CN104822875B - 蚕丝制品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了制备三维蚕丝制品的方法，其中，将三维蚕丝制品用蚕丝溶剂处理一段时间，使该蚕丝制品部分解体，然后通过再稳定溶液处理，而用物理的β‑片层诱导使所述部分解体的蚕丝制品重新稳定。

Description

蚕丝制品
技术领域
本发明涉及蚕丝材料加工领域，尤其是提供医用蚕丝材料。
背景技术
蚕丝用于生物医学缝线已有几十年历史，观察到了潜在的宿主免疫反应。这可能是蚕丝在过往的生物医学应用中不予考虑的主要原因。引发免疫反应的主因与丝胶蛋白(sericin)有关。故，从生丝(raw silk)彻底除去丝胶蛋白，是组织工程化和再生医学应用中制备丝织物、但避免生物相容性问题的关键步骤。
常见的蚕丝是从家蚕(Bombyx mori)幼虫的蚕茧获得的。单个蚕茧纤维由被称为丝胶蛋白的胶状蛋白包绕两个丝素蛋白(fibroin)核心而成，其中由丝胶蛋白将多个丝素蛋白纤维互相固定。丝素蛋白和丝胶蛋白分别占约75和25％wt.。
蚕丝丝素蛋白在形态上以高度有序的晶态纤维结构为特征。这种结构使它不溶于诸如水、乙醇、稀酸和碱等大多数溶剂。与丝素蛋白相反，球状的丝胶蛋白易溶于水性溶剂。纺织业对于去除丝胶蛋白也有极大兴趣，因为蚕丝服装的光泽会被丝胶掩盖。因此，不光是生物材料领域要研究蚕丝，纺织业也在寻找最佳的脱胶方法。这导致出现多种脱胶方法，包括，碱性溶液(加或不加表面活性剂)、尿素、酒石酸、柠檬酸、或诸如木瓜蛋白酶或内肽酶等酶类。传统的脱胶法是将生丝置于有或无表面活性剂的碱性溶液中煮沸，表面活性剂有助于使丝胶蛋白从纤维结构中脱离出来。值得注意的是，通常是用0.02M碳酸钠溶液在100℃处理30-60min来完成脱胶，尤其是在组织工程化研究领域。这种碱性脱胶常常以批量处理，使用的是肥皂或表面活性剂加碱。
工业蚕丝生产通常涉及将天然蚕丝纤维(native silk fibres)溶解成丝素蛋白溶液、再用合适的方法如离心法从这种溶液中再加工出(reprocessing)纤维。
提供医用蚕丝材料的方法几乎是唯一的：将蚕丝纤维以摩尔比1:2:8溶于含水体系如LiBr或CaCl2/EtOH/水中(CN 101736430B)，然后通过诸如离心、电纺丝(electrospinning)、由水性系统或有机溶剂系统注浆成形(casting)、凝胶化、起泡等等，将该蚕丝溶液再加工为所需形式的材料(Vepari等,2007,US 5,252,285 A；Sung-Won Ha等,Biomacromolecules 4(3)2003p.488-496)。
但这些由丝素蛋白溶液再加工出的蚕丝材料与天然蚕丝结构不同，常导致三维产物具有用于多种可能用途、尤其外科领域的用途时不令人满意的特性(特别是力学特性)。
为避免所得的蚕丝结构的这些被削弱的特性，需要一些使用脱胶的蚕丝纤维作为原材料的技术。蚕丝纤维用纺织工程化技术如编辫(braiding)、打结(knotting)、机织(weaving)等加工时的高度可加工性，尤其在生物医学制品领域，已得到Horan等(J Biomech 39(12)2006,p.2232-2240)证实。尽管用纺织工程化技术制备骨架能实现上述各种进步，仍有一些特殊情况有益于使纤维粘合，这是纺织工程化技术很难或根本不能实现的。因此研发了不同的策略来用溶剂、粘合剂(埋在树脂中)或加热处理(US 3 510 390 A)使天然以及合成的纤维粘在一起。一种将蚕丝纤维与相邻纤维粘合的方法用到离子液体。这些离子液体起到多种生物聚合物包括蚕丝的溶剂的作用。例如，Haverhals等(Macromolecular materials and engineering 295,1January 2010,p.425-430)表明，用1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐可以将天然未脱胶的蚕丝“焊接(weld)”到一起。该工艺被描述和展示为，将纤维表面粘合成无中断且无解体的结构(US 8202 379 B1)。
另一种用于将蚕丝纤维彼此粘连的化学试剂是甲酸。早在1915年就有人描述了从短蚕丝纤维制备均质纤维浆的工艺(GB 12374 A)。在生物医学领域，Ghanaati等(JTERM,2010(4)p.464-472)用甲酸将脱胶的无纺蚕丝纤维粘合在一起，形成可移植的稳定骨架，但不会形成一长串粘在一起的蚕丝纤维。
显然，生物医学材料(尤其植入材料)必需要有显著的力学稳定性，特别是要抵抗压力时，而这类材料的任何意外断裂都必须阻止或排除。因此，需要改进的方法来基于改进了力学特性和形态特性的蚕丝而提供结实耐用的生物医学材料。这些方法应允许稳健、可再现且可靠的制备方法；另一方面，这些产物应允许制得的生物材料能加以应用，尤其用于医药和用于细胞培养方法中。
发明内容
因此，本发明的一个目标是提供这样的方法；这样的方法应该也特别适于医学目的，尤其适于疗法和外科手术。
因此，本发明提供制备三维蚕丝制品的方法，其中，将三维蚕丝制品用蚕丝溶剂(silk solvent)处理一段时间，使该蚕丝制品发生部分解体(partialdisintegration)，之后，通过物理的(physical)β-片层(sheet)诱导而将该部分解体的蚕丝制品重新稳固。
本发明中，“三维蚕丝制品”应该不仅理解为，其三维中没有一维不与其它两维发生关联的那些制品，而且理解为，由至少两层丝素蛋白叠加而限定的那些制品，所述两层丝素蛋白中，一层是均匀的丝素蛋白层(区，域，相，等)，一层是纤维状丝素蛋白层，它们从空间上允许产生非均质(anisotropic)材料性质。
本发明的方法提供改进了力学特性的蚕丝结构物(silk constructs)，尤其丝素蛋白结构物。这允许将本发明方法可获得的产物移植到会暴露于特定机械作用力的区域中。例如，在神经导管(nerve conduit)的例子中，体内移植物可能暴露于能引起这类移植物崩解的压力。在这样的情形中，由未经处理的丝素蛋白构成的(梭织)管纱会崩解，阻碍所述管纱所覆盖正在生长的神经。本发明的方法使移植物能抵抗这类引起挤压(crush)或挫伤(contusion)的力量。鉴于之前在丝素蛋白结构物上实施了解体步骤或再稳定步骤但未制出具有本发明所述优点的产物，说明是这两个步骤的组合导致了产物具有本发明所述的改进的特性。
本发明的部分解体步骤可视为蚕丝制品在暴露于解体溶液，蚕丝溶剂的区域内的部分溶解。这涉及丝素蛋白中使之成形的beta-片层结构的部分解体。解体可以达到终产物所需的程度，例如，仅仅靠近表面或贯穿整个蚕丝制品，当然是产物尚未变成溶液。起始材料(即，蚕丝制品)的总体形状在部分解体步骤的全过程中基本保留。因此，蚕丝溶剂只是施用有限的时间段，不会一直用到彻底溶解的程度(达到平衡)。蚕丝(丝素蛋白)材料(再次)彻底液化成溶液或悬浮液的情形在本发明中不会发生，仅仅是产物的有限区域内发生部分的去固化过程。此(部分)“溶解”步骤允许丝素蛋白分子更紧密地聚集在以形成连续相为特征的产物的解体区域(disintegrated area)内部。在蚕丝制品上实施的解体步骤所能达到的程度因此导致本发明终产物的不同产物特征。
可见，本发明的“解体”明显有别于其它蚕丝加工步骤，如脱胶(“脱胶(degumming)”是指将两类蛋白彼此分离，即，使丝胶蛋白脱离丝素蛋白纤维，它类似于使外壳与核心脱离)。
在再稳定步骤中，蚕丝制品的解体部分再次固化，但形成了与该蚕丝制品的未解体部分相比有不同形态和力学特征的区域。由于该再稳定步骤，蚕丝制品再次彻底固化，通常形成非均质的终产物，其中最显著暴露于溶丝液的表面经历了最广延的结构变化，而蚕丝制品的内部(或未暴露于溶丝液(“蚕丝溶剂”)的表面)能够维持几乎不变或至少未变到更多暴露于蚕丝溶剂的部位所达到的程度。本发明的再稳定步骤因此引起形态上的晶样状态(morphological crystalline-like state)。所述再稳定步骤是通过物理的β-片层诱导来进行的。解体引起蚕丝的“无规”结构。此后，解体的蚕丝经物理处理而实现β-片层再折叠。实施该步骤的典型方式是除去无规蚕丝形式中解体区的水分子，直至发生这类再折叠。
蚕丝丝素蛋白是多形性材料，有三种不同的相(phases)，通常称为蚕丝I、II和III。蚕丝I代表一种螺旋且无规卷曲的水溶性结构状态，可见于离心处理前的蚕腺体或作为(含水)蚕丝溶液(也称再生丝(regenerated silk))。蚕丝II的特征在于不对称β-片层结构，其中甘氨酸的氢侧链大都暴露在β-片层的一侧、丙氨酸的疏水甲基侧链在另一侧。结果，各个β-片层通过并肩式排列而自我装配，通过强氢键和范德华力而稳定。
