CN104822867B - 天然蚕丝纤维制成的制品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了制备二维或三维蚕丝制品的方法，其中天然蚕丝纤维形成二维或三维蚕丝制品，所形成的蚕丝制品经历脱胶步骤，在该步骤中，用硼酸盐缓冲液作为脱胶剂，而且所形成的蚕丝制品优选与含水乙醇缓冲液接触后再进行脱胶步骤。

Description

天然蚕丝纤维制成的制品
技术领域
本发明涉及蚕丝(silk)加工领域，尤其是提供医用蚕丝材料。
背景技术
蚕丝用于生物医学缝线已有几十年历史，观察到了潜在的宿主免疫反应。这可能是蚕丝在过往的生物医学应用中不予考虑的主要原因。引发免疫反应的主因与丝胶蛋白(sericin)有关(综述：Altman等,Biomaterials 24(2003),401-416)。故，从生丝(rawsilk)彻底除去丝胶蛋白，是组织工程化和再生医学应用中制备丝织物、但避免生物相容性问题的关键步骤。
大多数情况下，蚕丝是从家蚕(Bombyx mori)幼虫的蚕茧获得的。单个蚕茧纤维由被称为丝胶蛋白的胶状蛋白包绕两个丝素蛋白(fibroin)链核心而成，其中由丝胶蛋白将多个丝素蛋白纤维互相固定。丝素蛋白和丝胶蛋白分别占约75和25％wt.。
蚕丝丝素蛋白在形态上以高度有序的晶态纤维结构为特征。这种结构使它不溶于诸如水、乙醇、稀酸和碱等大多数溶剂。与丝素蛋白相反，球状的丝胶蛋白易溶于水性溶剂。纺织业对于去除丝胶蛋白也有极大兴趣，因为蚕丝服装的光泽会被丝胶掩盖。因此，不光是生物材料领域要研究蚕丝，纺织业也在寻找最佳的脱胶方法。这导致出现多种脱胶方法，包括，碱性溶液(不加表面活性剂)、尿素、酒石酸、柠檬酸、或诸如木瓜蛋白酶或内肽酶等酶类。用硼酸加硼酸盐作为脱胶剂的可能性在纺织工程化领域已有人描述。在这些研究中，硼酸盐缓冲液被单独用于使未经处理的原料蚕丝纤维脱胶(Jiang等Materials Letters 60/7(2006),919-925)或与表面活性剂组合使用(JP 2 269870 A)或作为所谓“洗毛剂(scouring agent)”用于单根纤维或梭织物(woven fabric)。在后一种情况中，硼酸盐缓冲液被用于擦洗纤维表面，使之易于接受诸如漂白、染色等其它纺织工程化处理、但不必完全除去丝胶蛋白(JP 1 229803 A)。这类制品因此仍包含较多丝胶蛋白(例如，超过丝胶蛋白总量的半数仍存在于制品中)。丝胶蛋白的不完全去除对于医学领域而言是不够的，因为残余的丝胶蛋白会引发免疫反应。因此，这方面与本申请的领域无关。
由于其应用非常广泛且功能稳定，硼酸盐缓冲液在传统上用于多项生物医学和生物技术应用。在此上下文中，应注意硼酸盐缓冲液已用在基于酶的脱胶方法中将特定蛋白酶的pH值保持在最佳工作范围(CN 102605439A(摘要))。这意味着该缓冲液并未将其自身当做脱胶剂，而是当做给脱胶酶提供最佳pH工作范围的试剂。同样地，硼酸也已用于在使用肥皂的纺织工程化脱胶工艺中控制pH(FR 2528076A1)。
传统的脱胶法是将生丝置于有或无表面活性剂的碱性溶液中煮沸，表面活性剂有助于使丝胶蛋白从纤维结构中脱离出来。值得注意的是，通常是用0.02M碳酸钠溶液在100℃处理30-60min来完成脱胶，尤其是在组织工程化研究领域。这种碱性脱胶常常以批量处理，使用的是肥皂或表面活性剂加碱。
但是，不同的研究显示，丝胶蛋白的去除引起蚕丝纤维磨损，削弱其结构特性，难以将它们纺织改造(如编织或编辫)成适合组织工程化应用的骨架(Liu等J.Biomed.Mater.Res.B Appl.Biomater.82(2007),129-138)。因此，在一些研究中，先构建蚕丝骨架再进行脱胶工艺(Fan等,Biomaterials 30(2009),4967-4977；Fan等,Biomaterials 29(2008),3324-3337；Chen等,Biomaterials 29(2008),3683-3692)。但应注意，所有这些研究的骨架基础都是“普通(plain)”网格(Chen等,Biomaterials 29(2008),3683-3692)，厚度不超过500μm。而且，他们描述的网都以低水平几何层级为特征，例如只有简单的纺织编织技术。与高层级纺织工程化改造的骨架相比，单个的蚕丝纤维能很好地暴露于脱胶液，并可以因此用传统的碳酸钠溶液脱胶(见图11A和11B)。
Liu等,2007提议了一种增加无丝胶蛋白型纤维的加工特性、但劳动强度较大的方案。此研究描述了一种通过将不含丝胶蛋白的蚕丝纤维与明胶进行化学交联、而用明胶替代丝胶蛋白的方法。
Altman等(Biomaterials 23(2002),4131-4141)探寻了天然蚕丝丝素蛋白纤维(纱线)在有动态机械加载的培养物中作为前交叉韧带(ACL)组织工程化的3D骨架的潜力：提取丝胶蛋白后，蚕丝丝素蛋白纤维拧成6束缆绳基体(wire-rope matrices)，与由并行纤维形成的同等基体相比，具有改进的弹性、但不牺牲拉伸强度。这种基体与天然ACL中胶原纤维相似的层级结构(hierarchal structure)，而且力学特性(mechanicalproperties)与天然人ACL在强度、劲度、屈服点(yield point)、和断裂处的百分比延长方面相当。此外，这种缆绳几何结构增加了用于细胞附着的表面积和胞外基体(ECM)沉积，弱化了质量转移的限制，都是些引起新组织形成的因素。蚕丝丝素蛋白骨架支持成人骨髓来源的间质干细胞(MSCs)进行附着、散播、增殖和分化。
