CN110090298A - 一种细胞膜肿瘤疫苗及制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞膜肿瘤疫苗及制备方法和应用。本发明首次不使用外源肿瘤抗原和过继细胞，利用细胞融合技术使树突状细胞和肿瘤细胞发生融合，培养后使得全肿瘤抗原和共刺激分子在融合细胞的细胞膜上表达。剥离融合细胞的细胞膜包裹在纳米粒子上制备的纳米细胞膜疫苗能像抗原呈递细胞一样直接激活T细胞，也可以被树突状细胞识别，加工并呈递给T细胞，间接激活T细胞。结合这两种T细胞激活通路，能够引起强烈的抗肿瘤免疫响应。本发明的模拟肿瘤细胞和抗原呈递细胞的细胞膜肿瘤疫苗策略能够开发针对多种肿瘤类型的疫苗，并且具有良好的生物相容性和系统安全性。因此，这种细胞膜疫苗非常适合于肿瘤疫苗领域。

Description

一种细胞膜肿瘤疫苗及制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物肿瘤疫苗领域，涉及一种细胞膜肿瘤疫苗及制备方法与应用。
背景技术
近年来，许多学者进行了肿瘤疫苗的研究。通过注射疫苗，训练自身免疫系统来监测和消除系统肿瘤，并达到记忆效果，能够长期监测和预防肿瘤的发生。但是，肿瘤细胞会发生抗原或其他变化，使其能够逃脱免疫系统的消除，比如肿瘤细胞激活下调某些类型的肿瘤抗原来逃避免疫响应。所以，肿瘤疫苗包含尽可能多的肿瘤抗原，就可以避免因为肿瘤细胞下调某些肿瘤抗原的表达而引发的免疫逃逸。但是，迄今为止已知的肿瘤抗原的数量是非常有限的。另外，结合多种肿瘤抗原到一个纳米体系中是很难实现的，因为制备过程太昂贵并且复杂。所以，科研工作者一方面致力于肿瘤抗原的筛选鉴定，另一方面使用包含多种肿瘤抗原的肿瘤产物，如肿瘤裂解物。
上述手段存在的主要缺点：(1)肿瘤抗原的筛选鉴定，复杂成本高，耗时较长，不能满足目前对肿瘤疫苗的急需情况；(2)肿瘤裂解物等包含肿瘤遗传物质，有潜在的致癌风险；(3)回输的免疫细胞保存困难。
因此，有必要设计一种新的肿瘤疫苗系统，以克服上述问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种细胞膜肿瘤疫苗及其制备方法与应用。本发明的细胞膜肿瘤疫苗，用衍生自树突状细胞和肿瘤细胞的融合细胞的细胞膜作为疫苗，或用衍生自树突状细胞和肿瘤细胞的融合细胞的细胞膜包裹作为支撑物的纳米粒子，形成纳米细胞膜肿瘤疫苗，所述疫苗具有良好的生物相容性，包含肿瘤全抗原，并减少了致癌风险，有利于长期保存。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种细胞膜肿瘤疫苗的制备方法，包含以下步骤：
(1)将肿瘤细胞灭活处理，得到灭活的肿瘤细胞；
(2)将灭活的肿瘤细胞和树突状细胞进行融合，得到融合细胞FM；
(3)将融合细胞的细胞膜剥离，得到纯化的融合细胞膜，即为细胞膜肿瘤疫苗。
优选地，上述纳米细胞膜肿瘤疫苗的制备方法中：
步骤(1)将肿瘤细胞从培养皿上消化下来，离心收集，用磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.4)洗三次；肿瘤细胞用20％的乙醇溶液在4℃处理10-30min以灭活肿瘤细胞，以500g转速离心5-15分钟后，收集细胞；用PBS重新分散细胞，500g转速离心5-15分钟，重复上述PBS分散和离心三次；
步骤(2)将分散在PBS中的树突状细胞和分散在PBS的上述灭活的肿瘤细胞以10:1至2:1的不同比例进行均匀混合，以500g的转速离心5-15分钟后，尽可能地吸弃上层清液；在30-120秒内，逐滴加入0.5-2毫升预先加温到37-40℃的含有50％聚乙二醇(分子量为2000-4000)和0-10％二甲亚砜的无血清培养基中；37-40℃孵育1-5分钟，缓慢加入无血清培养基，至10-50毫升，终止融合过程；以500g的转速离心5-15分钟，分离细胞，细胞再分散在含有10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素，10000单位/毫升)和白介素-4(10纳克/毫升)的培养基中；融合细胞在湿润的包含5％二氧化碳的37℃的培养箱中培养，每隔一天用含有10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素，10000单位/毫升)和白介素-4(10纳克/毫升)的培养基进行半数换液，连续培养4-10天；
所述培养基为适合融合细胞生长的培养基；
步骤(3)将融合细胞用细胞刮刀刮下来收集；收集的细胞用冷PBS再分散，500g离心5-15分钟收集细胞，重复PBS分散和离心过程两次；收集细胞分散到包含0.1％苯甲基磺酰氯的细胞裂解液中，并在冰水浴中孵育10-30分钟；接着通过反复冻融三次使细胞破裂；在4℃以700g转速离心8-15分钟以除掉细胞核；吸取上层液体，在4℃条件下以14000g转速离心20-50分钟得到纯化的细胞膜碎片；细胞膜碎片冻干称重，-80℃冰箱中保存。冻干的细胞膜材料在使用前用超纯水水化。
进一步地，
