CN103948921A - 一种纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗的制备方法，该方法首先用微乳法制备纳米铝佐剂：将等比例的苯扎溴铵、正辛醇、环己烷高速搅拌后加入适量的AlCl3溶液搅拌。缓慢滴加氨水，保持反应体系PH>10反应2h，然后加入丙酮破乳离心，沉淀物离心洗涤三次，将离心后的沉淀干燥箱中干燥过夜，即得到蓬松的纳米Al(OH)₃佐剂。然后将H22肝癌细胞悬液与纳米铝佐剂共孵育，得到纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗。本发明制得的纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗粒径小、分散性好、具有较好的稳定性，有良好的生物相容性。动物实验结果显示：纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗抗肿瘤作用明显优于普通铝佐剂。

Description

一种纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗的制备方法

技术领域

本发明属于抗肿瘤的自体疫苗领域，涉及一种作为治疗癌症的纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗及其制备方法。

背景技术

迄今为止，肿瘤仍是威胁人类健康与生命的顽症。肿瘤的生物治疗作为治疗的新模式，已经成为肿瘤综合治疗中不可取代的重要组成部分，它主要包括免疫治疗和基因治疗两方面。肿瘤免疫治疗的目的是激发和调动免疫系统，增强肿瘤微环境的抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞。从目前国际研究的趋势分析，从实际应用的角度推测，免疫治疗将会有广泛的研究前景。而免疫治疗的研究上又包括对疫苗的研制和新型免疫佐剂的开发。

肿瘤疫苗是利用肿瘤细胞或肿瘤抗原类物质诱导机体产生针对肿瘤细胞的免疫反应，抑制其生长，防止其复发和转移。研制肿瘤疫苗所面临的最大问题就是如何使人体对肿瘤产生有效的免疫应答。T细胞介导以细胞免疫为主的免疫应答在机体抗肿瘤免疫起重要作用。T细胞的激活需双重信号，T细胞受体与抗原结合后，提供第一信号，共刺激因子B7等为第二信号。CD8⁺CTL细胞在Th细胞辅助下活化后除直接杀伤肿瘤细胞，还分泌淋巴因子如γ-干扰素、淋巴毒素间接杀伤瘤细胞。CD4⁺T细胞激活可分泌细胞因子如IL-2等，该类因子在CD8⁺CTL激活过程中起辅助作用。另外，NK、巨噬细胞等也可杀伤瘤细胞，体液免疫仅起辅助作用。

100多年前，Willam Coleys首次使用脓球菌抽提物刺激机体，可产生抗肿瘤的免疫应答，成为第一例有报道的肿瘤疫苗。在肿瘤免疫中，利用肿瘤细胞特异的细胞毒T淋巴细胞只杀伤肿瘤细胞而不杀伤正常细胞，利用机体免疫机制消灭肿瘤细胞是人们多年的梦想。随着人们对肿瘤的免疫机制深入认识，瘤苗的发展极为迅速，出现了细胞疫苗、多肽疫苗、核酸疫苗、癌基因与抑癌基因疫苗及亚单位疫苗等。根据疫苗的来源不同，肿瘤疫苗可分为以下四种：(1)活疫苗：自体或异体的瘤细胞制成；(2)灭活疫苗：瘤细胞经射线照射，抗癌药，冻融等处理，抑制其生长能力，保留其抗原性；(3)修饰或改变的瘤细胞：用蛋白佐剂、病毒佐剂、细菌佐剂、化学佐剂等处理，使肿瘤细胞的免疫原性增强，或肿瘤细胞转染基因，细胞融合等，改变了肿瘤的免疫原性；(4)亚细胞成份疫苗：用各种方法破坏的自体或异体肿瘤细胞，分离其细胞膜成分及提纯细胞膜表面可溶细胞表面肿瘤抗原。上述疫苗各有其优缺点，活疫苗虽抗原性较强，但毒副作用也很强；多肽疫苗具有安全性好、容易获得、纯度高的特点，曾被认为是最有希望的瘤苗，但所在的缺点是不可回避的，一是合成多肽的直链结构，在整个功能上可能与天然分子不完全相同；二是合成多肽的半衰期短，在体内一般只有数分钟，蛋白酶可将其迅速降解；更为关键的还因为表位多肽分子小，免疫原性较弱，难以刺激甚至根本不能刺激产生有效的免疫应答；再者，合成的多肽在APC细胞膜表面与MHC-Ⅱ或MHC-Ⅰ类分子的结合效率比在溶酶体中要低得多，最重要的原因在于肿瘤细胞潜在表达多种肿瘤抗原，针对某个或某些表位产生的免疫应答不能有效的抑制肿瘤细胞的生长。实践证明，其并不一定能激发机体的抗瘤免疫应答。而细胞疫苗可表达多种肿瘤抗原，同时与异体全肿瘤细胞疫苗相比，自体全肿瘤细胞疫苗(autologous tumor vaccine，ATV)拥有个体特异完整的肿瘤抗原和HLA分子，比异体肿瘤细胞疫苗安全、有效。自体肿瘤细胞的免疫原性弱，常常在制备自体肿瘤细胞疫苗时添加免疫佐剂，因此在细胞瘤苗免疫学治疗中佐剂是最重要的成分。

