CN109701038A - 一种脑部靶向外泌体、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脑部靶向外泌体，包括能够穿过血脑屏障的外泌体和具有成像功能的荧光材料，所述荧光材料分布在所述外泌体的内腔中。本发明还公开一种脑部靶向外泌体的制备方法，包括：使具有脑部靶向的神经干细胞分泌带有脑部靶向肽的外泌体；收集并纯化所述外泌体；使荧光材料进入所述外泌体的内腔中，从而获得脑部靶向外泌体。本发明提供的脑部靶向外泌体主要由天然材料形成，具有通过血脑屏障的作用，可以克服传统纳米粒子过血脑屏障效率低、有毒副作用的问题，以及克服传统粒子的脑部靶向的困难，为治疗脑相关疾病如创伤性脑损伤、脑肿瘤等提供一种可视化和精准化的治疗策略。

Description

一种脑部靶向外泌体、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及纳米生物材料领域，具体涉及一种脑部靶向外泌体及其在脑部疾病治疗中的应用。

背景技术

近年来，创伤性脑损伤(Traumatic brain injury，TBI)成为仅次于与脑卒中的神经系统疾病，成为世界范围内引起死亡和残疾的原因之一，TBI起初是初级创伤，继而随着时间的推移，TBI成为继发性脑损伤，这会导致一系列的病理生理反应，在原发性损伤后导致循环系统障碍，血脑屏障破坏，神经元死亡和随后的神经功能障碍。

研究表明除了传统的脂质体载药的治疗方式外，现在外泌体(exosome)作为细胞膜内陷形成的一种大小介于30-100nm的细胞囊泡受到大家的关注，外泌体里面包含脂质，蛋白和核酸，神经干细胞分泌的外泌体，包含神经干细胞内的一些核酸、脂质和蛋白，实验证明神经干细胞外泌体能够延缓衰老，即神经干细胞分泌的外泌体具有部分神经干细胞的特性；是一种天然的磷脂双分子层，并且可以穿过血脑屏障，这成为外泌体治疗创伤性脑损伤的一大优势。目前已经成功输送的药物有核酸类(miRNA，mRNA，siRNA等)，抗癌类药物(阿霉素，紫杉醇等)以及抗炎类药物(姜黄素等)。足见外泌体在治疗创伤性脑损伤的治疗应用上具有很大前景。

然而，现在生物医学影像技术比较单一，创伤性脑损伤的愈后检测不全面，而现在活体成像技术受到关注，因此，开发出既可以精准治疗的天然药物递送系统，同时可以实现实时监测的可视化的治疗，成为目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上现状，提供一种脑部靶向外泌体、其制备方法及应用，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种脑部靶向外泌体，包括能够穿过血脑屏障的外泌体和具有成像功能的荧光材料，所述荧光材料分布在所述外泌体的内腔中。

本发明实施例还提供了一种脑部靶向外泌体的制备方法，包括：

使具有脑部靶向的神经干细胞分泌带有脑部靶向肽的外泌体；

收集并纯化所述外泌体；

使荧光材料进入所述外泌体的内腔中，从而获得脑部靶向外泌体。

本发明实施例还提供了所述的脑部靶向外泌体或由所述的制备方法制备的脑部靶向外泌体于治疗脑部疾病中的用途。

与现有技术相比，本发明的优点包括：

利用基因改造的方法使神经干细胞先具有靶向脑部的作用，具有脑部靶向的神经干细胞分泌带有靶向肽的外泌体，因近红外荧光量子点能够实现近红外II区的成像，外泌体可以通过载入荧光材料，例如载入近红外II区量子点以实现活体成像，外泌体内腔还可以载入不同的水溶性药物。

脑部靶向外泌体具有通过血脑屏障的作用，可以克服传统纳米粒子过血脑屏障效率低的问题，不仅提供了一种通过血脑屏障的天然材料，还克服了传统纳米粒子的一些毒副作用，并且通过本方法制备的靶向肽使得外泌体更好地靶向脑部，克服了传统粒子的脑部靶向的困难，为治疗脑相关疾病如创伤性脑损伤、脑肿瘤等提供一种可视化和精准化的治疗策略。

附图说明

图1a、1b、1c是本发明实施例的慢病毒感染293T-17图；

图2是本发明实施例的慢病毒滴度测定图；

图3a、3b、3c是本发明实施例的慢病毒感染神经干细胞荧光图；

图4是本发明实施例的外泌体的电镜图；

图5是本发明实施例的活体成像图；

图6是本发明实施例中脑部靶向外泌体的制备流程图。

具体实施方式

下文将对本发明的技术方案作更为详尽的解释说明。但是，应当理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