通过暴露于热或剪切力，引起蚕丝I向蚕丝II的结构变化。这种相变(phase transition)也可以通过用甲醇或其它促进蚕丝分子失水的试剂处理蚕丝结构来获得。结果，从无规卷曲(蚕丝I)向β-片层形成(蚕丝II)的转变因链-链相互作用的增强而被诱导。除了所述相变，此过程还确保水稳定性蚕丝结构。其它引起和控制beta-片层形成的方法是，高压蒸汽灭菌(Park等,J.Mat.Sci 43(2008),6967-6985)和水冷退火法(water annealing methods,Hu等,Biomacromol.12(2011),1686-1696)。
再稳定步骤优选按照本发明通过用再稳定溶液处理来进行。也可以使用不同的再稳定溶液的多种组合。
用再稳定溶液进行的再稳定可以用任何能实现蚕丝的β-片层形成的溶液来进行。所述结晶(通过用再稳定溶液处理进行的再稳定)常常由两种目前业内的方法来诱导，是浸没在诸如甲醇或乙醇等醇溶液中。醇浸没既简单又快速，但如果必须要避免使用醇的话，可以使用诸如甲酸等无醇再稳定溶液。
作为本发明的测试系统，研究了用于神经修复的蚕丝丝素蛋白对照(control)结构。更具体地，对坐骨神经(N.ischiadicus)缺损的搭桥已在大鼠体内观察到，显示出令人意外的结果(见实施例部分)。
在本发明过程中意外发现，蚕丝制品(尤其三维丝素蛋白产物)，在应用了本发明的两个处理步骤后，可以有效改进其力学特性，尤其是它们抵抗体内移植后瓦解的抗性。这使得能产生与经丝素蛋白溶液再处理(无本发明的加固步骤)的蚕丝纤维相比具有显著优势和潜能的三维蚕丝制品。
根据本发明提供更结实耐用的复杂蚕丝结构，给当今手术带来明显好处。而且，该制备过程整体上是可靠的，适于进行工业化大规模生产。优选地，本发明的蚕丝溶剂包括LiBr、LiSCN、六氟代-2-丙醇(HFIP)、含乙醇和CaCl2的混合物或含甲醇和硝酸钙的混合物；或它们的混合物。根据优选实施方案，LiBr在蚕丝溶剂中的使用浓度是1-10M，优选3-10M，尤其5-7M。根据优选实施方案，LiSCN的使用浓度是1-17.5M，优选5-15M，尤其8-12M。根据优选实施方案，HFIP在溶液中的使用浓度是1-100％(v/v)，优选50-100％(v/v)HFIP，尤其90-100％(v/v)HFIP。乙醇可以，例如，在蚕丝溶剂中使用含水溶液，其包含1-50％(v/v)乙醇，优选5-40％(v/v)乙醇，尤其10-30％(v/v)乙醇。CaCl2可以，例如，在蚕丝溶剂中与乙醇的摩尔比为1:0.3-1:3(即，1mol CaCl2:0.3molEtOH至1mol CaCl2:3molEtOH)，优选1:1-1:2.5，尤其1:1.5-1:2.2。
本发明的方法适用于广泛多种不同的蚕丝制品,尤其丝素蛋白制品。优选,所述三维蚕丝制品是梭织物(woven fabric),无纺织物(non-woven fabric),管纱(tube),编织物(knitted product)或压制品(pressed product)。尽管本发明的方法可以用任何丝架(silk scaffold)来实施，但所述方法特别适于处理由蚕丝纤维构成的骨架。那些制品可以转而形成一个区域有解体而其它区域仍保留原始丝纤维结构的丝架，优选提供非均质(anisotropic)制品，即，表面已解体、内部仍包含丝纤维的制品。尤其优选使用丝素蛋白制品或由天然蚕丝纤维构成的梭织制品(woven product)。本发明方法优选的起始材料例如是，蚕丝管纱(如Lovett等,Biomaterials 29(2008),4650-4657；US 2008/249639 A1；Ghaznavi等,Ann.Pl.Surg.66(2011),273-279)等制得的那些)，蚕丝织物(如，WO 02/29141 A1制得的那些)，或蚕丝膜(如，US 2010/286774 A1)。
蚕丝材料可以从所有天然和合成的来源采集；但优选使用由家蚕(Bombyxmori)蚕茧的原生蚕丝纤维制得或衍生得到的蚕丝制品。这些纤维(原生形式或已脱胶(即已从纤维上除去丝胶))可以作为原生纤维用于制备当作本发明起始材料的蚕丝制品，或者先转变为丝素蛋白溶液，然后再加工(例如经离心)成(丝素)纤维和丝素制品。蚕丝纤维的主要工业来源当然是家蚕(Bombyxmori)，但其它蚕(鳞翅目昆虫(Lepidopteron))的丝纤维也可以用于本发明的方法中。蚕(Silkworms)通常可以区分为家蚕(muberry)(Bombyxmori,Bombyxmandarina)和非-家蚕(印度柞蚕(Antheraea(A.)mylitta),普利柞蚕(A.proylei),A.pernyi,A.yamamai,A.frithi,A.assamensis,Samiaricini,A.atlas,白斑枯叶蛾(Gonometapostica),芒果天蚕(Criculatrifenestrata))。野蚕与家蚕之间在提取的丝胶蛋白的氨基酸组成方面相似性至少97％，表明不同蚕种之间有大量的保守氨基酸序列(Mondal等,Caspian J.Env.Sci.5(2007),63–76)，这表明本文所述方法也适用于其它的蚕丝来源。
另一方面，也优选将本发明的方法应用在由丝素蛋白溶液(尤其重组丝素蛋白溶液)形成的再造(reconstituted)纤维这样的蚕丝制品上。
本发明的方法已针对家蚕丝纤维构成的制品进行了特别优化。这也是纺织业的原生丝纤维的主要工业来源。但是，正如上文已述，其它丝纤维，如来自其它蛾毛虫(moth caterpillars)或圆蛛(orb-spinning spiders)(如Nephilaclavipes)的丝纤维也可以用于生产本发明的蚕丝制品。还可以将本方法应用于包含蚕丝材料(纤维)、并包含其它用于提供生物相容性材料的物质的三维蚕丝制品，所述其它物质如PEG、明胶(gelatin)、胶原、透明质酸、几丁质等等，只要将方法步骤应用于这些不同组合时不实质上破坏产物的三维形状。
最优选的原生丝纤维是来自家蚕(Bombyxmori)蚕茧的那些。家蚕的丝纤维具有三角形横截面和圆角，5-10μm宽。丝素蛋白-重链主要包含多个beta-片层，归因于一个由59个氨基酸组成的带有一些变异的重复序列。这些纤丝(fibril)的平整表面以多角度反射光线，为蚕丝带来天然光泽。其它蚕的横截面在形状和直径上差异很大：Anaphe的为新月状(crescent-like)，柞蚕(tussah)的为细长楔形(elongated wedge)。自然状态下，蚕丝由两个蚕腺以原始丝(单丝)形式成对吐出，这些单丝粘在一起，与起胶水作用的丝胶蛋白共同形成茧丝(bave)。榨蚕丝(tussah silk)的茧丝直径可达65μm。
根据本发明方法制备的优选蚕丝制品是医用移植物，优选支架(stent)、神经导管、(组织)骨架(scaffold)(如肌腱、支气管、气管，等)、疝网(herniameshwork)、结扎丝(ligature)，尤其前交叉韧带(anterior cruciate ligament,ACL)，或软骨和骨移植物。
使用本发明的方法能提供非均质蚕丝制品，即在指定产品的不同侧面上或不同区域内改变了丝料特性的制品。本发明的非均质三维蚕丝制品的特征在于，至少两层(“相”、“区”、“域”)从空间上允许产生非均质材料性质的丝素蛋白丝状体叠加在一起。本发明的三维材料的特征还在于均匀的(连续)丝素蛋白相(制品中经过溶解后又再稳定的区域)和纤维状丝素蛋白相(未溶解丝纤维的那些区)，前者不含空洞(“凹洞(entrapped cavities)”)或至少不足5％v/v的凹洞，后者不是连续的、但以丝纤维的纤维本性为特征(见图11E-11I相比于图13，显示现有制品不具有均匀的丝素蛋白相(但具有长丝状本性(“多层纤维(stacked fibers)”、“连续长丝(continuous filaments)”等)的结构)；图11E-11I中的红线表示本发明制品中匀相的厚度)。
本发明的制品可以为非均质的，外膜连续而内膜为长丝状。也可以仅在制品的内核呈长丝状、但整个制品的表面是均匀的，或甚至整个制品为非丝状的均匀连续形式。制品表面不应为均匀的部位可以在加工过程中予以保护以抵抗蚕丝溶剂和再稳定溶液，例如进行物理覆盖或化学保护。
