CN102091327A - 一种负载自体肿瘤相关全抗原的树突状细胞疫苗的制备方法 - Google Patents

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CN102091327A CN2010106069604A CN201010606960A CN102091327A CN 102091327 A CN102091327 A CN 102091327A CN 2010106069604 A CN2010106069604 A CN 2010106069604A CN 201010606960 A CN201010606960 A CN 201010606960A CN 102091327 A CN102091327 A CN 102091327A
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本发明属于生物细胞制剂的制备，特别是指一种负载自体肿瘤相关全抗原的树突状细胞疫苗的制备方法。包括制备自体肿瘤相关全抗原，采取和分离培养DC细胞，用自体肿瘤相关全抗原冲击DC细胞，使DC细胞成熟并制备成自体肿瘤抗原特异性DC疫苗。本发明解决了现有技术存在的所用肿瘤抗原的免疫原性不够强、抗原靶点不完全、多数肿瘤病人的肿瘤抗原不易获得等问题。本DC疫苗具有能够有效的在体外和体内诱导肿瘤抗原特异性CTL、并能高效率的对肿瘤产生特异性杀伤、临床应用的总体有效率高、无明显毒副作用等优点。

Description

一种负载自体肿瘤相关全抗原的树突状细胞疫苗的制备方法
技术领域
本发明属于生物制剂的制备，特别是指一种负载自体肿瘤相关全抗原的树突状细胞疫苗的制备方法。
背景技术
肿瘤在我国多发，近年来其发生率和死亡率逐年上升，成为威胁人类健康的主要因素之一。肿瘤是全身性疾病，在传统的手术、放疗和化疗中，手术和放疗属于局部治疗手段，尽管能有效减低肿瘤负荷，但难以解决转移和复发问题。化疗是传统手段中唯一的全身治疗手段，但存在有效率低（30%左右）、副反应大、耐药性、和严重的免疫抑制等缺陷，而限制了临床应用。因而临床期待一种副反应小、有效率高、安全、可靠的全身治疗手段。
肿瘤免疫学的迅速发展，为肿瘤免疫治疗提供了一种新理念、新思路。肿瘤“免疫监视”学说的建立，为肿瘤的发生、发展提供了一种全新的解释。肿瘤病人机体免疫系统的“免疫监视”功能降低，致使其自身免疫系统不能有效的识别和清除变异的细胞，造成肿瘤的发生。“肿瘤微环境”学说解释了肿瘤病人自身免疫系统的无能，导致肿瘤无限制生长的原因。如何调动机体免疫系统对肿瘤的识别和杀伤功能，达到治疗肿瘤的目的，成为近年来人们关注的重点问题。
大量的基础研究证实，在“肿瘤微环境”下，会出现外周血CD4+CD25+的调节性T淋巴细胞（Treg）水平增高，白细胞介素-10（IL-10）、肿瘤生长因子-β（TGF-β）、白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-6（IL-6）等免疫抑制因子水平升高，以及树突状细胞（DC）功能降低、肿瘤细胞的表面抗原隐匿等。特别是Treg、IL-10和TGF-β等免疫抑制因素，造成自身免疫系统功能低下而不能有效地识别和杀伤肿瘤细胞，因而造成肿瘤的“免疫逃逸”或“免疫耐受”。
DC细胞是启动免疫系统对肿瘤进行识别和杀伤的关键细胞。DC细胞被认为是唯一的和专职的抗原提呈细胞，DC细胞能够在致炎因子的参与下，捕获肿瘤抗原，通过细胞内的加工过程制备成抗原多肽，然后将这些抗原多肽转移到细胞表面，并同MHC分子结合而形成MHC-抗原复合物，同时完成由非成熟DC向成熟DC的转化，获得其提供抗原和激活T细胞的强大功能。
DC疫苗是近年来发展起来的新型肿瘤疫苗，其机理主要是将携带肿瘤抗原的DC疫苗接种病人，以诱导体内产生持久、特异性的抗肿瘤免疫应答，达到识别和清除肿瘤细胞的目的。目前DC诱导的肿瘤免疫治疗已经作为三类医疗技术获批应用于临床。
DC疫苗的制备通常包括三个步骤：首先获取肿瘤抗原，再从病人外周血获取DC细胞，然后用肿瘤抗原冲击DC使其负载肿瘤抗原，即制备成DC疫苗。
DC疫苗的制备方法很多。首先抗原的选择种类很多，如肿瘤细胞性全抗原（放射线灭活的肿瘤细胞、肿瘤细胞裂解物等）、肿瘤细胞的亚细胞成分（凋亡小体、外排小体exosome、自噬小体autophage等）、肿瘤特异性抗原蛋白/多肽、肿瘤相关性抗原蛋白/多肽、肿瘤细胞mRNA、杂交融合的肿瘤细胞等。DC的来源种类也很多，可从外周血的直接分离、从骨髓造血细胞分离、从外周血单状核细胞分离、免疫磁珠法分离等。体外抗原冲击一般采用合适的抗原剂量，加入DC细胞的培养体系中，经过24-48小时孵育，祛除游离的抗原和细胞碎片即获得DC疫苗。
但是目前DC疫苗的临床应用受到限制，一是由于所用肿瘤抗原的免疫原性不够强，二是由于多数肿瘤病人的肿瘤抗原不易获得，三是临床疗效有限。肿瘤特异性抗原蛋白/多肽和肿瘤相关性抗原蛋白/多肽，抗原性弱，激活免疫的靶点单一，疫苗的免疫原性差，目前对大多数肿瘤来说，尚无法确定其有效的肿瘤特异性或相关性抗原，且受到HLA限制，因而很难广泛应用。肿瘤细胞mRNA虽能代表肿瘤全抗原，但制备过程复杂、容易降解而造成抗原的缺失，临床难以推广。肿瘤细胞裂解物等，含有肿瘤细胞全抗原的蛋白或多肽，抗原性强且完整，DC细胞摄取加工后所携带的抗原靶点全面，激发机体产生的抗肿瘤免疫全面，因而是一种很好的抗原选择，但许多病人的肿瘤细胞难以获取或细胞数量不足，是临床亟待解决的问题。应用蜡块标本制备肿瘤全抗原，尽管扩大了自体肿瘤抗原的来源，但标本处理的过程中难以避免大量抗原成分的丢失，使其临床应用同样受限。用以上抗原制备的DC疫苗，经临床应用发现疗效有限。
