CN109694882B - 包含5’端特定种子碱基序列的miR的应用、改良的雪旺细胞及其应用 - Google Patents

包含5’端特定种子碱基序列的miR的应用、改良的雪旺细胞及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供包含5’端特定种子碱基序列的miR的应用、改良的雪旺细胞及其应用，涉及中枢神经系统损伤修复技术领域。包含5’端特定种子碱基序列的miR在促进雪旺细胞与星形胶质细胞相容整合中的应用，所述5’端特定种子碱基序列为UAAGGCAC或AAGGCAC。实验表明，雪旺细胞中人为提高包含5’端特定种子碱基序列的成熟体miR表达水平后，改良的雪旺细胞中胶质细胞相关基因表达显著降低，NT‑3和BDNF神经营养因子基因表达显著提高，且改良的雪旺细胞与星形胶质细胞相容整合。所述改良的雪旺细胞能够抑制星形胶质细胞的细胞，促进雪旺细胞和星形胶质细胞间相互整合，进而降低星形胶质细胞导致的胶质瘢痕形成。

Description

包含5’端特定种子碱基序列的miR的应用、改良的雪旺细胞及 其应用
技术领域
本发明涉及脊髓损伤修复技术领域，尤其涉及包含5’端特定种子碱基序列的miR的应用、改良的雪旺细胞及其应用。
背景技术
脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)是指由外界直接或间接因素损伤脊髓导致机体损伤节段以下的感觉和运动功能障碍的疾病。据世界卫生组织(Worldhealthorganization，WHO)统计，全世界有约300万SCI患者且每年有约18万新患者，大多数SCI是由道路交通事故导致。SCI作为一种高发以及高致残率疾病目前尚未有完全治愈的医疗手段，依靠手术、药物治疗以及康复护理等无法达到理想的医疗效果，患者还将面临严重的神经功能障。SCI后，受损部位神经元和神经胶质细胞发生坏死和凋亡，神经轴索也会出现溃变和退缩；脊髓损伤周围星形胶质细胞(Astrocytes，As)变为反应性星形胶质细胞(Reactive astrocytes，RAs)活跃增殖并迁移至损伤灶周围，分泌硫酸软骨素蛋白聚糖(Chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs)等胞外基质与少突胶质细胞等一起形成胶质瘢痕，隔离损伤部位炎症细胞向周边组织扩散，同时后期阻碍神经轴突再生及延伸；SCI经急性损伤期后发生继发性反应，损伤区进一步扩大，损伤中心部位出现充满液体的空洞，最终使再生的神经轴突无法跨越空洞从而实现神经轴突链接达到功能恢复的目的。因此，减少胶质瘢痕形成和填充空洞病理结构且使再生的神经轴突有效地跨过空洞部位与周围神经元实现轴突链接是成功治疗SCI的重要策略。
近二十年来随着细胞学和再生医学领域的飞速发展，越来越多的研究结果显示：细胞移植是有效治疗SCI的最有希望的技术之一。目前，用于研究治疗SCI的移植细胞主要包括雪旺细胞(Schwann cells，SCs)、神经干细胞或前体细胞、嗅鞘细胞、间充质干细胞和胚胎干细胞等。这些细胞移植后不仅通过填充损伤后遗留的病理空洞为神经轴突再生提供物理支持促进SCI再生修复，还通过分泌神经营养因子和细胞因子发挥促进神经再生和保护作用、促进新生血管形成、抑制炎症反应、形成髓鞘等不同的生物学作用进一步促进SCI再生修复。其中，雪旺细胞移植在SCI治疗中的应用备受关注。雪旺细胞来源于神经嵴细胞，经由雪旺细胞前体细胞分化为未成熟雪旺细胞，最终分别形成髓鞘形成雪旺细胞(Myelinating Schwann Cells，MSCs)和非髓鞘形成雪旺细胞(Non-myelinating SchwannCells，NSCs)。雪旺细胞是周围神经系统(Peripheral nervous system,PNS)的神经胶质细胞，包绕轴突形成髓鞘，分泌神经营养因子NT-3(Neurotrophin-3)、NGF(Nerve growthfactor)和BDNF(Brain derived neurotrophic factor)等支持神经元和轴突的生长。SCI后，不仅一部分损伤脊髓周边PNS中的雪旺细胞迁入损伤部位，而且损伤部位部分少突胶质细胞前体细胞也分化为雪旺细胞参与损伤修复并在神经轴突形成髓鞘[1]。大量研究证实：雪旺细胞通过分泌多种神经营养因子(BDNF、GDNF、NGF等)和细胞外基质减少空洞形成、促进损伤的神经轴突再生以及再生轴突形成髓鞘，有效提高运动功能的恢复[2-5]。这些研究结果证明，雪旺细胞是SCI修复神经损伤重要的参与者并且是较理想的SCI修复自体细胞。雪旺细胞在SCI治疗的基础应用研究已有20余年历史，已在基础和临床研究中取得了丰硕的研究成果。Saberi等从33名患者自体腓肠神经分离雪旺细胞进行自体移植于患者脊髓，随后跟踪观察2年发现患者移植的雪旺细胞安全感染或肿瘤形成等异常反应，其安全性已经得到证实[6]。依据大量的动物实验结果，美国FDA批准进行临床实验确证在治疗急性和慢性SCI中自体雪旺细胞的有效性和安全性[7-9]。2016年W.Dalton Dietrich等利用人源雪旺细胞自体移植治疗SCI的研究已完成一期临床试验(https://www.clinicaltrials.gov/)。
