CN110269935B - 肿瘤细胞纳米金囊泡、免疫纳米金囊泡及制备方法与应用 - Google Patents

肿瘤细胞纳米金囊泡、免疫纳米金囊泡及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了肿瘤细胞纳米金囊泡、免疫纳米金囊泡及制备方法与应用。该肿瘤细胞纳米金囊泡为外层囊泡和内核组成的核壳结构；外层囊泡为包裹内核的细胞膜；内核由纳米金粒子组成；外层囊泡携带有肿瘤细胞特异性抗原；肿瘤细胞免疫纳米金囊泡携带有肿瘤细胞特异性抗原的肽段，且保留免疫细胞的特性。本发明提供的肿瘤细胞生成的纳米金囊泡，在保持纳米金原光热治疗的基础上，同时赋予囊泡携带母细胞的肿瘤特异性抗原，刺激机体产生免疫应答，释放相关免疫细胞及因子对肿瘤进行免疫杀伤，同时激发系统免疫防御，抑制肿瘤转移，并长效抑制肿瘤的复发。携带的抗原信息经抗原提呈细胞处理后可进一步提呈给免疫细胞，从而诱导免疫应答，同时实现肿瘤的免疫治疗和光热治疗。

Description

肿瘤细胞纳米金囊泡、免疫纳米金囊泡及制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种抗肿瘤药物及载体领域，更具体地，涉及一种肿瘤细胞胞吐的携带肿瘤抗原并具有光热转换能力的纳米金囊泡、免疫纳米金囊泡及其制备方法与应用。
背景技术
金纳米粒具有高效的光热转换能力、良好的稳定性、低毒性以及可调控的表面性质，广泛应用于肿瘤的多种治疗手段中如肿瘤光热治疗，肿瘤光动力治疗，肿瘤诊断及抗肿瘤药物的递送等。但其化学制备工序中需添加多种化学试剂包括硼氢化钠等毒性试剂，极大的限制了其安全生产及临床应用。而且近年来研究的基于金纳米粒的药物多应用于单一手段的抗肿瘤治疗，不能有效抑制肿瘤生长，进而诱发更严重的肿瘤转移及复发。
发明内容
本发明解决了现有技术中金纳米粒传统制备过程中产生安全隐患，肿瘤治疗中杀伤作用不强，且不能有效抑制肿瘤转移和复发的技术问题。
按照本发明的第一方面，提供了一种肿瘤细胞纳米金囊泡，该肿瘤细胞纳米金囊泡为外层囊泡和内核组成的核壳结构；所述外层囊泡为包裹所述内核的细胞膜；所述内核由纳米金粒子组成；所述外层囊泡携带有肿瘤细胞特异性抗原。
优选地，所述内核的直径为25nm-40nm；所述细胞膜的厚度为5nm-12nm。
按照本发明的另一方面，提供了一种肿瘤细胞免疫纳米金囊泡，该肿瘤细胞免疫纳米金囊泡为外层囊泡和内核组成的核壳结构；所述外层囊泡为包裹所述内核的免疫细胞的细胞膜；所述内核由纳米金粒子组成；所述外层囊泡携带有肿瘤细胞特异性抗原的肽段，且保留免疫细胞的特性。
优选地，所述内核的直径为25nm-40nm；所述细胞膜的厚度为6nm-12nm。
按照本发明的另一方面，提供了一种肿瘤细胞纳米金囊泡的制备方法，包括以下步骤：
(1)将含有三价金离子的溶液加入肿瘤细胞中，孵育72h-120h；所述肿瘤细胞的培养液为不添加血清的培养液，用于纳米金在肿瘤细胞内生成，同时刺激肿瘤细胞胞吐；
(2)收集步骤(1)所述肿瘤细胞胞吐的肿瘤细胞纳米金囊泡：将步骤(1)中孵育后的肿瘤细胞以800rpm-3000rpm的转速离心5min-10min，保留上清液；将所述上清液以8000rpm-13000rpm的转速离心30min-90min，弃上清后将沉淀用缓冲液清洗重悬，即得到肿瘤细胞纳米金囊泡。
