CN111748523B - 一种免疫调节小胞外囊泡的制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种免疫调节小胞外囊泡的制备方法及其用途，制备方法包括如下步骤：（a）将原代分离纯化的动物细胞在培养体系中培养一段时间，以使培养基中积累有效浓度的免疫调节小胞外囊泡；（b）收集步骤（a）的培养基；（c）从步骤（b）收集的培养基中分离出免疫调节小胞外囊泡。本发明提供的小胞外囊泡具有免疫调节活性，能够激活巨噬细胞，向M1表型转化，为由免疫抑制引起或加重的疾病的预防或治疗提供理论依据。

Description

一种免疫调节小胞外囊泡的制备方法及其用途

技术领域

本发明属于医学技术领域，具体涉及一种免疫调节小胞外囊泡的制备方法及其用途。

背景技术

免疫指生物机体识别和排除抗原物质的一种保护性反应，包括特异性免疫与非特异性免疫，表现为：免疫防御，防止外界病原体的入侵及清除已入侵病原体（如细菌、病毒、真菌、支原体、衣原体、寄生虫等）及其它有害物质；免疫监视，随时发现和清除体内出现的“非己”成分；如由基因突变而发生的肿瘤细胞以及衰老、凋亡细胞；免疫自稳，通过自身免疫耐受和免疫调节两种主要的机制来达到免疫系统内的稳定。1909年Paul Ehrlich提出免疫系统可以遏制肿瘤发生，免疫功能异常是肿瘤发生的基本原因。1959年FrankMacfarlane Burnet和Lewis Thomas提出了“肿瘤免疫监视”假说，认为免疫系统能够识别并清除恶变的肿瘤细胞，从而抑制肿瘤的发生和发展。免疫抑制，是指对于免疫应答的抑制作用，导致免疫防御功能过低或缺失以及免疫监视功能低下，机体容易受到细菌、真菌感染，发生持续性病毒感染，甚至形成肿瘤。

基础、临床和流行病学的大量研究已证实，慢性炎症是导致肿瘤发生发展的确切因素之一，其所导致的肿瘤被称为“炎症相关肿瘤”。世界范围内，大约 20%-25%的恶性肿瘤与慢性炎症有关，典型的炎症相关肿瘤包括：胃幽门螺杆菌感染的患者发生胃癌的风险增加；慢性乙肝及丙肝病毒感染，或者肝吸虫感染可增加肝癌的风险；乳头瘤病毒感染的患者更容易发生肛门及生殖器肿瘤，特别是宫颈癌；一些自身免疫性疾病，如自身免疫性肠病，与结肠癌的发生密切相关。

虽然特定病原体导致某种肿瘤发生的机制并不适用于其它所有肿瘤，但是炎症相关肿瘤在本质上具有共同的病理学特征和相同的发病机制，就是持续的慢性炎症诱导局部形成了免疫抑制微环境，导致癌变的细胞不能及时被免疫细胞识别清除，从而为肿瘤的发生发展提供了适合的土壤。靶向免疫抑制微环境的治疗，调动体内能识别肿瘤的免疫细胞，靠它们来杀灭和控制肿瘤是人类攻克癌症历史上的一个里程碑式进展。