本发明实施例的一个方面提供的一种脑部靶向外泌体，其特征在于包括能够穿过血脑屏障的外泌体和具有成像功能的荧光材料，所述荧光材料分布在所述外泌体的内腔中。

在一些实施方案中，所述荧光材料包括量子点。

在一些较为优选的实施方案中，所述量子点的荧光发射位于近红外II区，其中发射波长在1050-1700nm之间。

在一些较为优选的实施方案中，所述量子点选自谷胱甘肽修饰的近红外II区的量子点。

在一些较为优选的实施方案中，所述量子点包括Ag₂S、Ag₂Se、Ag₂Te、InAs、InSb、GbSb和Ag₂Se_xS_1-x中的任意一种或两种以上的组合，其中x取值为0.1-0.9。

本发明实施例的另一个方面还提供一种脑部靶向外泌体的制备方法，包括：

使具有脑部靶向的神经干细胞分泌带有脑部靶向肽的外泌体；

收集并纯化所述外泌体；

使荧光材料进入所述外泌体的内腔中，从而获得脑部靶向外泌体。

其中，外泌体来源于基因工程改造的神经干细胞，可以通过基因工程的方法先改造神经干细胞，使神经干细胞细胞膜表面携带靶向脑部的靶向肽。具有脑部靶向改造的神经干细胞分泌的带有脑部靶向肽的外泌体，具有穿过血脑屏障的功能，可治疗创伤性脑损伤，这样一种天然的纳米囊泡能够实现低毒副作用，高效性和精准性的治疗。

荧光材料用于可视化和成像。荧光材料标记外泌体，荧光材料进入带有靶向肽的外泌体的亲水性内腔，实现实时监测创伤性脑损伤可视化的治疗，提高传统的生物医学影像的缺陷，是一种活体荧光成像。

在一些实施方案中，所述具有脑部靶向的神经干细胞的制备方法包括：

将带有靶向肽的慢病毒感染神经干细胞，得到具有脑部靶向的神经干细胞。

在一些较为优选的实施方案中，具体包括：构建慢病毒的三质粒系统，使所述慢病毒的三质粒系统感染293T-17细胞，得到带有靶向肽的慢病毒。

在一些具体的实施方案中，所述具有脑部靶向的神经干细胞的制备方法包括：

提取神经干细胞；

构建慢病毒的三质粒系统，使所述慢病毒的三质粒系统感染293T-17细胞，得到带有靶向肽的慢病毒；

将所述带有靶向肽的慢病毒感染神经干细胞，得到具有脑部靶向的神经干细胞。

其中，利用基因工程的方法改造神经干细胞，通过构建慢病毒的三质粒系统，通过感染293T-17细胞获得带有目的基因的慢病毒，再将慢病毒感染神经干细胞，使神经干细胞带有靶向性，即具有脑部靶向的神经干细胞能够分泌带有脑部靶向肽的外泌体。

进一步地，所述慢病毒的三质粒系统的组成包括pMD2.G、psPAX2和目的质粒脑部靶向肽NFL。

其中，慢病毒三质粒系统感染293T-17细胞，能够包装更多的带有靶向肽的慢病毒。包装完成的慢病毒感染神经干细胞，使得神经干细胞表达目的基因，从而使具有脑部靶向的神经干细胞能够分泌带有脑部靶向肽的外泌体。

在一些实施方案中，所述脑部靶向肽包括Angiopep-2、ApoE、RVG、细胞穿膜肽和NFL中的任意一种或两种以上的组合。

脑部的靶向肽选择多样，有很多种，比如临床上使用的Angiopep-2，ApoE，还有比较广泛应用的狂犬病病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein，RVG)、细胞穿膜肽CPP，以及神经干细胞的靶向肽NFL；

优选的，RVG作为一种神经元和神经上皮细胞的靶向肽，NFL作为一种神经干细胞的靶向肽。

优选的，选择靶向神经干细胞的NFL肽，可以靶向脑部的神经干细胞，使得脑部的神经干细胞在创伤性脑损伤的部位起作用。

在一些实施方案中，所述荧光材料包括荧光发射位于近红外区的量子点。

在一些较为优选的实施方案中，所述量子点的荧光发射位于近红外II区，其中发射波长在1050-1700nm之间。

在一些较为优选的实施方案中，所述量子点选自谷胱甘肽修饰的近红外II区的量子点。

在一些较为优选的实施方案中，所述量子点包括Ag₂S、Ag₂Se、Ag₂Te、InAs、InSb、GbSb和Ag₂Se_xS_1-x中的任意一种或两种以上的组合，其中x取值为0.1-0.9。

