CN108114274B - 一种基于肿瘤细胞为模板的肿瘤疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于肿瘤细胞为模板的肿瘤疫苗及其制备方法,制备步骤:(1)收集处于对数生长期的肿瘤细胞,洗涤,用生理盐水调整浓度为2×105个/ml‑2×107个/ml的肿瘤细胞混悬液;以下各步骤在4℃以下进行;(2)向肿瘤细胞混悬液中加入EGCG水溶液和AlCl3水溶液,涡旋,离心,洗涤,得到Cell@EGCG/Al1,加入生理盐水;(3)重复步骤(2)n次得到Cell@EGCG/Al(n+1);(4)离心去上清,将Cell@EGCG/Al(n+1)用高纯水孵育使细胞灭活,离心,得到肿瘤疫苗;本发明保证了肿瘤细胞裂解物的活性及疫苗的使用安全性;原料廉价易得,制备工艺简单易行。抗原负载量高。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于肿瘤细胞为模板的肿瘤疫苗及其制备方法,属于生物医学、肿瘤免疫治疗、疫苗递送领域。
背景技术
肿瘤疫苗(tumor vaccine)即是利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应,以调节机体免疫功能,达到治疗肿瘤的目的。根据制备方法不同,目前肿瘤疫苗主要分为以下几种:肿瘤细胞疫苗、肿瘤抗原疫苗、抗独特型抗体疫苗、肿瘤核酸疫苗(DNA疫苗或RNA疫苗)、肿瘤基因工程疫苗。其中,肿瘤细胞疫苗是以自身肿瘤组织经过研磨、照射、药物灭活等方法处理后制成的肿瘤疫苗。单个细胞包埋技术已在其他领域得到广泛的应用,包括生物传感、组织工程及基因工程等领域,但是将其用于肿瘤疫苗的制备还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种基于肿瘤细胞为模板的肿瘤疫苗。
本发明的第二个目的是提供一种基于肿瘤细胞为模板的肿瘤疫苗的制备方法。
本发明的技术方案概述如下:
基于肿瘤细胞为模板的肿瘤疫苗的制备方法,包括如下步骤:
(1)收集处于对数生长期的肿瘤细胞,并用生理盐水洗涤以去除细胞培养基中血清,用生理盐水将细胞浓度调整为2×105个/ml-2×107个/ml的肿瘤细胞混悬液;以下各步骤在4℃以下进行;
(2)按比例,向9mL肿瘤细胞混悬液中加入0.5ml,10-30mg/ml的EGCG水溶液和0.5ml,2-8mg/ml的AlCl3水溶液,涡旋30-90s,离心,用生理盐水洗涤去除溶液中多余的EGCG和AlCl3,得到EGCG/Al包埋的肿瘤细胞Cell@EGCG/Al1,再加入生理盐水至9mL;
(3)重复步骤(2)n次得到Cell@EGCG/Al(n+1);
(4)离心去上清,将Cell@EGCG/Al(n+1)用高纯水孵育使细胞灭活,离心,得到肿瘤疫苗,即包埋有肿瘤细胞裂解物的微囊TCL@EGCG/Al(n+1);
所述n=0-2;
所述EGCG是表没食子儿茶素没食子酸酯的缩写。
肿瘤细胞为小鼠黑色素瘤细胞B16或人急性白血病细胞HL-60,也可以是其它肿瘤细胞。
步骤(4)优选为:离心去上清,将Cell@EGCG/Al(n+1)用5-20ml高纯水孵育15-30min使细胞灭活,离心,得到肿瘤疫苗,即包埋有肿瘤细胞裂解物的微囊TCL@EGCG/Al(n+1)
上述方法制备的基于肿瘤细胞为模板的肿瘤疫苗。
本发明的优点:
本发明制备过程在4℃及以下的水相下进行,条件温和,所采用的材料仅有EGCG和Al元素,EGCG即表没食子儿茶素没食子酸酯的缩写,是绿茶茶多酚的主要成分,具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗动脉硬化、抗血栓形成、抗血管增生、抗炎以及抗肿瘤作用,Al元素是商售铝佐剂的主要组成之一,上述制备条件保证了肿瘤细胞裂解物的活性及疫苗的使用安全性;原料廉价易得,制备工艺简单易行。采用二喹啉甲酸(BCA)法测量蛋白负载量,结果显示抗原负载量有TCL@EGCG/Al3(886±12ug mg-1vaccine),TCL@EGCG/Al2(695±21ugmg-1vaccine),TCL@EGCG/Al1(610±61ug mg-1vaccine)。
附图说明
图1为实施例1制备的肿瘤疫苗的扫描电子显微镜照片。
图2为实施例2制备的肿瘤疫苗的扫描电子显微镜照片。