肿瘤免疫治疗目前主要包括：1.细胞因子药物，具有活化免疫细胞的作用，如白细胞介素-2、γ-干扰素和胸腺肽，但细胞因子类药物半衰期非常短，限制了其在临床的应用；2.抗体药物，通过识别肿瘤细胞相对特异的分子，进而激活杀伤性细胞，如治疗B细胞淋巴瘤的美罗华，治疗结肠癌的贝伐单抗，以及最近的PD-1抗体，其可控性相对较弱，治疗一旦有效，会产生“细胞因子风暴”，危及患者生命；3.细胞治疗，分离患者或健康人血液中有效的淋巴细胞，再通过不同因子刺激使其有效抗肿瘤成分扩展壮大，再收集回输给患者，又称为免疫细胞过继回输，如早期的LAK细胞（淋巴因子激活的杀伤细胞）、TIL细胞（肿瘤浸润性淋巴细胞）、CIK细胞（细胞因子诱导的杀伤性细胞），还有DC细胞、NKT细胞治疗。近两年热门的CAR-T（嵌合抗原受体T细胞疗法），提取患者免疫系统中的T细胞，经体外培养改造，装备特殊分子使其能识别并攻击特定肿瘤细胞，再把回输患者。目前，CAR-T疗法在临床上主要用于B细胞发展而来的肿瘤，CAR-T特异识别清除B细胞，失去正常B细胞患者可以存活，但不能没有正常的神经细胞、血管细胞、皮肤细胞。所以CAR-T疗法还未能针对其它细胞，因此在实体瘤尚未取得突破。综上所述，已知的肿瘤免疫治疗主要针对已经形成的肿瘤，与激活T淋巴细胞有关，以PD-1/PD-L1、CAR-T疗法等为代表的免疫疗法改变了很多癌症患者的生活，然而并非所有患者都能从中受益，其应用也存在一定的局限性，因此急需更多的选择。

巨噬细胞是参与慢性炎症的主要免疫细胞，对死亡细胞、细胞残片及病原体进行吞噬与消化，并激活淋巴细胞或其他免疫细胞，加快其对病原体作出反应的时间，参与非特异性免疫（先天免疫）和特异性免疫（细胞免疫）。组织微环境中有两种巨噬细胞，M1型 （经典激活），由TNF-α激活，释放TNF-α、IL-12、IL-6和IL-1β等促炎因子,具有抗肿瘤活性和组织破坏作用；M2型（替代激活），由IL-4和IL-13等激活诱导，产生IL-10和TGF-β等抑制炎症反应的细胞因子，诱导免疫抑制，促进炎症消散，组织重塑和促进肿瘤发生发展的作用。慢性损伤、炎症的组织中巨噬细胞转化为M2表型，分泌IL-10和TGF-β增高，TNF-α和IL-12降低，在促进组织修复的同时，抑制免疫反应，帮助肿瘤细胞发生免疫逃逸；还可通过分泌VEGF帮助新生血管形成；通过分泌EGF支持肿瘤生长和重塑ECM。因此，M2型巨噬细胞是慢性炎症和癌症之间密切联系的一个重要成分。调节巨噬细胞表型，抑制M2表型和诱导M1信号的策略可以恢复巨噬细胞的抗肿瘤功能，有助于去除来自M2巨噬细胞的保护性信号，激活先天免疫反应，有效清除肿瘤细胞。对巨噬细胞进行免疫调控，使其保持生理状态下的免疫监视作用，促使其从促癌的M2型转变为抗癌的M1型，将成为肿瘤预防和治疗的有效策略。

胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs) 是由含跨膜蛋白的脂质双分子层包裹形成的纳米级囊泡状小体，含有来自宿主细胞的蛋白、RNA及脂质等多种成分，可通过多种方式被受体细胞所摄取，从而介导了物质和信息的传递，影响受体细胞功能。其中直径约40-100nm 的膜性囊泡又称为小胞外囊泡（sEV， small extracellular vesicle），来源于细胞内多泡体，稍早被称为外泌体。正常和病变细胞均释放小胞外囊泡，小胞外囊泡也存在于血液和其它体液中。

已有一些关于小胞外囊泡在促进细胞分化，调节免疫，目前主要是诱导免疫抑制方面的探索。已经证明B细胞来源的小胞外囊泡对T细胞具有免疫调节作用 (Admyre, C.et al. J. 2007, Allergy Clin. Immunol. 120, 1418–1424)，源于干细胞的小胞外囊泡能调节造血前体细胞的分化 （Record M et al., 2014, Biochimica et biophysicaacta 1841(1):108-120），源自树突细胞的小胞外囊泡具有免疫抑制特性，有望可用于自身免疫性疾病和器官移植的治疗（Thomson AW, Robbins PD. Ann Rheum Dis. 2008;67(suppl 3):iii90–iii96.）。

