CN114657123B - 白血病特异性树突状细胞来源的过表达rae-1的外泌体无细胞疫苗及其制备方法 - Google Patents

白血病特异性树突状细胞来源的过表达rae-1的外泌体无细胞疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种白血病特异性树突状细胞来源的过表达RAE‑1的外泌体无细胞疫苗，是将过表达RAE‑1的CML细胞裂解得到的肿瘤细胞裂解物与树突状细胞共培养得到成熟的树突状细胞，分离成熟的树突状细胞的外泌体，对外泌体进行纯化后得到。所述疫苗的制备方法，包括步骤：1)用表达RAE‑1γ的慢病毒转染CML细胞，获得过表达RAE‑1的CML细胞CML‑RAE‑1；2)收集CML‑RAE‑1细胞，裂解，得到肿瘤细胞裂解物；3)用培养液A诱导培养树突状细胞，取含有树突状细胞的培养液A与肿瘤细胞裂解物混合共培养，用培养液B培养树突状细胞直至成熟；4)取培养得到的成熟树突状细胞提取外泌体，纯化后即得。

Description

白血病特异性树突状细胞来源的过表达RAE-1的外泌体无细 胞疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种白血病特异性树突状细胞来源的过表达RAE-1的外泌体无细胞疫苗及其制备方法。
背景技术
慢性髓细胞白血病(CML)是一种来源于造血干细胞的骨髓增生性疾病，以9号染色体和22号染色体之间的典型易位为特征，这种易位产生了被称为费城染色体的截短染色体，并产生了bcr-abl融合基因。新形成的融合基因翻译形成了BCR-ABL融合蛋白，其具有很强的酪氨酸激酶活性导致了CML的发生和发展。虽然酪氨酸激酶抑制剂(TKI)伊马替尼作为CML的一线治疗用药可使患者达到一般预期寿命，但仍有超过30％的患者无法达到疾病根除，或者出现耐药或药物不耐受。涉及Abl激酶域的点突变是主要的耐药机制。其中，“看门人”T315I突变是最常见的突变，也是治疗失败的主要原因。虽然帕纳替尼作为第三代TKI对治疗T315I突变有效，但由于其明显的毒副作用，尚未得到广泛应用。因此，迫切需要开发新的治疗策略来防止CML的进展和复发。
肿瘤免疫治疗已被证明是一种有效的治疗方式，并且该疗法彻底改变了血液系统恶性肿瘤的治疗手段。树突状细胞(DCs)作为抗原提呈细胞(APCs)能诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTL)和CD4+辅助性T细胞(Th)的抗肿瘤反应，在偶联先天性免疫和适应性免疫反应中发挥重要作用。尽管以DC为基础的疫苗仍然是癌症免疫治疗的主要选择，但仅有5-15％的患者在接种DC疫苗后出现了客观的临床免疫应答。以DC为基础的疫苗的运用主要障碍之一在于肿瘤微环境介导的免疫抑制，使DC上共刺激信号的表达降低，导致CD8+T细胞耐受。此外，CML患者的T细胞显著降低了T细胞抗原受体(TCR)链的表达，这有助于肿瘤免疫逃避。因此，以DC为基础的疫苗对治疗CML患者具有很大挑战性。而树突状细胞来源的外泌体(Dex)在抗肿瘤相关免疫抑制、生物利用度和生物稳定性等方面都优于树突状细胞。值得注意的是，由于Dex在抗肿瘤方面具有明显的优势，现已成为一种新型的无细胞抗肿瘤疫苗。然而，用于靶向治疗CML的Dex疫苗还尚未见报道。
DC细胞在相关刺激因子的作用下，细胞膜向内凹陷以出芽的方式形成含多个小囊泡的多泡核内体(MVEs)，MVEs与细胞膜融合后，经胞吐的作用释放出小囊泡，形成Dex。Dex表面携带有功能性免疫刺激成分，包括主要组织相容性复合体I类和II类(MHC I/MHC II)、细胞间粘附蛋白(ICAM1)和共刺激分子如CD80、CD86等。Dex维持了亲代DC细胞的抗原呈递能力，通过表达MHC I-肽和MHC II-肽复合物激活抗原特异性CD8+ T细胞和CD4+ T细胞。Dex介导的T细胞活化在肿瘤免疫治疗的应用中发挥着重要作用，更重要的是，Dex同时还表达了NK活化受体，能诱导NK细胞的活化。Dex的多项临床试验结果表明，Dex疫苗在体内安全且具有良好的耐受性。然而这些临床试验结果显示，在接受Dex治疗的患者体内仅观察到较弱的肿瘤抗原特异性T细胞反应，Dex只发挥了很有限的临床疗效。缺乏有效的T细胞成熟信号和T细胞抗原的不足可能是这些临床试验中适应性免疫反应较差的原因。
