WO2010047293A1 - 外来遺伝子発現カイコ繭の製糸方法及びそれによる製品 - Google Patents

外来遺伝子発現カイコ繭の製糸方法及びそれによる製品 Download PDF

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WO2010047293A1
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cocoon
vacuum
surfactant
approximately
enzyme
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PCT/JP2009/067977
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千幸 高林
俊樹 田村
博明 町井
哲也 飯塚
秀樹 瀬筒
謙一郎 立松
晴夫 木下
栄子 宮崎
勝成 山田
宏征 栗原
哲郎 朝倉
伸夫 桑原
純次 山口
敬 中村
圭 吉井
敦史 宮脇
智司 唐澤
里歩 青木
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独立行政法人農業生物資源研究所
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    • D—TEXTILES; PAPER
    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01B—MECHANICAL TREATMENT OF NATURAL FIBROUS OR FILAMENTARY MATERIAL TO OBTAIN FIBRES OF FILAMENTS, e.g. FOR SPINNING
    • D01B7/00—Obtaining silk fibres or filaments
    • D01B7/04—Reeling silk
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/70—Invertebrates
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a silkworm cocoon expressing a foreign gene and a product obtained by the method. More specifically, the present invention relates to a technique for drying, boiled and reeled cocoons without losing the characteristics of the foreign gene-expressing silkworm cocoons at the stage of drawing the yarn from the foreign gene-expressing silkworm cocoons.
  • the initial temperature is set to 115 ° C or higher (in some cases, 130 ° C or higher), and then the temperature is gradually decreased to 60 ° C over 5 to 6 hours. Yes.
  • boiled rice cake is usually performed using a progressive-type rice cooker.
  • Boiled koji begins with the soaking of the koji at a temperature of about 40 ° C, and is treated with a high-temperature osmosis treatment that performs steam treatment at a temperature exceeding 100 ° C. It is performed by a steaming process that performs the above, an adjustment process that gradually lowers the temperature from the boiling temperature to about 60 ° C.
  • steam and hot water are taken in and out of the cavities by a combination of steam and high-temperature water close to the boiling point and low-temperature water.
  • the cocoon layer sericin water-soluble protein covering the periphery of the cocoon yarn
  • the cocoon yarn is released from the cocoon.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to express a foreign gene without impairing the properties of the foreign protein, and without subjecting the fibroin protein and sericin protein to heat denaturation.
  • the object is to provide a method using silkworm cocoons as raw silk.
  • the present inventors do not dry the cocoon under conditions exceeding 100 ° C., which is usually performed when using the cocoon as raw silk, but at a lower temperature than the conventional one (approximately 80 ° C. or less). ) Attempted to dry the koji under the conditions.
  • boiled rice cake instead of conventional high-temperature steam treatment at 100 ° C. or higher and high-temperature water treatment near the boiling point, we tried a low-temperature vacuum infiltration treatment (decompression treatment).
  • a combined treatment of swelling of sericin with alkali and penetration of hot water into the cocoon layer with a surfactant, enzyme, etc. was tried.
  • the present inventors tried to perform the yarn spinning at a lower temperature than in the past.
  • the present inventors expressed the foreign gene in the silk gland without impairing the properties of the foreign protein contained in silkworm cocoons expressing the foreign gene, and without subjecting the fibroin protein and sericin protein to heat denaturation.
  • silkworm cocoons can be used as raw silk.
  • the present invention is based on such knowledge and provides the following [1] to [18].
  • [1] A method of using silkworms spun by a transgenic silkworm as raw silk, which is vacuum infiltrated with a low-temperature solution containing at least one of an alkali agent, a surfactant, an enzyme and the like.
  • a method using raw silk as a silkworm spun by a transgenic silkworm containing a foreign protein in the silk gland comprising the following steps (a) to (g): (A) drying the cocoon spun by a transgenic silkworm containing a foreign protein in the silk gland, (B) a step of immersing the straw of step (a) in low-temperature hot water (approximately 80 ° C. or less); (C) a step of vacuum permeating the straw of step (b) with low-temperature hot water (approximately 80 ° C.
  • step (D) a step of vacuum dewatering the bag of step (c);
  • step (E) A step of vacuum permeating the straw of step (d) with low temperature hot water (approximately 80 ° C. or lower),
  • step (F) A step of immersing the cocoon in step (e) in water, and
  • step (g) a step of spinning the cocoon in step (f) under conditions of low temperature (approximately 50 ° C. or less).
  • the foreign protein is selected from the group consisting of a fluorescent chromoprotein, a protein having cell adhesion activity, a peptide mainly composed of acidic and alkaline amino acids, and fibroin protein and sericin protein derived from organisms other than silkworms, [1 ] To [8].
  • Raw silk obtained by the method according to [1] to [9].
  • a knitted fabric and a woven fabric obtained from the raw yarn according to [10].
  • [12] A three-dimensional structure obtained from the raw silk according to [10].
  • a method for producing a genetically modified raw silk comprising the following steps (a) to (g); (A) drying the cocoon spun by a transgenic silkworm containing a foreign protein in the silk gland, (B) a step of immersing the straw of step (a) in a solution containing an alkali agent and a surfactant, or an enzyme and a surfactant, (C) A step of vacuum permeating the soot of step (b) in a solution containing an alkali agent and a surfactant, or an enzyme and a surfactant, (D) a step of vacuum dewatering the bag of step (c); (E) A step of vacuum permeating the soot in step (d) in a solution containing an alkali agent and a surfactant, or an enzyme and a surfactant, (F
  • a method for producing a genetically modified raw silk comprising the following steps (a) to (g); (A) drying the cocoon spun by a transgenic silkworm containing a foreign protein in the silk gland, (B) a step of immersing the straw of step (a) in low-temperature hot water (approximately 80 ° C. or less); (C) a step of vacuum permeating the straw of step (b) with low-temperature hot water (approximately 80 ° C. or lower); (D) a step of vacuum dewatering the bag of step (c); (E) A step of vacuum permeating the straw of step (d) with low temperature hot water (approximately 80 ° C.
  • step (F) A step of immersing the cocoon in step (e) in water, and (g) a step of spinning the cocoon in step (f) under conditions of low temperature (approximately 50 ° C. or less).
  • step (a) The method according to [15] or [16], wherein in the step (a), the koji is dried under conditions of about 80 ° C. or less.
  • step (a) The method according to [15] or [16], wherein the cocoon is dried under vacuum conditions in the step (a).
  • PTFE Teflon (trademark) type resin
  • the present invention is characterized in that a silkworm gland spun by a transgenic silkworm containing a foreign protein in a silk gland is characterized by being vacuum infiltrated with a low-temperature solution containing at least one of an alkaline agent, a surfactant, an enzyme and the like. On how to do.
  • the present invention also relates to a method for producing a genetically modified raw silk. More specifically, the present invention relates to a method of using raw silk as a silkworm spun by a transgenic silkworm containing a foreign protein in a silk gland including the following steps.
  • the present invention also relates to a method for producing a genetically modified raw silk comprising the following steps.
  • a silkworm spun by a transgenic silkworm In the present invention, first, a transgenic silkworm containing a foreign protein in a silk gland is obtained.
  • a transgenic silkworm containing a foreign protein in the silk gland encodes the foreign protein in, for example, a DNA encoding a protein expressed specifically in the posterior silk gland (eg, a gene encoding a fibroin H chain or L chain protein).
  • a person skilled in the art can produce and obtain a transgenic silkworm containing a foreign protein in the silk gland according to the contents disclosed in the following documents, for example, by a known technique described in the following documents. It is not limited to.
  • the transgenic silkworm of the present invention has a foreign protein in the silk gland.
  • foreign proteins contained in the silk thread include fluorescent and pigment proteins such as CFP, GFP, YFP, DsRed, KO, KikGr, Kaede, and Dronpa, and proteins having cell adhesion activity such as collagen, fibronectin, and cell growth factors.
