JP5579586B2 - 腫瘍ワクチン - Google Patents
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Description
例1:本発明の腫瘍ワクチンの作用
抗原性が低いことが広く知られている同系移植マウス肝癌(Guo, Y. J., et al., Nat. Med. 3:451-5, 1997)を対象に、腫瘍抗原としての固定腫瘍細胞、GM-CSF、IL-2、及びアジュバントを組み合わせた腫瘍ワクチンが肝癌形成を阻害できるか否かを検討した。
[方法]
1.固定腫瘍細胞
C57BL/6に発症した肝癌細胞Hepa 1-6(理化学研究所細胞開発銀行より入手)を培養し、これをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(以下、「PBS」と略す。)に溶解した3%パラホルムアルデヒド溶液で2時間固定した。固定細胞を70%アルコールで一度洗浄滅菌してから、無菌的にPBSで4回洗浄し、さらに10%のウシ胎児血清を含むダルベッコの最少必須培地(以下、「DMEM」と略す。)を加え、炭酸ガスインキュベーターにて、37℃で2日間インキュベートした。この培地を除去後、細胞層にポリ-L-リジン水溶液(50 μg/ml)を添加し、2時間室温放置した後、PBSで4回洗浄した。この後、細胞をスクレーパーでかきとり、PBSにて1.25×108個/mlに希釈した。固定Hepa 1-6細胞はすべて100ミクロン以下のサイズであり、貪食能力のある抗原提示細胞が貪食可能なサイズである。
マイクロフフェア化すべきサイトカインとしてマウスGM-CSFまたはヒトIL-2(いずれもImmunex社製)を用いた。ヒト血清アルブミン注射液(25%濃度のもの、Albuminar-25, Centeon L.L.C.製, Illinois, USA)を二回蒸留水で5%に希釈し、塩酸にてpH 3.0に合わせた。さらに2.5%に希釈してから、0.22ミクロンの孔径を持つフィルターを通して除菌した。100 μgのGM-CSF、または106国際単位のIL-2を5 ml-遠心管に加え、つぎに注射用ヘパリン溶液(病院用市販品で1000 単位/ml、Elkins-SINN, Inc, NJ, USA)を1 mlいれ、これをボルテックスミキサーで撹拌しつつ、上述の2.5%ヒト血清アルブミン注射液(pH 3.0)を1 ml添加した。30秒以上撹拌を続けた後、形成された微粒子を遠心して回収した。この上澄みから、包埋効率を算定した。
上記1.で調製した固定Hepa 1-6細胞、上記2.で調製したGM-CSFマイクロスフェアとIL-2マイクロスフェア、アジュバントとして市販されているTiterMax Gold(CytRX, Atlanta, Norcross, GA)を混合して腫瘍ワクチンとした。それぞれの量は腫瘍ワクチン0.05 mlにつき、順に1.25×106個、106単位、103国際単位、20μlである。これらの構成製剤の組み合わせを変えた腫瘍ワクチンも作製した。組み合わせは表1、表2、表3にそれぞれ記載した。
表1に示すように、対照群では全てのマウスに肝癌ができ、癌組織の平均容積は270 mm3であった。これに対し、固定Hepa 1-6 細胞、アジュバントであるTiter Max Gold、IL-2マイクロスフェア、GM-CSF マイクロスフェアを含む腫瘍ワクチン処置群では5匹中4匹に全く腫瘍は認められず(表中では、tumor-freeマウスの割合で表現してある)、肝癌が観察された1匹ではわずか18 mm3の小さな腫瘍であった。腫瘍のワクチン療法の効果は明白である。
固定腫瘍細胞を含む固定腫瘍組織を破砕して、微細な固体化腫瘍抗原を調製した。
[方法]