步骤(1)将肿瘤细胞从培养皿上消化下来，离心收集，用PBS洗三次，肿瘤细胞用20％的乙醇溶液在4℃处理15min以灭活肿瘤细胞，以500g转速离心10分钟后，收集细胞；用PBS重新分散细胞，500g转速离心10分钟，重复上述PBS分散和离心三次；
步骤(2)将分散在PBS中的树突状细胞和分散在PBS的上述灭活的肿瘤细胞以2:1的比例进行均匀混合，以500g的转速离心10分钟后，尽可能地吸弃上层清液；在60秒内，逐滴加入1毫升预先加温到38℃的含有50％聚乙二醇(分子量为4000)和10％二甲亚砜的无血清培养基中。38℃孵育1分钟，缓慢加入无血清培养基，到50毫升，终止融合过程。以500g的转速离心15分钟，分离细胞，细胞再分散在含有10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素，10000单位/毫升)和白介素-4(10纳克/毫升)的培养基中。融合细胞在湿润的包含5％二氧化碳的37℃的培养箱中培养，每隔一天用含有10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素，10000单位/毫升)和白介素-4(10纳克/毫升)的培养基进行换液，连续培养6天；
所述培养基为适合融合细胞生长的培养基；
步骤(3)将融合细胞用细胞刮刀刮下来收集。收集的细胞用冷PBS再分散，500g离心10分钟收集细胞，重复PBS分散和离心过程两次，收集细胞分散到包含0.1％苯甲基磺酰氯的细胞裂解液中，并在冰水浴中孵育15分钟，接着通过反复冻融三次使细胞破裂，在4℃以700g转速离心10分钟以除掉细胞核；吸取上层液体，在4℃条件下以14000g转速离心30分钟得到纯化的细胞膜碎片，细胞膜碎片冻干称重，-80℃冰箱中保存。冻干的细胞膜材料在使用前用超纯水水化。
优选地，所述步骤(2)细胞融合方法为病毒诱导融合，电融合法和聚乙二醇诱导融合中的任意一种；
所述的病毒融合法：将肿瘤细胞和树突状细胞按照10:1-2:1的比例均匀混合，加入灭活的仙台病毒，4℃条下共培养1-5分钟，使病毒附着在细胞膜上，并使细胞相互凝聚，调节温度为37摄氏度，病毒-胞膜发生反应，5-30分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合；
所述的电融合法：将肿瘤细胞和树突状细胞按照10:1-2:1的比例均匀混合，将混合细胞放入融合小室，将开关拨向正弦输出档，其额度选择在1-1.3MHz，脉冲宽度为0.1毫秒，脉冲幅度为150伏特，脉冲频率为1-3次/秒，细胞在5秒到50秒钟的时间内会发生暂时性的收缩，两层膜之间形成小孔，连接成桥，形成一个个泡囊，经点连接到面连接，最后形成融合体；
所述聚乙二醇诱导融合：分散在PBS中的树突状细胞和分散在PBS的上述灭活的肿瘤细胞以10:1至2:1的不同比例进行均匀混合，以500g的转速离心5-15分钟后，尽可能地吸弃上层清液；在30-120秒内，逐滴加入0.5-2毫升预先加温到37-40℃的含有50％聚乙二醇(分子量为2000-4000)和0-10％二甲亚砜的无血清培养基中；37-40℃孵育1-5分钟，缓慢加入无血清培养基，至10-50毫升，所述培养基为适合融合细胞生长的培养基，终止融合过程；以500g的转速离心5-15分钟，分离细胞，用PBS洗去残余的聚乙二醇和二甲亚砜，得到融合细胞；
上述三种方法获得的融合细胞再分散在含有10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素，10000单位/毫升)和白介素-4(10纳克/毫升)的培养基中；融合细胞在湿润的包含5％二氧化碳的37℃的培养箱中培养，每隔一天用含有10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素，10000单位/毫升)和白介素-4(10纳克/毫升)的培养基进行半数换液，连续培养4-10天；
所述培养基为适合融合细胞生长的培养基。
第二方面，提供上述细胞膜肿瘤疫苗的制备方法获得的细胞膜肿瘤疫苗，所述的肿瘤疫苗衍生自树突状细胞和肿瘤细胞的融合细胞的细胞膜。
第三方面，提供一种纳米细胞膜肿瘤疫苗的制备方法，所述制备方法是将权利要求5的细胞膜肿瘤疫苗包裹在纳米粒子NP上，即得到纳米细胞膜肿瘤疫苗NP@FMs。
优选地，上述纳米细胞膜肿瘤疫苗的制备方法为：
(1)纳米粒子NP的制备：将60-120毫克的四(4-羧基苯基)卟吩，180-360毫克的ZrOCl2，和1.68-3.36克的苯甲酸溶解在60-120毫升的N,N-二甲基甲酰胺中，在90℃条件下搅拌5-10小时，混合溶液以12000rpm的转速离心30分钟，并用N,N-二甲基甲酰胺洗3次去除未反应的原料，得到的纳米粒子NP保存在N,N-二甲基甲酰胺溶液中；
(2)纳米细胞膜肿瘤疫苗NP@FMs的制备：包膜前，通过离心的方法(12000rpm离心30分钟)，用超纯水置换N,N-二甲基甲酰胺；1-10毫克/毫升的融合细胞膜和1-10毫克/毫升的纳米粒子NP混合，在冰水浴中超声处理混合溶液1-10分钟，混合溶液以12000rpm的转速离心20-50分钟，即可得到所述的纳米细胞膜肿瘤疫苗。