优选地，步骤(1)中将含有三价金离子的溶液加入肿瘤细胞后，所述三价金离子的浓度为0.5mM-1mM；步骤(1)所述肿瘤细胞的个数为0.3×107-1×107；
优选地，步骤(1)所述含有三价金离子的溶液为氯金酸溶液、氯金酸水合物溶液或氯化金溶液。
按照本发明的另一方面，提供了一种肿瘤细胞免疫纳米金囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求5得到的肿瘤细胞纳米金囊泡加入到在不添加血清的培养液中培养的免疫细胞中，孵育6h-8h后，将所述免疫细胞的培养液重新更换为不添加血清的培养液，继续孵育24h-48h，刺激所述免疫细胞胞吐；
(2)收集步骤(1)所述免疫细胞胞吐的肿瘤细胞免疫纳米金囊泡：将步骤(1)中孵育后的免疫细胞以800rpm-3000rpm的转速离心5min-10min，保留上清液；将所述上清液以10000rpm-20000rpm的转速离心30min-90min，弃上清后将沉淀用缓冲液清洗重悬，即得到肿瘤细胞免疫纳米金囊泡。
优选地，步骤(1)所述的肿瘤细胞纳米金囊泡的质量为20μg-50μg，步骤(1)所述的免疫细胞的个数为2×106-7×106；步骤(1)所述的免疫细胞为树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞或淋巴细胞；
优选地，所述步骤(1)中，将免疫细胞培养液重新更换为不添加血清的培养液之后，还包括用紫外光照射所述免疫细胞0.5h-2h。
按照本发明的另一方面，提供了如权利要求1-2所述的肿瘤细胞纳米金囊泡在制备抗肿瘤药物上的应用。
按照本发明的另一方面，提供了如权利要求3-4所述的肿瘤细胞免疫纳米金囊泡在制备抗肿瘤药物上的应用。
本发明具有以下有益效果：本发明提供的肿瘤细胞生成的纳米金囊泡中，在保持纳米金原有特性的基础上，即纳米金介导光热转换，实现光热治疗，同时赋予囊泡携带母细胞的肿瘤特异性抗原，刺激机体产生免疫应答，释放相关免疫细胞及因子对肿瘤进行免疫杀伤，同时激发系统免疫防御，抑制肿瘤转移，并长效抑制肿瘤的复发。携带的抗原信息经抗原提呈细胞处理后可进一步提呈给免疫细胞，从而诱导免疫应答，同时实现肿瘤的免疫治疗和光热治疗。该免疫纳米金囊泡具有以下特点：
(1)肿瘤细胞纳米金囊泡的制备方法简单，通过细胞胞吐产生，具有细胞膜包被的核壳结构，利用囊泡产生的原理和特性，使得制备肿瘤纳米金囊泡的过程中自发携带来源于肿瘤母细胞的特异性抗原，不需要再次外源性人工修饰。制备方法稳定性和重复性好、成本低、并且适合工业化生产。
(2)免疫纳米金囊泡将肿瘤纳米金囊泡进一步经免疫细胞处理后保留了肿瘤抗原的抗原性，消除其侵袭性，从而规避肿瘤纳米囊泡可能带来的促进肿瘤生长、转移等反效应，具有有效的治疗效果。
(3)材料安全，具有较好的生物相容性，未见明显的心、肝、脾、肺和肾脏的损伤，体内毒副作用低，安全性好。
(4)外部物理手段控制治疗，形成肿瘤靶向效果，从而提高肿瘤抑制效率，提高患者的顺应性。本发明提供的免疫纳米金囊泡能够有效抑制并消除原发肿瘤，肿瘤抑制率高达91.6％，可有效抑制肿瘤转移及复发，具有良好的长效抗肿瘤的效果。
附图说明
图1为肿瘤细胞纳米金囊泡AuNP@B16F10的光学图像和电子显微镜图像。
图2为肿瘤纳米金囊泡的能量色散X射线光谱图。
图3为肿瘤纳米金囊泡的相关蛋白表达western blot图。