将小胞外囊泡用于诱导巨噬细胞分化、激活免疫，增强机体的抗肿瘤作用、抗感染能力，纠正免疫缺陷，用于免疫缺陷疾病、恶性肿瘤的辅助治疗，以及难治性细菌或病毒慢性感染，和炎症相关肿瘤的预防和治疗的领域尚有待探索，包括持续稳定获能激活巨噬细胞的免疫调节胞外囊泡方法及其应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种免疫调节小胞外囊泡的制备方法及其用途，小胞外囊泡具有免疫调节活性，能够激活巨噬细胞，向M1表型转化，为由免疫抑制引起或加重的疾病的预防或治疗提供理论依据。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种免疫调节小胞外囊泡的制备方法，包括如下步骤：

（a）将原代分离纯化的动物细胞在培养体系中培养一段时间，以使培养基中积累有效浓度的免疫调节小胞外囊泡；

（b）收集步骤（a）的培养基；

（c）从步骤（b）收集的培养基中分离出免疫调节小胞外囊泡。

其中，步骤（a）中的培养体系是指：原代分离纯化后二维体系普通界面培养3天之内；或在被基质胶包裹的二维或三维培养界面，采用特定培养液，以模拟体内生理微环境，让细胞在生理行为上与机体实际的生理环境更接近，避免细胞由于体外培养条件的改变而活化，从而维持长时间的有效培养。

其中，三维培养体系包括但不限于以下两种：一种是将细胞分散在液体水凝胶中，然后通过交联实现3D培养，包括Cellendes, Matrigel, Glycosan Biosystems和QGel等的产品；另外一种是将细胞“播种”在3D基质上，包括3D Biotek, Alvetex和AlgiMatrix等的产品。

其中，步骤（a）中所用原代细胞的纯度大于95%，活力大于98%，细胞不表达或低表达激活标志物。

其中，步骤（c）中分离免疫调节小胞外囊泡的方法包括：聚合物沉淀法，如ExoQuick™ （SBI）；超滤法和大小阻排色谱柱法，如qEV-SEC（IZON，New Zealand）；磁免疫捕获，如MagCapture™Exosome Isolation Kit PS（Wako,Japan）；差速超速离心法（>100,000g），密度梯度离心法等。

本发明还提供一种利用上述的制备方法制备的免疫调节小胞外囊泡的用途，用于制备由免疫抑制引起的疾病的治疗药物。

其中，所述的免疫调节小胞外囊泡还用于与免疫调节剂结合制备由免疫抑制引起的疾病的治疗药物。

优选的，所述免疫调节剂包括但不限于：胸腺素α原，（prothymiosinalpha，ProTα）；免疫恢复剂，如多抗甲素（polyactinA，PAA），左旋咪唑（levamisole，LMS）；干扰素诱导免疫调节剂，如咪喹莫特（imiquimod）；中药成分，如黄芪多糖（astragaluspolysaccharide，APS）等。

本发明还提供一种药物组合物，包含上述的免疫调节小胞外囊泡，以及适于全身注射、局部输注或吸入疗法的生理上可接受的介质或载体。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明提供的小胞外囊泡具有免疫调节活性，能够激活巨噬细胞，向M1表型转化，为由免疫抑制引起或加重的疾病的预防或治疗提供理论依据。

附图说明

图1为本发明中免疫荧光检测肝星状细胞激活标记物 α-SMA的结果图；

图2为本发明中小胞外囊泡的分离和鉴定结果图；

图3为本发明中确认分离的小胞外囊泡具有免疫调节活性的结果图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