进一步地，上述纳米细胞膜肿瘤疫苗的制备方法为：
(1)制备纳米粒子NP：将60毫克的四(4-羧基苯基)卟吩，180毫克的ZrOCl2，和1.68克的苯甲酸溶解在60毫升的N,N-二甲基甲酰胺中，在90℃条件下搅拌5小时，混合溶液以12000rpm的转速离心30分钟，并用N,N-二甲基甲酰胺洗3次去除未反应的原料，得到的纳米粒子NP保存在N,N-二甲基甲酰胺溶液中；
(2)制备纳米细胞膜肿瘤疫苗NP@FMs：包膜前，步骤(1)保存在N,N-二甲基甲酰胺溶液中的纳米粒子NP通过离心的方法(12000rpm离心30分钟)，用超纯水置换N,N-二甲基甲酰胺；2毫克/毫升的融合细胞膜和2毫克/毫升的纳米粒子NP混合，在冰水浴中超声处理混合溶液1分钟，混合溶液以12000rpm的转速离心30分钟，即可得到所述的纳米细胞膜肿瘤疫苗；
所述的肿瘤细胞为小鼠乳腺癌细胞4T1，所述的树突状细胞是从小鼠胫骨中提取的骨髓间充质干细胞，所述的纳米粒子NP粒径大小约为130纳米，ζ电势约为24.5毫伏，纳米细胞膜肿瘤疫苗粒径大小约为145纳米，ζ电势约为-31.5毫伏。
第四方面，提供上述的纳米细胞膜肿瘤疫苗的制备方法获得的纳米细胞膜肿瘤疫苗，所述的肿瘤疫苗衍生自树突状细胞和肿瘤细胞的融合细胞的细胞膜，包裹住作为支撑物的纳米粒子。
第五方面，提供上述的细胞膜肿瘤疫苗或纳米细胞膜肿瘤疫苗在制备预防肿瘤的药物中的应用。
本发明的细胞膜疫苗可用于提高肿瘤预防的效果，减少疫苗致癌风险，并有利于保存。以应用于乳腺癌预防为例，其肿瘤预防机理为：树突状细胞和小鼠乳腺癌细胞(4T1)在诱导剂聚乙二醇的作用下融合后，成为杂交细胞，共享细胞质，但是保留各自的细胞核，这种结构使得全肿瘤抗原被加工，并以肿瘤抗原肽和主要组织相容性复合物(pMHC)的形式表达在融合细胞上，而且共刺激分子(B7家族)的表达增加，同时通过CC-细胞因子受体7(CCR7)进行淋巴回流的分子也上调表达。这样，全肿瘤抗原包括已知和未知的肿瘤抗原就富集在融合细胞表面，能够靶向到淋巴结，在共刺激分子的作用下刺激T细胞活化。同时，融合细胞膜上的全肿瘤抗原也能够被树突状细胞摄取，加工并呈递给T细胞，引起T细胞激活。通过两种激活T细胞的途径，显著提高了小鼠乳腺癌预防的效果。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的细胞膜肿瘤疫苗首次将衍生自树突状细胞和肿瘤细胞的融合细胞的细胞膜作为肿瘤疫苗或将该细胞膜包覆在支撑纳米粒子上，增加了肿瘤抗原的密度和类型，大大提高了肿瘤疫苗的免疫效果，而且所述的纳米细胞膜肿瘤疫苗具有良好的生物相容性和系统安全性，并且储存方便。
附图说明
图1为本发明实施例提供的NP的SEM图；
图2为本发明实施例提供的NP@FM的TEM图；
图3为本发明实施例提供的NP、NP@CM、NP@DM和NP@FM的ζ电势；
图4为本发明实施例提供的CM、DM和FM的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图5为本发明实施例提供的融合细胞裂解物和融合细胞膜的蛋白印迹图；
图6为本发明实施例提供的FM和T细胞共培养激活T细胞的流式分析图；
图7为本发明实施例提供的FM活化DCs，成熟DCs激活T细胞的流式分析图；
图8为本发明实施例提供的接种疫苗后再注射肿瘤细胞随着时间推移无肿瘤小鼠的比例图；
图9为本发明实施例提供的接种疫苗后再注射肿瘤细胞36天后剥离的肿瘤照片；
图10为本发明实施例提供的NP@FM的溶血照片和溶血率。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
以下实施例中的肿瘤细胞均为小鼠乳腺癌细胞4T1，购买自中国典型培养保藏中心；树突状细胞从小鼠胫骨中提取骨髓间充质干细胞分化得到(M.B.Lutz,J.Immunol.Methods 1999,223,77；J.Xiang,ACS Nano 2015,9,6401)；纳米粒子NP粒径大小约为130纳米，ζ电势约为24.5毫伏，纳米细胞膜肿瘤疫苗粒径大小约为145纳米，ζ电势约为-31.5毫伏。
【实施例1】纳米细胞膜肿瘤疫苗(NP@FMs)的制备
1、将肿瘤细胞灭活处理
将肿瘤细胞接种在细胞培养皿上，加入10毫升含有10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素，10000单位/毫升)的1640培养基中。培养皿放在湿润的包含5％二氧化碳的37℃的培养箱中培养。过段时间后在显微镜下观察，等细胞长满后，用胰蛋白酶把细胞从培养皿上消化下来，以500g的转速离心5分钟收集，并用PBS洗三次。用细胞计数仪记录细胞的数目。收集的细胞用20％的乙醇溶液在4℃处理15分钟以灭活肿瘤细胞，以500g转速离心10分钟后，收集细胞。用PBS重新分散细胞，500g转速离心10分钟，重复上述PBS分散和离心三次，洗去残余的乙醇，备用；
2、将灭活的肿瘤细胞和树突状细胞进行融合