  • Peptides mainly composed of acidic and alkaline amino acids such as aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, histidine, fibroin protein and sericin protein derived from organisms other than silkworms such as spiders, yamaga yuga, pearl oysters, and peptides derived from the primary structure
  • cocoons spun by transgenic silkworms containing foreign proteins in the silk gland are approximately 80 degrees or less (for example, 79 degrees, 78 degrees, 77 degrees, 76 degrees, 75 degrees, 74 degrees). , 73 degrees, 72 degrees, and 71 degrees, but not limited thereto). More preferably, it is 70 degrees or less, and more preferably 60 degrees or more and 70 degrees or less (for example, 61 degrees, 62 degrees, 63 degrees, 64 degrees, 65 degrees, 66 degrees, 67 degrees, 68 degrees, 69 degrees are mentioned.
  • the koji can be dried using a hot air drier, or a vacuum drier or a microwave (electromagnetic wave).
  • the degree to which the cocoon is dried varies depending on its variety and properties, but 36-44% (eg 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%) (But not limited to these) is preferably dried until a drying rate is obtained.
  • the koji is preferably dried for about 20 to 24 hours (for example, but not limited to 20 hours, 21 hours, 22 hours, 23 hours, and 24 hours).
  • a person skilled in the art can appropriately determine the drying rate according to the properties of the koji. For example, a dry percentage of 42-43% is appropriate for ordinary salmon such as “Chunchong x Kangetsu”, but a smaller percentage of dryness can be selected when the weight is heavy for the weight of the salmon layer. (For example, the drying rate can be about 36-38%).
  • the silkworm spun by a transgenic silkworm containing a foreign protein in the silk gland instead of drying the silkworm spun by a transgenic silkworm containing a foreign protein in the silk gland under a condition of approximately 80 degrees or less, it may be dried under a vacuum condition or at a room temperature and a vacuum condition.
  • drying under a temperature of 80 degrees or less, under vacuum conditions, or at room temperature and under vacuum conditions can be performed using a hot air drier, or using a vacuum drier or microwave (electromagnetic wave). It can also be done.
  • the soot is dried at a constant temperature of 60 ° C., as shown in FIG. 1, it is possible to reach a drying rate of about 45% by taking about 24 hours.
  • the soot obtained in this way can be stored without soot.
  • the drying can be performed more efficiently than when drying with hot air alone.
  • the soot is immersed in a solution containing at least one of an alkali agent, a surfactant, an enzyme and the like. More preferably, the soot is immersed in a solution containing an alkaline agent and a surfactant or a solution containing an enzyme and a surfactant.
  • the alkaline agent of the present invention includes, but is not limited to, sodium carbonate and sodium hydrogen carbonate.
  • the surfactant of the present invention includes, but is not limited to, nonionic surfactants, anionic surfactants, cationic surfactants, and amphoteric surfactants.
  • nonionic surfactants include, but are not limited to, polyoxyethylene alkyl ethers, fatty acid sorbitan esters, alkyl polyglucosides, fatty acid diethanolamides, alkyl monoglyceryl ethers, and the like.
  • examples of the anionic surfactant include, but are not limited to, fatty acid sodium, monoalkyl sulfate, alkyl polyoxyethylene sulfate, alkyl benzene sulfonate, and monoalkyl phosphate.
  • cationic surfactant examples include, but are not limited to, alkyltrimethylammonium salt, dialkyldimethylammonium salt, alkylbenzyldimethylammonium salt and the like.
  • amphoteric surfactants include, but are not limited to, alkyl dimethylamine oxide and alkyl carboxybetaine.
  • the enzyme of the present invention includes, but is not limited to, a proteolytic enzyme.
  • proteolytic enzymes include, but are not limited to, serine protease, aspartic protease, cysteine protease, metalloprotease, papain enzyme, and alcalase.
  • the immersion treatment can be performed, for example, as follows, but is not limited thereto.
  • the soot placed in a metal net is immersed in a mixed solution (treated water) of 0.15% sodium carbonate and 0.3% nonionic surfactant for 20 minutes.
  • a mixed solution treated water
  • sodium carbonate and 0.3% nonionic surfactant for 20 minutes.
  • sodium carbonate 0.15% sodium carbonate
  • nonionic surfactant for 20 minutes.
  • sodium carbonate the concentration of the surfactant
  • the treatment time depending on the properties of the soot.
  • a solution containing an enzyme and a surfactant is more preferable.
  • Enzyme and surfactant combinations include any combination that can be identified from the enzymes and surfactants described herein.
  • soot is vacuum infiltrated in a solution containing at least one of an alkali agent, a surfactant, and an enzyme. More preferably, the soot is immersed in a solution containing an alkaline agent and a surfactant or a solution containing an enzyme and a surfactant. Examples of the alkali agent, surfactant, and enzyme include those described above.
  • the vacuum infiltration treatment (reduced pressure infiltration treatment) can be performed, for example, by the following method. The soaked soot is moved to a vacuum apparatus while being put in the treated water to make a vacuum.
  • the degree of vacuum is about -620 mmHg (eg, about -640 mmHg to -600 mmHg, more preferably about -630 mmHg to -610 mmHg), but is not limited thereto.
  • the degree of vacuum reaches, for example, -620 mmHg
  • the pressure is restored to normal pressure over 5 to 10 minutes.
  • the treated water gradually permeates into the soot layer due to the pressure difference inside and outside the fistula. If the pressure is suddenly restored at this time, the treated water tends to enter the fistula at a stretch, and the wrinkle may be crushed by the pressure difference.
  • the vacuum infiltration treatment is also preferably performed with a solution containing the alkali agent and the surfactant.
  • the vacuum infiltration treatment is also preferably performed with a solution containing the enzyme and the surfactant.
  • the term “vacuum” is not limited to absolute vacuum, but also includes reduced pressure.
  • the soot that has been vacuum infiltrated in a solution containing at least one of an alkaline agent, a surfactant, and an enzyme is dehydrated in a vacuum.
  • the method of vacuum dehydration is not particularly limited.
  • the soot can be dehydrated in vacuum by the following method.
  • the soot that has been subjected to vacuum infiltration is pulled up from the treated water, and vacuum processing is performed with a vacuum device.
  • the degree of vacuum is preferably about -620 mmHg as described above (for example, -640 mmHg to -600 mmHg, more preferably -630 mmHg to -610 mmHg, but not limited thereto), but is not limited thereto.
  • This vacuum treatment is preferably performed gradually, for example, taking 5 to 10 minutes.
  • the treated water in the cavity can be gradually discharged out of the soot layer.
  • the vacuum treatment is suddenly performed, the solution passes through a place where the soot layer is thin or where the treated water is easy to pass, and therefore, a uniform boiling process may not be performed.
  • the soot dehydrated in a vacuum contains an alkali agent and a surfactant, or an enzyme and a surfactant again.
  • Perform vacuum infiltration treatment in solution The vacuum infiltration treatment can be performed, for example, by the above-described method, but is not limited to this method.
  • the vacuum infiltration treatment can be performed, for example, by the above-described method, but is not limited to this method.
  • the dissociation property of the kite can be increased.
  • there are problems such as an increase in the starting yarn and a decrease in the raw yarn yield.
  • the vacuum infiltration, vacuum dehydration, and vacuum infiltration cycles can be repeated once or twice.
  • this treatment is preferably performed gradually over time when the treated water is infiltrated into the fistula by vacuum treatment.
  • the treated water in the cavity is discharged out of the cavity by vacuum treatment, it is preferable to shift to a vacuum state over time.
  • the boiled cocoon treatment it is important to gradually swell and soften sericin at the glued portion of the cocoon yarn in the cocoon layer.
  • an alkali agent, an enzyme, or the like plays a role of swelling and softening of sericin
  • a surfactant plays a role of penetrating into the glued portion of the cocoon yarn.
  • immersion treatment or vacuum infiltration treatment it is preferable to perform the vacuum infiltration treatment again with a solution containing the alkali agent and the surfactant.
  • immersion treatment or vacuum infiltration treatment it is preferable to perform the vacuum infiltration treatment again with a solution containing the enzyme and the surfactant.
  • the soot is soaked in water.