例1において、対照群(A)のマウスに使用したHepa 1-6細胞と同量をマウス大腿部皮下に移植し、3週間後に生成された肝癌組織を摘出し、市販中性ホルマリン液に室温にて3日間浸漬して固定した。この組織を取り出し、眼科バサミにて径1 mm程度の細かいミンスとし、PBSを元の肝癌湿重量の10倍量加え、さらに氷冷しつつホモジェナイザー(ハイドルフ社製DIAX-600、6Gゼネレーターシャフト)にて30秒間ホモジェナイズした。このホモジェナイズは氷冷するために間隔を3分間以上あけながら5回繰り返した。このホモジェネート1.2 mlを1.5-mlエッペンドルフ遠心チューブにとり、エッペンドルフ微量高速遠心機にて15,000 rpm、3分間遠心し、packed volumeを計測した。計測は50 μl以上の水を入れた1.5-mlエッペンドルフ遠心チューブと比較して行った。また、残りのホモジェネートを半径12cmの水平ローターにて2000rpm、10分間遠心し、沈殿を得た。
固定肝癌組織から得たホモジェネート中の組織断片は非常に細かく、上述のメッシュ通過後は、通常の22G規格以下の細い注射針を易々と通過できる微細さであった。回収細胞数は不明だが、回収packed volumeは目測にして明らかにHepa 1-6生細胞107個相当を越えており、上述のメッシュ通過前後のpacked volumeで計測した回収率は78%であった。このホモジェネートは固体化された腫瘍細胞断片を含み、腫瘍ワクチンとしての必要量は十分あるため、微粒子化腫瘍抗原として用いることが可能である。
固定腫瘍細胞を標的としてCTLを誘導した場合の腫瘍細胞殺傷活性と特異性を検討した。
[方法]
1.固定腫瘍細胞
C57BL/6マウスに発症したメラノーマ細胞B16の亜株B16-F10(American Type Culture Collection (Bethesda, MA, USA)から入手)108ないし109個を10%ホルマリン液に漬け、4℃にて2ないし4週間固定した。これを70%エタノール30 mlで懸濁遠心洗浄後、さらにPBSにて3回懸濁遠心洗浄した。これを適量の10%ウシ胎児血清を含む細胞培養用MEM培地に懸濁し、37℃にて2〜3日加温するか、または60℃にて4時間加温した。さらにこれを遠心回収し(以下、この処理を行った細胞を「固定B16-F10細胞」という)、5×108個/mlとなるように懸濁した。
何も感作していないC57BL/6マウスの脾臓から、当業者に周知の方法により組織を軽く潰して脾臓細胞を得た。この大部分はリンパ球である。この4×107個を取り、2×106個の固定B16-F10細胞とともに、10%ウシ胎児血清を含むRPMI-1640培地にヒトIL-1β(167単位/ml), ヒトIL-2 (67国際単位/ml), ヒトIL-6 (134単位/ml)(いずれもImmunex社製のもの)を添加した培養液で10日間培養し増殖させた。この培養液を培養開始後3日目及び5日目に全交換し、以後は2日置きに半分交換した。こうして増殖したリンパ球をCTLとした。
図1にin vitro感作によって誘導したCTLの活性を示した。縦軸の % LysisはCTLによる標的細胞の殺傷活性を表している。また、横軸のE/T ratioは、4時間Cr-51遊離法による殺傷活性測定時のCTL数と標的細胞数の比である。B16-F10細胞を標的とした場合(□)はE/T ratioが10で約20%を殺傷した。この活性は、同じC57BL/6マウス由来である他の2種類の腫瘍細胞を標的とした場合よりも、明らかに高かった。この結果は、固定B16-F10細胞に対して誘導されたCTLは、同じC57BL/6マウス由来でありながら、他の2種類の腫瘍細胞よりも特異的に生きているB16-F10細胞を認識して殺す能力があることを示唆している。
病理切片を材料にする場合には、例2で示した方法で微粒子化すると収量が悪く、腫瘍ワクチンの作製が困難になる場合がある。そのような場合には、以下のようにして固定腫瘍細胞を消化酵素で溶解し、これをマイクロスフェア製剤とし、サイトカインのマイクロスフェア製剤と組み合わせて腫瘍ワクチンを製造することができる。
[方法]
1.溶解固定腫瘍マイクロスフェアの作製法と腫瘍ワクチン製剤の作製法