这可以通过例如仅在蚕丝制品的一侧使用溶解液，从而仅一侧按本发明加工，对侧不进行该处理或不明显进行该处理来实现。这会导致制品有两个不同表面，分别具有不同性质(例如，一侧仍有未经处理的特性而另一侧具有本发明蚕丝制品的特性)。也可以通过允许蚕丝制品的部分解体发生到一定“深度”、以至于蚕丝制品内部保留未经处理的本性、只有表面(直至目标“深度”)表现出本发明的改进特性，来给制品提供非均质特性(见例如图2)。因本发明的方法允许为了部分解体的目的而用蚕丝溶剂处理例如较短时间或较长时间(或改变方法中的其它参数，如温度、浓度、或用于处理的化学品等)，故可以控制解体所能达到的“深度”。例如，每种蚕丝制品可以仅短暂处理(仅仅最表面发生解体且很快用再稳定步骤加固)或处理较长一段时间(允许蚕丝制品的大部分在第一步骤中解体(然后用本发明的再稳定步骤加固，该步骤总是在解体后进行，优选在解体后马上进行))。
通常，本发明的三维制品是复杂三维结构，最窄处直径(“厚度”)至少0.1mm，优选0.5mm。理论上，厚度10-15μm也是可行的，但这样的实施方案通常可实践性较差。它们也可以通过折叠、焊接、或管通(tubing)更简单的三维制品来制得。事实上，本发明优选的三维制品在最窄处直径至少1.0mm，优选至少2.0mm，尤其至少5.0mm。
溶解步骤和再稳定步骤的处理参数能以可再现的方式很容易地对具体制品进行优化。对每一产物而言，温度、解体和再稳定化学剂的类型和浓度、处理的持续时间，都可以依据终产物应具有的解体量和加固程度来调整。例如，蚕丝溶剂处理可以在20-100℃、优选50-78℃、尤其70-77℃进行。优选实施方案中蚕丝溶剂处理的持续时间为例如1s-2h、优选1s-0.5h、尤其10s-30min。再稳定溶液处理可以例如进行1s-1h、优选5min-1h、尤其20min-30min。显然，所用温度和持续时间彼此相依，在给定的生产方案中需要各自调整以适应对方(较高的温度通常允许较短的反应时间)。
优选的再稳定剂是甲酸。甲酸已知是蚕丝溶剂也是蚕丝结晶剂(silkcristallising agent)(Um等Int.J.Biol.Macromol 33(2003)203-213)。在本发明的再稳定剂中，甲酸起弱溶剂作用，引起甲酸的无规卷曲结构，其导致这些丝素蛋白分子的流体动力学半径。这导致结晶前的事先排序/紧密包装。然后，最终的结晶可以通过本领域已知方法实现，例如(最优选)用甲醇进行处理。其他再稳定溶剂可以是乙酸、乙醇、丙酸、1-4个碳原子的卤代有机酸，例如FCOOH,ClCOOH,CF3COOH,CF2HCOOH,CFH2COOH,CCl3COOH,CCl2HCOOH,CClH2COOH,等等。尤其乙酸。优选的再稳定剂如上述是甲酸，优选90-100％甲酸，尤其97-99％甲酸。本发明特别优选的实施方案用的是98％甲酸，这是一种明确定义的(well-defined)基础化学物质。
在本发明的方法中，丝纤维经蚕丝溶剂溶解而形成三维制品，在该制品中，有一个区域已有丝纤维溶解、而丝素蛋白因此呈无规卷曲。再稳定溶液(尤其甲酸)然后诱导β-片层(连续相)的形成；丝素蛋白因该β-片层的形成而稳固。其它优选的用结晶剂(尤其甲醇)进行的处理导致水不溶性丝素蛋白流动相的稳定。
本发明一个特别优选实施方案是一种方法，其中蚕丝溶剂CaCl2、乙醇和水的组合，且其中部分解体的蚕丝制品被甲酸重新稳固，且其中所得制品进一步用甲醇处理作为最终的再稳定步骤。所述各步骤的这一组合使产物具有显著改进的力学特性(见例如图3)。
根据本发明优选实施方案，三维蚕丝制品具有可分解的(resolvable)、能从再稳定产物中除去的非-丝材料，优选所述可分解的非-丝材料是聚合物(如聚乙二醇)，多糖/糖(sugars)，盐(salts)，或一般意义上用作可溶性成孔剂(porogen)的任何物质。此材料可以–在本发明制品解体后–被分解，在制品中留出空间(这些空间可用作装载细胞或药用活性物质的容器)，或者提供组织(例如血管，尤其毛细血管)生长的空间。
根据本发明优选实施方案，所述蚕丝制品装配了另外的活性分子。有了这样的活性分子，可以给本发明的蚕丝制品增加有价值的重要特性。例如，具有促进细胞粘附的特性(或阻止细胞粘附的特性)的分子可以添加到蚕丝制品中。优选的三维蚕丝制品还包含促进细胞粘附的物质，优选细胞结合肽，尤其Arg-Gly-Asp(“RGD”)肽；促进细胞粘附的蛋白，尤其SF蛋白，明胶，纤连蛋白或凝集素(lectin)。优选地，三维蚕丝制品还包含修饰的促进细胞粘附的多肽，尤其修饰的RGD肽，SF蛋白，明胶，纤连蛋白或凝集素。一般地，在组织工程化应用中，对促进细胞粘附到生物材料表面的兴趣是很大的。已有多项尝试想用诸如结合细胞的肽序列(包括精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)等生物活性分子、或者诸如明胶或纤连蛋白等生物分子衍生物质来裁剪材料表面，以改善细胞粘附(Rowley等,Biomat.20(1999),45–53；Liu等,J.Biomed.Mat.Res.A 74(2005),84–91)。SF是有超过5000个氨基酸的蛋白(登录号P05790)，主要由甘氨酸和丙氨酸的重复基元构成。不过，SF包含充足的反应性氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸、酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸，对它们进行化学修饰是容易的(Murphy等,J.Mat.Chem.19(2009),6443–6450)。例如，碳二亚胺结合化学法已用于将蚕丝丝素蛋白与骨形态发生蛋白2(BMP-2)偶联来诱导骨形成(Karageorgiou等,J.Biomed.Mat.Res.A 71(2004),528–537)，以及与RGD肽偶联来促进细胞附着(Kardestuncer等,Clin.Orthop.Rel.Res.448(2006),234–239)。其它能用于修饰蚕丝丝素蛋白并改善细胞粘附的分子有凝集素，各种形式的RGD序列，与胶原蛋白、纤连蛋白或其它天然蛋白类似的结合基元。
根据另一方面，本发明还涉及可以由本发明方法获得的三维蚕丝制品。
如已述，这些制品具有改进的力学特性，尤其改进的抗压力或抗瓦解力(collapsing forces)的抗性。这使得本发明的制品特别适于提供导管形式的医学设备，尤其体内移植管，如血管移植物或神经导管，或其它骨架。因此，本发明优选制品有，支架，血管移植物，神经导管，疝网，或用于组织工程化或再生医学应用的任何其它骨架。
在本发明蚕丝制品上进行的部分解体(以及，当然，随后对制品中此解体区进行的再稳定)的程度可以由本发明的方法精确地控制，优选通过蚕丝溶剂的处理时间来控制。例如，处理约20s导致解体深度约50μm，处理40s导致解体约100μm，从蚕丝制品暴露于蚕丝溶剂的表面处起算。蚕丝制品暴露于蚕丝溶剂的表面当然彻底解体。蚕丝制品解体区的深度因此是可调的，例如由该表面暴露于蚕丝溶剂的持续时间来调。本发明蚕丝制品因此具有发生了此种解体的区域和未发生此种解体的区域。这些区域通常在终产物中(即，再稳定后)是被小边界区明确分开的(也可参见那些能看到所述边界区的实例)。尽管本发明的制品常展示至少一个彻底解体的表面(解体区有一定深度)，但也存在未解体区(通常在暴露于解体溶液(即，蚕丝溶剂)的那个表面的对侧)。
优选地，解体深度(终产物中可以看到的丝素蛋白经过再稳定(和结晶)、表现为致密物质(对比于蚕丝制品未解体部分中仍可见到的丝素蛋白纤维；即，丝素蛋白匀相或连续相)的深度)为5μm或更深，以便提供有本发明改进的力学特征和形态学特征(例如弯曲稳定性和/或闭合表面)的蚕丝制品。解体深度为例如约1μm或更浅的制品可显示裂缝或力学特性更弱。根据本发明蚕丝制品的计划用途，解体深度优选20μm以上，更优选50μm以上，尤其100μm以上。在本发明特别优选的实施方案中，蚕丝制品的解体深度达蚕丝制品总厚度的至少10％，意味着至少10％总厚度的蚕丝制品是解体的(从蚕丝制品的暴露表面向内算)。更优选的制品显示至少20％，尤其至少30％的解体。“解体深度”是终产物横切面中可以看到的从表面到再稳定(并结晶)区的末端的距离。“再稳定区的末端”也是未解体区的开端，未解体区中的丝纤维呈原始形状，彼此能清楚分开。“解体深度”实际上是终产物中丝素蛋白匀相(无凹洞或不到5％v/v的凹洞)的直径；其余实际上是终产物中的丝素蛋白长丝相。在连续相和长丝相的边界上，是混合相或区，取决于所用的反应条件、起始材料的厚度和本性。这样的混合区通常有超过5％v/v的空洞、且丝纤维至少部分粘在一起，但常常为非解体结构。
