CN106474549B - MicroRNA基因介导的新型组织工程化神经的构建及其在修复神经缺损的应用 - Google Patents

MicroRNA基因介导的新型组织工程化神经的构建及其在修复神经缺损的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了Let‑7家族miRNA、miR‑21或miR‑222中的一种或多种MicroRNA基因在组织工程化神经构建与修复周围神经缺损中的应用。可以将组织工程神经移植物的外和/或/内表面或者孔隙内部包覆或吸附有载有Let‑7家族miRNA抑制剂、miR‑21或miR‑222或其模拟物的高分子材料纳米微球，所述高分子材料由生物相容的纤维连接蛋白和肝素组成。本发明通过调控MicroRNA基因的表达促进周围神经再生与组织工程化神经构建，能有效促进体外原代培养的施万细胞增殖以及对神经元细胞有抗凋亡作用，体内实验证明桥接该组织工程化神经移植物有利于周围神经再生，可应用于治疗周围神经损伤。

Description

MicroRNA基因介导的新型组织工程化神经的构建及其在修复 神经缺损的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及MicroRNA基因在组织工程神经的构建与修复神经缺损的应用。
背景技术
周围神经损伤是临床常见病，由于交通事故和各种意外伤害而造成周围神经损伤呈大幅上升趋势。随着我国经济的快速发展，交通和生产事故等意外创伤导致的周围神经损伤患者亦逐年增加。目前中国周围神经损伤后存在功能障碍的患者数量接近2000万人，且以每年近200万人次的速度递增。周围神经损伤严重影响了患者的生活质量，劳动力的丧失和医疗费用的增加，给社会造成了严重的负担。
周围神经的损伤往往会导致瘫痪、麻痹和丧失对相应身体区域的自主控制。外科手术修复神经损伤的效果，目前并不十分满意。需要有新的策略来提高神经损伤后特异性的轴突再生。周围神经系统的神经元与中枢神经系统的神经元相比，具有更高的内在再生能力，在适宜的环境条件下能够再生轴突。周围神经再生过程复杂且受多因素控制，良好的微环境有利于神经再生神经。
自体神经移植一直是作为修复周围神经缺损的金标准。然而，由于自体神经供体来源困难，移植往往会造成二次损伤，其应用受到很大程度的限制。非自体组织的桥接和移植，由于同种异体或异种组织可能因组织本身携带传染源，容易引发传染疾病，同时也存在免疫排异反应，在临床实际应用受到限制。
目前，自体神经替代物研制的主要方向是组织工程化神经。组织工程化神经一般由支架材料、细胞外基质、种子细胞、生长因子等几个部分构成。为了更好地引导神经组织生长，人们在中空的神经导管内加入纤维支架、凝胶或者制备成具有许多微通道的神经导管，研究证实经过此类改进的人工神经移植物与无充填物的中空神经导管相比，修复神经缺损的距离得到一定程度增加。另一些研究人员则在生物材料神经移植物基础上结合特定细胞外基质或者生长因子来加强修复作用。研究表明，组织工程化神经可帮助机体在损伤局部产生一个利于再生的微环境。
然而单纯的支架材料，如胶原、壳聚糖和聚乙醇酸管等材料制成的神经导管，为较早应用于修复周围神经缺损的人工合成材料和天然材料的神经导管，部分产品已实现商品化并获批准在临床使用，但是其修复缺损的能力有限，一般只能用于修复较短距离的周围神经缺损。而作为种子细胞使用的施万细胞、骨髓间充质干细胞等又具有来源困难，机体必须经过二次损伤后才能获得，以及免疫原性等诸多问题。在支架材料中添加的生长因子又面临如何维持其稳定性和效率等问题。而在生物材料神经移植物基础上结合细胞外基质来加强修复的方法，需将细胞与神经导管在体外共培养，周期长，步骤繁琐，后期还需经过脱细胞处理，去除免疫原性，不同批次间很难保证一致性。
MicroRNAs (miRNA)是一类广泛存在于真核生物中的，内源性小非编码单链RNA（长度小于22个核苷酸），通过抑制蛋白翻译或是降解靶mRNA，负向调控转录后调节蛋白的表达。miRNA是发育和细胞分化时期一种广泛存在的调节因子。
lethal-7 (let-7) MicroRNA家族最初在秀丽隐杆线虫中发现，在脊椎动物和非脊椎动物中都高度保守。Let-7 MicroRNA家族能够调节神经元的细胞命运、影响神经退行性病以及神经再生。其家族的8个成员let-7a, 7b, 7c, 7d, 7e, 7f, 7i和miR-98，在坐骨神经损伤后的不同时间表达情况基本一致，表达变化与NGF呈负相关。Let-7 MicroRNA家族通过直接靶向调控NGF，减少NGF的蛋白翻译，显著降低体外原代培养的施万细胞的增殖和迁移。坐骨神经损伤后，通过抑制Let-7 MicroRNA的表达能促使施万细胞分泌NGF和促进施万细胞与DRG神经元共培养的轴突生长。体内动物实验结果显示，再生微环境中通过抑制Let-7 MicroRNA的表达能促使施万细胞的迁移和轴突生长。
miR-21基因位于染色体17q23.2，在哺乳动物的组织器官中广泛存在。miR-21基因是原癌基因，在几乎所有的人类癌症中都呈现高表达。大约2/3的实验研究结果表明：miR-21基因与内源性/外源性的细胞凋亡有关。miR-222位于染色体Xp11.3，很多临床癌症患者中呈表达上调。