本发明提供了一种免疫调节小胞外囊泡的制备方法，免疫调节小胞外囊泡能够激活巨噬细胞，向M1表型转化，所述制备方法包括如下步骤：

（a）将原代分离纯化的动物细胞在适宜的培养体系中培养一段时间，以使培养基中积累有效浓度的免疫调节小胞外囊泡；

（b）收集步骤（a）的培养基；

（c）从步骤（b）收集的培养基中分离出免疫调节小胞外囊泡。

其中，所述适宜的培养体系是指：原代分离纯化后二维体系普通界面培养3天之内；或在被基质胶包裹的二维或三维培养界面，采用特定培养液（如低血清浓度和低糖DMEM培液），以模拟体内生理微环境，让细胞在生理行为上与机体实际的生理环境更接近，避免细胞由于体外培养条件的改变而活化，从而维持较长时间的有效培养。所选用的三维培养体系包括但不限于以下两种，一种是将细胞分散在液体水凝胶中，然后通过交联实现3D培养，包括Cellendes, Matrigel, Glycosan Biosystems和QGel等的产品；另外一种是将细胞“播种”在3D基质上，包括3D Biotek, Alvetex和AlgiMatrix等的产品。

每批原代细胞都在纯度、活力和细胞状态等方面接受测试，需要保证细胞纯度大于95%，活力大于98%，细胞不表达或低表达激活标志物。步骤（a）中，根据不同培养体系中原代细胞的状态，原代分离后常规二维体系培养时间为3天，三维培养体系中可持续至6天。

步骤（c）中，分离免疫调节小胞外囊泡是通过已知的任何方法进行的，包括但不限于聚合物沉淀，如ExoQuick™（SBI）；超滤法和大小阻排色谱柱法，如qEV-SEC（IZON，NewZealand）；磁免疫捕获，如MagCapture™Exosome Isolation Kit PS（Wako,Japan）；差速超速离心（>100,000g）；密度梯度离心等。

步骤（a）中使用的动物细胞为哺乳动物细胞，更可能为人细胞。所述动物细胞源自适合于该目的的任何健康组织或细胞类型，包括但不限于源自脐带血、胎盘、存在于羊水中的非胎儿细胞、脂肪组织、骨髓、外周血、毛囊、胃肠器官、肝脏、胰腺、神经系统（即中枢神经系统和/或外周神经系统）、循环系统、呼吸系统、免疫系统和/或分泌器官。

本发明提供了通过将有效量的免疫调节小胞外囊泡给药于受试者来预防和治疗由免疫抑制引起或加重的疾病或病症，和/或需要免疫系统调节的受试者。受试者可以为任何有此需要且能接受本发明所述小胞外囊泡给药的哺乳动物，例如人、犬科动物、猫科动物、猪科动物和马科动物等。

当受试者是人类受试者时，预期此类疾病或病症包括但不限于各类免疫缺陷疾病；炎症相关肿瘤的癌前病变患者（难治性细菌或病毒慢性感染），例如伴EB病毒感染的慢性鼻窦炎，吸烟或其它损伤因素导致的慢性支气管炎，伴胃幽门螺杆菌感染的慢性萎缩性胃炎；慢性乙肝及丙肝病毒感染导致的病毒性肝炎和肝硬化，慢性酒精性肝病，非酒精性脂肪肝，肝吸虫感染；肛门及生殖器乳头瘤病毒感染；自身免疫性肠病；以及各类炎症相关肿瘤患者，例如鼻咽癌、支气管鳞癌、肺腺癌、胃癌、肝细胞肝癌、胆管细胞癌、宫颈癌和肠癌。

在进行本发明所述治疗各类炎症相关肿瘤的癌前病变和相应肿瘤的方法时，免疫调节小胞外囊泡通过任何本领域已知的合适的途径进行给药，例如静脉注射、肌内注射、关节内注射或输注、皮下注射和鞘内注射和/或输注，如果合适的话。有效全身用量的范围为例如每千克总体重约1.0×10¹⁰至约1.0×10¹²个小胞外囊泡。局部输注的有效量范围例如约1.0×10¹⁰至1.0×10¹¹个小胞外囊泡颗粒被注射或输注入局部组织或解剖学空间内。例如，当免疫抑制相关疾病或病症在肺部时，可选方法包括将免疫调节小胞外囊泡作为吸入的气雾进行给药。