最近的研究表明，Dex表达NKG2D配体(NKG2D-L)，通过与NKG2D直接作用来激活NK细胞。NKG2D为膜分子，属于C型凝集素样受体，广泛表达于几乎所有的NK细胞、大多数NKT细胞、γδT细胞、人类所有的CD8+ T细胞以及活化的小鼠CD8+ T细胞和某些CD4+ T细胞表面。其主要功能是与NKG2D-L结合，传导NK细胞活化信号，从而激活NK细胞免疫反应。在人类细胞中，NKG2D-L包括主要组织相容性复合体I类分子链相关蛋白A/B(MICA/B)和ULBP1-6家族。在小鼠细胞中NKG2D与视黄酸早期转录因子1(RAE-1)家族、H60家族和MULT-1蛋白相结合。此外，已有多项研究证实NKG2D对人类和小鼠的T细胞都能提供共刺激信号。综上所述，NKG2D/NKG2D-L通路在介导NK细胞和T细胞活化中发挥重要作用。
目前，在CML治疗方面，酪氨酸激酶抑制剂在治疗慢性髓细胞白血病(CML)方面取得了相当显著的进展，但疾病的进展和其耐药性仍是目前治疗的主要障碍，且目前的Dex疫苗临床疗效有限，因此我们需要寻求新的治疗策略。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种白血病特异性树突状细胞来源的过表达RAE-1的外泌体无细胞疫苗：是将过表达RAE-1的CML细胞裂解得到的肿瘤细胞裂解物与树突状细胞共培养得到成熟的树突状细胞，分离成熟的树突状细胞的外泌体，对外泌体进行纯化后得到。
所述过表达RAE-1的CML细胞是用表达RAE-1γ的慢病毒转染CML细胞得到。
所述CML细胞为T315I突变CML细胞。
上述疫苗的制备方法，包括如下步骤：
1)用表达RAE-1γ的慢病毒转染CML细胞，获得过表达RAE-1的CML细胞CML-RAE-1；
2)收集CML-RAE-1细胞，裂解，得到肿瘤细胞裂解物；
3)用培养液A诱导培养树突状细胞，培养6-8天后，取含有树突状细胞的培养液A与肿瘤细胞裂解物混合共培养，每1ml培养液A与80-120μg肿瘤细胞裂解物混合，共培养7-9小时后用培养液B培养树突状细胞直至成熟；
4)取培养得到的成熟树突状细胞提取外泌体，纯化后即得。
上述技术方案中，步骤1)中用基于CV186载体构建的表达RAE-1γ的慢病毒转染CML细胞。
步骤2)中所述裂解为通过反复冻融法裂解细胞；优选具体方法为：用液氮冷冻细胞10min，随后在37℃恒温水浴中解冻，解冻后再次液氮冻结细胞10min，再37℃解冻，经过总共三次重复的冷冻/解冻循环后，通过离心去除细胞碎片，随后将上清通过0.22μm过滤器得到肿瘤细胞裂解物。
步骤3)中所述培养液A为完全培养液；
所述培养液B为含胎牛血清、GM-CSF、IL-4、TNF-α的完全培养液。
步骤3)中含有树突状细胞的培养液A与肿瘤细胞裂解物在37℃、5％CO2的条件下共培养7-9小时；
所述培养液A为含有10％胎牛血清、10ng/ml GM-CSF、5ng/ml IL-4的RPMI 1640培养基；
所述培养液B为含有10％胎牛血清、10ng/ml GM-CSF、5ng/ml IL-4、10ng/ml TNF-α的RPMI 1640培养基。
步骤4)中外泌体的提取方法为：取含有血清的完全培养液通过超离心去除培养液中的外泌体得到去外泌体培养基，将步骤3)培养得到的成熟树突状细胞用去外泌体培养基培养过夜，然后收集培养液的上清液通过离心过滤法纯化。
所述纯化的具体方法为：收集培养液的上清液后以300g进行离心10分钟以去除细胞和细胞碎片后，连续离心进一步纯化：2000g离心10min，10000g离心30min，以去除细胞碎片；上清液通过0.22μm膜过滤后，4℃100,000g超离心70min；沉淀在预冷的PBS中重悬，4℃100,000g再离心70min，即得到树突状细胞来源的外泌体。
树突状细胞外泌体Dex继承了树突状细胞DC的抗原提呈能力，Dex需要进行抗原负载以后才能进一步激活免疫细胞。Dex的抗原负载方式分为直接负载和间接负载。直接负载指的是Dex是在弱酸性条件下直接加载抗原；对于间接负载，是DCs首先直接载抗原，然后生成载抗原的Dex；前者不仅制备技术困难，而且在体内效果不如后者。因此，为了制备间接抗原负载的Dex，本发明首先将CML细胞的肿瘤裂解液装载到DC中，生成CML特异性DC，然后提取抗原负载的Dex。
本发明的有益效果是：
鉴于目前的Dex疫苗临床疗效有限，临床试验中观察到的抗原特异性T细胞反应较少，本发明首次提出构建过表达RAE-1的CML特异性Dex，同时增强NK细胞和T细胞活性，大大提高Dex疫苗的抗肿瘤效果。