尽管蚕丝在组织工程学方面的应用很急迫，而且多个生物医学研究小组和工业研究小组正进行大量的脱胶工艺研究，仍需要了解具有高层级几何结构的纺织工程化构建物脱胶有哪些选择。因此，目前尚缺能从紧密的高层级原料家蚕蚕丝纤维基体，例如打算用于前交叉韧带组织工程化的那些，除去丝胶蛋白的脱胶方法。
与之截然相反，提供医用蚕丝材料的方法几乎是唯一的：将蚕丝纤维于含水体系中彻底溶解，然后通过诸如离心(spinning)、电纺丝(electrospinning)、由水性系统或有机溶剂系统注浆成形(casting)、凝胶化、起泡等等，将该蚕丝溶液再加工为所需形式的材料(Vepari等,2007,US 5,252,285A)。
但这些由丝素蛋白溶液再加工出的蚕丝材料与天然固有蚕丝结构不同，如机械强度减弱。另一方面，蚕丝纤维已广泛用作伤口缝合线；但这些纤维在用之前必须脱胶，因为丝胶蛋白会引起副作用(Kaplan等,Biomaterials 24(2003),401-416)。有关蚕丝缝线的最主要生物相容性问题的报道是关于生丝(virgin silk)，其中的丝胶蛋白仍然覆盖核心蚕丝丝素蛋白纤维。哮喘的诱导和IgE水平的上调可见于用生丝缝合的患者。在Dewair等(J.Allergy Clin.Immunol.76(1985),537-542)的研究中，经皮肤测试，特异性IgE的峰值以及蚕丝反应性患者中的阳性反应程度可见于具有最高丝胶蛋白含量(在所测试的蚕丝样品中)的组。而且，原生蚕丝纤维周围炎症细胞包括巨噬细胞的活化已得到证实，而在不含丝胶蛋白或丝素蛋白纤维包裹了明胶的对照组中，未发现活化。显然，植入的生物医学物不应引起这类外源机体反应。因此由蚕丝制得的生物材料必须不含丝胶蛋白。但是，由于脱胶的蚕丝纤维在形成最终生物材料(例如维系带)，尤其三维生物材料的过程中的负面特性，需要有改进的方法来提供基于蚕丝的生物材料。这些方法应允许稳健、可再现且可靠的制备方法；另一方面，这些制品应基本不含丝胶蛋白，从而允许制得的生物材料能加以应用，尤其医用。因此，本发明的一个目标是提供这样的方法，这样的方法应该也特别适于医学目的，尤其适于疗法和外科手术。
发明内容
因此，本发明提供了制备三维蚕丝制品的方法，其中天然蚕丝纤维形成三维蚕丝制品，所形成的蚕丝制品经历脱胶步骤，在该步骤中，用硼酸盐缓冲液作为脱胶剂，而且所形成的蚕丝制品优选与含水乙醇缓冲液接触后再进行脱胶步骤。
本发明的方法允许蚕丝有效脱胶，尤其三维制品脱胶。现有技术的脱胶制品仍含有至少1％(w/w)(或甚至至少2％(w/w))的丝胶蛋白，本发明的制品基本不含丝胶蛋白，即，丝胶蛋白含量低于0.1％(w/w)，优选低于0.05％(w/w)，尤其低于0.01％(w/w)(实践中也取决于丝胶蛋白检测方法，有不同的检测极限)。例如，本发明的制品在电镜下看不到任何丝胶蛋白残留或在丝胶蛋白染色实验中看不到丝胶蛋白着色。显然，丝胶蛋白含量高的纺织制品(如JP 2 269870 A或JP 1 229803 A公开的那些不适于医用，因此原则上排除在本发明之外(与丝胶蛋白如何(部分)去除无关)。
在本发明过程中意外发现，用本发明的脱胶步骤，可以从天然蚕丝纤维制成的复合三维蚕丝制品中有效去除丝胶蛋白。这允许由天然蚕丝纤维(其中丝胶蛋白仍是纤维的一部分)制备三维制品，由于天然蚕丝纤维比脱胶的蚕丝纤维或(从丝素蛋白溶液)再加工的蚕丝纤维有更好的操作特性(handling properties)，这提供了显著的优点和潜能。
现有技术的方法如碱处理或蛋白酶处理等未报道能从蚕丝纤维成功脱胶(Fan等,2008,2009；Freddi等,2003)，与之相反，本发明的脱胶方法能获得基本不含丝胶蛋白的三维蚕丝制品。现有技术的方法未能从高度扭曲的纬线(例如织物等材料中的高度扭曲纬线)成功除去丝胶蛋白，而本发明的脱胶方法提供医学应用所必需的丝胶蛋白去除。
因此，有了本发明，就有可能先产生复杂三维蚕丝结构再进行脱胶步骤。与应用脱胶的蚕丝纤维或再加工的蚕丝纤维相比，这能提供更多结实耐用的复杂蚕丝结构，这是现代手术的显著优势。而且制备方法整体上也更稳健，适于工业规模生产，因为它不受脱胶纤维被弱化的特性的困扰。
本发明中，“三维蚕丝制品”应该不仅理解为，其三维中没有一维不与其它两维发生关联的那些制品，而且理解为具有不止一种几何层级水平(geometric hierarchy)的制品。本发明的具有不止一种几何层级水平的纺织工程化结构物是最小维的直径(“厚度”)至少0.5mm的三维制品。事实上，,本发明优选的三维制品在最小维中的直径至少1.0mm，优选至少2.0mm，尤其至少5.0mm。相应地，本发明所用骨架(scaffold)可以细分为鞘(sheathing)及核心部分(第1层级水平)。核心部分自身可进一步分为4根线(strand)，每根线由8个束(bundles)组成(第2层级水平)。每个束可以进一步分为24支合股纱(twistedyarn)(第3层级水平)，每支纱由6根单个的蚕丝纤维组成(第4层级水平)。这种多重丝移植物直径达5.8mm。本发明显示了意图用作高层级(即至少两个几何结构层级)前交叉韧带的三维骨架中丝胶蛋白的去除。对这种复杂结构的脱胶中常规使用碳酸钠的情形中是不可能的，但是按照本发明用硼酸盐缓冲液溶液就能实现。
