CN109464668A - 一种装载纳米材料的靶向肿瘤的递药体系及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种装载纳米材料的靶向肿瘤的递药体系及其构建方法和应用，本发明将CTAB修饰的金纳米棒用水重悬后加入BSA溶液、NaOL溶液或MUDA溶液中搅拌反应，将反应产物离心取沉淀，即得BSA、NaOL或MUDA修饰的金纳米棒，再加入巨噬细胞共同孵育得装载纳米材料的靶向肿瘤的递药体系。本发明递药体系能有效提升纳米材料靶向肿瘤、渗透肿瘤的能力。并借助于纳米材料高效的通过近红外激光的照射将光能转换为热能，进而将肿瘤细胞杀死。在有效提升纳米光热转换材料靶向治疗的同时也降低了治疗的毒副作用，从而构建以巨噬细胞为载体的高靶向输送纳米光热转换材料治疗肿瘤的医疗策略。

Description

一种装载纳米材料的靶向肿瘤的递药体系及其构建方法和 应用

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种装载纳米材料的靶向肿瘤的递药体系及其构建方法和应用。

背景技术

在人类与疾病抗争的漫长历史长河中，癌症一直是我们想战胜却又不甚了解的疾病。现今癌症已成为威胁我们健康的头号杀手。愈发增高的发病率与致死率使得人人“谈癌色变”，从而对有效治愈癌症的医疗需求也愈发变得急切。

早在1896年，William Halsted采用手术切除肿瘤的治疗方法已正式开启了临床治疗肿瘤最为主要的治疗方式，但由于手术切除肿瘤也无法防止癌细胞的转移以及无法消灭循环血液中的癌细胞，因此，在实施手术后仍需结合放疗、化疗等治疗手段防止肿瘤的再次复发。但由于放疗、化疗对肿瘤细胞的识别特异性不高，治疗缺乏选择性从而大范围杀伤人体正常细胞。造成的副作用包括免疫功能下降、骨髓抑制、消化障碍、炎症反应等，严重影响患者生活质量，甚至对患者的生命产生新的威胁，部分患者难以耐受从而选择放弃治疗。基于以上原因的考虑，如何有效地提升对肿瘤的靶向治疗并防止肿瘤细胞从淋巴、血管系统转移复发已成为肿瘤医疗研究的关键问题。

近年来纳米材料研究的高速发展为精确治愈肿瘤提供了新的思路，其中，纳米材料与近红外光相结合的光热疗法就是一种高靶向微创治疗癌症的技术，通过将具有高光热转换效率的纳米材料选择性地靶向到肿瘤组织，再实施局部近红外激光照射，使肿瘤部位产生高温，从而诱使癌细胞产生蛋白变性或结构破坏等，最终引发癌细胞的死亡。如：一种金纳米粒子光热疗剂及其制备方法和应用[CN201410080067.0]、光热和光动联合抗肿瘤的以叶酸介导的金纳米星为载体的药物传递系统的制备方法及应用[CN201510204171.0]、一种多功能硒化铋纳米复合物、其制备方法及应用[CN201510903553.2]等众多新型纳米制剂的成功研发极大地推动了光热治疗肿瘤研究的进展。光热治疗领域当前的研究热点之一是高光热转化效率纳米材料的研发，其中，较早开展的基于金纳米壳的近红外光热治疗技术已获得美国FDA批准，进入了头颈癌临床III期的应用研究。近年来，具有独特近红外共振吸收特性的金纳米棒被认为是理想的光热材料，展现出巨大的应用潜力。此外，金/银纳米粒、硒化铋纳米粒子、石墨烯等光热转换材料的成功研发，有力地推动了光热治疗技术的发展。然而，由于光热治疗采用的是一种非侵入式局部治疗方式，通过将光直接照射到肿瘤部位实施治疗。如果在治疗过程中无法准确定位肿瘤，则有可能导致盲目照射、过度治疗等问题，从而对患者造成伤害。同时，由于生物体内的环境复杂，加之纳米材料携带的靶向肿瘤分子种类有限，肿瘤细胞可调节自身受体蛋白的表达，如分泌糖蛋白来封闭纳米材料上的靶向分子，从而“钝化”纳米光热材料的靶向性。另一方面，由于肿瘤内部多呈现病态的血管网络，瘤体结构致密、缺乏淋巴回流，使得大多数的纳米光热材料很难有效渗透肿瘤内部。在肿瘤供血较为丰富的边缘区域，纳米光热转换材料通过肿瘤Enhanced permeabilityand retention effect(EPR)效应容易在此聚积，而在远离供血的肿瘤内部，纳米光热转换材料则很难有效渗入发挥治疗功效。进而导致治疗不彻底，残余的肿瘤细胞很容易逃避治疗，通过转移分化后再次形成肿瘤，使得肿瘤再次复发。

