CN113679830B - 用于肿瘤治疗的复合纳米疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种用于肿瘤治疗的复合纳米疫苗及其制备方法，该制备方法包括先制备金属硫化物@抗原纳米粒子，然后将金属硫化物@抗原纳米粒子与未成熟树突状细胞共孵育2‑6h，得到金属硫化物@抗原@DC复合纳米疫苗。将具有高度生物相容性的抗原作为模板和原料合成纳米粒子，方法简单绿色，可解决应用于生物体内生物安全性问题；合成的金属硫化物纳米粒子尺寸为10±2.1nm、尺寸均匀、稳定性高、生物利用度高；合成的金属硫化物纳米粒子能作为金属佐剂刺激骨髓细胞诱导未成熟DC细胞成熟，增加抗原呈递以及激活下游的T细胞相关适应性免疫反应；合成的复合纳米疫苗具有高抗原负载率，且能够实现金属佐剂和抗原的共递送。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于肿瘤治疗的复合纳米疫苗及其制备方法和应用，属于生物医学纳米材料领域。
背景技术
近年来，我国恶性肿瘤的发病率呈明显上升趋势。目前，恶性肿瘤的治疗以放疗和化疗为主，但对正常组织仍有较高的毒副作用的风险，这使得癌症的治愈率仍处于很低的水平。进一步开发新的治疗方法具有重要意义。近十年来，随着树突状细胞(DendriticCells，DC)疫苗以及CAR-T细胞治疗的快速推进，免疫治疗包括治疗性疫苗在对肿瘤的治疗上引起了人们的广泛关注。肿瘤疫苗的主要组成包括抗原和佐剂，疫苗注射进入机体后通过MHC的交叉呈递给DC，级联式激活T细胞，发挥强劲的抗肿瘤作用。传统的预防性疫苗通常仅将抗原与佐剂简单混合，既无法实现抗原-佐剂的时空同步递送，又存在抗原呈递效率低下、无靶向性的问题。因此，开发新型的抗原高负载并能实现抗原-佐剂高效共递送的治疗性肿瘤疫苗是临床亟待解决的问题。
随着纳米材料和纳米医学的发展，纳米颗粒已被用作包裹抗原和佐剂的共递送系统，来实现抗原特异性的抗肿瘤反应。这些非细胞的纳米粒子作为纳米疫苗在转移到淋巴结或靶向树突状细胞时效率较低。另外，能负载纳米疫苗的树突状细胞可能为纳米颗粒的靶向性提供一个极好的平台。值得一提的是，负载纳米疫苗的DC输注到患者体内后的示踪和监测是优化给药时机、增强免疫应答的关键。科学家们研究了各种方法来合成绿色、高效、稳定的纳米疫苗。近年来，人们发现了金属硫化物，比如硫化铋有作为蛋白载体和新型金属佐剂刺激DC成熟、增强免疫治疗的潜能，并且铋元素对X射线有很强的吸收能力，是一种很好的X射线断层扫描造影剂，与DC共孵育后能实现对于该种纳米疫苗的实时可视化。更重要的是硫化物毒性较小，对生物体的影响较小。通过与蛋白质或模式抗原的结合，既能有效控制蛋白质或模式抗原的形态和大小，又能改善其在水相中的分散性，增加其生物相容性，实现蛋白质或模式抗原的高负载、高效递送和DC靶向，进而发挥高效的抗肿瘤作用。
但是利用抗原为模板生物仿生矿化金属硫化物材料尚未见报道。并且将纳米粒子与DC共孵育后，构建的治疗性金属硫化物@抗原@DC纳米疫苗也尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单的用于肿瘤治疗的复合纳米疫苗及其制备方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于肿瘤治疗的复合纳米疫苗的制备方法，所述方法包括：
S1、分别制备含金属化合物溶液和抗原溶液，其中，所述含金属化合物溶液的浓度为0.05-0.2mol/L，所述抗原的浓度为5.71-8.57g/L；