在本发明中，我们从小鼠DCs中生成富含RAE-1的CML特异性Dex(CML-RAE-1-Dex)。通过研究发现，过表达RAE-1并负载小鼠CML细胞裂解物的CML-RAE-1-Dex疫苗，在体内外均能通过NKG2D/NKG2D-L途径同时激活T细胞和NK细胞，从而在小鼠模型中达到抗CML的功效。此外我们还发现，过表达RAE-1的Dex负载具有T315I突变的CML细胞肿瘤裂解物后，也能够提高NK细胞和T细胞对T315I突变CML细胞的细胞毒活性。本发明为Dex疫苗在抗CML免疫治疗中开辟了新的途径，实验数据表明，我们构建的CML-RAE-1-Dex无细胞疫苗有望成为一种治疗CML的新策略，特别是对于有T315I突变的CML患者也可能带来显著的疗效，解决部分患者的耐药问题。
附图说明
图1是流式细胞术检测DC细胞表面标志物结果。
图2是Dex的特性检测结果；(a)透射电镜观察Dex的形貌；(b)NTA检测Dex的粒径；(c)Western blot检测DCs和不同类型Dex中HRS、Alix、TSG101、Cytochrome C和RAE-1的表达。
图3是CML-RAE-1-Dex促进NK细胞的活化和增殖实验结果；(a-c)采用流式细胞术检测NK细胞表面CD69(a)、CD137(b)和CD107a(c)的表达；数字表示阳性表达细胞的百分比；(d-e)细胞内流式细胞术检测外泌体刺激后NK细胞中的功能性标志物穿孔素和颗粒酶B；(f)NK细胞用CFSE标记，不同刺激条件下孵育72h，流式细胞仪检测细胞分裂的百分率。
图4是外泌体对NK细胞功能的影响实验结果；(a)ELISPOT方法比较不同组TNF-α的细胞外释放水平；(b)ELISPOT法测定IFN-γ的水平；(c)细胞毒性试验用于测量外泌体预先刺激的效应NK细胞对靶细胞BP210(左)或BP210-T315I(右)的杀伤能力，当效应靶比(E:T)分别为12.5:1、25:1、50:1、100:1时，检测细胞毒活性。
图5是CML-RAE-1-Dex增强CD4+ T细胞免疫反应实验结果，所有CD4+ T淋巴细胞的结果分析是基于CD3+CD4+ T细胞的分析；(a-c)流式细胞术显示CD69+(a)、CD137+(b)和CD107a+(c)细胞在CD4+ T细胞亚群中的比例；(d-e)采用流式细胞术检测不同外泌体处理组CD4+ T淋巴细胞中细胞毒性介质穿孔素和颗粒酶B的表达；(f)CD4+ T淋巴细胞与PBS或外泌体共培养后，采用CFSE法检测其增殖情况。
图6是CML-RAE-1-Dex增强CD8+ T细胞反应实验结果，所有CD8+ T淋巴细胞的结果分析是基于CD3+CD8+ T细胞的分析；(a-c)流式细胞术显示CD69+(a)、CD137+(b)和CD107a+(c)细胞在CD8+T细胞亚群中的比例；(d-e)采用流式细胞术检测不同外泌体处理组CD8+ T淋巴细胞中细胞毒性介质穿孔素和颗粒酶B的表达；(f)CD8+ T淋巴细胞与PBS或外泌体共培养后，采用CFSE法检测其增殖情况。
图7是外泌体对T淋巴细胞功能的影响实验结果；(a)ELISPOT方法比较不同组TNF-α的细胞外释放水平；(b)ELISPOT法测定IFN-γ的水平；(c)采用ELISA法测定体外培养T细胞上清中IL-2浓度(pg/ml)；(d)在不同E/T比(12.5:1,25:1,50:1和100:1)下，采用LDH法检测T淋巴细胞的细胞毒性，分别以BP210和BP210-T315I细胞为靶细胞。
图8是BP210-RAE-1-Dex对小鼠BP210肿瘤模型的治疗作用实验结果；(a)计算各组白细胞计数最大值的平均值；(b,c)分离肝脏(b)和脾脏(c)并称重；(d)显示了瑞氏染色液染色的组织涂片的代表性图像，黑色箭头表示侵入组织的异常细胞；(e)采用免疫荧光法检测BCR-ABL表达水平；(f)采用H&E染色的肝脏和脾脏组织确认病理特征，箭头指向的是白血病细胞；(g)Kaplan-Meier生存时间分析小鼠治疗后的生存时间。
图9是BP210-T315I-RAE-1-Dex对小鼠BP210-T315I肿瘤模型的治疗作用实验结果；(a)计算各组白细胞计数最大值的平均值；(b,c)分离肝脏(b)和脾脏(c)并称重；(d)显示了瑞氏染色液染色的组织涂片的代表性图像，黑色箭头表示侵入组织的异常细胞；(e)采用免疫荧光法检测BCR-ABL表达水平；(f)采用H&E染色的肝脏和脾脏组织确认病理特征，箭头指向的是白血病细胞；(g)Kaplan-Meier生存时间分析小鼠治疗后的生存时间。