因而，临床急需一种临床获取方便、抗原靶点完整、抗原性强且稳定、并能在临床容易操控的特定条件下，激发机体产生强大抗肿瘤免疫应答的肿瘤特异性DC疫苗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种负载自体肿瘤相关全抗原的树突状细胞疫苗的制备方法，采用一种自体肿瘤相关全抗原，制备自体肿瘤抗原特异性DC疫苗，并能在特定条件下激发强大的抗肿瘤免疫反应。
本发明的整体技术构思是：
一种负载自体肿瘤相关全抗原的树突状细胞疫苗的制备方法，包括如下工艺步骤：
A、制备自体肿瘤相关全抗原；
B、采取和分离培养DC细胞；
C、用自体肿瘤相关全抗原冲击DC细胞，使DC细胞成熟并制备成自体肿瘤抗原特异性DC疫苗。
本发明的具体技术解决方案和工艺路线是：
所述的步骤A包括如下工艺步骤：
A1、采用手术切除、内镜或穿刺活检获得的新鲜肿瘤组织、胸腹水离心获得的新鲜自体肿瘤细胞中的一种制成自体肿瘤细胞裂解物蛋白；
A2、将步骤A1中的自体肿瘤细胞裂解物蛋白和同源的细胞株裂解物蛋白混合，制备成自体肿瘤相关全抗原。
步骤A1中手术切除、内镜或穿刺活检获得的新鲜肿瘤组织采用如下方法：
取肿瘤周边部分组织0.3-1.0cm3，剪除周围非肿瘤组织，庆大霉素-生理盐水反复洗涤3-5次，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用。
步骤A1中胸腹水离心获得的新鲜自体肿瘤细胞采用如下方法：
取胸、腹水1500-2000ml，在转速为1200转/分钟条件下离心5分钟，生理盐水洗涤离心3次，300目钢网过网后获得单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用。
步骤A2中和同源的细胞株抗原混合，制备成自体肿瘤相关全抗原采用如下方法：
反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量，制成同源细胞株裂解物蛋白；将同源细胞株裂解物蛋白与步骤A1中制备的自体肿瘤细胞裂解物蛋白按照质量比为1:1的比例混合，制备成自体肿瘤相关全抗原备用。
步骤B中DC细胞的采取选用外周血直接采取获得、外周血单状核细胞分离获得、通过骨髓造血细胞分离获得、通过骨髓或其他组织来源的间充质干细胞定向分化获得、或通过HLA基因半相合或全相合同种异体外周血、单状核细胞、骨髓造血细胞、间充质干细胞分离分化获得方法中的一种。
步骤B单状核细胞采集和分离包括：
B1、单状核细胞采集前，用GM-CSF 150μg皮下注射，1次/日，行骨髓动员2-3天；
B2、用COBE SPECTRA细胞成分分离机，按照说明书中“单状核细胞采集”的设定参数设定程序，外周血循环6000-8000ml，采集单状核细胞140-160ml；
B3、将步骤B2中的单状核细胞分装入50ml离心管，细胞离心机1500转/分离心5分钟，收集上层血浆移入50ml离心管，加入质量比为10%葡萄糖酸钙溶液2.5ml吹打混匀，56℃水浴35分钟，2500转/分离心5分钟，收集上清制备成自体灭活血清，4℃冷藏备用；
B4、收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含密度为1.077g/ml的密度梯度淋巴细胞分离液15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机在2000转/分钟的转速下离心15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层即为单状核细胞。分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混匀，在1500转/分的转速下离心10分钟后弃上清；加入生理盐水45ml轻柔吹打混匀，在1000转/分的转速下离心5分钟洗涤，弃上清；重复洗涤3次后，加入RPMI-1640培养基，细胞计数（细胞总数量6-10×109）；
B5、在75cm3培养瓶中加入RPMI-1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化；将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在1×107个/ml，按体积百分比为10%-20％加入自身血清，于37℃，体积百分比为5%CO2的饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟取出，移除悬浮细胞和培养液，贴壁细胞即为DC细胞。
步骤C包括如下工艺方法：
在步骤B制备的DC细胞中加入无血清DC培养基20ml，在培养基中按照如下含量添加各种组分：
GM-CSF 500μg/500ml
IL-4 300μg/500ml
庆大霉素2.0万单位/500ml
其中无血清DC培养基选自美国SIGMA公司或美国BD公司的产品；
将上述培养基置于37℃，体积百分比为5% CO2的饱和湿度培养箱中扩增培养；第6天加入步骤A制备的自体肿瘤相关全抗原50μg/ml，次日补充体积百分比为10%-15%的自体血清，培养2天后获取DC疫苗，流式细胞检测CD80、CD83、CD86、HLA-ABC、HLA-DR表达，鉴定DC疫苗功能。