现有的抗肿纳米药物在使用过程中特别容易出现以下问题：

①靶向肿瘤能力不足，容易在非治疗区域富集，引发副作用；

②纳米药物主动渗透肿瘤组织的能力不足，特别是肿瘤乏氧区域，纳米药物很难到达；

③肿瘤治疗效果不佳，肿瘤容易复发转移。

近年来纳米材料研究的高速发展为精确治愈肿瘤提供了新的思路，但由于生物体内的微环境较为复杂，肿瘤细胞能够不断适应并躲避纳米材料的识别，以及肿瘤组织结构致密、缺乏淋巴回流的特点，使得纳米材料难以高效靶向肿瘤组织发挥抗肿瘤的功效。因此，急需探寻一种更为有效的靶向输送纳米光热转换材料的药物递送方式。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种装载纳米材料的靶向肿瘤的递药体系的制备方法。

本发明的另一目的在于提供一种装载纳米材料的靶向肿瘤的递药体系。

本发明的再一目的在于提供上述递药体系在制备治疗肿瘤药物中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种装载纳米材料的靶向肿瘤的递药体系的制备方法，包括以下步骤：

1)纳米材料的制备：在26-29℃条件下，将油酸钠溶液与硝酸银溶液混合，调pH值为 2.1～2.5，再加入十六烷基三甲基溴化铵溶液和氯金酸溶液，搅拌均匀后加入抗坏血酸至无色后再加入硼氢化钠溶液，于34～36℃静置2.8～3.2h，15000～17000转/分钟离心，收集沉淀得CTAB修饰的金纳米棒；将CTAB修饰的金纳米棒用水重悬后加入BSA溶液、NaOL溶液或MUDA溶液中搅拌反应，将反应产物离心取沉淀，即得BSA、NaOL或MUDA修饰的金纳米棒，简称纳米材料；

2)巨噬细胞装载纳米材料：将上步制备好的纳米材料散于磷酸盐缓冲液中，使浓度为10～30μg/mL，加入巨噬细胞共同孵育6～12h，即得装载纳米材料的靶向肿瘤的递药体系。

优选的，步骤1)中，油酸钠、硝酸银、十六烷基三甲基溴化铵、氯金酸的摩尔比为48～ 52：0.8～1.2：990～1100：9～11。

优选的，步骤1)中，将CTAB修饰的金纳米棒用水重悬后加入BSA溶液、NaOL溶液或MUDA溶液中搅拌反应，所述搅拌反应的搅拌速度为600～1000转/分钟，搅拌反应时间为1～30h。

更优选的，当CTAB修饰的金纳米棒与MUDA溶液进行搅拌反应时，搅拌反应时间为26～30小时，且每隔3.5～4.5小时补加一次MUDA溶液。

优选的，步骤1)中，反应产物离心的转速为15000～17000转/分钟。

优选的，步骤1)中，CTAB修饰的金纳米棒与BSA、NaOL或MUDA的摩尔比为1： 10^-4～10，优选为1：2×10^-4～3.2。

优选的，步骤1)中，BSA、NaOL或MUDA修饰的金纳米棒长度为3～10nm，宽度为 1～10nm。更优选的长度为8nm，宽度为5nm。

优选的，步骤2)中，每10～50μg纳米材料与0.8×10⁵～1.2×10⁵个巨噬细胞进行孵育。更优选的每30μg纳米材料与1×10⁵个巨噬细胞进行孵育。

优选的，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

上述任一项所述方法制备的递药体系。

上述所述递药体系在制备治疗肿瘤药物中的应用。

上述所述递药体系在制备近红外光热治疗肿瘤药物中的应用。

优选的，所述肿瘤包括浅表肿瘤、具有转移性质的肿瘤。

优选的，所述肿瘤包括乳腺肿瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、血管瘤。

本发明的有益效果是：

(1)本发明提供了一种装载纳米材料的靶向肿瘤的递药体系的制备方法和应用。其制备方法具有制备工艺简易、重现性好。本发明递药体系能有效提升纳米材料靶向肿瘤、渗透肿瘤的能力。并借助于纳米材料高效的通过近红外激光的照射将光能转换为热能，进而将肿瘤细胞杀死。在有效提升纳米光热转换材料靶向治疗的同时也降低了治疗的毒副作用，从而构建以巨噬细胞为载体的高靶向输送纳米光热转换材料治疗肿瘤的医疗策略。