然而雪旺细胞移植治疗SCI也有它的局限性。有研究显示，雪旺细胞在宿主中枢神经系统(Central nerve system,CNS)富含As区域中迁移能力较低，雪旺细胞注射到机体后基本滞留在移植原位，不能向星形胶质细胞形成的胶质瘢痕区域迁移，不易与星形胶质细胞发生交错整合，两者细胞群之间形成明显的界限，这一雪旺细胞特性显著限制雪旺细胞在CNS发挥神经修复功能[10]。这可能与雪旺细胞和星形胶质细胞两种细胞特性密切相关。研究发现：星形胶质细胞表达分泌ephrinAs与雪旺细胞表面EphA受体结合通过激活VAV2通路抑制雪旺细胞迁移以及与星形胶质细胞相整合[11]；CNS和PNS间有清晰的界面，不相互交错在一起，这可能与PNS中雪旺细胞高表达Krox20/Egr2转录因子密切相关，抑制Krox20/Egr2表达能够促进CNS中星形胶质细胞和少突胶质细胞向PNS侵袭迁移[12]。但是其中对雪旺细胞和星形胶质细胞不整合的机制还未阐明清楚，有待进一步深入研究。通过“人为修饰和改造雪旺细胞的特性提高其在SCI损伤微环境中迁移和与星形胶质细胞的整合”成为雪旺细胞移植治疗SCI中遇到的瓶颈问题。目前，有报道称应用超顺磁氧化铁纳米颗粒磁化雪旺细胞后在磁场作用下可以有效提高雪旺细胞的迁移[13]。
MicroRNA(miR)是细胞内产生的、长度约为20～24个核苷酸的非编码小RNA。miR通过与多种靶mRNA的3'非编码区(3'UTR)结合阻遏转录后蛋白质翻译的方式抑制并调控多种靶基因的蛋白表达，调节多种信号通路，改变细胞增殖和分化在内的各种细胞特性，在调控细胞分化和命运中起到举足轻重的作用。miR-124-3P是在CNS中存在最为广泛的miRNA，miR-124-3P与CNS紊乱情况如神经发生、神经元分化以及突触形成等密切相关。已有的研究结果显示：miR-124-3P还能诱导非神经系统细胞如Hela细胞、人成纤维细胞、胚胎干细胞和间充质干细胞等细胞的基因组表达模式向神经元方向转化[14-16]。
发明内容
本发明为了克服现有雪旺细胞与星形胶质细胞无法交错融合的缺陷，提供了一种包含5’端特定种子碱基序列的成熟体miR在促进雪旺细胞与星形胶质细胞相容整合中的应用，通过包含5’端特定种子碱基序列的miR-124-3P在雪旺细胞的表达水平来改变雪旺细胞的细胞学特性，从而提高其与星形胶质细胞的交错融合，促进雪旺细胞对脊髓在内中枢系统神经损伤的再生修复作用。
本发明还提供了一种包括含有包含5’端特定种子碱基序列的miR的表达载体的改良的雪旺细胞，所述改良的雪旺细胞可与患者自体的星形胶质细胞相容整合，改变雪旺细胞的迁移能力，从而促进雪旺细胞在脊髓在内中枢神经系统中的迁移和修复效果。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种包含5’端特定种子碱基序列的miR在促进雪旺细胞与星形胶质细胞相容整合中的应用，所述5’端特定种子碱基序列为UAAGGCAC或AAGGCAC。
优选的，所述包含5’端特定种子碱基序列的miR为miR-124的成熟体miR-124-3P。
优选的，所述包含5’端特定种子碱基序列的miR在雪旺细胞中过表达以促进雪旺细胞与星形胶质细胞相容整合。
本发明还提供了一种改良的雪旺细胞，包括含有包含5’端特定种子碱基序列的miR的表达载体。
优选的，所述表达载体的类型包括质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒。
优选的，所述表达载体包括含有miR-124的表达载体、含有miR-124-3P前体的表达载体或含有miR-124-3P成熟体的表达载体。
本发明还提供了上述技术方案所述改良的雪旺细胞在制备治疗脊髓在内中枢神经系统损伤的药物中的应用。
优选的，所述改良的雪旺细胞在制备抑制星形胶质细胞形成胶质瘢痕形成以治疗脊髓在内中枢神经系统损伤的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明提供了包含5’端特定种子碱基序列的miR在促进雪旺细胞与星形胶质细胞相容整合中的应用，所述5’端特定种子碱基序列为UAAGGCAC或AAGGCAC。应用外源性雪旺细胞移植治疗急性SCI虽然具有神经修复功能且安全性已得到证实，然而雪旺细胞注射到机体损伤区域后容易滞留在空洞病灶区难以向周围正常脊髓迁移与轴突末梢建立链接从而实现脊髓再生。主要原因是雪旺细胞难以向脊髓损伤周围富含星形胶质细胞区域迁移和长入；星形胶质细胞形成胶质瘢痕同时分泌抑制性分子抑制轴突再生。
