CN112972497A - 一种外泌体活性制剂的制备方法及其应用 - Google Patents

一种外泌体活性制剂的制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112972497A
CN112972497A CN202110382445.0A CN202110382445A CN112972497A CN 112972497 A CN112972497 A CN 112972497A CN 202110382445 A CN202110382445 A CN 202110382445A CN 112972497 A CN112972497 A CN 112972497A
Authority
CN
China
Prior art keywords
exosome
brain barrier
centrifugation
blood brain
minutes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110382445.0A
Other languages
English (en)
Inventor
董晓华
李心远
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Tong Ren Hospital
Original Assignee
Shanghai Tong Ren Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Tong Ren Hospital filed Critical Shanghai Tong Ren Hospital
Priority to CN202110382445.0A priority Critical patent/CN112972497A/zh
Publication of CN112972497A publication Critical patent/CN112972497A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons

Abstract

本发明公开了一种促血脑屏障修复的外泌体活性制剂的制备方法及其应用。用来源于新出生小鼠大脑皮层神经元原代细胞培养上清，通过超高速离心获得。将小鼠大脑皮层组织经胰酶消化后铺板培养，收集大脑皮层神经元培养上清，利用低温离心机经反复离心后，将离心得到的外泌体溶于PBS中。通过粒径分析仪分析大脑皮层神经元细胞分泌的外泌体浓度以及外泌体大小，将外泌体通过CCV注射到血脑屏障损伤的斑马鱼模型中，可通过促进血管新生方式有效修复血脑屏障损伤，降低头部血细胞流出量。因此，本发明公开的新生小鼠大脑皮层神经元原代细胞分泌外泌体可在促进血管新生、促进血脑屏障损伤修复，可用于制备促血脑屏障修复的药物或试剂。

