CN113717944B - 一种miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体及制备方法和应用，涉及生物医药技术领域。本发明采用30％蔗糖密度梯度离心法分离获取人脐带间质干细胞上清中的外泌体hucMSC‑Ex，能够在‑80℃超低温冰箱中长期保存并保持生物活性；本发明利用所述hucMSC‑Ex为纳米药物递送载体，负载miRNA13896形成miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体，能够被肿瘤细胞高效摄取，并主动靶向到肿瘤部位，并在体内外抑制胃癌细胞的增殖、迁移和自我更新，可以结合其他促抗癌药物或材料增强其抗肿瘤抑制效果，因此可将其用于制备预防和/或治疗胃癌的药物。

Description

一种miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体 及制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体及制备方法和应用。
背景技术
胃癌是全球常见的消化道恶性肿瘤之一。目前治疗胃癌的方法主要有手术治疗、放射治疗和化学治疗，除此之外还有热疗和生物治疗等。传统的治疗方法虽然有一定效果但仍面临着疗效不佳，易复发和转移等问题亟需解决。因此，急需寻找一个新的替代策略用于胃癌的干预治疗。
间质干细胞是一类能够自我更新和多向分化的成体干细胞。研究显示，间质干细胞在多肿瘤的干预中具有双刃剑的作用，其中脂肪和骨髓来源的间质干细胞争议最大，具有促瘤和抑瘤双重作用，因此目前还不能确认，是否能够将不同来源的间质干细胞用于肿瘤的干预和治疗。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体及制备方法和应用，不仅能特异性归巢到肿瘤部位，靶向胃癌细胞，还能抑制胃癌细胞的生长、迁移和自我更新，进而抑制肿瘤生长。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种脐带间质干细胞外泌体的分离和纯化方法，包括以下步骤：(1)对脐带间质干细胞进行分离培养至P3代，待P3代hucMSC的融合度达50％～60％时洗涤，将洗涤后的P3代hucMSC置于去血清外泌体的α-MEM培养基培养至P6代，取hucMSC上清；所述α-MEM培养基中还有质量含量为10％的胎牛血清；
(2)对所述hucMSC上清进行离心和除菌，得脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex；
所述离心包括对所述hucMSC上清进行第一离心、第一离心的上清液进行第二离心、第二离心的上清液进行第一超滤离心，第一超滤离心的膜上液进行第三离心，利用PBS缓冲液稀释第三离心的沉淀后进行第二超滤离心，收集第二超滤离心的膜上液；
所述第一离心的离心力为2000g，离心时间为10min；
所述第二离心的离心力为10000g，离心时间为30min；
所述第一超滤离心为100kDa MWCO超滤离心，离心力为1000g，离心时间为30min；
所述第三离心为将第一超滤离心的膜上液置于质量百分含量为30％蔗糖/重水密度垫上进行，所述第三离心的离心力为100000g，离心时间为3h；
第二超滤离心为100kDa MWCO超滤离心，离心力为1000g，离心时间为30min。
优选的，步骤(2)所述离心的温度均为4℃。
优选的，步骤(2)收集第二超滤离心的膜上液后过0.22μm滤膜，滤液为所述hucMSC-Ex。
本发明还提供了利用上述分离和纯化方法得到的脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex。
本发明还提供了一种miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体的制备方法，包括以下步骤：将miRNA13896 mimics的水溶液和上述脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex的PBS溶液混合后进行电转，将电转液置于37℃孵育1h，得所述miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体；
所述miRNA13896的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述miRNA13896 mimics的水溶液和脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex的PBS溶液的体积比为1：9。