本发明所制备的DC疫苗是这样使用的：
本发明制备的自体肿瘤特异性DC疫苗，主要用途有两个方面，一是体外诱导制备自体肿瘤特异性CTL，过继回输行肿瘤的细胞免疫治疗；二是表浅淋巴结接种，体内诱导肿瘤特异性杀伤，用于DC疫苗接种的肿瘤免疫治疗，或联合过继回输的细胞免疫治疗。DC疫苗接种治疗或联合DC-CIK-CTL过继回输治疗前，首先应用小剂量CTX或TBI技术，对病人的肿瘤微环境进行干扰，可显著下调Treg、IL-10和TGF-β等免疫抑制因子水平，消除肿瘤微环境中的免疫抑制因素，打破肿瘤免疫耐受。干扰后次日，行DC疫苗的表浅淋巴结接种和/或DC-CIK-CTL过继回输治疗。动物实验和临床试验证实，在以上条件下，本发明制备的DC疫苗，能够有效的在体外和体内诱导肿瘤抗原特异性CTL，并能有效的对肿瘤产生高效率的特异性杀伤。
本发明所制备的疫苗的试验结果如下：
一、实验目的：
（一）应用肿瘤病人自体肿瘤相关全抗原，负载自体DC细胞，制备自体肿瘤抗原特异性DC疫苗；
（二）应用负载自体肿瘤相关全抗原的DC，激活自体T淋巴细胞，制备自体肿瘤特异性CTL（效应细胞）；
（三）实验室实验研究，证实DC疫苗诱导的CTL对自体肿瘤细胞的杀伤效率； 
（四）动物实验研究，证实DC疫苗体内诱导的特异性抗肿瘤免疫杀伤效应；
（五）临床试验研究：证实DC疫苗在干扰肿瘤微环境、打破肿瘤免疫耐受条件下临床应用的实际疗效。
二、实验设计：
（一）自体肿瘤相关全抗原获取：手术切除、内镜或穿刺活检获取的新鲜肿瘤组织、胸腹水离心获取的新鲜肿瘤细胞、同组织来源的细胞株。
（二）自体DC和T细胞获取：应用COBE Spectra血液成分分离机，获取外周血DC和T细胞。
（三）DC疫苗制备：自体肿瘤相关全抗原负载DC细胞，获得DC疫苗。
（四）DC疫苗的功能检测：
（1）DC疫苗诱导肿瘤特异性CTL的实验：负载抗原的DC和T细胞共培养，获得肿瘤特异性CTL；
（2）in vitro实验：观察肿瘤特异性CTL对自体肿瘤细胞的杀伤效应（Cytotoxicity assay）；
（3）in vivo实验：动物实验观察CTL的肿瘤特异性杀伤效应；
（五）临床试验：选择肺癌病人10例，按照特定治疗流程进行治疗，观察临床疗效和副反应。
三、实验步骤：
（一）自体肿瘤相关全抗原的制备：
自体肿瘤相关全抗原的制备方法如下：取手术切除、内镜或穿刺获得的新鲜自体肿瘤标本、胸腹水离心获得的新鲜自体肿瘤细胞抗原，和同源的细胞株抗原混合，制备成自体肿瘤相关全抗原。这种自体肿瘤相关全抗原的特点是：一是具有和自体肿瘤相关的肿瘤全抗原，该全抗原的抗原靶点完整、稳定、抗原性强，具备个体化特征且不存在HLA限定性；二是同源的细胞株抗原成分95%以上和自体肿瘤抗原相同，因而能有效地补充自体肿瘤抗原的不足，而且少量的异抗原可使抗原性增强；三是大多数肿瘤病人可通过以上抗原制备方法获得自体肿瘤相关抗原，从而获得免疫治疗的机会；四是少数不能获取自体肿瘤抗原的病人，可以用相同组织来源的细胞株抗原代替，同样不失自体肿瘤抗原相关的特征。
具体步骤是：
（1）手术切除的新鲜肿瘤组织：取肿瘤周边部组织（避免肿瘤中心的坏死组织）0.3-1.0cm3（可液氮或-80℃冰箱保存备用），剪除周围非肿瘤组织，庆大霉素-生理盐水反复洗涤3-5次，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用。
（2）胸、腹水获得的肿瘤细胞：取胸、腹水1500-2000ml，1200rpm离心，生理盐水洗涤离心3次，300目钢网过网后获得单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用。
（3）同组织来源细胞株：反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用。
（4）取自体肿瘤裂解物蛋白和同源细胞株裂解物蛋白各50%，混合制备成自体肿瘤相关全抗原，定量备用。
（二）DC细胞的获取和分离：
本发明采用的DC细胞，可通过外周血直接采取获得，可通过外周血单状核细胞分离获得，可通过骨髓造血细胞分离获得，可通过骨髓或其他组织来源的间充质干细胞定向分化获得，还可以通过HLA基因半相合或全相合同种异体外周血、外周血单状核细胞、骨髓造血细胞、或其他组织来源的间充质干细胞分离或定向分化获得。
具体步骤是：
（1）单状核细胞采集：单状核细胞采集前，首先应用GM-CSF 150μg皮下注射，1次/日，行骨髓动员2-3天。采集日，应用COBE SPECTRA细胞成分分离机，按照说明书中“单状核细胞采集”的设定参数设定程序，外周血循环6000-8000ml，采集单状核细胞140-160ml。分装入50ml离心管，细胞离心机1500转/分离心5分钟。收集上层血浆移入50ml离心管，制备自体灭活血清（加入10%葡萄糖酸钙2.5ml吹打混匀，56℃水浴35分钟，2500转/分离心5分钟，收集上清），4℃冷藏备用。收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液（Ficoll，1.077）15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpm×15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层（单状核细胞）。分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混匀，离心1500rpm×10分钟，弃上清。加入生理盐水45ml轻柔吹打混匀，离心1000rpm×5分钟洗涤，弃上清。重复洗涤3次后，加入RPMI-1640培养基，细胞计数（细胞总数量6-10×109）。