  • the surface of the koji obtained by the boiled koji treatment up to (6) is covered with alkali. If left as it is, the sericin tends to swell due to the alkali adhering to the surface of the cocoon layer, and the string increases. Therefore, it is necessary to immerse in normal temperature water to converge the sericin on the surface of the cocoon layer.
  • the soot is immersed in water until the alkali attached to the surface of the soot layer is removed and sericin on the surface of the soot layer is converged (for example, about 10 to 20 minutes).
  • the spinning is performed under the condition of 60 ° C. or less. More preferably 50 degrees or less, more preferably 35 degrees to 45 degrees (for example, 35 degrees, 36 degrees, 37 degrees, 38 degrees, 39 degrees, 40 degrees, 41 degrees, 42 degrees, 43 degrees, 44 degrees, 45 degrees are included, but not limited thereto).
  • the reeling can be performed by an automatic reeling machine, a multi-spindle spinning machine or a counterspinner.
  • the cocoon yarn is drawn from the cocoon obtained by swelling and softening the cocoon layer sericin by the above method, and several yarns are conjugated with sericin to form one raw yarn.
  • the surface of the cocoon Prior to reeling, the surface of the cocoon is rubbed in a hot water of approximately 80 ° C or less (bundled with rice ears) and the surface of the cocoon is pulled out (referred to as cord), and then a single thread end. Until it becomes, it draws out further and becomes the cord / code (it is called the abstract).
  • a number of gathering devices for example, made of pottery, with a thin hole in the center
  • the raw silk that passed through is returned to the vicinity of the collector again with two drums provided on the collector, and combined with the yarn just raised from the collector (referred to as kennel sword) in a small frame Wind up.
  • the counter-feeder and the multi-spindle reel are wound at a constant number of yarns to meet the target fineness (fixed grain type), and the automatic reel is controlled by a fineness sensor so that the thickness is constant (fixed). Fiber type).
  • the automatic reel is controlled by a fineness sensor so that the thickness is constant (fixed). Fiber type).
  • the present invention also provides a method of using silkworms spun by a transgenic silkworm containing a foreign protein in a silk gland including the following steps (a) to (g) as raw silk. Moreover, the manufacturing method of the genetically modified raw silk including the process of the following (a) to (g) is provided.
  • step (C) a step of vacuum permeating the straw of step (b) with low-temperature hot water (approximately 80 ° C. or lower);
  • step (D) a step of vacuum dewatering the bag of step (c);
  • E) A step of vacuum permeating the straw of step (d) with low temperature hot water (approximately 80 ° C. or lower),
  • F) A step of immersing the cocoon in step (e) in water, and (g) a step of spinning the cocoon in step (f) under conditions of low temperature (approximately 50 ° C. or less).
  • low-temperature hot water of 80 degrees or less (for example, but not limited to 79 degrees, 78 degrees, 77 degrees, 76 degrees, 75 degrees, 74 degrees, 73 degrees, 72 degrees, and 71 degrees)
  • it is low-temperature hot water at 70 degrees or less (for example, but not limited to 69 degrees, 68 degrees, 67 degrees, 66 degrees, 65 degrees, 64 degrees, 63 degrees, 62 degrees, 61 degrees), and more preferably 55 degrees.
  • a low-temperature hot water having a temperature of not less than 60 degrees and not more than 60 degrees (for example, but not limited to 56 degrees, 57 degrees, 58 degrees, and 59 degrees) is used.
  • the present invention also provides raw silk obtained by the above method. Furthermore, this invention provides the knitting and textile fabric obtained from the said raw silk. In addition, the present invention provides a three-dimensional structure obtained from the raw silk. Examples of the three-dimensional structure of the present invention include lampshades, dresses such as dresses, jackets, shawls, kimonos, belts, clothes, panels, wallpaper, chair sheets, business cards, book covers, etc. Not. Lamp shades, dresses such as dresses, jackets, shawls, kimonos, belts, clothes, panels, wallpaper, chair sheets, business cards, book covers, etc. can be created by well-known methods.
  • this invention provides the medical material produced from the raw silk obtained by the method of this invention.
  • medical materials include, but are not limited to, surgical sutures, artificial blood vessels, artificial skin, artificial tendons, artificial bones, and corneal culture films. Processing for using the raw silk of the present invention for medical materials can be performed by methods known to those skilled in the art. It should be noted that all prior art documents cited in the present specification are incorporated herein by reference.
  • Example 1 Silkworm silkworm silkworm expressing a foreign gene in the silk thread line 1.
  • Method 1.1 Drying process Usually, a drying method is performed in which the temperature is gradually lowered from the maximum temperature of 115 ° C. to 120 ° C. and then changed to 60 ° C. after about 5 hours and 30 minutes. In this case, a dry rate of about 42% is obtained.
  • the temperature gradient was not taken, and the soot was put in a dryer maintained at a constant temperature of 60 ° C., and the soot was dried over 20 to 24 hours. As a result, the intended drying rate was obtained (FIG. 1).
  • boiling is performed using an alkali agent, a surfactant, an enzyme or the like.
  • an alkaline agent and surfactant 0.1-0.4% sodium carbonate and 0.2-0.4% nonionic surfactant were prepared, and the silkworm of the foreign gene expression silkworm was immersed in it for 20 minutes. Thereafter, the pressure was reduced to ⁇ 600 mmHg in a vacuum container, and the pressure was gradually restored after being left in that state, and the solution was gradually permeated into the cavity.
  • the cocoon yarn is dissociated from the boiled cocoon in the refining tank at about 40 ° C., and the raw yarn is wound around a small frame in an atmosphere at about 60 ° C.
  • the cord temperature, the temperature of the revolving tank were set to 50 ° C.
  • the temperature of the small frame portion was set to 40 ° C.
  • the cord and the yarn were fed.
  • Results Table 1 shows the results of spinning silkworm silkworms that express foreign genes in the silk thread. Conventionally, it has been impossible to carry out spinning at a low temperature of 60 ° C. or lower, but it has been possible to carry out the spinning by using the method of the present invention.
  • the present invention provides an unprecedented technique for producing silkworms by low-temperature treatment for silkworm cocoons that express foreign genes in the silk thread line. This is applicable not only to silkworm cocoons that express a foreign gene in the silk thread, but also to normal varieties that are usually used.
  • Example 2 Use of fluorescent silk-colored transgenic silk thread as an interior material.
  • the transgenic silk thread that develops fluorescence is directly wound around a spherical formwork while being glued with sericin that it has, dried, and then removed from the formwork.
  • the interior produced by such a method is shown in FIG.
  • the left side of FIG. 3 has no light source on the inside (only the light from the outside), FIG. 3 uses white light as the light source, and the right side of FIG. 3 uses black light as the light source. It was confirmed that the interior was made of transgenic silk that produces fluorescent light, and that the fluorescent light was emitted by black light.
  • FIG. 4 shows a state in which an artificial blood vessel substrate made of transgenic silk thread and an artificial blood vessel substrate made of PTFE (Teflon (registered trademark) resin) are transplanted into a rat.
  • FIG. 6 shows a state in which 3 months have passed after the transplantation into rats. It can be seen that cell proliferation is progressing in the artificial blood vessel substrate using the transgenic silk thread.
  • Transgenic silkworms with fluorescence have a green fluorescent protein (GFP) or red fluorescent protein (DsRed) gene in the vector described in Kojima et al. (2007) or Kurihara et al. (2007). Inserted and purified DNA from E. coli as a plasmid. This vector plasmid was injected into silkworm eggs according to the method of Tamura et al. (2007). In the next generation of larvae hatched from the eggs injected with the plasmid, transgenic silkworms were identified and systematized by embryonic monocular and fluorescence of pupae.
  • GFP green fluorescent protein
  • DsRed red fluorescent protein
  • transgenic silkworms that were systematized were crossed with practical varieties and selected and bred to improve the spider trait, and the resulting Japanese line was crossed with the Chinese line to create F1.
  • transgenic silkworm cocoons with fluorescence were prepared.
  • the method of the present invention it is possible to obtain raw silk in which the characteristics of silkworm spun by silkworms expressing a foreign gene in the silk gland are utilized as they are.
  • the present invention is useful when silkworm silkworms expressing foreign genes are used as raw silk.