而且，本发明优选的三维蚕丝制品其三维的比例是，最小维不小于最大维的1/100，优选不小于最大维的1/50，尤其不小于最大维的1/20。在优选实施方案(例如前交叉韧带)中，两个较小维甚至可以在相当的范围，例如具有1:1-1:5的比例(见例如图7和10)。
与本发明所用的骨架相反，先由原料蚕丝结构制成、再经历脱胶过程的蚕丝结构物结构简单，主要是平面网格(见下文)。
Chen等,2008的研究中所用骨架由12根绕织纱线组成，每根纱线只有单个蚕丝纤维(单个层级水平)。类似地，Liu等,2008和Fan等,2008的研究中使用的网，其每根纱线最多有80根蚕丝纤维。如此一来，这些网仅有一个层级水平，因而是更为松散的纤维结构，脱胶溶液很容易进入其中。而且，这些简单网格被描述为在不含丝胶蛋白的状态中平均厚度约0.325+/-0.116mm，仅是本发明为前交叉韧带提供的骨架的1/10，见本发明实施例部分。在。在用蚕丝作为生物材料对韧带(ligament)和肌腱进行的组织工程化领域，近年已有大量研究(综述：Vepari等,Prog.Polym.Sci.32(2007),991-1007)。由于它们的纤维结构松散，厚度值小于0.5mm，因此能用常规试剂如碳酸钠来脱胶。这些差异也可见于图11A和11B与例如图1,7或10的比较。
本发明方法去除丝胶蛋白的效力去除通过减重(weight loss)、苦味酸和胭脂红染色、以及扫描电镜检查来显示。此外，还分别用MTT实验和BrdU-ELISA测定了培养基中与蚕丝接触的前交叉韧带成纤维细胞(ACLF)和脂肪衍生的基质细胞(ASC)的细胞活力和增殖。
本发明的“天然蚕丝纤维(native silk fibre)”是含丝胶蛋白的任何天然蚕丝纤维。“天然蚕丝纤维”具有完整的丝素蛋白结构。与之相反，“再生的蚕丝纤维”是由丝素蛋白溶液/悬浮液通过离心方法或产生人工蚕丝纤维的相关人工方法生成的蚕丝纤维。天然蚕丝纤维可以从蚕茧中取出，经物理处理获得蚕丝纤维(通常将蚕茧溶于沸水中以获得单根单根的长纤维，将它们抽出并装到纺车式卷线器(spinning reel)上；但未对“天然蚕丝纤维”实施能影响天然来源蚕丝纤维的丝素蛋白结构的化学步骤)。
相应地，任何含丝胶蛋白的天然来源的蚕丝纤维都可以应用本发明的方法。当然，这类纤维的主要工业来源是家蚕(Bombyx mori)，但其它蚕(鳞翅目昆虫(Lepidopteron))的丝纤维也可以用于本发明的方法中。蚕(Silkworms)通常可以区分为家蚕(muberry)(Bombyxmori,Bombyxmandarina)和非-家蚕(印度柞蚕(Antheraea(A.)mylitta),普利柞蚕(A.proylei),A.pernyi,A.yamamai,A.frithi,A.assamensis,Samiaricini,A.atlas,白斑枯叶蛾(Gonometapostica),芒果天蚕(Criculatrifenestrata))。野蚕与家蚕之间在提取的丝胶蛋白的氨基酸组成方面相似性至少97％，表明不同蚕种之间有大量的保守氨基酸序列(Mondal等,Caspian J.Env.Sci.5(2007),63–76)。丝胶蛋白可以成功地从天然蚕丝纤维任何除去，这与蚕物种无关。其它可能的天然蚕丝来源是蚕以外的其它昆虫，如蚂蚁、蛾(moths)、跳蚤(fleas)、锯蝇(sawflies)、螳螂(mantises)等。
优选地，脱胶步骤通过将所形成的蚕丝制品与硼酸盐缓冲液接触来进行，所述缓冲液包含硼酸盐离子(borate ions)和碳酸盐离子(carbonate ions)，硼酸盐离子尤其硼酸钠、硼酸，碳酸盐离子尤其碳酸钠。
根据本发明优选实施方案，在脱胶步骤之前进行纯化步骤，使用的是含有1-98％(v/v)的乙醇、优选60-80％(v/v)的乙醇、尤其65-75％(v/v)的乙醇的水溶液。
优选地，脱胶步骤中用到的硼酸盐是含有10-2000mM硼酸盐，优选50-1000mM硼酸盐，尤其100-1000mM硼酸盐的水溶液。优选地，硼酸盐缓冲液的pH为7-11，优选8-10，尤其8.5-9.5。当定义指定混合物(set-up)的pH时，必需综合考虑pH、缓冲液组分浓度以及温度/持续时间的设置，阻止对制品中丝素蛋白结构的实质性破坏。优选地，乙醇纯化步骤和脱胶步骤在升高的温度中进行，优选60-100℃，优选80-100℃，尤其90-100℃。乙醇纯化步骤和脱胶步骤两者都优选持续30min以上，优选60min以上，尤其90min或更长时间。这些处理无技术方面的上限，从省钱的角度考虑，不太优选持续48h以上，24h以上，或甚至10h以上，因为之前已完成脱胶。
本发明现在能进行生成复杂蚕丝制品(对于天然蚕丝纤维而言是可能的)的所有制备步骤。蚕丝纤维或蚕丝制品开裂(fissuring)和断裂(rupture)的风险用本发明的方法大大降低。
相应地，所有已知用天然蚕丝纤维构筑三维结构的技术都可以用本发明进行。优选地，三维蚕丝制品通过机织(weaving)、编辫(braiding)、编结(knitting)或压制(pressing)来形成。
本发明的方法可以用任何天然蚕丝纤维来进行，但该方法已特别针对家蚕来源的蚕丝纤维进行了优化。这也是纺织工业中天然蚕丝纤维的主要工业来源。但是，其它含丝胶蛋白的蚕丝纤维也可以用于制备本发明的蚕丝制品。