Description

一种外泌体活性制剂的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及外泌体活性制剂领域，特别是涉及一种促血脑屏障损伤修复的外泌体活性制剂制备方法及其应用。
背景技术
血脑屏障是中枢神经系统特有的由血管内皮细胞、星形细胞、周细胞和临近神经元构成的一种独特而完整的细胞网络结构；其对维持中枢神经系统内环境稳态、控制物质交换、调节细胞运输方面至关重要。在临床上，急性缺血性中风后，代谢紊乱和能量失衡在细胞水平上引起继发性损伤，如炎症反应、氧化应激反应等，导致神经元，神经胶质细胞和血管细胞的死亡。其中，血脑屏障损伤和功能障碍是脑卒中常见的病理特征。脑卒中缺血再灌注后，血液中的炎症细胞通过受损的血脑屏障进入缺血区域，分泌大量炎症因子，如NF-κB、白细胞介素等进一步介导缺血再灌注区域的损伤，导致缺血性卒中的高死亡率，严重影响卒中患者预后。目前，针对脑卒中采用溶栓治疗、神经保护治疗、血管内治疗等治疗方式，但尚缺乏针对血脑屏障损伤修复的有效治疗方式。
国家1类创新药依达拉奉右莰醇注射用浓溶液具有保护血脑屏障作用，在减轻缺血再灌注损伤中发挥神经保护作用，但该类药目前在中国使用率较低，且疗效也不如预期。
因此，积极寻找新型、有效、无毒副作用的靶向保护血脑屏障修复手段对急性缺血性卒中的治疗十分必要。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种促血脑屏障损伤修复的外泌体活性制剂的制备方法，具体方案如下：
取新出生第0天的小鼠大脑皮层组织，经0.05-0.5％胰酶消化后铺板，培养后收集大脑皮层神经元培养上清，利用低温离心机首次离心5-30分钟；之后取上清第二次离心，时间为20-50分钟；再次取上清第三次离心10-80分钟；继续取上清第四次离心50-100分钟；最后取沉淀PBS溶解后第五次离心50-100分钟后弃上清，将离心得到的外泌体溶于PBS中，即可制得促血脑屏障损伤修复的外泌体活性制剂；
优选地，所述的小鼠具体为C57BL/6小鼠；
优选地，所述的胰酶浓度为0.25％；
优选地，所述的收集大脑皮层神经元的时间为第4天及第7天；
其中，所述的低温离心机的离心温度为4℃；
优选地，所述的首次离心具体为320g离心10分钟；
优选地，所述的第二次离心具体为2000g离心15分钟；
优选地，所述的第三次离心具体为10,000g离心30分钟；
优选地，所述的第四次离心为100,000g离心70分钟；
优选地，所述的第五次离心为100,000g离心70分钟；
本发明的第二个目的在于，提供了一种将外泌体活性制剂在制备促血脑屏障损伤修复的药物方面的应用。
本发明的有益效果
本发明中的促血脑屏障损伤修复的外泌体活性制剂具有无毒副作用、稳定、易保存、可量产等显著优势。
附图说明
图1为试验例1中促血脑屏障损伤修复的外泌体活性制剂的粒径分析结果图。
图2为试验例2中促血脑屏障损伤修复的外泌体活性制剂的电镜分析结果图。
图3为试验例3中促血脑屏障损伤修复的外泌体活性制剂可用于修复脑屏障损伤结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明中的DMEM、F12K和Neurobasal培养基及PDL试剂、FBS血清、B27、Glutamax、0.25％胰酶均购自美国Gibco公司。
实施例1促血脑屏障修复的外泌体活性制剂的制备
取新出生第0天的C57BL/6小鼠的大脑皮层组织，经0.25％胰酶消化后铺板，在培养的第4天及第7天收集大脑皮层神经元培养上清，利用低温离心机在离心温度为4℃行下述离心步骤：320g离心10分钟，取上清2000g离心15分钟，取上清10,000g离心30分钟，取上清100,000g离心70分钟，取沉淀PBS溶解后100,000g离心70分钟后弃上清，将离心得到的外泌体溶于PBS中，即可制得促血脑屏障修复的外泌体活性制剂。
实施例2促血脑屏障修复的外泌体活性制剂的稀释
将实施例1中制备得到的促血脑屏障修复的外泌体活性制剂用无菌PBS溶液稀释至20ul，-80℃储存备用。
试验例1促血脑屏障损伤修复的外泌体活性制剂的粒径分析
取10μl实施例2制备的外泌体稀释至终体积100μl的1X PBS缓冲液中，使用ZetaView PMX 110仪器(德国)上机测试并利用对应ZetaView 8.04.02软件进行分析。
结果如图1所示，离心所得外泌体粒径大小在127±80nm。
试验例2促血脑屏障损伤修复的外泌体活性制剂的电镜分析
取10μl实施例2制备的分离的外泌体活性制剂置于formvar/碳涂层铜网格上10分钟，并在1％戊二醛中固定10分钟，用水洗涤，并在室温下醋酸铀/甲基纤维素混合物中10分钟以使外泌体部分呈阴性染色，用JEM-1011透射电子显微镜下检测外泌体特征。
结果如图2所示，小鼠神经元外泌体在透射电镜下形态为圆形囊泡。
试验例3检测对血脑屏障损伤修复的效果
在血脑屏障损伤斑马鱼模型发育至30hpf时，将实施例2制备的外泌体制剂经斑马鱼总主静脉注射至斑马鱼血液循环系统，在观察血脑屏障损伤时，将10mg/ml DAPI经斑马鱼总主静脉注射至斑马鱼血液循环系统，采用ZEISS 880激光共聚焦观察斑马鱼中枢神经系统DAPI标记的红细胞泄漏数量来评估外泌体对血脑屏障损伤的修复。
结果如图3所示，通过统计DAPI标记的红细胞泄漏数量，注射外泌体组的血脑屏障损伤斑马鱼中枢神经系统血管的漏血量明显减少，减少了81.7％，表明本申请制备得到的新生小鼠大脑皮层神经元细胞分泌的外泌体制剂可显著修复血脑屏障损伤。

Claims (4)