(2)本发明递药体系具有靶向肿瘤组织的生物学性能，可有效解决纳米材料靶向肿瘤能力不足的问题，使本发明纳米材料靶向肿瘤的能力得以明显提升。

(3)在本发明递药体系中，特定的金纳米棒纳米材料性能稳定、生物相容性好，合适装载剂量的纳米材料并不会影响巨噬细胞正常的生物学性能。并且实验结果表明，本发明金纳米棒纳米材料在肿瘤治疗完成后可通过肾脏排出。

(4)成功构建以细胞为载体的高靶向输送纳米材料治疗肿瘤的新方法，推动细胞免疫治疗与纳米材料光热治疗肿瘤研究的发展。

(5)本发明递药体系将特定的金纳米棒递送到肿瘤组织部位进行光热治疗具备以下优点：

①本发明能有效提升本发明特定纳米材料的肿瘤靶向给药能力，降低纳米药物在非治疗区域残留。

②本发明能提升本发明特定纳米材料渗透肿瘤组织的能力，特别是提升纳米材料对肿瘤乏氧区域的渗透能力。

③本发明适用范围广，对多种类型的肿瘤，特别是具有转移能力的肿瘤细胞能主动识别治疗。

④本发明的肿瘤治疗策略对机体的毒副作用小，在后续的临床应用中，如使用宿主自身的免疫细胞进行治疗，将大大降低治疗的风险以及毒副作用。

附图说明

图1.金纳米棒的表征；a：不同制备工艺合成的金纳米棒紫外吸收光谱；b：金纳米棒不同表面修饰后的zeta电位检测；1：表面有牛血清蛋白BSA修饰的金纳米棒；2：表面有油酸钠NaOL修饰的金纳米棒；3：表面有CTAB修饰的金纳米棒紫外吸收光谱。

图2.本发明所使用的金纳米棒材料在近红外激光照射下将光能转换为热能的红外热成像图。

图3.不同表面修饰的金纳米棒材料对细胞毒性的影响。

图4.巨噬细胞装载FITC绿色荧光标记的金纳米棒能力观察；本发明金纳米棒与细胞作用6h，DAPI染核，黄色标尺为20μm。

图5.巨噬细胞摄入本发明金纳米棒含量分析。

图6.巨噬细胞运载金纳米棒通过光热诱导肿瘤细胞凋亡百分率。

图7.慢病毒标记巨噬细胞表达GFP绿色荧光蛋白及荧光成像。

图8.活体成像观察慢病毒荧光标记的巨噬细胞靶向渗透乳腺肿瘤。

图9.荷瘤裸鼠光热治疗前后肿瘤的变化，a为治疗前，b为治疗后。

图10.BSA修饰的金纳米棒在体内的分布与清除。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

本发明利用巨噬细胞高吞噬特性、免疫靶向肿瘤的细胞运载特性与纳米材料抗肿瘤能力相结合，提升了纳米材料在体内精准靶向、渗透肿瘤组织的能力，降低纳米光热转换材料在非治疗区域的残留。从而构建以巨噬细胞为载体的高靶向输送纳米材料治疗肿瘤的医疗策略。本发明具体的技术实现方案如下所示：

对比例1 CTAB修饰的金纳米棒的制备方法

在室温条件下(26-29℃),500μL浓度为0.1mol/L的油酸钠溶液中加入4mmol/L硝酸银溶液250μL，充分搅拌并缓慢加入盐酸将溶液pH值调整至2.3后加入10mL浓度为0.1mol/L 的十六烷基三甲基溴化铵以及2mL浓度为5mmol/L的氯金酸溶液，缓慢搅拌均匀后加入0.1 mol/L的抗坏血酸50μL至无色后再加入15μL新鲜配制的硼氢化钠溶液(10mmol/L)于恒温35℃静置3小时。溶液随后以16000转/分钟的转速离心30分钟，收集沉淀并除去上清液，沉淀物以超纯水再次重悬，并以8000转/分钟的转速离心10分钟，小心吸取上清液，则所制备的溶液中含有所要制备的CTAB修饰的金纳米棒。

