CN111909900A - 一种基于原位自组装智能纳米颗粒增强免疫应答的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于原位自组装智能纳米颗粒增强免疫应答的方法，具体是将金属离子前驱体溶液与病变细胞共同孵育8‑24小时，原位自组装合成金属纳米颗粒。然后利用差速离心的方法分离、提取出含有该纳米颗粒的外膜囊泡。将其与免疫细胞共培养，实现增强免疫应答的效果。将前驱体溶液从荷瘤小鼠或肺炎感染小鼠的尾静脉或病灶部位原位注射。同时设置对照组。结果显示，相比于对照组，实验组的中性粒细胞等免疫细胞明显升高。本发明原位生物自组装合成的金属纳米颗粒赋予了亲本细胞的生物信息，避免了免疫耐受性的产生，该方法简便易行，为其病变细胞如癌细胞或高致病性微生物导致相关疾病的有效抑制提供了坚实的技术支撑。

Description

一种基于原位自组装智能纳米颗粒增强免疫应答的方法
技术领域
本发明涉及生物材料领域，特别涉及一种基于原位自组装智能纳米颗粒增强免疫应答的方法。
背景技术
近年来造成人类感染的病原微生物日益复杂，高致病性禽流感、病毒性肺炎或癌症等突发疾病不断涌现，越来越多的新型病原体被发现，给临床诊断和治疗带来了极大的困扰。因此，安全而有效的抑菌方法是防控多种疾病的重要工具。目前，致病菌感染的治疗主要使用抗生素，然而，由于抗生素不合理的使用甚至乱用，使得大量的致病微生物对抗生素产生了耐药性，对人类健康和社会经济发展产生了巨大的威胁。虽然科研工作者现在不断开发新的抗生素，但是开发新药的过程通常无法匹敌耐药菌株的产生速度。避免抗生素耐药性产生和非精准靶向对人类健康带来的危害，开发新的治疗模式已成为人类维护健康的一个紧迫话题。
免疫系统在机体执行免疫应答和发挥免疫功能中起重要作用，近年来提出的免疫疗法具有治疗和预防感染性疾病的巨大潜力。纳米材料由于其独特的物理化学性质,如尺寸、结构、表面特性等，能够规避免疫耐受性，因此将纳米材料应用于免疫治疗中具有巨大潜力。然而，纳米材料多采用化学法合成，除了所需化学试剂会产生生物毒性外，其所需合成条件往往较为苛刻，比如需要保持高温、较窄的酸碱范围、复杂的编程等。近年来，金属纳米材料的胞内合成备受关注，是一种绿色简便的生物合成方法。由于细胞环境的影响，纳米颗粒可以被赋予亲本细胞的生物信息。本发明依托病变细胞如癌细胞或致病微生物原位自组装合成基于金属单质或金属合金的纳米颗粒，同时搭载相关细胞分泌的外膜囊泡，从而增强机体免疫应答的能力，为病变细胞如癌细胞或致病微生物的有效抑制提供了重要的技术支撑。
发明内容
发明目的：针对现有抗癌或抗菌技术存在的缺陷，本发明的目的是提供一种基于原位自组装智能纳米颗粒增强免疫应答的方法。依托病变细胞如癌细胞或致病菌特异微环境自组装合成金属纳米颗粒，以便实现免疫应答的增强，具有特异性高及简便易行等优点。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于原位自组装智能纳米颗粒增强免疫应答的方法。具体步骤如下：
步骤一、将病变细胞如癌细胞或处于对数期的致病菌细胞与金属可溶性盐相混合，得到混合液，置于培养箱中进行孵育；
步骤二、孵育一段时间后，将上述培养液进行差速离心，分离纯化得到含有金属纳米颗粒的外膜囊泡；
步骤三、将提取的外膜囊泡与相关免疫细胞在细胞培养液中进行孵育12-48小时；
步骤四、将共培养后的T细胞等免疫细胞离心洗涤，上流式细胞仪进行分析。
其中，
所述的金属可溶性盐为氯金酸、葡萄糖酸锌、硝酸银、氯化亚铁中的一种或任意几种组合。金属可溶性盐为具有生物相容性的金属元素对应的可溶性盐。
所述步骤一中混合液置于恒温摇床继续孵育的时间为8h-24h。时间为：8h、10h、12h、18h、20h、22h、24h等，但不仅限于所列举的数值。