通过本发明方法能获得的二维蚕丝制品也具有新的有利特性，尤其力学特性和形态学特性。特别优选的是片层形式的二维制品，优选用于医学用途，尤其薄片(film)、膜(membrane)、梭织片(woven sheet)或网，用于细胞附着、播散、生长和分化。
另一方面，本发明的方法可用于制备细胞培养材料，如细胞底层(用于培养细胞)，可将细胞接种在该底层上，使其进一步生长或生成细胞组分(如重组蛋白或其它从细胞分泌而出的物质)。
本发明优选的实施方案因此可以如下限定：
1.制备三维蚕丝制品的方法，其中将三维蚕丝制品用蚕丝溶剂处理有限的时间段，使蚕丝制品部分解体，再用物理的β-片层诱导使部分解体的蚕丝制品重新稳固。
2.根据实施方案1的方法，其中所述蚕丝溶剂包含LiBr,LiSCN,1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐，六氟代-2-丙醇(HFIP)，含乙醇和CaCl2的混合物或含甲醇和硝酸钙的混合物；或它们的混合物。
3.根据实施方案1或2的方法，其中LiBr的使用浓度为1-10M，优选3-10M，尤其5-7M。
4.根据实施方案1-3任一项的方法，其中LiSCN的使用浓度为1-17.5M，优选5-15M，尤其8-12M。
5.根据实施方案1-4任一项的方法，其中HFIP用在溶液中，所述溶液含1-100％(v/v)，优选50-100％(v/v)HFIP，尤其90-100％(v/v)HFIP。
6.根据实施方案1-5任一项的方法，其中乙醇用在含水溶液中，所述溶液含1-50％(v/v)乙醇，优选5-40％(v/v)乙醇，尤其10-30％(v/v)乙醇。
7.根据实施方案1-6任一项的方法，其中CaCl2用在蚕丝溶剂中，与乙醇的摩尔比为1:0.3-1:3，优选1:1-1:2.5.，尤其1:1.5-1:2.2。
8.根据实施方案1-7任一项的方法，其中硝酸钙用作蚕丝溶剂中，与甲醇的摩尔比为1:0.3-1:6，优选1:3-1:4.5，尤其1:3.5-1:4.2。
9.根据实施方案1-8任一项的方法，其中所述三维蚕丝制品是梭织物，无纺织物，管纱，编织物或压制品。
10.根据实施方案1-9任一项的方法，其中所述蚕丝制品是蚕丝丝素蛋白制品或天然蚕丝纤维的梭织制品，尤其其中所述蚕丝制品由家蚕蚕茧的纤维制成。
11.根据实施方案1-10任一项的方法，其中所述蚕丝溶剂是CaCl2，乙醇和水的组合，且其中部分解体的蚕丝制品用甲酸再稳定，且所得制品进一步用甲醇处理作为最后的再稳定步骤。
12.根据实施方案1-11任一项的方法，其中所述蚕丝制品由丝素蛋白溶液制得的再造纤维制成，所述丝素蛋白溶液尤其是重组的丝素蛋白溶液。
13.根据实施方案1-12任一项的方法，其中所述蚕丝制品是医学移植物，优选支架，血管移植物，神经导管，(组织)骨架(例如肌腱，支气管，气管等)，或疝网。
14.根据实施方案1-13任一项的方法，其中所述部分解体是用于提供非均质蚕丝制品或/和产生增强的力学特性(例如弹性特性)。
15.根据实施方案1-14任一项的方法，其中所述蚕丝溶剂处理在20-100℃，优选50-78℃，尤其70-77℃的温度进行。
16.根据实施方案1-15任一项的方法，其中所述蚕丝溶剂处理进行1s-2h，优选1s-0.5h，尤其10s-30min。
17.根据实施方案1-16任一项的方法，其中所述部分解体的蚕丝制品用再稳定溶液进行再稳定。
18.根据实施方案17的方法，其中再稳定溶液的处理进行1s-1h，优选5min-1h，尤其20min-30min。
19.根据实施方案17或18的方法，其中所述再稳定溶液是甲酸，优选90-100％甲酸，尤其97-99％甲酸。
20.根据实施方案17-19任一项的方法，其中所述再稳定溶液是乙酸，丙酸，1-4个碳原子的卤代有机酸，优选FCOOH，ClCOOH，CF3COOH，CF2HCOOH，CFH2COOH，CCl3COOH，CCl2HCOOH或CClH2COOH，尤其乙酸，或其混合物。
21.根据实施方案1-20任一项的方法，其中所述部分解体的蚕丝制品通过高压蒸汽灭菌法被再稳定。
22.根据实施方案1-21任一项的方法，其中所述部分解体的蚕丝制品通过水冷退火被再稳定。
23.根据实施方案1-22任一项的方法，其中所述三维蚕丝制品还包含促进肽(例如用转谷氨酰胺酶底物序列修饰)或细胞粘附的物质，优选结合细胞的肽，尤其Arg-Gly-Asp(“RGD”)肽；促进细胞粘附的c蛋白，尤其SF蛋白，明胶，纤连蛋白或凝集素。
24.根据实施方案1-23任一项的方法，其中所述三维蚕丝制品还包含修饰的、促进细胞粘附的多肽，尤其修饰的RGD肽，SF蛋白，明胶，纤连蛋白或凝集素。
25.三维蚕丝制品，能通过实施方案1-24任一项的方法获得。
26.根据实施方案25的三维蚕丝制品，其中所述制品是支架，血管移植物，神经导管，(组织)骨架(例如肌腱，支气管，气管等)，或疝网。
27.三维蚕丝制品，包含连续的(均匀的，晶态)丝区(silk region)和具有丝纤维的丝区。
28.根据实施方案27的三维蚕丝制品，能通过实施方案1-24任一项的方法获得。
29.根据实施方案25-28任一项的三维蚕丝制品，包含晶态丝区和具有丝纤维的丝区，其中所述晶态丝区延展至少5μm，优选至少20μm，更优选至少50μm，尤其至少100μm，从蚕丝制品表面起算。
30.根据实施方案25-29任一项的三维蚕丝制品，其中所述蚕丝制品额外进行了机械处理。
31.根据实施方案30的三维蚕丝制品，其中所述机械处理是压花(embossing)步骤。
32.根据实施方案25-31任一项的三维蚕丝制品，包含晶态丝区和具有丝纤维的丝区，其中所述晶态丝区从蚕丝制品表面开始延展蚕丝制品总厚度的至少10％，优选至少20％，尤其至少30％。
33.根据实施方案25-32任一项的三维蚕丝制品，其中该三维蚕丝制品还具有可分解的、能从再稳定产物中除去的非-丝材料，优选所述可分解的非-丝材料是聚合物(如聚乙二醇)，多糖/糖，盐，或一般用作可溶性成孔剂的任何物质。
本发明还通过以下实施例和附图来举例说明，但不限于此。
附图说明
图1显示编辫的管状结构的编辫设计(左图)和扫描电镜照片(右图)。
图2显示蚕丝丝素蛋白神经导管(SF-NGC)的显微照片，A)SF-NGC横截面视图的SEM显微照片(放大23x)；B)图A的部分放大(放大200x)；C)SF-NGC的侧视图(放大50x)；D)SF-NGC壁内表面上SC细胞的荧光显微照片。
图3显示一个定制测试系统的加压测试结果，用以验证对脱胶的管状结构进行改良后改进的弹性。对经四种不同处理的初始生丝架进行了机械测试：仅与甲醇(MeOH)一起保温；随后与甲酸和甲醇(FA–MeOH)一起保温；随后与CaCl2/H2O/乙醇和甲醇(CaCl2/H2O/EtOH-MeOH)一起保温；随后与CaCl2/H2O/乙醇、甲酸、和甲醇(CaCl2/H2O/EtOH–FA–MeOH)一起保温。
图4显示MTT试验对细胞毒活性的测定。NIH/3T3成纤维细胞在分别有未经加工的生丝骨架材料(raw scaffold material)和制得的SF-NGC的滤出培养基(leach-out medium)中培养。用标准培养基作为对照组。所有数据都是8个独立试验的均值±SEM。
图5显示细胞通透性测试结果，是用含有NIH/3T3成纤维细胞的纤维蛋白凝块和加载了PDGF-AA作为趋化剂的第二凝块进行迁移试验。成纤维细胞穿过不同空间，包括孔径100μm的细胞滤网(阳性对照，第1排)和未经处理的管状丝结构(第2排)，但不穿过所用的SF-NGC。A、B、C栏分别代表初始含细胞的纤维蛋白凝块，所用间隔物的另一侧和含PDGF-AA的初始纤维蛋白凝块。所有样品用钙黄绿素AM染色法染残余细胞或入侵细胞。
图6显示，A)蚕丝丝素蛋白神经导管(SF-NGC)体内移植到大鼠坐骨神经损伤模型中。B)移植后1周观察到的SF-NGC近端侧。黑箭头表示新形成的纤维状组织薄层覆盖SF-NGC末端。C)移植后1周观察到的外周神经手术区域，显示薄层纤维状组织中有小血管。D)是C图中黑色长方块的放大视图。
图7显示移植后12周时，轴突(axon)穿SF-NGC而生长的例子。轴突用神经丝200kDa免疫染色法染色。星号和箭头分别表示再生轴突的致密网和疏松网。