优选的，所述miRNA13896 mimics的水溶液的工作浓度为0.5μg/μL；所述脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex的PBS溶液的工作浓度为30μg/μL。
优选的，所述电转的参数包括：选择衰减模式，调节穿孔电压为110V，穿孔电压持续时间为3ms，穿孔后静息时间为10ms；驱动电压为25V，驱动电压持续时间为50ms，驱动后静息时间为50ms；驱动循环次数为10次，电容为940μF。
本发明还提供了利用上述制备方法制备得到的miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体。
本发明还提供了上述脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex或上述miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体在制备预防和/或治疗胃癌药物中的应用。
有益效果：本发明提供了脐带间质干细胞外泌体的分离和纯化方法，由新生儿脐带间质干细胞外泌体所分泌，采用30％蔗糖密度梯度离心法分离获取人脐带间质干细胞上清中的外泌体，能够在-80℃超低温冰箱中长期保存并保持生物活性。本发明所述miRNA13896(全称NC_000020.11_miRNA13896)在人脐带间质干细胞外泌体中特异性高表达，且分子本身就能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移和自我更新，以本发明所述分离和纯化方法得到的所述脐带间质干细胞外泌体为纳米药物递送载体，负载所述miRNA13896形成miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体，所述miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体能够被肿瘤细胞高效摄取，并主动靶向到肿瘤部位，并在体内外抑制胃癌细胞的增殖、迁移和自我更新，可以结合其他促抗癌药物或材料增强其抗肿瘤抑制效果，因此可将其用于制备预防和/或治疗胃癌的药物。
附图说明
图1为人脐带间质干细胞(hucMSCs)的鉴定；
图2为hucMSCs上清中外泌体(exosomes)的提取方法示意图；
图3为hucMSCs源性exosomes(hucMSC-Ex)的鉴定；
图4为miRNA测序筛选验证HFL1-Ex与hucMSC-Ex差异表达miRNAs；
图5为HucMSC-Ex中高表达miRNA13896分子筛选验证；
图6为miRNA13896抑制MKN45细胞的增殖和转移；
图7为miRNA13896抑制MKN45细胞干性表达和自我更新；
图8为miRNA13896抑制AGS细胞增殖和迁移；
图9为HucMSC-Ex能被胃癌细胞高效摄取；
图10为miRNA13896过表达工程化hucMSC-Ex制备与表征；
图11为miRNA13896过表达工程化hucMSC-Ex抑制胃癌细胞增殖；
图12为miRNA13896过表达工程化hucMSC-Ex体内抑制肿瘤生长；
图13为miRNA13896过表达工程化hucMSC-Ex体内安全性评价。
具体实施方式
本发明提供了一种脐带间质干细胞外泌体的分离和纯化方法，包括以下步骤：(1)对脐带间质干细胞进行分离培养至P3代，待P3代hucMSC的融合度达50％～60％时洗涤，将洗涤后的P3代hucMSC置于去血清外泌体的α-MEM培养基培养至P6代，取hucMSC上清；所述α-MEM培养基中还有质量含量为10％的胎牛血清；
(2)对所述hucMSC上清进行离心和除菌，得脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex；
所述离心包括对所述hucMSC上清进行第一离心、第一离心的上清液进行第二离心、第二离心的上清液进行第一超滤离心，第一超滤离心的膜上液进行第三离心，利用PBS缓冲液稀释第三离心的沉淀后进行第二超滤离心，收集第二超滤离心的膜上液；
所述第一离心的离心力为2000g，离心时间为10min；
所述第二离心的离心力为10000g，离心时间为30min；
所述第一超滤离心为100kDa MWCO超滤离心，离心力为1000g，离心时间为30min；
所述第三离心为将第一超滤离心的膜上液置于质量百分含量为30％蔗糖/重水密度垫上进行，所述第三离心的离心力为100000g，离心时间为3h；
第二超滤离心为100kDa MWCO超滤离心，离心力为1000g，离心时间为30min。