自从Ranmon发现一些与免疫原无关的物质可以增强类毒素或白喉毒素的抗原性以来，佐剂被用来增强机体对抗原的免疫力已经70多年了。佐剂是一类先于抗原或与抗原混合后注入机体，在广义上可通过特异性或非特异性免疫增强作用提高血清中疫苗抗原特异性抗体水平的物质。可溶性纯化蛋白质疫苗或蛋白质亚单位疫苗的免疫激活作用通常较弱，不足以刺激机体产生足够的抗体，因此通常在疫苗制剂中加入佐剂。与单独应用抗原相比，抗原与佐剂吸附应用所需的抗原量较少，机体产生的抗体量较多，并且还可以减轻免疫耐受。佐剂可以通过很多方式来增强机体对疫苗的反应：可增强弱抗原的抗原性；可增强免疫反应的持续时间和速度；可调控抗原的效价、特异性、同型或分化；可刺激细胞免疫应答；可增强和诱导粘膜免疫反应；可增强免疫系统未成熟或衰老的个体的免疫力；可减少抗原的剂量或降低抗原的成本，也可帮助克服联合疫苗中的抗原竞争。近来，Edelman对佐剂进行了细致分类：①矿物质盐，例如氢氧化铝、磷酸钙等；②表面活性物质及其微粒类，例如ISCOM、Ty类病毒颗粒等；③细菌或病毒产物，例如肺炎克雷伯杆菌糖蛋白、海藻糖结核环脂酸盐等，以及具有载体功能的白喉类毒素、B型脑膜炎球菌外膜蛋白等；④细胞因子，例如α或γ-干扰素、GM-CSF、IL-1、IL-2等；⑤激素，例如1,25-二羟维生素D3、人生长激素等；⑥独特抗原构架，例如N-端软脂酰化CTL抗原决定簇与Th细胞抗原决定簇的结合物等；⑦多阴离子物质，例如右旋糖苷；⑧多聚丙烯酸衍生物，例如丙烯酸与烯丙基蔗糖交联物等；⑨活病原微生物，例如啤酒酵母、减毒伤寒杆菌、戈登氏链球菌等；⑩佐剂制剂，例如弗氏不完全佐剂、MF-59、脂质体等。其中纳米颗粒为新一类型重要的佐剂，可以将抗原定向运输至肿瘤生成部位，控制抗原的释放，从而延长抗原释放时间，延长抗癌作用，减少肿瘤生长，延长荷瘤动物的存活时间。