本发明提供了免疫调节小胞外囊泡以及获得和使用免疫调节小胞外囊泡以激活受试者巨噬细胞、增强免疫反应的方法。受试者宽泛地为哺乳动物，并且在特定的实施方式中，所述动物为需要此种治疗的人或兽类受试者。

本发明还提供了免疫调节小胞外囊泡的用途，用于制备通过激活引起某些癌症或癌前病症的免疫微环境来预防或辅助治疗受试者的癌症或癌前病症的免疫疗法的药物。

本发明提供的免疫调节小胞外囊泡是当将其给药于患有免疫抑制性疾病或病症的受试者时，将激活巨噬细胞，增强免疫反应。免疫调节小胞外囊泡由体外适宜培养体系中的原代动物细胞产生。

本发明提供的免疫调节小胞外囊泡的制备方法中，概括地包括在体外适宜条件培养的细胞或组织。处于适宜培养条件下的细胞或组织将保持体内生理状态，不会被培养环境中的成分影响激活。适宜培养体系中原代动物细胞保持生理状态，释放的小胞外囊泡保持生理状态的免疫调节作用，可诱导巨噬细胞向M1型分化。当所述免疫调节小胞外囊泡被收集、纯化并给药于被诊断患有免疫抑制性疾病或病症的受试者时，将激活巨噬细胞，增强受试者免疫反应。

本发明所用术语细胞或组织，旨在广泛地包括源自或提取自哺乳动物的组织、血液或体液的任何正常细胞或正常组织。在本发明的实施方式中，细胞或组织来源于但不限于脐带、胎盘、存在于羊水中的非胎儿细胞、脂肪组织、骨髓、外周血、毛囊、胃肠器官、肝脏、胰腺、神经系统（即中枢神经系统和/ 或外周神经系统）、循环系统、呼吸系统、免疫系统和分泌器官如乳腺。

源自胃肠器官的细胞或组织包括但不限于源自食道、胃、小肠、大肠、胆囊、唾液腺和其他胃肠道储存和/或分泌器官的粘膜表面、肠肌丛、平滑肌和/或腺体组织的细胞或组织。

源自神经系统组织的细胞或组织包括源自中枢神经系统（包括脑、视网膜和脊髓）的细胞或组织。

源自神经系统组织的细胞或组织还包括源自外周神经系统的细胞或组织。

源自循环系统的细胞或组织包括源自血细胞的细胞或组织，以及源自心脏（例如心肌和/或心脏瓣膜）、动脉、静脉和淋巴系统的细胞或组织。

源自呼吸系统的细胞或组织包括源自肺、支气管、细支气管、咽和鼻咽的细胞或组织。

源自免疫系统的细胞或组织可选地包括与免疫系统相关的那些源自骨髓、脾和外周组织的成体干细胞。

本发明中术语“培养”是指于体外在适宜的培养基中维持、分化和/或增殖细胞。

用于培养的细胞或组织获取方法包括本领域已知的方法，包括使用来自实验动物的组织，来自人或兽类的活体组织。如果组织是实体组织，则将采取灌流或切碎组织，用胶原酶等孵育以分解结缔组织，处理以中和胶原酶，并梯度离心和/或磁珠分选以分离纯化组织特性的细胞。每批原代细胞都在纯度、活力和细胞状态等方面接受测试。需要保证细胞纯度大于95%，活力大于98%，细胞不表达或低表达激活标志物。

然后在适宜的条件下培养分离纯化的细胞。

可调整培养期持续时间，以优化效率、细胞计数和小胞外囊泡的释放和积累。根据不同培养体系中原代细胞的状态，在一个实施方式中，培养时间为3天，在一个替代实施方式中，培养可持续至6天。