图10是CML-RAE-1-Dex在小鼠体内的免疫预防作用实验结果；(a)记录WBC计数最大值；(b,c)测定各组肝脏(b)和脾脏(c)重量；(d)采用免疫荧光染色后通过显微镜对骨髓、脾脏和肝脏组织中的BCR-ABL蛋白进行评价；(e)Wright染色用于检测组织中的白血病细胞浸润，显微镜下显示典型的白血病细胞形态(箭头所指)；(f)肝、脾组织切片H&E染色显示白血病细胞浸润；(g)Kaplan-Meier生存曲线比较组间差异。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；所用生化试剂如无特殊说明，均为本领域常规试剂，均可商购获得。
实施例1
1材料和方法
1.1慢病毒转染CML细胞
小鼠前B淋巴细胞株BaF3购自中国医学科学院基础医学研究所细胞培养中心，培养在含10％胎牛血清(FBS,Gibco，美国)和1ng/ml IL-3(PeproTech，美国)的RPMI 1640培养基中。用表达P210 bcr-abl的逆转录病毒和表达P210 bcr-ablT315I的逆转录病毒(该两种逆转录病毒为现有技术中已知的)分别转染BaF3细胞，通过有限稀释法获得单克隆BP210细胞和耐伊马替尼BP210-T315I细胞，且BP210和BP210-T315I的培养不依赖于IL-3。用对照病毒(基于CV186载体构建)(吉凯基因，中国)分别转染BP210细胞和BP210-T315I细胞，获得对照细胞株BP210-mock和BP210-T315I-mock；用基于CV186载体构建的表达RAE-1γ的慢病毒(上海吉凯基因医学科技股份有限公司，货号GENE-007)分别转染BP210细胞和BP210-T315I细胞，获得过表达RAE-1的CML细胞株BP210-RAE-1和BP210-T315I-RAE-1。转染72小时后，在添加嘌呤霉素(2μg/ml,Solarbio，中国)的新鲜完全RPMI 1640培养基(Gibco,美国)中筛选稳转细胞株。用PE偶联的抗RAE-1抗体(ebioscience,USA)或PE偶联的大鼠IgG2b kappa抗体(ebioscience,USA)对细胞进行染色，然后通过流式细胞术进行检测。
1.2肿瘤细胞裂解物的制备
分别收集BP210-mock(空白对照)、BP210-RAE-1、BP210-T315I-mock(空白对照)和BP210-T315I-RAE-1细胞，洗涤后重悬于PBS中。用液氮快速冻结细胞10min后在37℃恒温水浴中解冻，三次重复的冷冻/解冻循环后，通过离心去除细胞碎片，随后将上清通过0.22μm过滤器(Millipore，美国)过滤得到肿瘤细胞裂解物，随后用BCA蛋白检测试剂盒(Biosharp，中国)检测上清浓度，在-80℃保存。
1.3树突细胞的分离培养
从6-8周龄雄性Balb/c小鼠胫骨和股骨中分离得到骨髓细胞，该小鼠购自重庆医科大学实验动物中心。骨髓细胞在含10％胎牛血清(FBS)、10ng/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，sinobiological，中国)、5ng/ml IL-4(sinobiological，中国)的RPMI1640培养基中培养产生骨髓源性树突状细胞(BMDCs)。培养第7天后，取200μg步骤1.2制备的肿瘤细胞裂解物置于六孔板中，在六孔板中加入含有DCs的RPMI 1640完全培养液，使每孔液体的终体积为2ml，将DCs与肿瘤细胞裂解物在37℃、5％CO2的条件下共培养8小时。与裂解物孵育后，用含10％胎牛血清、10ng/ml GM-CSF和5ng/ml IL-4的新鲜完全培养液培养DCs，并添加肿瘤坏死因子α(TNF-α,10ng/ml,sinobiological)培养48小时，直至成熟，用于1.4外泌体分离和纯化步骤。用流式细胞术(Becton Dickinson,USA)检测新鲜分离的树突状细胞和成熟树突状细胞的免疫表型。加入荧光素异硫氰酸酯(FITC)偶联的抗CD80单克隆抗体(mAb)(ebioscience,USA)检测CD80的表达。
1.4外泌体分离和纯化
取含有血清的RPMI 1640完全培养液通过超离心去除培养液中的外泌体得到去外泌体培养基，然后将1.3培养得到的成熟DCs用去外泌体培养基培养过夜，然后收集培养液的上清液以300g进行离心10min以去除死细胞和细胞碎片，连续离心进一步纯化外泌体：2000g离心10min，10000g离心30min，以去除细胞碎片；上清液通过0.22μm膜过滤后，4℃100,000g超离心70min；沉淀在预冷的PBS中重悬，4℃100,000g再离心70min，得到过表达RAE-1的CML特异性外泌体BP210-RAE-1-Dex和BP210-T315I-RAE-1-Dex(统称为CML-RAE-1-Dex)。外泌体用于直接检测或保存在-80℃。