图8显示各动物在移植后12周时运动(locomotor)功能恢复的定量分析，包括接受手术的右后足的足印面积(print area)、最大触地面积时施压的强度(intensity exerted at maximum floor contact area)、姿势保持时间(stance duration)以及占空比(duty cycle)。右后足的强度表示为对侧左后足的百分比。所有数据都是6个动物的均值±SD。
图9显示移植了SF-NGC，充满胶原的SF-NGC(SF-NGC Col)和自体移植物的所有动物的BBB运动等级量表。所有数据都是6个动物的均值±SD。
图10显示A)峰值动作电位振幅(peak action potential amplitude,PAPA)的电生理测量，B)复合神经动作电位面积(compound nerve action potential,CNAP)，以及C)神经传导速率(nerve conduction velocity,NCV)。所有参数都是在超最大刺激时测定的。所有数据都是6个动物的均值±SD。*表示p<0.05的显著性差异。
图11显示本发明三维蚕丝制品的照片，该制品已如上述经历了10或20秒的CaCl2/EtOH/H2O处理，接着10或20秒的甲酸处理。图11A和1C显示未处理的蚕丝丝素蛋白制品；图11B和11D显示经20秒的CaCl2/EtOH/H2O处理、接着20秒的甲酸处理后的制品。图11E-11G显示20秒处理的情形中解体(之后再稳固)深度的测量值(55.902,73.397和73.662μm)；图11H和11I显示10秒处理的情形中解体(之后再稳固)深度的测量值(17.804和27.57μm)。
图12显示，左图：扫描电镜检查(Scanning electron microscopy,SEM)照片显示编辫的未经处理的丝架(作为对照)。中图：SEM照片显示经CaCl2/EtOH/H2O处理(20sec CaCl2)或经甲酸处理(20sec FA)的蚕丝制品的表面，处理持续时间为20sec或40sec(40sec CaCl2；40sec FA)。右图：SEM照片显示经CaCl2/EtOH/H2O和甲酸处理的本发明蚕丝制品的表面，每步处理的持续时间为20sec(20sec CaCl2/20sec FA)。比例尺分别为100μm和10μm。
图13显示将原生丝纤维和未脱胶丝纤维粘在一起，得到未破坏且未解体的结构(13A(US 8 202 379 B1)、13B(Haverhals等,2010)、13C(Ghanaati等,2010)。
具体实施方式
实施例：
材料和方法
除非特指，所有试剂都得自Sigma(维也纳，奥地利)且为分析级。
设计并制备蚕丝导管
白色家蚕蚕丝(20/22den,250T/m)购自Testex AG(苏黎世，瑞士)。该蚕丝导管具有管状造型，是与一个商业纺织公司(Edelrid GmbH,德国)合作制造。六根单丝绞成纱线(yarn)，代表了商业编织机的原材料。所述管状结构是由六个相互缠绕扭结的丝线形成的，见图1的示例。所得的生丝导管在0.2M硼酸的0.05M硼酸钠缓冲液pH＝9.0中煮沸(Jiang等,Mat.Lett.60(2006),919-925)以脱胶。故，将2g生丝导管两次在500mL脱胶液中煮沸45min。脱胶后，丝架在ddH2O中充分洗净，风干，以备进一步加工。
经过脱胶的SF管纱置于ABS(丙烯腈-丁二烯-苯乙烯)杆上，在三元溶剂氯化钙/蒸馏水/乙醇(CaCl2/H2O/乙醇，摩尔比1:8:2)组成的煮沸液中浸泡20秒。待表面浸蚀后，马上将管纱在100％甲酸(FA)中室温浸泡20秒。然后将管纱再在甲醇中再浸没20分钟，随后用ddH2O彻底清洗。将这些管纱在层流气流下干燥，高压蒸汽灭菌，备用。
耐力(Endurance)和疲劳(fatigue)测试
为测试SF-NGC与未处理的初始管状SF-骨架相比的弹性，定制了一台加压测试仪。此设备被设计为以恒定最大压力对测试标本反复施压。活塞由随动发动机(Modelcraft RS2 MG/BB standard servo,Conrad Electronic SE,Hirschau,德国)驱动，以接近5mm/s的速度，从顶部位置向下直线移动，直到它触碰到探头(probe)。活塞持续压迫探头直至达到预设的力度阈值。活塞中整合有压力感应电阻(Strain gauge FSR 151,Interlink electronics,Camarillo,CA,USA)，起感应器的作用，是分压器(voltage divider)的组成部分。用微型控制器(ArduinoDuemilanove Controller Board with Atmega 328μC,AtmelMunich GmbH,Garching/Munich,德国)内置的10bit ADC，以50Hz的采样频率，对电阻、因此还有施加的压力不断采样。此系统用实验室标度(scale)校准，操作精度在±5g以内。活塞一旦达到阈值就返回顶部位置，并在顶部停留一段时间，该时间由用户设定。此过程按用户在串联LCD显示器(SerLCD SFE 09395 2 line LCD Display,Sparkfun electronics,Boulder,USA)上设定的反复次数而不断反复。
测试前，各份样品在PBS中水化过夜(o/n)。为进行测试，导管在Petri皿中固定，用PBS覆盖。力学测试方案是，进行1000个加压和释压周期，所加压力为300g，每次加压持续300ms。测试过程后，将所测试的管纱室温过夜以便风干，在施压部位小心地切出接近1mm厚的切片进行形态学分析。最后，施压后残余的变形能力用SEM分析来评估。
SEM分析
样品在2.5％戊二醛的次甲砷酸缓冲液中室温过夜进行固定。然后样品由分级乙醇和接下来的六甲基二硅氮(disilazane)脱水，再在通风橱中风干。样品用Polaron SC7620喷涂仪(Quorum Technologies Ltd.East Grinstead,英国)喷涂Pd-Au，用JEOL JSM-6510扫描电镜(JEOL GmbH,Eching/Munich,Germany)以3kV进行检查。
细胞培养实验
NIH/3T3
NIH/3T3细胞系购自ECACC(欧洲细胞培养物保藏中心,UK)。在包被有0.2％明胶溶液的平板中，将NIH/3T3细胞培养在含10％胎牛血清(FCS)的DMEM(Lonza Ltd.,巴塞尔，瑞士)中，该培养基补加了2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
许旺样细胞(Schwann-like cells)
脂肪衍生的基质细胞(Adipose-derived stroma cells,ASC)从Sprague-Dawley大鼠分离，并分化为许旺细胞样表型(Kingham等,Exp.Neurol.207(2007),267-274)。简言之，将解剖出的内脏脂肪切碎，用I型胶原蛋白酶处理，分离出ASC。细胞在作为生长培养基、含10％胎牛血清(FCS；PAA,Pasching,奥地利)的改良型Eagle培养基(α-MEM)中培养和传代后，ASC先与含1mMβ-巯基乙醇的生长培养基一起保温24h。然后，将培养基换成补加了35ng/mL全反式视黄酸的新鲜培养基，再培养2h。最后，添加分化培养基，其包含血小板衍生的生长因子(PDF；Peprotech,维也纳，奥地利)、10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；Peprotech,维也纳，奥地利)、14μM毛喉素和252ng/mL神经胶质生长因子2(GGF-2；Peprotech,维也纳，奥地利)。
许旺样细胞(Schwann-like cells,SLCs)以105个细胞/mL的浓度接种在SF-NGC内壁。2小时后，给细胞供应含10％FCS(PAA,Pasching,奥地利)、0.1％heregulin(Preprotech,维也纳，奥地利)和14μM毛喉素的培养基。3天后，SLC附着至SF-NGC内壁结构的情况用钙黄绿素AM染色(Invitrogen,维也纳，奥地利)评估。
细胞通透性