最优选的天然蚕丝纤维是来自家蚕(Bombyx mori)蚕茧的那些。家蚕的丝纤维具有三角形横截面和圆角，5-10μm宽。丝素蛋白-重链主要包含多个beta-片层，归因于一个由59个氨基酸组成的带有一些变异的重复序列。这些纤丝(fibril)的平整表面以多角度反射光线，为蚕丝带来天然光泽。其它蚕的横截面在形状和直径上差异很大：Anaphe的为新月状(crescent-like)，柞蚕(tussah)的为细长楔形(elongated wedge)。自然状态下，蚕丝由两个蚕腺以原始丝(单丝)形式成对吐出，这些单丝粘在一起，与起胶水作用的丝胶蛋白共同形成茧丝(bave)。榨蚕丝(tussah silk)的茧丝直径可达65μm。
如上文已述，任何三维蚕丝制品都可以根据本发明加工。优选地，用本发明方法制得的制品用于人类和兽医外科(优选人类外科，因为用本发明能提供制药上可应用的蚕丝制品)，例如医用移植物，优选支架(stent)，神经导管，疝网(hernia meshwork)，维系带(ligature),尤其前交叉韧带(anterior cruciate ligament,ACL)，或软骨以及骨的骨架(bone scaffolds)。
另一方面，本发明的方法可用于制备细胞培养材料，如细胞培养底层，可将细胞接种在该底层上，使其进一步生长或生成细胞组分(如重组蛋白或其它从细胞分泌而出的物质)。
本发明的方法可以很容易地根据三维制品的本性或天然蚕丝的本性以及具体的脱胶方法来优化。
根据优选实施方案，本发明方法中的脱胶步骤在20-100℃、优选70-100℃、尤其煮沸温度(例如100℃左右)进行。
本发明的方法也可以用于制备二维蚕丝制品。与现有技术制备二维蚕丝制品的方法(Freddi等,2003)相比，本发明提供了使天然蚕丝纤维制得的天然二维蚕丝结构物脱胶的更好方法。因此，本发明也提供了制备二维蚕丝制品的方法，其中天然蚕丝纤维形成二维蚕丝制品，所形成的蚕丝制品经历脱胶步骤，其中，所形成的蚕丝制品优选先与含水乙醇溶液接触、再进行本发明的脱胶步骤，在该脱胶步骤中，用硼酸盐缓冲液作为脱胶剂。
本发明另一方面涉及能根据本发明方法获得的三维蚕丝制品。根据本发明方法获得的制品具有优秀的力学稳定性，生物相容性，尤其无丝胶蛋白所致的副反应，可生物降解，具有非常大的形态学弹性(morphologic flexibility)。与其它脱胶方法相比，本发明制得的制品，其终产物的力学特性未降低到那种程度，恰恰相反，所述力学稳定性(例如拉伸强度等)与天然蚕丝制品的相当，并不像脱胶制品那样降低。
本发明的三维蚕丝制品可以是基体骨架(matrix scaffold)，优选用于医学用途，尤其用于细胞吸附、散播、生长和分化。本发明优选的制品是医学植入物，优选支架、神经导管、疝网、或维系带，尤其前交叉韧带(ACL)。根据本发明制备这类制品有显著优势，因为制得产品的同时丝胶蛋白仍存在于蚕丝纤维上。
本发明的制品显著有别于现有技术的制品，因为本发明的制品是真正的三维制品，不是由脱胶的一维或二维制品经机械操作形成某种形状。因此，本发明的制品也具有与例如Fan等2008或2009所述制品显著区别的内部结构。
本发明还涉及能通过本发明方法获得的二维蚕丝制品。
优选地，所述制品制成薄片形式，优选医用，尤其薄片(film)、膜(membrane)、梭织片(woven sheet)或网(mesh)，用于细胞吸附、散播、生长和分化.
本发明还通过以下实施例和附图来举例说明，但不限于此。
附图说明
图1图示了蚕丝骨架(silk scaffold)的层级。数字表示用于进一步分析的蚕丝纤维(silk fiber)的取样位置：1)外鞘,2)内鞘,3)外束(outer bundle)和4)内束纤维。
图2显示蚕丝骨架因以下原因而减重：A:蚕丝样品在70％乙醇中煮沸，B:蚕丝样品在70％乙醇中煮沸并进行Na2CO3脱胶，C:蚕丝样品在70％乙醇中煮沸并进行硼酸盐缓冲液脱胶。所有数据都是8个独立试验的均值±SD，***表示P<0.001的显著性差异。
图3显示缆绳样式(wire-rope design)的蚕丝骨架经不同脱胶的终极拉伸强度(ultimative,UTS)值。用未脱胶的蚕丝骨架作对照。蚕丝骨架用基于硼酸盐缓冲液的碱液或碳酸钠(Na2CO3)脱胶。柱高度对应于至少7个值的均值，误差线对应于SD。***表示与对照组相比的显著性差异，*表示P<0.05的显著性差异。
图4显示缆绳样式的蚕丝骨架经不同脱胶的劲度(stiffness)值。用未脱胶的蚕丝骨架作对照。蚕丝骨架用基于硼酸盐缓冲液的碱液或用碳酸钠(Na2CO3)脱胶。柱高度对应于至少7个值的均值，误差线对应于SD。
图5显示经不同脱胶的蚕丝骨架的扫描电镜照片。原料)未处理的原料蚕丝纤维，处于它们的天然状态。EtOH)乙醇处理的蚕丝；0.01M Na2CO3)Na2CO3脱胶的蚕丝，用的1.1g/L碳酸钠溶液；0.02M Na2CO3)Na2CO3脱胶的蚕丝，用的2.1g/L碳酸钠溶液；硼酸盐)硼酸盐缓冲液脱胶的蚕丝，用的是0.2M硼酸在0.05M硼酸钠缓冲液pH＝9.0中的溶液，所述蚕丝选自不同层级来源：外鞘纤维、内鞘纤维、外束纤维和内束纤维。所有照片都是放大500x。
图6显示苦味酸(picric acid)和胭脂红(carmine)染色：原料)未经脱胶的原料蚕丝骨架、Na2CO3)碳酸钠脱胶的蚕丝骨架、以及硼酸盐)硼酸盐缓冲液脱胶的蚕丝骨架。每张图片从左至右：鞘外侧，鞘内侧，朝向骨架结构外侧的束，以及朝向骨架结构内侧的束。
