CN111671894B - 一种基于铝佐剂的疫苗递送系统及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于铝佐剂的疫苗递送系统,并提供其制备方法。本发明采用一种简单的制备方法,在外力的作用下,抗原蛋白直接与铝盐复合形成纳米粒,并可包载其他类型的佐剂,本发明所述的铝盐纳米粒粒径均一、分散性良好,亦可包载脂质膜或生物膜,是多价抗原递送系统。本发明制备的疫苗载体可以高效地被抗原呈递细胞摄取,有效地传递到淋巴结并诱导抗原特异性的免疫反应,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于氢氧化铝纳米粒的疫苗递送系统及其制备方法,属于医药技术领域。
背景技术
疫苗,作为人类对抗疾病最重要的手段之一,已用于控制多种感染性疾病,为人类健康事业做出了不可估量的贡献。由于其广泛的使用,使曾经严重危害人类生命与健康的急性传染病如天花、麻疹、白喉等疾病的流行得到了有效控制。传统疫苗主要为减毒活疫苗或灭活疫苗,虽免疫原性高但安全性低,所以,现研究主要集中于亚单位疫苗的开发。亚单位疫苗是指通过化学分解、重组表达等手段,提取病原具有免疫活性的片段而制成的疫苗。相对于灭活疫苗及减毒活疫苗,亚单位疫苗具有安全性更高、稳定性更好、免疫更持久,可规模化生产等优势。但安全性提高的同时伴随着免疫原性的降低,即机体接种疫苗后不能产生有效的免疫应答,因此常需与佐剂联合使用。
铝佐剂作为最经典、应用最为广泛的免疫佐剂,已有超过80年的应用历史,其是强大的Th2型免疫佐剂,能有效地诱导机体产生大量的特异性抗体。但传统的铝佐剂采用的是“抗原储库”模式,不断诱导相关细胞产生炎症因子,吸引抗原呈递细胞靠近,从而对抗原进行摄取、提呈。这种方式虽然促进了免疫应答的产生,但同时也带来了一些明显的缺点,如引起注射部位长时间的炎症反应,局部组织严重的刺激性,诱发注射部位肉芽肿等,且许多流行性疾病如HIV、肿瘤、肺结核等仅靠中和性抗体并不能达到很好的效果,还需依靠细胞免疫应答才能有效地清除。
淋巴结是免疫应答的主要场所,拥有大量具有吞噬活性和抗原呈递能力的抗原提呈细胞,且存在于淋巴结等免疫器官中的CD8a+抗原提呈细胞可将外源性抗原以抗原-MHC-Ⅰ复合物的形式呈递,有效诱导细胞免疫应答,因此,促进疫苗的淋巴结递送,能够同时提高疫苗诱导的细胞免疫应答和体液免疫应答。正常状态下,组织间液经毛细淋巴管到淋巴结有一个单向回流的过程,利用正常生理情况下淋巴液的生成和回流现象,粒径较小的纳米粒可以穿过组织间隙,进入到淋巴管,实现淋巴结的高效传递,其是一种粒径依赖型行为,因此,需要通过某种技术手段将传统铝佐剂由胶状物向纳米载体转变。
抗原作为疫苗最重要的组成部分,是决定疫苗保护效果的关键所在,需要考虑选择最佳的针对某种疾病的特定抗原。但对于一种病原体而言,不同亚型间的抗原可能不尽相同,即具有一定的异质性,甚至某些抗原可能产生突变,因此,递送单一抗原的疫苗载体取得的效果有限,甚至可能失能。为了诱导机体产生更全面、更强效的保护效果,需要开发具有多价抗原递送能力的疫苗载体,优选的是能递送具有不同性质(例如亲水性或疏水性)的多价抗原递送系统。
在这里,我们将传统铝佐剂纳米化,使其比表面积急剧增大,活性变高,活性中心变多,吸附能力变强,在相同铝含量的情况下,可吸附更多的抗原,并弥补了其在细胞免疫应答方面的不足。此外,铝纳米粒还可包载其他类型的佐剂和实现多价抗原递送,可诱导机体产生全面、强效的保护作用。
发明内容
本发明的目的之一在于提供了一种基于铝佐剂的疫苗载体。本发明通过涡旋、超声或者微量注射泵等方法将抗原蛋白直接与铝盐吸附形成氢氧化铝纳米粒疫苗载体。制备的疫苗可以高效地将抗原传递至淋巴结,并促进抗原提呈细胞摄取、呈递抗原,从而诱导强效的抗原特异性的免疫反应。