实施例1 BSA修饰的金纳米棒的制备方法

将对比例1中的CTAB修饰的金纳米棒溶液以15000转/分钟离心10分钟后收集沉淀，使用超纯水进行重悬，并将浓度为0.08mol/L的CTAB修饰金纳米棒溶液每毫升中加入1mL BSA溶液(0.25mmol/L)，室温下8000转/分钟快速搅拌8小时后通过离心除去过量的BSA后以超纯水重悬则成功制备BSA修饰的金纳米棒。

实施例2 NaOL修饰的金纳米棒的制备方法

将对比例1中的CTAB修饰的金纳米棒溶液以15000转/分钟离心10分钟后收集沉淀，使用超纯水进行重悬，并将每毫升0.08mol/L CTAB修饰的金纳米棒溶液中加入100μL的NaOL溶液(0.25mmol/L)，在85℃下800转/分钟搅拌1小时后以15000转/分钟离心10分钟。收集油酸钠修饰的金纳米棒沉淀物后重悬浮于1毫升超纯水中，得NaOL修饰的金纳米棒。

实施例3 MUDA修饰的金纳米棒的制备方法

将对比例1中的CTAB修饰的金纳米棒以15000转/分钟离心10分钟后收集沉淀，使用超纯水进行重悬，并将浓度为0.08mol/L的CTAB修饰金纳米棒溶液每毫升中加入100μL浓度为23mmol/L的MUDA溶液，于室温下800转/分钟振荡28小时，每隔4小时补加一次 MUDA溶液。随后，通过离心除去多余的MUDA并以超纯水重悬，得MUDA修饰的金纳米棒。

下面对各组制备的金纳米棒作进一步的效果检测和对比。

一、不同表面修饰的金纳米棒的表征和光热升温效果

方法：

金纳米棒的理化表征：用紫外光谱仪对制备好的金纳米棒进行检测观察，以检验所制备的金纳米棒紫外吸收光谱的位移。

金纳米棒光热升温效果的测定：使用808nm近红外激光(1.0W/cm²)照射不同浓度的金纳米棒溶液，用热成像仪记录近红外激光照射不同时间段金纳米棒溶液温度的变化，绘制溶液升温曲线，观察金纳米棒的光热转换能力。

结果：

本发明制备的NaOL，BSA或MUDA分别修饰的金纳米棒形貌均一，金纳米棒长度为3～ 10nm，宽度为1～10nm。图1为金纳米棒的理化表征；图1a为不同制备工艺合成的金纳米棒紫外吸收光谱；图1b为：金纳米棒不同表面修饰后的zeta电位检测，其中1：表面有牛血清白蛋白BSA修饰的金纳米棒；2：表面有油酸钠NaOL修饰的金纳米棒；3：表面有CTAB 修饰的金纳米棒。从图1a的紫外吸收光谱的位移以及图1b金纳米棒zeta电位的变化皆表明本发明制备金纳米棒的表面成功修饰上NaOL或BSA。

图2为BSA修饰的金纳米棒(对照组为PBS溶液)在石英比色皿中的热成像照片，图中表明，金纳米棒具有优异的光热转换性能，可在近红外激光的照射下将光能迅速转换为热能，在近红外光照射5分钟后，金纳米棒溶液的温度能迅速从室温27.1℃上升至46.4℃。

二、不同表面修饰的金纳米棒细胞毒性研究

方法：分别将实施例1～3中制备的BSA、NaOL、MUDA修饰的金纳米棒，以及对比例 1制备的CTAB修饰的金纳米棒通过MTT实验检测其对巨噬细胞的毒性作用。

结果：如图3所示，在制备金纳米棒的过程中如果加入CTAB将对细胞造成较大的毒性，而本发明采用NaOL、MUDA、BSA取代CTAB则可减轻金纳米棒的毒性，在相同剂量下， BSA修饰的金纳米棒生物相容性更优于NaOL修饰的金纳米棒。上述结果说明本发明采用 NaOL、MUDA、BSA修饰不仅可以保持金纳米棒良好分散性，同时还能降低材料的毒副作用。