（2）DC细胞分离：75cm2培养瓶分别加入RPMI-1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化。将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在1×107个/ml，加入终浓度10-20％的自身血清，37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟取出，移除悬浮细胞和培养液（用作CIK和CTL制备），贴壁细胞即为非成熟DC细胞（imature DC）。
（3）流式细胞检测：取培养5天的imDCs 1.2×106/ml，加入20%兔血清400ul，4℃冰箱避光孵育20分钟；分装入流式细胞检测管，300g离心10分钟，弃上清，分别加入标有不同颜色荧光素的单克隆抗体工作液10μl (PE-IgG2a mAb，FITC-IgG2bmAb，PE-IgG1mAb，PE-HLA-ABCmAb，FITC-HLA-DRmAb，PE-CD83mAb，PE-CD80mAb，PE-CD86mAb)，避光4℃30分钟进行标记，PBS洗2次，上机检测。
结果：
肿瘤病人非成熟DC的表面标志物CD80、CD83、CD86和HLA-DR均显著低于健康正常人（P<0.01, respectively; Table 1）：
Table 1. DC markers in imature DCs（n=10；x±s）
DC markers Patientswith cancer Healthyvolunteers
CD80 19.17±3.31* 42.11±4.79**
CD83 26.33±4.72* 54.70±4.47**
CD86 32.53±6.05* 83.62±10.26**
HLA-DR 40.32±8.24* 80.13±13.52**
HLA-ABC 94.69±9.24＊ 95.14±10.68＃
* vs **: P<0.01, respectively; ＊vs＃: P>0.05;
（三）DC疫苗的制备：
自体肿瘤特异性DC疫苗，是通过自体肿瘤相关全抗原冲击非成熟DC细胞，然后将负载肿瘤全抗原的非成熟DC细胞培养成熟制备而成。
具体步骤是：
上述贴壁的DC细胞中加入RPMI-1640无血清培养基20ml（含GM-CSF 500μg/500ml，IL-4 300μg/500ml，庆大霉素2.0万单位/500ml），置于37℃，5%CO2的饱和湿度培养箱中扩增培养。第6天加入自体肿瘤相关全抗原50μg/ml，次日补充10-15%的自体血清，培养48小时获取DC疫苗（图1）。
DC标志物鉴定：取培养7天的imDCs 1.2×106/ml，加入20%兔血清400μl，4℃冰箱避光孵育20分钟；分装为6管，300g离心10分钟，弃上清，分别加入标有不同颜色荧光素的单克隆抗体工作液10μl （PE-IgG2a mAb，FITC-IgG2bmAb，PE-IgG1mAb，PE-HLA-ABCmAb，FITC-HLA-DRmAb，PE-CD83mAb，PE-CD80mAb，PE-CD86mAb），避光4℃30分钟进行标记，PBS洗2次，上机流式细胞检测。
分泌IL-12功能检测：取培养48小时后的DC上清液，应用酶标仪在450nm波长，按ELISA试剂盒说明，测定A值，计算各组上清中IL-12的平均浓度,并据标准曲线计算IL-12的量（pg/ml）。
T细胞活化功能鉴定：取imDC、mDC、以及自体和异体T淋巴细胞，分别按E:T=20:1的比例加入96 孔圆底培养板，37℃、5%CO2培养箱共培养24小时，加入CCK-8试剂20μl/孔,培养3小时后，酶标仪450nm波长测定OD值。
结果：
非成熟DC培养5天后，于第6天加入肿瘤抗原，培养2天后，完成DC的成熟过程，并制备成DC疫苗。此时的DC为成熟DC，其特征为：细胞表面出现明显的树突样突起（图2）、细胞表面标志物的表达显著上调（Table 2）、分泌IL-12的水平显著提高（图3）、并能有效的激活自体或异体T细胞（图4）。
 
Table 2.  DC markers in mature DCs（n=10；x±s）
DC markers Patientswith cancer Healthyvolunteers
CD80 75.02±2.67* 78.26±3.61**
CD83 83.73±10.18* 85.54±10.13**
CD86 95.23±7.81* 93.16±9.16**
HLA-DR 87.54±7.66* 88.47±11.62**
HLA-ABC 95.23±10.17* 96.33±8.87**
* vs **: P>0.05, respectively;
（四）DC疫苗抗瘤效应的实验研究：
1、DC诱导肿瘤特异性CTL的实验研究：