Fig 7显示用不同提取培养基培养的前交叉韧带成纤维细胞(ACLF)和脂肪衍生的基质细胞(adipose-derived stroma cells,ASC)的MTT分析。对照，Na2CO3、硼酸盐缓冲液分别对应于用来在37℃和5％CO2的潮湿温箱中将不同处理的蚕丝骨架浸没24h的培养基。所有数据都是8个独立试验的均值±SD。
图8显示用不同提取培养基培养的前交叉韧带成纤维细胞(ACLF)和脂肪衍生的基质细胞(ASC)的BrdU分析。对照，Na2CO3、硼酸盐缓冲液分别对应于用来在37℃和5％CO2的潮湿温箱中将不同处理的蚕丝骨架浸没24h的培养基。所有数据都是8个独立试验的均值±SD。
图9显示脂肪衍生的基质细胞(ASC)在硼酸盐缓冲液脱胶的内侧纤维束上的活力，用钙黄绿素AM染色活细胞(绿)来观察。蓝)是蓝通道的荧光照片，显示蚕丝丝素蛋白纤维的自荧光。蓝/绿表示蚕丝(蓝)自荧光照片在钙黄绿素AM-染色的细胞(绿)上的叠加。
图10显示经苦味酸和胭脂红染色确定的丝胶蛋白去除情况(A-D)。鞘、朝向骨架结构外侧的束，以及朝向骨架结构内侧的束中，未脱胶的原料蚕丝骨架(原料)、碳酸钠脱胶的蚕丝骨架(Na2CO3)和硼酸盐缓冲液脱胶的蚕丝骨架(硼酸盐)的苦味酸和胭脂红染色。B)显示“红色色度(redness)”绝对值，用Definiens XD 1.0软件从这些图片的RGB值计算而得。红色色度＝(2x红–绿–蓝)/(2x红+绿+蓝)。比例尺表示5mm。
图11显示仅具有1个几何层级水平的蚕丝网，如Chen等2008所述(11A：编织的蚕丝骨架的SEM照片；孔径约1x1mm)，以及如Liu等2008所述(11B：S编织的蚕丝骨架的SEM照片，比例尺＝200μm)。
具体实施方式
实施例：
材料和方法
材料
除非特指，所有试剂都得自Sigma(维也纳，奥地利)且为分析级。
蚕丝-基体设计
白色家蚕蚕丝纤维(20/22den,250T/m)原料购自Testex AG(苏黎世，瑞士)。编辫的骨架(braided scaffold)再与Edelrid(Edelrid GmbH,Isny im 德国)合作制造。所述编辫的骨架呈缆绳样式，可以进一步分为鞘和核心，这两者都具有层级结构，包括线、束、合股纱和单根蚕丝纤维(见图1)。编辫结构物的基本单位代表了由6根单根蚕丝纤维形成的合股纱。鞘和线的结构基础是分别是6根和24根合股纱。整个骨架如下组成：核心组分(4条线)外包管状鞘，总直径5.8mm。鞘和核心线的管状结构在商用编辫器的辅助下、用16个卷线轴(bobbin)每一个中的纤维制成。鞘和核心束的编辫密度分别总共是10和25交叉(crossings)/法寸(French inch)。1法寸对应于27.072mm。
用乙醇进行的纯化步骤
为清洁由家蚕蚕丝原料制得的骨架，使之与制备过程来源的物质如上浆剂(sizeing agents)或原料蚕丝上固有的物质如蜡区分开来，用70％乙醇进行了清洗步骤。将骨架浸没在圆底烧瓶内的70％乙醇中，回流煮2次，分批。
脱胶
在整个研究中用到两种不同的脱胶溶液来制备样品用于分析：(i)0.02M Na2CO3和(ii)0.2M硼酸在0.05M硼酸钠缓冲液中的溶液，pH＝9.0(Jiang等,2006)。为进行扫描电镜分析，一组样品用0.01M Na2CO3脱胶。该脱胶方法如下进行：将8cm长的骨架放置在1000ml烧杯中，加入500ml脱胶溶液，将烧杯用铝箔密封，在含常规磁力棒的热盘中加热，直到脱胶溶液开始沸腾。45min分钟后，更换新的脱胶溶液，重复煮沸步骤。脱胶后，样品用ddH2O彻底清洗。最后，将所有样品风干，以备进一步测试。
减重
每种脱胶方法的效力通过测量重量损失来定量评估。减重表示为起始重量的百分比，重量记录直至连续称重数值波动在0.1mg以内。
蚕丝纤维取样
用苦味酸胭脂红染色和SEM分析验证部位依赖性脱胶效力。从缆绳样式的骨架的不同部位(图1)取样蚕丝纤维。
苦味酸胭脂红染色
苦味酸胭脂红染色经典的组织切片染色方法，用胭脂红和苦味酸的混合液进行。按Wang等(Wang等,2011)所述，该染色被用作定量屁股蚕丝脱胶效果的方法。简言之，将溶于25％氨水的胭脂红与饱和苦味酸水溶液混合制得染色溶液，pH调成8.0–9.0。为了染蚕丝纤维，将基体浸没到不同试管的染色溶液中，沸水浴加热5min。再将样品用ddH2O彻底清洗，室温干燥。用数字照相机(Ixus 100S,Canon,Japan)获得染色后的蚕丝基体的数字图片。再用这些图片计算各自的“红色色度(redness)”值，使用Definiens XD 1.0软件(DefiniensAG,Germany,Munich)，按下列公式计算：红色色度＝(2x红–绿–蓝)/(2x红+绿+蓝)。
扫描电镜(SEM)分析
脱胶处理后，迅速将骨架用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)漂洗，在2.5％戊二醛中室温过夜进行固定。然后用分级乙醇和接下来的六甲基二硅氮(disilazane)脱水，再在通风橱中风干。样品用Polaron SC7620喷涂仪(Quorum Technologies Ltd.East Grinstead,英国)喷涂Pd-Au，用JEOL JSM-6510扫描电镜(JEOL GmbH,Eching/Munich,Germany)以3kV进行检查。