设计一个细胞迁移试验来验证SF-NGC的细胞不通透性。用100μl含PDGF-AA(Peprotech,维也纳，奥地利)的纤维蛋白凝块(Tisseel,Baxter,维也纳，奥地利)诱导细胞迁移。10ng PDGF-AA在纤维蛋白原中彻底混合后，将该混聚物与250个单位/mL的凝血酶一起保温。得到的紧密纤维蛋白结构避免了PDGF-AA的爆发释放。再将此纤维蛋白凝块置于所研究的管纱内侧，将如此装配的结构物钉入包被了硅酮的(184,Dow Corning EuropeS.A.,Seneffe,Belgium)12-孔平板中。另一份100μl的纤维蛋白凝块含2.5x105NIH/3T3成纤维细胞，将其放置在所述管纱顶部。.纤维蛋白原用2个单位/mL凝血酶聚合，以生成松散的均匀纤维蛋白结构，并允许成纤维细胞从该凝块相趋化刺激物迁移。作为阳性对照，从含有PDGF-AA的凝块用100μm孔径的细胞滤器的尼龙网(Becton Dickinson,Schwechat,奥地利)分离出含有细胞的纤维蛋白凝块。添加培养基，直至构建物被彻底覆盖，将这些实验物混合2天和4天后，更换培养基。第6天评估细胞迁移，方法是将含有PDGF-AA的纤维蛋白凝块用钙黄绿素AM(Invitrogen,维也纳，奥地利)染色。除了将所述结构物固定到Petri皿上的可能性以外，184已知因其疏水特性而能阻止细胞粘附(Ai等,Cell BiochemBiophys.38(2003),103-114)，从而避免细胞从一个凝块越过细胞培养板的表面向另一凝块迁移的可能性。结果，从一个凝块向另一凝块移动的唯一途径是穿过SF-NGC，因此必须要求SF-NGC有一定的细胞通透性。
细胞毒作用分析
为测试作制得的SF-NGC的细胞毒作用，将1g SF-NGC切割材料在5mL细胞培养基中浸没至少24h。与此平行地，在24孔板上每孔接种0.2x105NIH/3T3成纤维细胞。含有从切割材料滤出的产物的培养基然后过滤(0.22μm,Rotilabo,Karlsruhe,德国)，用于更换细胞培养中的培养基。用标准的细胞培养基作为阴性对照。将细胞培养基吸出，每孔分别添加含650mg/mLMTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑]溴化物的细胞培养基。在37℃和5％CO2中保温1h后，吸出培养基，将MTT甲臜(formazan)沉淀物避光机械振荡20min，使之溶于DMSO。将每份样品的100μl等份转移到96孔板。马上在自动微滴板读数仪(Spectra Thermo,TECAN Austria GmbH,奥地利)上读取540nm处的吸光度。针对非特异性本底，校准光密度(OD)值。
动物和10mm神经缺损模型
所有动物在Ludwig Boltzmann Institute的实验和临床外伤学部饲养，环境温度可控。随意供应食物和水。所有实验方案得到奥地利维也纳市政府批准，符合国家卫生院(National Institute of Health)制定的实验动物保护和使用指南的规定。
一共有22只体重介于350–450g的雌性Sprague-Dawley大鼠(AnimalResearch Laboratories,Himberg,奥地利)用于这些实验。18只大鼠随机分配到三个不同处理组：自体移植(n＝6)、SF-NGC(n＝6)和填充胶原的SF-NGC(n＝6)，观察12周。给动物称重后，在熏箱中以800mL/min流速给予3.5％异氟烷(Abbott,维也纳，奥地利)进行麻醉。后续在整个手术过程中的麻醉用喷嘴喷2.5％异氟烷来维持。在右后腿手术部位刮毛，用β-Isodona(Mundipharma,维也纳，奥地利)清洁。所有后续手术过程在手术显微镜(LeicaM651,Leica GmbH,维也纳，奥地利)下进行。切开皮肤和肌肉，暴露坐骨神经。取出一段8mm的坐骨神经，远端和近端残端都略微收缩，结果形成10mm的缺口。在自体移植组，切出8mm的坐骨神经，翻转180°，再用Ethilon8/0(Ethicon-Johnson&Johnson,布鲁塞尔，比利时)穿过神经外膜而缝回近端和远端残端。在两个SF-NGC组，神经导管的移植是，将近端和远端神经残端插入12mm管纱中，通过两个神经弓突缝合接到丝架上。其中一组的SF-NGC内腔另外填充大鼠尾部来源的I型胶原(Millipore,维也纳，奥地利)。之后，通过连续走针(Vicryl 4/0,Ethicon-Johnson&Johnson,布鲁塞尔，比利时)缝合肌肉层，通过可吸收型单线(Vicryl 4/0,Ethicon-Johnson&Johnson,布鲁塞尔，比利时)将皮肤闭合。之后，将大鼠都放回笼中，待其恢复。在即将手术之前，以及在手术的2天后，用0.75mg/kg BW美洛昔康(Meloxicam)(BoehringerIngelheim,Ingelheim/Rhein,Germany)和1.25mg/kgBW布托菲诺(butorphanol)(Richter Pharma AG,Wels,奥地利)进行止痛处理。
为获得有关SF-NGC行为和来自周围组织的反应的体内原始信息，按上述手术程序进行了1周和三周(2只动物/时点)的短移植时点研究。
组织取样，灌注，以及免疫组化
分别在术后1、3或12周时，给动物吸入3.5％异氟烷进行深度麻醉，腹膜内施用110mg/kg BW盐酸氯胺酮(Dr.E.Graeub AG,伯尔尼,瑞士)和12mg/kg BW赛拉嗪(2％,Bayer AG,维也纳，奥地利)进行安乐死。经升主动脉灌注4％低聚甲醛(paraformaldehyde)的0.1M磷酸缓冲液，pH 7.4。接着在手术显微镜下，沿着近端和远端神经残端收获自体移植物或移植的SF-NGC。
用小鼠第一抗体：抗-神经丝200kD(Abcam Ltd.,Cambridge,UK)进行免疫组化染色，来指示轴突再生(Huang等,Biomat.33(2011),59-71；Huang等,Eur.J.Neurosci.23(2006),273-278)。
行为测试-步态(Gait)分析(CATWALKTM)
为验证实验动物的功能恢复进展，用到了Catwalk(Noldus,Wageningen,Netherlands)足印分析系统。此方法允许客观量化多个静态和动态的步态参数(Deumens等,J.Neurosci.Meth.163(2007),120-130；Bozkurt等,J.Neurosci.Meth.173(2008),91-98)。动物们在术前3周时接受预备训练。在该过程之后，所有组都每周对动物测试一次，直至12周。每一轮期间，在玻璃板底下安置摄像机，捕捉真实的足印。用该分析法可以检测每一个足迹的位置、动力学(dynamics)、和压力的差异。测定了运动功能恢复的各种参数，包括足印面积、行走期间该兽足的总触地面积、最大强度、该兽足与玻璃地板最大接触那一刻的施压、姿势保持时间、该兽足与玻璃地板接触的时间、以及占空比，姿势保持时间的间隔(division)以及姿势保持时间加上该兽足不与玻璃地板接触的时间的总和。右后足的强度表示为对侧左后足的百分比。该Catwalk实验以盲试的形式进行。
BBB测试
Basso,Beattie and Bresnahan(BBB)测试最初是设计用于评估大鼠脊髓挫伤后的运动功能恢复情况。分值范围从彻底麻痹(0)直至正常运动(21)。这里用BBB分值作为外周神经恢复的评估参数，如前人所述(Schmidhammer等,ActaNeurochir.100(2007),Supplement 161-167)，由三名对动物身份“一无所知”的有经验的评论员进行。
电生理学和组织学：
移植后12周，如前述(Schmidhammer等,J.Trauma 56(2004),571-584)进行电生理分析(NeuroMax；XLTEK,Oakville,Ontario,加拿大)，包括峰值动作电位振幅，复合动作电位面积(CNAP)和神经传导速率。
统计分析
统计分析用统计软件Graph Pad Prism(Graph Pad Software Inc.,SanDiego,CA,USA)进行。数据的正态分布用Kolmogorov-Smirnov test来检验。功能恢复的数据经Catwalk步态分析和BBB评分获得，MTT和电生理数据用单向ANOVA来分析。本研究中的所有图都显示的是均值±标准差(SD)。
结果
丝管(silk conduits)的制备和局部解剖学(topography)