1.一种促血脑屏障损伤修复的外泌体活性制剂的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
取新出生第0天的小鼠大脑皮层组织，经0.05-0.5％胰酶消化后铺板，培养后收集大脑皮层神经元培养上清，利用低温离心机首次离心5-30分钟；之后取上清第二次离心，时间为20-50分钟；再次取上清第三次离心10-80分钟；继续取上清第四次离心50-100分钟；最后取沉淀PBS溶解后第五次离心50-100分钟后弃上清，将离心得到的外泌体溶于PBS中，即可制得促血脑屏障损伤修复的外泌体活性制剂。
2.一种如权利要求1所述的促血脑屏障损伤修复的外泌体活性制剂的制备方法，其特征在于：
其中，所述的小鼠具体为C57BL/6小鼠；
其中，所述的胰酶浓度为0.25％；
其中，所述的收集大脑皮层神经元的时间为第4天及第7天。
3.一种如权利要求1所述的促血脑屏障损伤修复的外泌体活性制剂的制备方法，其特征在于：
其中，所述的低温离心机的离心温度为4℃；
其中，所述的首次离心具体为320g离心10分钟；
其中，所述的第二次离心具体为2000g离心15分钟；
其中，所述的第三次离心具体为10,000g离心30分钟；
其中，所述的第四次离心为100,000g离心70分钟；
其中，所述的第五次离心为100,000g离心70分钟。
4.一种将权利要求1制备得到的外泌体活性制剂在制备促血脑屏障损伤修复的药物方面的应用。
CN202110382445.0A 2021-04-09 2021-04-09 一种外泌体活性制剂的制备方法及其应用 Pending CN112972497A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110382445.0A CN112972497A (zh) 2021-04-09 2021-04-09 一种外泌体活性制剂的制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110382445.0A CN112972497A (zh) 2021-04-09 2021-04-09 一种外泌体活性制剂的制备方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112972497A true CN112972497A (zh) 2021-06-18

Family

ID=76339580

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110382445.0A Pending CN112972497A (zh) 2021-04-09 2021-04-09 一种外泌体活性制剂的制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112972497A (zh)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101234121A (zh) * 2008-03-05 2008-08-06 山东大学 马齿苋酰胺类生物碱在制备抗氧化和神经元保护剂中的应用
CN109097328A (zh) * 2018-08-24 2018-12-28 深圳市浊安认证生物技术有限公司 一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法
CN109694882A (zh) * 2018-12-27 2019-04-30 吉林大学 包含5’端特定种子碱基序列的miR的应用、改良的雪旺细胞及其应用
CN109701038A (zh) * 2019-02-22 2019-05-03 上海大学 一种脑部靶向外泌体、其制备方法及应用
WO2020125447A1 (zh) * 2018-12-18 2020-06-25 深圳先进技术研究院 无创超声处理细胞在制备外泌体中的应用、外泌体及其制备方法和应用
CN111621558A (zh) * 2020-06-10 2020-09-04 南通大学 与血脑屏障破坏程度相关的血清外泌体miR-410-3p的应用及其检测方法
US20200297750A1 (en) * 2017-11-14 2020-09-24 Henry Ford Health System Compositions for use in the treatment and prevention of cardiovascular disorders resulting from cerebrovascular injury
CN111936628A (zh) * 2018-03-20 2020-11-13 清华大学 阿尔茨海默病动物模型及其应用
US20200362057A1 (en) * 2019-05-16 2020-11-19 Snake River Bioscience, Inc. Compositions and methods for the treatment of major depressive disorder