S2、将所述含金属化合物溶液缓慢加入到所述抗原溶液，并混合搅拌0.5-4h，其中，所述抗原溶液和所述含金属化合物溶液的体积比为7：1；
S3、向反应体系中加入含硫化合物溶液；
S4、向反应体系中加入pH调节剂调整pH至10-12，搅拌10-15h，得到澄清产物；
S5、将所述棕澄清产物清洗过滤，得到金属硫化物@抗原纳米粒子；
S6、提供未成熟树突状细胞，将所述金属硫化物@抗原纳米粒子与所述未成熟树突状细胞共孵育2-6h，得到金属硫化物@抗原@DC复合纳米疫苗。
进一步地，所述抗原为鸡卵清白蛋白。
进一步地，所述含金属化合物为含铋化合物或含铜化合物或含铁化合物。
进一步地，所述含铋化合物为硝酸铋或氯化铋或氯氧化铋；所述含铜化合物为硫酸铜或硝酸铜；所述含铁化合物为硝酸铁或氯化铁。
进一步地，所述含硫化合物为硫代乙酰胺。
进一步地，所述pH调节剂为氨水或氢氧化钠溶液。
进一步地，将所述棕澄清产物清洗过滤的具体步骤为：用截留分子量为7k的透析袋，在超纯水中透析24-48h，之后用截留分子量为100k的超滤管，去除多余的抗原，并用超纯水重悬。
进一步地，所述未成熟树突状细胞从小鼠骨髓中提取出骨髓细胞，用GM-CSF和IL-4两种细胞因子进行诱导刺激，7天后收集诱导分化得到。
进一步地，在所述步骤S6中，将25-500μg/mL的所述金属硫化物@抗原纳米粒子溶解在1640完全细胞培养基中与2x106 cells的所述未成熟树突状细胞共孵育6h，所述金属硫化物@抗原纳米粒子和所述未成熟树突状细胞的体积比为1:1。
本发明还提供一种如上所述的用于肿瘤治疗的复合纳米疫苗的制备方法制备得到的用于肿瘤治疗的复合纳米疫苗。
本发明的有益效果在于：用于肿瘤治疗的复合纳米疫苗的制备方法，将具有高度生物相容性的抗原作为模板和原料合成纳米粒子，方法简单绿色，可解决应用于生物体内生物安全性问题；合成的金属硫化物纳米粒子尺寸为10±2.1nm、且尺寸均匀、稳定性高、生物利用度高；合成的金属硫化物纳米粒子能作为金属佐剂刺激骨髓细胞诱导未成熟DC细胞成熟，增加抗原呈递以及激活下游的T细胞相关适应性免疫反应；合成的复合纳米疫苗具有高抗原负载率，且能够实现金属佐剂和抗原的共递送。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1为本发明实施例一制备得到的Bi2S3@OVA纳米粒子的电镜图；
图2为实施例一制备得到的Bi2S3@OVA纳米粒子与碘基造影剂碘普罗胺(Iopromide)的体外CT成像能力对比图；
图3为实施例一制备得到的Bi2S3@OVA@DC复合纳米疫苗以及Bi2S3@OVA分别注入小鼠体内0h(Ctrl)和6h的淋巴结CT示踪图；
图4为实施例一制备得到的Bi2S3@OVA@DC复合纳米疫苗的形态图；
图5为Bi2S3@OVA@DC复合纳米疫苗刺激树突状细胞成熟以及激活下游T细胞功能的表征。其中，图5A为OVA和Bi2S3@OVA体外刺激树突状细胞成熟表型CD86-FITC的平均荧光强度(MFI)图；图5B为OVA和Bi2S3@OVA体外刺激树突状细胞成熟表型CD80-PE的MFI图；图5C为OVA和Bi2S3@OVA体外刺激树突状细胞抗原呈递能力表征的OVA 257-264连接H-2Kb-APC的MFI图；图5D为在transwell共培养系统中，Bi2S3@OVA@DC激活下游T细胞的实验方案示意图；图5E至图5I分别为Bi2S3@OVA@DC和OVA-DC对激活不同下游T细胞增殖与杀伤功能的表征图；