用于体外培养哺乳动物细胞的培养基是本领域技术人员已知并且常用的。如合适的培养基是Eagle’s最低基础低糖培养基，含有2％胎牛血清、10mL/L的Pen/Strep溶液、2mM的Ala-Gln溶液。通过接种培养基培养细胞，每毫升约5×10⁵个细胞。在37℃下培育约3-4天，收集被接种的培养基，然后从培养基中纯化和分离小胞外囊泡。这可以通过本领域已知的任何合适的方法来实现。这些方法包括但不限于：聚合物沉淀，如ExoQuick™ （SystemBiosciences Inc., Mountain View, CA）；超滤法和大小阻排色谱柱法，如qEV-SEC（IZON，New Zealand）；磁免疫捕获，如MagCapture™Exosome Isolation Kit PS（Wako,Japan）；差速超速离心（>100,000g）；密度梯度离心等。采用ExoQuick™ （SBI）聚合物沉淀法，可以高效稳定地获取培养上清中的小胞外囊泡。

通过Nanosight NS300纳米颗粒追踪分析仪来检测分离纯化的小胞外囊泡尺寸分布和颗粒浓度，通过透射电镜观察小胞外囊泡的大小和形态，通过流式细胞术和蛋白质印迹检测所分离小胞外囊泡标志物的表达。

本发明还提供的免疫调节小胞外囊泡用于制备受试者的治疗药物，所述受试者包括被诊断患有由与免疫功能低下引起或加重的疾病或病症，和/或需要免疫系统调节的受试者。当所述受试者是人类受试者时，预期此类疾病或病症包括但不限于各类免疫缺陷疾病；炎症相关肿瘤的癌前病变患者（难治性细菌或病毒慢性感染），例如伴EB病毒感染的慢性鼻窦炎，吸烟或其它损伤因素导致的慢性支气管炎，伴胃幽门螺杆菌感染的慢性萎缩性胃炎；慢性乙肝及丙肝病毒感染导致的病毒性肝炎和肝硬化，慢性酒精性肝病，非酒精性脂肪肝，肝吸虫感染；肛门及生殖器乳头瘤病毒感染；自身免疫性肠病；以及各类炎症相关肿瘤患者，例如鼻咽癌、支气管鳞癌、肺腺癌、胃癌、肝细胞肝癌、胆管细胞癌、宫颈癌和肠癌。

本发明中，由体外适合条件下培养的细胞或组织产生的免疫调节小胞外囊泡诱导存在于慢性炎症损伤组织中的巨噬细胞从免疫抑制M2表型转变为具有免疫监视和抗肿瘤活性M1表型，发挥有效的抗微生物活性、可促进T辅助细胞反应，有助于及时发现和清除癌变细胞。

本发明中，免疫调节小胞外囊泡通过任何临床上适当的途径给药以将小胞外囊泡递送至慢性炎症的组织或器官，或者可以在临床上合适时进行全身递送。举例来说，免疫调节小胞外囊泡通过诸如静脉、肌肉内、关节内、皮下和/或鞘内和/或通过直接注射、输注或滴注、滴鼻或通过吸入给药进入慢性炎症的组织或器官，以及局部给药于皮肤。

免疫调节小胞外囊泡的有效用量是足以产生作用或所需结果的量，例如激活巨噬细胞、预防、治疗或改善相关病症。有效用量可以单次或多次给药。有效用量将根据待治疗患者的体重、年龄、健康、疾病或病症和以及给药途径的不同而改变。

本领域技术人员将能够容易地通过滴定量和给药持续时间来确定待给药的小胞外囊泡量，以达到最佳临床反应，使得正在治疗的疾病或病症缓解，例如短期效果能有效清除局部病毒等病原体，长期效果能预防肿瘤的发生，改善肿瘤患者预后。

将免疫调节小胞外囊泡以每千克总体重约1.0×10¹⁰至约1.0×10¹²个小胞外囊泡颗粒的量进行全身给药。或者，将小胞外囊泡以约1.0×10¹⁰至1.0×10¹¹个小胞外囊泡颗粒的量注射或输注入局部组织或解剖学空间中进行给药。

