカイコの
絹糸抽出液の抗ウイルス活性を示す図である。染色され
ているレーンのサンプルに活性があることを示す。
インターフェロン-ω遺伝子を導入した組換えカイコの
絹糸抽出液の抗ウイルス活性を示す図である。染色され
ているレーンのサンプルに活性があることを示す。
【図６】表３の陽性蛾区（実験１から３蛾区、実験２か
ら２蛾区）より得られたカイコ絹糸腺ゲノムＤＮＡをEc
oRIまたはBglII処理したのち、ネコインターフェロン−
ω遺伝子をプローブにしてサザンブロッティング解析を
行った結果を示す図である。
ら２蛾区）より得られたカイコ絹糸腺ゲノムＤＮＡをEc
oRIまたはBglII処理したのち、ネコインターフェロン−
ω遺伝子をプローブにしてサザンブロッティング解析を
行った結果を示す図である。
【図７】遺伝子組換えカイコ中部絹糸におけるネコイン
ターフェロンｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲによって検
出した図である。
ターフェロンｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲによって検
出した図である。
【図８】セリシンプロモーターに連結したネコインター
フェロン-ω遺伝子を導入した組換えカイコの中部絹糸
腺抽出液および繭糸抽出液の抗ウイルス活性を示す図で
ある。染色されているレーンのサンプルに活性があるこ
とを示す。
フェロン-ω遺伝子を導入した組換えカイコの中部絹糸
腺抽出液および繭糸抽出液の抗ウイルス活性を示す図で
ある。染色されているレーンのサンプルに活性があるこ
とを示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 平松 紳吾
愛知県名古屋市港区大江町９番地の１ 東
レ株式会社名古屋事業場内
(72)発明者 山田 勝成
愛知県名古屋市港区大江町９番地の１ 東
レ株式会社名古屋事業場内
(72)発明者 田村 俊樹
茨城県つくば市観音台二丁目１番地２ 独
立行政法人農業生物資源研究所内
Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA22 BA30 CA02 DA20
EA04 GA12 HA01
4B064 AG06 AG08 CA19 CA50 CC24
CE12
Claims (20)
- 【請求項１】 染色体にサイトカイン遺伝子を組み込ん
だ遺伝子組換えカイコを作製し、得られた遺伝子組換え
カイコの絹糸腺または繭糸に組換えサイトカインタンパ
ク質を生産させた後、その絹糸腺または繭糸からサイト
カインを回収することを特徴とする組換え型サイトカイ
ンの製造方法。 - 【請求項２】 絹糸腺特異的に発現するプロモーターの
下流に結合されたサイトカイン遺伝子を、染色体に組み
込むことを特徴とする請求項１記載の組換え型サイトカ
インの製造方法。 - 【請求項３】 絹糸腺特異的に発現するプロモーター
が、セリシン遺伝子のプロモーターであることを特徴と
する請求項２記載の組換え型サイトカインの製造方法。 - 【請求項４】 絹糸腺特異的に発現するプロモーター
が、フィブロインＨ鎖遺伝子のプロモーターであること
を特徴とする請求項２記載の組換え型サイトカインの製
造方法。 - 【請求項５】 サイトカイン遺伝子をトランスポゾン由
来のDNAを利用してカイコ染色体に組み込むことを特徴
とする請求項１から４に記載の組換え型サイトカインの
製造方法。 - 【請求項６】 サイトカイン遺伝子がトランスポゾン由
来の２対の末端逆位配列の間に位置することを特徴とす
る請求項５記載の組換え型サイトカインの製造方法。 - 【請求項７】 トランスポゾン由来のDNAが、昆虫由来
であることを特徴とする請求項５から６に記載の組換え
型サイトカインの製造方法。 - 【請求項８】 トランスポゾンが、鱗翅目昆虫由来のト
ランスポゾンpiggyBac由来であることを特徴とする請求
項７記載の組換え型サイトカインの製造方法。 - 【請求項９】 サイトカイン遺伝子が、インターフェロ
ン遺伝子またはコロニー刺激因子遺伝子であることを特
徴とする請求項１から８のいずれか１項記載の組換え型
サイトカインの製造方法。 - 【請求項１０】 インターフェロン遺伝子またはコロニ
ー刺激因子遺伝子が、ネコインターフェロン−ω遺伝
子、ヒトインターフェロン−β遺伝子またはネコ顆粒球