图6为Bi2S3@OVA@DC复合纳米疫苗刺激小鼠体内细胞毒性T淋巴细胞反应，以及产生OVA抗原特异性的IgG抗体反应，其中，图6A为在B16F10或B16F10-OVA小鼠黑色素瘤细胞中呈现的OVA特异性的CTL反应。图6B为Elisa法检测血清中OVA特异性的IgG1抗体的产生；图6C为Elisa法检测血清中OVA特异性的IgG2a抗体的产生。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
本发明提供一种用于肿瘤治疗的复合纳米疫苗的制备方法，该方法包括：
S1、分别制备含金属化合物溶液和抗原溶液，其中，含金属化合物溶液的浓度为0.05-0.2mol/L，抗原的浓度为5.71-8.57g/L；
S2、将含金属化合物溶液缓慢加入到抗原溶液，并混合搅拌0.5-4h，其中，抗原溶液和含金属化合物溶液的体积比为7：1；
S3、向反应体系中加入含硫化合物溶液；
S4、向反应体系中加入pH调节剂调整pH至10-12，搅拌10-15h，得到澄清产物；
S5、将棕澄清产物清洗过滤，得到金属硫化物@抗原纳米粒子；
S6、提供未成熟树突状细胞，将金属硫化物@抗原纳米粒子与未成熟树突状细胞共孵育2-6h，得到金属硫化物@抗原@DC复合纳米疫苗。
其中，将抗原溶解于双蒸水中形成抗原溶液。将含金属化合物溶于硝酸中形成含金属化合物溶液，硝酸的浓度为1-2mol/L。含硫化合物溶液的浓度可以为1mol/L。
抗原为鸡卵清白蛋白(OVA)，含金属化合物为含铋化合物或含铜化合物或含铁化合物，其中，含铋化合物为硝酸铋或氯化铋或氯氧化铋；含铜化合物为硫酸铜或硝酸铜；含铁化合物为硝酸铁或氯化铁；含硫化合物为硫代乙酰胺。关于抗原、含金属化合物和含硫化合物的原料不仅限于此，抗原、含金属化合物和含硫化合物还可以为其他原料，比如，抗原还可以为牛血清抗原(BSA)等，含铋化合物还可以为硫酸铋，含硫化合物可以为硫化钠、硫代硫酸钠或硫脲等，在此不一一列举。
pH调节剂为氨水或氢氧化钠溶液，在一较佳实施例中，使用氢氧化钠作为pH调节剂，且氢氧化钠的浓度为2mol/L。
搅拌可使用磁力搅拌，在不仅限于此，还可以使用其他搅拌方式，在此不一一列举。
在步骤S5中，将澄清产物清洗过滤的具体步骤为：用截留分子量为7k的透析袋，在超纯水中透析24-48h，之后用截留分子量为100k的超滤管，去除多余的抗原，并用超纯水重悬，具体为，用100K的超滤管进行离心，转速为3000rpm、时长为5min，并且使用超纯水重复离心分离。
在步骤S6中，未成熟树突状细胞从小鼠骨髓中提取出骨髓细胞，用GM-CSF和IL-4两种细胞因子进行诱导刺激，7天后收集诱导分化得到。
小鼠选取6-8周C57BL/6小鼠，优选的小鼠选取6-8周C57BL/6J小鼠。将25-500μg/mL的金属硫化物@抗原纳米粒子与2x106 cells的未成熟树突状细胞共孵育6h，金属硫化物@抗原纳米粒子和未成熟树突状细胞的体积比为1:1。其中，金属硫化物@抗原纳米粒子溶解在1640完全细胞培养基中。该1640完全细胞培养基为现有结构，在此不再赘述。
该制备方法中，抗原的量相对含金属化合物过量，将含金属化合物溶液缓慢加入到抗原溶液进行初步反应，在酸性环境下使金属离子与抗原结合，该反应过程中，由于抗原充分过量，故金属键能与抗原完全接触并被抗原吸附于其表面。初步反应结束后，加入硫源(硫代乙酰胺)，加入氢氧化钠调节pH至10-12，在碱性环境，硫逐步释放促进金属硫键的形成，充分搅拌后，可获得稳定且均一的金属硫化物纳米粒子。得到棕黑色的澄清产物后，用截留分子量大于抗原分子量的超滤管超滤来去除多余的蛋白或抗原，即得金属硫化物@抗原纳米粒子。