坐骨神经损伤后，miR-21和miR-222 通过抑制金属蛋白酶组织抑制剂3 tissueinhibitor of metalloproteinase 3 (TIMP3) 的表达，减少成年大鼠背根神经节神经元凋亡。miR-21和miR-222直接靶向超级凋亡蛋白TIMP3。miR-21和miR-222是大鼠坐骨神经横断伤后最初的7天内，L4-6背根神经节中13个差异表达的miRNA基因。miR-21和miR-222在损伤后的7天内，不断持续表达增加。过表达miR-21和miR-222通过其抑制靶向TIMP3的作用，显著抑制体外培养背根神经节神经元凋亡，增加背根神经节神经元细胞活力，促进神经元突起生长。坐骨神经损伤后，miR-21在脊髓和背根神经节中呈现高表达，通过直接靶向下调Sprouty2蛋白表达，促进神经突起的生长。
体外培养的DRG神经元中加入microRNA-222抑制剂，能够抑制神经突起生长。同源性磷酸酶-张力蛋白Phosphatase and tensin homolog (PTEN)是microRNA-222直接靶向的靶基因。PTEN 是抑制神经再生的重要调节因子，抑制PTEN能增加成年周围神经轴突的内在再生能力。miR-222通过PTEN调节cAMP response element binding protein (CREB)的磷酸化作用，c-Jun的激活增加miR-222表达，在转录水平调控激活周围神经损伤后神经元内在再生能力。miR-222是直接靶向TIMP3和PTEN的原癌基因，并且与tumor necrosisfactor (TNF)凋亡相关信号通路有关。
迄今为止尚无研究将调控机体损伤局部MicroRNA表达与构建新型组织工程化神经进行组合，以促神经再生，修复周围神经缺损。
发明内容
本发明根据周围神经再生的理论特征进行设计，将调控Let-7家族miRNA、miR-21和miR-222表达应用于组织工程化神经构建，研究结果表明具有良好的调节神经营养因子NGF生成、促进神经轴突再生、促进施万细胞增殖、调节血管形成等作用，为周围神经再生提供了合适的微环境。
进一步的，通过纳米微球技术，将Let-7家族miRNA抑制剂（miRNA inhibitor）、miR-21或miR-222或其模拟物（miRNA mimics）包埋于纳米微球中，将纳米微球与壳聚糖导管或丝素导管相结合，形成可用于周围神经缺损套接缝合的体内局部缓慢释放调控MicroRNA表达水平的新型组织工程化神经移植物。
本发明中的促周围神经再生给药导管系统，是在本发明前期所研发的壳聚糖或丝素生物导管基础上，采用纳米微球技术，将Let-7家族miRNA抑制剂、miR-21或miR-222或其模拟物包埋于纳米微球中，然后将纳米微球与生物导管相结合，从而形成能够用于周围神经缺损套接缝合的，并且在缝合后体内局部缓慢释放调控MicroRNA表达的组织工程神经。
本发明具体技术方案如下：
MicroRNA基因在组织工程化神经构建与修复周围神经缺损中的应用，所述MicroRNA基因为Let-7家族miRNA、miR-21或miR-222中的一种或多种。所述Let-7家族成员为let-7a, 7b, 7c, 7d, 7e, 7f, 7i和miR-98。
可通过调控上述MicroRNA基因的表达，即抑制Let-7 MicroRNA的表达或者上调miR-21或miR-222表达构建组织工程化神经，以促进周围神经再生。
优选的，可以将所述Let-7家族miRNA抑制剂、miR-21或miR-222或其模拟物作为促周围神经再生成分作用包覆或吸附于组织工程神经移植物的外和/或/内表面或者孔隙内部。
优选的，所述用量为每g组织工程化神经支架材料上有10μg-10mg的Let-7家族miRNA抑制剂、miR-21或miR-222或其模拟物。
本发明的一个优选的技术方案是利用纳米微球技术，将所述Let-7家族miRNA抑制剂、miR-21或miR-222或其模拟物包埋于纳米微球中。所述微球可以是载有Let-7家族miRNA抑制剂、miR-21或miR-222或其模拟物的高分子材料纳米微球，优选高分子材料由生物相容的纤维连接蛋白和肝素组成，纤维连接蛋白与肝素质量比为1:10-1:1。
进一步优选纳米微球的平均直径为100-250nm。
所述纳米微球可采用以下方法制备而成：
取适量纤维连接蛋白溶解于无菌纯水中，得到浓度为1mg/ml纤维连接蛋白水溶液；同样取适量肝素溶解于无菌纯水中，形成浓度为1mg/ml的肝素水溶液。然后在搅拌的条件下，将纤维连接蛋白的水溶液加入到肝素的水溶液中，室温持续反应90min。反应完成后，将生物相容性交联剂京尼平加入到上述溶液中混匀，4℃反应过夜，形成浅蓝色，粒径均一的纳米微球。其中京尼平与纤维连接蛋白的质量比为1:5。
将MicroRNA溶解于生理盐水，形成含MicroRNA的溶液浓度为250 ng/mL。然后将其加入到上述微球溶液中，4℃充分搅拌混合，孵育2h后最终形成负载MicroRNA基因的纤维连接蛋白-肝素纳米的微球分散液以备用。