本发明对脐带间质干细胞进行分离培养至P3代，待P3代hucMSC的融合度达50％～60％洗涤，将洗涤后的P3代hucMSC置于去血清外泌体的α-MEM培养基培养至P6代，取hucMSC上清；所述α-MEM培养基中还有质量含量为10％的胎牛血清。本发明对脐带间质干细胞的分离培养并没有特殊限定，优选参考Qiao Chun等的方法分离培养人脐带间质干细胞(hucMSC，Qiao Chun et al.Human mesenchymal stem cells isolated from theumbilical cord.Cell Biol Int.2008；32(1):8-15.)。本发明优选将分离出的脐带间质干细胞(hucMSC)于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱内培养；P3代的hucMSC进行多向分化潜能和流式鉴定，更优选包括选择生长状态良好的P3代hucMSC种板，加入成脂和成骨诱导分化培养基，培养至相应时间进行油红O染色和茜素红染色鉴定；选择生长状态良好的P3代hucMSC进行表面标记染色后进行流式细胞仪检测分析。
本发明优选将得到的P3代hucMSC，待融合度达50％～60％时，利用PBS洗涤3遍后，换成去血清外泌体的10％α-MEM培养基继(含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基)续培养48h，收集P3代至P6代上清后停止。本发明所述上清优选通过离心的方法获得，更优选的300g离心10min以去除漂浮的活细胞，收集上清用于外泌体的分离。
脐带间质干细胞上清(hucMSC-CM)的制备：选择生长状态良好的3～5代hucMSC先用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基培养，待细胞融合至70％～80％时换无血清培养基培养，48h后收集培养上清，300g离心10min以去除漂浮的活细胞，用于外泌体的分离。
得hucMSC上清后，本发明对所述hucMSC上清进行离心和除菌，得脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex；所述离心包括对所述hucMSC上清进行第一离心、第一离心的上清液进行第二离心、第二离心的上清液进行第一超滤离心，第一超滤离心的膜上液进行第三离心，利用PBS缓冲液稀释第三离心的沉淀后进行第二超滤离心，收集第二超滤离心的膜上液；所述第一离心的离心力为2000g，离心时间为10min；所述第二离心的离心力为10000g，离心时间为30min；所述第一超滤离心为100kDa MWCO超滤离心，离心力为1000g，离心时间为30min；所述第三离心为将第一超滤离心的膜上液置于30％蔗糖/重水密度垫上进行，所述第三离心的离心力为100000g，离心时间为3h；第二超滤离心为100kDaMWCO超滤离心，离心力为1000g，离心时间为30min。
本发明所述离心优选均为低温下离心，更优选为4℃离心，其中第一离心可去除完整死细胞和细胞碎片；第二离心可去除细胞器；第一超滤离心可浓缩。本发明将经第一超滤离心后得到的浓缩液缓慢移至5ml 30％蔗糖/重水密度垫(ρ＝1.210g/cm3)上进行第三离心，收集底部5ml蔗糖/重水层(含外体)，用PBS稀释后进行第二超滤离心。本发明优选将第二超滤离心后的膜上液利用PBS洗涤3次，用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，分装后于-80℃保存，并用BCA蛋白质定量试剂盒法进行蛋白质定量检测。
本发明还提供了利用上述分离和纯化方法得到的脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex。
本发明所述hucMSC-Ex的粒径分布在30～150nm，峰值在125nm左右；透射电镜下具有典型的“杯状”结构；且利用Westernblot检测hucMSC-Ex的表面标记蛋白，发现hucMSC-Ex蛋白特异性标志的CD9、CD63、TSG101、Alix和HSP70呈阳性表达，Albumin呈阴性表达。并且本申请所述hucMSC-Ex可-80℃长时间保存，避免了MSC冻存复苏的不便，融解后即可使用，使用时间易于掌握。
本发明还提供了一种miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体的制备方法，包括以下步骤：将miRNA13896 mimics的水溶液和上述脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex的PBS溶液混合后进行电转，将电转液置于37℃孵育1h，得所述miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体；