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Abstract

　通常繭を生糸とする際に行われているような100℃を越える条件下での繭の乾燥ではなく、低温（60℃以下）条件下で繭を乾燥させた。また煮繭においては、従来の100℃以上の高温処理や沸点近くの高温水処理ではなく、低温かつ真空浸透処理（減圧処理）を行った。またこれとは異なる煮繭方法として、アルカリによるセリシンの膨潤、界面活性剤、酵素等による繭層への湯水の浸透の組み合わせ処理を行った。さらに、従来よりも低温で繰糸を行った。 　その結果、外来遺伝子を発現するカイコの繭に含まれる外来タンパク質の性質を損なうことなく、外来遺伝子を発現するカイコの繭を生糸とすることが可能であることがわかった。

Description

外来遺伝子発現カイコ繭の製糸方法及びそれによる製品
　本発明は、外来遺伝子発現カイコ繭の製糸方法及び当該方法により得られる製品に関する。より具体的には本発明は、外来遺伝子発現カイコ繭から糸を引き出す段階において、外来遺伝子発現カイコ繭の特性を失わせることなく繭を乾燥、煮繭、繰糸する技術に関する。
　生繭の中の蛹は、そのままおいておけば蛾に変態し、繭糸によって構成される繭殻の繭糸を押しのけ、蛾として繭殻から出る。これによりその繭は繰糸不能となるため、蛾が繭殻から出る前に、殺蛹と繭乾燥を行う必要がある。通常繭乾燥を行う場合、初期温度を115℃以上（130℃以上で行う場合もある）とし、その後徐々に温度を下げ、５時間から６時間かけて60℃まで下げるなどの方法が行われている。
　また煮繭は通常、進行式煮繭機を用いて行われる。煮繭は、40℃程度の温度における繭糸の浸漬から始まり、100℃を超える温度にて蒸気処理を行う浸透高温処理、その後75℃くらいの低温部へ繭糸を入れる浸透低温処理、その後再び蒸気処理を行う触蒸処理、沸騰温度から徐々に60℃位まで温度を下げる調整処理等により行われる。このように煮繭では、蒸気及び沸点に近い高温水と低温水を組み合わせた処理により、繭腔内へ蒸気や湯の出し入れを行う。これにより、繭層セリシン（繭糸の周りを覆っている水溶性タンパク質）が膨潤柔和され、繭からの繭糸の解れが良くなる。
　繰糸では、約90℃熱水の中の繭から稲穂の穂先を利用して繭から糸口を出す索緒（さくちょ）を行い、糸口を出し繰糸を行う。
　このような従来の製糸方法では、絹タンパクは高温により熱変性を受ける。その結果、絹の染色性や織物の風合いが損なわれる。近年、外来タンパク質を含有するカイコ繭の作出が行われているが、外来タンパク質の性質を損なうことなく繭を生糸とする技術が求められている。
　なお、本発明の先行技術文献を以下に示す。
低温薬品煮繭装置：松本介・真砂義郎・勝野盛夫、実用新案出願公開　昭55-11197 真空煮繭機：西尾方男、特許公報　昭49-13926
　本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、本発明の課題は、外来タンパク質の性質を損なうことなく、またフィブロインタンパク質、セリシンタンパク質が熱変性を受けずに、外来遺伝子を発現するカイコの繭を生糸とする方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するに当たり、通常繭を生糸とする際に行われているような100℃を越える条件下での繭の乾燥ではなく、従来よりも低温（概ね80℃以下）条件下での繭の乾燥を試みた。また煮繭においては、従来の100℃以上の高温蒸気処理や沸点近くの高温水処理ではなく、従来よりも低温かつ真空浸透処理（減圧処理）を試みた。またこれとは異なる煮繭方法として、アルカリによるセリシンの膨潤、界面活性剤、酵素等による繭層への湯水の浸透の組み合わせ処理を試みた。さらに本発明者らは、従来よりも低温で繰糸を行うことを試みた。
　その結果本発明者らは、外来遺伝子を発現するカイコの繭に含まれる外来タンパク質の性質を損なうことなく、またフィブロインタンパク質、セリシンタンパク質が熱変性を受けずに、絹糸腺中に外来遺伝子を発現するカイコの繭を生糸とすることが可能であることを見出した。本発明はこのような知見に基づくものであり、次の〔１〕～〔１８〕を提供する。
〔１〕アルカリ剤、界面活性剤、酵素等の少なくとも１つを含む低温溶液で真空浸透することを特徴とする、トランスジェニックカイコが吐糸した繭を生糸とする方法。
〔２〕下記（ａ）から（ｇ）の工程を含む、〔１〕に記載の方法；
（ａ）絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランスジェニックカイコが吐糸した繭を乾燥させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の繭をアルカリ剤及び界面活性剤、又は酵素及び界面活性剤を含む溶液に浸漬する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の繭をアルカリ剤及び界面活性剤、又は酵素及び界面活性剤を含む溶液中で真空浸透する工程、
（ｄ）工程（ｃ）の繭を真空脱水する工程、
（ｅ）工程（ｄ）の繭をアルカリ剤及び界面活性剤、又は酵素及び界面活性剤を含む溶液中で真空浸透する工程、
（ｆ）工程（ｅ）の繭を水に浸漬する工程、及び
（ｇ）工程（ｆ）の繭を低温（概ね５０℃以下）の条件下で繰糸する工程。
〔３〕工程（ａ）において概ね８０℃以下の条件下にて繭を乾燥させる、〔２〕に記載の方法。
〔４〕工程（ａ）において真空条件下にて繭を乾燥させる、〔２〕に記載の方法。
〔５〕アルカリ剤が炭酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムからなる群より選択され、界面活性剤がノニオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤、カチオン系界面活性剤、及び両性界面活性剤からなる群より選択され、酵素がタンパク質分解酵素である、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕下記（ａ）から（ｇ）の工程を含む、絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランスジェニックカイコが吐糸した繭を生糸とする方法；
（ａ）絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランスジェニックカイコが吐糸した繭を乾燥させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の繭を低温湯水（概ね８０℃以下）に浸漬する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の繭を低温湯水中（概ね８０℃以下）で真空浸透する工程、
（ｄ）工程（ｃ）の繭を真空脱水する工程、
（ｅ）工程（ｄ）の繭を低温湯水中（概ね８０℃以下）で真空浸透する工程、
（ｆ）工程（ｅ）の繭を水に浸漬する工程、及び
（ｇ）工程（ｆ）の繭を低温（概ね５０℃以下）の条件下で繰糸する工程。
〔７〕工程（ａ）において概ね８０℃以下の条件下にて繭を乾燥させる、〔６〕に記載の方法。
〔８〕工程（ａ）において真空条件下にて繭を乾燥させる、〔６〕に記載の方法。
〔９〕外来タンパク質が蛍光色素タンパク質、細胞付着活性を有するタンパク質、酸性及びアルカリ性のアミノ酸を主とするペプチド、及びカイコ以外の生物由来のフィブロインタンパク質及びセリシンタンパク質からなる群より選択される、〔１〕から〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕〔１〕から〔９〕に記載の方法によって得られる生糸。
〔１１〕〔１０〕に記載の生糸から得られる編み物及び織物。
〔１２〕〔１０〕に記載の生糸から得られる立体構造物。
〔１３〕〔１０〕に記載の生糸から作成される医療用資材。
〔１４〕手術用縫合糸、人工血管、人工皮膚、人工腱、人工骨、及び角膜培養のフィルムからなる群より選択される〔１３〕に記載の医療用資材。
〔１５〕下記（ａ）から（ｇ）の工程を含む遺伝子組換え生糸の製造方法；
（ａ）絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランスジェニックカイコが吐糸した繭を乾燥させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の繭をアルカリ剤及び界面活性剤、又は酵素及び界面活性剤を含む溶液に浸漬する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の繭をアルカリ剤及び界面活性剤、又は酵素及び界面活性剤を含む溶液中で真空浸透する工程、