本发明所述Let-7家族miRNA抑制剂、miR-21或miR-222或其模拟物优选为：
rno-let-7a-5p: UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU，（SEQ ID No：1）；
rno-let-7a-3p: CUAUACAAUCUACUGUCUUUCC，（SEQ ID No：2）；
rno-let-7b-5p: UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU，（SEQ ID No：3）；
rno-let-7b-3p: CUAUACAACCUACUGCCUUCCC，（SEQ ID No：4）；
rno-let-7c-5p: UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU，（SEQ ID No：5）；
rno-let-7c-3p: CUGUACAACCUUCUAGCUUUCC，（SEQ ID No：6）；
rno-let-7d-5p: AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU，（SEQ ID No：7）；
rno-let-7d-3p: CUAUACGACCUGCUGCCUUUCU，（SEQ ID No：8）；
rno-miR-98 -5p: UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU，（SEQ ID No：9）；
rno-miR-98 -3p: CUAUACAACUUACUACUUUCC，（SEQ ID No：10）；
rno-miR-21 -5p: UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA，（SEQ ID No：11）；
rno-miR-21 -3p: CAACAGCAGUCGAUGGGCUGUC，（SEQ ID No：12）；
rno-miR-222-5p: GGCUCAGUAGCCAGUGUAGAU， （SEQ ID No：13）；
rno-miR-222-3p: AGCUACAUCUGGCUACUGGGU，（SEQ ID No：14）。
本发明的另一目的是提供一种组织工程神经移植物，所述组织工程神经移植物的外和/或/内表面或者孔隙内部包覆或吸附有Let-7家族miRNA抑制剂、miR-21或miR-222或其模拟物中的一种或几种。优选的，所述组织工程神经移植物的外和/或/内表面或者孔隙内部包覆或吸附载有Let-7家族miRNA抑制剂、miR-21或miR-222或其模拟物的高分子材料纳米微球，所述的高分子材料由生物相容的纤维连接蛋白和肝素组成。优选纤维连接蛋白与肝素质量比为1:10-1:1。进一步优选纳米微球的平均直径为100-250nm。
上述组织工程神经移植物，可以是本领域常规使用的组织工程神经移植物，优选神经移植物支架或者神经导管，支架或导管内分布有孔隙。优选壳聚糖人工神经移植物，支架为孔隙率为50%-90%且孔径为10μm-100μm的具有多孔结构抗拉强度高的神经导管。
本发明优点：
本发明根据周围神经再生的理论特征进行设计，将Let-7d抑制剂、 miR-21或miR-222或其模拟物应用于组织工程化神经，具有调节神经营养因子NGF生成、促进神经轴突再生、促进施万细胞增殖、调节血管形成等作用，为周围神经再生提供了合适的微环境。并且利用纳米微球技术，将Let-7d抑制剂、 miR-21或 miR-222或其模拟物包埋于由生物相容的纤维连接蛋白和肝素组成的纳米微球中。纤维连接蛋白与胶原、肝素、纤维素和整合蛋白家族的细胞表面受体参与了多种细胞生物学过程，如细胞黏附、迁移、血栓形成和胚胎分化。本发明利用纤维连接蛋白与肝素的生物学特性，通过交联制成纳米微球，不仅提高了Let-7家族miRNA抑制剂、miR-21或miR-222或其模拟物的稳定性，还能够对神经损伤局部实现缓慢释放维持浓度，同时还具有促进细胞增殖、组织或器官修复和再生的作用。本发明所述纳米微球生物相容性好，生物化学性质稳定，能有效促进体外原代培养的施万细胞增殖以及对神经元细胞具有抗凋亡作用，体内实验证明桥接该组织工程化神经移植物有利于周围神经再生，可应用于治疗周围神经损伤。
附图说明
图1为体外促施万细胞增殖实验流式细胞仪检测结果（A. Let-7d抑制剂微球组；B. miR-98抑制剂微球组；C. miR-21微球组；D. miR-222微球组；E. 联合应用Let-7d抑制剂, miR-98抑制剂，miR-21模拟物和miR-222模拟物非微球组；F.联合应用Let-7d抑制剂,miR-98抑制剂，miR-21模拟物和miR-222模拟物微球组）。