在一些具体的实施方案中，外泌体的标记方法是利用新型近红外II区Ag₂S荧光量子点标记的，研究表明近红外II区具有更高的空间分辨率和更好的组织穿透深度，与传统的可见光区(400-600nm)和近红外I区(600-1000nm)相比，近红外II区荧光(NIR-II 1000-1700nm)极大程度降低了生物组织对光子的散射和吸收，并且几乎没有生物自发荧光的干扰,并且在体内、体外经过不同程度的表面修饰后，呈现出比较好的生物相容性和更低的生物毒性。

优选的，所选标记物为近红外荧光量子点。所选的近红外荧光量子点为近红外II区(NIR-II 1000-1700nm),可以是1000，1100，1200等等。近红外荧光量子点有Ag₂S，Ag₂Se，Ag₂Te，CrSe等等。

优选的，选择位于近红外II区且配体为谷胱甘肽修饰的Ag₂S量子点，该量子点具有近红外II区荧光成像的特点。

其中，将纯化的外泌体和Ag₂S量子点进行混合，以量子点过量，通过电穿孔的方式，使得Ag₂S量子点进入外泌体内部，实现外泌体的量子点标记。

在一些实施方案中，所述荧光材料通过共孵育、超声破碎和电转中的任意一种方式进入所述外泌体的内腔中。

在一些实施方案中，包括：收集所述具有脑部靶向的神经干细胞的培养液，之后通过离心以收集所述培养液中的外泌体。

在一些较为优选的实施方案中，具体包括：依次采用750-1300rpm、1500-2500g、7000-15000g的转速，离心去除培养液中的活细胞、死细胞及细胞碎片，再采用80000-120000g的转速，离心收集培养液中的外泌体，并通过蔗糖密度梯度离心纯化外泌体。

在一些具体的实施方案中，包括：通过收集具有脑部靶向的神经干细胞的培养液来收集外泌体，外泌体的分离方式非常多样，主要通过超高速离心的方式收集外泌体。

例如，先通过750-1300rpm，1500-2500g，7000-15000g三种不同的转速，差速离心去除活死细胞和细胞碎片，再通过80000-120000g的超高转速离心收集外泌体。

其中，通过蔗糖密度梯度离心纯化外泌体。

本发明实施例的又一个方面还提供所述的脑部靶向外泌体或由所述的制备方法制备的脑部靶向外泌体于治疗脑部疾病中的用途。

为治疗脑部疾病如创伤性脑损伤提供了可视化和精准化的纳米药物治疗。

下面结合若干优选实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例中采用的实施条件可以根据实际需要而做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例：

(1)神经干细胞的提取

步骤1：取4周左右的Balb/C小鼠，断颈法处死，剪掉头部，取出完整的脑子，放在冰上预冷的DMEM-F12培养基上(含1％双抗)，小心剥离下丘脑(SVZ)区域，置于冰上，用镊子剥离脑膜和血管；用手术刀把下丘脑(SVZ)切碎，放到含5mL DMEM-F12无血清培养基的15mL离心管中，加0.5mL神经干细胞胰酶Accutase在37℃消化20min，每5min摇一次。200g离心5min去除上清；加入1mL DMEM-F12，培基重悬细胞，再加入20μl DNA酶，用移液枪轻轻吹打组织10次，吹打过程中不要产生气泡。再1mL新鲜培养基，和少量DNA酶，在冰上缓慢吹打15次，静置1-2min，将上清吸到新的15mL离心管中，向旧离心管再加入1mL新鲜培养基，重复2次以上操作步骤。

步骤2：将吹散开的细胞悬液用400目滤膜过滤，去除大块的组织块和细胞团；将过滤后的细胞悬液，200g转速离心5min，弃上清，将细胞沉淀用神经干细胞的完全培养基重悬，细胞计数，将合适细胞数目接种到用基质胶包被过的6孔板中进行贴壁培养；贴壁培养24小时后，去除细胞上清，加入少量PBS清洗一次，再加入2mL神经干细胞的完全培养基培养。培养可持续1周，每两天半换液。长至80％后进行传代培养。