氢氧化铝是一种两性氢氧化物,其在中性条件下为不溶于水的白色沉淀。目前大多采用高温煅烧、水热反应、反相微乳法等技术手段制备纳米级别氢氧化铝,其反应过程复杂繁琐,甚至有些反应条件十分剧烈,并且制得的纳米级别氢氧化铝易团聚,分散性和稳定性都较差,不适合于大规模生产及应用。本发明利用抗原蛋白表面富含大量游离羧酸残基,其可与铝发生相互作用,使抗原蛋白覆盖在氢氧化铝形成的内核表面,并且硫酸铝在中性或偏碱性的条件下生成氢氧化铝,氢氧化铝带正电荷,而大多数抗原蛋白的等电点小于7,在中性条件下带负电荷,通过静电吸附作用,抗原蛋白紧密地吸附在氢氧化铝内核表面,能够有效地限制氢氧化铝因过度聚集生长而生成微米级或更大粒径的氢氧化铝沉淀,从而得到稳定性较好、易于分散的纳米级别的氢氧化铝。
本发明的目的之一在于提供了一种基于铝佐剂的疫苗制剂,其优选为铝盐纳米粒,进一步优选为氢氧化铝纳米粒。
本发明的目的之一在于提供了一种基于铝佐剂的疫苗递送系统,其特征在于包含抗原蛋白与铝盐复合形成的氢氧化铝纳米粒,其中,所述铝盐为硫酸铝,所述抗原蛋白为水溶性蛋白。基于重量份计,抗原蛋白:硫酸铝为1:1—1:50,优选为1:1—1:20。
作为优选实验方案,本发明优选的水溶性抗原蛋白为模型抗原OVA、BSA、铜绿假单胞菌膜蛋白PcrVNH的一种或一种以上的组合物。
本发明的目的之一在于提供了一种基于铝佐剂的疫苗递送系统,其特征在于包含抗原蛋白与铝盐复合形成的氢氧化铝纳米粒,再包载脂质膜或生物膜。其中,所述抗原蛋白为水溶性蛋白。所述的脂质膜或生物膜为任意的具有磷脂双分子层结构的膜,在外力的作用下,其包裹在纳米粒表面上,形成分布较为均一的纳米粒,增加了其稳定性,此外,内核的铝与磷脂双分子层膜上的磷酸基团之间的相互作用,进一步增加了纳米粒的稳定性,形成分散性良好、稳定的纳米粒,所述的脂质膜或生物膜包括但不局限于:脂质体、肿瘤细胞膜、细菌细胞膜、支原体细胞膜、衣原体细胞壁、螺旋体、立克次体微荚膜、病毒包膜、外泌体等中的一种或多种。
作为优选实验方案,本发明优选的脂质膜或生物膜为任意的肿瘤细胞膜、细菌细胞膜的一种或一种以上的组合物。
本发明的目的之一在于提供了一种基于铝佐剂的疫苗制剂,其特征在于疫苗制剂为纳米颗粒,其粒径小于1000nm,优选小于500nm,特别优选小于300nm。
本发明的目的之一在于提供了一种基于铝佐剂的疫苗递送系统,其特征在于还可以同时含有铝佐剂以外的其他佐剂,所述附加佐剂包括但不限于:抗原相关分子模式类佐剂:Toll样受体激动剂:肽聚糖、脂磷壁酸、单磷酸类脂A、咪喹莫特、瑞喹莫特、CpG-ODN、细菌鞭毛蛋白、Poly I:C;RIG-I样受体激动剂:3pRNA、短的双链RNA;NOD样受体激动剂:胞壁酰二肽、N一乙酰葡萄糖胺;C-型凝集素受体:β-葡聚糖、海藻糖二硼酸盐;STING激动剂:cGAMP;细菌毒素及其衍生物:霍乱毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素B亚单位、百日咳毒素、破伤风毒素、白喉毒素;细胞因子:GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-6、IFN-γ、Flt-3、淋巴细胞趋化因子;其他佐剂:热激蛋白、A151、GTP-GDP中的一种或一种以上组合物。
作为优选实验方案,本发明优选的附加佐剂为CpG,单磷酸类脂A的一种或一种以上的组合物。
本发明的目的之一在于提供了一种用作疫苗载体的氢氧化铝纳米粒,其能同时诱导体液免疫应答和细胞免疫应答。
本发明的目的之一在于提供了一种氢氧化铝纳米粒的制备方法,其特征在于,包含以下步骤:
(1)向缓冲液中加入抗原蛋白,混合均匀;
(2)将硫酸铝溶液加入上述溶液中;