图2为体外原代培养的背根神经节（DRG）神经元的抗凋亡作用实验细胞免疫组织化学染色结果（A. Let-7d抑制剂微球组；B. miR-98抑制剂微球组；C. miR-21微球组；D.miR-222微球组；E. 联合应用Let-7d抑制剂, miR-98抑制剂，miR-21模拟物和miR-222模拟物非微球组；F.联合应用Let-7d抑制剂, miR-98抑制剂，miR-21模拟物和miR-222模拟物微球组）。
图3为本发明所述MicroRNA基因介导的新型组织工程化神经修复大鼠神经缺损实验电生理功能检测结果。（A. 壳聚糖微球导管组 B. 本发明组织工程化神经6实验组 C.自体神经组 D. 正常组）。
图4为本发明所述MicroRNA基因介导的新型组织工程化神经修复大鼠神经缺损实验肌肉Masson三色染色结果（A. 壳聚糖微球导管组 B. 本发明组织工程化神经6实验组C. 自体神经组 D. 正常组）。
图5为本发明所述MicroRNA基因介导的新型组织工程化神经修复大鼠神经缺损实验再生神经干的神经三色颜色的光镜结果（A. 壳聚糖微球导管组 B. 本发明组织工程化神经6实验组 C. 自体神经组 D. 正常组）。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1 载有Let-7家族抑制剂、 miR-21模拟物或 miR-222或其模拟物的纳米微球的制备
本发明选择Let-7家族miRNA抑制剂、miR-21模拟物或miR-222模拟物序列如下：
rno-let-7a-5p: UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU，（SEQ ID No：1）；
rno-let-7a-3p: CUAUACAAUCUACUGUCUUUCC，（SEQ ID No：2）；
rno-let-7b-5p: UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU，（SEQ ID No：3）；
rno-let-7b-3p: CUAUACAACCUACUGCCUUCCC，（SEQ ID No：4）；
rno-let-7c-5p: UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU，（SEQ ID No：5）；
rno-let-7c-3p: CUGUACAACCUUCUAGCUUUCC，（SEQ ID No：6）；
rno-let-7d-5p: AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU，（SEQ ID No：7）；
rno-let-7d-3p: CUAUACGACCUGCUGCCUUUCU，（SEQ ID No：8）；
rno-miR-98 -5p: UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU，（SEQ ID No：9）；
rno-miR-98 -3p: CUAUACAACUUACUACUUUCC，（SEQ ID No：10）；
rno-miR-21 -5p: UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA，（SEQ ID No：11）；
rno-miR-21 -3p: CAACAGCAGUCGAUGGGCUGUC，（SEQ ID No：12）；
rno-miR-222-5p: GGCUCAGUAGCCAGUGUAGAU， （SEQ ID No：13）；
rno-miR-222-3p: AGCUACAUCUGGCUACUGGGU，（SEQ ID No：14）。
取适量纤维连接蛋白溶解于无菌纯水中，得到浓度为1mg/ml纤维连接蛋白水溶液；同样取适量肝素溶解于无菌纯水中，形成浓度为1mg/ml的肝素水溶液。然后在搅拌的条件下，将纤维连接蛋白的水溶液加入到肝素的水溶液中，室温持续反应90min。反应完成后，将生物相容性交联剂京尼平加入到上述溶液中混匀，4℃反应过夜，形成浅蓝色，粒径均一的纳米微球。其中京尼平与纤维连接蛋白的质量比为1:5。
将上述Let-7家族miRNA抑制剂、miR-21模拟物或miR-222模拟物中的一种或几种溶解于生理盐水，形成含Let-7家族miRNA抑制剂、miR-21模拟物或miR-222模拟物的溶液浓度为250 ng/mL。然后将其加入到上述微球溶液中，4℃充分搅拌混合，孵育2h后最终形成负载Let-7家族miRNA抑制剂、miR-21模拟物或miR-222模拟物的纤维连接蛋白-肝素纳米的微球分散液以备用。
实施例2 载有微球的组织工程化神经的制备
参照文献Electrospun, Reinforcing Network-Containing, Silk Fibroin-Based Nerve Guidance Conduits for Peripheral Nerve Repair Journal of Biomaterials and Tissue Engineering Vol. 6, 53–60, 2016公开的方法制备神经导管，将神经导管与实施例1制得的微球在室温的条件下，孵育2小时，进行物理吸附，得到载有微球的组织工程化神经，或者将神经导管与let-7家族miRNA抑制剂、miR-21模拟物或miR-222模拟物中的一种或几种，在室温的条件下，孵育2小时，进行物理吸附，得到直接载有let-7家族miRNA抑制剂、miR-21模拟物或miR-222模拟物的组织工程化神经。