小鼠髓源树突状细胞(BMDCs)：从小鼠胫骨中提取骨髓间充质干细胞，在包含重组白细胞介素4(IL-4)(10纳克/毫升)，重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(20纳克/毫升)和20％FBS的1640培养基中培养，培养环境为含5％CO2的湿润气氛，温度为37℃。每隔一天，半数换液。一周后，以500g的转速离心10分钟收集分化得到的小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)。收集的细胞用冷PBS再分散，500g离心5分钟收集细胞，重复PBS分散和离心过程两次。
融合细胞：将分散在PBS中的树突状细胞和分散在PBS的上述灭活的肿瘤细胞以2:1的比例进行均匀混合，以500g的转速离心10分钟后，尽可能地吸弃上层清液。在在60秒内，逐滴加入1毫升预先加温到38℃的含有50％聚乙二醇(分子量为4000)和10％二甲亚砜的无血清1640培养基中。38℃孵育1分钟，缓慢加入无血清1640培养基，到50毫升，终止融合过程。以500g的转速离心15分钟，分离细胞，细胞再分散在含有10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素，10000单位/毫升)和白介素-4(10纳克/毫升)的1640培养基中。融合细胞在湿润的包含5％二氧化碳的37℃的培养箱中培养，每隔一天用含有10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素，10000单位/毫升)和白介素-4(10纳克/毫升)的1640培养基进行换液，连续培养6天。用胰蛋白酶把融合细胞消化下来，以500g的转速离心10分钟收集融合细胞，用PBS洗三次，备用；
3、将融合细胞的细胞膜剥离
将融合细胞用细胞刮刀刮下来收集。收集的细胞用冷PBS再分散，500g离心10分钟收集细胞，重复PBS分散和离心过程两次。收集细胞分散到包含0.1％苯甲基磺酰氯的细胞裂解液中，并在冰水浴中孵育15分钟。接着通过反复冻融三次使细胞破裂。在4℃以700g转速离心10分钟以除掉细胞核。吸取上层液体，在4℃条件下以14000g转速离心30分钟得到纯化的细胞膜碎片。细胞膜碎片冻干称重，-80℃冰箱中保存。冻干的细胞膜材料在使用前用超纯水水化。
4、将融合细胞的细胞膜包裹在纳米粒子上
60毫克的四(4-羧基苯基)卟吩，180毫克的ZrOCl2，和1.68克的苯甲酸溶解在60毫升的N,N-二甲基甲酰胺中。在90℃条件下搅拌5小时，混合溶液以12000rpm的转速离心30分钟，并用N,N-二甲基甲酰胺洗3次去除未反应的原料。得到的NP保存在N,N-二甲基甲酰胺溶液中。包膜前，通过离心的方法(12000rpm离心30分钟)，用超纯水置换N,N-二甲基甲酰胺。将2毫克/毫升的融合细胞膜和2毫克/毫升的纳米粒子混合，在冰水浴中超声处理混合溶液1分钟。混合溶液以10000g的转速离心30分钟，即可得到所述的纳米细胞膜肿瘤疫苗。
合成的纳米粒子用扫描电子显微镜(SEM)进行表征，结果如图1所示。纳米细胞膜肿瘤疫苗(NP@FMs)用投射电子显微镜(TEM)进行表征，结果如图2所示，可以看到NP表面包裹上了一层约10纳米厚的物质。纳米粒子包覆细胞膜前后ζ电势变化用激光粒度仪进行表征，结果如图3所示，包裹细胞膜后，纳米粒子的电势由约24.5毫伏变为约-31.5毫伏，表明细胞膜被成功地包覆在了NP表面。
【实施例2】纳米细胞膜肿瘤疫苗(NP@FMs)的制备
本实施例中灭活地肿瘤细胞和BMDCs的制备来源于实施例1。
1、将灭活的肿瘤细胞和树突状细胞进行融合，得到融合细胞；
将分散在PBS中的树突状细胞和分散在PBS的上述灭活的肿瘤细胞以10:1的比例进行均匀混合，以500g的转速离心10分钟后，尽可能地吸弃上层清液。在在60秒内，逐滴加入2毫升预先加温到40℃的含有50％聚乙二醇(分子量为2000)和10％二甲亚砜的无血清1640培养基中。40℃孵育1分钟，缓慢加入无血清1640培养基，到50毫升，终止融合过程。以500g的转速离心10分钟，分离细胞，细胞再分散在含有10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素，10000单位/毫升)和白介素-4(10纳克/毫升)的1640培养基中。融合细胞在湿润的包含5％二氧化碳的37℃的培养箱中培养，每隔一天用含有10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素，10000单位/毫升)和白介素-4(10纳克/毫升)的1640培养基进行换液，连续培养6天。
2、将融合细胞的细胞膜剥离
将融合细胞用细胞刮刀刮下来收集。收集的细胞用冷PBS再分散，500g离心10分钟收集细胞，重复PBS分散和离心过程两次。收集细胞分散到包含0.1％苯甲基磺酰氯的细胞裂解液中，并在冰水浴中孵育20分钟。接着通过反复冻融三次使细胞破裂。在4℃以700g转速离心10分钟以除掉细胞核。吸取上层液体，在4℃条件下以14000g转速离心30分钟得到纯化的细胞膜碎片。细胞膜碎片冻干称重，-80℃冰箱中保存。冻干的细胞膜材料在使用前用超纯水水化。
