JP2006137739A - カイコ中部絹糸腺特異的遺伝子発現系を利用したタンパク質の製造方法 - Google Patents
カイコ中部絹糸腺特異的遺伝子発現系を利用したタンパク質の製造方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】セリシン遺伝子のプロモーターによって発現が制御されるGFPを有するトランスジェニックカイコを作出した。該カイコの最終齢の幼虫の絹糸腺を観察した結果、中部絹糸腺でのみ蛍光が観察された。また、吐糸期ころからGFPは中部絹糸腺の細胞から分泌され、GFPが腺腔内に移動していることがわかった。最終的にはGFPは繭糸として吐糸され、GFPを大量に含む繭が作られた。このことから、セリシン遺伝子のプロモーター領域を利用することにより、中部絹糸腺において組換えタンパク質を生産することが可能であることが分かった。また、中部絹糸腺で生産された組換えタンパク質は容易に中部絹糸腺の内腔に分泌されることが分かった。
【選択図】なし
Description
田村俊樹(1999)トランスポゾンを利用した形質転換カイコの作出方法.第7回昆虫機能研究会講演要旨、p10-22. Horn, C., B. Jaunich and E. A. Wimmer,(2000)Highly sensitive, fluorescent transformation marker for Drosophila transgenesis. Dev Genes Evol 210: 623-629. Horn, C., and E. A. Wimmer,(2000)A versatile vector set for animal transgenesis. Dev Genes Evol 210: 630-637. Thomas, J. L., M. Da Rocha, A. Besse, B. Mauchamp and G. Chavancy, 2002 3xP3-EGFP marker facilitates screening for transgenic silkworm Bombyx mori L. from the embryonic stage onwards. Insect Biochem Mol Biol 32: 247-253. Tamura, T., Thibert, C., Royer ,C., Kanda, T., Abraham, E., Kamba, M., Komoto, N., Thomas, J.-L., Mauchamp, B., Chavancy, G., Shirk, P., Fraser, M., Prudhomme, J.-C. and Couble, P. (2000) A piggyBac element-derived vector efficiently promotes germ-line transformation in the silkworm Bombyx mori L. Nature Biotechnology 18, 81-84. Berghammer, A. J., M. Klingler and E. A. Wimmer,(1999) A universal marker for transgenic insects. Nature 402: 370-371. 富田正浩、佐藤勉、安達敬泰、宗綱洋人、田村俊樹、神田俊男、吉里勝利(2001)ヒトコラーゲン遺伝子を組み込んだトランスジェニックカイコの作出.第24回日本分子生物学会年会講演要旨. Tomita M, M. H., Sato T, Adachi T, Hino R, Hayashi M, Shimizu K, Nakamura N, Tamura T, Yoshizato K.,(2003)Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol 21, 52-56 田村俊樹(2000)トランスジェニックカイコ:現状と展望.日蚕雑69、1-12. 田村俊樹(2000)カイコ発生における有用遺伝子導入.第21回基礎育種シンポジウム報告:動植物分子育種における発生工学的手法の展開。p23-29. Tamura, T., Quan, G.X., Kanda, T., and Kuwabara, N. (2001) Transgenic silkworm research in Japan: Recent progress and future. Proceeding of Joint International Symposium of Insect COE Research Program and Insect Factory Research Project. p77-82. Tomita M, M. H., Sato T, Adachi T, Hino R, Hayashi M, Shimizu K, Nakamura N, Tamura T, Yoshizato K.,(2003)Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol 21, 52-56. Imamura, M., Nakai, J., Inoue, S., Quan, G-X., Kanda T., and Tamura, T.(2003)Targeted gene expression using the GAL4/UAS system in the silkworm Bombyx mori. Genetics 165, 1329-1340. Inoue, S., Tanaka, K., Tanaka, H., Ohtomo, K., Kanda, T., Imamura, M., Quan, G-X., Kojima, K., Yamashita, T., Nakajima, T., Taira, H., Tamura, T., and Mizuno, S. (2004) Assembly of the silk fibroin elementary unit in endoplasmic reticulum and a role of L-chain for protection of α1,2-mannose residues in N-linked oligosaccharide chains of fibrohexamerin/P25. Eur. J. Biochem. 271, 1-11. Tamura, T. (2003) Silkworms: Germ line transformation technology and production of useful substance. Farming Japan 37(3), 20-25. 山田勝成・田中 貴・平松紳吾・田村俊樹(2003)絹糸中に生理活性タンパク質を産生する組換えカイコの作出.ブレインテクノニュース 97, 6-10. 田村俊樹(2003)遺伝子組換えカイコと新繊維.高分子 52 (11), 822-825. 田村俊樹(2004)組換え体カイコを利用した有用物質の生産系の開発とその展望.バイオインダストリー20(3)、28-35.