(3)涡旋、超声或者通过微量注射泵进行混合,即得。
作为优选的实施方案其中步骤(1)所述的抗原蛋白含量为0.1mg/ml—10mg/ml,特别优选为1mg/ml—3mg/ml,
其中步骤(1)所述的缓冲液为Hepes,其终浓度为0.1mmol—80mmol,特别优选为1mmol—30mmol,
其中步骤(2)所述的硫酸铝的终浓度为0.01mg/ml—10mg/ml,特别优选为0.1mg/ml—1mg/ml,
其中步骤(3)的涡旋时间为3s—60s,
其中步骤(3)的超声功率为30W—300W,时间为1min—10min,
其中步骤(3)的微量注射泵的流速为10ml/min—80ml/min。
本发明的目的之一在于提供了一种基于铝盐纳米粒的疫苗递送系统的制备方法,其特征在于,包含以下步骤:
(1)向缓冲液中加入抗原蛋白,混合均匀,
(2)将硫酸铝溶液加入上述溶液中;
(3)涡旋、超声或者通过微量注射泵进行混合;
(4)再将上述溶液加入含有脂质膜或生物膜的水溶液中;
(5)挤膜、超声或者通过微量注射泵进行混合,即得。
作为优选的实施方案,其中步骤(1)所述的抗原蛋白含量为0.1mg/ml—10mg/ml,特别优选为1mg/ml—3mg/ml,
其中步骤(1)所述的缓冲液Hepes,其终浓度为0.1mmol—80mmol,特别优选为1mmol—30mmol,
其中步骤(2)所述的硫酸铝的终浓度为0.01mg/ml—10mg/ml,特别优选为0.1mg/ml—1mg/ml,
其中步骤(3)的涡旋时间为5s—60s,
其中步骤(3)和(5)的超声功率为30W—300W,时间为1min—10min,
其中步骤(3)和(5)的微量注射泵的流速为10ml/min—80ml/min,
其中步骤(4)的生物膜蛋白含量为0.01mg/ml—5mg/ml,特别优选为0.01mg/ml—0.5mg/ml,
其中步骤(5)的挤膜次数为5次—50次。
本发明所述的基于铝盐纳米粒的疫苗递送系统的制备方法简单、快速,可应用于多种病原体疫苗制备。
本发明的目的之一在于提供了一种多价抗原共递送的疫苗递送系统及其制备方法。
本发明的目的之一在于提供了一种基于铝盐纳米粒的疫苗递送系统,所述疫苗递送系统能同时诱导体液免疫应答和细胞免疫应答。
本申请提供了一种基于铝佐剂的疫苗递送系统,其特征在于包含抗原蛋白与铝盐复合形成的氢氧化铝纳米粒,其还可以包载脂质膜或生物膜,其中优选的抗原蛋白为水溶性抗原蛋白,优选的模型水溶性抗原蛋白为OVA、BSA以及铜绿假单胞菌膜蛋白PcrVNH的一种或多种,优选的脂质膜或生物膜为肿瘤细胞膜、细菌细胞膜的一种或多种,本申请成功制备了基于铝佐剂的氢氧化铝纳米粒,通过体、内外实验证明了,利用氢氧化铝纳米粒可以实现抗原与佐剂、多价抗原的共递送,并诱导机体产生全面、有效的体液免疫应答和细胞免疫应答。
有益效果
本发明提供了一种氢氧化铝纳米粒的制备方法,其制备方法简单,重复性好,所制得的纳米粒稳定性高,不易聚集,分散性好,适合于大规模生产及使用。
本发明将抗原蛋白与铝盐混合制备氢氧化铝纳米粒,提供了一种制备氢氧化铝纳米粒的普适性方法。
本发明的疫苗递送系统由抗原与佐剂组成,不添加其他成分,具有良好的生物相容性,毒性小,安全性高。
本发明的氢氧化铝纳米粒,其能被抗原提呈细胞高效摄取,有利于免疫应答的产生,同时减少了被其他细胞摄取而产生的副作用。
本发明将不同性质的抗原包载于同一载体内,实现多价抗原的共递送,有效诱导机体产生更全面、更高效的免疫应答。
本发明的疫苗递送系统中铝含量极低,在铝含量远远低于商品化铝凝胶吸附疫苗的情况下,诱导的免疫反应相当或更强,且无局部副反应和金属离子蓄积的危险。
附图说明
以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案