图4为免疫纳米金囊泡AuNP@DCB16F10的电子显微镜图像。
图5为免疫纳米金囊泡的能量色散X射线光谱图。
图6为免疫纳米金囊泡的相关蛋白表达western blot图。
图7为免疫纳米金囊泡在常温下PBS中的稳定性。
图8为纳米金囊泡的体外光热转化效果；图8(A)为免疫纳米金囊泡光热转换的红外照片；图8(B)为免疫纳米金囊泡光热转换的对应升温曲线。
图9为荧光染料DIR和DIR标记的免疫纳米金囊泡在黑色素瘤B16F10荷瘤小鼠活体成像和离体组织分布结果；其中图9(A)为DIR标记的免疫纳米金囊泡在小鼠体内分布随时间变化的图像，圆圈标记为肿瘤部位；图9(B)为DIR标记的免疫纳米金囊泡皮下注射后不同时间在各组织的分布；图9(C)为DIR标记的免疫纳米金囊泡在淋巴结的分布，上排为左右两侧的腹股沟淋巴结，下排为左右两侧的腋下淋巴结。
图10为免疫纳米金囊泡的在体光热转化效果；其中图10(A)为皮下注射的免疫纳米金囊泡在小鼠肿瘤部位的光热转换效果；图10(B)为图10(A)图对应的升温曲线。
图11为黑色素瘤B16F10荷瘤小鼠分别皮下给以PBS、PBS+NIR、AuNP@DCL929+NIR、AuNP@DC4T1和AuNP@DC4T1+NIR治疗后小鼠肿瘤和体重变化；其中图11(A)为小鼠肿瘤体积变化；图11(B)肿瘤瘤体图像；图11(C)为肿瘤重量；图11(D)相对体重的变化。
图12为乳腺癌4T1荷瘤小鼠分别皮下给以PBS、PBS+NIR、AuNP@DCL929+NIR、AuNP@DC4T1和AuNP@DC4T1+NIR治疗后小鼠肿瘤、体重和结节变化；其中图12(A)为肿瘤体积的变化；图12(B)为肿瘤瘤体图像；图12(C)为肿瘤重量；图12(D)为相对体重的变化；如12(E)为取出的各组小鼠肺部结节计数；图12(F)为取出的各组小鼠肺部结节图像。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1：肿瘤细胞纳米金囊泡的制备
具体合成步骤为：将氯金酸溶液(0.5mM)加入生长至80％并饥饿处理的B16F10细胞中混合均匀，置于37℃，5％CO2培养环境中培养4天，然后将上清液吸出，600g、10分钟离心除去细胞碎片等，重复两次，收集上清液10000g、30分钟离心将纳米金囊泡收集提纯，上清重复离心两次，收集的沉淀合并重悬，以1毫升磷酸盐缓冲液600g、10分钟低速离心清洗，上清液即为肿瘤细胞纳米金囊泡。
利用光学显微镜及透射电子显微镜观察纳米粒形态，可见肿瘤细胞胞吐的纳米金囊泡呈紫红色，图1显示胞吐的纳米金囊泡具有囊泡包被的核壳结构，内核为25～40nm，膜厚为5～8nm，图上标尺为100nm。
利用EDX能量色散X射线光谱确定纳米金囊泡所包含的元素，结果如图2所示，该产物具有Au的特征峰。同时，O元素的特征峰也证明外层细胞膜的存在。
使用WB免疫印迹技术确证纳米金囊泡的信息携带，结果如图3所示，该纳米金囊泡与B16F10细胞均携带肿瘤特异性抗原gp100(KD)，热休克蛋白Hsp70(KD)，说明该纳米金囊泡携带有所述肿瘤细胞抗原。
实施例2：具免疫功能的纳米金囊泡的制备