制剂中小囊泡的数量可通过本领域任何已知的方法进行确定，如通过使用NanoSight NS300 纳米颗粒跟踪分析仪 (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire,UK)直接计数确定；通过使用ZetaView PMX 110纳米颗粒跟踪分析仪 (Particle Metrix,Meerbusch, Germany) 直接计数确定。

根据需要重复治疗直至获得积极的免疫增强效果。可选地，根据需要以每日、每周或每月间隔重复治疗，以维持巨噬细胞的激活和免疫增强。

本发明提供的免疫调节小胞外囊泡还用于与免疫调节剂结合制备由免疫抑制引起的疾病的治疗药物。

所述免疫调节剂包括但不限于：胸腺素α原（prothymiosinalpha，ProTα）；免疫恢复剂，如多抗甲素（polyactinA，PAA），左旋咪唑（levamisole，LMS）；干扰素诱导免疫调节剂，如咪喹莫特（imiquimod）；中药成分，如黄芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）等。

胸腺素α原可刺激外周单核细胞增殖、自体混合淋巴细胞反应、上调CD25和黏附分子的表达以及淋巴细胞活化等免疫调节作用。胸腺素α原可用于先天性或获得性T细胞免疫缺陷病、自身免疫病和肿瘤等疾病的临床治疗。

左旋咪唑对免疫系统的功能主要包括：增加机体产生抗体的水平；增加IgA含量；促进免疫细胞增殖和成熟，增强其吞噬和趋化功能，诱导机体产生细胞因子；增强巨噬细胞功能，激活和提高补体活性。左旋咪唑临床上曾用于小儿哮喘、难治性血小板减少性紫癜、乙型肝炎病毒携带以及白癜风等。

黄芪多糖可促进巨噬细胞产生IL-1，同时抑制前列腺素E2（PGE2）的合成；体内应用可明显提高T淋巴细胞转化，并促进已受抑的IL-2的产生及IL-2受体的表达，进而增强T淋巴细胞增殖等。黄芪多糖对艾滋病等多种免疫缺陷症均有良好的防治作用。

本发明还提供一种药物组合物，包含所述免疫调节小胞外囊泡和适于全身注射、局部输注和/或吸入疗法的生理上可接受的介质或载体。

下面结合具体实施例进一步阐述和验证本发明的技术方案。

实施例1：从健康组织中分离细胞

从健康大鼠肝脏分离肝星状细胞。

1、肝脏原位灌流，0.075％的Ⅳ型胶原酶，37℃消化35分钟；

2、分离肝脏，剪碎后，0.015％的Ⅳ型胶原酶，37℃下消化15分钟；

3、D-Hanks重悬，将样品以50g离心10min，取上清；

4、500g离心10min收集沉淀；

5、终浓度11-13% Nycodenz 密度梯度离心，收集中间层细胞；

6、细胞计数及台盼兰染色；

7、将新鲜分离的细胞按 5×10⁵每毫升接种在25cm²培养瓶中，采用Eagle's最低基础低糖培养基（含2％胎牛血清、10mL/L Pen/Strep溶液、2mM的Ala-Gln溶液）中。

实施例2：在模拟体内生理条件下培养分离的细胞

例如，通过接种培养基培养细胞，每毫升约500000个细胞。

将实施例1中获得的细胞在普通二维界面培养至第3天，收集培养基；或在适合的模拟器官三维培养环境中及适合的培养基中进行孵育。通过在37℃ 培养条件下，采用三维Matrigel和低糖培养条件，模拟体内生理状态。培养足以积累有用水平的免疫调节小胞外囊泡的一段时间后，例如，至约6天，并收集培养细胞和培养基。

实施例3：验证细胞的生理状态

免疫荧光检测肝星状细胞激活标记物 α-SMA，结果如图1所示，原代分离所获细胞98%以上为肝星状细胞，体外培养14天后全部转变为激活状态，均表达α-SMA，呈绿色荧光，放大倍率×200。