如图1所示，未加工的(raw)SF-NGC由单丝纤维编辫而成。表面脱胶后，所述SF-NGC用CaCl2/H2O/乙醇和FA各浸蚀20秒，用甲醇固定其结构。从局部解剖学来看，这些处理导致外部单丝纤维融合成闭合层，厚度范围约25-75μm(图2A,B)。与外壁单丝纤维看上去融合而形成光滑层(图2C)相反，朝向内腔的壁侧仍显示为单丝纤维的编辫结构。图2D显示，这些内部单丝纤维作为SC细胞的良好底层，因它们的编辫设计而引起细胞定向排列。
耐力测试
为验证所述SF-NGC抵抗来自周围组织的外部压力(可以负面地导致管状结构瓦解)所需的弹性(elasticity)，用定制系统进行机械耐力测试。给丝架加压1,000轮，每轮300g，压力持续时间300ms。在所有处理中，所述SF-NGC在最终步骤中与甲醇一起保温，以便固定所述丝架的改良结构。未处理的或FA-处理的SF-NGC在加压后显示严重瓦解(图3)。CaCl2/H2O/乙醇处理提高了SF-NGC的机械耐力，导致保留某些腔，但仍有实质性的变形。这三种处理无一能为SF-NGC提供弹性特征来抵抗外部压力。但是，用CaCl2/H2O/乙醇处理、接着FA用处理的SF-NGC能在测试后保留它们的圆形形状。
细胞毒试验
用MTT试验来研究：所生成的SF-NGC中源于制备过程、可能有细胞毒活性的残余物的量。从SF-NGC切下的材料和未处理的生丝架用细胞培养基滤出(leached out)。将这些滤出培养基作为培养基使用24h。根据MTT试验结果(图4)，未经处理的标准细胞培养基、生丝架或SF-NGC材料的滤出培养基之间，并未发现NIH/3T3成纤维细胞在细胞活力方面有显著差异，表明制得的SF-NGC无细胞毒作用。
细胞通透性
设计了细胞迁移试验来验证所述SF-NGC的细胞非通透性，是基于PDGF-AA对成纤维细胞的趋化特性，诱导细胞从携带细胞的纤维蛋白凝块迁移至含有PDGF-AA的另一纤维蛋白凝块。为了侵入含有PDGF-AA的纤维蛋白凝块，NIH/3T3成纤维细胞必须穿过孔径100μm细胞滤网(阳性对照组)、未处理的管状生丝架、或SF-NGC。PDGF-AA刺激5天，观察到明显的成纤维细胞迁移穿过了细胞滤网(图5，第1排)和生丝架(图5，第2排)，但未穿过SF-NGC(图5，第3排)。
初步体内结果
用初步体内研究评估移植的SF-NGC的组织生物相容性。图6A显示近端和远端神经残端通过两个神经弓突缝合而接到SF-NGC上。移植后1周，目测发现，所述SF-NGC未表现出实质性降解(图6B)。而且，在接合部位未检测到炎症反应或神经瘤形成的征兆。整个移植物表面覆盖薄层纤维状组织。有趣的是，移植的SF-NGC的近端以及远端都被纤维状组织盖住，导致肉眼可看到丝架材料和神经残端之间有一个界面(图6B)。此外，该薄层纤维状组织显示了小血管(图6C,D)。
轴突再生
本结果表明，大鼠坐骨神经中8mm的小缺口可以通过将SF-NGC植入缺损部位而接起来。图5用神经丝200染色表明，再生的轴突遍布SF-NGC移植腔。从近端到远端，轴突的再生过程清晰可见(图5，用*表示)，约6.5mm后渐减。尽管轴突密度有此减弱，仍能看到一大束再生轴突，移植后12周直达远端。在内腔填充胶原不影响轴突再生。
功能恢复–Catwalk
移植后12周时，接受手术的右后足的平均足印面积在自体组和填充了胶原的SF-NGC组之间是相当的(comparable)。无胶原的SF-NGC组的平均足印面积小于自体组和填充了胶原的SF-NGC组两者，但差异不显著。右后足平均施压强度在两个SF-NGC组之间结果类似，但与自体对照相比无显著减弱。填充了胶原的SF-NGC组相比于纯SF-NGC组，右后足平均姿势保持时间指示功能恢复方面的进步，但不具有统计学显著性。与平均强度相似，右后足的平均占空比在填充胶原的SF-NGC组合SF-NGC足迹无差别，但它们各自的均值都低于自体组的。
表1.各动物在移植后12周时运动功能恢复的定量分析，包括右后足的足印面积、最大触地面积时施压的强度、姿势保持时间以及占空比。右后足的强度表示为对侧左后足的百分比。所有数据都是6个动物的均值±SD。
BBB恢复情况评分
BBB评分在移植后4,6,8,10和12周时测定。图8例示了手术介入后4-12周期间的神经功能恢复情况。在第一次术后评估(4周)中，移植了有或无胶原的SF-NGC的动物抬起前肢期间的脚趾开叉(toe clearance)频率大于用自体移植物处理的动物。移植后8周时，纯SF-NGC组平均BBB分值显著高于自体组和填充了胶原的SF-NGC组。在末次术后评估时点(12周)时，用自体移植物移植的动物的BBB分值低于用有或无胶原的SF-NGC移植的动物。在12周时，作为管道填充胶原的结果而接受SF-NGC结构物的动物未检测到BBB分值的提高。
电生理学
移植后12周，用电生理研究测定三个不同参数：峰值动作电位振幅(PAPA)、复合神经动作电位面积(CNAP)和神经传导速率(NCV)。结果总结在表2中并图示于图9中。SF-NGC、填充了的SF-NGC和自体对照之间，未检测到PAPA和CNAP的显著差异。相反，自体组的NCV值明显高于有或无胶原的SF-NGC组两者。
表2.峰值动作电位振幅,复合神经动作电位面积和神经传导速率的电生理测量。所有参数都是在超最大刺激时测定的。所有数据都是6个动物的均值±SD。
处理持续时间和解体深度
解体深度可以通过控制处理持续时间而很容易地控制并管理。本发明的三维蚕丝制品接受10或20秒的CaCl2/EtOH/H2O处理、接着10或20秒的甲酸处理，如上述。结果示于图11：图11A和1C显示未处理的蚕丝丝素蛋白制品；图11B和11D显示经20秒的CaCl2/EtOH/H2O处理、接着20秒的甲酸处理后的制品。图11E-11G显示20秒处理的情形中解体(之后再稳固)深度的测量值(55.902,73.397和73.662μm)；图11H和11I显示10秒处理的情形中解体(之后再稳固)深度的测量值(17.804和27.57μm)
讨论
在本研究中，用编了辫子的管状结构的蚕丝丝素蛋白(SF)纤维作为产生神经导管(NGC)的起始材料。通过对纺织工程化管状SF结构的后续化学处理，生成了一种具有局部解剖学非均质特性和力学特性的导管，所述特性有利于该导管作为NGC的用途。
这种SF管的弹性和抗扭性因用三元溶剂CaCl2/H2O/乙醇(1:2:8摩尔比)、FA(作为本发明的再稳定剂)和甲醇进行化学处理而增强(图2)。CaCl2/H2O/乙醇溶解天然SF纤维，甲醇通过形成β-片层而诱导结晶。在此上下文中，FA被描述为，在溶液态中通过消除溶解性FA而诱导了能导致β-片层构象的有序结构/分子排列。FA的这种独特性质被用于产生神经导管壁的晶样外层(图2)。此外，通过改变保温时间和用于制备的试剂，可以控制外部晶层的厚度。这种制备方法导致SF骨架能用于各种组织工程化(TE)和再生医学方法，如强化血管形成或创伤敷料。
多亏了CaCl2/H2O/乙醇处理，才使得SF-NGC的弹性和抗扭性大大增加。用定制的测试体系进行的耐力测试表明(图1)，这些改进的力学特性允许SF-NGC抵抗来自周围组织的外部压力(图3)。
移植前，用制得的SF-NGC进行了生物相容性试验。为测试体外细胞毒性，用到了常见的MTT试验(图4)，表明所述材料不释放任何对细胞活力有负面影响的物质。还评估了SF-NGC内侧作为SLC的细胞底层的用途(图2D)。一般将许旺(Schwann)细胞视为外周神经再生中最重要的因素，因为它们能启动穿过神经通道的增生，允许轴突出芽并随后延长。因此，对外周神经TE的盛行想法是用许旺细胞或SLC测试潜在的外周神经再生生物材料。在本施例中，从脂肪衍生的干细胞分化的SLC，在所研究的SF-NGC材料上相比于组织培养聚苯乙烯上，有良好的接种(seeding)和附着能力。
而且，所述体外测试包括细胞通透性分析。用迁移试验评估了细胞从SF-NGC外侧到内腔的侵入。已证实，成纤维细胞能横穿孔径为100μm的细胞滤器的网格以及未处理的原生丝架，但不能横穿打算用于移植的SF-NGC。这是一个关键的发现，因为在体内，来自周围组织的细胞，尤其成纤维细胞，应该不能迁移到两个神经残端之间的缺口中。正在侵入的细胞然后将形成能在空间上阻碍神经生长的纤维状组织。
有趣的是，除了作为SF溶解剂和结晶剂，FA可用于改变体内的血管形成。已证实，通过改变FA处理时间，可以控制基于SF的三维无纺微网络的体内血管形成。在对SF-NGC的体内生物相容性的本初步研究中，除了没有炎症的严重症状以外，还记录到了含有小血管的薄层纤维状组织(图6C,D)。这些发现表明有微血管生长到SF-NGC中，可能是被再生神经释放的生长因子触发，并且是作为再生神经的营养供应。这种进入SF-NGC的微血管生长可以通过制备期间的FA处理来影响。形成纤维状组织层的另一个有趣方面是，它盖住了移植物的末端，在神经残端和移植的SF-NGC之间形成渐变的界面。这种渐变的界面可以阻止移植的SF-NGC滑动，如果滑动将导致进一步的神经损伤，包括神经瘤形成。