在本发明的实验中，miR-124-3P的5’端特定种子碱基序列即为“UAAGGCAC”或“AAGGCAC”，申请人观察到大鼠雪旺细胞miR-124-3P的表达显著低于脊髓组织；通过生物学分析发现，Krox20/Egr2可能是miR-124-3P的靶基因。本发明通过人为促进雪旺细胞中miR-124-3P表达水平后，改良的雪旺细胞中胶质细胞相关基因(GFAP、Krox20)表达显著降低，而神经营养因子有关基因(NT-3以及BDNF)表达显著提高，并且改良的雪旺细胞与星形胶质细胞发生相容整合(如图5b所示)，可能在miR-124-3P的作用下雪旺细胞改变为易与星形胶质细胞交错整合的细胞。本发明首次将miR-124-3P用于改善雪旺细胞与星形胶质细胞不相容整合中，解决了现有技术中因雪旺细胞与患者自体的星形胶质细胞不相容整合而阻碍雪旺细胞对脊髓修复作用的问题。
本发明还提供了一种改良的雪旺细胞，包括含有包含5’端特定种子碱基序列的miR核苷酸序列的表达载体。本发明通过向雪旺细胞中导入含有包含5’端特定种子碱基序列的miR的表达载体来提高miR-124-3P的表达水平。本发明实验表明，改良的雪旺细胞除了易于星形胶质细胞交错融合外，还能够降低星形胶质细胞形成的胶质瘢痕，可以有效增进中枢神经组织的再生。本发明为将雪旺细胞作为移植细胞以包含5’端特定种子碱基序列的miR改进雪旺细胞的细胞特性、显著提高SCI治疗和运动功能恢复的临床治疗应用提供理论依据和治疗方案。
附图说明
图1a为培养得到的雪旺细胞在倒置相差显微镜下观察的形状；
图1b为免疫荧光鉴定培养得到的雪旺细胞表面标志物GFAP、sox10、p75NTR的结果；
图2a为细胞免疫荧光法检测原代提取的星形胶质细胞中胶质细胞相关标志物GFAP和S100β图；其中图左为星形胶质细胞标志物GFAP的染色结果，图右为星形胶质细胞标志物S100β的染色结果；
图2b为实时荧光定量PCR检测正常雪旺细胞、星形胶质细胞以及正常脊髓组织中miR-124-3P的表达水平；
图3a为实施例2步骤2.1中各组细胞受到慢病毒感染情况；
图3b为实施例2步骤2.1中荧光定量PCR检测各组感染慢病毒不同时间后，雪旺细胞表达的miR-124-3P的表达量与正常雪旺细胞表达miR-124-3P的增高倍数；
图4a为实施例2步骤2.2中各组雪旺细胞的胶质细胞相关标志物表达情况，其中左图表示通过RT-PCR检测各组雪旺细胞特异性特异性标志基因GFAP、sox10、Krox20表达情况的电泳图；右图表示通过ImageJ分析基因表达对比图；
图4b为实施例2步骤2.2中各组雪旺细胞的分泌的神经营养因子表达情况，通过实时荧光定量PCR检测各组雪旺细胞分泌的神经营养因子CNTF、NT-3、BDNF、NGF基因水平变化情况；
图4c为实施例2步骤2.2中各组雪旺细胞的标志物表达情况，其中左图表示通过Westernblot检测各组雪旺细胞特异性标志物蛋白GFAP、sox10、Krox20表达情况的电泳图；右图表示通过ImageJ分析蛋白表达对比图；
图4d为实施例2步骤2.2中各组雪旺细胞增殖情况，其中上图表示通过EdU染色检测各组雪旺细胞的DNA合成情况；下图表示通过ImageJ分析统计荧光阳性表达对比图；
图5a为Boundary assay检测改良的雪旺细胞与星形胶质细胞相容整合的示意图；
图5b为实施例2步骤3中免疫荧光法检测试验组和阴性对照组细胞的相容整合情况；其中星形胶质细胞被GFAP抗体标记为红色，改良的雪旺细胞以及感染NC-EGFP的雪旺细胞表达GFP显示为绿色；
图5c为实施例2步骤3中试验组、阴性对照组细胞的迁移最远距离对比图；
图5d为实施例2步骤3中试验组、阴性对照组细胞的迁移面积对比图；
图6a为实施例2步骤4中通过Transwell细胞培养小室模拟体内移植微环境的示意图；
图6b为实施例2步骤4中雪旺细胞与星形胶质细胞3D共培养体系在含10％胎牛血清的DMEM中培养5-7天后，通过荧光显微镜观察试验组和阴性对照组感染慢病毒的情况；
图6c为实施例2步骤4中通过实时荧光定量PCR检测星形胶质细胞标记基因GFAP、sox9、S100β基因水平表达情况；
图6d为实施例2步骤4中通过Westernblot检测GFAP、sox9和p-STAT3等星形胶质细胞特异性标志物表达的电泳图；其中：WT-As：与空白组雪旺细胞共培养的星形胶质细胞；NC-As：与阴性对照组雪旺细胞共培养的星形胶质细胞；miR-As：与改良雪旺细胞共培养的星形胶质细胞；右图为实施例2步骤4中通过Westernblot检测GFAP、sox9和p-STAT3等星形胶质细胞特异性标志物表达量对比图。