1、细胞爬片制备，用1×PBS漂洗5次；

2、甲醇室温10min，1×PBS漂洗5次；

3、1% BSA溶液37℃，20min，封闭；

4、α-SMA一抗（ab124964兔抗）孵育，37℃，1小时45分钟（每次实验需以单纯一抗稀释液1% BSA做空白对照）；

5、1×PBS漂洗5次；

6、加入1% BSA稀释的FITC标记的荧光二抗（ab136817羊抗兔），避光37℃孵育1小时；

7、1×PBS漂洗5次；

8、dd H20漂洗3次，洗去PBS；加入分泌液；

9、在载玻片上滴加1~2滴DAPI，将爬片倒扣在封片液上。

实施例4：分离免疫调节小胞外囊泡

通过聚合物沉淀法（ExoQuickTM, System Biosciences Inc., Mountain View,CA）或大小阻排色谱柱法，如qEV-SEC（IZON，New Zealand）从实施例2中收集的培养基中纯化和分离小胞外囊泡。

1、将细胞培养上清液3000g离心15min，取上清液；

2、过0.22μm滤膜，收集滤液；

3、滤液按5:1的比例加入ExoQuik试剂，使之充分混匀；

4、4℃孵育过夜（至少孵育12小时）；

5、4℃，1500 g离心30min，可见白色沉淀，弃上清，留沉淀；

6、再次4℃，1500g离心5min，尽量除去上清，无颗粒PBS重悬备用；

7、取一部分悬液用于鉴定。

实施例5：鉴定分离的小胞外囊泡

通过透射电镜观察囊泡大小和形态，通过纳米颗粒跟踪分析囊泡大小分布和浓度，通过蛋白质印迹验证分离的小胞外囊泡标志物表达。结果如图2所示，图2A为透射电镜观察囊泡形态呈圆形（聚合物沉淀法），图2B为纳米颗粒跟踪分析囊泡大小分布和浓度（聚合物沉淀法），图2C为蛋白质印迹验证分离的小胞外囊泡标志物CD63和CD81表达（大小阻排色谱柱法）。

通过RIPA裂解缓冲液从纯化的小胞外囊中提取总蛋白，使用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度。将在12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上分离的40mg蛋白转移到PVDF膜上。室温下用5%牛血清白蛋白封闭60min后，将膜与抗CD63，CD9，CD81（System Biosciences，Mountain View，CA），Calnexin和Albumin的抗体孵育过夜。洗涤3次并与结合HRP的二抗室温孵育60min后，通过增强的化学发光液显示条带。

实施例6：确认分离的小胞外囊泡具有免疫调节活性

通过细胞因子基因表达分析评估实施例1-4制备和纯化的小胞外囊泡激活巨噬细胞向M1型分化的免疫调节功能。

将肝脏巨噬细胞与纯化的小胞外囊泡共同孵育48小时，并通过RT-PCR评估细胞因子编码mRNA表达。

观察到IL-12，IL-6，CCR2等M1型激活巨噬细胞标志物在基因水平表达显著上调。

结果证实，源自类似健康个体静息状态肝星状细胞的小胞外囊泡能够刺激巨噬细胞向M1型分化。

确认分离的小胞外囊泡具有免疫调节活性如图3所示，与单纯培养基和来自激活肝星状细胞的小胞外囊泡相比，源自类似健康个体静息状态肝星状细胞的小胞外囊泡能刺激IL-12（图3A），IL-6（图3B），CCR2（图3C）等M1型激活巨噬细胞标志物表达显著增加。KC：肝脏巨噬细胞；Q-HSC：类似健康个体来源的静息状态肝星状细胞；A-HSC：类似病理状态下激活的肝星状细胞。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种利用静息状态肝星状细胞来源的小胞外囊泡的用途，其特征在于，用于制备刺激巨噬细胞向M1型分化的药物。

2.根据权利要求1所述的小胞外囊泡的用途，其特征在于，用于与免疫调节剂结合制备药物。

3.根据权利要求2所述的小胞外囊泡的用途，其特征在于，所述免疫调节剂选自：胸腺素α原，干扰素诱导免疫调节剂。

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