固定B16-F10細胞を5×108個/mlとなるようにPBSに懸濁した。これにpronase K(Sigma社)を1 mg/mlとなるように添加し、56℃にて一夜加温した。3000 rpm, 10分間の遠心にて沈殿を除去し、上清を溶解B16-F10抗原とした。この上清に例1で用いたヒト血清アルブミン注射液を添加し、最終アルブミン濃度が2.5%となるように調製した。これ以下の操作は例1のGM-CSFマイクロスフェアの作製手順と同じとし、溶解固定腫瘍マイクロスフェアを作製した。最終的には80μlの生理食塩水に懸濁されたマイクロスフェアに含まれる腫瘍抗原量が107個の腫瘍細胞数に相当するように希釈した。これに、例1と同じ方法で調製したGM-CSFマイクロスフェア20μlを混合し、腫瘍ワクチン製剤とした。
B16-F10細胞とは同系(syngeneic)の関係にある6-8週齢のC57BL/6雄マウス(1群10匹)をエーテル麻酔し、26G注射針を使って腫瘍ワクチン製剤をマウスの大腿部の皮内に1匹あたり100μlを注射した。対照群にはPBSを同量注射した。腫瘍ワクチン投与を繰り返す場合は、隔週に同量の投与を繰り返した。初回の腫瘍ワクチン投与2週間後、腹部皮下に懸濁した培養B16-F10生細胞105個を注射した。抗腫瘍効果は残存tumor-freeマウスの%で算出した。
図2にはin vivo感作実験の結果を示した。対照群に比べて、腫瘍ワクチン製剤投与群の残存tumor-freeマウスは明らかに高い%を示した。特に、この腫瘍ワクチン製剤を3回投与した群では、観察期間が90日を越えてもなお半数のマウスがtumor-freeの状態を保っていた。この結果は、in vivoでも腫瘍ワクチン製剤投与によってB16-F10細胞に対するCTLが誘導され、そのため後から注射した生きているB16-F10細胞が殺傷され、半数のマウスで生着しなかったことを示唆している。また、この結果は、腫瘍の摘出手術後、その腫瘍細胞を用いて腫瘍ワクチン製剤を製造すれば、腫瘍の再発を防止できる腫瘍ワクチン療法が成立し得ることを示唆している。
例4で腫瘍ワクチンを投与した動物に、実際にin vivoでCTLが誘導されていることをin vitroで検証した。
[方法]
例4と同じ方法で腫瘍ワクチン製剤を投与したC57BL/6雄マウス、対照群のマウス、及び別種の対照群として、例4における腫瘍ワクチン製剤1回投与群の代わりに、X-線50Gyをあらかじめ照射した生きているB16-F10細胞107個とGM-CSFマイクロスフェア20μlを混合して対照腫瘍ワクチン製剤として投与した群のマウスを使用した。これらから脾臓と鼠径リンパ節を取り出し、組織を軽く潰してリンパ球を得た。これらのリンパ球を10%ウシ胎児血清を含むRPMI-1640培地にヒトIL-1β(167単位/ml), ヒトIL-2 (67国際単位/ml), ヒトIL-6 (134単位/ml)(いずれもImmunex社製のもの)を添加した培養液で7日間培養し増殖させた。この実験系は、培養期間中に固定B16-F10細胞による刺激を一切加えていない点で例3の系と異なっている。これによって、培養期間中にCTLが誘導される可能性はなく、体内で誘導されたCTL数に比例した数のCTLがin vitroで増殖すると期待できる。培養リンパ球の細胞殺傷活性は、放射線照射をしていない生きているB16-F10細胞を標的にして、標準的な測定法として広く知られている4時間Cr-51遊離法により測定した。
培養リンパ球と標的腫瘍細胞の比(E/T ratio)を変えて細胞殺傷活性を検討した。図3にその結果を示す。例4と同じ方法で腫瘍ワクチン製剤をin vivo投与したマウス由来のリンパ球による処理群では、殺傷された標的のB16-F10細胞の割合が明らかに高い。このリンパ球の腫瘍細胞殺傷活性は、CTLを誘導できることが明らかにされている既存の方法である別種の対照群(対照腫瘍ワクチン製剤を投与したマウス)由来のリンパ球の細胞殺傷活性とほぼ同等であった。この結果はマウス体内でB16-F10細胞に対するCTLが誘導されていることを示唆している。また、この結果から、CTLには高い腫瘍細胞殺傷能力があるが故に、一旦CTLが誘導されれば、in vivoでも既存の腫瘍細胞を殺せると推定され、腫瘍の転移防止、腫瘍の治癒が期待できる。