具体实施方式
本发明提供了一种包含5’端特定种子碱基序列的miR在促进雪旺细胞与星形胶质细胞相容整合中的应用，所述5’端特定种子碱基序列为UAAGGCAC或AAGGCAC。本发明所述5’端特定种子碱基序列与靶基因3`端序列碱基配对结合能够干扰靶基因mRNA翻译为蛋白，从而抑制靶基因在细胞中的生物学作用在本发明中，所述包含5’端特定种子碱基序列的miR中除了5’端特定种子碱基序列外，优选的还包括与靶基因mRNA的3’UTR部位结合抑制该mRNA蛋白翻译的完整的其它类型小非编码RNA。在本发明中，所述包含5’端特定种子碱基序列的miR优选为miR-124-3P。本发明研究表明，提高雪旺细胞中5’端带有UAAGGCAC或AAGGCAC的miR-124-3P表达，可以实现促进雪旺细胞与星形胶质细胞相容整合的目的。如图5所示，过表达了miR-124-3P的雪旺细胞能够与星形胶质细胞发生相容整合，并且过表达了miR-124-3P的雪旺细胞与星形胶质细胞向彼此方向迁移的最远距离也有显著增加。miR-124-3P为含有5’端特定种子碱基序列的成熟体miR的一种形式，其他5’端为UAAGGCAC或AAGGCAC的人工改造的非编码核苷酸片段如小非编码RNA也具有类似作用，也在本发明的保护范围内。
在本发明中，所述包含5’端特定种子碱基序列的miR能够促进雪旺细胞中miR-124-3P过表达指的是促进雪旺细胞中miR-124-3P的表达量至少提高3倍以上。
本发明还提供了一种改良的雪旺细胞，包括含有包含5’端特定种子碱基序列的miR的表达载体。本发明通过向雪旺细胞中导入含有包含5’端特定种子碱基序列的miR的表达载体提高雪旺细胞的miR-124-3P表达水平，改造雪旺细胞的细胞学特性，降低了胶质细胞相关基因(GFAP、Krox20)表达，并且提高了神经营养因子有关基因(NT-3以及BDNF)表达水平。本发明所述改良后的雪旺细胞与未改良的雪旺细胞相比，能够实现与星形胶质细胞的相容整合，克服常规雪旺细胞在脊髓损伤微环境中难以迁移并与宿主星形胶质细胞整合的问题，同时可以抑制星形胶质形成瘢痕的细胞特性，解除了雪旺细胞移植整合性问题进而有效促进脊髓在内中枢神经系统损伤再生修复。
在本发明中，所述表达载体的类型包括但不限于质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒，采用其他任何能够将包含5’端特定种子碱基序列的非编码小RNA或核苷酸序列导入到雪旺细胞载体类型均可。本发明对如何构建含有包含5’端特定种子碱基序列的miR核苷酸序列的表达载体没有特殊限定，采用本领域已知的构建方式即可。
在本发明中，所述表达载体优选的包括含有miR-124的表达载体、含有miR-124-3P前体的表达载体或含有miR-124-3P成熟体表达载体。在本发明中，所述miR-124-3P的核苷酸序列为5’-uaaggcacgcggugaaugcc-3’。本发明对所述miR-124-3P前体和miR-124-3P成熟体的序列不做特殊限定，根据mirbase数据库(http://www.mirbase.org)和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，所述miR-124-3P前体和miR-124-3P成熟体包括转录后剪切和加工后形成上述成熟体miR-124-3P核苷酸序列的各种种属pri-miR-124-3P-1、pri-miR-124-3P-2、pri-miR-124-3P-3和Pre-miR-124-3P-1、Pre-miR-124-3P-2以及Pre-miR-124-3P-3等。
在本发明中，雪旺细胞中人为高表达miR-124-3P后得到的改良的雪旺细胞分泌的细胞因子、生长因子以及外泌体中活性成分发生量和质的改变。高表达miR-124-3P的改良的雪旺细胞在移植部位分泌这些细胞因子和生长因子和外泌体，改造损伤的微环境影响星形胶质细胞的细胞表型和抑制胶质瘢痕的形成，进而促进神经组织的再生。因此，凡是从高表达miR-124-3P的改良的雪旺细胞中分离纯化这些活性成分如细胞因子、生长因子和外泌体并制备成治疗剂应用于脊髓损伤在内中枢神经以及外周神经系统损伤性再生修复的治疗均为借鉴本发明。
在本发明中，所述改良的雪旺细胞是通过将含有包含5’端特定种子碱基序列非编码小RNA或核苷酸序列的表达载体导入到雪旺细胞中而得到的。
本发明还提供了上述技术方案所述改良的雪旺细胞在制备治疗脊髓在内中枢神经系统损伤的药物中的应用。具体的，本发明所述改良的雪旺细胞一方面可以通过与宿主星形胶质细胞整合，解除常规雪旺细胞治疗脊髓在内中枢神经系统损伤再生修复能力的限制；另一方面，改良的雪旺细胞还能够抑制其周围的星形胶质细胞形成胶质瘢痕形成，进而提高对脊髓在内中枢神经系统损伤再生修复的效果，可用于制备治疗脊髓在内中枢神经系统损伤的药物中。