负载肿瘤相关全抗原的DC细胞分别和自体或异体T细胞按比例1:5、1:10、1:20、1:40分组混合，在RPMI-1640培养基中加入GM-CSF、IL-4、TNF-α培养1周，每3天换液，维持细胞浓度在1×106/ml；一周后按以上比例加入DC再刺激，培养48小时后获得肿瘤特异性CTL（图5、6）。
INF-γ检测：取培养48小时后的CTL上清液，应用酶标仪在450nm波长，按ELISA试剂盒说明，测定A值，计算各组上清中INF-γ的平均浓度,并据标准曲线计算INF-γ的量（pg/ml）。
结果：
负载肿瘤相关全抗原的DC，诱导制备的肿瘤特异性CTL，较未负载抗原的DC诱导的CTL，分泌INF-γ的能力显著增强（P<0.05；图7）。
2、CTL的体外特异性杀伤实验（in vitro）：
取平底96孔板，加入原代培养的肿瘤细胞1×104/100ul/孔，培养3-4天后肿瘤细胞长满孔底，按E:T= 20:1的比例加入CTL,同时设单一靶细胞、单一效应细胞及空白对照，每组各设3个复孔。培养24小时,加入CCK-8试剂20μl/孔,培养3小时，用酶标仪450nm波长测定A 值，如下公式计算CTL对肿瘤细胞的杀伤效率（%）。
                               
Figure 34039DEST_PATH_IMAGE001
由负载自体肿瘤相关抗原的DC诱导产生的CTL对原代培养的自体肿瘤细胞的杀伤效率为83.77%±0.72%，显著高于对异体原代肿瘤细胞的杀伤效率（19.30%±0.71%；P<0.01；图8），表明CTL的特异性杀伤效应。
3、干扰肿瘤微环境基础上，DC疫苗诱导体内肿瘤特异性杀伤实验（in vivo）：
（1）裸鼠人源化免疫重建：取非贴壁的单状核细胞，悬浮于RPMI-1640完全培养基，轻柔注入尼龙毛柱，37℃水浴1小时，洗出的非贴壁细胞即为人外周血T细胞（HuPBTL），FCM检测其纯度，PBS洗涤2次，调整细胞浓度为6×107/ml。裸鼠腹腔注射HuPBTL（3×107/0.5ml），建立裸鼠人源化免疫重建模型。重建后第2、7、14天流式细胞检测人源T细胞（CD3+、CD4+、CD8+）比例。
结果：
重建用人源T细胞纯度为92%。重建后2、7、14天均可检测出人源T细胞标志物的稳定表达（Table 3），证实裸鼠体内人源化免疫重建成功。
Table 3. The rate of HuPBTL（%；x±s）in human imunity-reconstructed nude mice
T cellmarkers Day 2 Day 7 Day 14
Human CD3+ 46.86±9.14 43.52±9.76 45.78±8.21
Human CD4+ 31.68±10.17 37.23±9.68 35.45±7.43
Human CD8+ 17.91±1.38 22.65±3.16 25.67±6.12
（2）人结肠癌裸鼠模型构建：
取原代培养的人结肠癌细胞4×106/0.2ml，接种于裸鼠右腋窝中部外侧皮下造模，造模后12天，肿瘤生长至0.5cm3大小，成瘤率100%。
（3）CTX干扰肿瘤微环境：
取健康人外周血T细胞经裸鼠尾静脉注射，行人源化免疫重建；人结肠癌原代细胞4×106/0.2ml皮下接种裸鼠造模；造模前和造模后12天采取鼠外周血单状核细胞，流式细胞检测CD4+CD25+Treg比率。造模第12天腹腔内注射环磷酰胺2.0mg/2.0ml，分别于注射后第2、4、6、8、10、12、14天处死动物采集外周血，流式细胞检测CD4+CD25+Treg比率。
结果：
健康裸鼠（Control）外周血Treg水平为4.48%，造模成功后第12天Treg水平明显升高（16.89%; P<0.01）。应用CTX处理后第2-8天，Treg水平显著降低，第10天恢复原有水平（图9）。
（4）DC疫苗诱导的肿瘤免疫杀伤：
裸鼠腹腔注射HuPBTL（3×107/0.5ml）人源化免疫重建，同时右腋窝中部外侧皮下接种人结肠癌细胞（4×106/0.2ml）造模。肿瘤生长到0.5cm3时，皮下注射肿瘤特异性DC疫苗1-2×106/0.2ml,一周后重复一次。观察肿瘤生长情况及皮疹、腹泻等副反应。
结果：
PBS阴性对照组肿瘤生长迅速，DC疫苗治疗组（TLDC）肿瘤生长明显减缓，CTX+DC疫苗治疗组（CTX-TLDC）肿瘤生长显著受抑（P<0.01；图10）。未见腹泻、烦躁、皮色改变、皮疹等自身免疫反应或副反应。
（5）临床试验：
选择非小细胞肺癌病人10例，男7例，女3例，平均年龄62岁。其中肺腺癌8例，肺鳞状细胞癌2例，均有病理组织学确诊。CT证实其中4例为肺内孤立病灶，行手术切除；6例同时具有纵隔淋巴结、肺内播散、或骨转移。卡氏评分80-90分3例，70-80分4例，40-60分3例。治疗前查：血常规、肝功能、血生化、乙肝表面抗原等。
自体肿瘤相关全抗原获取：4例手术切除后获得自体肿瘤组织；3例在CT介导下行组织穿刺获得自体肿瘤组织；2例大量胸水穿刺、离心获得自体肿瘤细胞；1例锁骨上淋巴结活检获得自体肿瘤组织。肺腺癌和肺鳞状细胞癌细胞株由上海细胞库购入。
应用COBE SPECTRA血液成分分离机采取外周血单状核细胞，Ficoll分离，贴壁法获取DC细胞和T细胞。将自体肿瘤抗原和细胞株抗原混合制备自体肿瘤相关全抗原，负载DC制备肿瘤特异性DC疫苗。以负载抗原的DC和T细胞共培养制备肿瘤特异性CTL；在CD3单抗和IL-2细胞因子参与下，DC和T细胞共培养10天制备DC-CIK。将DC-CIK和CTL混合入200ml生理盐水中（含人血白蛋白2.0g，IL-2 20万单位）制备成效应细胞制剂，细胞数量控制在1-3×109。