（ｄ）工程（ｃ）の繭を真空脱水する工程、
（ｅ）工程（ｄ）の繭をアルカリ剤及び界面活性剤、又は酵素及び界面活性剤を含む溶液中で真空浸透する工程、
（ｆ）工程（ｅ）の繭を水に浸漬する工程、及び
（ｇ）工程（ｆ）の繭を低温（概ね５０℃以下）の条件下で繰糸する工程。
〔１６〕下記（ａ）から（ｇ）の工程を含む遺伝子組換え生糸の製造方法；
（ａ）絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランスジェニックカイコが吐糸した繭を乾燥させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の繭を低温湯水（概ね８０℃以下）に浸漬する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の繭を低温湯水中（概ね８０℃以下）で真空浸透する工程、
（ｄ）工程（ｃ）の繭を真空脱水する工程、
（ｅ）工程（ｄ）の繭を低温湯水中（概ね８０℃以下）で真空浸透する工程、
（ｆ）工程（ｅ）の繭を水に浸漬する工程、及び
（ｇ）工程（ｆ）の繭を低温（概ね５０℃以下）の条件下で繰糸する工程。
〔１７〕工程（ａ）において概ね８０℃以下の条件下にて繭を乾燥させる、〔１５〕又は〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕工程（ａ）において真空条件下にて繭を乾燥させる、〔１５〕又は〔１６〕に記載の方法。
繭の乾燥歩合の時間変化を示すグラフである。 絹糸線内に外来遺伝子を発現するカイコの繭の煮繭例を示す図である。 蛍光発色するトランスジェニック繭糸のインテリア用素材としての利用を示す写真である。 細胞付着性を有するトランスジェニック繭糸より作成した人工血管を示す写真である。 トランスジェニック繭糸による人工血管基材とPTFE(テフロン（登録商標）系樹脂）による人工血管基材をラットへ移植した状態を示す写真である。 トランスジェニック繭糸による人工血管基材とPTFE(テフロン（登録商標）系樹脂）による人工血管基材をラットへ移植後３ヶ月経過した状態を示す写真である。
　本発明は、アルカリ剤、界面活性剤、酵素等の少なくとも１つを含む低温溶液で真空浸透することを特徴とする、絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランスジェニックカイコが吐糸した繭を生糸とする方法に関する。また本発明は、遺伝子組換え生糸の製造方法に関する。
　より具体的には本発明は、以下の工程を含む絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランスジェニックカイコが吐糸した繭を生糸とする方法に関する。また本発明は、以下の工程を含む遺伝子組換え生糸の製造方法に関する。
（ａ）絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランスジェニックカイコが吐糸した繭を概ね８０℃以下の条件下にて、真空条件下にて、又は常温かつ真空条件下にて乾燥させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の繭をアルカリ剤及び界面活性剤、又は酵素及び界面活性剤を含む溶液に浸漬する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の繭をアルカリ剤及び界面活性剤、又は酵素及び界面活性剤を含む溶液中で真空浸透する工程、
（ｄ）工程（ｃ）の繭を真空脱水する工程、
（ｅ）工程（ｄ）の繭をアルカリ剤及び界面活性剤、又は酵素及び界面活性剤を含む溶液中で真空浸透する工程、
（ｆ）工程（ｅ）の繭を水に浸漬する工程、及び
（ｇ）工程（ｆ）の繭を低温（概ね50℃以下）の条件下で繰糸する工程。
（１）トランスジェニックカイコが吐糸した繭
　本発明ではまず、絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランスジェニックカイコを取得する。絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランスジェニックカイコは、例えば、後部絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNA（例えば、フィブロインH鎖またはL鎖のタンパク質をコードする遺伝子）に、外来タンパク質をコードするDNAを繋ぎ、この融合遺伝子を有するトランスジェニックカイコを作ることによって取得することができる。当業者であれば、例えば以下の文献に開示された内容に従い、絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランスジェニックカイコを以下の文献に記載の公知の手法によって製造、取得することが出来るがこれらの方法に限定されない。
・ 特開2006-137739
・ WO2008/081922
・ Tamura, T., Thibert, C., Royer, C., Kanda, T., Abraham, E., Kamba, M., Komoto, N., Thomas, J.L., Mauchamp, B., Chavancy, G., Shirk, P., Fraser, M., Prudhomme, J.C., Couble, P., Toshiki, T., Chantal, T., Corinne, R., Toshio, K., Eappen, A., Mari, K., Natuo, K., Jean-Luc, T., Bernard, M., Gerard, C., Paul, S., Malcolm, F., Jean-Claude, P. and Pierre, C. (2000) Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol, 18, 81-84
・ Tomita, M., Munetsuna, H., Sato, T., Adachi, T., Hino, R., Hayashi, M., Shimizu, K., Nakamura, N., Tamura, T. and Yoshizato, K. (2003) Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol, 21, 52-56.
・ Yamao, M., Katayama, N., Nakazawa, H., Yamakawa, M., Hayashi, Y., Hara, S., Kamei, K. and Mori, H. (1999) Gene targeting in the silkworm by use of a baculovirus. Genes Dev, 13, 511-516.
・ Kojima K, Kuwana Y, Sezutsu H,Kobayashi I, Uchino K, Tamura T, Tamada Y. 2007. New Method for Modification of Fibroin Heavy Chain Protein in Transgenic Silkworm. Biosci BiotechnolBiochem.71, 2943-2951.
・ Kurihara H, Sezutsu H, Tamura T, YamadaK. 2007. Production of an active feline interferon in the cocoonof transgenic silkworms using the fibroin H-chain expression system.Biochem. Biophys. Res. Commun. 355, 976-980.
・ Tamura, T., Kuwabara, K., Uchino, K.,Kobayashi, I., and Kanda,T. 2007 An Improved DNA Injection Method forSilkworm Eggs Drastically Increases the Efficiency of ProducingTransgenic Silkworms. J. Insect Biotechnol. Sericol.76,155-159.