在本发明中，所述治疗脊髓在内中枢神经系统损伤的药物除了包括改良的雪旺细胞外，还可以包括药学上可接受的辅料。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
大鼠雪旺细胞分离培养与鉴定：
取成年雌性Wistar大鼠(200～250g)坐骨神经，在无菌操作台中于显微镜中用显微镊和眼科剪剥离除去肌肉组织、脂肪、血管和神经外膜。得到白色神经纤维后浸泡在无菌PBS(磷酸缓冲液)中，用眼科剪切成2毫米长度左右的组织块。弃掉液体，加入0.1％I型胶原酶于恒温37℃细胞孵育箱中消化25分钟。弃去I型胶原酶并用无菌PBS清洗残留酶溶液并终止消化反应。用显微镊夹出组织块放到干净细胞培养皿中贴壁于皿底部，加入少量SCM(雪旺细胞培养液：DMEM/F12+10％胎牛血清+成纤维细胞生长因子bFGF+神经营养因子heregulin-β1+腺苷酸环化酶激活剂forskolin)进行培养，每三天更换新鲜培养液，培养第10天有80～90％成纤维细胞生长。待成纤维细胞优先大量增殖爬出组织块时夹出组织块到新的细胞培养皿中直至第30天，雪旺细胞大量增殖且成纤维细胞几乎不存在(培养至第30天，成纤维细胞占比不到10％)。此时，将组织块用0.25％trypsin(胰蛋白酶)消化5分钟，终止反应后离心收集沉淀，用SCM重悬细胞铺于6孔细胞培养板中贴壁培养7天左右。弃掉未贴壁细胞，即分离得到贴壁培养的原代雪旺细胞。
通过倒置相差显微镜鉴定雪旺细胞的形态(轴突细长针状、梭形、二极或三极)。通过细胞免疫荧光鉴定雪旺细胞的标志物(GFAP、sox10、p75NTR)及纯度。
倒置相差显微镜显示的雪旺细胞形态如图1a所示，该细胞轴突细长、胞体较小，细胞通常为二级或三级性状，针状梭型，即表明培养得到了正常的雪旺细胞。
免疫荧光鉴定所得雪旺细胞的标志物GFAP、sox10、p75NTR，的结果如图1b所示，GFAP是胶质纤维酸性蛋白，可作为雪旺细胞的特异性标志物，通过免疫荧光鉴定出所提雪旺细胞的GFAP阳性率可以达到100％；sox10作为雪旺细胞的特异性转录因子，通过免疫荧光鉴定出阳性率达到95％以上；p75NTR是神经营养因子受体，可作为雪旺细胞特异性标志物，其阳性率达到99％以上。
实施例2对比雪旺细胞、星形胶质细胞与正常骨髓细胞中的miR-124-3P含量：
大鼠星形胶质细胞分离培养：
取出生1～3天大鼠乳鼠大脑，于无菌操作台和显微镜下剥离大脑皮层。浸泡在无菌DMEM中。用5ml枪头吹打将大脑皮层组织打碎至均匀无颗粒混悬液。将组织液收集于无菌离心管中离心弃上清收集沉淀。将组织用0.05％胰蛋白酶(trypsin)和DNA酶(Deoxyribonuclease I,Worthington)于37℃消化25分钟。终止消化后用无菌滤网40μm-sterile EASYstrainerTM(Greiner bio-one)过滤得到单细胞悬液。待离心后收集沉淀，用PBS清洗三次。细胞用ASM(星形胶质细胞培养液：DMEM/F12+10％胎牛血清+成纤维细胞生长因子bFGF+转化生长因子TGF-β1+神经细胞生长添加剂N2supplement)铺于细胞培养瓶中于恒温细胞培养箱中贴壁培养。待细胞汇合至80～90％，在恒温震荡箱中震荡2天，每天震荡8小时，去除未贴壁的小胶质细胞和少突胶质细胞等杂细胞。得到的原代星形胶质细胞用于后续实验。
细胞免疫荧光方法：将星形胶质细胞培养至汇合率80％，用4％多聚甲醛固定30分钟，PBS清洗三次。随后用0.1％tritonX-100打孔，PBS清洗三次。用10％山羊血清封闭1小时，随后用星形胶质细胞相关标志物GFAP和S100β抗体封闭，4度过夜。第二天用PBS将一抗洗去，用荧光二抗封闭1小时，PBS清洗三次。随后用Hoechst 33342(Hoechst 33342是一种蓝色荧光染料，可以穿透细胞膜，与细胞核中的dsDNA结合后发出蓝色荧光)染核10分钟，PBS清洗后用在倒置相差荧光显微镜下观察。
分别取雪旺细胞(SCs)、星形胶质细胞(As)以及正常脊髓细胞(spinal cord)，通过实时荧光定量PCR确定雪旺细胞和星形胶质细胞的miR-124-3P表达水平。