图1蛋白-氢氧化铝纳米粒的粒径图,其中,图a为OVA-氢氧化铝纳米粒的粒径图,图b为BSA-氢氧化铝纳米粒的粒径图,图c为PcrVNH-氢氧化铝纳米粒的粒径图;
图2膜-蛋白-氢氧化铝纳米粒的粒径图,其中,图a为肿瘤细胞膜-OVA-氢氧化铝纳米粒的粒径图,图b为肿瘤细胞膜-BSA-氢氧化铝纳米粒的粒径图,图c为细菌膜-BSA-氢氧化铝纳米粒的粒径图,图d为细菌膜-PcrVNH-氢氧化铝纳米粒的粒径图;
图3 OVA-氢氧化铝纳米粒的透射电镜图;
图4肿瘤细胞膜-OVA-氢氧化铝纳米粒的透射电镜图;
图5铝盐纳米粒在DC2.4细胞(a)和Raw264.7细胞(b)上的摄取结果;
图6铝盐纳米粒淋巴结分布情况;
图7铝盐纳米粒免疫小鼠的血清抗体水平。图a为IgG抗体水平,图b为IgG1抗体水平,图c为IgG2a抗体水平;
图8铝盐纳米粒免疫小鼠后的CTL结果;
图9铝盐纳米粒免疫小鼠后的抗肿瘤效果。
具体实施方案
以下实施例是对本发明的进一步说明,但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明,但是本领域技术人员应当理解,本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且,本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰,但这些都将包括在本发明的范围内。
实施例1
OVA-氢氧化铝纳米粒的制备:取20μl 10mM硫酸铝溶液与50μl注射用水混匀,作为A相,取50μl 5mg/ml的OVA水溶液与30μl 100mM的Hepes缓冲液(pH=7.8)、50μl注射用水混匀,作为B相,在涡旋的条件下,A相逐滴加入B相中,再继续涡旋10s即得。
实施例2
OVA-氢氧化铝纳米粒的制备:取6ml的Hepes缓冲液(pH=7.8)、10ml 5mg/mlOVA溶液和5ml注射用水,混合均匀后加入1号注射器,5ml 10mM硫酸铝溶液与16ml注射用水,混合均匀后加入2号注射器,两个注射器同时通过微量注射泵以50ml/min的速度通过异型三通道微流体装置,收集混合后的液体,即为包载OVA的铝盐纳米粒。
实施例3
OVA-氢氧化铝纳米粒的制备:取50μl 5mg/ml的OVA水溶液与30μl 100mM的Hepes缓冲液(pH=7.8)、100μl注射用水混匀,吸取20μl 10mM硫酸铝溶液,加入上述溶液中,超声5min,功率为120w,即得。
实施例4
BSA-氢氧化铝纳米粒的制备:取30μl 10mM硫酸铝溶液与50μl注射用水混匀,作为A相,取50μl 5mg/ml的BSA水溶液与40μl 100mM的Hepes缓冲液(pH=7.8)、50μl注射用水混匀,作为B相,在涡旋的条件下,A相逐滴加入B相中,再继续涡旋10s即得。
实施例5
BSA-氢氧化铝纳米粒的制备:取50μl 5mg/ml的BSA水溶液与40μl 100mM的Hepes缓冲液(pH=7.8)、90μl注射用水混匀,吸取30μl 10mM硫酸铝溶液,加入上述溶液中,超声5min,功率为120w,即得。
实施例6
BSA-氢氧化铝纳米粒的制备:取4ml的Hepes缓冲液(pH=7.8)、5ml 5mg/ml BSA溶液和2ml注射用水,混合均匀后加入1号注射器,3ml 10mM硫酸铝溶液与8ml注射用水,混合均匀后加入2号注射器,两个注射器同时通过微量注射泵以50ml/min的速度通过异型三通道微流体装置,收集混合后的液体,即为包载BSA的铝盐纳米粒。
实施例7