3、将融合细胞的细胞膜包裹在纳米粒子上
120毫克的四(4-羧基苯基)卟吩，360毫克的ZrOCl2，和3.36克的苯甲酸溶解在60毫升的N,N-二甲基甲酰胺中。在90℃条件下搅拌10小时，混合溶液以12000rpm的转速离心30分钟，并用N,N-二甲基甲酰胺洗3次去除未反应的原料。得到的NP保存在N,N-二甲基甲酰胺溶液中。包膜前，通过离心的方法(12000rpm离心30分钟)，用超纯水置换N,N-二甲基甲酰胺。将10毫克/毫升的融合细胞膜和10毫克/毫升的纳米粒子混合，在冰水浴中超声处理混合溶液1分钟。混合溶液以10000g的转速离心30分钟，即可得到所述的纳米细胞膜肿瘤疫苗。【实施例3】纳米细胞膜肿瘤疫苗(NP@FMs)的制备
本实施例中灭活地肿瘤细胞和BMDCs的制备来源于实施例1。
1、将灭活的肿瘤细胞和树突状细胞进行融合，得到融合细胞；
将分散在PBS中的树突状细胞和分散在PBS的上述灭活的肿瘤细胞以5:1的比例进行均匀混合，以500g的转速离心10分钟后，尽可能地吸弃上层清液。在在120秒内，逐滴加入2毫升预先加温到38℃的含有50％聚乙二醇(分子量为2000)和10％二甲亚砜的无血清1640培养基中。38℃孵育1分钟，缓慢加入无血清培养基，到25毫升，终止融合过程。以500g的转速离心10分钟，分离细胞，细胞再分散在含有10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素，10000单位/毫升)和白介素-4(10纳克/毫升)的1640培养基中。融合细胞在湿润的包含5％二氧化碳的37℃的培养箱中培养，每隔一天用含有10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素，10000单位/毫升)和白介素-4(10纳克/毫升)的1640培养基进行换液，连续培养9天。
2、将融合细胞的细胞膜剥离
将融合细胞用细胞刮刀刮下来收集。收集的细胞用冷PBS再分散，500g离心10分钟收集细胞，重复PBS分散和离心过程两次。收集细胞分散到包含0.1％苯甲基磺酰氯的细胞裂解液中，并在冰水浴中孵育10分钟。接着通过反复冻融三次使细胞破裂。在4℃以700g转速离心10分钟以除掉细胞核。吸取上层液体，在4℃条件下以14000g转速离心30分钟得到纯化的细胞膜碎片。细胞膜碎片冻干称重，-80℃冰箱中保存。冻干的细胞膜材料在使用前用超纯水水化。
3、将融合细胞的细胞膜包裹在纳米粒子上
60毫克的四(4-羧基苯基)卟吩，180毫克的ZrOCl2，和1.68克的苯甲酸溶解在60毫升的N,N-二甲基甲酰胺中。在90℃条件下搅拌5小时，混合溶液以12000rpm的转速离心30分钟，并用N,N-二甲基甲酰胺洗3次去除未反应的原料。得到的NP保存在N,N-二甲基甲酰胺溶液中。包膜前，通过离心的方法(12000rpm离心30分钟)，用超纯水置换N,N-二甲基甲酰胺。将5毫克/毫升的融合细胞膜和5毫克/毫升的纳米粒子混合，在冰水浴中超声处理混合溶液2分钟。混合溶液以10000g的转速离心30分钟，即可得到所述的纳米细胞膜肿瘤疫苗。
【实施例4】细胞融合前后蛋白变化
本实施例中融合细胞膜(FM)来源于实施例3。
1、制备肿瘤细胞膜(CM)和树突状细胞膜(DM)
制备CM：将4T1细胞接种于细胞培养皿上，并于培养箱中培养直到培养皿长满(培养基为1640)。然后，将培养基小心吸弃，PBS洗3遍。将细胞用细胞刮刀刮下来收集。收集的细胞用冷PBS再分散，500g离心5分钟收集细胞，重复PBS分散和离心过程两次。收集细胞分散到包含0.1％苯甲基磺酰氯的细胞裂解液中，并在冰浴中孵育15分钟。接着通过反复冻融三次使细胞破裂。在4℃以700g转速离心10分钟以除掉细胞核。吸取上层液体，在4℃条件下以14000g转速离心30分钟得到纯化的细胞膜碎片。细胞膜碎片冻干称重，-80℃冰箱中保存。冻干的细胞膜材料在使用前用超纯水水化。
制备DM：从小鼠胫骨中提取骨髓间充质干细胞，在包含重组白细胞介素4(IL-4)(10纳克/毫升)，重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(20纳克/毫升)和20％FBS的1640培养基中培养，培养环境为含5％CO2的湿润气氛，温度为37℃。每隔一天，半数换液。一周后，以500g的转速离心10分钟收集分化得到的小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)。收集的细胞用冷PBS再分散，500g离心5分钟收集细胞，重复PBS分散和离心过程两次。收集细胞分散到包含0.1％苯甲基磺酰氯的细胞裂解液中，并在冰浴中孵育15分钟。接着通过反复冻融三次使细胞破裂。在4℃以700g转速离心10分钟以除掉细胞核。吸取上层液体，在4℃条件下以14000g转速离心30分钟得到纯化的细胞膜碎片。细胞膜碎片冻干称重，-80℃冰箱中保存。冻干的细胞膜材料在使用前用超纯水水化。
将等质量的CM、DM和FM进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。