1.5外泌体特征
将1.4得到的悬浮在PBS中的外泌体添加到Formvar和碳涂层铜网格上，并用2％的醋酸铀酰进行负染色。外泌体的形态通过透射电子显微镜(TEM,Tecnai G2 Spirit,荷兰)在80kV电压下进行检测。通过ZetaView(ZetaView PMX 110，德国)的纳米颗粒跟踪分析(NTA)测量悬浮液中外泌体的大小分布。
1.6免疫印迹
Western blot按照已有报道的步骤进行。裂解后的DCs蛋白和外泌体用10％SDS-PAGE凝胶分离。用HRS(Santa Cruz，美国)、Alix和TSG101抗体(Bimake，美国)(稀释倍数为1:1000)检测外泌体标记物，用细胞色素C(Cytochrome C)的单克隆抗体(Bimake，美国)和小鼠RAE-1多克隆抗体(R&D Systems，美国)分别检测Cytochrome C和RAE-1的表达量，使用浓度分别为1:10 000和1:500。
1.7NK细胞和T淋巴细胞的分离
分别使用脾淋巴细胞或NK细胞分离液试剂盒(TBD，中国)从6～8周龄Balb/c小鼠脾脏中分离T淋巴细胞或NK细胞。采用CD49b(DX5)磁珠(Miltenyi Biotec,德国)进行阳性选择，从单个新鲜脾细胞悬液中富集高纯度的NK细胞。NK细胞重悬于含10％胎牛血清、2mML-谷氨酰胺(Solarbio，中国)、50μmol/Lβ-巯基乙醇(Sigma，美国)和300U/ml IL-2(PeproTech，美国)的RPMI 1640培养基中。小鼠T淋巴细胞按现有技术报道的方法培养。
1.8流式细胞仪检测
NK细胞(CD3-DX5+)用FITC偶联的抗CD3ε(克隆：145-2C11,ebioscience)和PE-Cyanine7偶联的抗CD49b(克隆：DX5,ebioscience)标记，随后用流式细胞仪检测。CD4+或CD8+ T细胞用FITC标记的CD3ε和PE-Cyanine7抗小鼠CD4(克隆：RM4-5,ebioscience)或PerCP-Cyanine5.5抗小鼠CD8αmAb(克隆:53-6.7,ebioscience)染色。用PBS或外泌体刺激NK细胞或T细胞6h后，PBS冲洗，荧光标记抗体在室温避光条件下染色30min。细胞重悬后用BD FACSCanto流式细胞仪检测(BD Biosciences,USA)。使用的抗体如下:APC-CD69(克隆:H1.2F3,ebioscience)，eFluor 450-CD107a(LAMP-1，克隆:eBio1D4B(1D4B)，ebioscience)，APC-CD137(4-1BB，克隆:17B5,ebioscience)和同型对照抗体直接偶联相关荧光染料(ebioscience，美国)。为了研究免疫细胞溶解靶细胞的水平，NK细胞或T细胞加入PBS或相关的外泌体后孵育，在收集细胞前4h时加入Brefeldin A(ebioscience,USA)混合培养。收集的细胞用免疫细胞表面特征标记物染色，然后用固定缓冲液固定，并进行细胞透化(Invitrogen，美国)。细胞内用抗穿孔素-APC抗体(克隆：eBioOMAK-D,ebioscience)、抗granzyme B-PE抗体(克隆：NGZB,ebioscience)或同型对照抗体(均为ebioscience，美国)标记，并送去流式细胞仪分析。
1.9酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测TNF-α和IFN-γ
TNF-α和IFN-γ的浓度分别由小鼠TNF-α和IFN-γELISPOT试剂盒(Mabtech，瑞典)检测。NK细胞或T细胞以2.5×105PBS或不同组外泌体(每组10μg)混合培养后，将其置于抗细胞因子单克隆抗体包被的平板上过夜。每孔的斑点由斑点计数器(EliSpot Reader-iSpot,Germany)自动显示和记录。用斑点定量计数法检测NK细胞或T细胞分泌的细胞因子。
1.10细胞毒性试验
通过CytoTox
Figure BDA0003538984720000081
非放射性细胞毒性试验(Promega，美国)检测效应NK细胞或T细胞对靶细胞的细胞毒性。以BP210或BP210-T315I细胞为靶细胞，用PBS或各组外泌体预先刺激的效应NK细胞或T细胞，并按不同的比例将免疫细胞分别与1×104个靶细胞在每孔中混合。取每个样品上清的一半，与底物溶液孵育。计算得到的乳酸脱氢酶(LDH)释放量反映了免疫细胞的裂解能力。