PcrVNH-氢氧化铝纳米粒的制备:取12μl 10mM硫酸铝溶液与93μl注射用水混匀,作为A相,取200μl 3mg/ml的铜绿假单胞菌膜蛋白PcrVNH水溶液与15μl100mM的Hepes缓冲液(pH=7.8)混匀,作为B相,在涡旋的条件下,A相逐滴加入B相中,再继续涡旋10s即得。
实施例8
OVA-氢氧化铝-CpG纳米粒的制备:取20μl 10mM硫酸铝溶液与50μl注射用水混匀,作为A相,取50μl 5mg/ml的OVA水溶液与30μl 100mM的Hepes缓冲液(pH=7.8)、4.5μl 1mg/ml的CpG、50μl注射用水混匀,作为B相,在涡旋的条件下,A相逐滴加入B相中,再继续涡旋10s,即得包载抗原蛋白、佐剂的铝盐纳米粒。
实施例9
BSA-氢氧化铝-CpG纳米粒的制备:取30μl 10mM硫酸铝溶液与50μl注射用水混匀,作为A相,取50μl 5mg/ml的BSA水溶液与40μl 100mM的Hepes缓冲液(pH=7.8)、5μl 1mg/ml的CpG、50μl注射用水混匀,作为B相,在涡旋的条件下,A相逐滴加入B相中,再继续涡旋10s,即得包载抗原蛋白、佐剂的铝盐纳米粒。
实施例10
肿瘤细胞膜的制备:700g×7min离心收集EG7-OVA肿瘤细胞,用无菌PBS洗两遍,再用含有蛋白酶抑制剂的TDS缓冲液(2.3646g Tris-HCl、20.49g D-甘露糖、12.99g蔗糖,溶于450ml无菌注射用水,调节pH到7.0,再用无菌注射用水定容至500ml,无菌过滤后4℃保存备用)重悬,在冰水浴的条件下探头超声将细胞破碎(150W,6min,4s开,6s关),10000g离心35min除掉细胞器、细胞核及肿瘤细胞的大碎片,收集上清,150000g超高速离心40min得到细胞膜沉淀,最后用0.2mM的EDTA二钠水溶液洗涤细胞膜沉淀2次,最后用无菌注射用水重悬,用常量BCA定量蛋白浓度,4℃保存备用。
实施例11
细菌膜的制备:取250μl保种的铜绿假单胞菌菌液加入到10ml LB液体培养基中,220rpm×37℃摇菌,过夜培养,第二天早上取5ml一次复苏的菌液到50mlLB液体培养基中,220rpm×37℃摇菌,二次复苏2小时使铜绿假单胞菌OD值在0.6—0.8之间,6000rpm×4min离心收集处于对数生长期的铜绿假单胞菌,用无菌PBS洗涤两遍,再用含苯甲基磺酰氟的0.1×PBS重悬,在冰水浴的条件下探头超声将细菌破碎(180W,6min,4s开,6s关),6000g离心35min除掉细胞器、细胞核及大的细菌碎片,收集上清,100000g超高速离心40min得到细菌膜沉淀,最后用0.2mM的EDTA二钠水溶液洗涤细菌膜沉淀2次,最后用无菌注射用水重悬,用常量BCA定量蛋白浓度,4℃保存备用。
实施例12
肿瘤细胞膜-OVA-氢氧化铝纳米粒的制备:在涡旋的条件下,取80μl实施例1制备的OVA-氢氧化铝纳米粒逐滴加入到浓度为0.2mg/ml的肿瘤细胞膜的水溶液中,混匀后水浴超声(70W)4min即得。
实施例13
肿瘤细胞膜-BSA-氢氧化铝纳米粒的制备:在涡旋的条件下,取56μl实施例4制备的BSA-氢氧化铝纳米粒逐滴加入到浓度为0.2mg/ml的肿瘤细胞膜的水溶液中,混匀后水浴超声(70W)4min即得。
实施例14
肿瘤细胞膜-BSA-氢氧化铝纳米粒的制备:将实施例10制备的肿瘤细胞膜依次通过800nm、400nm、200nm的聚碳酸酯膜,分别挤出11次,再在涡旋的条件下,取56μl实施例4制备的BSA-氢氧化铝纳米粒和挤出的浓度为0.2mg/ml的肿瘤细胞膜水溶液混匀,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤出11次即得。
实施例15
铜绿假单胞菌膜-BSA-氢氧化铝纳米粒的制备:在涡旋的条件下,取42μl实施例4制备的BSA-氢氧化铝纳米粒逐滴加入到浓度为0.04mg/ml的铜绿假单胞菌膜的水溶液中,混匀后水浴超声(70W)4min即得。