所述miRNA13896的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述miRNA13896(NC_000020.11_miRNA13896，TGGTCTGGACTGCTGAGGGG)在人肺成纤维细胞(HFL1-Ex)和人脐带间质干细胞外泌体(HucMSC-Ex)中特异性差异表达，且所述miRNA13896具有抑制胃癌细胞的增殖、迁移和自我更新的功能，并促进细胞凋亡，是一种抑制胃癌生长的有益分子。
本发明所述miRNA13896 mimics的水溶液和脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex的PBS溶液的体积比优选为1：9；并且所述miRNA13896 mimics的水溶液的工作浓度优选为0.5μg/μL；所述脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex的PBS溶液的工作浓度优选为30μg/μL。本发明对所述miRNA13896 mimics的水溶液和脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex的PBS溶液的制备方法并没有特殊限定。
本发明在进行所述电转时，优选每次取50μL混合物沿侧壁小心加入到电极杯中(全程不要产生气泡)，随后将电极杯放置于电转仪的电极杯槽中，并设置如下电转条件设置参数：选择衰减模式，并调节穿孔电压(Pp V)为110V，穿孔电压持续时间(Pp on)为3ms，穿孔后静息时间(Pp off)为10ms；驱动电压(PdV)为25V，驱动电压持续时间(Pd on)为50ms，驱动后静息时间(Pd off)为50ms；驱动循环次数(Pd Cycle N)为10次，电容为940μF。本发明在所述电转完成后，优选还包括将hucMSC-Ex放置于37℃孵育1h用于恢复外泌体膜的完整性。
本发明在实验时，为方便对电转效果进行鉴定，优选还包括对miRNA13896 mimics和hucMSC-Ex分别进行荧光标记，如利用Cy5荧光染料标记miRNA13896 mimics得到Cy5-miRNA13896 mimics，利用DIO荧光染料标记hucMSC-Ex得DIO-HucMSC-Ex，但是并不能仅将其认定为本发明的保护范围。
本发明在所述电转后，优选还包括进行荧光检测，以确定电转效果，所述荧光检测优选包括将Cy5-miRNA13896 mimics加载到DIO-HucMSC-Ex中，将工程化负载的hucMSC-Ex与种在细胞爬片上的胃癌细胞MKN45共孵育12h；随后，通过超高分辨荧光显微镜检测miRNA13896的装载情况。荧光检测显示，胃癌细胞质及细胞核中含有大量红绿重叠的黄色荧光，这表明，电转的方式能够高效的将miRNA13896 mimics装载到hucMSC-Ex中，并能有效的递送到靶细胞中。
本发明还提供了利用上述制备方法制备得到的miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体。本发明所述miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体的粒径略大于hucMSC-Ex，但无显著差异；电位呈负性电位；超高分辨显微镜结果显示，DIO标记的外泌体和Cy5标记的miRNA13896 mimics能够实现共定位。因此本发明所述miRNA13896能够被有效富集到外泌体中，并经裸鼠皮下荷瘤模型验证，miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体相比其天然来源的外泌体具有更高效的治疗效果，不仅能特异性归巢到肿瘤部位，靶向胃癌细胞，还能抑制胃癌细胞的生长、迁移和自我更新，进而抑制肿瘤生长，所以miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞来源的外泌体具有抑制胃癌恶性进展的药用价值。
本发明还提供了上述脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex或上述miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体在制备预防和/或治疗胃癌药物中的应用。
本发明所述miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体的安全性高，经所述miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体干预后，肿瘤体积显著减少(瘤体组织细胞结构松散并且血管的数量减少)，体重无显著差异，对其他的组织脏器无明显影响，所以本发明所述hucMSC-Ex是一种安全性载体，且miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体可用于核苷酸递送实现胃癌治疗目的。