纳米金囊泡制备的具体操作步骤为：将实施例1制备的肿瘤细胞纳米金囊泡20微克加入到生长至80％的树突状细胞DC2.4的空白培养基中，孵育6小时后换新的空白培养基，在8W紫外光下照射1小时，然后在37℃,5％CO2环境中继续培养，24小时后，收集上清液，600g、10分钟低速离心除去细胞碎片，重复两次，上清液再13000g、30分钟高速离心收集提纯纳米金囊泡，上清液重复离心两次，合并后的沉淀用250微升磷酸盐缓冲液重悬，600g、10分钟离心清洗即得由免疫细胞处理后得具免疫功能的纳米金囊泡。
通过透射电镜纳米金囊泡的形态、大小，其图谱如图4所示。可以看出，纳米金囊泡粒径为25～40nm，呈现膜包被的核壳结构，膜厚度为6～12nm，图上标尺为200nm。
通过EDX能量色散X射线光谱检测纳米金囊泡的元素组成。如图5所示，该产物具有Au特征峰，同时具有P和O等元素证明外层细胞膜的存在，外层囊泡为包裹纳米金内核的免疫细胞的细胞膜。
通过WB免疫印迹技术检测具免疫功能的纳米金囊泡所携带的母细胞信息。如图6所示，该产物携带树突细胞的特征分子主要相容性抗原分子MHC II(KD)以及热休克蛋白Hsp70(KD)，说明该免疫纳米金囊泡携带有树突细胞的标志，可以发挥树突细胞的抗原提呈功能，保留了免疫细胞的特性。
为了考察肿瘤细胞免疫纳米金囊泡的存储稳定性，我们连续5天观察免疫纳米金囊泡的稳定性，结果见图7。图7分别是在4℃低温保存下，连续5天免疫纳米粒囊泡溶液，从图上可以看出，纳米金囊泡未发生聚沉现象，说明纳米粒稳定性好。
实施例3：纳米金囊泡的体外光热转化效果研究
为了考察免疫纳米金囊泡的光热转化能力，我们对Au浓度为100ug/mL的纳米金囊泡进行光照升温实验。具体步骤为：将功率为2W/cm2的近红外光(NIR)直接照射纳米金囊泡溶液，用红外照相仪监控3分钟内溶液的温度变化。结果见图8，可知纳米金囊泡具有良好的光热转化能力。图8(A)为免疫纳米金囊泡光热转换的红外照片；图8(B)为免疫纳米金囊泡光热转换的对应升温曲线，可知照射1分钟就升温至42℃以上，达到细胞的热杀伤温度，可以实现光热对肿瘤细胞的杀伤效果。
实施例4：免疫纳米金囊泡的小鼠活体成像和离体组织分布结果
首先建立B16F10荷瘤小鼠模型，在C57BL/6小鼠左后肢背部皮下接种B16F10细胞悬浮液5×104细胞数/0.2mL/只。待肿瘤长至500-1000mm3后，老鼠分为两组，分别给予游离荧光燃料DIR和DIR标记的免疫纳米金囊泡(AuNP@DCB16F10-DIR)。在4h、8h、12h、24h和48h分别监测老鼠的体内荧光分布，同时于8h、24h和48h处死小鼠，收集其主要脏器并检测其荧光信号强度。
免疫纳米金囊派的肿瘤富集和体内分布情况如图9所示。1、2、3、4、5和6分别表示离体的肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织。与游离DIR相比，AuNP@DCB16F10-DIR纳米粒给药组有很好的肿瘤富集和滞留的效果，如图9(A)所示。同时在离体的器官分布中，如图9(B)所示，纳米粒也有很好的肿瘤靶向效果。另外，纳米粒在淋巴结中也有明显的滞留，并且从近段向远段逐渐迁移，如图9(C)所示。
实施例5：免疫纳米金囊泡的在体光热转化效果研究
建立如实施例4所述荷瘤小鼠模型，待肿瘤长至500-1000mm3后，将小鼠分为三组，分别皮下给予PBS，AuNP@DCL929和AuNP@DCB16F10，24小时后，近红外光照射肿瘤部位(2W/cm2)，并用红外照相仪监控3分钟内肿瘤部位温度变化。结果如图10所示，其中图10(A)为皮下注射的免疫纳米金囊泡在小鼠肿瘤部位的光热转换效果；图10(B)为图10(A)图对应的升温曲线，可知两种纳米金囊泡在体升温速度快，40s时即可达到肿瘤杀伤温度，随照射时间延长温度仍继续升高，证明免疫纳米金囊泡维持了纳米金的光热转化能力，可以有效地实现肿瘤的光热治疗。