(2)制备慢病毒靶向基团lamp2b-NFL

设计脑部靶向肽的序列，合成Lamp2b-NFL的质粒；转染前一天，消化293T-17细胞，取2×10⁶个细胞/孔来铺6孔板；观察细胞密度为80-90％即可进行转染；取Lipofectamine^TM2000转染试剂，DMEM-High培养基(不含抗生素)先在37℃恒温水浴锅中预热2min，Lipofectamine^TM 2000转染试剂需要恢复至室温使用；先取1.5mL预热的DMEM-High培养基加入新的EP管中，再分别取4μg质粒Pmd 2.G、8μg质粒psPAX2和12μg质粒Lamp2b-NFL加入EP管混匀；取1.5mL预热的新鲜DMEM-High培养基和50μL的Lipofectamine^TM 2000转染试剂混匀，室温下孵育5min；将上述所有质粒和Lipofectamine^TM 2000转染试剂混匀，室温孵育20min，将孵育的混合物加入293T-17细胞中，转染后5-6h后，更换为新鲜培养基；转染后48h和72h分别两次收集含有慢病毒的细胞上清；浓缩慢病毒，进行滴度测定。慢病毒感染293T-17图参图1a、1b、1c所示，慢病毒滴度测定参图2所示。

(3)制备慢病毒靶向基团lamp2b-RVG

在公司合成靶向肽lamp2b-RVG的靶向序列，得到目的序列；转染前消化293-17细胞铺板，使得细胞在第二天的密度能够达到80-90％，先取适量Lipofectamine^TM 2000转染试剂和不含抗生素的DMEM-High培养基，37℃水浴锅中预热2min，先取1.5mL预热的DMEM-High培养基，再分别取4μg质粒Pmd 2.G、8μg质粒psPAX2和12μg质粒Lamp2b-RVG加入EP管混匀；再取1.5mL的新鲜DMEM-High培养基，取50μL的转染试剂加入高糖培养基中混合均匀，室温孵育5min；将上述所有质粒和Lipofectamine^TM 2000混匀，室温下孵育20min，将孵育的混合物加入293T-17细胞中，转染后5-6h，更换为新鲜培养基；转染后48h和72h分别两次收集含有慢病毒的细胞上清；浓缩慢病毒，进行滴度测定。

(4)带有靶向的神经干细胞的制备

将神经干细胞(NSCs)铺24孔板，细胞的数量密度约70％为宜，37℃培养箱中培养过夜；提前准备好神经干细胞完全培养基和Polybrene混合物，去除旧培养基并添加0.4mLPolybrene与培养基混合物于每孔中；感染前，从超低温冰箱取出病毒，并在37℃水浴中快速融化病毒，取合适剂量的病毒加入细胞中，轻轻吹打混匀；在37℃培养箱中以小体积感染4h，后补齐完全培养基至正常体积；慢病毒感染24h后换液，换上新鲜的完全培养液，继续37℃培养；感染后48h，对于带mCherry报告基因的病毒，通过荧光显微镜观测mCherry的表达效率；流式筛选成功转染的神经干细胞，扩增细胞并保种。慢病毒感染神经干细胞荧光图参图3a、3b、3c所示。

(5)脑部靶向肽的外泌体的制备

大量培养转染成功的神经干细胞，收集神经干细胞的培养液；750-1300rpm 5min，离心去除活细胞，1500-2500g，10min去除死细胞，7000-15000g，10min，去除细胞碎片；80000-120000g，2h超高速离心收集外泌体；通过设置蔗糖密度梯度，离心纯化外泌体，收集纯化的外泌体，通过透析的方法将蔗糖透析干净。外泌体的电镜图参图4所示。

(6)外泌体装载Ag₂S量子点

取100μg的纯化后的外泌体与100μg的谷胱甘肽修饰的Ag₂S QD混合后；用细胞电转仪在200V，350μF的条件下电转；电转后37℃培养箱孵育30min，使外泌体的膜自动融合；载有Ag₂S QDs的外泌体能够标记N2a细胞，在近红外显微镜上能看到外泌体的成像；载有Ag₂S QDs的外泌体实现活体成像如图5所示。

(7)外泌体转载GbSb量子点

取适量带有靶向的外泌体与100μg的GbSb量子点充分混合均匀后，用细胞电转仪在200V，350μF的条件下电转；电转后37℃细胞培养箱孵育30min，外泌体的双层膜自动融合；载有GbSb QDs的外泌体能够标记N2a细胞，在近红外显微镜上能看到外泌体的成像；载有GbSb QDs的外泌体实现活体成像。