下面结合实施例对本发明提供的一种miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体及制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
如非特殊说明，本发明中所用的试剂和材料均为市售产品：
MSC培养试剂：低糖α-MEM、胎牛血清(Gibco公司)、胰蛋白酶(Sigma)和抗生素(Sigma公司)、二氧化碳培养箱(Forma公司)；
倒置显微镜，流式细胞仪，超净工作台，台式离心机；
重水(D2O，上海创赛公司)，分析纯蔗糖(广州化学试剂厂)；
成脂、成骨诱导培养基、干细胞表面标记检测试剂盒(广州赛业生物科技有限公司)；
CD9、CD63、CD81、TSG101、Albumin抗体(CST)；
BCA蛋白定量试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗(北京康为世纪公司)，预混HRP化学发光底物、100kDa MWCO超滤离心管、0.22μm无菌滤膜(美国Millipore公司)；
无胸腺裸鼠(江苏大学动物实验中心，此实验由江苏大学伦理委员会批准)；
免疫组织化学染色试剂(武汉博士德公司，按照试剂盒说明书进行操作)；
胃癌细胞株MKN45和HGC27细胞(购于ATCC)；
倒置显微镜，激光共聚焦和超高分辨显微镜，电转仪(BEX)，超净工作台，台式离心机；
qRTPCR技术相关试剂(Takara)；
透射电子显微镜(FEI Tecnai 12，Philips公司)；
原子力显微镜(德国，布鲁克)纳米颗粒追踪分析仪(德国，ZetaView)。
实施例1人脐带间质干细胞分离与鉴定
(1)HucMSC的分离培养及鉴定：采用Qiao Chun等的方法分离培养人脐带间质干细胞(hucMSC，Qiao Chun et al.Human mesenchymal stem cells isolated from theumbilical cord.Cell Biol Int.2008；32(1):8-15.)，分离出的hucMSC于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱内培养；选择生长状态良好的第三代hucMSC种板，加入成脂和成骨诱导分化培养基，培养至相应时间进行油红O染色和茜素红染色鉴定；选择生长状态良好的第三代hucMSC进行表面标记染色后进行流式细胞仪检测分析。
倒置显微镜下观察hucMSC呈典型的纺锤形(图1中A)；成脂诱导分化结果显示诱导后的hucMSC胞体呈现典型油滴(图1中B)；成骨诱导分化结果显示诱导后的hucMSC胞体呈现钙结节(图1中C)；流式细胞仪结果显示hucMSC阳性表达CD29、CD73和CD105，阴性表达CD11b、CD14和CD45(图1中D)。
(2)人脐带间质干细胞上清(hucMSC-CM)的制备：选择生长状态良好的3～6代hucMSC先用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基培养，待细胞融合至50％～60％时换无血清培养基培养，48h后收集培养上清，300g离心10min以去除漂浮的活细胞，用于外泌体的分离。
实施例2人脐带间质干细胞来源外泌体的分离纯化
(1)根据图2所示流程对脐带间质干细胞上清中外泌体进行分离纯化：将收集的hucMSC上清液于4℃、2000g离心10min，以去除细胞碎片；收集上清后于4℃、10000g离心30min，以去除细胞器；将上清转移至100kDa MWCO超滤离心管，4℃、1000g离心30min进行浓缩；将浓缩液缓慢移至5ml 30％蔗糖/重水密度垫(ρ＝1.210g/cm3)，4℃、100000g离心3h；收集底部5ml蔗糖/重水层(含外泌体)，PBS稀释后加入100kDa MWCO超滤离心管中，4℃、1000g离心30min，PBS洗涤3次；最后用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，分装后于-80℃保存，并用BCA蛋白质定量试剂盒法进行蛋白质定量检测，分离的hucMSC-Ex浓度为35mg/ml。
(2)NTA检测hucMSC-Ex的粒径、浓度和电位：取1μL的hucMSC-Ex进行稀释(1:5000)后，于NTA上检测。如图3中A所示，hucMSC-Ex粒径分布在30～150nm，峰值在125nm左右。