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101234121A (zh) * 2008-03-05 2008-08-06 山东大学 马齿苋酰胺类生物碱在制备抗氧化和神经元保护剂中的应用
US20200297750A1 (en) * 2017-11-14 2020-09-24 Henry Ford Health System Compositions for use in the treatment and prevention of cardiovascular disorders resulting from cerebrovascular injury
CN111936628A (zh) * 2018-03-20 2020-11-13 清华大学 阿尔茨海默病动物模型及其应用
CN109097328A (zh) * 2018-08-24 2018-12-28 深圳市浊安认证生物技术有限公司 一种特异性的间充质干细胞外泌体提取方法
WO2020125447A1 (zh) * 2018-12-18 2020-06-25 深圳先进技术研究院 无创超声处理细胞在制备外泌体中的应用、外泌体及其制备方法和应用
CN109694882A (zh) * 2018-12-27 2019-04-30 吉林大学 包含5’端特定种子碱基序列的miR的应用、改良的雪旺细胞及其应用
CN109701038A (zh) * 2019-02-22 2019-05-03 上海大学 一种脑部靶向外泌体、其制备方法及应用
US20200362057A1 (en) * 2019-05-16 2020-11-19 Snake River Bioscience, Inc. Compositions and methods for the treatment of major depressive disorder
CN111621558A (zh) * 2020-06-10 2020-09-04 南通大学 与血脑屏障破坏程度相关的血清外泌体miR-410-3p的应用及其检测方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BING XU等: "Neurons secrete miR-132-containing exosomes to regulate brain vascular integrity", 《CELL RESEARCH》, pages 892 *
DENG ZHITING等: "Ultrasound-mediated augmented exosome release from astrocytes alleviates amyloid-β-induced neurotoxicity", 《THERANOSTICS》, vol. 11, no. 9, XP093038491, DOI: 10.7150/thno.52436 *
LAURA GOETZL等: "Diagnostic Potential of Neural Exosome Cargo as Biomakers for Acute Brain Injury", 《ANNALS》, vol. 5, no. 1 *
PARK SEYEON等: "Neuroblastoma SH-SY5Y cell-derived exosomes stimulate dendrite-like outgrowths and modify the differentiation of A375 melanoma cells", 《CELL BIOLOGY INTERNATIONAL》, vol. 39, no. 4 *
刘洪悦等: "人结肠癌来源的间充质干细胞通过分泌外泌体促进结肠癌发生发展的机制研究", 《中国药学杂志》, vol. 55, no. 12 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhou et al. A comparison of the use of adipose-derived and bone marrow-derived stem cells for peripheral nerve regeneration in vitro and in vivo
EP2289526B1 (en) Muscle derived cells (mdcs) for promoting and enhancing nerve repair and regeneration.
JP5385219B2 (ja) 造血幹細胞及び該細胞を使用して眼の新生血管の疾患を治療する方法
US20110217385A1 (en) Method for extracting mesenchymal stem cell from human or animal embryo and for extracting the secretion product thereof
JP6077996B2 (ja) 神経変性性疾患および／または障害を処置および／または逆転させるための方法
CN104825491A (zh) 利用骨髓间充质干细胞和/或多能干细胞的血中动员的组织再生促进剂
Wang et al. Mesenchymal stem cell therapy improves diabetic cardiac autonomic neuropathy and decreases the inducibility of ventricular arrhythmias
CN111467373A (zh) 一种牙髓干细胞外泌体制剂、制备方法及其应用
CN115125198A (zh) 一种人脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用
Xie et al. In vitro expanded skeletal myogenic progenitors from pluripotent stem cell-derived teratomas have high engraftment capacity
CN112972497A (zh) 一种外泌体活性制剂的制备方法及其应用
CN108774633A (zh) 一种用于脑梗死治疗同时可被磁共振及荧光成像双模态示踪的神经干细胞制剂
CN106606512B (zh) 一种用于治疗心肌梗死的混合细胞制剂及制备方法与应用
WO2023165062A1 (zh) 一种少突胶质细胞的制备方法及应用
WO2012034348A1 (zh) 逆向分化体细胞产生造血干细胞的培养液、方法及用途
CN112175902B (zh) 一种脂肪干细胞的分离方法
US20190136195A1 (en) Composition for treating tendonitis and manufacture thereof
CN106065401A (zh) 慢病毒介导cxcr7高表达工程化内皮祖细胞在缺血性疾病中的治疗应用
Liang et al. Perfusable adipose decellularized extracellular matrix biological scaffold co-recellularized with adipose-derived stem cells and L6 promotes functional skeletal muscle regeneration following volumetric muscle loss
WO2023217130A1 (zh) 包含骨骼肌前体样细胞的生物制剂及其制备方法和应用
CN114990068B (zh) 一种脐带间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用
CN108795987A (zh) 一种FerritinH、Bcl2及EGFP基因联合修饰的神经干细胞制备方法及应用
CN115197905B (zh) 活化血小板在制备促进间充质干细胞迁移产品中的应用
WO2003060107A1 (fr) Separation, preparation et utilisation de cellules souches de ganglions spinaux (drg) d'embryons humains
CN116270742A (zh) MitoQ和MSCs的细胞混合制剂及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination