CN111298111A

CN111298111A - 一种治疗和/或预防癌症的药物和应用

Info

Publication number: CN111298111A
Application number: CN202010267462.5A
Authority: CN
Inventors: 台桂香
Original assignee: Changchun Kang Yue Biotechnology Co ltd
Current assignee: Liu Yuebin
Priority date: 2020-04-08
Filing date: 2020-04-08
Publication date: 2020-06-19

Abstract

本发明涉及一种治疗和/或预防癌症的药物和应用。本发明所述药物包括重组MUC1‑MBP融合蛋白疫苗和PD‑1抗体，所述药物有望打破体内和肿瘤微环境的免疫耐受状态，增强MUC1特异性抗肿瘤免疫应答，并且有望完全清除肿瘤，为广大癌症患者带来福音。

Description

一种治疗和/或预防癌症的药物和应用

技术领域

本发明涉及免疫学治疗药物技术领域，具体涉及一种治疗和/或预防癌症的药物和应用。

背景技术

癌症疫苗是一种主动免疫疗法，通过靶向肿瘤抗原而特异性杀伤癌细胞，癌症疫苗主要包括有DNA疫苗、DC疫苗、溶瘤病毒疫苗或重组病毒载体疫苗、以及基于肽或蛋白质的疫苗。至今为止，癌症疫苗的研究多数处于I-II期临床试验阶段，有10余个产品进入III期临床试验阶段，有两个上市的治疗性癌症疫苗：一是2010年被美国FDA批准的治疗前列腺癌的Provenge疫苗，二是2015年被美国FDA批准的治疗晚期黑色素瘤的T-VEC疫苗。二者在III期临床试验中分别延长患者生存期为4个月和4.4个月，均只能产生适度的临床效益。其中Provenge疫苗还因不能延长患者的疾病进展时间以及价格昂贵等因素而在使用中存在争议。此外，由于在III期临床试验中缺乏对患者的临床效益，PROSTVAC重组病毒载体疫苗以及针对MAGE-A3融合蛋白疫苗的III期临床试验被终止。长期以来，人们一直设想将癌症疫苗设计为通过主动免疫提高肿瘤特异性免疫应答，尤其是T细胞应答，并将其作为有效癌症免疫疗法的关键工具，然而，由于体内的免疫耐受微环境的存在，癌症疫苗只能产生适度的临床效益。因此，打破免疫耐受微环境，提高疫苗的临床效益尤为重要！

免疫检查点分子是一类免疫抑制性分子，如CTLA-4和PD-1，可调节免疫应答的强度和广度，从而避免正常组织的损伤和破坏，在肿瘤的发生、发展过程中成为诱导肿瘤免疫耐受的主要原因之一。程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1，PD-1，又称CD297)是由Pdcd1编码的I型跨膜蛋白，是CD28免疫球蛋白超家族的一员。在多种免疫细胞中均有表达，包括T细胞、B细胞和髓细胞，可抑制T细胞的激活、调节CD8+T细胞的效应。细胞程序性死亡-配体1(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1，又称CD274、B7-H1)是B7家族中一个负性T细胞共刺激分子，由人9号染色体上基因编码，广泛表达于树突状细胞等抗原提呈细胞表面。PD-L1主要由IFN-γ诱导产生，通过与PD-1结合抑制T细胞的增殖和活化。有研究表明，PD-1及其同源配体主要抑制炎症反应时周围组织T细胞的活性，并通过诱导活化的T细胞凋亡、促进T细胞衰竭、增强调节性T细胞的免疫抑制功能、抑制T细胞的增殖与活化和产生白介素(interleukin-2，IL-2)等方式调控自身免疫，同时也介导了肿瘤的免疫逃逸。PD-1抗体可以通过阻断PD-1/PD-L1信号通路打破免疫耐受，并且在临床试验中已经取得了显著的疗效，2014年2015年PD-1和PD-L1抗体的相继上市为打破免疫耐受提供了新的工具。

在癌症疫苗单一疗法方面，只能产生适度的临床效益，不能克服免疫耐受的微环境，而PD-1抗体可以弥补癌症疫苗的缺陷，打破免疫耐受微环境，从而激发肿瘤抗原特异性的免疫应答，特异性杀伤肿瘤细胞；在PD-1单一疗法方面，其在大多数癌症中客观缓解率仅约20-30％，并且对先前具有肿瘤浸润免疫反应的肿瘤疗效显著，对非免疫原性肿瘤效果较差，杀伤肿瘤缺乏特异性，容易引起自身免疫。而癌症疫苗恰能弥补PD-1抗体的不足，癌症疫苗可以在肿瘤部位产生免疫反应，并且疫苗介导的肿瘤细胞死亡导致更多的级联抗原的释放。癌症疫苗与PD-1抗体的联合应用能互补不足，进而提高肿瘤杀伤活性。基于上述的理论基础，癌症疫苗联合PD-1抗体成为目前研究的热点之一。迄今为止，关于癌症疫苗和PD-1抗体的联用还处于早期研究阶段，其中T-VEC联合pembrolizumab(PD-1抗体)在晚期黑色素瘤和头颈部晚期鳞状细胞癌患者中进行Ⅰ期临床试验，联合疗法与单独疗法相比，客观缓解率都明显提高，尤其在晚期黑色素瘤患者中，联合疗法的客观缓解率达到单独疗法的2-3倍。并且联合疗法具有可控的安全性。此外，Nivolumab(PD-1抗体)联合肽疫苗(MART-1/NY-ESO-1/gp100联合Montanide)在晚期黑色素瘤患者的Ⅰ期临床试验显示：联合疗法的的无复发生存率是疫苗单独疗法的两倍(47.1个月vs.12-21个月)。然后癌症疫苗联合PD-1抗体也有失败的案例，其中PD-1抗体联合肽疫苗在难治性和初治性黑色素瘤的I期临床实验中未能改善PD-1单一疗法的临床疗效。因此，癌症疫苗与PD-1抗体的联用急需注入新鲜的血液。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗和/或预防癌症的药物和应用。本发明所述药物将重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗与抗PD-1的抗体联用有望清除肿瘤微环境的免疫细胞尤其是T细胞的免疫耐受状态，增强MUC1特异性抗肿瘤免疫应答，并且有望完全清除肿瘤，为广大癌症患者带来福音。

本发明提供了一种治疗和/或预防癌症的药物，所述药物包括重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗和抗PD-1抗体。

优选的是，所述癌症包括所有表达MUC1的癌症，包括表达MUC1的腺癌或表达MUC1的血液肿瘤。

本发明还提供了重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。

本发明还提供了重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体在制备提高CTL杀伤效率的药物中的应用。

本发明还提供了重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体在制备诱导偏向Th1免疫应答的药物中的应用。

本发明还提供了重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体在制备增强MUC1特异性抗体应答的药物中的应用。

本发明还提供了重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体在制备诱导增强T细胞应答、降低免疫抑制细胞水平的药物中的应用。

本发明还提供了重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体在制备促进DC成熟的药物中的应用。

本发明提供了一种治疗和/或预防癌症的药物和应用。本发明所述药物将重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗和抗PD-1抗体联用，能够显著增强重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗的抗肿瘤效果，本发明所述药物，能够高效抑制表达MUC1的黑色素瘤(B16-MUC1)生长、提高CTL杀伤效率、诱导偏向Th1免疫应答、增强MUC1特异性抗体应答、增强T细胞应答、降低免疫抑制细胞水平，并且促进淋巴结中DC成熟。试验结果表明，与抗PD-1抗体或者重组MUC1融合蛋白疫苗单独疗法相比，重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗与抗PD-1抗体联用可显著提高肿瘤抑制率，肿瘤抑制率达到90％以上，并且肿瘤治愈率明显提高，肿瘤治愈率在30～50％之间，因此，重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗与抗PD-1抗体联用有望打破肿瘤微环境的免疫耐受状态，增强MUC1特异性抗肿瘤免疫应答，并且有望完全清除肿瘤，为广大癌症患者带来福音。重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体增强抗肿瘤免疫应答，提高抑瘤效果图如图9所示。

附图说明

图1为本发明提供的重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体对B16-MUC1黑素瘤的抑制作用结果；

图2为本发明提供的重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体对小鼠CTL杀伤活性的影响结果；

图3为本发明提供的重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体对MUC1特异抗体及亚类产生的影响结果；

图4为本发明提供的重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体对MUC1特异性T细胞分泌细胞因子水平的影响结果；

图5为本发明提供的重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体增强CD4⁺T和CD8⁺T在CD3⁺T亚群中的比例结果；

图6为本发明提供的重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体增强Th1和Tc1占CD4及CD8⁺T细胞比例结果；

图7为本发明提供的重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体降低(CD11b+Gr1+)MDSC比例结果；

图8为本发明提供的重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体联合增强引流淋巴结树突状细胞CD11C⁺DC_S上CD80、MHCⅠ、MHCⅡ分子的表达结果；

图9为本发明提供的重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体增强抗肿瘤免疫应答，提高抑瘤效果图。

具体实施方式

本发明提供了一种治疗和/或预防癌症的药物，所述药物包括重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗和抗PD-1抗体。本发明对所述抗PD-1抗体的来源没有特殊限定，采用常规市售抗PD-1抗体即可。在本发明中，所述重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗优选利用申请号为“CN03111045.2”的专利中的蛋白进行制备；本发明对疫苗的制备方法没有特殊限定，采用本领域技术人员公知的常规利用已知蛋白制备疫苗的方法即可。在本发明中，编码所述MUC1-MBP融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：ATGAAAAAATTATTATTCGCAATTCCTTTAGTGGTACCTTTCTATTCTCACTCGGCCGATATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACTATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACTAATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAACAACCTCGGGATCGAGGGAAGGATTTCAGAATTCGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCCCCGCCCCCCCAGCCCACGGAGTCACCTCGGCCCCGGACACCAGGCCGGCCCCGGGCTCCACCGCCCCCCCAGCCCACGGTGTCACCTCGGCCCCGGACACCAGGCCGGCCCCGGGCTCCACCGCCCCCCAAGCCCACGGTGTCACCTCGGCCCCGGACACCAGGCCGGCCCCGGGCTCCACCGCCCCCCCAGCCCACGGTGTCACCTCGGCCCCGGACACCAGGCCGGCCCCGGGCTCCACCGCCCCCCCAGCCCACGGTGTCACCTCGGCCCCGGACACCAGGCCGGCCCCGGGCTCCACCGCCCCCCCACTCCACGGTGTCACCTCGGCCCCGGAGAACAGGCCGGCCCCGGGCTCCACCGCGCCCGCAGCCCACGGTGTCACCTCGGCCCCGGAGAGCAGGCCGGAATTCGATATCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGA。本发明所述药物包括重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗和抗PD-1抗体，所述药物不仅协同刺激诱导MUC1特异性体液免疫应答，而且能显著增强MUC1特异性细胞免疫应答；能够阻断PD-1的抑制性信号，解除免疫细胞的抑制状态，协同增强重组MUC1-MBP诱导MUC1特异性抗体应答和T细胞免疫应答，协同诱导显著地抑制肿瘤的效果。即抗PD-1抗体作为免疫检测点抑制剂联合重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗可显著增强重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗的抗肿瘤(治疗癌症)效果。

在本发明中，所述癌症包括所有表达MUC1的癌症，包括表达MUC1的腺癌或表达MUC1的血液肿瘤。在本发明中，所述癌症优选还包括表达MUC1的非小细胞癌、表达MUC1的乳腺癌、表达MUC1的胰腺癌、表达MUC1的胃癌、表达MUC1的结直肠癌、表达MUC1的肝癌、表达MUC1的肾癌或表达MUC1的多发性骨髓瘤等。

本发明还提供了重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体在制备诱导增强T细胞应答、降低免疫抑制细胞(MDSC)水平的药物中的应用。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种治疗和/或预防癌症的药物和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

1.材料

实验试剂：重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗根据如SEQ ID NO.1所示序列，采用常规疫苗制备方法进行制备得到，抗PD-1抗体RMP1-14和rat IgG 2a同型对照抗体购自BioXcell公司。灭菌注射用水及生理盐水购自四川科伦药业有限公司。

实验动物：C57 BL/6小鼠(SPF级，雌雄各半，6-8周龄，体重18-22g)购自沈阳长生生物技术有限公司。

2.方法

2.1小鼠免疫

将小鼠称重，随机分组，每组10只鼠，分别是生理盐水对照组(NS组)、免疫检测点抑制剂抗PD-1抗体注射组(PD-1组)、重组MUC-MBP融合蛋白疫苗组(疫苗组)、重组MUC-MBP融合蛋白疫苗制剂联合免疫检测点抑制剂抗PD1抗体组(联合组)。每7天免疫一次，共免疫5次，采用皮下进行免疫，重组MUC-MBP融合蛋白疫苗制剂注射剂量为100μg/只(用NS稀释，总量200μl)。末次免疫后第7天荷瘤，右侧胁背部皮下注射，B16-MUC1肿瘤细胞5×10⁵/只(用IMDM基础培养液稀释，总量100μl/只)。于荷瘤后第3、6、9天腹腔注射免疫检测点抑制剂抗PD-1抗体，注射剂量250μg/只(用NS稀释，总量500μl/只)。

2.2重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体对B16-MUC1黑素瘤的抑制作用

如前所述，于末次免疫后第7天荷瘤，右侧胁背部皮下注射，B16-MUC1肿瘤细胞5×10⁵/只。于荷瘤后第16天，取血、取脾后，剥离皮下肿瘤并称重，计算各组皮下黑色素移植瘤抑制率和肿瘤抑制率。公式如下：[肿瘤抑制率＝(对照组平均瘤重－实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％]。[肿瘤治愈率＝(未长肿瘤小鼠个数/10(只))×100％]。

3.结果

与生理盐水对照组相比，PD-1抗体组肿瘤抑制率为42.77％，疫苗组的肿瘤抑制率为84.66％；联合组的肿瘤抑制率为97.83％，P<0.05(如表1和图1)。生理盐水组、PD-1抗体组及疫苗组的肿瘤治愈率均为0％，联合组的肿瘤治愈率为50％，P<0.05。(图1，重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体对B16-MUC1黑素瘤的抑制作用，肿瘤大小分布(A)及肿瘤治愈率(B))。

表1小鼠肿瘤瘤重(g)及肿瘤抑制率(％)和肿瘤治愈率

4.结论

重组MUC-MBP融合蛋白疫苗能够对肿瘤有一定的抑制作用，与免疫检测点抑制剂PD-1抗体联合给药后能够更加有效抑制B16-MUC1黑色素瘤肿瘤生长，且能提高肿瘤治愈率，最高达到50％治愈。

实施例2

1.材料

实验试剂：重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗根据如SEQ ID NO.1所示序列，采用常规疫苗制备方法进行制备得到，抗PD-1抗体RMP1-14和ratIgG2a同型对照抗体购自BioXcell公司。灭菌注射用水及生理盐水购自四川科伦药业有限公司。实验动物：C57BL/6小鼠(SPF级，雌雄各半，6～8周龄，体重18～22g)购自沈阳长生生物技术有限公司。

2.方法

2.1重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体对小鼠CTL杀伤活性的影响

CTL杀伤是评估抗肿瘤效果的金标准。为了验证重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合PD-1抗体治疗是否能够在小鼠中诱导稳定的MUC1特异性CTL杀伤。如前所述，于荷瘤后第16天，处死小鼠，取脾，制备脾细胞悬液，将细胞浓度调为1×10⁷/ml，500μl/孔加于24孔板内培养，每孔加0.5ml含IL-2和MUC1-MBP蛋白的IMDM培养液，共有4个实验组，每组培养4个孔，置37℃、5％CO₂孵箱中培养5天，铺板后第三天半量换液。在体外用MUC1-MBP和IL-2刺激培养5天，以此作为效应细胞，以B16-MUC1作为靶细胞，效靶比为50：1，采用xCELLigence RTCAS16实时无标记细胞功能分析仪对体外增殖培养的小鼠脾细胞进行CTL杀伤活性检测以判断联合免疫治疗的抗肿瘤活性。

3.结果

由图2(重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体联合对小鼠CTL杀伤活性的影响)知，与疫苗单独疗法组相比，联合组的CTL杀伤率提高，联合组vs.疫苗组(83.37％vs.68.6％)；PD-1抗体单独组的CTL杀伤率高于生理盐水组而低于疫苗组，杀伤率为45.14％。(图2，重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体对小鼠CTL杀伤活性的影响)。

4.结论

重组MUC-MBP融合蛋白疫苗能够提升小鼠的CTL杀伤活性，与免疫检测点抑制剂PD-1抗体联合给药后能进一步增强CTL杀伤活性，杀伤率最高可以提高19％。

实施例3

1.材料

实验试剂：重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗根据如SEQ ID NO.1所示序列，采用常规疫苗制备方法进行制备得到，抗PD-1抗体RMP1-14和rat IgG2a同型对照抗体购自BioXcell公司。灭菌注射用水及生理盐水购自四川科伦药业有限公司。MUC1多肽由上海紫域生物科技有限公司合成，山羊抗小鼠IgG2c–HRP和大鼠抗小鼠IgG1-HRP购自SouthernBiotech公司，羊抗鼠IgG(H+L)购自Proteintech公司。实验动物：C57 BL/6小鼠(SPF级，雌雄各半，6-8周龄，体重18-22g)购自沈阳长生生物技术有限公司。

2.方法

2.1重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体对MUC1特异抗体及亚类产生的影响

为了观察疫苗的免疫应答强度，进行了MUC1特异性抗体的测定。IgG2c和IgG1分别是Th1和Th2型免疫应答中的重要抗体，IgG为总抗体，如前所述，于荷瘤后第16天眼球采血，常温静置4小时后，4℃离心，3000rpm，10min，分离小鼠血清。采用间接ELISA的方法检测小鼠血清中IgG2c、IgG1及IgG抗体的产生水平。简而言之，采用0.5μg/well MUC1多肽包被96孔板，4℃过夜，次日，通过3％BSA封闭液封闭1h，采用0.5‰Tween-20的PBS(PBS-T)液洗涤后，加入小鼠不同稀释度的血清，均设双复孔，37℃孵育0.5～1.5h，弃去孔内液体，PBS-T洗液5-7次后，加入HRP标记山羊抗小鼠IgG或IgG2c或IgG1(按说明书稀释)，37℃孵育0.5-1.5h，弃去孔内液体，PBS-T洗液5-7次后加入底物OPD显色5～10min，加2mol/L硫酸溶液终止反应，采用酶标仪检测A490吸光光度值。

3.结果

通过间接ELISA的方法检测小鼠血清中MUC1特异性的抗体，求每组平均值，计算标准差(表2及图3)，NS组和单独的PD-1抗体组均不产生抗MUC1特异的抗体，只有含疫苗的组产生抗MUC1特异的抗体。根据IgG2c、IgG1、IgG的值计算IgG2c/IgG的比值，可以看到单独抗体组的IgG2c/IgG1低于NS组，疫苗组联合PD-1组的IgG2c/IgG1最高，说明联合组IgG2c的产生量高于IgG1，提示了强的Th1应答。根据阴性对照孔的2.1倍作为临界值计算阳性，对于IgG、IgG2c、IgG1，NS组和单独抗体组阳性率均为0，单独制剂组和联合组阳性率均为100％。(见图3，重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体联合对MUC1特异抗体及亚类产生的影响，其中，A为MUC1特异抗体及亚类产生水平，B为IgG2c/IgG的比值)。

表2血清MUC1特异性抗体水平(平均值和标准差)

分组	IgG	IgG1	IgG2c
				NS	0.066±0.022	0.068±0.014	0.074±0.037
PD-1组	0.061±0.003	0.058±0.003	0.06±0.003
				疫苗组	0.6773±0.025	0.502±0.341	0.68±0.421
联合组	0.7021±0.134	0.473±0.056	0.752±0.203

4.结论

重组MUC-MBP融合蛋白疫苗能够诱导产生较高水平的MUC1特异抗体及亚类，与免疫检测点抑制剂PD-1抗体联合给药后能进一步增强这一效果，更能有效的使免疫应答偏向Th1。

实施例4

1.材料

实验试剂：重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗根据如SEQ ID NO.1所示序列，采用常规疫苗制备方法进行制备得到，抗PD-1抗体RMP1-14和ratIgG2a同型对照抗体购自BioXcell公司。灭菌注射用水及生理盐水购自四川科伦药业有限公司。MUC1多肽由上海紫域生物科技有限公司合成，小鼠IFN-γ和IL-4ELISA检测试剂盒购自invitrogen公司。实验动物：C57BL/6小鼠(SPF级，雌雄各半，6～8周龄，体重18～22g)购自沈阳长生生物技术有限公司。

2.方法

2.1重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体对MUC1特异性T细胞分泌细胞因子水平的影响

IFN-γ和IL-4分别是Th1和Th2型免疫应答中的重要细胞因子，因此我们通过双抗体夹心ELISA的方法检测体外刺激5天的脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4的分泌水平。如上所述，在荷瘤后第16天，处死小鼠，无菌取脾、研磨、细胞记数，制备脾细胞悬液，采用小鼠淋巴细胞分层液分离小鼠脾脏单个核细胞，用IMDM调整细胞浓度至1×10⁷/ml，以100μl/well加入96孔板中。实验设3组，每组设3复孔，分别为阴性对照组、IL-2单独刺激组(终浓度100U/ml)、MUC1多肽刺激组(MUC1多肽10μg/ml+IL-2 100U/ml)，MUC-MBP刺激组(MUC-MBP10μg/ml+IL-2 100U/ml)。37℃的CO₂培养箱培养3天，半量换液，继续培养5天后，吸取每孔细胞培养上清100μl用于细胞因子的检测。通过夹心ELISA检测IFN-γ和IL-4的分泌水平。按照invitrogen公司的ELISA检测试剂盒说明书进行操作。简而言之，首先将包被抗体(抗IFN-γ和IL-4的抗体)包被96孔酶标板，每个样本设双复孔，4℃过夜。采用PBS-0.05％Tween-20洗板5次，加入封闭液封闭1h后，洗涤2次，加入标准品(IFN-γ：2000、1000、500、250、125、62.5、32.5、15.625pg/ml；IL-4标准品配制：500、250、125、62.5、32.5、15.6、7.8、3.9pg/ml)和样品，100μl/孔，4℃过夜。洗涤5次后，加入检测抗体室温孵育1h，洗涤5次，加入酶标抗体Avindin-HRP，室温孵育30min。洗涤5次，加入酶生物素，室温孵育30min。洗7次，加TMB，室温15min。加硫酸终止后，采用酶标仪450nm波长测定吸光度值波长450nm。

3.结果

实验结果显示，对于脾细胞培养上清IFN-γ的分泌水平(见表3、图4)，

IL2+MUC1-MBP与IL2+MUC1多肽刺激产生的IFN-γ相比，IL2+MUC1-MBP刺激产生的IFN-γ较高，并且联合组高于疫苗组的IFN-γ分泌水平。对于脾细胞培养上清IL-4的分泌水平，联合组均远低于疫苗组，说明联合组的体液免疫被PD-1抗体抑制住。对细胞因子分泌水平IFN-γ/IL-4的比值进行比较，联合组的比值大于疫苗组。(图4，重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体对MUC1特异性T细胞分泌细胞因子水平的影响，其中，A为IFN-γ分泌水平，B为IL-4分泌水平，C为IFN-γ/IL-4的比值)。

表3小鼠脾细胞培养上清细胞因子水平

4.结论

重组MUC-MBP融合蛋白疫苗能够诱导产生较高水平的IFN-γ的分泌，较低水平的IL-4，与免疫检测点抑制剂PD-1抗体联合给药后能进一步增强这一效果，IFN-γ的分泌量更高，IL-4分泌量更低，说明联合给药后更能有效的使免疫应答偏向Th1。

实施例5

1.材料

实验试剂：重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗根据如SEQ ID NO.1所示序列，采用常规疫苗制备方法进行制备得到，抗PD-1抗体RMP1-14和ratIgG2a同型对照抗体购自BioXcell公司。灭菌注射用水及生理盐水购自四川科伦药业有限公司。实验动物：C57BL/6小鼠(SPF级，雌雄各半，6-8周龄，体重18-22g)购自沈阳长生生物技术有限公司，4型胶原酶、透明质酸酶购自索莱宝公司，淋巴细胞分离液购自达科为公司，Foxp3/Transcription FactorStaining Buffer Set、Cocktail、CD16/32和APC-CD8a购自eBioscience公司，FITC-CD4(RM4-5)、PE/CY7-IFN-γ、BV510-Fixable Viability Stain 510、PE-CY7-CD11b和PE-LY-6G LY-6C购自BD公司。

2.方法

2.1肿瘤浸润淋巴细胞分离

处死小鼠后浸泡于75％乙醇中，剥离肿瘤组织，称重后，在培养皿中，用剪刀将肿瘤组织剪成1mm³小块，10mlIMDM重悬组织；用剪刀将5ml枪头剪一斜口，将组织悬液吸取至15ml离心管中，1000rpm离心10min弃上清；加入3倍体积配置好的消化液，重悬组织，用封口膜封口；将样品在37℃振荡培养箱中温育1小时，然后通过70μm细胞过滤器过滤；1000rpm离心10分钟，1ml完全培养基重悬细胞；细胞计数，稀释为1×10⁸/15ml离心管，1000rpm离心10min；加入5ml淋巴细胞分离液重悬沉淀，沿着管壁缓慢加入1ml IMDM；800G离心30min离心后缓慢取出离心管，将IMDM下层细胞吸出，细胞计数。

2.2脾脏淋巴细胞分离

处死小鼠后浸泡于75％乙醇中，取脾，在60×15mm培养皿加入5ml IMDM磨脾三层纱布过滤，移至15ml离心管中，每只脾细胞悬液均分成2管进行裂解红细胞。1500rpm离心5min，弃去上清；松解细胞团，加入红细胞裂解液5ml/管，重悬，室温静置5min；1000rpm离心10min，弃去上清；加含双抗的IMDM 3ml，吹悬，300目滤网过滤至15ml离心管中；加含双抗的IMDM 7ml，吹悬，抽出20μl细胞悬液置于1.5ml EP管中用于细胞计数。

2.3流式细胞术检测T细胞亚群

细胞浓度调节至2×10⁷个/ml、每孔500μl；Cocktail配置浓度是4μl/ml，工作浓度2μl/ml、每孔500μl；刺激时间选择6h。刺激结束后，吹悬收集细胞，计数后，调细胞浓度为1×10⁶个/test，进行随后的细胞染色。细胞洗涤：每管中加入1ml PBS液，1500rpm，离心5min；封闭Fc段CD16/32：0.5μl/test：吹悬，冰上封闭10min，冰冷PBS1ml/管洗涤细胞，1500rpm离心5min，弃上清，共洗2次。FVS 510活死细胞染料和表面抗体染色：冰上避光孵育30min，冰冷PBS 1ml/管洗涤细胞，1500rpm离心5min，弃上清，共洗2次；固定破膜：加1ml/管Foxp3固定破膜工作液，吹悬，室温避光孵育30min，3000rpm，离心5min，倒去上清，加1ml/管1×破膜缓冲液，吹悬，3000rpm，室温离心5min，弃上清，共1次；胞内抗体染色：室温避光孵育30min，加1ml/管1×破膜缓冲液，吹悬，3000rpm，离心5min，倒去上清共两次；加入500μlPBS重悬，用300目滤网过滤后，流式细胞仪进行检测。