实时荧光定量PCR方法(miRNA)：通过QIAzol(Qiagen)试剂盒从原代培养的雪旺细胞、星形胶质细胞和正常脊髓组织中分别提取总RNA。通过All-in-OneTM First-StrandcDNA Synthesis Kit将RNA进行逆转录合成cDNA。反转录体系为：1000ng总RNA，1μl 2.5U/μl Poly A Polymerase，1μl RTase Mix,5μl 5×PAP/RT Buffer，用double distilledwater将体系补充至25μl。反转录反应设置为37℃反应60分钟，85℃反应5分钟。通过All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Reagent Kit进行荧光定量PCR反应。体系为：2μl 2×All-in-One qPCR Mix,2μl cDNA(100-1000ng,稀释比例1:5),0.4μl ROX Reference Dye,2μlmiR-124-3P forward primer,2μl Universal Adaptor PCR Primer(2uM)和3.6μl doubledistilled water。将体系放入荧光定量PCR反应仪器Applied Biosystem 7300 Plus中进行实时荧光定量PCR反应，温度设定为95℃预变性10分钟，95℃变性反应10秒以及60℃复性反应20秒作为一个反应循环，共40个循环，最后72℃延伸反应10秒。通过AppliedBiosystem 7300 Plus Real-time PCR System software进行荧光定量结果分析并通过2-△△Ct的方法进行结果定量统计。
结果如图2a所示，图2a左图为Hoechst 33342染色星形胶质细胞后对星形胶质细胞标志物GFAP的观测结果，可以看出通过免疫荧光鉴定出GFAP阳性率可以达到99％，右图为Hoechst 33342染色星形胶质细胞后对星形胶质细胞标志物S100β的观测结果。可以看出通过免疫荧光鉴定出S100β阳性率可以达到95％。可以看出成功提出原代培养的星形胶质细胞并用于后续实验。
图2b为实时荧光定量PCR检测雪旺细胞和星形胶质细胞的miR-124-3P表达水平的结果，其中雪旺细胞(SCs)中miR-124-3P的相对表达量为1、星形胶质细胞(As)中miR-124-3P的相对表达量为1.2及正常脊髓细胞中miR-124-3P的相对表达量为8.7。可以看出，雪旺细胞和星形胶质细胞中miR-124-3P的相对表达量显著低于正常脊髓组织。
实施实例3
2以慢病毒为例：慢病毒转染雪旺细胞以获得改良的雪旺细胞
2.1构建改良的雪旺细胞(高表达miR-124-3P的雪旺细胞)
2.1.1委托上海吉凯基因化学技术有限公司构建滴度、稳定表达miR-124-3P的慢病毒GV309，得到miR-124-3P慢病毒载体。所得miR-124-3P慢病毒载体毒滴度为6E+8，miR-124-3P的表达量是转染前的4倍左右。
2.1.2确定最佳MOI值(感染复数)。
将miR-124-3P慢病毒载体分别以1、10、25、50、75梯度MOI值感染雪旺细胞，48小时后感染效率超过80％且细胞毒性最小的MOI值(MOI＝50)为最佳MOI值，用于后续实验。
2.1.3确定构建稳定高表达miR-124-3P的雪旺细胞。
将miR-124-3P慢病毒载体以MOI＝50来感染步骤1中培养得到的雪旺细胞48小时、96小时和7天三个时间点(miR-124-3P-48h、miR-124-3P-72h以及miR-124-3P-7d)，并设置空白对照组(WT-48h)和阴性对照组(NC-48h)：WT-48h为不转染病毒培养48小时；NC-48h为转染携带对照序列的慢病毒培养48小时。
通过实时荧光定量PCR检测慢病毒感染后的各组雪旺细胞与阴性对照组相比雪旺细胞中miR-124-3P的表达增高倍数。
检测结果如图3a和3b所示，由图3a可以看出按照MOI值为50，感染携带miR-124-3P的慢病毒的雪旺细胞和感染对照序列的慢病毒的雪旺细胞均被病毒感染且发绿色荧光。细胞形态与对照组相比仍维持雪旺细胞的细胞特性。由图3b可以看出在雪旺细胞在慢病毒感染48小时后，其miR-124-3P的表达量提高3.4倍；感染96小时后，miR-124-3P的表达量提高4.3倍，感染7天后，miR-124-3P的表达量提高4.1倍。说明雪旺细胞感染慢病毒后其miR-124-3P能够稳定持续高表达。
2.2检测miR-124-3P对雪旺细胞生物学特性的影响
2.2.1检测基因水平变化。
改良的雪旺细胞(miR-124-3P-48h)：按照MOI值为50，将miR-124-3P慢病毒载体感染步骤1培养的雪旺细胞感染48h，得到miR-124-3P表达量为提高3～4倍的改良的雪旺细胞。
设置空白对照组(WT-48h)和阴性对照组(NC-48h)。
通过RNA提取试剂盒提取改良的雪旺细胞、空白对照组和阴性对照组的总RNA，反转录为cDNA，通过PCR检测各组雪旺细胞GFAP、sox10、Krox20的表达；通过实时荧光定量PCR检测雪旺细胞分泌神经营养因子NT-3、BDNF、NGF、CNTF表达。