实施例16
铜绿假单胞菌膜-BSA-氢氧化铝纳米粒的制备:将实施例11制备的铜绿假单胞菌膜依次通过400nm和200nm的聚碳酸酯膜,分别挤出11次,再在涡旋的条件下,取42μl实施例4制备的BSA-氢氧化铝纳米粒和挤出的浓度为0.04mg/ml的铜绿假单胞菌膜水溶液混匀,再通过200nm的聚碳酸酯膜挤出11次即得。
实施例17
铜绿假单胞菌膜-PcrVNH-氢氧化铝纳米粒的制备:在涡旋的条件下,取160μl实施例7制备的PcrVNH-氢氧化铝纳米粒逐滴加入到浓度为0.04mg/ml的铜绿假单胞菌膜的水溶液中,混匀后水浴超声(70W)4min即得。
实施例18
铝盐纳米粒的粒径测定:使用Zetasizer Nano ZS90激光粒度分析仪测定实施例1-9、12-17的基于铝佐剂的铝盐纳米粒的粒径分布,分别取0.2ml制备得到的纳米粒溶液加入到微量粒径皿中,将样品放入样品池内,选择介质为水,设定测定温度为25℃。结果如图1a-c、图2a-d所示,其中图1a为实施例1中的OVA-氢氧化铝纳米粒的粒径图、图1b为实施例4中的BSA-氢氧化铝纳米粒的粒径图、图1c为实施例7中的PcrVNH-氢氧化铝纳米粒的粒径图、图2a为实施例12中的肿瘤细胞膜-OVA-氢氧化铝纳米粒的粒径图、图2b为实施例13中的肿瘤细胞膜-BSA-氢氧化铝纳米粒的粒径图、图2c为实施例15中的铜绿假单胞菌膜-BSA-氢氧化铝纳米粒的粒径图、图2d为实施例17中的铜绿假单胞菌膜-PcrVNH-氢氧化铝纳米粒的粒径图,结果显示铝盐纳米粒粒径在100nm-200nm左右,PDI符合要求,分布均一,具体粒径结果如表1、表2所示。
表1实施例1-9基于铝佐剂的铝盐纳米粒的粒径
实施例编号 | 粒径(nm) | PDI |
1 | 179.7 | 0.281 |
2 | 159.8 | 0.206 |
3 | 175.8 | 0.235 |
4 | 171.7 | 0.226 |
5 | 151.4 | 0.134 |
6 | 169.7 | 0.196 |
7 | 104.8 | 0.294 |
8 | 218.2 | 0.296 |
9 | 198.5 | 0.245 |
表2实施例12-17基于铝佐剂的铝盐纳米粒的粒径
实施例编号 | 粒径(nm) | PDI |
12 | 192.9 | 0.207 |
13 | 211.1 | 0.266 |
14 | 185.7 | 0.195 |
15 | 196.2 | 0.197 |
16 | 176.2 | 0.097 |
17 | 145.1 | 0.227 |
实施例19
OVA-氢氧化铝纳米粒的透射电镜:将实施例1制备的OVA-氢氧化铝纳米粒样品置于铜网上,静置2min,然后用磷钨酸染色2min,之后用滤纸吸走铜网上多余的染液,室温晾干样品,在200kv条件下,透射电镜观察样品。结果如图3所示,由实验结果可知纳米粒均为圆整的颗粒,粒径在100nm左右。
实施例20
肿瘤细胞膜-OVA-氢氧化铝纳米粒的透射电镜:将实施例12制备的肿瘤细胞膜-OVA-氢氧化铝纳米粒样品置于铜网上,静置2min,然后用磷钨酸染色2min,之后用滤纸吸走铜网上多余的染液,室温晾干样品,在200kv条件下,透射电镜观察样品。结果如图4所示,由实验结果可知纳米粒均为圆整的颗粒,且膜核结构清晰可见,粒径在100nm左右。
实施例21