(3)透射电镜观察外泌体的基本形态：取20μL的hucMSC-Ex，充分混匀后滴加于直径2mm的载样铜网上，于室温静置5min后，用滤纸轻轻吸去铜网边缘残余液体，然后将铜网倒扣于30g/L磷钨酸(pH 6.8)液滴上，室温下负染5min，最后将铜网在白炽灯下烘干，置于透射电镜下观察并拍照，如图3中B所示，外泌体为典型的“杯状”结构。
(4)原子力显微镜观察外泌体的高度和形貌：取10μL的hucMSC-Ex滴加到细胞爬片上，于室温静置干燥后，用双蒸水润洗以去除PBS盐结晶。再次自然干燥后，置于原子力显微镜下观察并拍照，如图3中C所示，外泌体为典型的“杯状”结构；
(5)Western blot检测hucMSC-Ex的表面标记蛋白：配制15％SDS-PAGE电泳胶，将上述提取的外泌体充分裂解后加入1/4体积的5×SDS上样缓冲液，煮沸5min，按200μg蛋白质总量上样，电转移(350mA，120min)将蛋白质转至PVDF膜上，用含50g/L脱脂牛奶的TBS/T室温封闭1h，分别与CD9、CD63、CD81、TSG101、Calnexin抗体(1:500)于4℃反应过夜，次日用TBS/0.5％Tween 20洗膜3次后，与HRP标记的山羊抗兔IgG二抗37℃温育1h，TBS/0.5％Tween 20洗膜3次后，加入预混HRP化学发光底物，并通过化学发光凝胶成像系统进行检测，如图3中D所示，hucMSC-Ex蛋白特异性标志的CD9、CD63、TSG101、Alix和HSP70呈阳性表达，Albumin呈阴性表达。
实施例3人脐带间质干细胞来源外泌体中差异表达分子的筛选及验证
(1)miRNA测序筛选人肺成纤维细胞(HFL1-Ex)和人脐带间质干细胞外泌体(HucMSC-Ex)中差异表达miRNA分子：欧易生物公司对HFL1-Ex和HucMSC-Ex中的差异miRNA分子进行测序。hucMSC-Ex和HFL1-Ex的miRNAs表达谱如图4中A所示，相比HFL1-Ex，其中102个miRNAs在hucMSC-Ex中表达上调。
qRT-PCR技术对测序结果中显著高表达的已有和新的miRNA分子进行验证，结果如图4中B所示，qRT-PCR的大部分检测结果与测序结果相一致。图5显示相比HFL1-Ex及hucMSC，miRNA分子NC_000020.11_miRNA13896呈现显著高表达。
表1 qRT-PCR所涉及的引物信息
20μl qRT-PCR体系：SYBR Green Mix 10μl、RNase free ddH2O 7μl、F/R引物各0.5μl和cDNA2μl。
qRT-PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸10min。
实施例4 miRNA13896抑制胃癌细胞的增殖、迁移和自我更新，促进细胞凋亡
miRNA13896抑制胃癌细胞的增殖，迁移：Lipo2000转染两种浓度(2.5nmol和5nmol)的miRNA13896的mimics和inbihitor到胃癌细胞MKN45中48h后，细胞计数分别进行克隆形成，迁移和CCK8实验。
Westernblot检测增殖，凋亡和迁移相关蛋白的表达；qRT-PCR检测凋亡相关基因的表达。图6显示miRNA13896显著的抑制胃癌细胞的增殖和迁移，并促进细胞凋亡。细胞成球实验结果显示，miRNA13896能抑制胃癌细胞MKN45的干性基因表达和细胞的自我更新(图7)。miRNA13896也能抑制AGS细胞增殖和迁移(图8)。综上，miRNA13896是一种抑制胃癌生长的有益分子。
实施例5天然的hucMSC-Ex能够高效被胃癌细胞所摄取
DIL标记的hucMSC-Ex与胃癌细胞内化：5μL的DIL染料与1mL的hucMSC-Ex在37℃共孵育30min。将上清转移到100kDa的超滤管中，加入预冷PBS洗涤三遍。最后PBS重悬后，0.22μm滤器滤菌。随后，加入到爬片上种有胃癌细胞的培养孔中共孵育12h，24h和48h。共聚焦的检测结果如图9所示，DIL-hucMSC-Ex能呈时间依赖性的被MKN45和HGC27细胞所摄取。表明天然的外泌体是一种良好的递送载体，能够高效的靶向胃癌细胞。
实施例6 miRNA13896过表达工程化人脐带间质干细胞外泌体制备和鉴定
(1)miRNA13896 mimics和hucMSC-Ex的实验前准备：将Cy5标记的miRNA13896 NC和miRNA13896 mimics粉末(33μg)分别于室温条件下3000rpm离心5min。在超净工作台中，用配套的DEPC水将其溶解为0.5μg/μL的工作浓度；随后，用PBS将hucMSC-Ex稀释为30μg/μL的工作浓度。
(2)DIO荧光染料标记hucMSC-Ex的制备：将5μL的DIO染料与1mL的hucMSC-Ex充分混匀，混合物放置于37℃，摇床上共孵育37min。将混合物加入到100kDa的超滤管中，加入5ml的PBS洗涤，4℃，1000g离心30min。PBS重复洗涤3次后，加入新的PBS重悬，0.22μm除菌滤器过滤后备用。