治疗前应用CTX 800-1200mg静脉注射，1次/日，共2天，同时应用止吐药。第3天行DC疫苗表浅淋巴结接种，同时细胞制剂静脉回输。回输治疗日1次共6次，DC疫苗接种1次/周，共3次。治疗期间同时应用退热药物、止吐药物、利尿药物等以缓解发热、消化道反应、以及水肿等副反应。
治疗期间观察：卡氏评分的改善情况及副反应，并对症处理。一个疗程结束休息1个月，2个疗程后评估疗效。评估按照RECIST标准：CR：目标病灶完全消失，未出现新发转移灶，维持4周以上；PR：病灶缩小30%以上，无新发转移灶，维持4周；SD：非PR非PD；PD：病灶增大20%，增大前属于非CR/PR/SD。
结果：
1例病灶完全消失，并维持6个月以上（CR；10%； 图11）；3例病灶缩小30%以上，并维持5周以上（PR；30%； 图12）；2例病灶无变化，1例病灶缩小未达到30%，均未出现新发转移灶（SD；30%）；1例肿瘤增大超过20%，1例病灶无变化但出现新发转移灶，1例出现肝转移死亡（PD；30%）。总体有效率（CR＋PR＋SD）为70%。副反应：发烧38.5℃左右4人，食欲减退3人，未见其他副反应。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
动物实验和临床试验证实，本发明制备的DC疫苗，能够有效的在体外和体内诱导肿瘤抗原特异性CTL，并能有效的对肿瘤产生高效率的特异性杀伤。本疫苗临床应用的总体有效率高达68-70%，远远高于其他DC疫苗治疗以及DC疫苗联合过继回输治疗（CIK法、DC-CIK法、CTL法、NK法、TIL法等）的30-45%的总体有效率，且无明显的毒副反应。本发明所制备的自体肿瘤特异性DC疫苗，具有临床操作简易、安全可靠、副反应小、有效率高等特征，为临床提供了又一优选的DC疫苗和用于细胞免疫治疗的新途径。
附图说明
本发明的附图有：
图1是本发明的工艺流程图。
图2是本发明的DC疫苗在不同培养时期的镜下形态图。
图2中培养的1-5天，属于未成熟DC，形态特点是类圆形，细胞表面平滑，缺少树突样结构。随培养时间延长，细胞表面逐渐出现树突样结构。加入抗原后培养2天，DC成熟，细胞表面呈典型的树突样突起。
图3是体外制备的DC疫苗，其标志性细胞因子IL-12的分泌量示意图。
图3中体外制备的DC疫苗，其标志性细胞因子IL-12的分泌量显著升高。
图4是携带肿瘤抗原的DC疫苗，对自体T细胞和同种异体T细胞的激活效果示意图。
携带肿瘤抗原的DC疫苗，能有效的激活自体T细胞和同种异体T细胞，且在DC:T为1：20时，激活效率最高。
图5是携带肿瘤抗原的DC疫苗，在第一信号和第二信号共同参与下激活T细胞，制备肿瘤特异性CTL的示意图。
携带肿瘤抗原的DC疫苗，在第一信号和第二信号的共同参与下，能够有效的激活T细胞，制备成肿瘤特异性CTL。第一信号即，DC表面的MHC分子提供抗原给T细胞表面的T细胞受体（TCR）；第二信号即，DC表面的B7分子（CD80、CD86）激活T细胞表面的CD28分子。
图6是 DC细胞激活T细胞的电镜示意图。
图7是体外制备的CTL，其标志性细胞因子INF-γ的分泌量示意图。
图7中体外制备的CTL，其标志性细胞因子INF-γ的分泌量显著增高。
图8是体外制备的自体肿瘤特异性CTL，对肿瘤特异性杀伤效果示意图。
图8中体外制备的自体肿瘤特异性CTL，对肿瘤的特异性杀伤能力显著增强。负载肿瘤相关全抗原的DC诱导的肿瘤特异性CTL，对自体肿瘤细胞的杀伤效率（83.77%±0.72%），显著高于对异体肿瘤细胞的杀伤效率（19.30%±0.71%；P<0.01）。
图9是循环应用CTX干扰肿瘤微环境，CD4+CD25+ Treg水平变化示意图。
图9中裸鼠造模后10天（Tu），外周血Treg水平显著高于造模前裸鼠（Con；P<0.01）；CTX腹腔注射后2-8天，Treg维持在较低水平，第10天恢复到用药前水平（P<0.01）。
图10是肿瘤特异性CTL对肿瘤的特异性杀伤效果示意图。
图10中的动物实验表明，肿瘤特异性DC疫苗能有效的诱导体内抗肿瘤免疫杀伤，而在干扰肿瘤微环境基础上，DC疫苗诱导的体内抗肿瘤免疫杀伤效果显著增强（*vs**: P<0.01）。
图11是肺癌患者治疗前后体表转移结节对照图。
图11中一个疗程后26天，头皮下和腋窝皮下转移结节消失（CR）。
图12是肺癌病人应用本发明制备的DC疫苗联合DC-CIK-CTL过继回输治疗一个疗程后，肿瘤前后变化示意图。
图12中肺癌病人应用本DC疫苗联合DC-CIK-CTL过继回输治疗一个疗程后，肿瘤缩小50%以上（PR）。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
本发明中的方法所制备的DC疫苗在干扰肿瘤微环境条件下应用，激发机体产生高效率抗肿瘤免疫应答，以达到治疗肿瘤、延缓肿瘤进程、争取带瘤生存、改善生存质量和延长生存期的免疫治疗效果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据本发明说明书所作出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
本实施例的整体技术构思是：
一种负载自体肿瘤相关全抗原的树突状细胞疫苗的制备方法，包括如下工艺步骤：
A、制备自体肿瘤相关全抗原；
B、采取和分离培养DC细胞；