〔1〕
以下の(a)および(b)の工程を含む、任意のタンパク質の製造方法。
(a)中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、および該プロモーターによって直接的または間接的に発現制御される任意のタンパク質をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該任意のタンパク質を繭糸に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程
(b)製造されたトランスジェニックカイコから、該任意のタンパク質を回収する工程
〔2〕
中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、および該プロモーターによって直接的または間接的に発現制御される任意のタンパク質をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、該任意のタンパク質を繭糸に分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。
〔3〕
トランスジェニックカイコが、以下の(i)および(ii)に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、〔1〕または〔2〕に記載の方法。
(i)中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した任意のタンパク質をコードするDNA
〔4〕
トランスジェニックカイコが、以下の(i)および(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の方法。
(i)中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した任意のタンパク質をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ
〔5〕
転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔3〕または〔4〕に記載の方法。
〔6〕
中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質またはセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の方法。
〔7〕
中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)または(b)である、〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の方法。
(a)配列番号:1または2に記載の塩基配列を含むDNA
(b)配列番号:1または2に記載の塩基配列において1または複数の塩基が置換、欠失、付加、および/または挿入された塩基配列を含むDNA
〔8〕
任意のタンパク質が、絹糸腺細胞から絹糸腺内腔への分泌シグナルを有さないタンパク質である、〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の方法。
〔9〕
中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、および該プロモーターによって直接的または間接的に発現制御される任意のタンパク質をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該任意のタンパク質を繭糸に分泌するトランスジェニックカイコ。
〔10〕
以下の(i)および(ii)に記載のDNAを有する、〔9〕に記載のトランスジェニックカイコ。
(i)中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した任意のタンパク質をコードするDNA
〔11〕
以下の(i)および(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、〔9〕または〔10〕に記載のトランスジェニックカイコ。
(i)中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した任意のタンパク質をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ
〔12〕
転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、〔10〕または〔11〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔13〕
中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質またはセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔9〕〜〔12〕のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。
〔14〕
中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)または(b)である、〔9〕〜〔12〕のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。
(a)配列番号:1または2に記載の塩基配列を含むDNA
(b)配列番号:1または2に記載の塩基配列において1または複数の塩基が置換、欠失、付加、および/または挿入された塩基配列を含むDNA
〔15〕
任意のタンパク質が、絹糸腺細胞から絹糸腺内腔への分泌シグナルを有さないタンパク質である、〔9〕〜〔14〕のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。
〔16〕
中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
〔17〕
転写制御因子がGAL4である、〔16〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔18〕
中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質またはセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、〔16〕または〔17〕に記載のトランスジェニックカイコ。
〔19〕
中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)または(b)である、〔16〕または〔17〕に記載のトランスジェニックカイコ。
(a)配列番号:1または2に記載の塩基配列を含むDNA
(b)配列番号:1または2に記載の塩基配列において1または複数の塩基が置換、欠失、付加、および/または挿入された塩基配列を含むDNA