3.结果

3.1重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体增强CD4+T和CD8+T在CD3+T亚群中的比例

CD8+T细胞为肿瘤杀伤的主要效应细胞，CD4+T在辅助CD8+T细胞杀伤肿瘤过程中发挥着重要的作用，很多文献表明，全身循环和肿瘤浸润CD8+T和CD4+T的增多与肿瘤治疗后良好相关。我们用小鼠淋巴细胞分离液分离小鼠脾脏和肿瘤组织中的单个核细胞，用流式细胞术分析脾脏及肿瘤浸润的CD4+T，CD8+T细胞亚群的变化。结果显示，与生理盐水组相比，单独给药及联合给药组脾脏与肿瘤浸润的CD8+T细胞水平均有显著性提高，CD4+T略有升高；与单独给药相比，联合给药后脾脏与肿瘤浸润的CD8+T细胞水平更高，获得更强的细胞免疫作用。(图5，重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体增强CD4+T和CD8+T在CD3+T亚群中的比例，脾脏及肿瘤浸润T细胞中CD4+T及CD8+T细胞比例的代表图(A、B)及比例(C、D))。

3.2重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体增强Th1和Tc1占CD4及CD8+T细胞比例。

Th1通过分泌IFN-γ，辅助CTL的杀伤活性，Tc1分泌IFN-γ，是主要杀伤肿瘤细胞的CTL亚型。因此为了研究疫苗联合PD1抗体对Th1，Tc1的影响，采用流式细胞术分析脾脏CD4+T和CD8+T细胞IFN-γ的百分比及平均荧光强度，结果显示，与生理盐水组相比，给药组Th1、Tc1分别占CD4、CD8+T细胞的百分比及IFN-γ的荧光强度均增加；与单独给药相比，联合给药后的Th1、Tc1的比例及IFN-γ的荧光强度更高，增强抗肿瘤作用。(图6，重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体增强Th1和Tc1占CD4及CD8+T细胞比例；Th1细胞占CD4+T细胞比例，Tc1占CD8+T细胞比例的代表图(A)及比例(B)，Th1，Tc1IFN-γ表达的平均荧光强度(C))。

3.3重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体降低(CD11b+Gr1+)MDSC比例，增加了CD8/MDSC比值。

肿瘤疫苗在诱导机体T细胞应答以清除肿瘤的同时，肿瘤细胞会诱导免疫抑制细胞的产生，进而逃避免疫细胞的攻击。髓样来源的抑制细胞(MDSC)是具有代表性的免疫抑制细胞群，MDSC通过转录因子STAT1，STAT3，STAT3，STAT3，STAT6和NF-κB在骨髓中增殖并获得免疫抑制活性。为了研究疫苗对免疫抑制细胞亚群的影响，如上所述从脾脏和肿瘤微环境中获取淋巴细胞，采用流式细胞术对脾脏及肿瘤浸润的MDSC进行了分析。结果显示，与生理盐水组相比，给药组的小鼠脾脏和肿瘤浸润细胞中的MDSC水平下降；与单独给药相比，联合给药后的MDSC比例显著下降。肿瘤微环境中CD8/MDSCratio和CD8/Tregratio已经在很多文献中被表明与抗肿瘤免疫有关。在我们的研究中，与生理盐水组相比，给药组的CD8/MDSC比值增加；与单独给药相比，联合给药的CD8/MDSC比值增加更加明显。说明抗肿瘤作用增强。(图7，重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体联合降低(CD11b+Gr1+)MDSC比例，脾脏及肿瘤浸润的CD11B+Gr1+MDSC代表图(A、B)及比例(C)，CD8/MDSC比值(D))。4.结论

重组MUC-MBP融合蛋白疫苗能够诱导增强Th和Tc1的活性，增强细胞免疫应答，降低免疫抑制细胞MDSC的水平，与免疫检测点抑制剂PD-1抗体联合给药后能进一步增强这一效果，T细胞应答更强，MDSC细胞水平更低，说明联合给药后更能有效诱导增强T细胞应答，并降低免疫抑制细胞MDSC的水平。

实施例6

1.材料

实验试剂：MUC1-MBP冻干制剂-20℃保存(lot：201809011)，PD-1抗体RMP1-14和ratIgG2a同型对照抗体购自BioXcell公司。实验动物：C57BL/6小鼠(SPF级，雌雄各半，6-8周龄，体重18-22g)购自沈阳长生生物技术有限公司，CD16/32购自eBioscience公司，BV510-FixableViabilityStain510、购自BD公司，APC-CD11c、FITC-MHCⅠ、FITC-MHCⅡ、FITC-CD80购自三箭生物技术有限公司。