RT-PCR方法：通过QIAzol(Qiagen)试剂盒从改良的雪旺细胞、空白对照组和阴性对照组中分别提取总RNA。通过TransScript One-step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix(Transgen)A将RNA进行反转录合成cDNA。反转录体系为500ng总RNA,1μl Anchored Oligo(dT)18primer(0.5μg/μl),10μl 2×TS Reaction Mix,1μlTransScript RT/RI Enzyme Mix以及1μl gDNA Remover，用double distilled water将体系补充至20μl。反转录反应温度设定为：42℃反应30分钟，85℃反应5分钟，此合成的DNA用于PCR反应；42℃反应15分钟，85℃反应5分钟，此合成的cDNA用于荧光定量PCR反应。通过2×Easytaq PCR SuperMix(+Dye)(Transgen)进行PCR反应，PCR反应体系为0.8μl cDNA,0.4μl Forward Primer,0.4μl Reverse Primer,10μl 2×Easytaq PCR SuperMix(+Dye)以及8.4μl double distilled water。反应温度设定：94℃预变性反应5分钟，94℃变性反应30秒以及引物复性温度下反应30秒为一个循环共反应35个循环，72℃延伸反应30秒。将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳得到电泳图，通过ImageJ分析电泳图灰度值得到半定量结果统计。
实时荧光定量PCR方法：将上述提到的反转录得到用于实时荧光定量PCR的cDNA进行荧光定量PCR反应。用ChamQTM Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)进行荧光定量PCR，反应体系为：10μl ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(2×),0.4μl ForwardPrimer(10μM),0.4μl Reverse Primer(10μM)，2μl cDNA以及7.2μl double distilledwater。反应温度设定为95℃预变性反应秒，95℃变性反应10秒以及60℃复性反应30秒为一个循环共反应40个循环，60℃延伸反应。将体系通过Applied Biosystem 7300 Plus Real-time PCR System software进行荧光定量结果分析并通过2-△△Ct的方法进行结果定量统计。
结果如图4a所示：图4a中雪旺细胞的标志物krox20在基因水平表达量是对照组的0.5倍，GFAP和sox10分别是对照组表达量的0.6倍。由右图可以看出，改良的雪旺细胞相对于空白对照组和阴性对照组而言，改良的雪旺细胞中基因GFAP、sox10、Krox20表达显著降低。
结果如图4b所示：图4b中通过荧光定量PCR检测出NT-3和BDNF表达量分别提高4.5倍和5倍。相对于空白对照组和阴性对照组而言，改良的雪旺细胞中分泌神经营养因子NT-3和BDNF显著高表达，而CNTF和NGF表达无显著变化。
2.2.2检测蛋白水平变化。通过蛋白免疫印迹(Western blot)检测雪旺细胞标记蛋白GFAP、sox10、Krox20表达。
结果如图4c所示：图4c中雪旺细胞的标志物GFAP在蛋白水平表达量是对照组0.3倍，krox20的表达量是对照组的0.47倍。无显著差异的sox10是对照组表达量的0.68倍。由右图可以看出，改良的雪旺细胞相对于空白对照组和阴性对照组而言，改良的雪旺细胞中的GFAP和Krox20表达显著降低
2.2.3检测细胞增殖。通过EdU细胞增殖实验检测细胞增殖情况。
图4d中对照组DNA合成率在13％，而改良的雪旺细胞其DNA合成率在12.6％，无显著差异。由图4d可以看出，改良的雪旺细胞相对于空白对照组和阴性对照组而言，EdU法检测改良的雪旺细胞的增殖能力与空白对照组和阴性对照组相比无显著差异，说明miR-124-3P对雪旺细胞的生长无明显影响，即无毒性影响。
3检测miR-124-3P促进雪旺细胞与星形胶质细胞相容整合
3.1通过边界实验确定miR-124-3P促进雪旺细胞与星形胶质细胞相容整合。
用玻璃刀在12孔细胞培养板背面中心处划一竖直中线，分别取步骤2.2中制备的改良的雪旺细胞(1×105细胞数/20μl)和星形胶质细胞(3×104细胞数/20μl)两种细胞悬液各20微升滴于孔板中的中线左右两侧。在无菌操作台中用高压过的玻片分别将液滴涂抹至中线边缘两侧，直至两种细胞悬液之间留有大约0.3mm间隙。设置感染NC-EGFP的雪旺细胞与星形胶质细胞的边界实验作为阴性对照。