铝盐纳米粒在DC2.4和Raw264.7细胞上的摄取:DC2.4细胞或Raw264.7细胞按照1×106cells/孔接种于12孔板,待细胞长至80%时,去除培养基,PBS洗涤1遍,加入1ml无血无抗培养基,再向其中加入游离的FITC标记的OVA和DID标记的肿瘤细胞膜,以及FITC标记的OVA和DID标记的肿瘤细胞膜按照实施例12的方法制备的肿瘤细胞膜-OVA-氢氧化铝纳米粒,给药剂量为OVA 10μg/孔,肿瘤细胞膜10μg/孔,37℃孵育1h后用PBS轻轻冲洗细胞表面一遍,再用PBS直接吹打,2000rpm×4min离心并洗涤细胞一遍,最后用400μlPBS重悬细胞,用流式细胞仪检测。实验结果如图5所示,与游离的OVA和肿瘤细胞膜相比,肿瘤细胞膜-OVA-氢氧化铝纳米粒在DC2.4细胞和Raw264.7细胞上的摄取显著增加,具有显著性差异(****,即p<0.0001),猜测是因为铝盐纳米粒中的铝与细胞膜上的磷酸基团相互作用,显著增加了细胞摄取。图5中OVA+CM表示游离的OVA和肿瘤细胞膜,AlOH/OVA/CM表示肿瘤细胞膜-OVA-氢氧化铝纳米粒。
实施例22
铝盐纳米粒淋巴结靶向作用:C57BL/6小鼠脚掌注射游离的FITC标记的OVA和DID标记的肿瘤细胞膜,FITC标记的OVA和DID标记的肿瘤细胞膜按照实施例12的方法制备的肿瘤细胞膜-OVA-氢氧化铝纳米粒,以及商品化铝凝胶吸附的FITC标记的OVA和DID标记的肿瘤细胞膜,每组的给药剂量都为OVA 10μg/只,肿瘤细胞膜10μg/只,分别在3h、10h、17h以及24h处死小鼠,取腘弯处淋巴结,用PBS研磨成单细胞悬液,3000rpm×4min离心并洗涤细胞一遍,最后用300μl PBS重悬细胞,用流式细胞仪检测。实验结果如图6所示,相比于游离组以及商品化铝凝胶吸附组,肿瘤细胞膜-OVA-氢氧化铝纳米粒在体内能快速有效的传递到引流淋巴结,并滞留一定时间,具有显著性差异(***,即p<0.001;****,即p<0.0001),为迅速有效的产生免疫应答提供了基础。图6中,OVA+CM表示游离的OVA和肿瘤细胞膜,Al/OVA/CM表示肿瘤细胞膜-OVA-氢氧化铝纳米粒,Algel表示商品化铝凝胶吸附的OVA和肿瘤细胞膜。
实施例23
小鼠免疫方案:在第0天、第7天、第14天,BALB/c小鼠脚掌注射按照实施例17的方法制备的铜绿假单胞菌膜-PcrVNH-氢氧化铝纳米粒,游离的PcrVNH与细菌膜或商品化铝凝胶吸附的PcrVNH与细菌膜,其中每次的给药剂量都为PcrVNH 15μg/只,铜绿假单胞菌膜1μg/只。
实施例24
小鼠免疫方案:在第0天、第7天、第14天,C57BL/6小鼠脚掌注射按照实施例12的方法制备的肿瘤细胞膜-OVA-氢氧化铝纳米粒,游离的OVA与肿瘤细胞膜或商品化铝凝胶吸附的OVA与肿瘤细胞膜,其中每次的给药剂量都为OVA 10μg/只,肿瘤细胞膜10μg/只。
实施例25
小鼠血清抗体水平检测:BALB/c小鼠按照实施例22进行免疫,第21天从小鼠眼眶取血,检测血清中细菌膜特异性抗体的量,结果如图7所示,图7a、图7b和图7c分别是IgG、IgG1和IgG2a的抗体检测结果,相比游离的PcrVNH和铜绿假单胞菌膜、商品化铝凝胶吸附的PcrVNH与细菌膜,铜绿假单胞菌膜-PcrVNH-氢氧化铝纳米粒能显著增加血清中菌膜特异性抗体的产生,具有显著性差异(**,即p<0.01;***,即p<0.001;****,即p<0.0001)。图7中,PcrVNH+BM表示游离的PcrVNH和铜绿假单胞菌膜,Al/PcrVNH/BM表示细菌膜-PcrVNH-氢氧化铝纳米粒,Algel表示商品化铝凝胶吸附的PcrVNH与细菌膜。
实施例26
细胞毒性T淋巴细胞(CTL)实验:C57BL/6小鼠按照实施例23进行免疫,第21天通过CFSE染色的方法检测体内CTL反应。结果如图8所示,肿瘤细胞膜-OVA-氢氧化铝纳米粒产生较强的抗原特异性细胞免疫反应,其CTL效果显著高于游离OVA和肿瘤细胞膜组以及商品化铝凝胶吸附的OVA与肿瘤细胞膜组,具有显著性差异(*,即p<0.1;***,即p<0.001;)。图8中,OVA+CM表示游离的OVA和肿瘤细胞膜,Al/OVA/CM表示肿瘤细胞膜-OVA-氢氧化铝纳米粒,Algel表示商品化铝凝胶吸附的OVA和肿瘤细胞膜。