(3)HucMSC-Ex负载miRNA13896的制备：将溶解好的Cy5-miRNA13896 NC和Cy5-miRNA13896mimics分别与hucMSC-Ex按照1:9比例充分混匀。移液器取50μL混合物沿侧壁小心加入到电极杯中(全程不要产生气泡)，随后将电极杯放置于电转仪的电极杯槽中。
电转：选择衰减模式，并调节穿孔电压(Pp V)为110V，穿孔电压持续时间(Pp on)为3ms，穿孔后静息时间(Pp off)为10ms；驱动电压(Pd V)为25V，驱动电压持续时间(Pdon)为50ms，驱动后静息时间(Pd off)为50ms；驱动循环次数(Pd Cycle N)为10，电容为940μF。随后，检测电阻在适当的范围后，开始电转。两组电转完成后，将hucMSC-Ex放置于37℃孵育1h用于恢复外泌体膜的完整性。
(3)HucMSC-Ex负载miRNA13896的鉴定：将Cy5-miRNA13896 mimics加载到DIO-HucMSC-Ex中，将工程化负载的hucMSC-Ex与种在细胞爬片上的胃癌细胞MKN45共孵育12h；随后，通过超高分辨荧光显微镜检测miRNA13896的装载情况。
结果如图10所示，电穿装载miRNA13896后外泌体的两组粒径略有增加，但无显著差异(图10中A)；电位呈负性电位，两组变化无显著差异(图10中B)。超高分辨显微镜结果显示，DIO标记的外泌体和Cy5标记的miRNA13896 mimics能够实现共定位(图10中C)，因此miRNA能够有效被富集到外泌体中。
实施例7miRNA13896过表达工程化人脐带间质干细胞外泌体治疗作用及安全性评价
(1)miRNA13896过表达工程化hucMSC-Ex抑制胃癌细胞增殖：利用实施例5所述方法，将相同颗粒数的微囊泡被用来处理胃癌细胞MKN45 48h。细胞被计数后，分别进行克隆形成、CCK8实验检测和细胞的增殖活力鉴定。
结果如图11所示，miRNA13896过表达工程化hucMSC-Ex显著的抑制了胃癌细胞的增殖。
(2)裸鼠皮下荷瘤模型构建：3周大小的雄性裸鼠(江苏大学动物中心提供)，适应性喂养1周。胰酶消化HGC27细胞，PBS洗涤细胞沉淀后无血清1640将其重悬并放置于冰盒中。酒精棉球擦拭腋下血管丰富的部位后，每只裸鼠皮下注射200μL(1x107)的胃癌细胞。一周后观察裸鼠成瘤情况。
(3)DIL标记miRNA负载huMSC-Ex的体内示踪：按照实施例5的染色步骤，将DIL标记miRNA负载huMSC-Ex通过尾静脉注射到成瘤裸鼠体内，24h后检测外泌体的分布情况。
结果如图12中A和B所示，外泌体能够特异性靶向到肿瘤部分，并高效的聚集。
(4)miRNA13896过表达工程化hucMSC-Ex干预成瘤裸鼠：成瘤裸鼠分为PBS组，Ex组，NC-Ex组和mimic-Ex组。每个三天尾静脉注射一次外泌体，每隔一天记录体重和肿瘤体积变化。外泌体干预17天后，裸鼠进行安乐死。取血清、肿瘤组织以及主要脏器心，肝，脾，肺，肾。
结果如图12所示，相比PBS处理组，miRNA13896过表达工程化hucMSC-Ex干预后，肿瘤体积显著减少(图12中C、D进而E)。体重无显著差异(图12中F)。HE结果显示，miRNA13896过表达工程化hucMSC-Ex干预后瘤体组织细胞结构松散并且血管的数量少于PBS组(图12中G)。
(5)miRNA13896过表达工程化hucMSC-Ex体内安全性评价：HE结果显示，miRNA13896过表达工程化hucMSC-Ex干预后对其他的组织脏器无明显影响(图13)。表明外泌体是一种安全性载体用于核苷酸递送实现胃癌治疗目的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体及制备方法和应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
tggtctggac tgctgagggg 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
cacgaaacta ccttcaactc c 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
catactcctg cttgctgatc 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
caccagctct gagcagatca t 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
gatcagttcc ggcaccttg 19