1.11酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-2
取1x106 T淋巴细胞与PBS或外泌体混合培养上清24h，检测IL-2浓度。采用小鼠IL-2ELISA试剂盒(Mabtech，瑞典)检测各组T淋巴细胞的IL-2水平。
1.12 CFSE检测免疫细胞增殖
将2.5μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE,Invitrogen,USA)加入新鲜分离的NK细胞或T淋巴细胞中，在避光情况下轻柔充分混匀。洗涤后，将细胞置于24孔板中，与各组的外泌体共培养72小时。将收获的NK细胞与PE偶联的CD3ε抗体(克隆:145-2C11,Thermofisher，美国)和PE-cyanine7偶联的DX5抗体(ebioscience，美国)在室温下孵育30分钟。通过PE标记的CD3ε抗体(Thermofisher，美国)、PE-cyanine7标记的CD4抗体(ebioscience，美国)和percp-cyanine5.5标记的CD8α抗体(ebioscience，美国)鉴别CD4+和CD8+ T细胞，并通过流式细胞仪检测细胞增殖情况。
1.13构建小鼠模型
6～8周龄Balb/c小鼠饲养于重庆医科大学动物中心。将3×106BP210或BP210-T315I细胞悬浮于PBS中，并通过尾巴静脉注射进入体内，来建立CML模型。接种CML细胞7天后，每只小鼠皮内注射50μg的各组外泌体或等量的PBS，持续4周。每周测量体重，并进行外周血白细胞计数。当出现体重减轻、皮毛紊乱、典型髓外造血如肝脾肿大、驼背、白细胞异常增高等症状时作为典型的CML样疾病特征。
为了检测外泌体在体内是否具有持久的抗肿瘤作用，治疗周期结束后存活的小鼠分别在尾静脉再次接种3×106BP210或BP210-T315I细胞。采用年龄和性别匹配的新一批Balb/c小鼠作为对照组，尾静脉注射相同数量的BP210或BP210-T315I细胞。本研究中体内实验已经重庆医科大学动物护理与伦理委员会批准。
1.14统计分析
所有实验数据均以均数±标准差(SD)表示。所有统计检验均采用GraphPad Prism8软件生成曲线图。多组间统计学差异采用单因素方差分析。采用t检验比较两组间的差异。生存分析采用Kaplan-Meier法。采用log-rank(Mantel-Cox)检验评价差异。P值<0.05为有统计学意义。
2结果
2.1树突细胞的分离培养和鉴定
用GM-CSF和IL-4诱导培养Balb/c小鼠骨髓源性DC(BMDCs)。首先，根据CD11c、CD80、CD86和MHC I/II类等表面标记物，鉴定DCs亚群的比例和表型特征。图1是流式细胞术检测DC细胞表面标志物的结果，与未处理细胞相比，细胞因子治疗增加了树突状细胞的百分比以及CD80和CD86的表达。
2.2 Dex的分离和鉴定
我们从DC细胞培养液中纯化得到Dex。为了验证Dex的特性，分别采用透射电镜(TEM)和纳米颗粒跟踪分析(NTA)检测Dex的形态和尺寸分布。透射电镜(TEM)观察其呈典型的杯形(图2a)，NTA检测到直径在30～150nm之间(图2b)。通过Western blot检测具有代表性的外泌体标记物，包括HRS、Alix和TSG101，结果表明负载全细胞裂解物并不影响Dex的组成。此外，细胞色素C作为线粒体蛋白被用作外泌体阴性标记物。Western blot分析也表明BP210-RAE-1-Dex和BP210-T315I-RAE-1-Dex(统称为CML-RAE-1-Dex)表达高水平的RAE-1分子(图2c)。
2.3 CML-RAE-1-Dex激活NK细胞并促进其增殖
如图3a-c所示，与对照组Dex、BP210-mock-Dex和BP210-T315I-mock-Dex相比BP210-RAE-1-Dex和BP210-T315I-RAE-1-Dex与NK细胞共培养后能分别上调NK细胞表面分子CD69、CD137(4-1BB)和CD107a的表达。细胞内流式细胞术分析显示，BP210-RAE-1-Dex和BP210-T315I-RAE-1-Dex组的穿孔素表达水平高于CML-mock-Dex组(图3d)。同时，BP210-RAE-1-Dex和BP210-T315I-RAE-1-Dex分别促进NK细胞产生颗粒酶B(GzmB)(图3e)。这些结果表明，暴露于CML-RAE-1-Dex的NK细胞具有更高的细胞毒活性。CFSE结果显示BP210-RAE-1-Dex与BP210-T315I-RAE-1-Dex能显著增强NK细胞的增殖能力(图3f)。