・ Yanagisawa S, Zhu Z, Kobayashi I,Uchino K, Tamada Y, Tamura T, Asakura T. 2007. Improving Cell-AdhesiveProperties of Recombinant Bombyx mori Silk by Incorporation of Collagen or Fibronectin Derived Peptides Produced by Transgenic Silkworms. Biomacromolecules8(11), 3487-3492.等
　本発明のトランスジェニックカイコは、絹糸腺内に外来タンパク質を有する。絹糸線内に含まれる外来タンパク質としては、例えばCFP、GFP、YFP、DsRed、KO、KikGr、Kaede、Dronpa等の蛍光・色素タンパク質、コラーゲンやフィブロネクチン、細胞の成長因子等の細胞付着活性を有するタンパク質、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン等の酸性及びアルカリ性のアミノ酸を主とするペプチド、クモやヤママユガ、真珠貝等カイコ以外の生物由来のフィブロインタンパク質及びセリシンタンパク質及びその一次構造に由来するペプチド等が挙げられるがこれらに限定されない。
　絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランスジェニックカイコが取得されれば、当業者であれば容易に当該カイコから繭を得ることが出来る。
（２）繭の乾燥
　本発明では、絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランスジェニックカイコが吐糸した繭を概ね８０度以下（例えば７９度、７８度、７７度、７６度、７５度、７４度、７３度、７２度、７１度が挙げられるがこれらに限定されない）の条件下で乾燥させる。より好ましくは７０度以下、さらに好ましくは６０度以上７０度以下（例えば６１度、６２度、６３度、６４度、６５度、６６度、６７度、６８度、６９度が挙げられるがこれらに限定されない）、特に好ましくは５５度以上６５度以下（例えば５６度、５７度、５８度、５９度、６０度、６１度、６２度、６３度、６４度が挙げられるがこれらに限定されない）の条件下で繭を乾燥させる。
　繭の乾燥は、熱風式乾燥機を使用して乾燥させることが出来るほか、真空式乾燥機、マイクロウェーブ（電磁波）を使用して行うことも出来る。
　繭を乾燥させる程度は、その品種や性状によって異なるが、36-44%（例えば36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％が挙げられるがこれらに限定されない）の乾燥歩合が得られるまで乾燥させることが好ましい。あるいは、20～24時間程度（例えば20時間、21時間、22時間、23時間、24時間が挙げられるがこれらに限定されない）乾燥させることが好ましい。乾燥歩合は、当業者であれば繭の性状に応じて適切に決定することが出来る。例えば「春嶺×鐘月」等の普通蚕繭では、42-43％の乾燥歩合が適切であるが、繭層重の割に蛹重が重い場合はより小さい乾燥歩合を選択することが出来る（例えば36-38%程度の乾燥歩合とすることが出来る）。なお本発明においては、繭の乾燥は一定温度の条件下で行うことが好ましい。
　また本発明では、絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランスジェニックカイコが吐糸した繭を概ね８０度以下の条件下で乾燥させる代わりに、真空条件下、又は常温かつ真空条件下で乾燥させることも可能である。８０度以下、真空条件下、あるいは常温かつ真空条件下での乾燥は、上述とおり、熱風式乾燥機を使用して乾燥させることが出来るほか、真空式乾燥機、マイクロウェーブ（電磁波）を使用して行うことも出来る。例えば、繭を60℃の一定温度で乾燥させる場合、図１に示すように、24時間程度の時間をかけることにより、約45%の乾燥歩合にもっていくことが出来る。このようにして得られる繭は、黴が生えることなく保存が可能となる。
　なおこのような方法で繭を乾燥させる場合、蛹から出た水分を早く乾燥機の外へはき出す必要がある。乾燥機の中が湿気で満たされると繭糸の解れ（解じょ）が悪くなるためである。真空条件下で乾燥する場合、温度をかけながら真空にすることにより、熱風のみによって乾燥させる場合に比べ、効率よく乾燥させることが出来る。
（３）アルカリ剤、界面活性剤、酵素等を含む溶液への浸漬
　本発明では、繭をアルカリ剤、界面活性剤、酵素等の少なくとも１つを含む溶液に浸漬する。より好ましくは、繭をアルカリ剤及び界面活性剤を含む溶液、又は酵素及び界面活性剤を含む溶液に浸漬する。
　本発明のアルカリ剤としては、炭酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムが挙げられるがこれらに限定されない。
　また本発明の界面活性剤としてはノニオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤、カチオン系界面活性剤、及び両性界面活性剤が挙げられるがこれらに限定されない。
　ノニオン系界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテルなどが挙げられるがこれらに限定されない。
　アニオン系界面活性剤としては、例えば脂肪酸ナトリウム、モノアルキル硫酸塩、アルキルポリオキシエチレン硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、モノアルキルリン酸塩などが挙げられるがこれらに限定されない。
　カチオン系界面活性剤としては、例えばアルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩などが挙げられるがこれらに限定されない。
　両性系界面活性剤としては、例えばアルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタインなどが挙げられるがこれらに限定されない。
　また本発明の酵素としてはタンパク質分解酵素が挙げられるがこれに限定されない。タンパク質分解酵素としては、例えばセリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、パパイン酵素、アルカラーゼなどが挙げられるがこれらに限定されない。
　浸漬処理は、例えば以下のようにして行うことが出来るが、これに限定されない。金属製の網籠へ入れた繭を例えば炭酸ナトリウム0.15%、ノニオン系界面活性剤0.3%混合溶液（処理水）へ20分浸漬する。これにより、繭層表面に水分が浸み込む状態とすることが出来る。炭酸ナトリウム、界面活性剤の濃度、及び処理時間は、当業者であれば繭の性状によって適宜調整することが出来る。
　なお本発明においては、酵素及び界面活性剤を含む溶液がより好ましい。酵素及び界面活性剤の組み合わせとしては、本明細書に記載の酵素及び界面活性剤より特定可能なあらゆる組み合わせが含まれる。
（４）アルカリ剤、界面活性剤、酵素等を含む溶液中での真空浸透
　本発明では繭を、アルカリ剤、界面活性剤、酵素の少なくとも１つを含む溶液中で真空浸透する。より好ましくは、繭をアルカリ剤及び界面活性剤を含む溶液、又は酵素及び界面活性剤を含む溶液に浸漬する。アルカリ剤、界面活性剤、酵素としては、上述のものが挙げられる。
　真空浸透処理（減圧浸透処理）は、例えば以下の方法により行うことが出来る。浸漬処理した繭を処理水へ入れたまま真空装置へ移動し、真空とする。真空度は-620mmHg程度（例えば-640mmHg～-600mmHg、より好ましくは-630mmHg～-610mmHg程度）が適当であるがこれに限定されない。真空度が例えば-620mmHgに到達した時点で、５分～10分かけて常圧まで復圧する。こうすることにより、繭腔内外の圧力差により処理水が徐々に繭層内へ浸透する。このときに急激に復圧すると一気に処理水が繭腔内へ入ろうとするため、繭が圧力差により潰れる場合がある。また処理水が繭層の薄い部分や繭層通り易い部分を通るため、均一な煮繭ができない場合がある。従って、急激な復圧は避けるべきである。当業者であれば、繭の性状に応じて適切な復圧時間を設定することが出来る。
　なお本発明においては、アルカリ剤及び界面活性剤を含む溶液で前述の浸漬処理を行った場合、真空浸透処理もアルカリ剤及び界面活性剤を含む溶液で行うことが好ましい。また酵素及び界面活性剤を含む溶液で前述の浸漬処理を行った場合、真空浸透処理も酵素及び界面活性剤を含む溶液で行うことが好ましい。
　また本発明において真空とは、絶対真空に限定されず、減圧も含む。
（５）真空脱水