该金属硫化物纳米粒子，可以为硫化铋、硫化铜或硫化铁等能够作为蛋白载体和新型金属佐剂的材料。
该制备方法将具有高度生物相容性的抗原作为模板和原料，模拟生物体内矿化过程，构建支架对无机金属离子进行支撑来形成尺寸在几个纳米的金属簇纳米材料，从而合成金属硫化物纳米粒子。
下面以具体实施例对上述制备方法进行详细说明：
实施例一
步骤一、将鸡卵清白蛋白(OVA)溶解于双蒸水中形成鸡卵清白蛋白溶液，鸡卵清白蛋白的浓度为7.14g/L；
步骤二、将硝酸铋溶于硝酸中形成硝酸铋溶液，硝酸铋溶液的浓度为0.05mol/L，硝酸的浓度为2mol/L；
步骤三、将硝酸铋溶液缓慢加入到鸡卵清白蛋白溶液，并混合搅拌1h，其中，鸡卵清白蛋白溶液和硝酸铋溶液的体积比为7：1，其中，硝酸铋溶液的体积为5ml，鸡卵清白蛋白溶液的体积为35ml；
步骤四、向反应体系中加入0.5ml含硫化合物溶液(1mol/L)；
步骤五、向反应体系中加入pH调节剂调整pH至12，搅拌12h，得到棕黑色澄清产物；
步骤六、将棕黑色澄清产物用截留分子量为7k的透析袋，在超纯水中透析24-48h，之后用截留分子量为100k的超滤管，去除多余的鸡卵清白蛋白，并用超纯水重悬，具体为，用100K的超滤管进行离心，转速为3000rpm、时长为5min，并且使用超纯水重复离心分离，得到Bi2S3@OVA纳米粒子；
步骤七、从6-8周C57BL/6J小鼠骨髓中提取出骨髓细胞，用GM-CSF和IL-4两种细胞因子进行诱导刺激，7天后收集诱导分化的未成熟树突状细胞，将400μg/mL的Bi2S3@OVA纳米粒子与2x106 cells未成熟树突状细胞共孵育6h，得到Bi2S3@OVA@DC复合纳米疫苗。
实施例二
步骤一、将鸡卵清白蛋白(OVA)溶解于双蒸水中形成鸡卵清白蛋白溶液，鸡卵清白蛋白的浓度为5.71g/L；
步骤二、将硝酸铋溶于硝酸中形成硝酸铋溶液，硝酸铋溶液的浓度为0.05mol/L，硝酸的浓度为1mol/L；
步骤三、将硝酸铋溶液缓慢加入到鸡卵清白蛋白溶液，并混合搅拌1h，其中，鸡卵清白蛋白溶液和硝酸铋溶液的体积比为7：1，其中，硝酸铋溶液的体积为5ml，鸡卵清白蛋白溶液的体积为35ml；
步骤四、向反应体系中加入0.5ml硫化钠溶液(1mol/L)；
步骤五、向反应体系中加入pH调节剂调整pH至10，搅拌12h，得到棕黑色澄清产物；
步骤六、同实施例一；
步骤七、同实施例一。
实施例三
步骤一、将鸡卵清白蛋白(OVA)溶解于双蒸水中形成鸡卵清白蛋白溶液，鸡卵清白蛋白的浓度为8.57g/L；
步骤二、将氯化铋溶于盐酸中形成氯化铋溶液，盐酸铋溶液的浓度为0.2mol/L，盐酸的浓度为2mol/L；
步骤三、将盐酸铋溶液缓慢加入到鸡卵清白蛋白溶液，并混合搅拌2h，其中，鸡卵清白蛋白溶液和盐酸铋溶液的体积比为7：1，其中，硝酸铋溶液的体积为5ml，鸡卵清白蛋白溶液的体积为35ml；
步骤四、向反应体系中加入0.5ml硫代乙酰胺溶液(1mol/L)；
步骤五、向反应体系中加入pH调节剂调整pH至10，搅拌12h，得到棕黑色澄清产物；
步骤六、同实施例一；
步骤七、同实施例一。
实施例一至实施例三制备得到的Bi2S3@OVA纳米粒子尺寸超小。请参见图1，实施例一制备得到的Bi2S3@OVA纳米粒子尺寸为10±2.1nm，且尺寸均匀、稳定性高、生物利用度高。此外，将纳米粒子与未成熟树突状细胞进行共孵育后构建的DC相关纳米粒子，也为解决纳米粒子的DC靶向性提供了一定的方向性。纳米疫苗的抗原的负载率能实现最大化，纳米疫苗中抗原所占比例高达75％，解决当前纳米疫苗中抗原负载率低的问题。