纳米粒子是指直径一般在1～1000nm之间的聚合物形成的微粒，它具有独特的小尺寸效应和界面效应。抗原物质或能编码免疫原多肽的DNA或RNA可被包裹于纳米粒子内部或是吸附在纳米粒子表面，也可通过化学连接作用与纳米粒子结合，纳米粒子佐剂可有效增强细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫。纳米佐剂的作用包括：可增强抗原的免疫原性，极大减少抗原用量；增强细胞免疫和体液免疫；形成抗原储库作用并实现疫苗的控释；辅助抗原诱导机体特异的粘膜免疫。

QingHe等用磷酸钙纳米粒子加2型单纯疱疹病毒蛋白(CAP+HSV-2)，CAP磷酸盐缓冲溶液(PBS)，2型单纯疱疹病毒蛋白(HSV-2)分别对雌性BALB/C小鼠进行阴道内或鼻腔内免疫接种。结果表明CAP+HSV-2诱导产生特异性的黏膜免疫球蛋白IgA和IgG，同时提高全身IgG水平，而且在小鼠血清中发现了中和抗体。在首次接种后第45天,以2型单纯疱疹病毒攻击小鼠，试验结果显示用CAP+做佐剂副反应轻微，能引起Th1型反应，产生很高滴度的IgG2a抗体，因而认为它在不久的将来可取代铝盐佐剂应用于人体。钟石根等将钙纳米粒子与NP30制备成Ca-NP30结合物，主动免疫BALB/c小鼠，观察其对小鼠受血吸虫攻击的保护性作用。结果表明钙纳米粒子可增强NP30对宿主的保护性作用，减虫率明显提高，从单用NP30的30.4％提高到57.8％；血清特异性抗体IgG水平比对照组显著升高；足垫实验可引发迟发型过敏反应。此项研究表明：钙纳米粒子可作为血吸虫抗独特型抗体NP30疫苗的佐剂，其作用机制与同时引起体液免疫和细胞免疫应答增强有关。何萍等用纳米铝佐剂物理吸附HbsAg，以常规铝佐剂为对照，分别免疫小鼠和豚鼠，发现纳米铝佐剂对小鼠和豚鼠的体液免疫应答和细胞免疫应答都比常规铝佐剂强。

纳米疫苗佐剂具有很多的优点。综上所述：可以增强疫苗免疫原性和抗原性；靶向运输抗原；控制抗原的可持续性释放，从而延长抗原释放时间，延长治疗作用；安全性好，副作用少。但是纳米颗粒作为佐剂仍有不完善之处，如纳米颗粒与疫苗抗原结合方式，纳米颗粒与疫苗结合比例等对疫苗保护性免疫力得影响，胶囊化和微球体储存过程中抗原的稳定性，以及疫苗控释前需要解决微球体的水合作用。

基于以上研究进展，我们运用微乳法制备了纳米铝佐剂，并吸附自体肿瘤疫苗对小鼠进行肿瘤免疫的预防与治疗免疫学实验，观察纳米铝佐剂能否增强自体肿瘤疫苗诱导小鼠体内细胞免疫应答，从而抑制和清除肿瘤细胞。同时研究其可能的作用机制以及毒副作用，以期为以后的临床应用提供可靠的实验依据。

发明内容

技术问题：本发明提供一种将纳米铝佐剂与自体肿瘤疫苗有机结合，具有肿瘤治疗作用的纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗，同时提供了这种纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗的制备方法。

技术方案：本发明的纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗的制备方法，包括下述步骤：

1)制备纳米铝佐剂：

按质量比1:1:1将苯扎溴铵、正辛醇、环己烷高速混合后搅拌均匀，得到的混合溶液置入磁力搅拌器上，按正辛醇与AlCl₃质量比1:1.3～1.5，将后者加入混合溶液中搅拌20min以上。然后按20～30滴/min的速度向混合溶液中滴加氨水，保持反应体系PH>10反应2h，得到乳浊液。反应结束后向乳浊液中加入丙酮，至乳浊液变清，以>500rpm的速度离心，弃去上清液，得到沉淀物。最后将沉淀物分别用双蒸水、乙醇离心洗涤各三次后，置于干燥箱中干燥，即得到纳米铝佐剂。