图3为实施例3制备的肿瘤疫苗的扫描电子显微镜照片。
图4为实施例4制备的肿瘤疫苗的扫描电子显微镜照片。
图5为用绿色荧光染料对B16细胞进行染色,之后按照实施例3的方法制备得到的疫苗被小鼠树突状细胞系(DC2.4)的吞噬情况。
图6为实施例1、实施例2和实施例3所制得的疫苗刺激BMDC分泌细胞因子的水平。
图7为实施例1、实施例2和实施例3所制得的疫苗在C57BL6小鼠中淋巴结迁移情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
小鼠黑色素瘤细胞B16购于中国医学科学院基础医学研究所,以下简称B16;
人急性白血病细胞HL-60购于中国医学科学院基础医学研究所,以下简称HL-60细胞;
小鼠树突状细胞DC2.4购于中国医学科学院基础医学研究所。
C57BL6小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
实施例1
基于肿瘤细胞(B16)为模板的肿瘤疫苗的制备方法,包括如下步骤:
(1)收集处于对数生长期的肿瘤细胞B16,并用生理盐水洗涤2次以去除细胞培养基中血清,用生理盐水将细胞浓度调整为2×105个/ml的肿瘤细胞混悬液;以下各步骤在4℃进行;
(2)向9mL肿瘤细胞混悬液中加入0.5ml,10mg/ml的EGCG水溶液和0.5ml,2mg/ml的AlCl3水溶液,涡旋30s,在转速200g离心5min,用生理盐水洗涤2次去除溶液中多余的EGCG和AlCl3,得到EGCG/Al包埋的肿瘤细胞B16@EGCG/Al1;
(3)将B16@EGCG/Al1放置于5ml高纯水中孵育15min使细胞灭活,离心,这个过程重复2次,充分灭活肿瘤细胞,最终得到肿瘤疫苗,即包埋有肿瘤细胞裂解物的微囊(TCL@EGCG/Al1),见图1。
在4℃及以下温度进行是为了阻断能量相关的细胞内吞路径。
实施例2
基于肿瘤细胞(B16)为模板的肿瘤疫苗的制备方法,包括如下步骤:
(1)收集处于对数生长期的肿瘤细胞B16,并用生理盐水洗涤2次以去除细胞培养基中血清,用生理盐水将细胞浓度调整为2×107个/ml的肿瘤细胞混悬液;以下各步骤在4℃进行;
(2)向9mL肿瘤细胞混悬液中加入0.5ml,30mg/ml的EGCG水溶液和0.5ml,8mg/ml的AlCl3水溶液,涡旋90s,在转速200g离心5min,用生理盐水洗涤2次去除溶液中多余的EGCG和AlCl3,得到EGCG/Al包埋的肿瘤细胞B16@EGCG/Al1;
(3)重复步骤(2)1次得到B16@EGCG/Al2;
(4)离心去上清,将B16@EGCG/Al2放置于20ml高纯水中孵育30min使细胞灭活,离心,这个过程重复2次,充分灭活肿瘤细胞,最终得到肿瘤疫苗,即包埋有肿瘤细胞裂解物的微囊TCL@EGCG/Al2;见图2。
实施例3
基于肿瘤细胞(B16)为模板的肿瘤疫苗的制备方法,包括如下步骤:
(1)收集处于对数生长期的肿瘤细胞B16,并用生理盐水洗涤3次以去除细胞培养基中血清,用生理盐水将细胞浓度调整为2×106个/ml的肿瘤细胞混悬液;以下各步骤在4℃进行;
(2)向9mL肿瘤细胞混悬液中加入0.5ml,20mg/ml的EGCG水溶液和0.5ml,5mg/ml的AlCl3水溶液,涡旋60s,在转速200g离心5min,用生理盐水洗涤2次去除溶液中多余的EGCG和AlCl3,得到EGCG/Al包埋的肿瘤细胞B16@EGCG/Al1;
(3)重复步骤(2)2次得到B16@EGCG/Al3;
(4)离心去上清,将B16@EGCG/Al3放置于10ml高纯水中孵育20min使细胞灭活,离心,这个过程重复3次,充分灭活肿瘤细胞,最终得到肿瘤疫苗,即包埋有肿瘤细胞裂解物的微囊TCL@EGCG/Al3;见图3。
采用二喹啉甲酸(BCA)法测量蛋白负载量,结果显示蛋白负载量有TCL@EGCG/Al3(886±12ug mg-1vaccine),TCL@EGCG/Al2(695±21ug mg-1vaccine),TCL@EGCG/Al1(610±61ug mg-1vaccine)。