实施例4一种装载纳米材料的靶向肿瘤的递药体系的制备方法

本实施例使用绿色荧光染料异硫氰酸荧光素(FITC)对本发明制备的BSA修饰的金纳米棒(或者选用本发明NaOL或MUDA修饰的金纳米棒)进行标记，并将FITC标记好BSA 修饰的金纳米棒(简称纳米材料)分散于磷酸盐缓冲液中，使纳米材料的浓度为10～30μg/mL，加入巨噬细胞共同孵育(每10～50μg纳米材料与0.8×10⁵～1.2×10⁵个巨噬细胞进行孵育)，并观察巨噬细胞吞噬金纳米棒的情况。结果表明本发明金纳米棒与细胞共同孵育6h之后，用倒置荧光显微镜观察可见巨噬细胞细胞质部位都可观察到明显的绿色荧光，表明巨噬细胞对本发明金纳米棒具有较强的吞噬能力，本发明金纳米棒被巨噬细胞吞噬后主要分布于细胞质内(图4)，其中吞噬了本发明金纳米棒的巨噬细胞即为装载纳米材料的靶向肿瘤的递药体系。

下面对本发明制备的装载纳米材料的靶向肿瘤的递药体系作进一步的效果检测。

一、装载金纳米棒的能力检测

方法：检测巨噬细胞摄入本发明金纳米棒的能力，并与正常细胞、肿瘤细胞进行比较。按上述实施例4相似的方法，分别用正常细胞、肿瘤细胞取代巨噬细胞与本发明金纳米棒在相同的条件进行孵育。将各组吞噬了金纳米棒的细胞分别加入王水中直至细胞被消解至澄清透明后将剩余的王水蒸发除去，加水稀释后过滤。通过电感耦合等离子体质谱仪(ICP)检测溶液中金离子的浓度，从而推算出各组细胞摄入本发明金纳米材料的含量。

结果：由图5可知，正常细胞摄入本发明金纳米棒的能力较弱，摄入量为38.7±4.5pg/ 细胞。肿瘤细胞对本发明金纳米棒的摄入能力要高于正常细胞，为43.8±5.6pg/细胞，巨噬细胞摄入本发明金纳米棒的能力最强，为106.4±5.2pg/细胞，明显高于正常细胞和肿瘤细胞的摄入量。上述结果说明，本发明金纳米棒非常适用于巨噬细胞高效吞入，使巨噬细胞能够吞噬大量金纳米棒用于肿瘤的靶向治疗。

二、光热治疗效果检测

方法：将BSA修饰的金纳米棒与巨噬细胞相互作用12h，收集细胞加入Annexin-V/PI 染料对细胞进行标记。通过流式细胞仪检测比较未添加本发明金纳米棒(空白对照组)、添加本发明金纳米棒不进行激光照射(金纳米棒组)、添加金纳米棒并进行近红外光照射10min (金纳米棒加激光照射组)的巨噬细胞的细胞凋亡情况。

结果：如图6所示，仅使用近红外激光照射并不会明显引起巨噬细胞的凋亡，而加入金纳米棒但不进行激光照射的巨噬细胞凋亡率也低于10％，当加入激光照射后，巨噬细胞凋亡率明显上升，近红外光照射10min后细胞凋亡可升高至34％。该结果表明BSA修饰的金纳米棒有着更为优异的生物相容性以及较高的光热转换效率，当巨噬细胞携带金纳米棒靶向肿瘤细胞后，在近红外光的照射下可通过升高肿瘤细胞的环境温度有效杀灭肿瘤细胞。

三、巨噬细胞均匀靶向渗透全部乳腺肿瘤组织

方法：为了观察巨噬细胞在动物体内运载本发明金纳米棒靶向渗透乳腺肿瘤的情况，本发明采用慢病毒侵染的方法，将带有表达GFP绿色荧光蛋白质粒的慢病毒侵染巨噬细胞。该慢病毒载体系统由pGC-LV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。pGC-LV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，通常根据不同的实验目的针对pGC-LV载体改造以进行启动子活性研究、基因表达研究、RNA干扰等研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因编码病毒特异性的酶；rev基因编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。

在完成慢病毒侵染后，将慢病毒侵染后的巨噬细胞进行离体培养扩增，通过吹打、离心收集巨噬细胞，以0.1mL体积含1×10⁷个细胞的浓度注射入荷乳腺肿瘤的裸鼠体内，将裸鼠置于小动物成像系统内用蓝色激光进行照射。