如图4所示，图4为CM、DM和FM的SDS-PAGE，FM和CM、DM相比，拥有两者绝大多数蛋白条带，并且有新的条带出现，如黑色方框所示。
【实施例5】融合细胞裂解物和FM的蛋白不同
本实施例中融合细胞和融合细胞膜(FM)来源于实施例3。
制备融合细胞裂解物：收集的融合细胞用冷PBS再分散，500g离心10分钟收集细胞，重复PBS分散和离心过程两次。收集细胞分散到包含0.1％苯甲基磺酰氯的细胞裂解液中，并在冰浴中孵育15分钟。接着通过反复冻融三次使细胞破裂。
将融合细胞裂解物和FM进行蛋白质印记(Western blotting)分析。
如图5所示，图5为融合细胞裂解物和FM的Western blotting分析，FM和融合细胞裂解物相比，FM不含有钠钾ATP酶、泛钙黏着蛋白和组蛋白H3，而细胞色素c氧化酶IV和甘油醛磷酸脱氢酶含量不变，说明FM不含细胞核成分和线粒体成分。
【实施例6】FM直接激活T细胞
本实施例中融合细胞膜(FM)来源于实施例3。
50微克/毫升的CM，DM和FM分别与T脾淋巴细胞(来自小鼠脾脏)共培养48h后，T淋巴细胞用PBS洗三次，接着用抗CD3-FITC抗体，抗CD4-PE抗体和抗CD8-APC抗体(Biolegend)在4℃条件下染色30min。之后用预冷的PBS洗三次，用流式细胞仪检测细胞的荧光。
如图6所示，图6为流式定量分析CD3+T细胞中CD4和CD8的表达，在FM组中CD3+CD8+T细胞的比例最大，表明和对照组相比FM激活T细胞能力最强。
【实施例7】FM间接激活T细胞
本实施例中BMDCs的制备来源于实施例1，本实施例中融合细胞膜(FM)来源于实施例3。
50微克/毫升的CM，DM和FM分别与BMDCs共培养48h。细胞用PBS洗三次，接着用抗CD11c-FITC抗体，抗CD80-PE抗体和抗CD86-APC抗体(Biolegend)在4℃下染色30min。用预冷的PBS洗三次后，用流式细胞仪检测细胞的荧光。BMDCs先按照上述预处理。48h后，T脾淋巴细胞(源自小鼠脾脏)以BMDCs十倍的数量加入预处理的BMDCs中。共培养36h后，T淋巴细胞用PBS洗三次，接着用抗CD3-FITC抗体，抗CD4-PE抗体和抗CD8-APC抗体(Biolegend)在4℃条件下染色30min。之后用预冷的PBS洗三次，用流式细胞仪检测细胞的荧光。
如图7所示，图7为流式定量分析CD11c+DCs中CD80和CD86的表达以及CD3+T细胞中CD4和CD8的表达，在FM组中CD+CD86+DCs的比例最大，同时CD3+CD8+T细胞的比例也最大，表明与对照组相比FM活化DCs，并由成熟的DCs激活T细胞能力最强。
【实施例8】接种NP@FMs后再注射肿瘤细胞后无肿瘤小鼠的比例
本实施例中NP@FMs来源于实施例1。
体内动物实验中使用的小鼠均购买于武汉大学A3动物实验室，BALB/c小鼠(雌性，4～5周龄)。在健康的Balb/c小鼠的左腹股沟皮下分别注射NP，NP@CM，NP@DM和NP@FM，每周一次，注射两次。最后一次注射后7d，这些Balb/c小鼠在右后腿附近皮下注射1×105个4T1细胞。记录小鼠长出瘤子的时间。
如图8所示，图8为注射肿瘤后随着时间推移无瘤子小鼠的比例。空白对照组的所有小鼠在注射4T1后10d有明显的肿瘤出现，而其他组都有一定程度的无肿瘤时间的延长。在注射4T1后36天后，NP@FM处理组中无肿瘤的老鼠占60％，而NP@CM处理组所有小鼠都有肿瘤，NP和NP@DM组只有20％的小鼠没有发生肿瘤。
【实施例9】接种NP@FMs后再注射肿瘤细胞后36天肿瘤照片
本实施例中NP@FMs来源于实施例1。
在健康的Balb/c小鼠的左腹股沟皮下分别注射NP，NP@CM，NP@DM和NP@FM，每周一次，注射两次。最后一次注射后7天，这些Balb/c小鼠在右后腿附近皮下注射1×105个4T1细胞。在36d后收集肿瘤，拍照。
如图9所示，图9为注射肿瘤后36天收集的肿瘤照片，NP@FM接种组有60％的小鼠没有可观察到的肿瘤，长出的肿瘤相对其他组也较小，说明NP@FM作为肿瘤疫苗抗肿瘤效果优异。
【实施例10】NP@FMs的血液相容性试验：
本实施例中NP@FMs来源于实施例1。
将柠檬酸抗凝的小鼠全血1毫升，以200g离心10分钟，弃掉上清，得到的红细胞用PBS缓冲溶液洗5次。纯化的红细胞分散在PBS中，100微升的红细胞溶液加入到400微升的NP@FM(材料的终浓度为200微克/毫升)。100微升的红细胞分别用PBS或去离子水处理作为阴性和阳性对照。溶液在37℃下300rpm震荡孵育30分钟。之后，溶液在5000rpm条件下离心5分钟，100微升的上清转移到96孔板中。在570nm处检测上清的吸光度。溶血率使用下面方程式计算：
溶血率(％)＝(样品的吸光度-阴性对照组的吸光度)/(阳性对照组的吸光度-阴性对照组的吸光度)×100
如图10所示，图10为各种材料的溶血实验，根据照片和溶血率发现各组材料只有很小的溶血发生，说明了NP@FM的生物相容性良好。