2.方法

2.1淋巴结细胞的获取

处死小鼠后浸泡于75％乙醇中，剥离淋巴结置于培养皿中，用镊子将淋巴结于300目滤网中磨碎，将细胞悬液吸取至15ml离心管中，1000rpm离心10min弃上清；加入1ml培养液进行细胞重悬，抽出20μl细胞悬液置于1.5mlEP管中用于细胞计数。

2.2流式细胞术检测DC细胞以及成熟markerCD80、MHCⅠ、MHCⅡ

调细胞浓度为1×10⁶个/test，进行随后的细胞染色。细胞洗涤：每管中加入1mlPBS液，1500rpm，离心5min；封闭Fc段CD16/32：0.5μl/test：吹悬，冰上封闭10min，冰冷PBS1ml/管洗涤细胞，1500rpm离心5min，弃上清，共洗2次。FVS510活死细胞染料和表面抗体APC-CD11c、FITC-MHCⅠ、FITC-MHCⅡ、FITC-CD80进行染色，冰上避光孵育30min，1500rpm，离心5min，倒去上清；冰冷PBS1ml/管洗涤细胞，1500rpm离心5min，弃上清，共洗2次；加入500μlPBS重悬，用300目滤网过滤后，流式细胞仪进行检测。

3.结果

3.1重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体促进了DC细胞的成熟

DC细胞是重要的抗原呈递细胞，DC细胞的成熟，有利于

CD4+T细胞的活化，因此我们使用流式细胞术检测淋巴结中DC细胞的成熟度。结果表明，与NS组，疫苗组，抗PD-1抗体组相比，疫苗联合抗PD1抗体增加了CD11c⁺DC细胞上CD80的表达，以及MHCⅠ、MHCⅡ分子的平均荧光强度，促进了DC细胞的成熟度，从而增强了抗肿瘤免疫作用。(图8，重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体促进了DC细胞的成熟；淋巴结中CD11c细胞上CD80的表达(A)MHCⅠ的荧光强度(B)MHCⅡ的荧光强度(C))。

4.结论

重组MUC-MBP融合蛋白疫苗能够增强CD11c⁺DC细胞上CD80的表达，以及MHCⅠ、MHCⅡ分子的平均荧光强度，与免疫检测点抑制剂PD-1抗体联合给药后能进一步增强这一效果，CD11c⁺DC细胞上CD80的表达，以及MHCⅠ、MHCⅡ分子的平均荧光强度明显增强，说明联合给药后更能有效促进淋巴结中DC的成熟。

重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体能够增强抗肿瘤免疫应答，提高抑瘤效果。如图9所示，其中，图9中的A和B选自图1中的A和B，图9中的C选自图2，图9中的D选自图4中的A。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 长春康悦生物科技有限公司

<120> 一种治疗和/或预防癌症的药物和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1713

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaaaaaat tattattcgc aattccttta gtggtacctt tctattctca ctcggccgat 60

atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 120

ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 180

ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 240

atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 300

accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 360

aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 420

gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 480

aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 540

ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 600

gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 660

aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 720

ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 780

gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 840

ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 900

ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 960

ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 1020

actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1080

tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1140

gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1200

aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttcggatccc ccgggctgca ggaattcccc 1260

gcccccccag cccacggagt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc 1320

gcccccccag cccacggtgt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc 1380

gccccccaag cccacggtgt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc 1440

gcccccccag cccacggtgt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc 1500

gcccccccag cccacggtgt cacctcggcc ccggacacca ggccggcccc gggctccacc 1560

gcccccccac tccacggtgt cacctcggcc ccggagaaca ggccggcccc gggctccacc 1620

gcgcccgcag cccacggtgt cacctcggcc ccggagagca ggccggaatt cgatatcaag 1680

cttggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tga 1713

Claims

1.一种治疗和/或预防癌症的药物，其特征在于，所述药物包括重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗和抗PD-1抗体。

2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述癌症包括所有表达MUC1的癌症，包括表达MUC1的腺癌或表达MUC1的血液肿瘤。

3.重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述癌症包括所有表达MUC1的癌症，包括表达MUC1的腺癌或表达MUC1的血液肿瘤。

5.重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体在制备提高CTL杀伤效率的药物中的应用。

6.重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体在制备诱导偏向Th1免疫应答的药物中的应用。

7.重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体在制备增强MUC1特异性抗体应答的药物中的应用。

8.重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体在制备诱导增强T细胞应答、降低免疫抑制细胞水平的药物中的应用。

9.重组MUC1-MBP融合蛋白疫苗联合抗PD-1抗体在制备促进DC成熟的药物中的应用。