采用异硫氰酸荧光素(FITC)对活的B16细胞进行染色,之后完全按照实施例3的方法制备染色肿瘤疫苗,将染色肿瘤疫苗与小鼠树突状细胞DC2.4共培养6小时,之后固定细胞并采用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核进行染色,然后采用激光共聚焦显微镜观察DC2.4细胞对疫苗的吞噬情况,如图5所示,一个DC2.4细胞吞噬了3个肿瘤疫苗,表明DC2.4能很好的吞噬疫苗,DC细胞是体内功能最强大的抗原提呈细胞,图5表明此肿瘤疫苗能被抗原提呈细胞所吞噬。
采用6-8周大的C57BL6小鼠,取股骨和胫骨,并提取骨髓树突状细胞(BMDC),采用实施例1、实施例2和实施例3制备得到的疫苗与此BMDC共孵育48小时,之后检测细胞培养上清中细胞因子水平,结果如图6所示,其中Control为PBS溶液,属于阴性对照,脂多糖LPS属于阳性对照,TCL是肿瘤细胞裂解液,其制备过程为收集处于对数生长期的肿瘤细胞,并用生理盐水洗涤以去除细胞培养基中血清,将细胞放置于10ml高纯水中孵育20min使细胞灭活,离心,这个过程重复2次,充分灭活肿瘤细胞,最终得到肿瘤细胞裂解液(TCL),由图6可以看出,所制备的疫苗能引起产生较高的Th1相关的细胞因子水平。
采用染料Cy7对活的B16细胞进行染色,之后完全按照上述方法制备疫苗,得到Cy7染色的疫苗(TCL-Cy7@EGCG/Aln+1),之后将此疫苗尾根部皮下注射C57BL6小鼠,之后采用小动物活体成像观察此疫苗的淋巴结迁移情况,结果如图7所示,其中TCL-Cy7是Cy7染色了的肿瘤细胞裂解液,其制备方法为先采用Cy7对活的B16细胞进行染色,之后制备方法与TCL的制备方法一样,由图中可看出,注射6个小时之后,所有疫苗都已经部分迁移到淋巴结中,然而游离的TCL-Cy7在注射48小时之后,淋巴结中的荧光消失,说明TCL-Cy7已被降解。相比之下TCL-Cy7@EGCG/Aln+1在注射48小时之后,在淋巴结中的荧光强度基本不变,表明所制备的疫苗具有较强的淋巴结迁移能力。
实施例4
基于肿瘤细胞(HL60)为模板的肿瘤疫苗的制备方法,包括如下步骤:
(1)收集处于对数生长期的肿瘤细胞HL60,并用生理盐水洗涤4次以去除细胞培养基中血清,用生理盐水将细胞浓度调整为2×107个/ml的肿瘤细胞混悬液;以下各步骤在4℃进行;
(2)向9mL肿瘤细胞混悬液中加入0.5ml,30mg/ml的EGCG水溶液和0.5ml,8mg/ml的AlCl3水溶液,涡旋90s,在转速200g离心5min,用生理盐水洗涤4次去除溶液中多余的EGCG和AlCl3,得到EGCG/Al包埋的肿瘤细胞HL-60@EGCG/Al1;
(3)重复步骤(2)2次得到HL-60@EGCG/Al3;
(4)离心去上清,将HL-60@EGCG/Al3放置于20ml高纯水中孵育30min使细胞灭活,离心,这个过程重复4次,充分灭活肿瘤细胞,最终得到肿瘤疫苗,即包埋有肿瘤细胞裂解物的微囊TCL@EGCG/Al3;见图4。
Claims (3)
1.基于肿瘤细胞为模板的肿瘤疫苗的制备方法,其特征是包括如下步骤:
1)收集处于对数生长期的肿瘤细胞,并用生理盐水洗涤以去除细胞培养基中血清,用生理盐水将细胞浓度调整为2×105个/ml-2×107个/ml的肿瘤细胞混悬液;以下各步骤在4 oC以下进行;
2)按比例,向9mL肿瘤细胞混悬液中加入0.5ml,10-30 mg/ml的EGCG水溶液和0.5ml,2-8 mg/ml的AlCl3水溶液,涡旋,离心,用生理盐水洗涤去除溶液中多余的EGCG和AlCl3,得到EGCG/Al包埋的肿瘤细胞Cell@EGCG/Al1,再加入生理盐水至9mL;
(3)重复步骤(2)n次得到Cell@EGCG/Al(n+1);
(4)离心去上清,将Cell@EGCG/Al(n+1)用高纯水孵育使细胞灭活,离心,得到肿瘤疫苗,即包埋有肿瘤细胞裂解物的微囊TCL@EGCG/Al(n+1);
所述n=0-2;
所述EGCG是表没食子儿茶素没食子酸酯的缩写;
所述肿瘤细胞为小鼠黑色素瘤细胞B16或人急性白血病细胞HL-60。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征是步骤(4)为:离心去上清,将Cell@EGCG/Al(n+1)用5-20ml高纯水孵育15-30min使细胞灭活,离心,得到肿瘤疫苗,即包埋有肿瘤细胞裂解物的微囊TCL@EGCG/Al(n+1) 。
3.权利要求1或2的方法制备的基于肿瘤细胞为模板的肿瘤疫苗。
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