所述步骤一中金属可溶性盐与病变细胞如癌细胞或致病菌混合，其中金属可溶性盐的终浓度为10μmol/L—100μmol/L。浓度为：10μmol/L、30μmol/L50μmol/L、80μmol/L、100μmol/L等，但不仅限于所列举的数值。
本发明还公开了一种智能金属纳米颗粒，所述智能金属纳米颗粒的制备方法为：将病变细胞如癌细胞或处于对数期的致病菌细胞与金属可溶性盐相混合，得到混合液，置于恒温摇床进行孵育，在细胞中自发地还原生成智能金属纳米颗粒。
本发明还公开了一种智能金属纳米颗粒的用途，所述智能金属纳米颗粒用于增强免疫应答。
有益效果：与现有技术方法相比，本发明具有以下优点和效果：
本发明公开了一种基于原位自组装智能纳米颗粒增强免疫应答的方法。通过将具有生物相容性的金属元素对应的可溶性盐与病变细胞如癌细胞或致病菌细胞共孵育，在细胞中自发地还原生成智能金属纳米颗粒，使得该纳米材料被赋予了亲本细胞的生物信息，避免了病变细胞如癌细胞或病原微生物的免疫耐受性，同时搭载致病细胞分泌的外膜囊泡，为机体免疫应答的增强提供了新的方法。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明具体实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂、仪器均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
本发明公开了一种基于原位自组装智能纳米颗粒增强免疫应答的方法，具体是将金属离子前驱体溶液中的一种或几种与病变细胞如癌细胞或致病微生物等细胞共同孵育8-24小时，原位自组装合成金属纳米颗粒。然后利用差速离心的方法分离、提取出含有该纳米颗粒的外膜囊泡。进一步地，将其与T细胞或中性粒细胞等免疫细胞共培养，实现增强免疫应答的效果。在此基础上，将一定浓度的(如10mmol/L)锌离子前驱体溶液和一定浓度的(如10mmol/L)亚铁离子/或金离子等前驱体溶液从荷瘤小鼠或肺炎感染小鼠的尾静脉或病灶部位原位注射。同时设置对照组。采用小动物活体成像仪，将上述实验小鼠进行实时多模态(荧光、MRI、CT、超声与光声等)原位成像观察，同时，利用射频或超声或近红外光照射，记录病灶的变化和消融情况。进一步地，将病灶部位组织中的巨噬细胞、中性粒细胞与T细胞等免疫细胞进行分离，利用流式细胞仪检测中性粒细胞等的阳性表达率，检测巨噬细胞M2向M1转化情况。结果显示，相比于对照组，实验组的中性粒细胞等免疫细胞明显升高。本发明原位生物自组装合成的金属纳米颗粒赋予了亲本细胞的生物信息，避免了免疫耐受性的产生，该方法简便易行，为其病变细胞如癌细胞或高致病性微生物导致相关疾病的有效抑制提供了坚实的技术支撑。
一种智能金属纳米颗粒，所述智能金属纳米颗粒的制备方法为：将病变细胞如癌细胞或处于对数期的致病菌细胞与金属可溶性盐相混合，得到混合液，置于恒温摇床进行孵育，在细胞中自发地还原生成智能金属纳米颗粒。
一种智能金属纳米颗粒的用途，所述智能金属纳米颗粒用于增强免疫应答。
实施例1
一种基于原位自组装智能纳米颗粒增强免疫应答的方法，具体步骤如下：
用无菌水配置的硝酸银溶液作为本实施例的银离子前驱体溶液，将病变细胞如癌细胞或大肠杆菌与一定浓度的(如100μmol/L)银离子前驱体溶液相混合。同时设置对照组。将上述混合液充分混合后置于37℃培养箱中继续培养。孵育12h后，将混合液进行差速离心，分离提取出细胞分泌的外膜囊泡。进一步地，将分离得到的外膜囊泡与T细胞等免疫细胞在细胞培养箱中继续共孵育24h后，利用流式细胞仪检测T细胞等免疫细胞的阳性表达率。结果显示，相比于对照组，实验组的T细胞等明显升高。
其中，对照组未添加银离子前驱体溶液。
实施例2
一种基于原位自组装智能纳米颗粒增强免疫应答的方法，具体步骤如下：