请参见图2，实施例一制备得到的Bi2S3@OVA纳米粒子与碘基造影剂碘普罗胺(Iopromide)的体外CT成像能力对比图。可得出，硫化铋具有更高的X射线衰减能力，提高了CT成像的对比度。Bi2S3@OVA纳米粒子浓度线性关系斜率约为90.2HUL g-1远大于商用的碘基造影剂碘普罗胺(Iopromide)浓度线性关系斜率15.9HUL g-1。
Bi2S3@OVA纳米粒子在无创性成像示踪如CT成像等也有着巨大潜力，能够实现通过CT来进行实时示踪，进而监测治疗效果，实现高效的个性化抗肿瘤治疗。
请参见图3，实施例一制备得到的Bi2S3@OVA@DC复合纳米疫苗经小鼠脚垫注射后，利用CT进行淋巴结示踪成像，同时使用Bi2S3@OVA对应对照，可以看出，Bi2S3@OVA@DC复合纳米疫苗能够在刚注射进小鼠体内就可以富集在淋巴结内，具有淋巴结DC靶向性。而Bi2S3@OVA在注射进小鼠体内6h才富集在淋巴结内。
请参见图4，实施例一制备得到的Bi2S3@OVA@DC复合纳米疫苗的形态图，可以得到树突状细胞DC具有成熟时伸出的许多树突状或伪足状突起结构，且Bi2S3和OVA分布在树突状细胞DC内。
请参见图5，图5A为OVA和Bi2S3@OVA体外刺激树突状细胞成熟表型CD86-FITC的平均荧光强度(MFI)图；图5B为OVA和Bi2S3@OVA体外刺激树突状细胞成熟表型CD80-PE的MFI图；图5C为OVA和Bi2S3@OVA体外刺激树突状细胞抗原呈递能力表征的OVA 257-264连接H-2Kb-APC的MFI图。其中，Control为阴性对照，LPS(内毒素)为阳性对照。可以看出，对于体外刺激DC细胞的能力，Bi2S3@OVA比OVA效果好。
图5D为在transwell共培养系统中，Bi2S3@OVA@DC激活下游T细胞的实验方案示意图。主要为从小鼠脾脏中分离CD3+T或CD8+T细胞(在上室中)用CFSE染色标记，并与Bi2S3@OVA@DC或OVA-DC(在下室中)共培养；图5E至图5I分别为Bi2S3@OVA@DC和OVA-DC对激活不同下游T细胞增殖与杀伤功能的表征图。其中，Control为阴性对照，LPS为阳性对照。可以看出，Bi2S3@OVA@DC比OVA-DC效果好。
Bi2S3@OVA@DC复合纳米疫苗刺激小鼠体内产生OVA特异性细胞毒性T淋巴细胞反应(CTL)。具体的，在正常小鼠皮下分别注射DC、OVA-DC、Bi2S3@OVA@DC复合疫苗，每7天注射一次，共3次，后取小鼠的脾脏制备脾细胞悬液。再将预处理的脾细胞一分为二，分别与CFSE标记的B16F10或B16F10-OVA小鼠黑色素瘤细胞进行共培养。两天后，通过流式细胞仪对CFSE标记两种细胞的MFI进行定量。
请参见图6，图6A为在B16F10或B16F10-OVA小鼠黑色素瘤细胞中呈现的OVA特异性的CTL反应。图6B为Elisa法检测血清中OVA特异性的IgG1抗体的产生；图6C为Elisa法检测血清中OVA特异性的IgG2a抗体的产生。由此可以得出Bi2S3@OVA@DC复合纳米疫苗具有通过抗原特异性的CTL反应和增加抗原特异性的IgG抗体水平来发挥抗肿瘤作用的巨大潜力。
本发明还提供一种如上的用于肿瘤治疗的复合纳米疫苗的制备方法制备得到的用于肿瘤治疗的复合纳米疫苗。