力学测试
蚕丝骨架用ZwickZ050材料测试仪(Zwick GmbH&Co.KG,Ulm,Germany)进行拉力(tension)测试。为确保测试仪中的稳定固定，将骨架末端包埋在环氧树脂中(epoxy resinBK,VOSSCHEMIE GmbH,Uetersen,Germany)。测试前，将骨架在PBS中保温至少24h。样品以10mm/min的拉伸率在23±2℃和相对湿度45-65％时拉伸直至断裂(failure)。拉断测试(pull-to-failure test)用50N预应力(pretension)进行。断裂前达到的最大加载力用终极拉伸力(UTS)表示。为计算劲度值，用到了应力/应变(stress/strain)曲线。
细胞培养
前交叉韧带成纤维细胞(ACLF)
AUVA(IRB)伦理道德委员会批准了从患者采集ACL组织进行总体ACL重建的分案。前交叉韧带成纤维细胞(ACLFs)按Nagineni等(Nagineni,Amiel,Green,Berchuck,&Akeson,1992)的方案的改良方案。简言之，收获ACL组织，无菌切碎，成1-3mm3的小片。再将这些组织分离块转移到100mm细胞培养petri皿中，在含10％FCS(PAA,Pasching,Austria)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素的DMEM中培养。监控从分离块长出的细胞，直至90％铺满，然后移种细胞。
脂肪衍生的基质细胞(ASC)
在门诊病人于局部肿胀麻醉下实行抽脂术期间获得皮下脂肪组织(得到IRB同意)。如前述(Wolbank等,2007)，分离出脂肪衍生的基质细胞(ASC)，在培养基中培养，所述培养基含DMEM-低糖/HAM’s F-12补加10％FCS(PAA,Pasching,Austria)、2mM L-谷氨酰胺、1ng/mL重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhFGF,R&D Systems,Minneapolis,USA)。
细胞活力和增殖测试
为测试经不同方式脱胶的蚕丝骨架对细胞活力和增殖行为的影响，将1g已脱胶的蚕丝在5ml细胞培养基中37℃、5％CO2环境下浸没至少24h。并行地，将细胞以0.2x105个细胞/孔的密度接种在24孔板中。含有从蚕丝材料滤出的产物的培养基然后过滤(0.22μm,Rotilabo,Karlsruhe,德国)，用于更换细胞培养中的培养基。用标准的细胞培养基作为阴性对照。
增殖
增殖用5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)摄取实验(细胞增殖ELISA分析盒，目录号1647229,Roche Diagnostics)按说明书进行测定。简言之，细胞各自用含100μM BrdU的培养基在37℃、5％CO2的潮湿温箱中培养12h。去掉培养基，将培养板风干15min。加溶液作用30min，随后与抗-BrdU POD(过氧化物酶)抗体一起室温保温60min。板用PBS洗三次，加入四甲基联苯胺作为底物，作用30min。加1M H2SO4终止反应，测量450nm处的吸附，以690nm作为参考波长。
用MTT试验进行细胞活力/细胞毒测试
将细胞培养基吸出，每孔分别添加含650mg/mL MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑]溴化物的细胞培养基。细胞在37℃和5％CO2中保温1h。吸出培养基，将MTT甲臜(formazan)沉淀物避光机械振荡20min，使之溶于DMSO。将每份样品的100μl等份转移到96孔板。马上在自动微滴板读数仪(Spectra Thermo,TECAN Austria GmbH,奥地利)上读取550nm处的吸光度。针对非特异性本底，校准光密度(OD)值。
在硼酸盐缓冲液脱胶的蚕丝骨架上的细胞活力
为观察ASC在硼酸盐缓冲液脱胶的蚕丝骨架上的细胞活力，完整构建物的1cm内部纤维束接种1x106cells/mL细胞悬浮液，在37℃、5％CO2环境中放置24h。然后将接种了细胞的骨架材料用钙黄绿素-乙酰氧-甲醚(CalceinAM,Invitrogen,Lofer,Austria)染色。为此，将构建物在含5mg/ml CalceinAM的CM中保温15min，用PBS清洗。在再用PBS清洗之后，用Leica DMI6000B落射荧光显微镜(Leica Microsystems GmbH,Wetzlar,Germany)获得显微荧光照片。
统计分析
所有计算用GraphPad软件(GraphPad software,Inc.,La Jolla,CA,USA)进行。数据的正态分布用Kolmogorov-Smirnov test来检验。用单向ANOVA和接下来的Tukey事后检验(post hoc test)进行统计分析，将P值小于0.05视为统计学显著。
结果：
减重
为证实基于硼酸盐缓冲液的脱胶与经典Na2CO3脱胶法相比的有效性，测定处理过的蚕丝骨架的减重。在去除丝胶蛋白之前，先将蚕丝骨架在70％乙醇(w/w)中煮沸，以脱去任何可能的织物防腐剂。这种用醇进行的处理导致蚕丝骨架减重2.9％±0.1％。随后分别用Na2CO3或硼酸盐缓冲液脱胶导致减重25.2±0.3％和27.1％±0.1％。