2)制备纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗：

将H22肝癌细胞悬液与浓度为2～4mg/ml的纳米铝佐剂4℃共孵育7天，即得到纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗。

本发明方法的优选方案中，H22肝癌细胞悬液是按照如下方法制备的：小鼠腹腔接种H22肝癌细胞，待腹水产生后，无菌条件下抽取腹水，离心取沉淀，加入磷酸盐缓冲液制备成浓度为1×10⁸～3×10⁸个/ml细胞悬液，将细胞悬液经65℃30min水浴处理后即可。

本发明的纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗，是按照上述方法制备得到的。

有益效果：本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1.采用微乳法制备纳米铝佐剂，制备的纳米佐剂粒径均匀，平均在100nm左右，分散性良好。其粒径小于普通纳米铝佐剂。(见附图1)

2.本发明制备的纳米铝佐剂具有良好的生物相容性，我们通过材料浸提液细胞毒性试验、溶血试验、材料的小鼠LD50测定，以及体内遗传毒性试验—微核试验等方法，对自制纳米铝佐剂的生物相容性进行评价，证明自制纳米铝佐剂生物相容性良好。对机体的毒性小于普通铝佐剂。

3.目前普遍使用的以及通常的铝佐剂指的是氢氧化铝佐剂。它主要诱导体液免疫应答，抗体以IgG1类为主，刺激产生Th2型反应。铝佐剂可刺激机体迅速产生持久的高抗体水平，但其不能诱导细胞免疫。这就极大的限制了以细胞免疫为主的抗肿瘤免疫治疗。本发明优点为纳米佐剂是铝佐剂的新剂型，比较铝佐剂，该佐剂粒径小，分布均匀，易被抗原递呈细胞摄取，尤其被树突细胞以吞饮的方式摄取抗原(树突状细胞是最有效的抗原递呈细胞，吞饮小泡直径一般小于150nm)，从而引起机体强烈的细胞免疫和体液免疫应答。应用于肿瘤免疫治疗，改变了普通铝佐剂不能激活细胞免疫的局限，为肿瘤的免疫治疗开拓了新的思路。

4.制备的纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗抗肿瘤作用明显优于普通铝佐剂/自体肿瘤疫苗。在与普通铝佐剂的对比实验中，自制的铝佐剂/自体肿瘤疫苗显著的抑制了H22肝癌的质量和体积，细胞毒杀伤活性明显高于普通铝佐剂。

附图说明

图1为纳米铝佐剂的透射电镜图。

图2为纳米铝佐剂的能谱分析图。

图3为DCs吞噬不同佐剂的形态学观察图像(倒置显微镜下×400)，其中图3(a)为普通铝佐剂与DCs共培养组；图3(b)为纳米铝佐剂与DCs共培养组。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案做进一步具体说明。

本发明的制备纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗的方法，包括以下步骤：

1)制备纳米铝佐剂：

按质量比1:1:1将苯扎溴铵、正辛醇、环己烷高速混合后搅拌均匀，得到的混合溶液置入磁力搅拌器上，按正辛醇与AlCl₃质量比1:1.3～1.5，将后者加入混合溶液中搅拌20min以上。然后按20～30滴/min的速度向混合溶液中滴加氨水，保持反应体系PH>10反应2h，得到乳浊液。反应结束后向乳浊液中加入丙酮，至乳浊液变清，以>500rpm的速度离心，弃去上清液，得到沉淀物。最后将沉淀物分别用双蒸水、乙醇离心洗涤各三次后，置于干燥箱中干燥，即得到纳米铝佐剂。