用无菌水配置的氯金酸溶液作为本实施例的金离子前驱体溶液，将病变细胞如癌细胞或大肠杆菌与一定浓度的(如100μmol/L)金离子前驱体溶液相混合。同时设置对照组。将上述混合液充分混合后置于37℃恒温摇床继续培养。孵育12h后，将混合液进行差速离心，分离提取出细胞分泌的外膜囊泡。进一步地，将分离得到的外膜囊泡与T细胞等免疫细胞在细胞培养箱中继续共孵育24h后，利用流式细胞仪检测相关免疫细胞的阳性表达率。结果显示，相比于对照组，实验组的T细胞等明显升高。
其中，对照组未添加金离子前驱体溶液。
实施例3
一种基于原位自组装智能纳米颗粒增强免疫应答的方法，具体步骤如下：
用无菌水配置的葡萄糖酸锌溶液作为本实施例的锌离子前驱体溶液，将病变细胞如癌细胞或大肠杆菌与一定浓度的(如100μmol/L)锌离子前驱体溶液相混合。同时设置对照组。将上述混合液充分混合后置于37℃恒温摇床继续培养。孵育12h后，将混合液进行差速离心，分离提取出细胞分泌的外膜囊泡。进一步地，将分离得到的外膜囊泡与T细胞等免疫细胞在细胞培养箱中继续共孵育24h后，利用流式细胞仪检测T细胞等免疫细胞的阳性表达率。结果显示，相比于对照组，实验组的T细胞等明显升高。
其中，对照组未添加锌离子前驱体溶液。
实施例4
一种基于原位自组装智能纳米颗粒增强免疫应答的方法，具体步骤如下：
用无菌水配置的氯化亚铁溶液作为本实施例的亚铁离子前驱体溶液，将病变细胞如癌细胞或大肠杆菌与一定浓度的(如100μmol/L)亚铁离子前驱体溶液相混合。同时设置对照组。将上述混合液充分混合后置于培养箱中继续培养。孵育12h后，将混合液进行差速离心，分离提取出细胞分泌的外膜囊泡。进一步地，将分离得到的外膜囊泡与T细胞等免疫细胞在细胞培养箱中继续共孵育24h后，利用流式细胞仪检测T细胞等免疫细胞的阳性表达率。结果显示，相比于对照组，实验组的T细胞等免疫细胞明显升高。
其中，对照组未添加亚铁离子前驱体溶液。
实施例5
一种基于原位自组装智能纳米颗粒增强免疫应答的方法，具体步骤如下：
用无菌水配置的氯金酸溶液和硝酸银溶液分别作为本实施例的金离子前驱体溶液和银离子前驱体溶液，将病变细胞如癌细胞或大肠杆菌与一定浓度的(如10μmol/L)金离子前驱体溶液和一定浓度的(如10μmol/L)银离子前驱体溶液相混合。同时设置对照组。将上述混合液充分混合后置于培养箱中继续培养。孵育12h后，将混合液进行差速离心，分离提取出细胞分泌的外膜囊泡。进一步地，将分离得到的外膜囊泡与T细胞等免疫细胞在细胞培养箱中继续共孵育24h后，利用流式细胞仪检测T细胞等的阳性表达率。结果显示，相比于对照组，实验组的T细胞等免疫细胞明显升高。
其中，对照组未添加金离子前驱体溶液和银离子前驱体溶液。
实施例6
一种基于原位自组装智能纳米颗粒增强免疫应答的方法，具体步骤如下：
用无菌水配置的氯金酸溶液和氯化亚铁溶液分别作为本实施例的金离子前驱体溶液和亚铁离子前驱体溶液，将病变细胞如癌细胞或大肠杆菌与一定浓度的(如10μmol/L)金离子前驱体溶液和一定浓度的(如10μmol/L)亚铁离子前驱体溶液相混合。同时设置对照组。将上述混合液充分混合后置于培养箱中继续培养。孵育12h后，将混合液进行差速离心，分离提取出细胞分泌的外膜囊泡。进一步地，将分离得到的外膜囊泡与T细胞等免疫细胞在细胞培养箱中继续共孵育24h后，利用流式细胞仪检测T细胞等的阳性表达率。结果显示，相比于对照组，实验组的T细胞等免疫细胞明显升高。
其中，对照组未添加金离子前驱体溶液和亚铁离子前驱体溶液。
实施例7
一种基于原位自组装智能纳米颗粒增强免疫应答的方法，具体步骤如下：
用无菌水配置的氯化亚铁溶液和硝酸银溶液分别作为本实施例的亚铁离子前驱体溶液和银离子前驱体溶液，将病变细胞如癌细胞或大肠杆菌与一定浓度的(如10μmol/L)亚铁离子前驱体溶液和一定浓度的(如10μmol/L)银离子前驱体溶液相混合。同时设置对照组。将上述混合液充分混合后置于培养箱中继续培养。孵育12h后，将混合液进行差速离心，分离提取出细胞分泌的外膜囊泡。进一步地，将分离得到的外膜囊泡与T细胞等免疫细胞在细胞培养箱中继续共孵育24h后，利用流式细胞仪检测T细胞等的阳性表达率。结果显示，相比于对照组，实验组的T细胞等免疫细胞明显升高。