组织工程化神经1：载有Let-7d抑制剂微球的组织工程化神经。
组织工程化神经2：载有miR-98抑制剂微球的组织工程化神经。
组织工程化神经3：载有miR-21模拟物微球的组织工程化神经。
组织工程化神经4：载有miR-222模拟物微球的组织工程化神经。
组织工程化神经5：载有Let-7d抑制剂, miR-98抑制剂以及miR-21模拟物和miR-222的模拟物的组织工程化神经。
组织工程化神经6：载有Let-7d抑制剂, miR-98抑制剂以及miR-21模拟物和miR-222的模拟物微球的组织工程化神经。
实施例3 体外促施万细胞增殖实验
分别将长度为1cm组织工程化神经1-6完全浸没于2ml的培养基中（根据不同的实验目的，施万细胞增殖实验用DMEM+10%FBS；DRG神经元凋亡实验用97%Neurobasal+2%B27+1%GluMAX），室温浸泡24h后，4℃储存备用。
取出生1-2 天的新生SD 大鼠，经冰冻后，75％酒精喷洒消毒后，以下步骤均在培养室无菌超净台下进行。经股骨后外侧肌间隙暴露分离取出坐骨神经，置于预冷的HBSS 溶液中，经解剖镜剥除神经外膜后，放入盛有200μl 1mg/ml 胶原酶的1.5ml EP 管中剪碎，37℃消化30min，去除胶原酶加入0.125%的胰酶37℃消化12min，移至5ml EP 管中，加入3ml施万细胞培养液反复吹打分离，直至肉眼基本看不到组织块为宜，离心弃上清，用施万细胞培养液清冼两次，以1×106 的密度种至预先用PLL 包被的培养皿中，放入37℃，通95%空气和5% CO2 的湿润的培养箱中24h 内换成加含有阿糖胞苷（1:1000）培养液，24h 后换成含有2μM forsokolin 和10ng/ml 的HRG，每3天换一次液，待细胞长至50%融合时，将培养基分别完全换成组织工程化神经1-6的浸出液，继续培养24h，用0.25％胰蛋白酶消化后调整细胞密度为5×105/ml，加入0.5ml的50ug/ml的PI染液，室温下避光染色30min 后，以标准程序进行流式细胞仪的细胞周期检测。
流式细胞仪检测结果如图1所示（A. Let-7d抑制剂微球组；B. miR-98抑制剂微球组；C. miR-21微球组；D. miR-222微球组；E. 联合应用Let-7d抑制剂, miR-98抑制剂，miR-21模拟物和miR-222模拟物非微球组；F.联合应用Let-7d抑制剂, miR-98抑制剂，miR-21模拟物和miR-222模拟物微球组）。结果显示图E和F实验组的处于增殖周期的施万细胞分别为74.93%和88.58%，显著高于图A 64.71%, 图B 68.57%，图C 66.34%，图D 60.15%，这说明组合应用多种Let-7d抑制剂, miR-98抑制剂，miR-21模拟物和miR-222模拟物的效果要显著优于单一应用。并且使用纳米微球结合含Let-7d抑制剂, miR-98抑制剂，miR-21和miR-222模拟物的组织工程化神经要显著优于直接物理吸附Let-7d抑制剂, miR-98抑制剂，miR-21和miR-222模拟物对施万细胞增殖作用。结论：微球联合应用Let-7d抑制剂,miR-98抑制剂，miR-21和miR-222模拟物）的组织工程化神经，体外能促进原代培养的施万细胞增殖。
取胚胎16d SD 大鼠DRG L4,5,6，用0.25%的胰酶37℃消化15min，以细胞密度为105/ml接种于24孔培养板，体外常规培养1d 后相差显微镜下观察发现，细胞贴壁并有少量神经突起生长。用40ng/ml 的TNF-α预处理细胞12h后，再分别用组织工程化神经1-6浸出液处理原代培养的DRG神经元12h。吸去培养液，用0.01MPBS 洗涤一次，加入4%多聚甲醛，室温下固定30min，去除固定液，用0.01M PBS 室温下洗涤10min× 3 次。用含10%羊血清、0.3%Triton X-0100 的0.01M PBS 液在37ºC 条件下封闭60min，吸去封闭液。滴加一抗Rabbitantibodies against cleaved caspase-3 1:500; Mouse rabbit antibody againsttotal caspase-3 1:800，4ºC孵育过夜，，0.01M PBS 洗涤10min×3 次。滴加二抗TRITClabeled secondary antibody donkey anti-mouse IgG 1:600；FITC labeled secondaryantibody donkey anti-rabbit IgG 1:600，以Hoechst（5μg/ml）标记细胞核，室温、避光放置1h，0.01M PBS 洗涤10min×3 次。在激光共聚焦显微镜下（FITC 激发波长：488nm，观察波长：500-535nm；Hoechst 亚离子Ar 激发波长： 353-364 nm，观察波长：460-480 nm），观察免疫荧光细胞化学检测结果。