2)制备纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗：

将H22肝癌细胞悬液与浓度为2～4mg/ml的纳米铝佐剂4℃共孵育7天，即得到纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗；所述H22肝癌细胞悬液是按照如下方法制备的：小鼠腹腔接种H22肝癌细胞，待腹水产生后处死，无菌条件下抽取腹水，离心取沉淀，加入磷酸盐缓冲液制备成浓度为1～3×10⁸/ml细胞悬液，将细胞悬液经65℃30min水浴处理后即可。

其中H22肝癌细胞是肝癌细胞的一种细胞株，是腹水型细胞株，悬浮生长。

下面通过实施例对本发明方案做进一步具体说明。

实施例1：

1)制备纳米铝佐剂：

按质量比1:1:1称取苯扎溴铵、正辛醇、环己烷高速搅拌后倒入三角瓶，置入磁力搅拌器上，按正辛醇与AlCl₃质量比1:1.3，将后者加入前述溶液搅拌20min以上。然后按20滴/min的速度滴加氨水，保持反应体系PH10反应2h，得乳浊液。反应结束后加入丙酮至乳浊液变清，以500rpm的速度离心，弃去上清液。然后将沉淀分别用双蒸水、乙醇离心洗涤各三次，得沉淀。将上述沉淀置于干燥箱中干燥过夜，即得到纳米铝佐剂。

2)制备纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗：

小鼠腹腔接种H22肝癌细胞，待腹水产生后处死，无菌条件下制备成浓度为1×10⁸/ml细胞悬液，将细胞悬液经65℃30min水浴处理后，分别与浓度为2mg/ml上述纳米铝佐剂和购买的普通铝佐剂4℃共孵育7天。即得到纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗。

按每种物质不同的配比制备的其他具体实施例如下：

实施例2：基本流程同实施例1，与实施例1不同之处在于：

步骤1)中正辛醇与AlCl₃质量比为1:1.5，然后搅拌20min，以30滴/min的速度加入氨水搅拌。反应体系PH为14。加入丙酮后离心，离心速度为1000rpm。

步骤2)中，细胞悬液浓度为3×10⁸,细胞经65℃30min水浴处理后，与4mg/ml的纳米铝佐剂和普通铝佐剂4℃共孵育7天。

本实施例其他比例关系与实施例1相同。

实施例3：基本流程步骤同实施例1，与实施例不同之处在于：

步骤1)中正辛醇与AlCl₃质量比为1:1.4，然后搅拌20min，以25滴/min的速度加入氨水搅拌。反应体系PH为12。加入丙酮后离心，离心速度为800rpm。

步骤2)中，细胞悬液浓度为2×10⁸,细胞经65℃30min水浴处理后，与3mg/ml的纳米铝佐剂和普通铝佐剂4℃共孵育7天。

本实施例其他比例关系与实施例1相同。

1.纳米铝佐剂的表征：制备的纳米铝佐剂粒子为白色粉末，在无水乙醇超声分散后，用透射电镜观察，纳米铝佐剂粒子近似方形，电子密度高，分散性好，大小较一致，呈散在分布(附图1)。扫描电镜下对所制备的材料表面进行能谱分析(附图2)，可见其中仅含有铝和氧两种成分，质量百分含量分别为铝占80.05﹪，氧占19.95﹪，与AL(OH)₃中铝氧质量百分含量吻合，证实纳米铝佐剂粒子已制备。