我们将NK细胞与外泌体共培养，然后使用ELISPOT检测TNF-α和IFN-γ的产生。在本实验中，CML-RAE-1-Dex组中TNF-α的斑点数量比各对照组中的斑点数多(图4a)，且NK细胞也在CML-RAE-1-Dex组分泌更多的IFN-γ(图4b)。
采用LDH法比较不同刺激条件下NK细胞的杀伤活性。CML-RAE-1-Dex组的靶细胞裂解率要明显高于其他对照组(图4c)。值得注意的是，经BP210-T315I-RAE-1-Dex处理的NK细胞对有T315I耐药突变的CML细胞株BP210-T315I具有杀伤作用，说明经修饰的Dex对耐药的CML细胞株具有一定的杀伤作用。
因此，这些结果证实，CML-RAE-1-Dex能激活NK细胞并获得较强的抗CML疗效。
2.4 CML-RAE-1-Dex激活T细胞并促进其增殖
通过流式细胞术检测活化T淋巴细胞的生物标志物。与未经过RAE-1修饰的Dex处理的T细胞相比，BP210-RAE-1-Dex或BP210-T315I-RAE-1-Dex刺激的CD4+和CD8+ T细胞表达了更高比例的活化生物标志物，如CD69、CD137和CD107a(图5a-c和6a-c)。同样，我们也观察到与其他组相比，BP210-RAE-1-Dex或BP210-T315I-RAE-1-Dex组CD4+和CD8+ T细胞穿孔素和GzmB的表达显著上调(图5d-e和6d-e)。
采用CFSE标记法检测T淋巴细胞增殖，结果显示BP210-RAE-1-Dex和BP210-T315I-RAE-1-Dex诱导CD4+和CD8+ T细胞增殖较其他对照组强(图5f和6f)。说明CML-RAE-1-Dex能诱导并增强T淋巴细胞的免疫活性，增强CD4+和CD8+ T细胞的活化和增殖。如图7a-b所示，BP210-RAE-1-Dex或BP210-T315I-RAE-1-Dex刺激后，T淋巴细胞分泌相当数量的TNF-α和IFN-γ。如图7c所示，BP210-RAE-1-Dex组和BP210-T315I-RAE-1-Dex组的T细胞IL-2水平明显升高。将CML细胞系BP210和BP210-T315I(靶细胞)分别与活化的T细胞(效应细胞)按多效应靶细胞(E/T)比例共培养。与对照和其他刺激相比，BP210-RAE-1-Dex和BP210-T315I-RAE-1-Dex组的LDH活性显著增加(图7d)。值得注意的是，在BP210-T315I-RAE-1-Dex刺激后，T细胞对BP210-T315I细胞的杀伤能力增加，这暗示了一个解决耐药性问题的潜在途径。
2.5 CML-RAE-1-Dex在小鼠体内具有抗肿瘤活性
为探讨CML-RAE-1-Dex是否具有体内治疗作用，将3×106BP210或BP210-T315I细胞经尾静脉注射入Balb/c小鼠体内，建立小鼠白血病模型。肿瘤细胞接种1周后，小鼠分别皮内注射Dex、CML-mock-Dex、CML-RAE-1-Dex或等量PBS。每周监测外周血白细胞(WBC)计数并记录其最大值。如图8a-c，9a-c所示，BP210-RAE-1-Dex和BP210-T315I-RAE-1-Dex治疗组小鼠的白细胞水平和肝、脾重量均显著低于其他对照组。瑞氏染色结果表明，与其他对照组小鼠相比，接受BP210-RAE-1-Dex或BP210-T315I-RAE-1-Dex治疗的小鼠其骨髓、肝和脾细胞观察到较少的白血病细胞浸润(图8d，图9d)。苏木精/伊红(H&E)染色结果证实，对照组肝脏和脾脏中有较多的白血病细胞浸润(图8e，图9e)。免疫荧光法检测骨髓、肝脏、脾脏中BCR-ABL的表达水平，与CML-RAE-1-Dex组相比，PBS组、Dex组和CML-mock-Dex组中BCR-ABL表达水平较高(图8f，图9f)。上述结果表明，CML-RAE-1-Dex治疗能有效抑制白血病细胞增殖和浸润。Kaplan-Meier生存分析显示，与其他组相比，接受BP210-RAE-1-Dex或BP210-T315I-RAE-1-Dex治疗的肿瘤小鼠的总生存期明显延长(图8g，图9g)。综上所述，CML-RAE-1-Dex可抑制BCR-ABL或BCR-ABLT315I诱导的CML的发生和发展，从而显著提高CML小鼠的总生存期。
2.6 CML-RAE-1-Dex在小鼠体内的免疫预防作用