其中，对照组未添加亚铁离子前驱体溶液和银离子前驱体溶液。
实施例8
一种基于原位自组装智能纳米颗粒增强免疫应答的方法，具体步骤如下：
用无菌水配置的葡萄糖酸锌溶液和氯金酸溶液分别作为本实施例的锌离子前驱体溶液和金离子前驱体溶液，将病变细胞如癌细胞或大肠杆菌与一定浓度的(如10μmol/L)锌离子前驱体溶液和一定浓度的(如10μmol/L)金离子前驱体溶液相混合。同时设置对照组。将上述混合液充分混合后置于培养箱中继续培养。孵育12h后，将混合液进行差速离心，分离提取出细胞分泌的外膜囊泡。进一步地，将分离得到的外膜囊泡与T细胞等免疫细胞在细胞培养箱中继续共孵育24h后，利用流式细胞仪检测T细胞等的阳性表达率。结果显示，相比于对照组，实验组的T细胞等免疫细胞明显升高。
其中，对照组未添加锌离子前驱体溶液和金离子前驱体溶液。
实施例9
一种基于原位自组装智能纳米颗粒增强免疫应答的方法，具体步骤如下：
用无菌水配置的葡萄糖酸锌溶液/和氯化亚铁溶液/或氯金酸溶液分别作为本实施例的锌离子前驱体溶液和亚铁离子或金离子前驱体溶液，将一定浓度的(如10mmmol/L)锌离子前驱体溶液和一定浓度的(如10mmol/L)亚铁离子或金离子前驱体溶液从荷瘤小鼠或肺炎感染小鼠的尾静脉或病灶部位原位注射。同时设置对照组。采用小动物活体成像仪，将上述实验小鼠进行实时多模态(荧光、MRI、CT、超声与光声等)原位成像观察，同时，利用射频或超声或近红外光照射，记录病灶的变化和消融情况。进一步地，将病灶部位组织中的巨噬细胞、中性粒细胞与T细胞等免疫细胞进行分离，利用流式细胞仪检测中性粒细胞等的阳性表达率，检测巨噬细胞M2向M1转化情况。结果显示，相比于对照组，实验组的中性粒细胞等免疫细胞明显升高。
其中，对照组未添加锌离子前驱体溶液/和亚铁离子/或金离子前驱体溶液。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，对本发明的各种修改和润饰均落于本申请所附权利要求所限定的范围内。

Claims (6)

1.一种基于原位自组装智能纳米颗粒增强免疫应答的方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤一、将病变细胞与金属可溶性盐相混合，得到混合液，置于培养箱进行孵育；病变细胞包括癌细胞或处于对数期的致病菌细胞；
步骤二、孵育后，将上述培养液进行差速离心，分离纯化得到含有金属纳米颗粒的外膜囊泡；
步骤三、将提取的外膜囊泡与免疫细胞在细胞培养液中进行孵育12-48小时；免疫细胞包括T细胞或中性粒细胞；
步骤四、将共培养后的免疫细胞离心洗涤，上流式细胞仪进行分析。
2.根据权利要求1所述的一种基于原位自组装智能纳米颗粒增强免疫应答的方法，其特征在于，所述的金属可溶性盐为氯金酸、葡萄糖酸锌、硝酸银、氯化亚铁中的一种或任意几种组合。
3.根据权利要求1所述的一种基于原位自组装智能纳米颗粒增强免疫应答的方法，其特征在于，所述步骤一中混合液置于培养箱继续孵育的时间为8h-24h。
4.根据权利要求1所述的一种基于原位自组装智能纳米颗粒增强免疫应答的方法，其特征在于，金属可溶性盐与病变细胞混合，其中金属可溶性盐的终浓度为10μmol/L—100μmol/L；病变细胞包括癌细胞或致病菌。
5.一种智能金属纳米颗粒，其特征在于，所述智能金属纳米颗粒的制备方法为：将病变细胞与金属可溶性盐相混合，得到混合液，置于恒温摇床进行孵育，在细胞中还原生成智能金属纳米颗粒；病变细胞包括癌细胞或处于对数期的致病菌细胞。
6.一种智能金属纳米颗粒的应用，其特征在于，所述智能金属纳米颗粒用于增强免疫应答。
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