2.纳米铝佐剂的生物相容性及安全行试验：本研究参照GB/T16886(等同于ISO10993)及国内外其他相关标准，通过材料浸提液细胞毒性试验、溶血试验、材料的小鼠LD50测定，以及体内遗传毒性试验——微核试验等方法，对自制纳米铝佐剂的生物相容性性进行评价。应用纳米铝佐剂浸提液作CCK-8试验，结果显示不同浓度的浸提液对于细胞增殖无明显影响，细胞毒性分级为0～1级，说明自制的纳米铝佐剂体外试验无细胞毒性作用；应用纳米铝佐剂做溶血实验，发现纳米铝佐剂的浸提液溶血率为3.57％，小于5％.表明实验用纳米铝佐剂无溶血作用，符合医用材料的溶血试验要求；选择微核试验评价自制纳米铝佐剂的遗传毒性，结果显示该材料对小鼠骨髓微核形成率与阴性对照组相比无显著差异、而与阳性对照CTX组相比有显著差异，可以认为该材料无致畸或致突变作用；全身急性毒性试验结果显示纳米铝佐剂的小鼠LD50为10.33g/kg体重，95％的可信区间为9.12～11.54g/kg体重，根据联合国世界卫生组织(WHO)对外来化合物急性毒性分级五级标准，LD50在5g/kg体重以上即属实际无毒范畴，故其小鼠腹腔注射毒性很低，且具有较广的安全值范围。

3.树突状细胞吞噬不同佐剂形态观察

3.1小鼠骨髓树突状细胞培养

取健康6-8周的KM小鼠，无菌手术取出股骨和胫骨，剪去股骨两端，用5ml无菌注射器抽取PBS2ml，将其针头分别从两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓，直至骨变白，将骨髓收入50ml离心管中；低渗法去除红细胞，1000rpm，离心5min，洗涤2次；用RPMI1640调整细胞浓度为1×10⁶/ml，置于于6孔培养板内，每孔2ml；37℃、5％CO₂、饱和湿度下贴壁3h；吸弃上清，用37℃预温的RPMI1640轻轻洗去非贴壁细胞，每孔加入2ml含rmGM-CSF(20ng/ml)、rmIL-4(20ng/ml)和10％FBS的RPMI1640完全培养液继续培养，隔日换液，使用常规半量换液方法，即吸弃1ml上清液，补充1ml含细胞因子的完全培养基。第8天收集悬浮细胞即为小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC)。

3.2DC吞噬不同佐剂形态观察的比较

收集的小鼠树突状细胞以浓度为1×10⁶/ml，每孔2ml培养于六孔板内，共四孔，1号孔为单独树突状细胞组，2号孔内加入10ul2mg/ml纳米铝佐剂，3号孔内加入10ul2mg/ml纳米Fe₃O₄佐剂、4号孔内加入10ul2mg/ml普通铝佐剂。共培养24h后于倒置显微镜下观察并拍照，并离心收集各孔细胞，用预冷戊二醛固定24h，EPON812包埋、60℃聚合72h，超薄切片、柠檬酸铅及醋酸铀染色，透射电镜下观察细胞形态变化并拍照。

3.3树突状细胞倒置显微镜下形态学观察

在DC培养过程中，第2-3天时见有树突状细胞集落可见贴壁细胞聚集成散在的细胞集落，每个集落有约10～20个细胞，并出现少量的悬浮细胞。随诱导时间的延长，悬浮细胞渐增多。大部分细胞呈悬浮状，细胞体积大且形态不规则，出现许多短的毛刺状突起。本实验采用树突状细胞与不同佐剂共培养，可见纳米铝佐剂因为其粒径小，大多被细胞所吞噬，游离于培养液中较少，而普通铝佐剂大多均匀分散于培养液中，被树突状细胞吞噬相对较少。

3.4树突状细胞透射电镜观察

培养7d的DC，透射电镜DC胞体周围可见不规则突起和褶皱；胞核染色深，偏向一侧，形状不规则，多为分叶状；胞质线粒体较为丰富，较多吞饮大泡及小泡，高尔基体、溶酶体少。所培养细胞具有典型的DC形态特征。