脱胶对缆绳蚕丝骨架的力学特性的影响
从拉至断裂测试获得的参数总结在表1中。另外，该表还包含参考值，人类股骨(femur)-ACL-胫骨(tibia)复合体的线性劲度(242±28N/mm)和UTS(2160±157N)，来自Woo等(Woo,Hollis,Adams,Lyon,&Takai,1991)的研究。
表1.脱胶工艺对缆绳蚕丝骨架的力学特性的影响，以及来自Woo等(Woo等,1991)的人ACL参考值，所有数据都是7个动物的均值±SEM。
终极拉伸强度(UTS)
两种脱胶方法引起相比于未脱胶对照而言显著的UTS值减小(图3)。原料未脱胶蚕丝骨架、硼酸盐缓冲液脱胶的蚕丝骨架、碳酸钠脱胶的骨架的UTS值分别为2757±42、2440±182和2230±94。这些值对应于硼酸盐缓冲液脱胶的蚕丝骨架去除丝胶蛋白之前的起始UTS值的89％和碳酸钠脱胶的骨架的81％。可见，硼酸盐缓冲液脱胶的骨架的UTS显著高于用经典碳酸钠脱胶获得的UTS。
劲度
用碳酸钠脱胶或用硼酸盐缓冲液脱胶的蚕丝骨架的劲度颇为等效，分别是271±34N/mm和290±29N/mm，且都与未脱胶的天然蚕丝骨架(270±49)无显著性差异。
SEM-分析
为研究依赖于3D构架的丝胶蛋白去除效力，收集了不同层级来源的纤维纤维，用SEM进行观察分析。图5显示了这些蚕丝纤维的表面形态。可以看到，未脱胶的原料SF纤维展示出丝胶蛋白不均匀的树胶样涂层，覆盖了底下的蚕丝丝素蛋白长丝(图5，原料)。图5中的蚕丝纤维，“EtOH”排已用乙醇煮沸以除去脂肪性质的物质，如纺织工程化防腐剂。第2排代表未脱胶、但经过醇处理的原料SF纤维。明显地，醇处理和未处理的SF纤维无差别。用经典Na2CO3法脱胶的SF骨架(图5 0.01M Na2CO3,0.02M Na2CO3)和用基于硼酸盐缓冲液的方法脱胶的SF骨架(图5硼酸盐)的照片显示出丝胶蛋白去除方面的差异，尤其在3D结构的骨架的内部。硼酸盐缓冲液脱胶的骨架(图5，硼酸盐)展示出，从外鞘直至内部纤维都是无丝胶蛋白的SF纤维。
苦味酸加胭脂红染色
除了SEM分析，丝胶蛋白去除还用苦味酸加胭脂红染色来证实。如Wang等(Wang等,2011)所述，丝素蛋白和丝胶蛋白以不同方式吸附胭脂红和苦味酸。丝胶蛋白同时吸附胭脂红和苦味酸，而丝素蛋白选择性吸附苦味酸分子。因此，蚕丝的红色染色可以标示丝胶蛋白残留。图3A显示未脱胶的原料蚕丝骨架被染成深红，表明这些骨架纤维表面有大量丝胶蛋白。图3B和3C代表分别用Na2CO3和硼酸盐缓冲液脱胶的蚕丝骨架的染色。Na2CO3脱胶的蚕丝骨架展示了鞘上和外部纤维束有稀疏红色、而内部纤维束的红色较深。相反，硼酸盐缓冲液脱胶的蚕丝骨架展示了白色至黄色，说明成功除去了丝胶蛋白，3D层级结构的骨架的内部很明显。
为进行密度计量分析，给不同着色的骨架拍照，用所得照片(图10A,C,E)计算不同骨架样品的红色色度。在图10B中，这些值以柱图形式定量表示上述观察值。
细胞活力
ACLF和ASC细胞在不同脱胶的蚕丝骨架的滤出培养基上培养后的MTT实验结果见图7。两类细胞的细胞活力与未处理的标准细胞培养基的活力相比，培养24h后无显著差异。
增殖
根据BrdU ELISA结果，在不同脱胶的蚕丝提取液或未处理的标准培养基中培养24h后，ACLF或ASC所检测到的细胞增殖无显著差异(图8)。
在硼酸盐缓冲液脱胶的蚕丝骨架上接种细胞
为验证ASC在硼酸盐缓冲液脱胶的蚕丝构建物上的细胞活力，在接种了ASC的内部纤维束上用钙黄绿素AM进行活细胞染色。图9(绿)显示蚕丝丝素蛋白纤维上的活细胞。将蓝通道照片(图9蓝)叠加在绿通道照片(图9绿)上，证实ASC沿着纤维结构的骨架材料附着(图9蓝/绿)。
讨论
为了在TE和再生医学应用中使用蚕丝纤维的骨架，去除丝胶蛋白对保证生物相容性是的基本。但是，以前没有研究过高层级蚕丝骨架的丝胶蛋白去除。为此，研究了展示数级几何结构层级的预制蚕丝骨架用经典Na2CO3溶液脱胶的能力，并与基于硼酸盐缓冲液的脱胶方法相比较。TE中的标准工序是在制备骨架之前从生丝中去除胶质。但是，去除丝胶蛋白使蚕丝纤维磨损并削弱其结构特性，使得很难将它们纺织工程化(如编织或编辫)改造为用于TE应用的骨架。Liu等(Liu等,2007)提出了一种劳动密集的方法，来增强无丝胶蛋白的纤维的加工特性。在该研究中，通过使无丝胶蛋白的蚕丝纤维与凝胶进行化学交联来代替丝胶蛋白，明胶作为滑动的表面并保证纺织工程化的可加工性。在其它的研究中，先制备蚕丝骨架，之后进行脱胶处理。(Fan等,2009)(Fan等,2008)(Chen等,2008)。无论如何，上述所有这些研究的结构基础是普通网格。与高层级的纺织工程化结构相比，它们容易被脱胶试剂穿透。
众所周知，家蚕生丝中的丝胶蛋白含量占大约25wt.％。减重测量显示，使用基于硼酸盐缓冲液的脱胶溶液(27.1％±0.1％减重)去除丝胶蛋白比通常使用的Na2CO3脱胶方法(25.2±0.3％减重)更为高效。这些结果得到SEM分析的进一步支持，SEM分析显示Na2CO3脱胶的蚕丝仍然展示丝胶蛋白的残留，主要是位于层级化的骨架的内部结构中。相反，用硼酸盐缓冲液脱胶的蚕丝骨架的表面很光滑和干净，而与采样位置无关。苦味酸和胭脂红染色法支持了SEM分析的结果，其在Na2CO3处理的蚕丝中将丝胶蛋白残留呈现为红色区域，尤其是在其内部结构的纤维上。由减重测量、SEM分析和PACS染色法获得的结果都表明，用基于硼酸盐缓冲液的脱胶能有效去除丝胶蛋白。