(a)中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、および該プロモーターによって直接的または間接的に発現制御される任意のタンパク質をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該任意のタンパク質を繭糸に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程
(b)製造されたトランスジェニックカイコから、該任意のタンパク質を回収する工程
卵の培養は、例えば、18℃〜25℃のインキュベーター、または定温の部屋に入れることによって行うことができ、幼虫の飼育は20℃〜29℃の飼育室で人工飼料を用いて行うことができる。
本発明の上記休眠卵の培養は、当業者においては、一般的なカイコ卵の培養法に従って行うことができる。例えば、「文部省(1978)蚕種製造.pp193、実教出版社、東京」に記載の方法に従って培養を行う。また、本発明におけるカイコ幼虫の飼育は、当業者においては、周知の方法によって行うことができる。例えば、「文部省(1978)蚕種製造.pp193、実教出版社、東京」に記載の方法に従って飼育を行う。
本発明において、産卵された卵が非休眠卵であるか否かは、卵の色で判定することができる。一般に、休眠卵は濃い茶褐色に着色し、非休眠卵は黄白色であることが知られている。よって、本発明においては、濃い茶褐色ではないこと、より好ましくは黄白色であることをもって産卵された卵が非休眠卵であると判定する。
本発明において、「ほぼ垂直」とは、70°〜120°を意味し、好ましくは80°〜90°を意味する。本発明において、「将来的に生殖細胞になる位置」としては、通常、卵の腹側の卵表に近い位置(通常、卵表から0.01mm〜0.05mmの位置)であり、好ましくは、卵の腹側中央の卵表に近い位置でやや後極よりの位置である。
本発明のDNAの導入方法において、好ましい態様としては、上記のカイコ卵に物理的または化学的に穴を空け、DNA注入用の管を挿入角度が該卵の腹側の側面に対してほぼ垂直となるように該穴から卵内に挿入し、DNAを注入する工程を、針とDNA注入用の管が一体型となったマニュピュレーターを使用して行う。通常、該マニュピュレーターを構成要素の1つとする装置を使用して本発明は好適に実施される。
さらに、本発明は、本発明のトランスジェニックカイコの繭を提供する。このような繭は、目的のタンパク質を大量に含有する繭として有用である。また、本発明は、該繭から製造される絹糸であって、任意のタンパク質を含む絹糸を提供する。また、公知の手法により、本発明の絹糸を含有する絹織物、例えば抗菌性絹糸を含有する絹織物を作製することができる。本発明はこのような絹織物も提供するものである。
1.材料と方法
カイコは組換えカイコ作出用の非休眠卵系統w1-pndを用いた。カイコの飼育は密閉したタッパウエア内で用い、組換えカイコ専用の飼育室内で人工飼料(農産工)を用いて行った。セリシン1遺伝子のプロモーター領域は大造系統のゲノムDNAからPCRによって調製した。プロモーター領域としてセリシン1遺伝子の上流約1kbをPCRによって増幅し(図1)、プラスミドに挿入した。このプラスミドを大腸菌で増殖し、精製した。自動シークエンサーを用いて塩基配列を確認した後、GAL4遺伝子の上流に挿入し、組換えカイコ作出用のベクタープラスミドにこの融合遺伝子を挿入した。次いで、組換え体検出のため眼での発現特性を持つ、3XP3DsRed遺伝子をこのベクターに挿入した(図2)。組換えカイコの作出はTamura ら(2000)の方法によって行った。得られた組換えカイコはImamuraら(2003)の方法で作出されたGAL4の標的配列UASの下流にレポーターとして緑色蛍光タンパク質遺伝子をもつUASGFPホモの系統と交配した。組換えカイコにおけるGFPの発現はGFPフィルターを持つ蛍光顕微鏡によって行った。
作出されたベクターの構造を図2に示した。これらのベクタープラスミドと遺伝子を導入するための転移酵素を発現するヘルパープラスミドを一緒に非休眠卵系統w1pndの産卵直後の卵に注射した。DNAを注射した卵から孵化した幼虫を人工飼料で飼育後、実験区内の蛾を互いに交配して次世代の卵を採種した。この卵を25℃でインキュベートし、6日後の胚の単眼の蛍光を、DsRedフィルターを装着した実体蛍光顕微鏡で観察した結果、眼で蛍光を発する個体が検出された。孵化直後の幼虫の単眼でDsRedを発現している個体を選抜し、飼育した。得られた成虫をImamuraら(2002)によって作出されたUASGFPホモの系統と交配した(図3)。GAL4遺伝子はマーカーである3XP3DsRed遺伝子と一緒にベクターに組み込み、組換えカイコが作られている。そのため、個体にGAL4遺伝子が組み込まれているかどうかは、眼でDsRedが発現しているかどうかによって見分けることができる。また、UASGFP遺伝子についてはホモの系統と交配しているため、全ての個体がこの遺伝子を持っている。
実施例1においては、中部絹糸腺からセリシン1遺伝子のプロモーターの下流に酵母のGAL4遺伝子を繋いだ遺伝子をカイコに導入し、GAL4の標的配列UASの下流にレポーターとして緑色蛍光タンパク質遺伝子をもつUASGFPと交配させることによって中部絹糸腺において組換えタンパク質を大量に発現する方法を作出した。この場合、中部絹糸腺で合成されたタンパク質は内腔へと分泌された。本実施例ではフィブロインタンパク質の分泌に異常があり、中部絹糸腺で発現しているセリシンのみを分泌する突然変異系統Nd-sDにこれらの遺伝子導入した系統を作出し、中部絹糸腺から組換え蛋白質としてGFPの精製を試みた結果、容易に組換えタンパク質を精製できることが分かった。
セリシン遺伝子1のプロモーターをもつGAL4(Ser1GAL4)遺伝子と標的配列UASの下流にレポーターとして緑色蛍光タンパク質遺伝子(UASGFP)をもつ正常カイコ系統とNd-sD突然変異系統を交配しF1を作成した。赤色蛍光タンパク質(DsRed)と緑色蛍光タンパク質(GFP)検出用のフィルターを備えた蛍光実体蛍光顕微鏡により、Ser1GAL4とUASGFP遺伝子を持つ個体を同定し、これらの個体を飼育した。成虫同士を交配した次世代において、再度Ser1GAL4とUASGFP遺伝子を持つ個体を残して飼育し、5齢期のカイコを解剖して突然変異系統かどうかを後部絹糸腺の発育程度によって判断した。突然変異系統の個体の中部絹糸腺を取り出し、実体顕微鏡下で中部絹糸腺の全体、中部絹糸腺の内容物に分け、水又は2%LDSで抽出した。抽出物は5℃で保存し、一部をSDSPAGE及び市販のGFP抗体を用いたウェスタンブロッテイングにより検出した。
図7に交配によってSer1GAL4とUASGFP遺伝子を導入したセリシン蚕系統の作出法を示した。この交配によりF2において目的とする個体を得ることができた。吐糸を始めた5齢のカイコを解剖し、絹糸腺を観察したところ、図8Aに示したように中部絹糸腺は十分発達していた。しかし、後部絹糸腺は正常なカイコより短く(実施例1図4の写真参照)、明らかに退化していた。また、可視光下の観察においても中部絹糸腺は緑色をしているのが分かり、緑色蛍光タンパク質GFPが大量にこの組織で生産されていることが予想された。実体蛍光顕微鏡によってこの絹糸腺を観察した結果、予想通り中部絹糸腺において強い緑色蛍光が観察され(図8B)、この部位に大量のGFPが存在することが分かった。この組織を解剖し、内容物をピンセットで取り出し、5℃の水に溶かしたところ容易に溶けることが分かった。また、2%LDS溶液では溶かすのがさらに容易であった。この溶液で溶かしたサンプルをSDSPAGEで観察した結果、ゲルをクマシーブリリアントブルーで染めた電気泳動像からも目的のバンドが観察され、大量の目的タンパク質がNd-sD突然変異系統の中部絹糸腺で合成されていることがわかった(図9)。また、この変異系統で目的タンパク質を作らせた場合は、タンパクの変成剤を用いることなく、内腔に分泌する目的タンパク質を容易に水などの溶媒で抽出できることが分かった。