实施例6：免疫纳米金囊泡的抗肿瘤活性研究。
在C57BL/6小鼠左后肢背部皮下接种B16F10细胞悬浮液5×104细胞数/0.2mL/只。小鼠随机分为5组，当肿瘤体积到50mm3左右时，小鼠分别皮下注射PBS、PBS、AuNP@DCL929、AuNP@DCB16F10和AuNP@DCB16F10，其中2、3、5组24小时后对肿瘤局部进行NIR照射(2W/cm2，1min)。每三天给药一次，重复三次。隔天监测给药后肿瘤体积和体重的变化。第21天，处死老鼠，剥离肿瘤，拍照并称重。
肿瘤抑制结果如图11所示，肿瘤生长曲线如图11(A)所示、肿瘤剥离情况如图11(B)、肿瘤重量如图11(C)所示。从图11(A)、图11(B)和图11(C)可以得知，PBS组和PBS+NIR组肿瘤生长迅速，其余三组均有明显的肿瘤抑制效果，其中，AuNP@DCL929+NIR和AuNP@DCB16F10两组展现了一定的肿瘤抑制效果，分别证明了纳米金囊泡的光热治疗效果和免疫治疗效果，而AuNP@DCB16F10+NIR组的抗肿瘤活性最强，肿瘤抑制率达到91.7％。这说明免疫纳米金囊泡自身可以发挥纳米金的光热治疗作用，也可以通过携带的抗原信息激发自体免疫应答，从而发挥免疫治疗的效果。从老鼠的体重变化情况来看，如图11(D)所示，各组老鼠体重均无明显降低。这说明免疫纳米金囊泡具有良好的抗肿瘤效果，体内安全性高。
实施例7：免疫金纳米囊泡的抗肿瘤效果普适性及抗肿瘤转移效果研究
为了验证免疫金纳米囊泡制备方法，抗肿瘤效果的普适性以及抗肿瘤转移效果，我们利用胰腺癌细胞4T1制备了提呈4T1相关肿瘤抗原的免疫纳米金囊泡(AuNP@DC4T1)，制备方法同实施例1和2，其中将黑色素瘤B16F10细胞替换成为4T1细胞。
接着构建4T1小鼠荷瘤模型，在Balb/c小鼠的右前肢第二对和第三对乳房垫之间接种4T1细胞(105细胞数/0.2mL/只)，待肿瘤生长至约60mm3时，将小鼠随机分为5组，分别皮下注射PBS,PBS,AuNP@DCL929，AuNP@DC4T1，AuNP@DC4T1，其中第2，3，5组在给药24小时后进行肿瘤局部近红外照射(3W/cm2，1min)，每三天给药一次，照射一次，重复3次。隔天监控小鼠体重和肿瘤体积变化，第26天，处死老鼠，剥离肿瘤，拍照并称重。同时剥离小鼠肺部，bovin’s液染色过夜，统计肺部肿瘤结节数，通过老鼠肺部的结节分布可以判断免疫纳米金囊泡的抗肿瘤肺转移效果。
肿瘤抑制结果如图12所示，其中肿瘤生长曲线如图12(A)所示、肿瘤剥离情况如图12(B)所示、肿瘤重量如图12(C)所示。从图12(A)、图12(B)和图12(C)可以得知，PBS组和PBS+NIR组肿瘤生长迅速，其余三组均有明显的肿瘤抑制效果，其中AuNP@DC4T1+NIR组的体内抗肿瘤活性最强。这说明免疫纳米金囊泡可以通过调节制备方法而修饰所携带的抗原，从而应对不同的肿瘤治疗。从老鼠的体重变化情况来看，如图12(D)所示，各组老鼠体重均无明显降低，再次证明了纳米金囊泡的安全性。从小鼠各组肺结节数量，如(图12(E)和图12(F)可以看出，PBS和PBS+NIR组肺部有很明显的肿瘤结节发生，而另外三组的肺结节发作明显被抑制，尤其是AuNP@DC4T1+NIR组，几乎没有明显的结节发生。这说明免疫纳米金囊泡发挥免疫作用抑制肿瘤生长的同时，还能够有效的抑制肿瘤的转移。