实施例27
抑瘤实验:C57BL/6小鼠按照实施例23进行免疫,第21天皮下接种6*105个EG7-OVA细胞,每隔两天记录肿瘤生长情况。结果如图9所示,相比游离的OVA和肿瘤细胞膜组以及商品化铝凝胶吸附的OVA与肿瘤细胞膜组,肿瘤细胞膜-OVA-氢氧化铝纳米粒能显著抑制肿瘤的生长,具有显著性差异(*,即p<0.1;**,即p<0.01;)。图9中,OVA+CM表示游离的OVA和肿瘤细胞膜,Al/OVA/CM表示肿瘤细胞膜-OVA-氢氧化铝纳米粒,Algel表示商品化铝凝胶吸附的OVA和肿瘤细胞膜。
综上可知,本申请制备的基于铝佐剂的疫苗递送系统,制备方法简单,重复性好,所制得的纳米粒稳定性高,不易聚集,分散性好,具有实现抗原与佐剂、多价抗原共递送的优势,进一步的实验结果表明,本申请的疫苗递送系统能促进抗原提呈细胞对抗原的摄取,靶向淋巴结,诱导全面、有效的体液免疫应答和细胞免疫应答,接受该疫苗递送系统免疫治疗的小鼠,显示出了优异的抗肿瘤效果。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已,并非对本发明做任何形式上的限制,虽然本发明已以优选实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明技术方案的范围内,当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (5)
1.一种铝盐纳米粒疫苗载体,其特征在于包括抗原蛋白与铝盐复合形成的氢氧化铝纳米粒作为内核,表面再包载生物膜,其粒径小于500nm,其中,所述生物膜为肿瘤细胞膜或细菌细胞膜,所述抗原蛋白为水溶性蛋白,其与铝盐通过静电吸附作用形成纳米粒,所述铝盐为硫酸铝,基于重量份计,硫酸铝:抗原蛋白为1:1—1:50,所述铝盐纳米粒疫苗载体的制备方法包括以下步骤:
(1)向缓冲液中加入抗原蛋白,混合均匀;
(2)将硫酸铝溶液加入上述溶液中;
(3)涡旋、超声或者通过微量注射泵进行混合;
(4)再将上述溶液加入含有生物膜的水溶液中;
(5)挤膜、超声或者通过微量注射泵进行混合,即得。
2.根据权利要求1所述的铝盐纳米粒疫苗载体,其特征在于,还可包载其他类型的佐剂,所述佐剂包括抗原相关分子模式类佐剂:Toll样受体激动剂:肽聚糖、脂磷壁酸、单磷酸类脂A、咪喹莫特、瑞喹莫特、CpG-ODN、细菌鞭毛蛋白、Poly I:C;RIG-I样受体激动剂:3pRNA、短的双链RNA;NOD样受体激动剂:胞壁酰二肽、N一乙酰葡萄糖胺;C-型凝集素受体:β-葡聚糖、海藻糖二硼酸盐;STING激动剂:cGAMP;细菌毒素及其衍生物:霍乱毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素B亚单位、百日咳毒素、破伤风毒素、白喉毒素;细胞因子:GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-6、IFN-γ、Flt-3、淋巴细胞趋化因子;其他佐剂:热激蛋白、A151、GTP-GDP。
3.根据权利要求1所述的铝盐纳米粒疫苗载体,其特征在于,其粒径小于300nm。
4.根据权利要求1所述的铝盐纳米粒疫苗载体,其特征在于,所述疫苗载体可以同时诱导体液免疫应答和细胞免疫应答。
5.根据权利要求1-4任一所述的基于铝盐纳米粒的疫苗载体在制备预防性和/或治疗性免疫药物中的应用。
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