综上，用于肿瘤治疗的复合纳米疫苗的制备方法，将具有高度生物相容性的抗原作为模板和原料合成纳米粒子，方法简单绿色，可解决应用于生物体内生物安全性问题；合成的金属硫化物纳米粒子尺寸为10±2.1nm、且尺寸均匀、稳定性高、生物利用度高；合成的金属硫化物纳米粒子能作为金属佐剂刺激骨髓细胞诱导未成熟DC细胞成熟，增加抗原呈递以及激活下游的T细胞相关适应性免疫反应；合成的复合纳米疫苗具有高抗原负载率，且能够实现金属佐剂和抗原的共递送。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种用于肿瘤治疗的复合纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
S1、分别制备含金属化合物溶液和抗原溶液，其中，所述含金属化合物溶液的浓度为0.05-0.2mol/L，所述抗原的浓度为5.71-8.57g/L，其中，所述含金属化合物为含铋化合物；
S2、将所述含金属化合物溶液缓慢加入到所述抗原溶液，并混合搅拌0.5-4h，其中，所述抗原溶液和所述含金属化合物溶液的体积比为7：1；
S3、向反应体系中加入含硫化合物溶液；
S4、向反应体系中加入pH调节剂调整pH至10-12，搅拌10-15h，得到澄清产物；
S5、将所述澄清产物清洗过滤，得到金属硫化物@抗原纳米粒子；
S6、提供未成熟树突状细胞，将所述金属硫化物@抗原纳米粒子与所述未成熟树突状细胞共孵育2-6h，得到金属硫化物@抗原@DC复合纳米疫苗。
2.如权利要求1所述的用于肿瘤治疗的复合纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述抗原为鸡卵清白蛋白。
3.如权利要求1所述的用于肿瘤治疗的复合纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述含铋化合物为硝酸铋或氯化铋或氯氧化铋。
4.如权利要求1所述的用于肿瘤治疗的复合纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述含硫化合物为硫代乙酰胺。
5.如权利要求1所述的用于肿瘤治疗的复合纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述pH调节剂为氨水或氢氧化钠溶液。
6.如权利要求1所述的用于肿瘤治疗的复合纳米疫苗的制备方法，其特征在于，将所述澄清产物清洗过滤的具体步骤为：用截留分子量为7k的透析袋，在超纯水中透析24-48h，之后用截留分子量为100k的超滤管，去除多余的抗原，并用超纯水重悬。
7.如权利要求1所述的用于肿瘤治疗的复合纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述未成熟树突状细胞从小鼠骨髓中提取出骨髓细胞，用GM-CSF和IL-4两种细胞因子进行诱导刺激，7天后收集诱导分化得到。
8.如权利要求1所述的用于肿瘤治疗的复合纳米疫苗的制备方法，其特征在于，在所述步骤S6中，将25-500μg/mL的所述金属硫化物@抗原纳米粒子溶解在1640完全细胞培养基中与2x106 cells的所述未成熟树突状细胞共孵育6h，所述金属硫化物@抗原纳米粒子和所述未成熟树突状细胞的体积比为1:1。
9.一种如权利要求1至8项中任一项所述的用于肿瘤治疗的复合纳米疫苗的制备方法制备得到的用于肿瘤治疗的复合纳米疫苗。
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