脑部靶向外泌体的制备流程参图6所示。

综上所述，本发明藉由上述技术方案，利用基因改造的方法使神经干细胞先具有靶向脑部的作用，具有脑部靶向的神经干细胞分泌带有靶向肽的外泌体，外泌体可以通过载入荧光材料，以实现活体成像。脑部靶向外泌体具有通过血脑屏障的作用，可以克服传统纳米粒子过血脑屏障效率低的问题。本发明不仅提供了一种通过血脑屏障的天然材料，还克服了传统纳米粒子的一些毒副作用，并且克服了传统粒子的脑部靶向的困难，为治疗脑相关疾病如创伤性脑损伤、脑肿瘤等提供一种可视化和精准化的治疗策略。

此外，本案发明人还利用前文所列出的其它原料以及其它工艺条件等替代实施例中的各种原料及相应工艺条件进行了相应试验，例如，还以Angiopep-2、ApoE、RVG、细胞穿膜肽作为脑部靶向肽，以Ag₂Se、Ag₂Te、InAs、InSb、GbSb和Ag₂Se_xS_1-x作为量子点分别进行了试验，所获脑部靶向外泌体的性能等亦较为理想，基本与实施例相似。故而此处不对各个实施例的验证内容进行逐一说明，仅以上述实施例作为代表说明本发明申请优异之处。

应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种脑部靶向外泌体，其特征在于包括能够穿过血脑屏障的外泌体和具有成像功能的荧光材料，所述荧光材料分布在所述外泌体的内腔中。

2.根据权利要求1所述的脑部靶向外泌体，其特征在于：所述荧光材料包括量子点；优选的，所述量子点的荧光发射位于近红外II区，其中发射波长在1050-1700nm之间；优选的，所述量子点选自谷胱甘肽修饰的近红外II区的量子点；优选的，所述量子点包括Ag₂S、Ag₂Se、Ag₂Te、InAs、InSb、GbSb和Ag₂Se_xS_1-x中的任意一种或两种以上的组合，其中x取值为0.1-0.9。

3.一种脑部靶向外泌体的制备方法，其特征在于包括：

使具有脑部靶向的神经干细胞分泌带有脑部靶向肽的外泌体；

收集并纯化所述外泌体；

使荧光材料进入所述外泌体的内腔中，从而获得脑部靶向外泌体。

4.根据权利要求3所述的脑部靶向外泌体的制备方法，其特征在于，所述具有脑部靶向的神经干细胞的制备方法包括：

将带有靶向肽的慢病毒感染神经干细胞，得到具有脑部靶向的神经干细胞。

5.根据权利要求4所述的脑部靶向外泌体的制备方法，其特征在于具体包括：构建慢病毒的三质粒系统，使所述慢病毒的三质粒系统感染293T-17细胞，得到带有靶向肽的慢病毒；

优选的，所述慢病毒的三质粒系统的组成包括pMD2.G、psPAX2和目的质粒脑部靶向肽NFL。

6.根据权利要求3所述的脑部靶向外泌体的制备方法，其特征在于：所述脑部靶向肽包括Angiopep-2、ApoE、RVG、细胞穿膜肽和NFL中的任意一种或两种以上的组合。

7.根据权利要求3所述的脑部靶向外泌体的制备方法，其特征在于：所述荧光材料包括荧光发射位于近红外区的量子点；优选的，所述量子点的荧光发射位于近红外II区，其中发射波长在1050-1700nm之间；优选的，所述量子点选自谷胱甘肽修饰的近红外II区的量子点；优选的，所述量子点包括Ag₂S、Ag₂Se、Ag₂Te、InAs、InSb、GbSb和Ag₂Se_xS_1-x中的任意一种或两种以上的组合，其中x取值为0.1-0.9。

8.根据权利要求3所述的脑部靶向外泌体的制备方法，其特征在于：所述荧光材料通过共孵育、超声破碎和电转中的任意一种方式进入所述外泌体的内腔中。

9.根据权利要求3所述的脑部靶向外泌体的制备方法，其特征在于包括：收集所述具有脑部靶向的神经干细胞的培养液，之后通过离心以收集所述培养液中的外泌体；优选的，具体包括：依次采用750-1300rpm、1500-2500g、7000-15000g的转速，离心去除培养液中的活细胞、死细胞及细胞碎片，再采用80000-120000g的转速，离心收集培养液中的外泌体，并通过蔗糖密度梯度离心纯化外泌体。

10.权利要求1-2中任一项所述脑部靶向外泌体或权利要求3-9中任一项所述制备方法制备的脑部靶向外泌体于治疗脑部疾病中的用途。