C、用自体肿瘤相关全抗原冲击DC细胞，使DC细胞成熟并制备成自体肿瘤抗原特异性DC疫苗。
本实施例的具体技术解决方案和工艺路线是：
所述的步骤A包括如下工艺步骤：
A1、采用手术切除、内镜或穿刺活检获得的新鲜肿瘤组织、胸腹水离心获得的新鲜自体肿瘤细胞中的一种制成自体肿瘤细胞裂解物蛋白；
A2、将步骤A1中的自体肿瘤细胞裂解物蛋白和同源的细胞株裂解物蛋白混合，制备成自体肿瘤相关全抗原。
步骤A1中手术切除的新鲜肿瘤组织采用如下方法：
取肿瘤周边部组织0.3-1.0cm3，剪除周围非肿瘤组织，庆大霉素-生理盐水反复洗涤3-5次，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用。
步骤A1中胸腹水离心获得的新鲜自体肿瘤细胞采用如下方法：
取胸、腹水1500-2000ml，在转速为1200转/分钟条件下离心5分钟，生理盐水洗涤离心3次，300目钢网过网后获得单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用。
步骤A2中和同源的细胞株抗原混合，制备成自体肿瘤相关全抗原采用如下方法：
反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量，制成同源细胞株裂解物蛋白；将同源细胞株裂解物蛋白与步骤A1中制备的自体肿瘤细胞裂解物蛋白按照质量比为1:1的比例混合，制备成自体肿瘤相关全抗原备用。
步骤B中DC细胞的采取选用外周血直接采取获得、外周血单状核细胞分离获得、通过骨髓造血细胞分离获得、通过骨髓或其他组织来源的间充质干细胞定向分化获得；或通过HLA基因半相合或全相合同种异体外周血、单状核细胞、骨髓造血细胞、间充质干细胞分离或分化获得方法中的一种。
步骤B单状核细胞采集和分离包括：
B1、单状核细胞采集前，用GM-CSF 150μg皮下注射，1次/日，行骨髓动员2-3天；
B2、用COBE SPECTRA细胞成分分离机，按照说明书中“单状核细胞采集”的设定参数设定程序，外周血循环6000-8000ml，采集单状核细胞140-160ml；
B3、将步骤B2中的单状核细胞分装入50ml离心管，细胞离心机1500转/分离心5分钟，收集上层血浆移入50ml离心管，加入质量比为10%葡萄糖酸钙溶液2.5ml吹打混匀，56℃水浴35分钟，2500转/分离心5分钟，收集上清制备成自体灭活血清，4℃冷藏备用；
B4、收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含密度为1.077g/ml的密度梯度淋巴细胞分离液15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机在2000转/分钟的转速下离心15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层即为单状核细胞。分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混匀，在1500转/分的转速下离心10分钟后弃上清；加入生理盐水45ml轻柔吹打洗涤，在1000转/分的转速下离心5分钟弃上清；重复洗涤3次后，加入RPMI-1640培养基，细胞计数（细胞总数量6-10×109）；
B5、在75cm3培养瓶加入RPMI-1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化；将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在1×107个/ml，按体积百分比为10%-20％加入自身血清，于37℃，体积百分比为5%CO2的饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟取出，移除悬浮细胞和培养液，贴壁细胞即为DC细胞。
步骤C包括如下工艺方法：
在步骤B制备的DC细胞中加入无血清DC培养基20ml，在培养基中按照如下含量添加各种组分：
GM-CSF 500μg/500ml
IL-4 300μg/500ml
庆大霉素2.0万单位/500ml
其中无血清DC培养基选自美国SIGMA公司的产品；
将上述培养基置于37℃，体积百分比为5% CO2的饱和湿度培养箱中扩增培养；第6天加入步骤A制备的自体肿瘤相关全抗原50μg/ml，次日补充体积百分比为10%-15%的自体血清，培养2天后获取DC疫苗，流式细胞检测CD80、CD83、CD86、HLA-ABC、HLA-DR表达，鉴定DC疫苗功能。

Claims (8)

1.一种负载自体肿瘤相关全抗原的树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于包括如下工艺步骤：
A、制备自体肿瘤相关全抗原；
B、采取和分离培养DC细胞；
C、用自体肿瘤相关全抗原冲击DC细胞，使DC细胞成熟并制备成自体肿瘤抗原特异性DC疫苗。
2.根据权利要求1所述的负载自体肿瘤相关全抗原的树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤A包括如下工艺步骤：
A1、采用取手术切除、内镜或穿刺获得的新鲜肿瘤组织、以及胸腹水离心获得的新鲜自体肿瘤细胞中的一种，制成自体肿瘤细胞裂解物蛋白；
A2、将步骤A1中的自体肿瘤细胞裂解物蛋白和同源的细胞株裂解物蛋白混合，制备成自体肿瘤相关全抗原。