4.小鼠模型的建立以及免疫预防、治疗实验

取20～25克雌性KM小鼠80只，随机分为两大组，每组40只，一组为预防免疫组，另一组为治疗免疫组。在这两大组中，我们又随机将小鼠各分成四小组，每组10只。第Ⅰ组：免疫接种纳米铝佐剂吸附疫苗组；第Ⅱ组：免疫接种普通铝佐剂吸附疫苗组；第Ⅲ组：免疫接种单纯疫苗组，无佐剂吸附；第Ⅳ组：对照组，不做免疫治疗。在预防免疫组中，我们先对五小组分别免疫接种佐剂吸附疫苗，疫苗或生理盐水，皮下多点注射，一周后，各组均接种H₂₂肝癌细胞5×10⁶/ml，0.2ml/只。每周免疫接种一次，皮下共免疫4次，四周后处死；在治疗免疫组，各组先均接种H₂₂肝癌细胞5×10⁶/ml，0.2ml/只，观察成瘤大小，当肿瘤直径大约为0.5mm左右时，开始在皮下多点注射佐剂吸附疫苗，疫苗或生理盐水，每周免疫一次，共免疫两次，两周后处死。摘除眼球取血，采集实验鼠血清，测定血清中IFN-γ，IL-4水平；剥离肿瘤，称重，计算肿瘤质量抑制率；取脾脏，分离脾细胞，测定细胞毒杀伤活性。同时，取肿瘤局部组织心、肝、肺、肾，观察病理学改变。

4.1小鼠预防免疫实验结果

4.1.1肿瘤质量抑制率

实验结束时，处死荷瘤鼠，小心剥离出肿瘤，在电子天平上分别称量各实验组肿瘤的质量，计算肿瘤的质量抑制率见(表1)

表1.实验鼠预防免疫组肿瘤质量抑制率结果

¹⁾P>0.05vsⅠ组；²⁾P<0.01vsⅠ和Ⅱ组；³⁾P<0.01vsⅠ，Ⅱ和Ⅲ组；

4.1.2细胞毒性试验

表2.实验鼠预防免疫组细胞毒活性检测结果

当效靶比为100:1时,¹P>0.05vsⅠ组；²P>0.05vsⅠ和Ⅱ组；³P<0.05vsⅠ和Ⅱ组.当效靶比为50:1时,^aP<0.05vsⅠ组；^bP<0.05vsⅠ组,^cP>0.05vsⅡ组；^dP<0.01vsⅠ,Ⅱ和Ⅲ组.当效靶比为25:1时,^AP>0.05vsⅠ组；^BP<0.05vsⅠ组^CP>0.05vsⅡ组；^DP<0.01vsⅠ,Ⅱ组和Ⅲ组.

4.1.3血清IFN-γ，IL-4水平检测结果

表3.实验鼠预防免疫组血清IFN-γ，IL-4水平检测结果

血清IFN-γ水平:¹P>0.05vsⅠ组；²P<0.05vsⅠ,³P>0.05vsⅡ组；⁴P<0.05vsⅠ,Ⅱ和Ⅲ组；血清Il-4水平:ELISA试剂盒所测Il-4水平的灵敏度为5-320pg/ml，仅有第Ⅴ组值为7.53±1.90pg/ml，其余组因子水平均低于最低检出限以下.

4.2小鼠治疗免疫实验结果

4.2.1肿瘤质量抑制率

实验结束时，处死荷瘤鼠，小心剥离出肿瘤，在电子天平上分别称量各实验组肿瘤的质量，依公式：肿瘤的质量抑制率(％)＝(1－实验组肿瘤质量/对照组肿瘤质量)×100，计算肿瘤的质量抑制率见(表4)。

表4.实验鼠治疗免疫组肿瘤质量抑制率结果

¹⁾P>0.05vsⅠ组；²⁾P<0.01vsⅠ和Ⅱ组；³⁾P<0.01vsⅠ，Ⅱ和Ⅲ组

4.2.2细胞毒性试验

表5.实验鼠治疗免疫组细胞毒活性检测结果

当效靶比为100:1时,¹P>0.05vsⅠ组,²P>0.05vsⅠ和Ⅱ组,³P<0.01vsⅠ,Ⅱ和Ⅲ组.当效靶比为50:1时,^aP<0.05vsⅠ组；^bP<0.05vsⅠ^cP>0.05vsⅡ组；^dP<0.01vsⅠ,Ⅱ和Ⅲ组；当效靶比为25:1时，^AP<0.05vsⅠ组；^BP<0.05vsⅠ；^CP>0.05vsvsⅡ组；^DP<0.01vsⅠ,Ⅱ和Ⅲ组。