SF-NGC移植后12周时再生的神经组织的纵向剖面显示，10mm的坐骨神经缺失由再生轴突完全接上了(图7)。但要注意，成束的轴突在整个缺失尺寸的头65％中密集得多。轴突的再生能力可以受限，它们可以需要其它神经生长刺激因子如神经营养因子，一种填充内腔的胞外基质或SLC。
这里的实例还显示了对SF-NGC的体外和体内评估。为了进行体内测试，包括了一个在所述导管内腔填充了胶原的组。内腔填充物的应用在人工神经导管领域有急迫的兴趣，尤其当面临较长的、所谓关键尺寸的缺口时。除了在文献中评价胶原对神经再生有辅助作用，还发现胶原对外周神经再生有益。而且，胶原被认为是将生长因子和细胞运送到神经缺失部位的载体基质。虽然如此，在这里的实例中，无论是在组织学分析中、还是在运动功能恢复中，胶原作为内腔填充物并未观察到任何有益效果。电生理测量甚至指示，填充了胶原的SF-NGC组与自体对照组相比，神经传导速率显著减小(图9C)。
用于评估功能恢复的行走轨迹分析(Catwalk)并未显示，移植后12周时，SF-NGC、填充了胶原的SF-NGC和自体对照之间有任何差异。Catwalk结果与最近一项研究是一致的，在那项研究中，导管也是由家蚕丝装配而成、但含有内腔纤维状填充物另一种基于丝的生物材料。
除了行走轨迹分析，还用BBB评分方法评估了运动功能恢复情况。BBB评分方法最初是用于脊髓损伤模型中评估功能恢复和运动，但它也适于在神经缺损模型中评估功能恢复。BBB评分被认为对检测残留缺陷比传统上使用的坐骨神经功能指数(sciatic functional index,SFI)更敏感。在这里的实例中，神经缺口被SF-NGC和填充了胶原的SF-NGC桥接，导致在BBB运动评分上比自体对照组显著更优秀的功能恢复。
此外，本发明制品的参数，尤其解体(接着再稳定)的深度，可以很容易且可再现地控制(图11A-I)。
结论
肢体的开放性创伤中外周神经损伤的发生率接近5％。此外，肿瘤切除术或先天畸形也导致神经损伤。结果，这些发生率引起数额庞大的健康护理花费，广泛的不在岗和慢性残疾。这说明对这些损伤进行精确临床护理的重要性，因为它们有非常大的流行病学影响。直接修复神经是创伤治疗的其中一个临床选项。但这种直接接骨术以及端对端的缝合仅限于短距离的空缺缺口。目前修复较长缺口的临床金标准是自体神经移植。自体移植物的主要优势是它们形态学上的天然结构，这是从近端到远端神经残端的轴突再生的物理指导。但自体移植有几项缺点，如供体上移植物采集部位的限制或相关的供体部位发病率包括失去神经功能、有痛感的神经瘤形成和感觉过敏(hyperesthesia)。
这些方面显示，现有金标准不是神经修复的最佳方法，因此相比于自体移植的其他替代方法得到广泛研究。除了用神经组织桥接缺口，其它自体材料如静脉移植物或肌肉也有测试。但过去几年的临床前结果和临床结果仍不令人满意。
组织工程化(TE)方法在外周神经修复方面开放了新的机会。结果是，有人正研究用含合成或天然聚合物的人工神经导管(NGCs)桥接神经缺口。NGC的基本原理是使神经残端生出导管、介入缺口，以确保神经组织新生的环境受到保护。
有多种合成和天然的生物材料在接受桥接神经缺陷的临床前和临床评估，但它们在治疗方面的溢出仍难令人满意。
在过去几年中，蚕丝丝素蛋白作为外周神经再生的合适生物材料引起了兴趣。在多项研究中，发现SF的多个有利于其作为NGC来用的潜在特性，如力学稳定性、缓慢的降解速率、神经-生物相容性及其对神经再生的支持，都打了折扣。除了维持生物相容性，NGC应完成一系列其它任务，包括阻止成纤维细胞浸润或抵抗周围组织带来的压力。已有文献描述了多种从SF制备导管的方法。在TE中生成基于SF的导管的目标不限于神经再生领域，关注血管TE的研究小组也对它有研究。大多数这类血管TE和神经TE方法用电纺丝生成管状结构，因为它的高度可控性。其它技术包括浸渍、胶离心或模塑。所有前述制备方法都基于从水溶液或有机溶剂加工而来的SF。有了本发明，纺织工程化生丝结构被用作桥接神经缺损的原料。
在本文实例中显示，本发明方法适于生成SF的NGC，其具有不同的力学特性和非均质、局部解剖学特性，本发明在大鼠坐骨神经损伤模型中证实了它的体外和体内生物相容性和功能。在本文实施例中，神经导管(NGC)用生丝纺织工程化SF管状结构作为原料制成，随后用CaCl2/H2O/乙醇、FA和甲醇处理。这些处理导致管壁表面发生形态学改变，形成融合丝纤维层。该非均质特性的结果是，SF-NGC的弹性戏剧性地改善，阻止了细胞侵入SF-NGC内腔。体外细胞培养试验以及大鼠坐骨神经损伤模型中的初步体内评估显示了有希望的结果，表明按本发明制得的SF-NGC以几乎与自体移植(目前临床用于桥接神经缺陷的“金标准”)相当的形式支持神经再生。此外，用胶原作为SF-NGC的内腔填充物与空导管相比并没有占优势的结果。本发明的SF-NGC，尤其添加了含神经营养性生长因子和辅助细胞如SLC的内腔填充物后，代表了治疗较大神经缺失方面的替代治疗方法，与自体神经移植无关。

Claims (27)

1.制备三维蚕丝制品的方法，其中，将三维蚕丝制品用蚕丝溶剂处理，所用的处理时间足以使得该蚕丝制品部分解体，然后通过再稳定溶液处理，而用物理的β-片层诱导使所述部分解体的蚕丝制品重新稳定，其中所述再稳定溶液是甲酸。
2.权利要求1的方法，其中所述再稳定溶液是90-100％的甲酸。
3.权利要求2的方法，其中所述再稳定溶液是97-99％的甲酸。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述蚕丝溶剂包含LiBr、LiSCN、1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐、六氟代-2-丙醇、含乙醇和CaCl2的混合物或含甲醇和硝酸钙的混合物；或它们的混合物。
5.权利要求4的方法，其中乙醇用的是含有1-50％体积比的乙醇的水溶液。
6.权利要求5的方法，其中乙醇用的是含有5-40％体积比的乙醇的水溶液。
7.权利要求5的方法，其中乙醇用的是含有10-30％体积比的乙醇的水溶液。
8.权利要求1-3任一项的方法，其中所述三维蚕丝制品是梭织物、无纺织物、管纱、编织物或压制品。
9.权利要求1-3任一项的方法，其中所述蚕丝制品是蚕丝丝素蛋白制品或天然蚕丝纤维的梭织制品。
10.权利要求1-3任一项的方法，其中所述蚕丝制品由家蚕蚕茧的纤维制成。
11.权利要求1-3任一项的方法，其中所述蚕丝制品由丝素蛋白溶液制得的再造纤维制成。
12.权利要求11的方法，其中所述丝素蛋白溶液是重组的丝素蛋白溶液。
13.权利要求1-3任一项的方法，其中所述蚕丝制品是医学植入物。
14.权利要求13的方法，其中所述医学植入物是支架，血管移植物，神经导管，或组织骨架。
15.权利要求13的方法，其中所述医学植入物是肌腱，支气管或气管，或疝网。
16.权利要求1-3任一项的方法，其中所述部分解体是用于提供非均质蚕丝制品或/和产生增强的力学特性。
17.权利要求1-3任一项的方法，其中所述蚕丝溶剂处理在20-100℃的温度进行。
18.权利要求17的方法，其中所述蚕丝溶剂处理在50-78℃的温度进行。
19.权利要求17的方法，其中所述蚕丝溶剂处理在70-77℃的温度进行。
20.权利要求1-3任一项的方法，其中所述再稳定溶液是甲酸，且其中的再稳定产物进一步用甲醇处理。
21.权利要求20的方法，其中所述蚕丝溶剂包含含有乙醇和CaCl2的混合物。
22.三维蚕丝制品，能通过权利要求1-21任一项的方法制得，包含至少两个丝素蛋白长丝层的叠加，其中一个是均匀的丝素蛋白层，一个是纤维状的丝素蛋白层。
23.权利要求22的三维蚕丝制品，其中所述制品是支架，血管移植物，神经导管，或组织骨架。
24.权利要求22的三维蚕丝制品，其中所述制品是肌腱，支气管或气管，或疝网。
25.权利要求22的三维蚕丝制品，其中所述均匀的丝素蛋白层的直径为至少20μm。
26.权利要求22的三维蚕丝制品，其中所述均匀的丝素蛋白层的直径为至少50μm。
27.权利要求22的三维蚕丝制品，其中所述均匀的丝素蛋白层的直径为至少100μm。
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