为了分析脱胶对蚕丝结构的力学特性的影响，对缆绳样式的、脱胶和未脱胶的蚕丝骨架进行了拉断测试。脱胶后蚕丝的力学强度(UTS)的减小与先前的文献(Liu等,2007)(Wang等,2011)一致。有趣的是，与碳酸钠脱胶组比，硼酸盐缓冲液中的UTS值明显更高。这些结果与Jiang等(Jiang等,2006)的研究的发现相符。在该文章中，对经不同脱胶处理的单个蚕丝纤维的拉伸参数进行了确定，结果表明，在保持蚕丝纤维的固有力学特性方面，硼酸盐缓冲液是比碳酸钠更好的脱胶剂。
在去除丝胶蛋白后，单个蚕丝纤维表现出较低的弹性特性。令人吃惊的是，在本发明中，劲度值在脱胶的或未脱胶的蚕丝骨架之间并没有明显区别。这些结果与先前认为脱胶后骨架劲度会减小的预期并不一致。对这些反常发现的一种可能的解释也许是，纺织工程化的骨架的大多数劲度特性是归因于其层级架构而不是单个纤维的力学特征。这种解释得到了(Horan等,2006)的研究的支持，其中，通过选择各种纺织方法来调节成形蚕丝骨架的UTS和劲度的潜力得到证实。
为了了解不同方法脱胶的蚕丝骨架与脂肪衍生的基质细胞(ASC)和前交叉韧带成纤维细胞(ACLF)细胞配伍之间的体外生物相容性的差异，(两类细胞都打算将来用于韧带TE方法中)，进行了细胞活力和增殖试验。在两项试验中，测试了是否蚕丝丝素蛋白提取液对细胞活力和细胞增殖有负面影响。MTT结果表明，不管用哪一种脱胶溶液，蚕丝的提取液对所调查的细胞类型无细胞毒效应。借助BrdU掺入所进行的细胞增殖分析表明，两个脱胶组均无变化。而且，ASC在硼酸盐缓冲液脱胶的蚕丝上的细胞活力经钙黄绿素AM染色得到证实。
尽管体外结果很好，仍需另外进行体内测试，以研究硼酸盐缓冲液脱胶对体内行为的影响，尤其考虑降解速率。
结论
这些结果显示，对不能用经典碳酸钠脱胶溶液脱胶的高层级3D骨架，可以用基于硼酸盐缓冲液的系统进行脱胶，优选与乙醇清洗步骤配合。不仅蚕丝骨架的力学完整性基本保留，还发现硼酸盐缓冲液适于将引起免疫应答的丝胶蛋白完全去除，甚至在所测试的蚕丝骨架的内部结构中也是如此。这种能在纺织工程化化工艺之后较充分除去丝胶蛋白的可能性，使生产高层级骨架结构变得容易。这一发现有可能促使蚕丝作为骨架材料用于其它需要复杂的多层级结构的TE和再生医学应用中。

Claims (28)

1.制备具有不止一个几何结构层级水平的三维蚕丝医学植入物制品的方法，其中天然蚕丝纤维形成三维蚕丝医学植入物制品，所形成的蚕丝制品经历至少30min的脱胶步骤，在该步骤中，用硼酸盐缓冲液作为脱胶剂，而且所形成的蚕丝制品在所述脱胶步骤之前与含水乙醇缓冲液接触，且所述蚕丝医学植入物制品具有小于0.1％重量比的丝胶蛋白含量和至少0.5mm的厚度。
2.根据权利要求1的方法，其中脱胶步骤是将所形成的蚕丝制品与硼酸盐缓冲液接触，所述缓冲液包含硼酸盐离子。
3.根据权利要求2的方法，其中的硼酸盐离子是硼酸钠、硼酸。
4.根据权利要求1的方法，其中乙醇用的是含有1-98％体积比的乙醇的水溶液。
5.根据权利要求1的方法，其中乙醇用的是含有60-80％体积比的乙醇的水溶液。
6.根据权利要求1的方法，其中乙醇用的是含有65-75％体积比的乙醇的水溶液。
7.根据权利要求1的方法，其中硼酸盐用的是含有10-2000mM硼酸盐的水溶液。
8.根据权利要求1的方法，其中硼酸盐用的是含有50-1000mM硼酸盐的水溶液。
9.根据权利要求1的方法，其中硼酸盐用的是含有100-1000mM硼酸盐的水溶液。
10.根据权利要求1的方法，其中三维蚕丝制品通过机织、编辫、编结或压制来形成。
11.根据权利要求1的方法，其中天然蚕丝纤维是家蚕蚕茧的纤维。
12.根据权利要求1的方法，其中所形成的蚕丝医学植入物制品是支架，神经导管，疝网，维系带,用于肌腱、气管或支气管的骨架，或软骨以及骨的骨架。
13.根据权利要求12的方法，其中用于肌腱、气管或支气管的骨架是前交叉韧带。
14.根据权利要求1的方法，其中所形成的蚕丝制品是细胞底层(cell substratum)。
15.根据权利要求1的方法，其中脱胶步骤在20-100℃进行。
16.根据权利要求1的方法，其中脱胶步骤在70-100℃进行。
17.根据权利要求1的方法，其中脱胶步骤在煮沸温度进行。
18.三维蚕丝制品，能通过权利要求1-17任一项的方法获得。
19.根据权利要求18的三维蚕丝制品，其中所述制品是基质骨架。
20.根据权利要求19的三维蚕丝制品，其中所述基质骨架用于医学用途。
21.根据权利要求19的三维蚕丝制品，其中所述基质骨架用于细胞粘附、散播、生长和分化。
22.根据权利要求18的三维蚕丝制品，其中最小维不小于最大维的1/100。
23.根据权利要求18的三维蚕丝制品，其中最小维不小于最大维的1/50。
24.根据权利要求18的三维蚕丝制品，其中最小维不小于最大维的1/20。
25.根据权利要求18的三维蚕丝制品，其中两个较小维具有1:1-1:5的比例。
26.根据权利要求18的三维蚕丝制品，其中该制品最小维的直径为至少1.0mm。
27.根据权利要求18的三维蚕丝制品，其中该制品最小维的直径为至少2.0mm。
28.根据权利要求18的三维蚕丝制品，其中该制品最小维的直径为至少5.0mm。
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