结果：如图7所示，在完成慢病毒侵染后，被侵染的巨噬细胞能表达绿色的GFP荧光蛋白，用倒置荧光显微镜和小动物成像设备的蓝色激光照射细胞，可观察到明亮的绿色荧光，并且慢病毒侵染后的巨噬细胞在经过多次传代后仍然能持续表达GFP荧光蛋白，细胞明亮的绿色荧光并不会随着巨噬细胞的生长分裂增殖而衰减。

如图8所示，可观察到注射了慢病毒标记的巨噬细胞裸鼠乳腺肿瘤处有明显的绿色荧光，并且随着时间的延长，巨噬细胞逐渐生长扩散，注射2周后可观察到裸鼠肿瘤大面积呈现明亮的绿色荧光。将裸鼠处死取出肿瘤组织置于蓝色激光的照射下可观察到对照组无绿色荧光，注射了慢病毒标记的巨噬细胞裸鼠乳腺肿瘤有明显的绿色荧光，将肿瘤组织切开后可见巨噬细胞逐渐向乳腺肿瘤内部渗透。

四、本发明装载纳米材料的巨噬细胞靶向渗透肿瘤组织的光热治疗检测

方法：将装载BSA修饰的金纳米棒的巨噬细胞(即本发明靶向肿瘤的递药体系)收集后，以0.1mL体积含1×10⁷个细胞的浓度注射入荷乳腺肿瘤的裸鼠体内24h后，注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，使用808nm波长功率为1.0W/cm²的激光器照射裸鼠肿瘤部位10min，各组的具体处理情况，如下：

近红外激光照射组：只注射PBS溶液并进行近红外激光光照。

激光照射+巨噬细胞组：注射0.1mL体积含1×10⁷个巨噬细胞PBS溶液后进行近红外激光光照。

激光照射+金纳米棒组：注射0.1mL体积含10μg的BSA修饰金纳米棒PBS溶液后进行近红外激光光照。

激光照射+装载金纳米棒巨噬组：注射0.1mL体积含1×10⁷个装载BSA修饰金纳米棒后的巨噬细胞PBS溶液并进行近红外激光光照。结果：如图9所示，注射了装载BSA修饰的金纳米棒的巨噬细胞实验组肿瘤组织中金纳米棒的分布要比直接注射BSA修饰的金纳米棒更为均匀，因此在近红外激光的照射下，注射装载BSA修饰的金纳米棒的巨噬细胞能更为高效地将光能转化为热能，肿瘤中心部位在近红外光的激光照射下温度最高可达53℃，肿瘤组织整体的升温幅度明显优于单纯注射纳米棒实验组，同时肿瘤组织升温的区域要明显大于直接注射纳米光热材料的升温区域。更高的升温效能以及升温覆盖区域提供了更为优异的杀灭肿瘤细胞的能力，展现出更好的治疗效果。图9a表示治疗前，图9b表示治疗后，在治疗完成2周后，仅使用近红外激光照射与仅加入金纳米棒组的裸鼠肿瘤生长没有受到明显抑制，而直接注射金纳米棒并进行近红外激光照射的裸鼠只是肿瘤局部温度升高，不能有效杀灭大部分的肿瘤细胞，导致肿瘤容易再次复发。注射装载本发明纳米材料的巨噬细胞能够均匀透到全部的肿瘤组织中，在近红外激光的照射下，肿瘤组织整体的升温明显，能有效杀灭大部分的肿瘤细胞，在治疗完成后肿瘤的复发率受到明显的抑制。并且，从本实验中也可以看出，本发明递药体系降低了纳米药物在非治疗区域残留；提升了本发明特定纳米材料渗透肿瘤组织的能力，特别是提升纳米材料对肿瘤乏氧区域的渗透能力。本发明的该肿瘤治疗策略对机体的毒副作用小，在后续的临床应用中，如使用宿主自身的免疫细胞进行治疗，将大大降低治疗的风险以及毒副作用。

五、本发明所使用的金纳米材料在光热治疗后可被机体代谢排出

方法：BSA修饰的金纳米棒通过尾静脉注射的方法注射入Balb/c小鼠体内(5mg/mL) 后，分别选取1，5，10，15，30天时间点的小鼠进行安乐死处死并取出主要器脏。将主要器脏进行称重后置于王水中消化24小时并加热至140℃以除去组织中的氮氧化物，直至溶液变为无色透明后加入10毫升含2％硝酸和1％氢的水溶液搅拌10分钟。使用滤膜过滤溶液后采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)检测滤液中金离子含量。