4.2.3血清IFN-γ，IL-4水平检测结果

表6.实验鼠治疗免疫组血清IFN-γ，IL-4水平检测结果

血清IFN-γ水平：¹P<0.05vsⅠ；²P<0.05vsⅠ组,³P>0.05vsⅡ组；⁴P<0.05vsⅠ,Ⅱ,和Ⅲ组；

血清Il-4水平：ELISA试剂盒所测Il-4水平的灵敏度为5-320pg/ml，仅有第Ⅴ组值为15.44±3.79pg/ml，其余组因子水平均低于最低检出限以下。

4.3大体形态改变

无论预防实验还是治疗实验，各组肿瘤的质量按阴性对照组、单纯疫苗组、普通铝联合自体疫苗组、纳米铝佐剂吸附自体疫苗组的顺序依次减小。单纯疫苗组、普通铝联合自体疫苗组、纳米铝佐剂吸附自体疫苗组与单纯疫苗组、普通铝联合自体疫苗组对照组相比其肿瘤质量均有显著差异(p<0.05)；单纯疫苗组、普通铝联合自体疫苗组相比其肿瘤质量无显著差异(p>0.05)。同时，在预防实验中，纳米铝佐剂吸附自体疫苗组有三只小鼠未见肿瘤形成，而其他组10只小鼠全部成瘤。

4.4病理组织学改变

预防实验中，光学显微镜组织学检查发现荷瘤鼠皮下生长的肿瘤组织为低分化癌，进一步说明我们成功建立了小鼠H₂₂皮下移植瘤。阴性对照组、单纯疫苗组和普通铝佐剂吸附自体疫苗组中可见肿瘤组织可见少量淋巴细胞，而纳米铝佐剂吸附自体疫苗组肿瘤则可见有多量淋巴细胞。各组小鼠心肝肺肾等各内脏组织没有发现明显的形态学改变。同时，在治疗组中，我们观察到与预防免疫组类似的现象。

应理解上述实施例仅用于说明本发明技术方案的具体实施方式，而不用于限制本发明的范围。在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等同形式的修改和替换均落于本申请权利要求所限定的保护范围。

Claims (3)

1.一种纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1）制备纳米铝佐剂：

按质量比1:1:1将苯扎溴铵、正辛醇、环己烷高速混合后搅拌均匀，得到的混合溶液置入磁力搅拌器上，按正辛醇与AlCl₃质量比1:1.3~1.5，将后者加入所述混合溶液中搅拌20min以上，然后按20~30滴/min的速度向混合溶液中滴加氨水，保持反应体系PH>10反应2h，得到乳浊液；

向所述乳浊液中加入丙酮，至乳浊液变清，以>500rpm的速度离心，弃去上清液，得到沉淀物；最后将沉淀物先后用双蒸水、乙醇离心洗涤各三次后，置于干燥箱中干燥，即得到纳米铝佐剂；

2）制备纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗：

将H22肝癌细胞悬液与浓度为2~4mg/ml的纳米铝佐剂4℃共孵育7天，即得到纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗。

2.根据权利要求1所述的纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中，H22肝癌细胞悬液是按照如下方法制备的：小鼠腹腔接种H22肝癌细胞，待腹水产生后，无菌条件下抽取腹水，离心取沉淀，加入磷酸盐缓冲液制备成浓度为1×10⁸~3×10⁸个/ml细胞悬液，将细胞悬液经65℃30min水浴处理后即可。

3.一种纳米铝佐剂/自体肿瘤疫苗，其特征在于，该疫苗是按照权利要求1或2所述方法制备得到。