3.根据权利要求2所述的负载自体肿瘤相关全抗原的树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤A1中手术切除、内镜或穿刺获得的新鲜肿瘤组织采用如下方法：
取肿瘤周边部分组织0.3-1.0cm3，剪除周围非肿瘤组织，庆大霉素-生理盐水反复洗涤3-5次，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用。
4.根据权利要求2所述的负载自体肿瘤相关全抗原的树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤A1中胸腹水离心获得的新鲜自体肿瘤细胞采用如下方法：
取胸、腹水1500-2000ml，在转速为1200转/分钟条件下离心5分钟，生理盐水洗涤离心3次，300目钢网过网后获得单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用。
5.根据权利要求2所述的负载自体肿瘤相关全抗原的树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤A2中的自体肿瘤抗原和同源的细胞株抗原混合，制备成自体肿瘤相关全抗原采用如下方法：
反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量，制成同源细胞株裂解物蛋白；将同源细胞株裂解物蛋白与步骤A1中制备的自体肿瘤细胞裂解物蛋白按照质量比为1:1的比例混合，制备成自体肿瘤相关全抗原备用。
6.根据权利要求1所述的负载自体肿瘤相关全抗原的树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤B中DC细胞的采取选用外周血直接采取获得、外周血单状核细胞分离获得、通过骨髓造血细胞分离获得、通过骨髓或其他组织来源的间充质干细胞定向分化获得、或通过HLA基因半相合或全相合同种异体外周血、外周血单状核细胞、骨髓造血细胞、间充质干细胞分离或定向分化获得方法中的一种。
7.根据权利要求6所述的负载自体肿瘤相关全抗原的树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤B单状核细胞采集和分离包括：
B1、单状核细胞采集前，用GM-CSF 150μg皮下注射，1次/日，行骨髓动员2-3天；
B2、用COBE SPECTRA细胞成分分离机，按照说明书中“单状核细胞采集”的设定参数设定程序，外周血循环6000-8000ml，采集单状核细胞140-160ml；
B3、将步骤B2中的单状核细胞分装入50ml离心管，细胞离心机1500转/分离心5分钟，收集上层血浆移入50ml离心管，加入质量比为10%葡萄糖酸钙溶液2.5ml吹打混匀，56℃水浴35分钟，2500转/分离心5分钟，收集上清制备成自体灭活血清，4℃冷藏备用；
B4、收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含密度为1.077g/ml的密度梯度淋巴细胞分离液15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机在2000转/分钟的转速下离心15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层即为单状核细胞；
分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混匀，在1500转/分的转速下离心10分钟后弃上清；加入生理盐水45ml轻柔吹打混匀，在1000转/分的转速下离心5分钟洗涤，弃上清；重复洗涤3次后，加入RPMI-1640培养基，细胞计数；
B5、在75cm3培养瓶加入RPMI-1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化；将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在1×107个/ml，按体积百分比为10%-20％加入自身血清，于37℃，体积百分比为5%CO2的饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟取出，移除悬浮细胞和培养液，贴壁细胞即为DC细胞。
8.根据权利要求1所述的负载自体肿瘤相关全抗原的树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤C包括如下工艺方法：
在步骤B制备的DC细胞中加入无血清DC培养基20ml，在培养基中按照如下含量添加各种组分：
GM-CSF 500μg/500ml
IL-4 300μg/500ml
庆大霉素2.0万单位/500ml
其中无血清DC培养基选自美国SIGMA公司或美国BD公司的产品；
将上述培养基置于37℃，体积百分比为5%CO2的饱和湿度培养箱中扩增培养；第6天加入步骤A制备的自体肿瘤相关全抗原50μg/ml，次日补充体积百分比为10%-15%的自体血清，培养2天后获取DC疫苗，流式细胞检测CD80、CD83、CD86、HLA-ABC、HLA-DR表达，鉴定DC疫苗功能。
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