细胞免疫组织化学染色结果如图2所示，（A. Let-7d抑制剂微球组；B. miR-98抑制剂微球组；C. miR-21微球组；D. miR-222微球组；E. 联合应用Let-7d抑制剂, miR-98抑制剂，miR-21模拟物和miR-222模拟物非微球组；F.联合应用Let-7d抑制剂, miR-98抑制剂，miR-21模拟物和miR-222模拟物微球组）。图中蓝色的为Hoechst，标记细胞核；红色的为total caspase-3，正常细胞一般都有表达；绿色的为活化型的caspase-3，只有凋亡的细胞才会表达。结果显示，Let-7d抑制剂微球组（图A），miR-98抑制剂微球组（图B），C. miR-21微球组（图C），miR-222微球组（图D）的免疫组化显示有大量绿色即活化型的caspase-3，即细胞发生了凋亡，图E为联合应用Let-7d抑制剂, miR-98抑制剂，miR-21和miR-222模拟物的非微球组，虽然仍有活化型的caspase-3的表达，但明显少于应用单一MicroRNA的实验组。图F为联合应用Let-7d抑制剂, miR-98抑制剂，miR-21模拟物和miR-222模拟物的微球组，结果未见有活化型的caspase-3表达，即细胞基本没有发生凋亡。结论，联合应用Let-7d抑制剂, miR-98抑制剂，miR-21模拟物和miR-222模拟物的组织工程化神经，能明显抑制TNF-α导致的原代培养的背根神经节神经元的凋亡。
实施例4 MicroRNA基因介导的新型组织工程化神经在修复神经缺损中的应用
1. 动物实验分组及模型制备
1.1 动物实验及分组
大鼠随机分为4组（每组15只）：组织工程化神经组（实验组，实施例2所述的组织工程化神经6）、自体神经组、壳聚糖微球导管组（阴性对照组）、假手术组（正常组）。
壳聚糖微球导管的制备：
根据参考文献Kawadkar J，Chauhan M K．I Intra-articular delivery ofgenipin cross-linked chitosan microspheres of flurbiprofen: preparation,characterization, in vitro and in vivo studies. [J]．European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2012，81(3)：563-572．，将3ml浓度为30g/L的壳聚糖乙酸水溶液逐滴加入40ml含20g/L span-80的液体石蜡中，在室温的条件下经磁力搅拌使之成为稳定W/O 型乳化体系。生物交联剂京尼平用2ml体积分数70%的乙醇溶液溶解，滴入乳化液中进行交联固化。反应完成后，离心分散收集所得的壳聚糖微球。将实施例1所述的Let-7d抑制剂, miR-98抑制剂以及miR-21模拟物和miR-222的模拟物溶解于生理盐水，形成含Let-7d抑制剂, miR-98抑制剂以及miR-21模拟物和miR-222的模拟物的溶液浓度为250 ng/mL。然后将其加入到上述微球溶液中，4℃充分搅拌混合，孵育2h后最终形成负载Let-7d抑制剂, miR-98抑制剂以及miR-21模拟物和miR-222的模拟物的壳聚糖纳米的微球分散液以备用。
参照文献Electrospun, Reinforcing Network-Containing, Silk Fibroin-Based Nerve Guidance Conduits for Peripheral Nerve Repair Journal of Biomaterials and Tissue Engineering Vol. 6, 53–60, 2016公开的方法制备神经导管，将神经导管与上述微球在室温的条件下，孵育2小时，进行物理吸附，得到载有微球的壳聚糖导管。
1.2 模型制备
动物以复合麻醉剂（0.2-0.3ml/100g体重）腹腔注射麻醉。麻醉成功后，左股骨部手术区域常规备皮、消毒、铺巾。取左股后正中切口，依次切开皮肤和筋膜，游离并充分暴露坐骨神经；于股骨中段切除坐骨神经并造成10mm缺损。组织工程化神经组（nTENG）和丝素导管组（Scaffold），两侧神经断端分别套入导管内1mm，无损伤缝线缝合神经外膜固定；自体神经组以切下的坐骨神经反转后缝合。常规关闭切口。模型制备以及其后的饲养观察均在SPF级屏障系统内进行。
2. 术后功能恢复评价
2.1电生理功能检测