综上所述，本发明提供的纳米细胞膜疫苗首次利用衍生自树突状细胞和肿瘤细胞的融合细胞的细胞膜，包裹住作为支撑物的纳米粒子，这是一种具有肿瘤抗原、共刺激分子和淋巴结靶向性的纳米疫苗，大大提高了肿瘤预防的效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种细胞膜肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)将肿瘤细胞灭活处理，得到灭活的肿瘤细胞；
(2)将灭活的肿瘤细胞和树突状细胞进行融合，得到融合细胞；
(3)将融合细胞的细胞膜剥离，得到纯化的融合细胞膜，即为细胞膜肿瘤疫苗。
2.根据权利要求1所述的细胞膜肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，
所述步骤(1)将肿瘤细胞从培养皿上消化下来，离心收集，用磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.4)洗三次；肿瘤细胞用20％的乙醇溶液在4℃处理10-30min以灭活肿瘤细胞，以500g转速离心5-15分钟后，收集细胞；用PBS重新分散细胞，500g转速离心5-15分钟，重复上述PBS分散和离心三次；
所述步骤(2)将分散在PBS中的树突状细胞和分散在PBS的上述灭活的肿瘤细胞以10:1至2:1的不同比例进行均匀混合，以500g的转速离心5-15分钟后，尽可能地吸弃上层清液；在30-120秒内，逐滴加入0.5-2毫升预先加温到37-40℃的含有50％聚乙二醇(分子量为2000-4000)和0-10％二甲亚砜的无血清培养基中；37-40℃孵育1-5分钟，缓慢加入无血清培养基，至10-50毫升，终止融合过程；以500g的转速离心5-15分钟，分离细胞，细胞再分散在含有10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素，10000单位/毫升)和白介素-4(10纳克/毫升)的培养基中；融合细胞在湿润的包含5％二氧化碳的37℃的培养箱中培养，每隔一天用含有10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素，10000单位/毫升)和白介素-4(10纳克/毫升)的培养基进行半数换液，连续培养4-10天；
所述培养基为适合融合细胞生长的培养基；
所述步骤(3)将融合细胞用细胞刮刀刮下来收集；收集的细胞用冷PBS再分散，500g离心5-15分钟收集细胞，重复PBS分散和离心过程两次；收集细胞分散到包含0.1％苯甲基磺酰氯的细胞裂解液中，并在冰水浴中孵育10-30分钟；接着通过反复冻融三次使细胞破裂；在4℃以700g转速离心8-15分钟以除掉细胞核；吸取上层液体，在4℃条件下以14000g转速离心20-50分钟得到纯化的细胞膜碎片；细胞膜碎片冻干称重，-80℃冰箱中保存，冻干的细胞膜材料在使用前用超纯水水化。
3.根据权利要求2所述的细胞膜肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，
所述步骤(1)将肿瘤细胞从培养皿上消化下来，离心收集，用PBS洗三次，肿瘤细胞用20％的乙醇溶液在4℃处理15min以灭活肿瘤细胞，以500g转速离心10分钟后，收集细胞；用PBS重新分散细胞，500g转速离心10分钟，重复上述PBS分散和离心三次；
所述步骤(2)将分散在PBS中的树突状细胞和分散在PBS的上述灭活的肿瘤细胞以2:1的比例进行均匀混合，以500g的转速离心10分钟后，尽可能地吸弃上层清液；在60秒内，逐滴加入1毫升预先加温到38℃的含有50％聚乙二醇(分子量为4000)和10％二甲亚砜的无血清培养基中；38℃孵育1分钟，缓慢加入无血清培养基，到50毫升，终止融合过程，以500g的转速离心15分钟，分离细胞，细胞再分散在含有10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素，10000单位/毫升)和白介素-4(10纳克/毫升)的培养基中；融合细胞在湿润的包含5％二氧化碳的37℃的培养箱中培养，每隔一天用含有10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素，10000单位/毫升)和白介素-4(10纳克/毫升)的培养基进行换液，连续培养6天；
所述培养基为适合融合细胞生长的培养基；
所述步骤(3)将融合细胞用细胞刮刀刮下来收集；收集的细胞用冷PBS再分散，500g离心10分钟收集细胞，重复PBS分散和离心过程两次，收集细胞分散到包含0.1％苯甲基磺酰氯的细胞裂解液中，并在冰水浴中孵育15分钟，接着通过反复冻融三次使细胞破裂，在4℃以700g转速离心10分钟以除掉细胞核；吸取上层液体，在4℃条件下以14000g转速离心30分钟得到纯化的细胞膜碎片，细胞膜碎片冻干称重，-80℃冰箱中保存，冻干的细胞膜材料在使用前用超纯水水化。
4.根据权利要求1所述的细胞膜肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)细胞融合方法为病毒诱导融合，电融合法和聚乙二醇诱导融合中的任意一种；