本発明により誘導され得るCTLが、抗原とした腫瘍B16-F10細胞一種に限定されるものではないことを確認した。
[方法]
HA-A20細胞はBalb/cマウス由来のBリンパ腫細胞株である。この細胞を遺伝子操作により改変したGM-CSF-HA-A20細胞は、influenza-hemagglutininとマウスGM-CSFの二つの遺伝子の発現ベクターを導入した安定細胞株で、古典的なGM-CSF産生性生細胞型腫瘍ワクチンとして研究材料になっている (Levitsky,H.I., et al., J. Immunol., 156, pp.3858-3865, 1996)。B16-F10細胞の代わりに野生型HA-A20細胞を用い、例4と同様な方法で、GM-CSFマイクロスフェア20μlを混合した腫瘍ワクチン製剤を作製し、Balb/cマウスの感作に使用した。このとき、対照群としてPBS投与群、X-線50Gyをあらかじめ照射した生きているHA-A20細胞107個投与群、GM-CSFマイクロスフェアを混合していない腫瘍ワクチン製剤投与群、ならびにX-線50Gyをあらかじめ照射した生きているGM-CSF-HA-A20細胞107個投与群を作製した。
図4に示すように、対照群のうち、PBS投与群、(X-線50Gyをあらかじめ照射した生きている)HA-A20細胞投与群、GM-CSFマイクロスフェアを混合していない腫瘍ワクチン製剤投与群では細胞殺傷活性がほとんど認められなかった。一方、GM-CSFマイクロスフェア20μlを混合した腫瘍ワクチン製剤投与群では明らかな標的の野生型HA-A20細胞殺傷活性があり、この強さは古典的なGM-CSF産生性生細胞型腫瘍ワクチンとして知られる(X-線50Gyをあらかじめ照射した生きている)GM-CSF-HA-A20細胞投与群とほぼ同様であった。しかも、E/T ratioを64として、マウスCD8に対するモノクローナル抗体を添加した場合、図5に示すように、細胞殺傷活性は明らかに阻害された。これは細胞殺傷活性がCD8陽性リンパ球、すなわち典型的CTLが含まれるリンパ球群によるものが大部分であることを示唆している。
[方法]
例2において作製した微粒子化腫瘍抗原でパックトボリュームにして 10μl分を、例1において用いた固定腫瘍細胞 1.25×106 個の代わりに用いて、例1の表1の実験と同様の実験を行い、in vivo抗腫瘍効果を測定した。ただし、培養 Hepa 1-6生細胞をチャレンジする時は、例1では直接肝臓内に107個を注射したが、本実施例では左後肢皮下に2×107 個を注射し、腫瘍組織の成長速度を体外から計測した。しかも腫瘍のサイズの表し方は、当該研究分野の慣例に従って、容積ではなく皮下腫瘍の面積で表した。また同時に、同じ実験の中の1群として、アジュバントとして Titer Max Gold 20μlではなく、市販のツベルクリン(日本ビーシージー製造株式会社)20μlを代わりに用いた群を作製した。
表4に示すように、対照群は3週間でHepa 1-6生細胞をチャレンジした6匹すべてのマウスに腫瘍を形成した。しかし、処置群のうち、例1の表1の(B)群に対応する、固定腫瘍細胞の代わりに微粒子化腫瘍抗原を用いた群では、6匹中3匹のマウスに腫瘍を形成しただけであり、3匹(50%)で抗腫瘍効果が観察された。また、この微粒子化腫瘍抗原群でアジュバントをツベルクリンとした群では6匹中わずかに1匹のマウスに腫瘍を形成しただけであり、抗腫瘍効果は83%に高まった。
Claims (1)
- 3%パラホルムアルデヒド溶液又は10%ホルマリン液により固体化された腫瘍組織及び腫瘍細胞からなる群から選ばれる腫瘍材料から調製された微粒子とアジュバント(該アジュバントはポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン・ブロックコポリマー又はBCGの細菌製剤である)とを含む腫瘍ワクチン。
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