　本発明では、アルカリ剤、界面活性剤、酵素の少なくとも１つを含む溶液中で真空浸透した繭を真空中で脱水する。真空脱水の方法は特に限定されるものではないが、例えば以下の方法により繭を真空中で脱水することが出来る。真空浸透処理した繭を処理水から引き上げ、真空装置で真空処理を行う。真空度は上記と同様-620mmHg程度（例えば-640mmHg～-600mmHg、より好ましくは-630mmHg～-610mmHgが挙げられるがこれらに限定されない）とすることが好ましいがこれに限定されない。この真空処理は、例えば5分～10分かけるなど、徐々に行うことが好ましい。徐々に真空処理を行うことにより繭腔内の処理水を徐々に繭層の外に排出することが出来る。急激に真空処理を行うと、溶液が繭層の薄い所や、処理水の通り易い所を通るため、均一な煮繭処理ができない場合がある。
（６）アルカリ剤、界面活性剤、酵素等を含む溶液中での真空浸透
　本発明では真空中で脱水した繭に対して、再度、アルカリ剤及び界面活性剤、又は酵素及び界面活性剤を含む溶液中で真空浸透処理を行う。真空浸透処理は、例えば上述の方法によって行うことが出来るがこの方法に限定されない。
　真空浸透と真空脱水を繰り返すことにより、繭糸の解離性を増すことができる。一方、真空浸透と真空脱水を繰り返すことにより上緒糸が増加し、生糸量歩合が減少するなどの弊害も生ずる。従って、真空浸透と真空脱水の回数は繭特性により調整することが肝要である。例えば、真空浸透、真空脱水、真空浸透のサイクルを１回あるいは２回繰り返しとすることが出来る。
　なおこの処理も、上記（４）と同様、真空処理によって繭腔内へ処理水を浸透させる時には、真空状態から常圧への復圧は時間をかけて徐々に行うことが好ましい。逆に真空処理によって繭腔内の処理水を繭腔外へ排出する時には、時間をかけて真空状態へ移行することが好ましい。煮繭処理においては、繭層の繭糸の膠着部位のセリシンを徐々に膨潤軟和させることが重要である。本発明においては、アルカリ剤や酵素等がセリシンの膨潤軟和の役目を担い、界面活性剤が繭層繭糸の膠着部位への浸透の役目を担う。
　なお、アルカリ剤及び界面活性剤を含む溶液で前述の浸漬処理や真空浸透処理を行った場合、再度の真空浸透処理もアルカリ剤及び界面活性剤を含む溶液で行うことが好ましい。また酵素及び界面活性剤を含む溶液で前述の浸漬処理や真空浸透処理を行った場合、再度の真空浸透処理も酵素及び界面活性剤を含む溶液で行うことが好ましい。
（７）繭の水への浸漬
　本発明の方法では次に、繭を水に浸漬する。（６）までの煮繭処理により得られた繭は、その表面がアルカリで覆われている。そのまま放置しておくと、繭層表面に付着しているアルカリによりセリシンが膨潤する傾向となり、緒糸が多くなる。そのため、常温水に浸漬し、繭層表面のセリシンを収斂させる必要がある。繭の水への浸漬は、繭層表面に付着しているアルカリがとれ、繭層表面のセリシンが収斂するまで（例えば１０分から２０分程度）行う。
（８）繰糸
　本発明では、60℃以下の条件下で繰糸を行う。より好ましくは50度以下、より好ましくは35度から45度の条件下（例えば３５度、３６度、３７度、３８度、３９度、４０度、４１度、４２度、４３度、４４度、４５度が挙げられるがこれらに限定されない）で繰糸を行う。繰糸は自動繰糸機、多条繰糸機もしくは座繰器により行うことが出来る。
　繰糸は、上記方法により繭層セリシンを膨潤軟和させた繭から繭糸を引き出し、それを数本、セリシンで抱合させながら１本の生糸とするものである。繰糸に先立ち、概ね80℃以下の温湯内で索緒箒（稲穂を束ねたもの）で、繭の表面をこすり、数本の繭糸を引き出した（索緒と称す）後に、１本の糸口になるまで、更に引き出して正緒とする（抄緒と称す）。その繭（正緒繭）から引き出した繭糸を目的の太さになるように数本合わせ集緒器（例えば陶器等で作られたもので、ボタン形状でその中心に細い孔の開いたもの）を通過した生糸を、集緒器上に設けられた二つの鼓車で再び集緒器近くに戻し、集緒器から上がってきたばかりの糸条と縒り合わせて（ケンネル縒りと称す）小枠に巻き取る。座繰器、多条繰糸機は目的繊度にあうように一定の繭数で繰糸を行い（定粒式）、自動繰糸機では繊度感知器により一定の太さとなるように繊度制御を行う（定繊式）。繰糸については、文献（総合蚕糸学　日本蚕糸学会編　P.358-369.　1979.、日本製糸技術史　加藤宗一著　P.59-144.　1976.）も参照される。
　また本発明は、以下（ａ）から（ｇ）の工程を含む絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランスジェニックカイコが吐糸した繭を生糸とする方法を提供する。また以下（ａ）から（ｇ）の工程を含む遺伝子組換え生糸の製造方法を提供する。
（ａ）絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランスジェニックカイコが吐糸した繭を概ね８０℃以下の条件下にて、真空条件下にて、又は常温かつ真空条件下にて乾燥させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の繭を低温湯水（概ね８０℃以下）に浸漬する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の繭を低温湯水中（概ね８０℃以下）で真空浸透する工程、
（ｄ）工程（ｃ）の繭を真空脱水する工程、
（ｅ）工程（ｄ）の繭を低温湯水中（概ね８０℃以下）で真空浸透する工程、
（ｆ）工程（ｅ）の繭を水に浸漬する工程、及び
（ｇ）工程（ｆ）の繭を低温（概ね５０℃以下）の条件下で繰糸する工程。
　上記方法においてトランスジェニックカイコの繭の取得、繭の乾燥、繭の低温湯水への浸漬、繭の真空浸透、繭の真空脱水、繭の水への浸漬、繭の繰糸は上述の方法によって行うことが出来る。
　本発明においては、80度以下（例えば７９度、７８度、７７度、７６度、７５度、７４度、７３度、７２度、７１度が挙げられるがこれらに限定されない）の低温湯水、より好ましくは70度以下（例えば６９度、６８度、６７度、６６度、６５度、６４度、６３度、６２度、６１度が挙げられるがこれらに限定されない）の低温湯水、さらに好ましくは55度以上60度以下（例えば５６度、５７度、５８度、５９度が挙げられるがこれらに限定されない）の低温湯水が用いられる。
　また本発明は、上記方法によって得られる生糸を提供する。さらに本発明は当該生糸から得られる編み物及び織物を提供する。加えて本発明は、当該生糸から得られる立体構造物を提供する。本発明の立体構造物の例としてはランプシェード、ワンピース・ジャケット・ショール等の洋装品、着物、帯、洋服、パネル、壁紙、椅子のシート、名刺、本の表装等が挙げられるがこれに限定されない。ランプシェード、ワンピース・ジャケット・ショール等の洋装品、着物、帯、洋服、パネル、壁紙、椅子のシート、名刺、本の表装等は周知の方法によって作成することが出来る。
　さらに本発明は、本発明の方法によって得られる生糸から作成される医療用資材を提供する。医療用資材としては手術用縫合糸、人工血管、人工皮膚、人工腱、人工骨、角膜培養のフィルム等が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の生糸の医療用資材用に使用するための加工等は、当業者に公知の方法によって行うことが出来る。
　なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　以下実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕絹糸線内に外来遺伝子を発現するカイコの繭の製糸
１．方法
１．１　乾燥工程
　通常、最高温度115℃ないし120℃から徐々に温度を下げて、5時間30分位経過後に60℃へ変えていくという乾燥方法が行われている。この場合、約42%の乾燥歩合が得られる。一方本実施例では、温度勾配はとらずに、60℃の一定温度に保たれた乾燥機内に繭を入れ、20時間から24時間かけて繭を乾燥させた。結果、目的とする乾燥歩合が得られた（図１）。
１．２　煮繭工程
　本発明では、低温（60℃以下）状態で繭層セリシンを膨潤軟和するために、アルカリ剤、界面活性剤、酵素等を用いて煮繭を行う。以下に、アルカリ剤及び界面活性剤を用いた例を示す。
　まず、0.1～0.4%の炭酸ナトリウム、0.2～0.4%のノニオン系界面活性剤を作製し、その中に外来遺伝子発現カイコの繭を20分間浸漬させた。その後、真空容器中で-600mmHgまで真空にして、その状態で放置後徐々に復圧させ、繭腔内へ徐々に溶液を浸透させた。その後真空容器内で溶液から繭を出し、その状態で真空状態とさせ繭腔内の溶液を脱水させた。この操作により繭層繭糸の籠目構造に溶液が浸潤するため、繭糸相互を膠着させているセリシンを膨潤軟和させることができる。その後、繭を再び溶液に入れ、再び真空状態として繭腔内に溶液を浸透させ、終了後常温水によりセリシンを収斂させた。以上の工程を図２に示す。
１．３　繰糸工程
　通常繭から緒糸を出すために、85℃～90℃の熱湯に入れて、繭層表面のセリシンを膨潤軟和させながら索緒箒にて繭糸を導き出す処理を行う。また繰糸では、約40℃の繰解槽の煮熟繭から繭糸を解離し、約60℃の雰囲気中の小枠に生糸を巻き取っている。本発明では、索緒温度、繰解槽の温度を50℃、小枠部の温度を40℃とし、緒糸、繰糸を行った。
２．結果