所述的病毒融合法：将肿瘤细胞和树突状细胞按照10:1-2:1的比例均匀混合，加入灭活的仙台病毒，4℃条下共培养1-5分钟，使病毒附着在细胞膜上，并使细胞相互凝聚，调节温度为37摄氏度，病毒-胞膜发生反应，5-30分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合；
所述的电融合法：将肿瘤细胞和树突状细胞按照10:1-2:1的比例均匀混合，将混合细胞放入融合小室，将开关拨向正弦输出档，其额度选择在1-1.3MHz，脉冲宽度为0.1毫秒，脉冲幅度为150伏特，脉冲频率为1-3次/秒，细胞在5秒到50秒钟的时间内会发生暂时性的收缩，两层膜之间形成小孔，连接成桥，形成一个个泡囊，经点连接到面连接，最后形成融合体；
所述聚乙二醇诱导融合：分散在PBS中的树突状细胞和分散在PBS的上述灭活的肿瘤细胞以10:1至2:1的不同比例进行均匀混合，以500g的转速离心5-15分钟后，尽可能地吸弃上层清液；在30-120秒内，逐滴加入0.5-2毫升预先加温到37-40℃的含有50％聚乙二醇(分子量为2000-4000)和0-10％二甲亚砜的无血清培养基中，37-40℃孵育1-5分钟，缓慢加入无血清培养基，至10-50毫升，终止融合过程，以500g的转速离心5-15分钟，分离细胞，用PBS洗去残余的聚乙二醇和二甲亚砜，得到融合细胞；
上述三种方法获得的融合细胞再分散在含有10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素，10000单位/毫升)和白介素-4(10纳克/毫升)的培养基中；融合细胞在湿润的包含5％二氧化碳的37℃的培养箱中培养，每隔一天用含有10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素，10000单位/毫升)和白介素-4(10纳克/毫升)的培养基进行半数换液，连续培养4-10天；
所述培养基为适合融合细胞生长的培养基。
5.权利要求1-4任一项所述的细胞膜肿瘤疫苗的制备方法获得的细胞膜肿瘤疫苗，其特征在于，所述的肿瘤疫苗衍生自树突状细胞和肿瘤细胞的融合细胞的细胞膜。
6.一种纳米细胞膜肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，将权利要求5的细胞膜肿瘤疫苗包裹在纳米粒子NP上，即得到纳米细胞膜肿瘤疫苗NP@FMs。
7.根据权利要求6所述的纳米细胞膜肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，
(1)纳米粒子NP的制备：将60-120毫克的四(4-羧基苯基)卟吩，180-360毫克的ZrOCl2，和1.68-3.36克的苯甲酸溶解在60-120毫升的N,N-二甲基甲酰胺中，在90℃条件下搅拌5-10小时，混合溶液以12000rpm的转速离心30分钟，并用N,N-二甲基甲酰胺洗3次去除未反应的原料，得到的纳米粒子NP保存在N,N-二甲基甲酰胺溶液中；
(2)纳米细胞膜肿瘤疫苗NP@FMs的制备：包膜前，通过离心的方法(12000rpm离心30分钟)，用超纯水置换N,N-二甲基甲酰胺；1-10毫克/毫升的融合细胞膜和1-10毫克/毫升的纳米粒子NP混合，在冰水浴中超声处理混合溶液1-10分钟，混合溶液以12000rpm的转速离心20-50分钟，即可得到所述的纳米细胞膜肿瘤疫苗。
8.根据权利要求7所述的纳米细胞膜肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，
(1)制备纳米粒子NP：将60毫克的四(4-羧基苯基)卟吩，180毫克的ZrOCl2，和1.68克的苯甲酸溶解在60毫升的N,N-二甲基甲酰胺中，在90℃条件下搅拌5小时，混合溶液以12000rpm的转速离心30分钟，并用N,N-二甲基甲酰胺洗3次去除未反应的原料，得到的纳米粒子NP保存在N,N-二甲基甲酰胺溶液中；
(2)制备纳米细胞膜肿瘤疫苗NP@FMs：包膜前，步骤(1)保存在N,N-二甲基甲酰胺溶液中的纳米粒子NP通过离心的方法(12000rpm离心30分钟)，用超纯水置换N,N-二甲基甲酰胺；2毫克/毫升的融合细胞膜和2毫克/毫升的纳米粒子NP混合，在冰水浴中超声处理混合溶液1分钟，混合溶液以12000rpm的转速离心30分钟，即可得到所述的纳米细胞膜肿瘤疫苗；
所述的肿瘤细胞为小鼠乳腺癌细胞4T1，所述的树突状细胞是从小鼠胫骨中提取的骨髓间充质干细胞，所述的纳米粒子NP粒径大小约为130纳米，ζ电势约为24.5毫伏，纳米细胞膜肿瘤疫苗粒径大小约为145纳米，ζ电势约为-31.5毫伏。
9.权利要求6-8任一项所述的纳米细胞膜肿瘤疫苗的制备方法获得的纳米细胞膜肿瘤疫苗，其特征在于，所述的肿瘤疫苗衍生自树突状细胞和肿瘤细胞的融合细胞的细胞膜，包裹住作为支撑物的纳米粒子。
10.权利要求5所述的细胞膜肿瘤疫苗或权利要求9所述的纳米细胞膜肿瘤疫苗在制备预防肿瘤的药物中的应用。
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