术后12w，室温下对大鼠进行电生理学检测。大鼠称重，腹腔注射复合麻醉剂（大鼠每100克体重0.2-0.3ml），麻醉成功后，暴露坐骨神经，用玻璃分针小心分离坐骨神经，记录复合肌动作电位 (compound muscle action potentials, CMAPs)。将记录电极刺入腓肠肌肌腹，干扰电极置于大鼠膝部皮肤表面，依次将刺激电极置于夹伤处近、远侧坐骨神经干，刺激神经，记录CMAPs，测量CMAPs振幅、潜伏期。同样的方法，记录正常侧CMAPs的振幅和潜伏期。CMAPs的与神经纤维支配靶肌的神经纤维成正比，因此检测CMAPs，为周围神经的传导功能的恢复提供重要参数。根据公式计算CMAPs恢复指数(recovery index), recoveryindex=术侧CMAPs最大振幅/正常侧CMAPs最大振幅。
实验结果如图3所示，（A. 壳聚糖微球导管组 B. 本发明组织工程化神经6实验组C. 自体神经组 D. 正常组）。结果表明本发明组织工程化神经6实验组的大鼠腓肠肌的复合肌动作电位CMAP和神经传导速度的恢复情况要明显优于壳聚糖微球组，与阳性对照自体神经组接近。
2.3灌流固定与取材
2.3.1 灌流固定
术后4w, 12w，将经复合麻醉剂麻醉后的大鼠，打开胸腔，暴露心脏，刺破右心耳，将针尖刺入左心室用生理盐水灌注（灌注量约为动物体重的2倍），直至肝脏的颜色变浅，同时肠系膜血管内液体由红色变为接近无色，然后再注入等量的4%多聚甲醛。
2.3.2 取材
每组3只大鼠经灌流固定，取下再生坐骨神经干，浸入预冷的的戊二醛固定液中，留待树脂包埋和电镜观察。
灌流完毕后，仔细解剖并切下双侧完整的腓肠肌，体积大小约0.5cm×0.3cm×0.3cm，浸入预冷的适量后固定液中(4%PA)4℃过夜。仔细解剖并取出术侧再生坐骨神经干，在正常侧相对应部位取一段坐骨神经作为对照，取下坐骨神经样品绷直贴于硬纸板上，浸入预冷的适量后固定液(4%PA) 4℃过夜。
2.4 样品处理与观察
2.4.1 电镜样品的处理
分别于术后4w和12w，戊二醛固定坐骨神经和腓肠肌样品，经1%锇酸后固定，醋酸铀快染，乙醇梯度脱水后，Epon 812环氧树脂包埋。
2.4.2 肌肉Masson三色染色
分别于术后4w和12w，取腓肠肌置于蔗糖溶液中沉底后，用5%蔗糖（0.1M PB配制）包埋，冰冻切片，10μm，横切。切片置于室温约24小时，利于组织贴附。按如下步骤进行Masson三色染色，胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色，胞核呈黑蓝色。
(1) 切片置于ddH2O中3-5min。
(2) Ehrlich苏木素液中染20min。
(3) ddH2O浸洗约1min，1%盐酸乙醇溶液中分色，约1min。
(4) 自来水蓝化约20min，显微镜下控制。
(5) 丽春红-酸性复红液中染5min。
(6) ddH2O清洗染液。
(7) 1％磷钼酸中染5min。
(8) 不经水洗，直接入醋酸苯胺蓝液中染5min。
(9) ddH2O洗，以1％冰醋酸分色1min。
(10) 95％乙醇脱水5minx3次，无水乙醇中脱水5minx2次。
(11) 二甲苯透明5minx3次，中性树胶封固，室温风干后即可光镜下观察。
实验结果如图4所示，（A. 壳聚糖微球导管组 B. 本发明组织工程化神经6实验组C. 自体神经组 D. 正常组，图中红色标记肌纤维；蓝色标记胶原纤维。）。结果表明本发明组织工程化神经6实验组的肌纤维横截面积与自体神经组相近，均显著高于壳聚糖微球组，且胶原纤维面积百分比均显著低于壳聚糖微球组。
2.5 神经组织电镜计量分析
(1)harris苏木素：将0.5g苏木素精加入5ml无水乙醇中溶解，将10g硫酸铝钾加入100 m1双蒸水中溶解，将两种溶液混匀后加热至沸．即加入0．25g黄色氧化汞。待溶解后在冰水中冷却。过滤后加入5ml冰醋酸。(2)三色液：将0.3g固绿FCF，0.6g变色素2R及0.6g磷钨酸依次加入100 m1双蒸水中溶解，再加入2m1冰醋酸，调节pH值至3.4。该染液可在室温保存两周，若保存时间过长或PH值发生改变，则染色偏紫。绿色变浅。(3)0.3％冰醋酿溶液，在临用前配制。
参照Meyer等实验方法并加以适当改良：(1)切片常规脱蜡至ddH2O (2)harris苏木素液染5分钟；(3)双蒸水冲洗5分钟，显微镜下控制蓝化程度；〔4)三色液染30分钟；(5)0.3％冰醋酸冲洗2次，每次20秒钟；流水冲洗5-10分钟。至切片组织不脱色为止；(7)脱水、透明、中性树胶封片。
结果如图5所示，（A. 壳聚糖微球导管组 B. 本发明组织工程化神经6实验组 C.自体神经组 D. 正常组，图中紫红色为标记施万细胞核；绿色为标记神经轴索。）结果表明本发明组织工程化神经6实验组的再生神经干的髓鞘形成情况显著优于壳聚糖微球组，与阳性对照自体神经组接近。
3. 数据统计
本实验为成组设计，形态计量分析的数据用STATA7统计分析软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），若组间差异有统计学意义，进一步采用Turkey’s法进行两两比较。所得结果表示均数±标准差（X±SD），p＜0.05表示差异有统计学意义。
SEQUENCE LISTING
<110> 南通大学
<120> MicroRNA基因介导的新型组织工程化神经的构建及其在修复神经缺损的应用
<130>