コロニー刺激因子遺伝子であることを特徴とする請求項
９記載の組換え型サイトカインの製造方法。 - 【請求項１１】 繭糸から水溶性溶媒を用いてサイトカ
インを抽出することを特徴とする請求項１から３のいず
れか１項記載の組換え型サイトカインの製造方法。 - 【請求項１２】 染色体中にサイトカイン遺伝子が導入
され、かつ、絹糸腺または繭糸にサイトカインを産生す
る性質を持つ遺伝子組換えカイコ。 - 【請求項１３】 染色体に導入されたサイトカイン遺伝
子が、インターフェロン遺伝子またはコロニー刺激因子
遺伝子であることを特徴とする請求項12記載の遺伝子組
換えカイコ。 - 【請求項１４】 染色体に導入されたインターフェロン
遺伝子またはコロニー刺激因子遺伝子が、ネコインター
フェロン−ω遺伝子、ヒトインターフェロン−β遺伝子
またはネコ顆粒球コロニー刺激因子遺伝子であることを
特徴とする請求項13記載の遺伝子組換えカイコ。 - 【請求項１５】 サイトカイン遺伝子を、絹糸腺特異的
に発現するプロモーターの下流に連結することを特徴と
するカイコ染色体への外来遺伝子導入用ベクター。 - 【請求項１６】 プロモーターが、セリシン遺伝子のプ
ロモーターであることを特徴とする請求項15記載のカイ
コ染色体への外来遺伝子導入用ベクター。 - 【請求項１７】 プロモーターが、フィブロインＨ鎖遺
伝子のプロモーターであることを特徴とする請求項15に
記載のカイコ染色体への外来遺伝子導入用ベクター。 - 【請求項１８】 サイトカイン遺伝子が、トランスポゾ
ン由来の２対の末端逆位配列の間に位置することを特徴
とする請求項15から17のいずれか１項記載のカイコ染色
体への外来遺伝子導入用ベクター。 - 【請求項１９】 サイトカイン遺伝子が、インターフェ
ロン遺伝子またはコロニー刺激因子遺伝子であることを
特徴とする請求項15から18記載のいずれか１項記載のカ
イコ染色体への外来遺伝子導入用ベクター。 - 【請求項２０】 インターフェロン遺伝子またはコロニ
ー刺激因子遺伝子が、ネコインターフェロン−ω遺伝
子、ヒトインターフェロン−β遺伝子またはネコ顆粒球
コロニー刺激因子遺伝子であることを特徴とする請求項
19記載のカイコ染色体への外来遺伝子導入用ベクター。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003045918A JP2003325188A (ja) | 2002-03-06 | 2003-02-24 | サイトカイン遺伝子組換えカイコおよびそのタンパク質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002-60374 | 2002-03-06 | ||
| JP2002060374 | 2002-03-06 | ||
| JP2003045918A JP2003325188A (ja) | 2002-03-06 | 2003-02-24 | サイトカイン遺伝子組換えカイコおよびそのタンパク質の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003325188A true JP2003325188A (ja) | 2003-11-18 |
Family
ID=29713783
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003045918A Pending JP2003325188A (ja) | 2002-03-06 | 2003-02-24 | サイトカイン遺伝子組換えカイコおよびそのタンパク質の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003325188A (ja) |
Cited By (6)
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001161214A (ja) * | 1999-12-13 | 2001-06-19 | Japan Science & Technology Corp | 形質転換カイコ |
-
2003
- 2003-02-24 JP JP2003045918A patent/JP2003325188A/ja active Pending
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