　表１は、絹糸線内に外来遺伝子を発現するカイコの繭について繰糸を行った結果を示す。従来、60℃以下の低温繰糸では繰糸は不能であったが、本発明の方法を使用することにより繰糸を行うことが出来た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明は、絹糸線内に外来遺伝子を発現するカイコの繭を対象として、従来にない低温処理による製糸技術を提供するものであり、生繭繰糸（生繭を高温乾燥しないで生の状態のまま繰糸すること）を行う場合など、絹糸線内に外来遺伝子を発現するカイコの繭に限らず、通常使われる普通品種繭にも適用できる。
〔実施例２〕蛍光発色するトランスジェニック繭糸のインテリア用素材としての利用
　蛍光発色するトランスジェニック繭糸を、インテリア用素材として利用した。蛍光発色するトランスジェニック繭糸を直接、球形の型枠に自身の持っているセリシンで膠着させながら巻き、乾燥後、型枠から外した。このような方法により作製されたインテリアを図３に示す。図３左は内側に光源のないもの（外部からの光だけのもの）、図３中は光源に白色光を用いたもの、図３右は光源にブラックライトを用いたものである。蛍光発色するトランスジェニック繭糸を素材としたインテリアでは、ブラックライトにより蛍光を発することが確認された。
〔実施例３〕細胞付着性繭糸の人工血管基材への応用
　細胞付着性を有するトランスジェニック繭糸により人工血管用基材を作製した（図４）。図４に示した人工血管は、内径が1.5mm～5mmまでのものであり、この素材は繭乾燥60℃、煮繭は60℃以下、繰糸は50℃で行った結果得られた生糸より作製したものである。図５は、トランスジェニック繭糸による人工血管基材とPTFE(テフロン(登録商標)系樹脂）による人工血管基材をラットへ移植した状態を示す。図６は、それらをラットへ移植後３ヶ月経過した状態を示す。トランスジェニック繭糸による人工血管基材では、細胞増殖が進んでいることがわかる。
〔参考例〕トランスジェニックカイコの繭の作成
　蛍光を持つトランスジェニックカイコはKojimaら(2007)又はKuriharaら（2007）に記載されたベクターに緑色蛍光タンパク質（GFP)又は赤色蛍光タンパク質（DsRed)遺伝子を挿入し、プラスミドとして大腸菌からDNAを精製した。このベクタープラスミドをTamuraら（2007）の方法に従って、カイコの卵中に注射した。プラスミドを注射した卵から孵化した幼虫の次世代において、胚の単眼や繭の蛍光により、トランスジェニックカイコを同定し、これらを系統化した。系統化されたトランスジェニックカイコと実用品種を交配し、選抜育成することによって繭形質を高め、得られた日本種系統と中国系統を交配してＦ1を作成した。このＦ1を桑の葉又は人工飼料で飼育することにより、蛍光を持つトランスジェニックカイコの繭を作成した。
　本発明により、外来タンパク質の性質を損なうことなく、またフィブロインタンパク質、セリシンタンパク質が熱変性を受けずに、絹糸腺中に外来遺伝子を発現するカイコの繭を生糸とする方法が提供された。カイコの品種改良において、従来の交配による方法では限界があることから、近年、遺伝子組換え技術を使用した外来遺伝子を発現するカイコの繭の作出が活発に行われている。しかしながら、外来遺伝子を発現するカイコの繭を従来の方法で製糸すると、外来タンパク質が変性してしまうという問題があった。
　一方本発明の方法を用いることにより、絹糸腺中に外来遺伝子を発現するカイコが吐糸した繭の特徴がそのまま生かされた生糸を得ることが可能である。本発明は、外来遺伝子を発現するカイコの繭を生糸とする際に有用である。

Claims (18)

  1. アルカリ剤、界面活性剤、酵素等の少なくとも１つを含む低温溶液で真空浸透することを特徴とする、トランスジェニックカイコが吐糸した繭を生糸とする方法。
  2. 下記（ａ）から（ｇ）の工程を含む、請求項１に記載の方法；
    （ａ）絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランスジェニックカイコが吐糸した繭を乾燥させる工程、
    （ｂ）工程（ａ）の繭をアルカリ剤及び界面活性剤、又は酵素及び界面活性剤を含む溶液に浸漬する工程、
    （ｃ）工程（ｂ）の繭をアルカリ剤及び界面活性剤、又は酵素及び界面活性剤を含む溶液中で真空浸透する工程、
    （ｄ）工程（ｃ）の繭を真空脱水する工程、
    （ｅ）工程（ｄ）の繭をアルカリ剤及び界面活性剤、又は酵素及び界面活性剤を含む溶液中で真空浸透する工程、
    （ｆ）工程（ｅ）の繭を水に浸漬する工程、及び
    （ｇ）工程（ｆ）の繭を低温（概ね５０℃以下）の条件下で繰糸する工程。
  3. 工程（ａ）において概ね８０℃以下の条件下にて繭を乾燥させる、請求項２に記載の方法。
  4. 工程（ａ）において真空条件下にて繭を乾燥させる、請求項２に記載の方法。
  5. アルカリ剤が炭酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムからなる群より選択され、界面活性剤がノニオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤、カチオン系界面活性剤、及び両性界面活性剤からなる群より選択され、酵素がタンパク質分解酵素である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 下記（ａ）から（ｇ）の工程を含む、絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランスジェニックカイコが吐糸した繭を生糸とする方法；
    （ａ）絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランスジェニックカイコが吐糸した繭を乾燥させる工程、
    （ｂ）工程（ａ）の繭を低温湯水（概ね８０℃以下）に浸漬する工程、
    （ｃ）工程（ｂ）の繭を低温湯水中（概ね８０℃以下）で真空浸透する工程、
    （ｄ）工程（ｃ）の繭を真空脱水する工程、
    （ｅ）工程（ｄ）の繭を低温湯水中（概ね８０℃以下）で真空浸透する工程、
    （ｆ）工程（ｅ）の繭を水に浸漬する工程、及び
    （ｇ）工程（ｆ）の繭を低温（概ね５０℃以下）の条件下で繰糸する工程。
  7. 工程（ａ）において概ね８０℃以下の条件下にて繭を乾燥させる、請求項６に記載の方法。
  8. 工程（ａ）において真空条件下にて繭を乾燥させる、請求項６に記載の方法。
  9. 外来タンパク質が蛍光色素タンパク質、細胞付着活性を有するタンパク質、酸性及びアルカリ性のアミノ酸を主とするペプチド、及びカイコ以外の生物由来のフィブロインタンパク質及びセリシンタンパク質からなる群より選択される、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  10. 請求項１～９に記載の方法によって得られる生糸。
  11. 請求項１０に記載の生糸から得られる編み物及び織物。
  12. 請求項１０に記載の生糸から得られる立体構造物。
  13. 請求項１０に記載の生糸から作成される医療用資材。
  14. 手術用縫合糸、人工血管、人工皮膚、人工腱、人工骨、及び角膜培養のフィルムからなる群より選択される請求項１３に記載の医療用資材。
  15. 下記（ａ）から（ｇ）の工程を含む遺伝子組換え生糸の製造方法；
    （ａ）絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランスジェニックカイコが吐糸した繭を乾燥させる工程、
    （ｂ）工程（ａ）の繭をアルカリ剤及び界面活性剤、又は酵素及び界面活性剤を含む溶液に浸漬する工程、
    （ｃ）工程（ｂ）の繭をアルカリ剤及び界面活性剤、又は酵素及び界面活性剤を含む溶液中で真空浸透する工程、
    （ｄ）工程（ｃ）の繭を真空脱水する工程、
    （ｅ）工程（ｄ）の繭をアルカリ剤及び界面活性剤、又は酵素及び界面活性剤を含む溶液中で真空浸透する工程、
    （ｆ）工程（ｅ）の繭を水に浸漬する工程、及び
    （ｇ）工程（ｆ）の繭を低温（概ね５０℃以下）の条件下で繰糸する工程。
  16. 下記（ａ）から（ｇ）の工程を含む遺伝子組換え生糸の製造方法；
    （ａ）絹糸腺内に外来タンパク質を含むトランスジェニックカイコが吐糸した繭を乾燥させる工程、
    （ｂ）工程（ａ）の繭を低温湯水（概ね８０℃以下）に浸漬する工程、
    （ｃ）工程（ｂ）の繭を低温湯水中（概ね８０℃以下）で真空浸透する工程、
    （ｄ）工程（ｃ）の繭を真空脱水する工程、
    （ｅ）工程（ｄ）の繭を低温湯水中（概ね８０℃以下）で真空浸透する工程、
    （ｆ）工程（ｅ）の繭を水に浸漬する工程、及び
    （ｇ）工程（ｆ）の繭を低温（概ね５０℃以下）の条件下で繰糸する工程。
  17. 工程（ａ）において概ね８０℃以下の条件下にて繭を乾燥させる、請求項１５又は１６に記載の方法。
  18. 工程（ａ）において真空条件下にて繭を乾燥させる、請求項１５又は１６に記載の方法。
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