Claims (19)
- 以下の(a)および(b)の工程を含む、任意のタンパク質の製造方法。
(a)中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、および該プロモーターによって直接的または間接的に発現制御される任意のタンパク質をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該任意のタンパク質を繭糸に分泌するトランスジェニックカイコを製造する工程
(b)製造されたトランスジェニックカイコから、該任意のタンパク質を回収する工程 - 中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、および該プロモーターによって直接的または間接的に発現制御される任意のタンパク質をコードするDNAを有するカイコ卵を製造する工程を含む、該任意のタンパク質を繭糸に分泌するトランスジェニックカイコの製造方法。
- トランスジェニックカイコが、以下の(i)および(ii)に記載のDNAを有するトランスジェニックカイコである、請求項1または2に記載の方法。
(i)中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した任意のタンパク質をコードするDNA - トランスジェニックカイコが、以下の(i)および(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
(i)中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した任意のタンパク質をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ - 転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、請求項3または4に記載の方法。
- 中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質またはセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)または(b)である、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
(a)配列番号:1または2に記載の塩基配列を含むDNA
(b)配列番号:1または2に記載の塩基配列において1または複数の塩基が置換、欠失、付加、および/または挿入された塩基配列を含むDNA - 任意のタンパク質が、絹糸腺細胞から絹糸腺内腔への分泌シグナルを有さないタンパク質である、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーター、および該プロモーターによって直接的または間接的に発現制御される任意のタンパク質をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコであって、該任意のタンパク質を繭糸に分泌するトランスジェニックカイコ。
- 以下の(i)および(ii)に記載のDNAを有する、請求項9に記載のトランスジェニックカイコ。
(i)中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNA
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した任意のタンパク質をコードするDNA - 以下の(i)および(ii)に記載のトランスジェニックカイコを交配させることで製造される、請求項9または10に記載のトランスジェニックカイコ。
(i)中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ
(ii)該転写制御因子の標的プロモーターの下流に、機能的に結合した任意のタンパク質をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ - 転写制御因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである、請求項10または11に記載のトランスジェニックカイコ。
- 中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質またはセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項9〜12のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。
- 中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)または(b)である、請求項9〜12のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。
(a)配列番号:1または2に記載の塩基配列を含むDNA
(b)配列番号:1または2に記載の塩基配列において1または複数の塩基が置換、欠失、付加、および/または挿入された塩基配列を含むDNA - 任意のタンパク質が、絹糸腺細胞から絹糸腺内腔への分泌シグナルを有さないタンパク質である、請求項9〜14のいずれかに記載のトランスジェニックカイコ。
- 中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に、機能的に結合した転写制御因子をコードするDNAを有するトランスジェニックカイコ。
- 転写制御因子がGAL4である、請求項16に記載のトランスジェニックカイコ。
- 中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、セリシン1タンパク質またはセリシン2タンパク質をコードするDNAのプロモーターである、請求項16または17に記載のトランスジェニックカイコ。
- 中部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターが、以下の(a)または(b)である、請求項16または17に記載のトランスジェニックカイコ。
(a)配列番号:1または2に記載の塩基配列を含むDNA
(b)配列番号:1または2に記載の塩基配列において1または複数の塩基が置換、欠失、付加、および/または挿入された塩基配列を含むDNA
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