结果：如图10所示，在尾静脉注射金纳米棒后，纳米材料主要分布在肝脏，其次为肾脏和脾脏。随着注射时间的增加，本发明BSA修饰的金纳米棒可快速从小鼠体内代谢排出。注射后5天即可明显观察到主要的器脏中金元素的含量明显下降。当到达注射后10天时一半以上的金纳米棒已被机体代谢排出。注射后15天大部分的金纳米材料已成功被机体代谢排出，直至30天后，金纳米棒几乎被机体完全代谢排出。由此可见本发明所使用的BSA修饰的金纳米棒可以顺利地通过肾小球快速排出体内，避免了纳米材料在完成治疗后残留在体内可能造成的毒副作用。

综上所述，本发明已经实验证实，金纳米棒的制备及表征的实验结果表明制备的金纳米棒形貌均一，金纳米棒长度为3～10nm，宽度为1～10nm。紫外吸收光谱以及zeta电位的检测结果表明所使用的金纳米棒表面已成功修饰上牛血清白蛋白和油酸钠。红外热成像照片表明，本发明金纳米棒具有优异的光热转换性能，可在近红外激光的照射下将光能迅速转换为热能。金纳米棒的细胞毒性实验结果表明，采用BSA、NaOL或MUDA来取代CTAB可明显减轻金纳米棒的细胞毒性。巨噬细胞装载本发明金纳米棒能力检测的实验结果表明，巨噬细胞对本发明金纳米棒具有较强的吞噬能力，本发明金纳米棒被巨噬细胞吞噬后主要分布于细胞质内。金纳米棒的光热治疗实验结果表明，本发明金纳米棒有着更为优异的生物相容性以及较高的光热转换效率，当巨噬细胞携带本发明金纳米棒靶向肿瘤细胞后，在近红外光的照射下可通过升高肿瘤细胞的环境温度，能够有效杀灭肿瘤细胞。本发明装载纳米材料的递药体系能够有效均匀渗透肿瘤组织，从而提升纳米材料的肿瘤覆盖率。巨噬细胞运载本发明金纳米棒光热治疗肿瘤的实验结果表明，运载本发明金纳米棒的巨噬细胞组在近红外激光的照射下，使肿瘤组织整体升温明显，有效杀灭大部分的肿瘤细胞，在治疗完成后肿瘤的复发率受到明显的抑制。本发明适用范围广，对多种类型的肿瘤，特别是具有转移能力的肿瘤细胞能主动识别治疗。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种装载纳米材料的靶向肿瘤的递药体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)纳米材料的制备：在26-29℃条件下，将油酸钠溶液与硝酸银溶液混合，调pH值为2.1～2.5，再加入十六烷基三甲基溴化铵溶液和氯金酸溶液，搅拌均匀后加入抗坏血酸至无色后再加入硼氢化钠溶液，于34～36℃静置2.8～3.2h，15000～17000转/分钟离心，收集沉淀得CTAB修饰的金纳米棒；将CTAB修饰的金纳米棒用水重悬后加入BSA溶液、NaOL溶液或MUDA溶液中搅拌反应，将反应产物离心取沉淀，即得BSA、NaOL或MUDA修饰的金纳米棒，简称纳米材料；

2)巨噬细胞装载纳米材料：将上步制备好的纳米材料散于缓冲液中，使浓度为10～50μg/mL，加入巨噬细胞共同孵育6～12h，即得装载纳米材料的靶向肿瘤的递药体系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，将CTAB修饰的金纳米棒用水重悬后加入BSA溶液、NaOL溶液或MUDA溶液中搅拌反应，所述搅拌反应中的搅拌速度为600～1000转/分钟，搅拌反应时间为1～30h。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，当CTAB修饰的金纳米棒与MUDA溶液进行搅拌反应时，搅拌反应时间为26～30小时，且每隔3.5～4.5小时补加一次MUDA溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，BSA、NaOL或MUDA修饰的金纳米棒长度为3～10nm，宽度为1～10nm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，每10～50μg纳米材料与0.8×10⁵～1.2×10⁵个巨噬细胞进行孵育。

7.根据权利要求1～6任一项所述方法制备的递药体系。

8.权利要求7所述递药体系在制备治疗肿瘤药物中的应用。

9.权利要求7所述递药体系在制备近红外光热治疗肿瘤药物中的应用。

10.根据权利要求8～9任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括浅表肿瘤、具有转移性质的肿瘤。