将改良的雪旺细胞和星形胶质细胞在细胞孵育箱中培养1小时左右，待细胞贴壁后加入DMEM洗去未贴壁细胞。加入新鲜含10％胎牛血清的培养基培养两周，两种细胞(改良的雪旺细胞和星形胶质细胞)向彼此方向汇合生长。用4％多聚甲醛固定细胞，随后通过细胞免疫荧光技术检测雪旺细胞和星形胶质细胞相容整合情况，转染慢病毒的雪旺细胞标记EGFP显现绿色荧光，星形胶质细胞通过GFAP标记显现红色荧光。在荧光显微镜下观察雪旺细胞与星形胶质细胞向彼此方向迁移的最远距离，以及雪旺细胞与星形胶质细胞的迁移面积(即通过ImageJ统计荧光面积)。
结果如图5所示：由图5a、5b可以看出，本发明提供的改良的雪旺细胞与星形胶质细胞发生了相容整合，而阴性对照组中感染NC-EGFP的雪旺细胞与星形胶质细胞之间形成清晰的边界，无法整合。
由图5c、5d可以看出，通过ImageJ统计，与阴性对照组相比，改良的雪旺细胞与星形胶质细胞向彼此方向的迁移的最远距离显著增加，且改良的雪旺细胞与星形胶质细胞向彼此方向迁移的面积与阴性对照组相比也显著增高。
4检测miR-124-3P抑制星形胶质细胞形成胶质瘢痕
4.1通过Transwell小室实验模拟细胞移植的体内微环境，检测高表达miR-124-3P的雪旺细胞抑制星形胶质细胞形成胶质瘢痕。
在康宁Transwell细胞培养小室中的上层小室培养高表达miR-124-3P的雪旺细胞(试验组)：先将原代培养的星形胶质细胞用0.05％胰蛋白酶消化下来，终止消化后以1×105个每孔铺在康宁Transwell细胞培养小室六孔板下层小室中，体系培养于2.6mL含10％胎牛血清的培养液中；再将转染病毒的雪旺细胞用0.25％胰蛋白酶消化下来，终止消化后以3×105个每孔铺在上层小室中，体系培养于1.5mL含10％胎牛血清的培养液中。整个小室培养5～7天。
感染NC-EGFP的雪旺细胞作为阴性对照，不感染病毒的雪旺细胞作为空白对照；细胞培养小室的下层小室培养星形胶质细胞，体系培养于含10％胎牛血清的培养液中培养5～7天。提取星形胶质细胞的总RNA通过实时荧光定量PCR检测星形胶质细胞标记基因的表达变化(GFAP、sox9和S100β)。提取星形胶质细胞的总蛋白通过蛋白免疫印迹(Westernblot)检测星形胶质细胞标志物的表达变化(GFAP、sox9、stat3和p-stat3)。
结果如图6所示，由图6a、6b可以看出，3D共培养体系在含10％胎牛血清的DMEM中培养5-7天后，通过荧光显微镜观察雪旺细胞仍然感染慢病毒并表达；
由图6c可以看出，实时荧光定量PCR检测试验组和阴性对照组、空白对照组中的星形胶质细胞标记基因GFAP、sox9、S100β基因水平表达无显著差异；
由图6d可知，星形胶质细胞标志物GFAP表达量蛋白水平是对照组的0.48倍；p-STAT3是对照组的0.56倍，具有显著性差异。STAT3和sox9均与对照组相比表达量是1.1倍。由图6d可以看出，Western blot检测试验组和阴性对照组、空白对照组中的星形胶质细胞特异性标志物GFAP表达下调，sox9表达无显著差异，p-STAT3表达下调，说明miR-124-3P-SC抑制星形胶质细胞形成瘢痕的细胞学特性。
由以上实施例可知，通过提高雪旺细胞中miR-124-3P的表达量可以改变雪旺细胞的生物学标志物表达情况，具有促进雪旺细胞与星形胶质细胞相容整合的作用，同时还能够抑制其周围的星形胶质细胞形成胶质瘢痕。利用高表达miR-124-3P的雪旺细胞可有效提高对脊髓在内中枢神经系统损伤的修复效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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Claims (3)

1.一种miR-124的成熟体miR-124-3P在制备促进雪旺细胞与星形胶质细胞相容整合的药物中的应用，其特征在于，在雪旺细胞中过表达，使得miR-124-3P的表达量提高3倍以上；所述miR-124-3P的核苷酸序列为5’-uaaggcacgcggugaaugcc-3’。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，向雪旺细胞中转入含有miR-124-3P的表达载体，使得miR-124-3P在细胞中过表达。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述表达载体的类型包括质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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