受到CML-RAE-1-Dex诱导的强大抗肿瘤免疫反应的鼓舞，我们想要探索CML-RAE-1-Dex是否能在体内引起持久的免疫反应。为了评估CML-RAE-1-Dex介导的对CML的长期免疫作用，我们将相同数量的BP210或BP210-T315I细胞再次注入上述CML-RAE-1-Dex治疗组小鼠体内。用年龄和性别匹配的小鼠接种同量肿瘤细胞作为对照组。如图10a-c所示，对照组白细胞异常升高，肝脾肿大，而CML-RAE-1-Dex组无此现象。说明接种BP210-RAE-1-Dex和BP210-T315I-RAE-1-Dex后的存活小鼠对CML细胞的二次暴露具有明显的免疫保护作用。同时，如图10d-e所示，Wright’s和H&E分析证实CML-RAE-1-Dex组小鼠的骨髓、肝脏和脾脏的白血病浸润有所缓解。此外，比较各组各组织中BCR-ABL癌蛋白的表达水平得到一致结果(图10f)。与预期的一样，BP210-RAE-1-Dex和BP210-T315I-RAE-1-Dex疫苗接种组与对照组相比小鼠的生存时间显著延长(图10g)。
总之，这些结果进一步揭示了CML-RAE-1-Dex疫苗诱导了强烈的记忆反应，并对抵抗白血病细胞攻击提供了长期保护。

Claims (9)

1.一种白血病特异性树突状细胞来源的过表达RAE-1的外泌体无细胞疫苗，其特征在于：是将过表达RAE-1的CML细胞裂解得到的肿瘤细胞裂解物与树突状细胞共培养得到成熟的树突状细胞，分离成熟的树突状细胞的外泌体，对外泌体进行纯化后得到；所述过表达RAE-1的CML细胞是用表达RAE-1γ的慢病毒转染CML细胞得到。
2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述CML细胞为T315I突变CML细胞。
3.权利要求1或2所述的疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)用表达RAE-1γ的慢病毒转染CML细胞，获得过表达RAE-1的CML细胞CML-RAE-1；
2)收集CML-RAE-1细胞，裂解，得到肿瘤细胞裂解物；
3)用培养液A诱导培养树突状细胞，培养6-8天后，取含有树突状细胞的培养液A与肿瘤细胞裂解物混合共培养，每1ml培养液A与80-120μg肿瘤细胞裂解物混合，共培养7-9小时后用培养液B培养树突状细胞直至成熟；所述培养液A为完全培养液；所述培养液B为含胎牛血清、GM-CSF、IL-4、TNF-α的完全培养液；
4)取培养得到的成熟树突状细胞提取外泌体，纯化后即得。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中用基于CV186载体构建的表达RAE-1γ的慢病毒转染CML细胞。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述裂解为通过反复冻融法裂解细胞。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述裂解的具体方法为：用液氮冷冻细胞10min，随后在37℃恒温水浴中解冻，解冻后再次液氮冻结细胞10min，再37℃解冻，经过总共三次重复的冷冻/解冻循环后，通过离心去除细胞碎片，随后将上清通过0.22μm过滤器得到肿瘤细胞裂解物。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中含有树突状细胞的培养液A与肿瘤细胞裂解物在37℃、5％CO2的条件下共培养7-9小时；
所述培养液A为含有10％胎牛血清、10ng/ml GM-CSF、5ng/ml IL-4的RPMI 1640培养基；
所述培养液B为含有10％胎牛血清、10ng/ml GM-CSF、5ng/ml IL-4、10ng/ml TNF-α的RPMI 1640培养基。
8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤4)中外泌体的提取方法为：取含有血清的完全培养液通过超离心去除培养液中的外泌体得到去外泌体培养基，将步骤3)培养得到的成熟树突状细胞用去外泌体培养基培养过夜，然后收集培养液的上清液通过离心过滤法纯化。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述纯化的具体方法为：收集培养液的上清液后以300g进行离心10分钟以去除细胞和细胞碎片后，连续离心进一步纯化：2000g离心10min，10000g离心30min，以去除细胞碎片；上清液通过0.22μm膜过滤后，4℃100,000g超离心70min；沉淀在预冷的PBS中重悬，4℃100,000g再离心70min，即得到树突状细胞来源的外泌体。
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