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
ctgggagaac agggtacgat aa 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
cccaccgaac tcaaagaagg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
ccttgggatg gtctggactg 20
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
tatggttgtt cacgactcct tcac 24
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
cgcttcggca gcacatatac 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
ttcacgaatt tgcgtgtcat c 21

Claims (7)

1.miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体在制备治疗胃癌药物中的应用，其特征在于，所述miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体的制备方法，包括以下步骤：将miRNA13896 mimics的水溶液和脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex的PBS溶液混合后进行电转，将电转液置于37℃孵育1h，得所述miRNA13896过表达的工程化人脐带间质干细胞源外泌体；
所述miRNA13896的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述脐带间质干细胞外泌体的分离和纯化方法，包括以下步骤：(1)对脐带间质干细胞进行分离培养至P3代，待P3代hucMSC的融合度达50％～60％时洗涤，将洗涤后的P3代hucMSC置于去血清外泌体的α-MEM培养基培养至P6代，取hucMSC上清；所述α-MEM培养基中还有质量含量为10％的胎牛血清；
(2)对所述hucMSC上清进行离心和除菌，得脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex；
所述离心包括对所述hucMSC上清依次进行：第一离心、第一离心的上清液进行第二离心、第二离心的上清液进行第一超滤离心，第一超滤离心的膜上液进行第三离心，利用PBS缓冲液稀释第三离心的沉淀后进行第二超滤离心，收集第二超滤离心的膜上液；
所述第一离心的离心力为2000g，离心时间为10min；
所述第二离心的离心力为10000g，离心时间为30min；
所述第一超滤离心为100kDa MWCO超滤离心，离心力为1000g，离心时间为30min；
所述第三离心为将第一超滤离心的膜上液置于质量百分含量为30％蔗糖/重水密度垫上进行，所述第三离心的离心力为100000g，离心时间为3h；
第二超滤离心为100kDa MWCO超滤离心，离心力为1000g，离心时间为30min。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，步骤(2)所述离心的温度均为4℃。
4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，步骤(2)收集第二超滤离心的膜上液后过0.22μm滤膜，滤液为所述hucMSC-Ex。
5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述miRNA13896 mimics的水溶液和脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex的PBS溶液的体积比为1：9。
6.根据权利要求1或5所述应用，其特征在于，所述miRNA13896 mimics的水溶液的工作浓度为0.5μg/μL；所述脐带间质干细胞外泌体hucMSC-Ex的PBS溶液的工作浓度为30μg/μL。
7.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述电转的参数包括：选择衰减模式，调节穿孔电压为110V，穿孔电压持续时间为3ms，穿孔后静息时间为10ms；驱动电压为25V，驱动电压持续时间为50ms，驱动后静息时间为50ms；驱动循环次数为10次，电容为940μF。
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