综上所述，免疫纳米金囊泡具有制备简单、安全性高和抗肿瘤效果好等优点，是一个非常有潜力的抗肿瘤药物。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种肿瘤细胞纳米金囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将含有三价金离子的溶液加入肿瘤细胞中，孵育72h-120h；所述肿瘤细胞的培养液为不添加血清的培养液，用于纳米金在肿瘤细胞内生成，同时刺激肿瘤细胞胞吐；
(2)收集步骤(1)所述肿瘤细胞胞吐的肿瘤细胞纳米金囊泡：将步骤(1)中孵育后的肿瘤细胞以800rpm-3000rpm的转速离心5min-10min，保留上清液；将所述上清液以8000rpm-13000rpm的转速离心30min-90min，弃上清后将沉淀用缓冲液清洗重悬，即得到肿瘤细胞纳米金囊泡。
2.如权利要求1所述的肿瘤细胞纳米金囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(1)中将含有三价金离子的溶液加入肿瘤细胞后，所述三价金离子的浓度为0.5mM-1mM；步骤(1)所述肿瘤细胞的个数为0.3×107-1×107。
3.如权利要求2所述的肿瘤细胞纳米金囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述含有三价金离子的溶液为氯金酸溶液、氯金酸水合物溶液或氯化金溶液。
4.一种肿瘤细胞免疫纳米金囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求1得到的肿瘤细胞纳米金囊泡加入到在不添加血清的培养液中培养的免疫细胞中，孵育6h-8h后，将所述免疫细胞的培养液重新更换为不添加血清的培养液，继续孵育24h-48h，刺激所述免疫细胞胞吐；
(2)收集步骤(1)所述免疫细胞胞吐的肿瘤细胞免疫纳米金囊泡：将步骤(1)中孵育后的免疫细胞以800rpm-3000rpm的转速离心5min-10min，保留上清液；将所述上清液以10000rpm-20000rpm的转速离心30min-90min，弃上清后将沉淀用缓冲液清洗重悬，即得到肿瘤细胞免疫纳米金囊泡。
5.如权利要求4所述的肿瘤细胞免疫纳米金囊泡的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的肿瘤细胞纳米金囊泡的质量为20μg-50μg，步骤(1)所述的免疫细胞的个数为2×106-7×106；步骤(1)所述的免疫细胞为树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞或淋巴细胞。
6.如权利要求5所述的肿瘤细胞免疫纳米金囊泡的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，将免疫细胞培养液重新更换为不添加血清的培养液之后，还包括用紫外光照射所述免疫细胞0.5h-2h。
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