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
CUAUACAAUCUACUGUCUUUCC
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
CUAUACAACCUACUGCCUUCCC
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 6
CUGUACAACCUUCUAGCUUUCC
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 7
AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 8
CUAUACGACCUGCUGCCUUUCU
<210> 9
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 9
UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 10
CUAUACAACUUACUACUUUCC
<210> 11
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 11
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
<210> 12
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 12
CAACAGCAGUCGAUGGGCUGUC
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 13
GGCUCAGUAGCCAGUGUAGAU
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 14
AGCUACAUCUGGCUACUGGGU

Claims (3)

1.一种组织工程神经移植物，其特征在于所述组织工程神经移植物的外和/或/内表面或者孔隙内部包覆或吸附有载有Let-7家族miRNA抑制剂、miR-21或miR-222或其模拟物的高分子材料纳米微球，所述的高分子材料由生物相容的纤维连接蛋白和肝素组成，所述Let-7家族miRNA抑制剂、miR-21模拟物或miR-222模拟物为：
rno-let-7a-5p: UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU，SEQ ID No：1；
rno-let-7a-3p: CUAUACAAUCUACUGUCUUUCC，SEQ ID No：2；
rno-let-7b-5p: UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU，SEQ ID No：3；
rno-let-7b-3p: CUAUACAACCUACUGCCUUCCC，SEQ ID No：4；
rno-let-7c-5p: UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU，SEQ ID No：5；
rno-let-7c-3p: CUGUACAACCUUCUAGCUUUCC，SEQ ID No：6；
rno-let-7d-5p: AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU，SEQ ID No：7；
rno-let-7d-3p: CUAUACGACCUGCUGCCUUUCU，SEQ ID No：8；
rno-miR-98-5p: UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU，SEQ ID No：9；
rno-miR-98-3p: CUAUACAACUUACUACUUUCC，SEQ ID No：10；
rno-miR-21-5p: UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA，SEQ ID No：11；
rno-miR-21-3p: CAACAGCAGUCGAUGGGCUGUC，SEQ ID No：12；
rno-miR-222-5p: GGCUCAGUAGCCAGUGUAGAU，SEQ ID No：13；
rno-miR-222-3p: AGCUACAUCUGGCUACUGGGU，SEQ ID No：14。
2.如权利要求1所述的组织工程神经移植物，其特征在于所述Let-7家族miRNA抑制剂、miR-21或miR-222或其模拟物在组织工程化神经支架材料上的用量10μg/g-10mg/g。
3.如权利要求1所述的组织工程神经移植物，其特征在于所述纤维连接蛋白与肝素质量比为1:10-1:1。
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